Khóa luận Xây dựng qui trình pcr phát hiện nấm ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN NẤM Ustilago scitaminea GÂY BỆNH THAN TRÊN MÍA Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: HỒ BỬU THƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN NẤM Ustilago scitaminea GÂY BỆNH THAN TRÊN MÍA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 Sinh viên thực hiện: HỒ BỬU THƠNG Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** ESTABLISHING A PROTOCOL PCR TO DETECT Ustilago scitaminea CAUSING SUGARCANE SMUT Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: PhD. BUI CACH TUYEN HO BUU THONG Term: 2003 - 2007 HCMC, 9/2007 iv LỜI CẢM TẠ Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Gia đình luơn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vơ cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Mơi trường - Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh cùng tồn thể các anh chị tại đây đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng như tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. ThS. Hà Đình Tuấn cùng tồn thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường tỉnh Bình Dương đã giúp đỡ em hồn thành tốt đề tài này. Anh Nguyễn Đình Trường đã tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn anh Trưởng, anh Khoa, anh Nam, anh Phương chị Hưng, chị Dung đã hết lịng giúp đỡ em để em cĩ thể hồn thành tốt khĩa luận tốt nghiệp này. Cảm ơn các bạn trong lớp Cơng nghệ Sinh học K29 đã luơn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007 Hồ Bửu Thơng v TĨM TẮT KHĨA LUẬN Hồ Bửu Thơng, Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8 / 2007. “Xây dựng qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía.” đề tài được thực hiện từ tháng 5 đến tháng 8 năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Mơi trường, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Nội dung nghiên cứu  Nuơi cấy, phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea.  Xây dựng qui trình PCR phát hiện trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea. Kết quả đạt đƣợc  Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối 11 dịng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác nhau ở Bình Dương.  Xây dựng được qui trình PCR phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm để phát hiện nấm Ustilago scitaminea. vi SUMMARY Ho Buu Thong studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 8 th , 2007. The thesis entitled “Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea causing sugarcane smut”. This research was conducted from 5th, 2007 to 8th, 2007 at the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University. Board of scientific instruction: Prof.Dr. BUI CACH TUYEN The content of research:  Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass of Ustilago scitaminea.  Establishing a protocol PCR to detect Ustilago scitaminea. The results obtained from this study:  Culturing, isolating, demorphisming the spore and multiplying the living mass of 11 Ustilago scitaminea clonies.  A protocol PCR for detecting Ustilago scitaminea was established. vii MỤC LỤC PHẦN TRANG LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................. iv TĨM TẮT ........................................................................................................................ v SUMMARY.................................................................................................................... vi MỤC LỤC ..................................................................................................................... vii DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................... xi DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................ xii Chương 1: MỞ ĐẦU....................................................................................................... 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu .............................................................. 1 1.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2 1.3. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2 1.4. Giới hạn đề tài .......................................................................................................... 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 2.1. Sơ lược về cây mía ................................................................................................... 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại ................................................................................................................ 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ........................................................................................... 4 2.1.4. Nhân giống ............................................................................................................ 5 2.1.5. Sản lượng ............................................................................................................... 5 2.1.6. Chế biến và sử dụng .............................................................................................. 5 2.1.7. Vị trí kinh tế của cây mía ...................................................................................... 6 2.1.8. Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía ......................................................................... 7 2.1.9. Bệnh trên cây mía .................................................................................................. 7 2.2. Bệnh than .................................................................................................................. 8 2.2.1. Nguồn gốc và phân bố ........................................................................................... 8 2.2.2. Triệu chứng ............................................................................................................ 9 2.2.3. Tác nhân gây bệnh ................................................................................................. 9 2.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh ..................................................................... 10 viii 2.2.5. Thiệt hại về kinh tế .............................................................................................. 11 2.2.6. Biện pháp phịng trừ ............................................................................................ 11 2.3. Các phương pháp xác định bệnh than .................................................................... 11 2.3.1. Dựa vào triệu chứng ............................................................................................ 11 2.3.2. Phương pháp chẩn đốn bằng cách nhuộm mắt mầm và soi dưới kính hiển vi huỳnh quang. ....................................................................................................... 12 2.3.3. Phương pháp ELISA ........................................................................................... 12 2.3.4. Phương pháp PCR ............................................................................................... 12 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh than ............................................................................. 21 2.4.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 21 2.4.2. Trong nước .......................................................................................................... 23 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 24 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 24 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 24 3.3. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................. 24 3.4. Phương pháp tiến hành ........................................................................................... 24 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu .......................................................................................... 24 3.4.2. Phương pháp phân lập ......................................................................................... 25 3.4.3. Phương pháp tách đơn bào tử .............................................................................. 25 3.4.4. Phương pháp nhân sinh khối nấm ....................................................................... 26 3.4.5. Phương pháp ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea ..................... 26 3.4.6. Tinh sạch sản phẩm ly trích ................................................................................. 28 3.4.7. Phương pháp PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea ...................................... 29 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................... 32 4.1. Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea ................. 32 4.1.1. Kết quả phân lập .................................................................................................. 32 4.1.2. Kết quả tách đơn bào tử ....................................................................................... 33 4.1.3. Kết quả nhân sinh khối ........................................................................................ 34 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm ............................................................ 36 4.2.1. Kết quả ly trích .................................................................................................... 36 4.2.2. Kết quả tinh sạch ................................................................................................. 37 ix 4.3. Phát hiện DNA của Ustilago scitaminea bằng kỹ thuật PCR ................................ 39 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 43 5.1. Kết luận................................................................................................................... 43 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 44 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 47 x DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT bp : base pair BLAST : Basic Local Alignment Search Tool ctv : cộng tác viên dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay Kb : kilo base m : micro mol M : micro mol/lít ng : nano gram NST : nhiễm sắc thể Nu : Nucleotide. PCR : Polymerase Chain Reaction PGA : Potato glucose agar RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism SDS : Sodium dodecyl sulphate TAE : tris acetic EDTA Taq : Thermus aquaticus TE : tris EDTA Tm : melting temperature UI : unit international UV : Ultraviolet xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Thống kê các nhĩm tác nhân gây bệnh và số lượng bệnh xảy ra trên cây mía. .................................................................................................................... 8 Bảng 2.2: Tỉ lệ nhiễm bệnh than của các giống mía ở Hawaii đối với nịi mới ........... 23 Bảng 3.1: Thành phần mơi trường PGA* ..................................................................... 25 Bảng 3.2: Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ......................... 30 Bảng 4.1: Các dịng nấm được tách đơn bào tử ............................................................ 34 Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau 4 ngày lắc trong mơi trường PGA* lỏng ............. 35 Bảng 4.3: Nồng độ các yếu tố trong phản ứng PCR thay đổi ....................................... 40 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Triệu chứng bệnh than trên mía ...................................................................... 9 Hình 2.2: Bào tử nấm.................................................................................................... 10 Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 5 ngày nuơi cấy ........................... 32 Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 7 ngày nuơi cấy ........................... 33 Hình 4.3: Bào tử nấm Ustilago scitaminea. ................................................................. 33 Hình 4.4: Bào tử nấm nảy mầm trên mơi trường agar soi dưới kính hiển vi ở vật kính x 40 .............................................................................................................. 34 Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc ....................................................................... 35 Hình 4.6: Kết quả li trích DNA của 11 dịng nấm ........................................................ 36 Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch ............................................................................. 38 Hình 4.8: DNA tổng số sau khi pha lỗng .................................................................... 39 Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình của Albert, H. H., và Schenck, S., ............... 39 Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi đầu tiên ......................................................... 40 Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau khi thay đổi nồng độ hĩa chất và chu kỳ nhiệt ........... 41 Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình mới ............................................................. 41 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây cơng nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới như Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v... vì vậy diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới khơng ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhưng lại cĩ khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ước, 1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu cĩ nhiều biến đổi cũng gĩp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hưởng đến năng suất mía hiện nay cĩ rất nhiều, trong đĩ phải kể đến bệnh than (smut). Bệnh than do nấm Ustilago scitaminea gây ra, đây là bệnh rất phổ biến và cĩ ảnh hưởng lớn đến ngành sản xuất mía đường của nhiều nước trên thế giới. Do vậy việc phát hiện bệnh than trên các giống mía cĩ vai trị rất quan trọng, nhằm thống kê tình hình nhiễm bệnh, nâng cao hiệu quả chọn lọc giống và kiểm sốt bệnh. Các phương pháp phát hiện Ustilago scitaminea như là nhuộm mắt mầm, phát hiện bằng phương pháp miễn dịch học,.v.v.. nhưng độ chính xác và độ nhạy chưa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, cĩ ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ cho cơng tác chọn giống, kiểm định giống từ đĩ đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm sốt và quản lí bệnh cĩ hiệu quả. Trước tình hình trên, được sự hướng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ trợ từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Mía Đường tỉnh Bình Dương, chúng tơi đã thực hiện đề tài “Xây dựng qui trình PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía”. Đề tài được thực hiện trên 11 dịng nấm từ 11 giống mía khác nhau thuộc tỉnh Bình Dương. 2 1.2. Mục đích nghiên cứu  Thu nhận khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea đồng nhất về mặt di truyền.  Khuếch đại đoạn gen bE nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía, từ đĩ đề ra phương pháp chẩn đốn sớm bệnh than bằng kỹ thuật PCR. 1.3. Yêu cầu  Nhận dạng được triệu chứng biểu hiện của bệnh than trên mía.  Nắm vững kỹ thuật nuơi cấy, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea.  Nắm vững kỹ thuật PCR. 1.4. Giới hạn đề tài  Thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn vì vậy khơng thể thực hiện phản ứng RFLP – PCR để xác định tính đa dạng di truyền của các dịng nấm thu thập được.  Chưa giải trình tự vùng gene bE của nấm đã được khuếch đại. 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 2.1.1. Lịch sử phát hiện Cây mía (Saccharum spp.) đã được biết từ rất lâu (cách đây khoảng 2.300 năm), khi quân đội của Alexander chinh phục Ấn Độ vào năm 326 trước Cơng Nguyên họ đã thấy được cây mía. Cây mía đến Persia vào thế kỉ thứ 6 và người Ả Rập đã mang cây mía đến Ai Cập vào năm 641 sau Cơng Nguyên trong quá trình chinh phục các miền đất của họ. Cây mía cũng được mở rộng phân bố bằng cách này đến Syria, Cyprus, Crete, và đến Tây Ban Nha vào khoảng những năm 714 sau cơng nguyên. Vào những năm 1150 ngành cơng nghiệp mía đường ở Tây Ban Nha rất phát triển với khoảng 30.000 ha mía được trồng. Vào khoảng năm 1420 người Bồ Đào Nha đã đưa cây mía đến Madeira nơi mà chúng ngay lập tức lan rộng sang các quần đảo Canary, Azores. Nhà máy xử lí mía hoạt động đầu tiên vào năm 1516 ở nước cộng hịa Dominica. Sản phẩm đường được đưa đến Cuba, Jamaica, Puerto Rico vào những năm cuối của thế kỷ 15 (Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía). 2.1.2. Phân loại Theo phân loại thực vật cây mía thuộc: Ngành: Spermatophyta Lớp: Monocotyledoneae Họ: Gramineae Loại: Saccharum Trong loại Saccharum cĩ năm lồi: - Lồi nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) - Lồi Trung Quốc (Saccharum sinence Roxb Emend. Jesw) - Lồi Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) 4 - Lồi hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) - Lồi hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround và Jesw) Cây mía thuộc họ Gramineae, giống Saccharum (S) là hỗn hợp của sáu lồi cỏ lưu năm thuộc giống Saccharum L., trong đĩ cĩ hai lồi hoang dại: S. spontaneum L. và S. robustum (Brvaes và Jeswiet ex Grassl), và 4 lồi cây trồng ở vườn: S. officinarum L., S. barberi Jeswiet, S. sinense Roxb., và S. edule Hassk . Bốn lồi cây trồng ở vườn cĩ sự lai giống phức tạp và luơn cĩ thể giao phấn chéo với nhau. Tất cả các loại giống mía thương mại được trồng hiện nay đều là các giống lai giữa các lồi này với nhau. 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố Cây mía được cho là cĩ nguồn gốc từ vùng nam Thái Bình Dương.  S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đơng và nam Châu Phi, từ suốt vùng Trung Đơng đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia, và từ suốt vùng Thái Bình Dương đến New Guinea.  Trung tâm xuất xứ của cây mía cĩ thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện giống S. robustum cĩ số lượng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sơng ở New Guinea và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.  S. officinarum cịn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất đai và khí hậu thuận lợi.  S. barberi cĩ thể cĩ nguồn gốc ở Ấn Độ.  S. sinense cĩ xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung Quốc và Triều Tiên.  S. edule là loại khơng thể sản xuất mùa màng như S. robustum và chỉ tìm thấy được ở New Guinea và các đảo kế cận. Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nước vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (Phan Gia Tân, 1990. Cây mía). 5 2.1.4. Nhân giống Để nhân giống mía người ta thường trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chưa trưởng thành cĩ thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân được cho là tốt nhất nếu được lấy từ đốt thứ ba từ dưới lên của cây mía vì chồi ở đốt này cịn non và ít bị khơ. Đoạn thân cĩ thể được trồng xiên theo một gĩc 450 hay cũng cĩ thể đặt nằm ngang luơn lên trên luống. Ước tính cần 12.500 - 20.000 đoạn thân để trồng hết 1 hecta. Mía là cây trồng quanh năm với thời gian từ 3 - 6 năm trước khi được đốn bỏ và trồng lại. Vụ đầu tiên được gọi là mía tơ và thường mất khoảng 9 - 24 tháng để cây trưởng thành, nĩ phụ thuộc vào vùng địa lý. Các vụ mía gốc mất khoảng 1 năm để trưởng thành và thường thì sau khoảng hai vụ mía gốc là người ta đã thay bằng các ruộng mía mới, điều này phụ thuộc vào năng suất và sự chậm suy tàn của giống. 2.1.5. Sản lƣợng Năng suất cao nhất của mía về chỉ số calories trên đơn vị diện tích là 10 tấn đường (sucrose) trên hecta ở Barbardos. Sản lượng cao nhất đạt được ở Hawaii là 22 tấn sucrose trên hecta, nhưng giống mía này cần đến 2 năm hay hơn mới cĩ thể đạt được trạng thái thành thục ở khu vực này. Sản lượng mía đã được cải thiện và gia tăng đáng kể trong suốt 100 năm qua nhờ quá trình cải tiến giống, đặc biệt là nhờ vào việc sử dụng phân bĩn, kiểm sốt được cơn trùng và các loại bệnh, cơ giới hĩa đồng ruộng và nhà máy, và việc tạo ra nhiều giống mới cho năng suất cao. 2.1.6. Chế biến và sử dụng Trước khi sản phẩm đường được làm ra lần đầu tiên ở Ấn Độ khoảng 1.000 năm trước Cơng Nguyên, nhờ vào việc đun sơi dịch chiết nước mía thì cây mía ban đầu được trồng chỉ nhằm mục đích làm thực phẩm mà thơi. Ngày nay cây mía được nhiều ngành cơng nghiệp sử dụng và là một trong những sản phẩm được sử dụng rộng rãi và cĩ giá trị của mỗi quốc gia. - Khoảng 1 tấn đường thơ cĩ thể thu được khi chế biến 8 - 9 tấn mía. Loại đường thơ màu nâu này cĩ thể được tinh chế thành đường trắng sạch hơn. - Cây mía được sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ khơng riêng gì việc sản xuất ra đường: 6  Mật đường là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đường, nĩ là chất lắng xuống khi khơng cịn khả năng kết tinh thành đường. Gần 2,7 % mật đường hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đường được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau: dùng để làm phân bĩn cho đất trồng mía, được vơ trùng và lên men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau như cồn vơ trùng, rượu rum, hay ethyl alcohol.  Sản phẩm cịn lại sau quá trình ép nước mía đĩ là bã mía được dùng như là nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đường, nĩ cịn đườc dùng để làm giấy, bìa cứng, bảng và tường bằng giấy ép cứng. 2.1.7. Vị trí kinh tế của cây mía Hiện nay ở nước ta mía là nguyên liệu duy nhất để chế biến ra đường, nên mía là một cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây thực phẩm. Đường là thức ăn lành tính dễ tiêu, giàu năng lượng. Một cân đường cung cấp năng lượng tương đương với 0,5 kg mỡ, 50 - 60 kg rau quả. Đường cung cấp 10 % nhu cầu năng lượng của cộng đồng. Trên thế giới năng lượng do đường cung cấp bằng 7 % năng lượng do các loại ngũ cốc cung cấp. Đường cĩ thị trường tiêu thụ ổn định do nhu cầu về đường trong nước ngày càng tăng cao. Đường lại là mặt hàng chế biến bằng cơng nghệ hiện đại nên chất lượng ổn định, dễ dàng đạt tiêu chuẩn quốc tế, cho nên nếu sản xuất nhiều sẽ xuất khẩu ra bất cứ nước nào trong khu vực. Vì vậy nên người trồng mía khơng cĩ gì lo ngại về thị trường tiêu thụ. Mía là cây xĩa đĩi giảm nghèo cho nơng dân trung du, miền núi, là cây cĩ hiệu quả kinh tế cao. Do mía là cây hàng năm, thích hợp với nhiều loại đất, bộ rễ bám sâu nên cĩ khả năng chịu hạn khá, cĩ thể trồng trên đất đồi và trung du miền núi. Vì mía cĩ khả năng lưu gốc tới vụ sau nên đỡ cơng và giống trồng. Mía là cây cĩ sản lượng cao (200 - 250 tấn sinh khối/1ha/năm). Nhờ những ưu thế trên mà cây mía trở thành cây làm giàu cho nhiều gia đình, nhiều khu vực như Thanh Hĩa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi, … 7 Mía là cây năng lượng cuối thế kỷ XX và về sau. Do nguồn nhiên liệu địa khai ngày càng cạn kiệt trong khi nhu cầu năng lượng trên thế giới càng tăng nên việc tìm ra một nguồn nguyên liệu thay thế cĩ ý nghĩa rất quan trọng. Nguồn năng lượng từ thực vật là hướng được nhiều quan tâm vì đây là nguồn năng lượng tái tạo được hàng năm khơng bao giờ cạn kiệt. Trong đĩ, cây mía được coi là cây năng lượng hàng đầu trong các loại thực vật cĩ thể sản xuất năng lượng lỏng. Từ một tấn mía cĩ thể sản xuất ra 35 - 50 lít cồn 960, cĩ thể dùng làm nhiên liệu cho động cơ. Ở Brazil từ lâu người ta đã sản xuất cồn từ mía để thay thế xăng chạy ơ tơ vận tải. Mía là cây kiêm dụng, ngồi đường, cellulose trong bã mía cĩ thể làm giấy, làm gỗ ép thay cho một phần gỗ rừng. Mía là cây ngắn ngày lại là cây đặc biệt cao sản nên rất cĩ nhiều triển vọng trong lĩnh vực này. Mía với thành phần hĩa học rất phong phú nên ngày càng được nhiều ngành cơng nghiệp quan tâm khai thác. Saccarose được ngành đường khai thác để sản xuất đường trắng. Cellulose được ngành giấy và ngành gỗ ép khai thác. Mật rỉ trong quá trình lên men, chưng cất và các phương pháp hĩa học khác cĩ thể sản xuất ra rượu các loại, cồn tinh khiết, acid lactic, acid nitric, acid glutamic, men thực phẩm, … 2.1.8. Sản xuất protein tái tổ hợp từ mía Việc sử dụng cây trồng như một nhà máy sinh học cĩ năng suất cao địi hỏi cả một hệ thống chuyển biến nạp và khả năng sản xuất, tích lũy ở mức độ cao các protein tái tổ hợp cĩ giá trị kinh tế cao. Wang và cộng sự (2001) đã tạo ra cây mía chuyển gene tạo ra protein dược liệu cĩ giá trị cao là granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM_CSF). Trên một vài dịng mía đã tạo ra tới 0,03 % protein tổng số giống GM-CSF. GM-CSF được sản xuất từ mía cĩ hoạt tính tự nhiên được chỉ ra trong thử nghiệm sự tăng sinh tế bào xương người. Dịch trích từ mía kích thích sự phân chia của tế bào tủy xương. 2.1.9. Bệnh trên cây mía Theo thống kê ở các nước trồng mía hiện nay thì cĩ tất cả 126 bệnh hại mía trên thế giới (Philippe Rott, 2000), trong đĩ cĩ 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại được gây ra bởi 8 nhĩm tác nhân chính cho ở Bảng 2.1. 8 Bệnh do nấm gây ra cĩ số lượng nhiều nhất cũng như là gây thiệt hại nhiều nhất như bệnh đốm vịng (Ring spot), bệnh mốc sương (Downy mildew) và bệnh than (Smut). Bảng 2.1: Thống kê nhĩm tác nhân gây bệnh và số lượng bệnh xảy ra trên cây mía. Nhĩm tác nhân gây bệnh Số lƣợng bệnh gây ra Bệnh do virus 9 Bệnh do phytoplasma 2 Bệnh do vi khuẩn 9 Bệnh do nấm 68 Tuyến trùng và chưa rõ tác nhân 24 Thực vật bán ký sinh 3 Dinh dưỡng, mơi trường 9 Ảnh hưởng của thuốc trừ cỏ 2 Tổng cộng 126 (Nguồn: Hà Đình Tuấn, 2004) 2.2. Bệnh than 2.2.1. Nguồn gốc và phân bố Bệnh được ghi nhận đầu tiên vào năm 1877 tại Natal bởi Mc Martin, bệnh cũng được báo cáo tại hiệp hội “Victoria Planters” Association vào năm 1982. Sau đĩ bệnh được báo cáo ở tất cả các nước trên thế giới. Bệnh gây thành dịch rất nghiêm trọng tại Cuba, Nhật và Mỹ. Tại Ấn Độ, bệnh gây thiệt hại trầm trọng cho mía vào những năm 1942 - 1943, hơn 66 % diện tích trồng mía của bang Bihar bị nhiễm bệnh. Các giống bị nhiễm nặng là Co419, Co740, Co975… Trong hơn 102 nước trồng mía trên thế giới bị bệnh than gây thiệt hại, chỉ trừ nước Úc và những hải đảo lân cận do cĩ khí hậu khơ và nĩng là ít bị nhiễm bệnh này (Vũ Triệu Mân, 2003). Ở nước ta bệnh than là một trong những bệnh nguy hiểm trên cây mía, cần phải cĩ những biện pháp kịp thời để hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra. 9 2.2.2. Triệu chứng Khi cây mía bị nấm xâm nhập, cây trở nên cịi cọc, biến dạng, mất khả năng tạo lĩng, ở gốc đẻ nhiều nhánh nhỏ, các mầm mới ra hầu hết đều nhiễm bệnh, thân mía nhỏ bé lại, từ ngọn đâm lên một roi than màu đen cong xuống, cĩ khi roi dài cả mét. Bên ngồi roi bao phủ một lớp mang đầy bào tử dạng bột, dễ bung ra, lan truyền theo giĩ, nước,…đi rất xa (Hình 2.1). Tính chất nguy hiểm của bệnh này là mỗi roi than mang hàng ngàn bào tử nấm, trung bình một roi than cĩ khoảng 5.000 triệu bào tử. Hình 2.1: Triệu chứng bệnh than trên mía (Comstock và Lentini, 2006). 2.2.3. Tác nhân gây bệnh Bệnh do nấm Ustilago scitaminea Sydow, họ Ustilaginaceae, bộ Ustilaginales, lớp Hemibasidiomycetes. Cơ quan sinh sản khơng cĩ quả thể, sợi nấm phát triển trong tồn thân cây và cĩ khi lan sang cả mầm thân cây. Sợi nấm hoạt động mạnh trong các tế bào non của cây, chúng phát triển giữa các tế bào và cĩ vịi hút. Đến giai đoạn hình thành cơ quan sinh sản, chúng tập trung lại thành một khối chặt ở lĩng thân cuối cùng. Các sợi nấm từng bước phân cắt theo chiều ngang và chiều dọc tạo thành các bào tử hậu (chlamydospore). Bào tử hậu là giai đoạn bắt buộc trong chu kỳ phát triển của nấm bệnh. Bào tử hậu cĩ dạng hình trịn, bề mặt vỏ bào tử gợn gai nhỏ hoặc nhẵn, màu sắc thay đổi từ nâu, nâu vàng, đen, chúng cĩ đường kính 6 – 11 μm, trung bình 8,6 μm. (Hình 2.2). Bào tử hậu nảy mầm trong điều kiện ấm và ẩm, hình thành đảm đa bào thường cĩ 3 - 4 tế bào và một số khơng ổn định, các bào tử đảm dài 25*3 μm sắp xếp thành từng 10 nhĩm 2 - 3 cái. Bào tử hậu hình thành từ các sợi nấm hai nhân, phân chia tế bào tạo thành một khối bột đen bao gồm tồn bào tử nấm. Khối bào tử này cĩ kích thước thay đổi từ 15 - 50 cm và dài hơn. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử nấm từ 21 – 30 0C, tối thiểu là 5 0C, tối đa là 40 0C. Tuy nhiên ở nhiệt độ 25 0C, nấm sinh sản rất nhiều bào tử, pH thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của nấm là 6,5 (Nguyễn Văn Tuất, 2002). Hình 2.2: Bào tử nấm (Wada, 1999). 2.2.4. Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh  Bệnh thường xâm nhiễm vào tế bào non của cây, ở mầm cây và ở cả ngay lát cắt đầu hom mía.  Bệnh lan truyền bằng bào tử theo giĩ, nước mưa, nước tưới, bào tử bám bên ngồi cơ thể cơn trùng, qua dụng cụ chăm sĩc, qua hom trồng và qua đất.  Bào tử cĩ khả năng tồn tại rất lâu trong đất, khi gặp điều kiện thuận lợi là phát triển gây hại và dễ dàng lây lan trong tự nhiên.  Một số giống nhập nội nhiễm bệnh than nặng là: F134 (Đài Loan), Co715 (Ấn Độ), NCO310 (Nam Phi), Việt đường 77-9 (của Trung Quốc lai tạo), Roc1 (Đài Loan) (Trần Văn Sỏi, 2003). 11 2.2.5. Thiệt hại về kinh tế Bệnh cĩ thể làm giảm năng suất đến trên 50 %, gây thiệt hại trong nhiều năm và ngày càng lan rộng nhanh chĩng ra diện tích xung quanh (Ferreira và Comstock, 1989). 2.2.6. Biện pháp phịng trừ  Chọn giống chống bệnh: F156, Ja60-5, MY55-14. Khơng trồng những giống mẫn cảm với bệnh trên những chân đất cĩ mang mầm bệnh.  Xử lý hom giống bằng nước nĩng 54 – 60 0C trong 2 giờ hoặc dung dịch bordeaux 1 %, dung dịch HgCl2 0,1 % trong 5 phút, dung dịch formon 1 %, để khơ ráo và ủ kín trong 2 giờ.  Biện pháp canh tác: Vệ sinh đồng ruộng, chuẩn bị đất kỹ trước khi trồng, giảm số lần để gốc, đối với mía để gốc cần phải vệ sinh, xử lý loại trừ mầm bệnh sau khi thu hoạch.  Trong quá trình chăm sĩc mía, cần kiểm tra đồng ruộng thường xuyên, khi phát hiện cây bị nhiễm bệnh, cần phải nhổ bỏ đem đốt hoặc chơn sâu, khơng để các bào tử nấm lây lan.  Áp dụng luân canh đất trồng mía với cây trồng khác (chủ yếu cây họ đậu) để làm giảm và loại trừ mầm bệnh đồng thời cải thiện độ màu cho đất.  Phịng trừ tốt sâu đục thân mía là biện pháp hữu hiệu vì từ vết đục của sâu tạo điều kiện cho nấm bệnh xâm nhập, phát triển.  Biện pháp hố học: cĩ thể dùng Score 250ND pha ở nồng độ 0,1 - 0,15 % phun phịng trừ bệnh (Phan Gia Tân, 1990). 2.3. Các phƣơng pháp xác định bệnh than 2.3.1. Dựa vào triệu chứng Cây mía cịi cọc, biến dạng, mất khả năng tạo lĩng, ở gốc đẻ nhiều nhánh nhỏ, các mầm mới ra hầu hết đều nhiễm bệnh, thân mía nhỏ bé lại, từ ngọn đâm lên một roi than màu đen cong xuống, cĩ khi roi dài cả mét. Bên ngồi roi bao phủ một lớp mang 12 đầy bào tử dạng bột, dễ bung ra, mỗi roi than mang hàng ngàn bào tử nấm, trung bình một roi than cĩ khoảng 5.000 triệu bào tử. 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đốn bằng cách nhuộm mắt mầm và soi dƣới kính hiển vi huỳnh quang (Shinha và ctv, 1982). Nhuộm mắt mầm với thuốc nhuộm Trypanblue (0,1 %) + Sodium hydroxide (6 %), hồ theo tỉ lệ 1:1. Hệ sợi nấm sẽ bắt màu với thuốc nhuộm nên cĩ màu xanh. Các bƣớc tiến hành  Gọt mỏng dần cho đến khi xuất hiện đỉnh sinh trưởng.  Bĩp nhẹ: Thu được đỉnh sinh trưởng bỏ vào nước cất.  Ngâm đỉnh sinh trưởng trong thuốc nhuộm 3,5 giờ.  Rửa qua nước cất.  Chuyển qua dung dịch cồn 80 % trong thời gian 2 phút.  Chuyển qua ống nghiệm thuỷ tinh chứa 1 ml Lactophenol, đun sơi 2 phút.  Soi ở độ phĩng đại 40 lần. 2.3.3. Phƣơng pháp ELISA Nguyên lý ELISA Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng: Kháng nguyên, kháng thể và cơ chất tạo màu, gồm hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể. - Phản ứng hĩa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phĩng oxi nguyên tử và chính oxi nguyên tử này oxy hĩa cơ chất tạo màu. Cơ chất tạo màu thay đổi màu chứng tỏ sự cĩ mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. 2.3.4. Phƣơng pháp PCR Giới thiệu sơ lƣợc về PCR Kỹ thuật PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuơn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuơn này 13 thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đốn bệnh, biện pháp cắt mầm bệnh trên người, vật nuơi và thực phẩm. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước như sau: Bước 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đơi tách ra thành dạng mạch đơn, thường là 94 0C – 95 0C trong vịng 30 giây – 4 phút. Bước 2 (bước lai, anealation): trong bước này, ở nhiệt độ nhỏ hơn Tm (nhiệt độ nĩng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 0C – 70 0C tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thước sản phẩm khuếch đại. Bước 3 (bước kéo dài, elongation): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuơn. Mạch mới được tạo thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72 0C. Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lập lại nhiều lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính tốn sau 30 đến 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm được nhuộm bởi Ethidium Bromide và cĩ thể quan sát thấy thơng qua việc điện di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sĩng 312 nm). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR DNA khuơn DNA khuơn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhưng đơi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thơng thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đốn. Lượng DNA khuơn dùng trong phản ứng PCR là một lượng thật nhỏ khoảng 1 µg, 14 ngồi ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao cịn cĩ thể giảm lượng DNA khuơn xuống cịn 100 ng. Nếu lượng DNA khuơn quá cao cĩ thể tạo ra những sản phẩm phụ khơng mong muốn hay cịn gọi là dương tính giả. Khuơn DNA cĩ thể được thu nhận từ các mẫu khơng được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong tế bào máu lâu ngày, tinh dịch đã khơ, hĩa thạch, tĩc, mĩng tay của người đã chết. Enzyme Thơng thường DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là men chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase tách chiết từ vi khuẩn suối nước nĩng Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại men polymerase chịu nhiệt khác đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hồn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase được tách từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thơng qua sự hình thành cDNA trong điều kiện cĩ RNA khuơn và ion Mg2+, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Primer và nhiệt độ Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau  Trình tự của primer được chọn sao cho khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuơi” và primer “ngược”, khơng cĩ những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.  “Nhiệt độ nĩng chảy” (Tm) của primer xuơi và primer ngược khơng được cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lập đi lập lại nhiều lần.  Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa hai primer xuơi và ngược khơng quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 15 Các thành phần khác trong phản ứng PCR  Bốn loại nucleotide (dNTP) thường được sử dụng ở nồng độ là 200 µM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.  Nồng độ Mg2+ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ MgCl2 càng cao càng làm giảm độ đặc hiệu của Taq DNA polymerase. Nồng độ tối ưu của ion này khơng tuân theo một quy luật chung, thơng thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng. Số lƣợng chu kỳ phản ứng Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thơng thường khơng vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đĩ hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng; sự xuất hiện những sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại; các bản sao vừa được tổng hợp khơng bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng cịn phụ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng  Thiết bị cho phản ứng PCR như máy PCR cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng.  Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là một loại cĩ vách mỏng và cĩ khả năng truyền nhiệt tốt. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR Phương pháp PCR cĩ nhiều ứng dụng rộng lớn kể cả trong lĩnh vực nghiên cứu và đời sống. Dưới đây là một số ứng dụng tiêu biểu của phương pháp này: 16 Trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học, kỹ thuật PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, dịng hố gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen. Trong đời sống, kỹ thuật PCR nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm từ một lượng khuơn DNA rất nhỏ. Người ta cĩ thể lấy một lượng nhỏ DNA khuơn từ một giọt máu, một sợi tĩc và sử dụng kỹ thuật PCR để tạo ra hàng triệu bản sao DNA mong muốn nhằm phục vụ cho các khảo sát trong pháp y, trong điều tra hoặc tính di truyền. Trong khi đĩ với một lượng DNA nhỏ như vậy thì khơng thể sử dụng trong pháp y hoặc di truyền nếu khơng sử dụng PCR. Do vậy, ưu điểm của cơng cụ PCR là khả năng khuếch đại chính xác một trình tự DNA mong muốn với một lượng lớn. Hiện nay, phương pháp PCR cịn được sử dụng trong phát hiện các virus, vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật cũng như việc kiểm nghiệm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, trong nước. Sử dụng phƣơng pháp PCR tổng hợp mẫu dị cho các thử nghiệm S1 nuclease Phương pháp S1 nuclease dựa trên sự lai của mẫu dị DNA mạch đơn với RNA, tiếp theo hỗn hợp lai được xử lý với enzyme S1 nuclease để phân cắt các RNA mạch đơn khơng bắt cặp với mẫu dị. Cuối cùng phương pháp lai sẽ được phát hiện bằng phương pháp phĩng xạ dị tự ghi hay đo mật độ quang. Thử nghiệm S1 nuclease cĩ ưu điểm là độ nhạy cao, cho kết quả nhanh hơn Northern blot. Các mẫu dị DNA cho phương pháp này được tổng hợp đơn giản bằng phương pháp PCR. Sử dụng PCR để sàng lọc Sàng lọc các gen trong thƣ viện gen Việc phân lập một dịng từ thư viện bộ gen hay cDNA được thực hiện bằng phương pháp lai đĩa và màng lọc (plating and filter hybridization) lặp lại nhiều lần. Tuy nhiên, phương pháp này khơng chỉ tốn thời gian và nhân lực mà cịn khơng chính xác như cho dương tính giả trong lai màng lọc. Các vấn đề này cĩ thể khắc phục khi sử dụng PCR ở những lần sàng lọc đầu tiên trước khi lai bằng màng lọc. Việc sàng lọc bằng PCR cĩ những thuận lợi sau: 17 Các dịng dương tính được xác định dựa vào các vạch cĩ kích thước chính xác trên gel, do đĩ loại bỏ được những điểm dương tính giả của lai bằng màng lọc. Tiết kiệm thời gian. Sàng lọc chuột chuyển gen Hiện nay, việc sản xuất chuột chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm trực tiếp các DNA vào phơi chuột là một kỹ thuật chuẩn dành cho phân tích phân tử và phát triển. Phương pháp truyền thống dùng sàng lọc chuột chuyển gen là Southern blot dùng mẫu dị đánh dấu bắt đặc hiệu với các DNA đã tiêm vào chuột. Tuy nhiên phương pháp này địi hỏi lượng mẫu lớn, tinh sạch (mẫu mơ) và tốn nhiều thời gian (ít nhất 5 ngày). Trong khi đĩ phương pháp PCR cho kết quả nhanh (vài giờ) và chỉ cần lượng mẫu ít do đĩ ít làm tổn thương chuột chuyển gen nhất là với chuột non. Sử dụng PCR cho việc thiết kế nhanh các gene tổng hợp Thơng thường các gen của tế bào eukaryote biểu hiện kém trong các hệ thống biểu hiện ở vi khuẩn (prokaryote). Một nguyên nhân gây ra sự biểu hiện kém này là do các codon trên bộ gen của tế bào eukaryote khơng được “ưa thích” ở tế bào vi khuẩn. Do đĩ người ta thiết kế một gen tổng hợp được dùng để biểu hiện protein của eukaryote mà nĩ cĩ mang các codon “ưa thích” ở vi sinh vật. Điều này được thực hiện nhanh chĩng bằng PCR hai bước (two - step PCR).Trong phương pháp này, cần biết trước trình tự gen cần tổng hợp, tổng hợp các cặp mồi cĩ trình tự tương ứng với gen cần tổng hợp và cĩ khả năng bắt cặp với nhau trong khoảng từ 20 nucleotide. Hai phản ứng PCR được thực hiện liên tiếp, phản ứng thứ nhất tạo ra DNA bản mẫu đúng với gen tổng hợp mà sau đĩ được khuếch đại trong phản ứng thứ hai. Phương pháp này là một cơng cụ rất hữu ích cho việc thao tác trên nucleottide acid và thiết kế các gen tổng hợp. Sử dụng PCR trong việc kiểm nghiệm Hiện nay, cĩ nhiều ứng dụng của phản ứng PCR trong các bộ kit thương mại dùng để phát hiện đặc hiệu các chủng vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, bệnh phẩm hoặc những lồi khĩ nuơi cấy. 18 Trong kiểm nghiệm bệnh phẩm Bằng phản ứng PCR, cĩ thể phát hiện virus, vi khuẩn gây bệnh cho người và vật nuơi. Gen đặc trưng của virus hoặc vi khuẩn gây bệnh được khuếch đại, sau khi khuếch đại được một lượng lớn gen đặc trưng, kiểm tra khuếch đại bằng điện di trên gel agarose, rút ra kết quả cĩ hoặc khơng cĩ nhiễm virus hoặc vi khuẩn gây bệnh trên mẫu bệnh phẩm cần kiểm tra. Trong kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm, nƣớc Việc phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, nước bằng phương pháp PCR cũng tương tự như việc phát hiện virus và vi sinh vật gây bệnh trên bệnh phẩm. Nhưng đơi khi cần phải qua bước nuơi cấy tăng sinh chọn lọc vi sinh vật cần phát hiện trước khi tách chiết DNA để thực hiện cho phản ứng PCR. Sau khi nuơi cấy tăng sinh, tiến hành thu tế bào vi sinh vật từ dịch tăng sinh để tách chiết DNA làm khuơn cho phản ứng PCR. Phương pháp này rất đơn giản, dễ thao tác, cĩ thể thực hiện được những vi sinh vật khĩ nuơi cấy, ít tốn kém về mặt nhân sự, chi phí thấp, độ chính xác và độ nhạy cao và một ưu điểm lớn nhất đĩ là cho kết quả trong thời gian ngắn. Định lƣợng bằng phƣơng pháp PCR PCR thường được sử dụng để nghiên cứu các trình tự (DNA hay RNA) cĩ số lượng bản sao thấp, khơng thể định lượng bằng các phương pháp lai phân tử cổ điển. Về nguyên tắc người ta cĩ thể xác định số lượng bản mẫu ban đầu qua tính tốn dựa vào sản phẩm cuối cùng, số chu kỳ đã thực hiện, nhưng trong thực tế người ta chỉ cĩ thể định lượng tương đối một trình tự đích, tức so sánh hàm lượng của nĩ trong nhiều nguồn khác nhau, ví dụ như khi muốn so sánh mức độ biểu hiện của gen THR (Thyroid Hormone Redeptor ) vốn là một gen cĩ biểu hiện rất yếu trong các loại mơ khác nhau. Trong thực nghiệm, người ta tiến hành khuếch đại đồng thời trình tự đích và một trình tự đối chứng cĩ nồng độ đã biết. Trình tự đích và một lượng xác định trình tự đối chứng được khuếch đại trong cùng một ống nghiệm, tốt nhất là với cùng một cặp mồi. Điều đĩ cĩ nghĩa là hai trình tự phải cĩ hai đầu nơi bắt cặp với mồi giống nhau nhưng phần trung tâm cĩ độ dài khác nhau (do sự gắn thêm vào hay cắt bớt đi một đoạn trên trình tự đối chứng). Như vậy, sau phản ứng, người ta cĩ thể phân biệt 19 hai trình tự này dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di. Nếu sản phẩm khuếch đại của trình tự đối chứng khơng thay đổi trong các phản ứng (chứng tỏ hiệu quả khuếch đại là như nhau trong tất cả các phản ứng) thì người ta cĩ thể so sánh hàm lượng sản phẩm của trình tự đích, từ đĩ so sánh được số lượng bản mẫu ban đầu. Điều quan trọng là số chu kỳ khuếch đại khơng được vượt quá giai đoạn đầu của phản ứng PCR khi mà số lượng bản sao cịn tỷ lệ thuận với số lượng mẫu ban đầu. Một số ứng dụng khác của kỹ thuật PCR Ở các nước phát triển, PCR đã được sử dụng rộng rãi như cơng cụ chẩn đốn trong y học để phát hiện những bệnh di truyền, được sử dụng trong điều tra tội phạm để xác định những người bị tình nghi ở cấp độ phân tử, được sử dụng trong xác định quan hệ huyết thống và là một cơng cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen người. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta cĩ khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên ta khơng thể quên rằng phương pháp này cĩ nhiều mặt hạn chế và địi hỏi sự thận trọng đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Cĩ thể kể ba vấn đề lớn khi sử dụng PCR: Trong thực nghiệm, kích thƣớc của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR khơng hoạt động được với những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực nghiệm. Sự ngoại nhiễm là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao của phƣơng pháp này Vấn đề đặt biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đốn, dự phịng vì hậu quả cĩ thể rất nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các 20 ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng khơng gian của phịng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thốt ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong khơng khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ, rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đĩ. Cĩ thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện pháp sau:  Các cơng đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau.  Dụng cụ dùng để thiết lặp phản ứng (micropipette) khơng sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải cĩ lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.  Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử cịn lại từ các lần khuếch đại trước.  Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính tốn sao cho đủ 1,2 lần thao tác.  Ngồi ra, các hãng sản xuất cịn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ hồn tồn sự ngoại nhiễm. Ví dụ hãng Perkin-Elemer-Cetus đề xuất sử dụng dUTP thay vì dTTP; việc thay thế này khơng ảnh hưởng đến phản ứng. Trước mỗi lần phản ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracylglycosylase; enzyme sẽ phân hủy tất cả các DNA cĩ mang dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời enzyme sẽ bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. Bất lợi của hệ thống này là giá thành cao. Các sai sĩt gây ra do Taq polymerase Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (cứ 10.000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998)). Đặc tính này khơng nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự cĩ mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng cĩ ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta khơng thể loại bỏ hồn tồn các sai sĩt này mà chỉ cĩ thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). 21 2.4. Tình hình nghiên cứu bệnh than 2.4.1. Trên thế giới:  Tạo tính kháng của mía bằng cách nhiễm với Ustilago scitaminea (Burner; Grisham và Legendre, 1993).  Biện pháp quản lý sự xâm nhập bệnh than vào Australia (Croft và Braithwaite, 2006).  Bệnh than trên mía (Comstock và Lentini, 2006).  Đánh giá tính mẫn cảm bệnh than trong ống nghiệm (Singh và ctv., 2005).  Tính đa dạng di truyền của Ustilago scitaminea ở lục địa Trung Quốc (Xu; Que và ctv., 2004).  Phương pháp chẩn đốn bệnh than (Muđiz; Martínez và ctv., 2004).  Sự biến đổi di truyền của Ustilago scitaminea (Braithwaite; Bakkeren và ctv., 2004).  Khống chế bệnh than ở Nigeria bằng thuốc diệt nấm (Wada, 2003).  Lồi mới của bệnh than ở Maui (Schenck, 2003).  Giảm năng suất ở những giống cĩ tính kháng bệnh than khác nhau (Kumar; Misra và ctv., 2003).  Bước đầu nghiên cứu tác động của chất điều hồ sinh trưởng trên mía nhiễm bệnh than (Péros, 2002).  Xác định sớm sự nhiễm bệnh than bằng kỹ thuật ELISA (Naik; Jayaraj, 2002).  Hình thái và đặc tính của các giống mía mẫn cảm và kháng với bệnh than (Da Gloria, 2000).  Đánh giá 5 thuốc diệt nấm khác nhau trong việc khống chế bệnh than ở Iran (Sharififar và Kazemi, 1999).  Nhuộm mơ, một phương pháp hiệu quả để chẩn đốn bệnh than (Nallathambi; Padmanaban và ctv., 1998). 22  Tác động của bệnh than lên năng suất mía (Natarajan và Kalaimani, 1996).  Cấu trúc, hình thái của mắt mầm với mức độ kháng khác nhau đối với bệnh than (Da Gloria; Albernas, 1995).  Đánh giá một vài thuốc diệt nấm mới trong việc khống chế bệnh than (Olufolaji, 1993).  Khống chế bệnh than bằng phương pháp vật lý và hố học (Vala; Joshi và ctv., 1992).  Tác động của nước nĩng và thuốc diệt nấm trong khống chế bệnh than (Elrasoul; Mohamed và ctv., 1991).  Cơ chế kháng bệnh than ở mía (Padmanaban; Alexander, 1988).  Bệnh than, so sánh sự nhiễm tự nhiên và nhiễm nhân tạo (Comstock; Wu và ctv., 1987).  Sự phát tán bào tử của nấm Ustilago scitaminea (Sreeramulu và Vittal, 1972).  Theo Wada (2003), các thuốc sau đây cĩ tác dụng chống lại nấm Ustilago scitaminea: Mancozeb, carbendazim + maneb, metalaxyl + carboxin + furathiocarb, pyroquilon, benomyl và chlorothalonil. Tuy nhiên kiểm sốt tốt nhất lần lượt là pyroquilon, carbendazim + maneb, metalaxyl + carboxin + furathiocarb.  Theo Shingte và More (1982), Kiểm sốt bệnh than với hỗn hợp thuốc diệt nấm Bavistin và Bayleton. Dùng nước nĩng 50 0C + 0,1 % Bavistin [carbendazim] hoặc + 0,1 % Bayleton [triadimefon] ngâm trong 2 giờ giúp khống chế 100 % bệnh than và kết quả là năng suất mía tăng 24,627 tấn/ha. Khi chỉ dùng với nước nĩng thì năng suất chỉ 11 tấn/ha.  Theo Schenck (2003), xuất hiện nịi gây bệnh than mới ở Hawaii, giống mía H78-7750 là giống kháng và chưa bao giờ nhiễm với bệnh than. Tuy nhiên, năm 2001 nhiều cánh đồng mía ở Hawaii đã xuất hiện bệnh than trên giống này, giống này nhiễm với nịi mới nhưng vẫn cịn kháng với nịi nấm than cũ. 23 Ustilago scitaminea sẵn sàng lai giữa các nịi, ngay cả giữa các lồi để tạo nên nịi mới. Tính mẫn cảm của các giống mía ở Hawaii đối với nịi mới (Bảng 2.2). Bảng 2.2: Tỉ lệ nhiễm bệnh than của các giống mía ở Hawaii đối với nịi mới. 2.4.2. Trong nƣớc Theo nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004), thì tỉ lệ nhiễm bệnh than phát sinh và phát triển tăng theo các giai đoạn sinh trưởng của cây mía. Một số giống ngồi sản xuất biểu hiện triệu chứng với tỉ lệ bụi bị bệnh khá cao như giống ROC16 (11,38 %), F156 (2,93 %). Đặc biệt giống ROC10 khơng xuất hiện triệu chứng ngồi đồng nhưng qua kiểm tra xuất hiện 4,0 % mẫu cĩ tác nhân gây bệnh tiềm ẩn bên trong mắt mầm. Năng suất trên các giống chủng bệnh than thấp hơn đối chứng từ 1,8 – 30,19 %, sự khác biệt về năng suất là do các giống chủng bệnh than cĩ mật độ cây hữu hiệu thấp hơn đối chứng mặc dù đường kính thân và trọng lượng cây khơng khác biệt. So sánh hiệu quả một số biện pháp xử lý hom giống phịng trừ bệnh than hại mía (Đỗ Ngọc Diệp và ctv., 2000). Đánh giá khả năng kháng bệnh than trên một số giống mía cĩ triển vọng (Nguyễn Văn Hoan, 1999). Giống mía % nhiễm Mía gốc Mía tơ H65-7052 15,9 7,7 H77-4643 7,7 7,7 H78-3567 0 0 H78-4153 7,1 7,1 H78-7750 9,0 27,3 H83-7061 33,3 16,7 H87-4319 0 0 H87-5794 0 0 H88-2953 27,3 27,3 H90-7492 0 0 24 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm cĩ 2 nội dung chính:  Nuơi cấy, phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea.  Xây dựng qui trình PCR phát hiện trực tiếp DNA sợi nấm Ustilago scitaminea gây bệnh than trên mía. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu  Đề tài được thực hiện từ tháng 05 đến tháng 08 năm 2007.  Địa điểm thực hiện: Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Mơi trường, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 11 dịng nấm Ustilago scitaminea thu thập được từ 11 giống mía khác nhau ở tỉnh Bình Dương, đĩ là các giống: Comus, F156, H39 – 3633, Ja60 – 5, K84 – 200, My55 – 14, VĐ86 – 368, R570, ROC10, ROC16, VN84 – 4137. 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Dùng kéo cắt các roi than từ mía bệnh cho vào bịch nhựa vơ trùng, ghi tên giống mía lên bịch, rồi đặt vào thùng xốp giữ lạnh, đem về trữ ở Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố Sinh thuộc Viện Nghiên cứu Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Mơi trường, Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 25 3.4.2. Phƣơng pháp phân lập Dụng cụ: Bình tam giác, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, kẹp, cân, ống đong, giấy thấm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, bút lơng, máy đo pH… Hố chất: Mơi trường PGA cĩ bổ sung (PGA*) (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Thành phần mơi trường PGA*. Thành phần Mơi trường PGA* Khoai tây 200 g Glucose 20 g CaCO3 3 g Streptomycin sulfate 0,5 g Agar 20 g Nước cất Vừa đủ 1 lít Cách pha mơi trƣờng PGA*: Khoai tây đã được gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200 g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất đun sơi trong 20 phút, lọc lấy nước trong cho vào bình tam giác, thêm 20 g agar, 3 g CaCO3, bổ sung nước cất cho đủ 1 lít, chuẩn pH 7,2, đem hấp khử trùng ở 121 0 C/ 15 phút, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 60 0C cho vào 0,5 g Streptomycin sulfate lắc nhẹ đều, sau đĩ phân vào mỗi đĩa pertri vơ trùng 15 ml mơi trường. Phƣơng pháp phân lập: Lấy bào tử nấm từ các roi than, rửa chúng 3 lần trong nước vơ trùng chứa 500 ppm streptomycin sulfate, cho bào tử vào nước vơ trùng, dùng que cấy lấy bào tử, cấy ria lên đĩa mơi trường PGA*, đem ủ ở nhiệt độ 28 0C trong thời gian 24 giờ, sau đĩ cấy khuẩn lạc sang mơi trường mới và tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. 3.4.3. Phƣơng pháp tách đơn bào tử Dụng cụ: kim mũi mác, đèn cồn, pipette, lame, kính hiển vi, tủ ủ, giấy thấm, bút lơng, máy đo pH... Sau khi phân lập được dịng nấm Ustilago scitaminea thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: 26  Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm.  Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng.  Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame cĩ trải một lớp mỏng agar.  Ủ ở nhiệt độ phịng 12 giờ.  Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng lẻ và mọc tách riêng lẻ. Đánh dấu, sau đĩ tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa mơi trường PGA*.  Đem ủ ở nhiệt độ phịng 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc. 3.4.4. Phƣơng pháp nhân sinh khối nấm Dụng cụ: kim mũi mác, nồi hấp, bình tam giác, máy lắc, vải lọc, đèn cồn, tủ lạnh - 20 0 C. Hĩa chất: chuẩn bị mơi trường PGA* lỏng, cách pha giống với mơi trường PGA* nhưng khơng bỏ agar. Sau khi thu được khuẩn lạc ta tiến hành nhân sinh khối trong mơi trường PGA* lỏng, nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vịng/phút, ở 28 0C). Sau 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên vải lọc tiệt trùng. Sau đĩ làm khơ sinh khối, giữ ở nhiệt độ -20 0C. 3.4.5. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea Các dụng cụ và thiết bị dùng để ly trích DNA  Epffendorf 1,5 ml.  Micropipette các loại.  Bồn ủ nhiệt (water bath).  Máy vortex.  Máy ly tâm lạnh.  Tủ 4 0C và -20 0C  Cối và chày để nghiền mẫu  Đầu típ các loại  Giấy bạc  Găng tay 27 Các hố chất đƣợc sử dụng để ly trích DNA  Nitơ lỏng.  Lysis buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 50 mM EDTA, 3 % SDS, 1 % β_mercaptoethanol.  Hỗn hợp: phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1).  Hỗn hợp: chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1).  Isopropanol 100 %.  Ethanol 70 %.  TE 1X: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. Phƣơng pháp ly trích: DNA nấm được ly trích theo phương pháp của Lee và Taylor (1990). Quy trình cụ thể:  Lấy 1 g sợi nấm khơ kiệt nghiền trong nitơ lỏng.  Chuyển bột nghiền vào eppendorf 1,5 ml.  Thêm 400 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ở 65 0C trong 1giờ. Di chuyển eppendorf ra khỏi bồn ổn nhiệt.  Thêm 300 l phenol : chlorophorm : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) lắc nhẹ.  Ly tâm 14.000 vịng trong 1 phút ở nhiệt độ 28 0C.  Chuyển dịch nổi (khoảng 500 l) vào eppendorf mới.  Thêm vào 300 l chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) lắc nhẹ.  Ly tâm 14.000 vịng trong 1 phút ở nhiệt độ 28 0C.  Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.  Kết tủa DNA bằng cách thêm vào một phần hai thể tích isopropanol, trộn nhẹ.  Ly tâm 14.000 vịng trong 1 phút ở 4 0C.  Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần.  Làm khơ DNA, hịa tan trong 50 l dung dịch TE 1X và tồn trữ ở -20 0C. 28 Kiểm tra chất lƣợng DNA: Yêu cầu DNA được tách chiết cĩ chất lượng tốt (tương đối sạch và khơng bị gãy nhiều). Định tính DNA bằng phương pháp điện di. Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (cĩ bị gãy nhiều hay khơng, cĩ tạp khơng,.v.v.).Tuy nhiên khơng cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Quá trình điện di kiểm tra chất lượng được thực hiện như sau:  Chuẩn bị gel agrose 0,8 %.  Dùng 4 l mẫu DNA trộn đều với 2 l loading dye, cho vào giếng gel.  Điện di ở hiệu điện thế 100 V, cường độ dịng điện 400 mA, trong 20 phút.  Nhuộm Ethidium Bromide 15 phút. Chụp ảnh.  Dựa trên băng hình DNA đánh giá chất lượng.  Pha dung dịch DNA bằng TE. Định lượng DNA bằng quang phổ kế:  Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA cĩ trong mẫu kết quả thu được.  Hàm lượng DNA được tính theo cơng thức: DNA (ng/μl) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * Độ pha lỗng Gồm hai bước:  Xây dựng đường chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đường chuẩn.  Pha lỗng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thường pha lỗng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 10 μl dung dịch DNA hịa tan với 990 μl TE 1X. Cho vào Curvette. Tiến hành đo OD. DNA sau khi tách chiết và kiểm tra định tính, định lượng sẽ được bảo quản ở -20 0C. 3.4.6. Tinh sạch sản phẩm ly trích Sản phẩm DNA tổng số được ly trích cĩ nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như protein khử khơng hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy.v.v., sẽ được tinh sạch trước khi đem phản ứng PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện như sau: 29 Bước 1: Pha lỗng mẫu ly trích, 100 l DNA mẫu với 200 l TE 1X. Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 200 l phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) lắc nhẹ. Bước 3: Đem ly tâm hỗn hợp ở 12.000 vịng, trong thời gian 1 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác. Bước 2 và 3 được thực hiện lại một lần nữa. Bước 4: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 600 l ethanol 100 % và 20 l sodium acetate ủ ở -20 0C, trong 20 phút. Bước 5: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vịng, trong thời gian 1 phút. Bước 6: Loại bỏ dịch nổi. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần. Làm khơ DNA, hịa tan trong 50 l dung dịch TE 1X và tồn trữ ở -20 0C. 3.4.7. Phƣơng pháp PCR phát hiện nấm Ustilago scitaminea Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf các loại. Micropippette và đầu típ các loại. Máy luân nhiệt Hĩa chất thí nghiệm: PCR phát hiện dựa vào cặp mồi và quy trình của Albert và Schenck (1996), gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.2. Cặp mồi đƣợc sử dụng là: bE4: (5’– CGC TCT GGT TCA TCA ACG – 3’) bE8: (5’– TGC TGT CGA TGG AAG GTG T – 3’)  Sản phẩm PCR sau phản ứng được điện di trên gel agarose 1 %, trong dung dịch đệm TAE 1X, hiệu điện thế là 90 V, cường độ dịng điện là 250 mA, trong 20 phút.  Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuếch đại chuyên biệt vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea trên gel điện di cĩ kích thước là 442 bp. 30 Bảng 3.2: Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt Điện di và đọc kết quả PCR trên gel agarose Các hĩa chất được sử dụng để điện di và đọc kết quả: - Agarose - TAE 0,5X - Loading dye 6X - Ethidium bromide Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng để điện di và đọc kết quả: - Cân kĩ thuật 4 số - Lị viba - Khay đổ gel - Bồn và máy điện di - Giấy parafin - Máy chụp hình gel - Ống đong Hĩa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích/ phản ứng (μl) Chu kỳ nhiệt Buffer MgCl2 dNTPs Primer F Primer R Taq DNA polymerase DNA mẫu H2O 5 X 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 10 pmol/μl 5 U/μl 1 X 2,5 mM 0,2 mM 1 pmol/μl 1 pmol/μl 2,5 U 20ng 10 5 1 5 5 0,5 1 22,5 Khởi động: 940C – 3 phút. 94 0 C – 30 giây 52 0 C – 30 giây 30 chu kỳ 72 0 C – 30 giây Kết thúc: 720C – 3 phút. Tổng thể tích 50 μl 31 Phương pháp đổ gel agarose điện di: Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1 % (Cho 0,125 g agarose vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X, đun sơi hỗn hợp trên khoảng hai phút trong lị viba). Bước 2: Làm nguội agarose đã được nấu chín đến 60 0C, sau đĩ đổ vào khuơn đã được đặt lược vào trước. Bước 3: Lấy lược ra, cho gel vào bồn điện di. Bước 4: Hút 2 µl loading dye trộn với 4 µl mẫu. Bước 5: Bơm vào các giếng một cách cẩn thận 4 µl mẫu + dung dịch đệm. Bước 6: Chạy điện di ở ở hiệu điện thế 90 V/20 phút, cho đến khi thuốc nhuộm cách đầu tận cùng của gel là 1 cm. Bước 7: Lấy gel ra và ngâm vào dung dịch ethidium bromide (0,5 µg/ml) trong 20 phút. Bước 8: Rửa nhẹ gel dưới vịi nước chuyên dụng. Bước 9: Đọc kết quả dưới tia UV. Bước 10: Chụp bản gel để lưu lại kết quả. 32 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập, tách đơn bào tử và nhân sinh khối nấm Ustilago scitaminea 4.1.1. Kết quả phân lập Sau khi thu được các mẫu bệnh từ 11 giống mía khác nhau, chúng tơi đã tiến hành phân lập nấm trên mơi trường PGA*, chọn những khuẩn lạc đặc trưng như màu nâu xám, hình dạng khuẩn lạc là tập hợp những vịng trịn đồng tâm, cấy chuyền nhiều lần. Sau 5 ngày nuơi cấy thì chúng tơi thấy xuất hiện những vết nứt từ tâm khuẩn lạc thẳng ra ngồi (Hình 4.1). Theo chúng tơi thì những vết nứt này là do mơi trường bị mất nhiều nước do ủ ở nhiệt độ 30 0C làm cho mơi trường bị khơ. Những ngày đầu sự tăng trưởng về đường kính của khuẩn lạc rất chậm và sau 7 ngày nuơi cấy thì khuẩn lạc lan ra hết đường kính đĩa petri (Hình 4.2). Hình 4.1: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 5 ngày nuơi cấy. 33 Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm Ustilago scitaminea sau 7 ngày nuơi cấy. 4.1.2. Kết quả tách đơn bào tử Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tơi đã tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử của nấm Ustilago scitaminea cĩ kích thước lớn nên cĩ thể quan sát và tiến hành tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học (Hình 4.3 và Hình 4.4). Hình 4.3: Bào tử nấm Ustilago scitaminea (Gupta, 2006). 34 Hình 4.4: Bào tử nấm nảy mầm trên mơi trường agar soi dưới kính hiển vi ở vật kính x 40. Kết quả: Chúng tơi đã tách đơn bào tử được 11 dịng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác nhau (Bảng 4.1). Bảng 4.1: Các dịng nấm được tách đơn bào tử. Dịng nấm được mã hĩa Tên các giống mía Us1 Comus Us2 F 156 Us3 H 39 - 3633 Us4 Ja 60 - 5 Us5 K 84 – 200 Us6 My 55 – 14 Us7 VĐ 86 – 368 Us8 R 570 Us9 ROC 10 Us10 ROC 16 Us11 VN 84 – 4137 4.1.3. Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Tiến hành chuyển sinh khối sợi nấm từ đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các 35 bình tam giác này chứa mơi trường PGA* lỏng và được lắc ở 160 vịng/phút, ở nhiệt độ 28 0C. Sau 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5). Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khĩ phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo khơng bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát dịch lỏng trên kính hiểu vi quang học để kiểm tra sự cĩ mặt của vi khuẩn (chỉ là phương pháp tương đối). Thơng thường, mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. Kết quả nhân sinh khối được thể hiện ở Bảng 4.2. Bảng 4.2: Khối lượng sợi nấm sau 4 ngày lắc trong mơi trường PGA* lỏng. Dịng nấm Nguồn Khối lượng (g) Us1 Comus 3,24 Us2 F 156 2,86 Us3 H 39 – 3633 2,57 Us4 Ja 60 – 5 3,31 Us5 K 84 – 200 2,87 Us6 My 55 – 14 2,64 Us7 VĐ 86 – 368 2,14 Us8 R 570 3,02 Us9 ROC 10 2,43 Us10 ROC 16 2,53 Us11 VN 84 – 4137 2,65 36 Nhận xét: Qua Bảng 4.2 cho thấy tất cả các dịng nấm thí nghiệm đều cĩ khả năng tạo sợi nấm trong mơi trường PGA* lỏng. Dịng nấm Us4 cho sinh khối cao nhất với khối lượng là 3,31 g. Dịng nấm Us7 cho sinh khối thấp nhất với khối lượng là 2,14 g. 4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm 4.2.1. Kết quả ly trích Các dịng nấm Ustilago scitaminea sau khi nhân sinh khối sẽ thu nhận sợi nấm và tiến hành li trích DNA tổng số. DNA của sợi nấm được li trích theo qui trình của Lee và Taylor (1990). DNA tổng số được kiểm tra chất lượng bằng cách điện di trên gel agarose 0,8 %.Kết quả li trích DNA tổng số được thể hiện ở Hình 4.6. Hình 4.6: Kết quả li trích DNA của 11 dịng nấm. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 Kết quả ly trích cho thấy DNA tổng số khơng tinh sạch hồn tồn. Ngồi DNA tổng số cịn cĩ thêm những đoạn DNA bị đứt gãy, RNA và protein mà quá trình ly trích khơng thể loại bỏ được. DNA tổng số 37 Nguyên nhân tạo ra những sản phẩm tạp là do  Quá trình nghiền chưa tốt hoặc do hĩa chất như phenol, chloroform.  Thời gian cho phenol để phá hủy lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu như thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lượng rất đáng kể.  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chưa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol. - Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy - Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều. 4.2.2. Kết quả tinh sạch Để phản ứng PCR được tối ưu thì sản phẩm DNA li trích cần phải tương đối sạch các tạp chất. Khi DNA khuơn cịn lẫn protein, DNA gãy, hiệu quả của phản ứng PCR giảm tỉ lệ thuận với độ tinh sạch của DNA khuơn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Vì vậy, để cĩ DNA khuơn tốt hơn, chúng tơi đã tiến hành tinh sạch DNA tổng số. Kết quả tinh sạch được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8 % (Hình 4.7) Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 DNA tổng số 38 Sau khi tiến hành tinh sạch, chúng tơi đã thu được DNA tổng số tương đối tốt, lượng tạp nhiễm giảm đi rất nhiều. DNA tổng số thu được từ qui trình tinh sạch này sẽ được sử dụng để làm khuơn cho phản ứng PCR. Pha lỗng DNA tổng số Khi dùng để khuếch đại vùng mục tiêu từ DNA tổng số bằng phản ứng PCR, lượng DNA được sử dụng thường khoảng từ 10 – 100 ng cho một phản ứng. Nếu lượng DNA sử dụng quá ít thì sẽ khơng đủ số lượng khuơn DNA cho quá trình tổng hợp. Kết quả là sản phẩm PCR rất ít khơng đủ số lượng mong muốn. Cịn nếu số lượng DNA khuơn quá nhiều thì sẽ tạo ra nhiều sản phẩm phụ khơng mong muốn (Khuất Hữu Thanh, 2003). Nhưng DNA tổng số li trích được cĩ hàm lượng rất lớn. Vì vậy, trước khi thực hiện phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành pha lỗng DNA gốc trong TE 1X. Tùy vào lượng DNA tổng số mà các mẫu được pha lỗng theo các nồng độ khác nhau. DNA khuơn mẫu sau khi pha lỗng được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 % và ghi nhận hình ảnh điện di thơng qua máy chụp DNA bằng phần mềm Gel doc (Hình 4.8). Hình 4.8: DNA tổng số sau khi pha lỗng. Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 DNA tổng số 39 4.3. Phát hiện DNA của Ustilago scitaminea bằng kỹ thuật PCR Sử dụng 2 primer bE4 và bE8 do Albert, H. H. và Schenck, S. (1996) thiết kế cho vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea, sản phẩm khuếch đại cĩ kích thước khoảng 442 bp. Dùng quy trình nhiệt và cặp primer do Albert, H. H. và Schenck, S. (1996) thiết kế, chúng tơi đã khuếch đại được đoạn DNA cĩ kích thước khoảng 442 bp (Hình 4.9). Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo quy trình của Albert, H. H. và Schenck, S. Tuy nhiên, theo Hình 4.9 thì lượng sản phẩm tạp là tương đối lớn. Sản phẩm tạp này cĩ thể do nhiều nguyên nhân: Tạp 1: Là sản phẩm PCR khơng đặc hiệu, sản phẩm này cĩ kích thước lớn hơn sản phẩm PCR cần khuếch đại, nguyên nhân là do: primer, DNA mẫu, dNTPs, thời gian kéo dài chuỗi, hay Taq DNA polymerase cho một phản ứng quá nhiều. Để giảm sản phẩm tạp này ta cĩ thể thay đổi một hoặc kết hợp một vài yếu tố sau:  Giảm thời gian bắt cặp.  Tăng nhiệt độ bắt cặp.  Giảm thời gian kéo dài.  Giảm nhiệt độ kéo dài.  Giảm primer, giảm DNA mẫu, giảm Taq DNA polymerase. Tạp 2: Cĩ thể là do lượng primer, Taq DNA polymerase, DNA mẫu cho một phản ứng quá nhiều. DNA mẫu biến tính khơng tốt do thời gian biến tính ngắn hoặc nhiệt độ biến tính thấp. Chúng tơi đã tiến hành thay đổi một vài yếu tố trong phản ứng PCR để thu được sản phẩm đặc hiệu, khơng cĩ tạp. Sản phẩm PCR Tạp1 Tạp2 40 Trường hợp tăng nhiệt độ bắt cặp khơng thể được, vì nhiệt độ nĩng chảy của mồi xuơi là 53,6 0C và mồi ngược là 54,5 0C, cịn nhiệt độ bắt cặp theo chu kỳ nhiệt là 52 0C. Thay đổi đầu tiên: Chúng tơi giảm lượng DNA mẫu đưa vào, kết hợp với giảm Taq DNA polymerase (1,5 U/phản ứng), giảm primer (0,5 pmol/μl), các thành phần phản ứng khác và chu kỳ nhiệt khơng đổi, kết quả là đã giảm bớt tạp (phần tạp 1 khơng cịn nữa) (Hình 4.10). Hình 4.10: Sản phẩm PCR sau thay đổi đầu tiên. Những thay đổi sau: Chúng tơi giảm các yếu tố Taq DNA polymerase, primer, dNTPs, MgCl2, thay đổi chu kỳ nhiệt và cuối cùng đã thiết lập được nồng độ các hĩa chất và chu kỳ nhiệt tối ưu để khuếch đại đặc hiệu sản phẩm trên vùng gene bE của nấm Ustilago scitaminea (Bảng 4.3). Bảng 4.3: Nồng độ các yếu tố trong phản ứng PCR thay đổi. Hĩa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Nồng độ cuối thay đổi MgCl2 dNTPs Primer F Primer R Taq DNA polymerase 25 mM 10 mM 10 pmol/μl 10 pmol/μl 5 U/μl 2,5 mM 0,2 mM 1 pmol/μl 1 pmol/μl 2,5 U 2 mM 0,15 mM 0,4 pmol/μl 0,4 pmol/μl 1 U Sản phẩm PCR 41 Chu kỳ nhiệt thay đổi: Khởi động: 94 0C – 5 phút. 94 0 C – 45 giây 52 0 C – 30 giây 30 chu kỳ. 72 0 C – 30 giây Kết thúc: 72 0C – 3 phút. Cuối cùng chúng tơi đã thu được sản phẩm PCR rất đặc hiệu và khơng cịn tạp (Hình 4.11). Hình 4.11: Sản phẩm PCR sau khi thay đổi nồng độ hĩa chất và chu kỳ nhiệt. Sau khi xây dựng được quy trình tối ưu, chúng tơi tiến hành khuếch đại DNA của 11 dịng nấm đã phân lập được. Sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1,2 %. Kết quả cho thấy ở Hình 4.12. Hình 4.12: Sản phẩm PCR theo quy trình mới. 442 bp Sản phẩm PCR 400 bp 42 Ghi chú: L1: Us1 L4: Us4 L7: Us7 L10: Us10 L2: Us2 L5: Us5 L8: Us8 L11: Us11 L3: Us3 L6: Us6 L9: Us9 M: Ladder 100 bp Như vậy theo quy trình mới thì vừa tiết kiệm được hĩa chất, đặc biệt là Taq DNA polymerase là hĩa chất đắt tiền, từ 2,5 U cho 1 phản ứng giảm xuống cịn 1 U cho 1 phản ứng, lại cho sản phẩm khuếch đại rất tốt. Chúng tơi đã BLAST được trình tự khuếch đại trên cơ sở dữ liệu GenBank (phụ lục 1). 43 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  Đã phân lập và tách đơn bào tử được 11 dịng nấm Ustilago scitaminea từ 11 giống mía khác nhau ở Bình Dương.  Nấm Ustilago scitaminea tăng sinh khối rất nhanh trên mơi trường PGA* lỏng.  Cĩ thể áp dụng các quy trình ly trích DNA tổng số nấm đang phổ biến trên thế giới để tiến hành ly trích DNA tổng số của nấm Ustilago scitaminea.  Áp dụng quy trình tinh sạch (mục 3.4.6) để thu được DNA tổng số của nấm sau khi ly trích được tốt hơn.  Qua nghiên cứu chúng tơi đã xây dựng được quy trình PCR tương đối tốt, phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm để khuếch đại đoạn gen bE của nấm Ustilago scitaminea. 5.2. Đề nghị  Xây dựng qui trình PCR để phát hiện trực tiếp nấm Ustilago scitaminea xâm nhiễm vào cây mía, từ đĩ cĩ thể chẩn đốn sớm bệnh than.  Cần cĩ những nghiên cứu rộng hơn về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hĩa của nấm Ustilago scitaminea để cĩ thể đánh giá chính xác hơn về tình trạng nhiễm bệnh của cây mía tại Việt Nam.  Nghiên cứu sâu hơn bằng các sử dụng các phương pháp như RFLP, RAPD, AFLP… để đánh giá mức độ khác biệt di truyền của các dịng nấm Ustilago scitaminea tại Việt Nam.  Tiến hành giải trình tự vùng gene bE và so sánh để đánh giá chính xác sự khác biệt trong bộ gene của nấm. 44  Tiến hành nghiên cứu về độc tố của nấm để cĩ thể đề ra các biện pháp ngăn ngừa và điều trị bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nơng nghiệp. 2. Lê Song Dự, Nguyễn Thị Quí Mùi, 1997. Cây mía. Nhà xuất bản Nơng nghiệp Tp. Hồ Chí Minh. 3. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đốn bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. 4. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu cơng nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nơng nghiệp TP. Hồ Chí Minh. 5. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. 6. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu vùng Đơng Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp. Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 7. Phan Gia Tân, 1990. Cây mía. Tủ sách ĐH Nơng Lâm. 8. Nguyễn Văn Tuất, 2002. Kỹ thuật chẩn đốn và giám định bệnh hại cây trồng. Nhà xuất bản Nơng nghiệp. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGỒI. 9. Albert, H, H., Schenck, S., 1996. PCR amplification from a homolog of the bE mating – type gene as a sensitve the presence of Ustilago scitaminea DNA. Plant Dis 80: 1189 – 1192 10. Braithwaite K. S., Bakkeren G., et al., 2004. Genetic variation in a worldwide collection of the sugarcane smut fungus Ustilago scitaminea. Australian Society of Sugar Cane Technologists 47: 233 – 235. 45 11. Comstock J. C., and Lentini R.S., 2006. Sugarcane Smut Disease. 12. Croft B. J., and Braithwaite K. S., 2006. Management of an incursion of sugarcane smut in Australia. Australasian Plant Pathology 35: 113 - 122. 13. Engelke J. H., Egan B. T., et al., 2001. Sugarcane smut: successful management in the Ord. Crop Protection 22: 45 – 49. 14. Grisham M. P., 2001. An international project on genetic variability within sugarcane smut. International Society of Sugar Cane Technologists 45: 459 - 461. 15. Gupta V.P., 2006. Sugarcane smut. 16. Martinez M. I., Medina, et al., 2000. Changes of some chemical parameters, involved in sucrose recovery from sugarcane juices, related to the susceptibility or resistance of sugarcane plants to smut (Ustilago scitaminea). International Sugar Journal 102: 445 - 448. 17. Muđiz Y., Martínez B., et al., 2004. Sugarcane smut (Ustilago scitaminea Sydow): diagnostic methods. Revista de Protecciĩn Vegetal 19: 16. 18. Naik G. R., Jayaraj Y. M., et al., 2002. Early detection of sugarcane smut infection by serological (ELISA) technique. Indian Sugar 51: 801 - 805. 19. Nallathambi P., Padmanaban P., et al., 2001. Standardization of an indirect ELISA technique for detection of Ustilago scitaminea Syd., causal agent of sugarcane smut disease. Journal of Mycology and Plant Pathology 31: 76 - 78. 20. Riley I. T., Jubb T. F., et al., 1999. First outbreak of sugarcane smut in Australia. Proceedings of the XXIII ISSCT Congress 2: 333 - 337. 21. Schenck S., 2003. New race of sugarcane Smut on Maui. Pathology Report 69:13. 22. Sharififar and Kazemi Q., 1999. Evaluation of five different fungicides on control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea) in Iran. Sugar Technologists' Association of India 79: 125 – 129. 23. Singh N., Somai B.M., et al., 2005. In vitro screening of sugarcane to evaluate smut susceptibility. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 80: 259 - 266. 46 24. Singh N., Somai B.M., et al., 2004. Smut disease assessment by PCR and microscopy in inoculated tissue cultured sugarcane cultivars. Plant Science 167 : 987 - 994. 25. Sinky K. V., 2000. The smut fungi on Saccharum and related grasses. Australasian Plant Pathology 29: 3. 26. Solas M. T., Piđon D., et al., 1999. Ultrastructural aspects of sugarcane bud infection by Ustilago scitaminea teliospores. Sugar Cane 2: 14 - 18. 27. Wada A. C., 2003. Control of sugarcane smut disease in Nigeria with fungicides. Crop Protection 22: 45 - 49. 28.Wada A. C., Mian M. W., et al., 1999. Control of sugarcane smut (Ustilago scitaminea Syd) disease in Nigeria and suggestions for an integrated pest management approach. Sugar Tech 3: 48 - 53. 29. Xu L., Que Y., et al., 2004. Genetic diversity of Ustilago scitaminea in Mainland China. Sugar Tech 6: 267 - 271. 30. Yadahalli K. B., 2002. Evaluation of artificial inoculation techniques of sugarcane smut Ustilago scitamines Syd. Cooperative Sugar 34: 33 - 35. ĐỊA CHỈ TRÊN WEB 31. 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Trình tự đoạn khuếch đại trên gene bE của nấm Ustilago scitaminea khi dùng cặp mồi bE4 và bE8 trên cơ sở dữ liệu GenBank. LOCUS USU61291 442 bp DNA linear PLN 23-JUL- 1996 DEFINITION Ustilago scitaminea b East mating-type gene, partial cds. ACCESSION U61291 VERSION U61291.1 GI:1438940 KEYWORDS . SOURCE Sporisorium scitamineum ORGANISM Sporisorium scitamineum Eukaryota; Fungi; Basidiomycota; Ustilaginomycetes; Ustilaginomycetidae; Ustilaginales; Ustilaginaceae; Sporisorium. REFERENCE 1 (bases 1 to 442) AUTHORS Albert,H.H. and Schenck,S. TITLE PCR amplification from a homolog of the bE mating-type gene as a sensitive assay for the presence of Ustilago scitaminea DNA JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 442) AUTHORS Albert,H.H. and Schenck,S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (19-JUN-1996) USDA ARS, Hawaii Agriculture Research Center, 99-193 Aiea Heights Dr., Aiea, HI 96701, USA FEATURES Location/Qualifiers source 1..442 /organism="Sporisorium scitamineum" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:49012" /note="plus mating-type" gene 1..442 /gene="b East mating-type gene" CDS 442 /gene="b East mating-type gene" /codon_start=2 /protein_id="AAB04128.1" /db_xref="GI:1438941" /translation="FINARRRSGWSNILREFARGDRSRMKVLMQAKMSSCGLSVPLHP GCSTPIRSVDDILCDNLNRPLTAADKKGFEEEWSSMISWIRYGVKEKIGDWVYDLVAA SKKPRKTGQARPVTTPVKRTPARKAATTQQAKPGRAKQRXSATPS" ORIGIN 1 gttcatcaac gcgcgccgcc gttccggctg gtccaacatt ctccgcgaat ttgcacgggg 61 cgatcgttca cgaatgaaag ttctcatgca agccaagatg agctcttgcg gcttgtccgt 121 tcctttgcac ccgggctgct cgacgccaat tcggagcgtg gacgatatcc tttgcgacaa 181 cctcaatcga cctctcacag cagcagacaa gaaagggttc gaagaagaat ggagcagcat 241 gatcagctgg atcagatatg gcgtcaagga aaagatcgga gactgggtct acgatctcgt 301 tgcggcaagc aagaagccgc ggaaaactgg tcaagcgcgc ccagtcacca ctcctgtgaa 361 gcgcacacca gcacgcaaag cagccacgac tcagcaggcc aagcctggga gggctaagca 421 gagarcaagc gcgacacctt cc 48 Phụ lục 2: Cách pha một số hĩa chất 1. Pha lysis buffer Lysis buffer cĩ các thành phần cụ thể như sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS 3 %, - mercaptoethanol 1 %.  Cho vào becher một thể tích nước khử ion gần bằng với thể tích dung dịch buffer mong muốn.  Lần lượt cho các thành phần khác: Tris HCl, EDTA và SDS vào dung dịch với một lượng sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng như mong muốn.  Khuấy đều cho hỗn hợp hịa tan, sau đĩ cho - mercaptoethanol vào.  Khuấy đều và chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = 8. Nếu sau khi chuẩn độ thể tích cuối cùng chưa đạt như mong muốn cần thêm nước khử ion vào cho đạt thể tích mong muốn. 2. Pha Phenol  Làm tan 100 g phenol (tinh thể) bằng cách đặt trong bồn ủ nhiệt ở 65 0C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hịa tan).  Sau khi phenol đã tan hồn tồn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M, pH = 8.  Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phịng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lưu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luơn giữ phenol trong tối để tránh oxy hĩa và nguy hiểm đến sức khỏe.  Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch Tris HCl 0,5 M, pH 8.  Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phịng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên.  Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đĩ phủ lên trên dung dịch phenol thu được một lớp TE 1X (50 ml). 49  Lưu ý là phải bảo quản dung dịch phenol trong tối (dùng bình đựng cĩ màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc). 3. Pha dung dịch TE 1X  Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8.  Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH 8.  Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nước khử ion.  Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.