Khóa luận Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA THỦY SẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM MỘT SỐ LOẠI THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH VI KHUẨN TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thế Vương Lớp : Thủy sản 39A Địa điểm thực tập : Phòng thí nghiệm Khoa thủy sản Trường Đại học nông lâm Huế Giáo viên hướng dẫn : Nguyễn Anh Tuấn Năm 2009 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng của bản thân, em được sự giúp đỡ của rất nhiều thầy cô giáo. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến trường Đại học Nông lâm Huế, Ban chủ nhiệm Khoa Thủy sản, bộ môn Ngư Y, Phòng thí nghiệm Khoa thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành chương trình thực tập. Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Thầy giáo Nguyễn Anh Tuấn, đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy trong suốt quá trình thực tập cuối khóa và hoàn thành bài khóa luận. Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả thấy cô giáo Khoa Thủy sản. Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có rất nhiều cố gắng, tuy nhiên do thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh được những sai xót. Rất mong được sự quan tâm, góp ý của thầy cô để khóa luận hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày 25 tháng 5 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thế Vương MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, ĐỒ THỊ Bảng 4.1. Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh 28 Bảng 4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng 39 Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus 37 Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey 37 Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus 38 Bảng 4.6. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey 39 Bảng 4.7. So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được 40 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 21 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 26 Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với Vibrio alginolyticus 32 Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi ở đối với Vibrio harveyi 32 Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) đối với Vibrio alginolyticus 35 Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng ( tỷ lệ 1:1) đối với Vibrio harvey 35 Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus 41 Đồ thị 4.6. So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược đối với Vibrio harvey 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1. Tôm thẻ chân trắng 16 Hình 3.2. Tỏi 17 Hình 3.3. Lá húng 17 Hình 3.4. Cây rau má 18 Hình 3.5. Cây diếp cá 18 Hình 3.6. Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh 21 Hình 3.7. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược 27 Hình 4.1. Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh 28 Hình 4.2. Vibrio alginolyticus 30 Hình 4.3. Vibrio harveyi 30 Hình 4. 4. Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio alginolyticus trên môi trường TCBS 31 Hình 4. 5. Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio harveyi trên môi trường TCBS 31 Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus 33 Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi 33 Hình 4.8. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi thử nghiệm trên V.alginolyticus 36 Hình 4.9. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của các thảo dược 43 PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngành Nuôi trồng thủy sản Việt Nam ngày càng phát triển, trở thành ngành kinh tế mũi nhọn của quốc gia, không chỉ mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước mà còn góp phần đáng kể vào sự thành công trong công tác xóa đói giảm nghèo, bảo đảm an ninh lương thực, làm thay đổi đời sống dân cư các vùng miền núi và ven biển. [4] Tuy nhiên, trong những năm gần đây, dịch bệnh và ô nhiễm môi trường đang trở thành những thách thức lớn đối với ngành Nuôi trồng thủy sản. Thiệt hại do dịch bệnh gây ra trên tôm sú tăng từ 0,5 tỉ USD năm 1995 - 1997 lên đến 1,5 tỉ USD trong giai đoạn 2001 – 2002. Trong số những tác nhân gây bệnh trên động vật thủy sản, bệnh do vi khuẩn gây ra chiếm tỷ lệ khá lớn. Điều này đã cản trở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản cũng như nuôi thương phẩm. [7], [19] Một khi nuôi trồng thủy sản đã phát triển ở mức công nghiệp, thì kỹ thuật quản lý môi trường và dịch bệnh đã trở thành các bí quyết quan trọng để đảm bảo sự thành công của một vụ nuôi. Thông thường, để hạn chế dịch bệnh do vi khuẩn người nuôi thường sử dụng kháng sinh, các loại hóa chất đặc trị. Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất, kháng sinh không đúng quy cách, không đúng liều lượng đã gây lên tác hại lớn như là tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc, làm suy thoái môi trường, ảnh hưởng không tốt tới sức khỏe con người [10], [14], [15]. Hơn nữa hiện nay theo các quy định về an toàn thực phẩm, nghiêm cấm sự tồn dư các loại hóa chất, kháng sinh có trong động vật thủy sản. Chính vì thế chúng ta cần có biện pháp tốt để vượt qua những rào cản này. [7] Những năm gần đây xu hướng sử dụng thảo dược trong chữa trị bệnh trên động vật thủy sản được xem như một giải pháp có biên độ an toàn cao trong bảo quản, điều trị bệnh nấm và vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản [9] Từ đó, đề tài “Xác định tác nhân gây bệnh và nghiên cứu thử nghiệm một số loại thảo dược trong phòng trị bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei)” nhằm mục đích: Phân lập và định danh một vài chủng vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Thử nghiệm một số thảo dược có khả năng phòng trừ bệnh vi khuẩn trên tôm thẻ chân trắng. PHẦN 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam và Thừa Thiên Huế 2.1.1. Tại Việt Nam Năm 1990, Việt Nam có hơn 187.000 ha mặt nước nuôi tôm với sản lượng đạt được khoảng 31.000 tấn. Năm 1995, diện tích nuôi tăng lên 260.000 ha, sản lượng đạt được 52.000 tấn. Nhưng mặt trái của sự phát triển nhanh chóng, không quy hoạch đã dẫn đến dịch bệnh bùng phát ở nhiều nơi. Năm 1994, dịch bệnh bùng phát tại Đồng bằng sông Cửu Long: Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Long An, Nha Trang … gây thiệt hại hàng chục tỷ đồng cho bà con nuôi tôm. [7] Năm 1996, tại các tỉnh miền Nam (từ Phú Yên đến Cà Mau) dịch bệnh đã xảy ra trên 84.917 ha, trong đó nuôi quảng canh: 52.017 ha, quảng canh cải tiến: 29.011 ha, bán thâm canh: 3.829 ha. Tổng thiệt hại lên đến hàng chục tỷ đồng. Các tỉnh bị dịch bệnh nặng như Cà Mau hơn 70.000 ha, Kiên Giang hơn 4.000 ha, Bến Tre hơn 3.000 ha. [7] Năm 1997, theo ước tính của Nguyễn Việt Thắng (báo cáo nghiên cứu khoa học) tỉnh Bến Tre bị thiệt hại nặng nề nhất với 20% tôm thả bị chết, Trà Vinh với hơn 15% tôm thả bị chết. Cũng trong thời gian này dịch bệnh bùng phát nghiêm trọng ở các tỉnh Miền Trung, đặc biệt vào tháng 2-3. Tổng số diện tích bị bệnh chiếm khoảng 80% tổng diện tích nuôi trồng gây thiệt hại lớn cho các tỉnh miền Trung. [20] Báo cáo kết quả Nuôi trồng thủy sản năm 2003 của ngành đã đưa ra vài con số: Cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích bị bệnh khoảng 30.083 ha. Riêng các tỉnh thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước. Các bệnh xảy ra với tôm chủ yếu là đốm trắng (WSSV), bệnh MBV (Monodon Baculovirus), bệnh do vi khuẩn vibrio, bệnh do ký sinh trùng, gần đây xuất hiện thêm bệnh phân trắng, teo gan ở một vài nơi. Tại các tỉnh Bắc Trung Bộ, theo báo cáo của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I cho thấy: Thanh Hóa có hơn 40% diện tích nuôi tôm bị nhiễm virut đốm trắng, tập trung ở vùng nuôi tôm công nghiệp như Khu công nghiệp Hoằng Phụ, với 70/110 ha nuôi tôm bị nhiễm bệnh. Nghệ An có 47,8% diện tích nuôi tôm nhiễm virus đốm trắng; 30,4% bệnh MBV; 54,5% bệnh đầu vàng. Ở Hà Tĩnh, trong số 150 ha nuôi tôm bị bệnh, có 67 ha nhiễm bệnh virus đốm trắng, trong đó 27 ha có tôm nuôi chết hoàn toàn. Ở các tỉnh Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, cũng có từ xấp xỉ trăm ha cho tới vài trăm ha nuôi tôm bị bệnh.[18] Tại các tỉnh miền Trung, Nam Trung Bộ, theo Phòng bệnh học thủy sản -Trung tâm nghiên cứu Thủy sản III, Khánh Hòa có tỷ lệ diện tích nuôi tôm bị bệnh thấp nhất 14,3%, cao nhất ở Ninh Thuận 52,4%. Tỷ lệ nhiễm virus đốm trắng ở tôm nuôi tại khu vực này tuy có giảm nhưng bệnh phân trắng, teo gan lại xảy ra hầu hết ở các vùng nuôi trọng điểm như Ninh Hải, Phan Rang, Ninh Phước có những nơi lên tới 90-95% tôm bị nhiễm bệnh.[18] Theo kết quả nghiên cứu của Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, tại các tỉnh Nam Bộ tỷ lệ nhiễm bệnh virus đốm trắng trên mẫu tôm ở ao nuôi quảng canh cải tiến chiếm tới 56%, 50% tôm nhiễm bệnh MBV. Bệnh virus đốm trắng gây chết tôm hàng loạt, tác hại lớn đến năng suất, sản lượng tôm của khu vực.[18] Năm 2007, dịch bệnh đã bùng phát trên hơn 30 ha ao nuôi tôm trên cát ở huyện Phù Mỹ (Bình Định). Tôm chết chủ yếu ở giai đoạn 30 - 40 ngày nuôi gây tổn thất hàng chục tỉ đồng. Năm 2005, vùng nuôi tôm trên cát trọng điểm tỉnh Bình Định tập trung tại hai xã Mỹ An, Mỹ Thắng (Phù Mỹ) cũng xảy ra dịch bệnh.[19] Những tháng đầu năm 2008, một số tỉnh nuôi tôm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long như: Kiên Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau bị thiệt hại nặng do tôm chết hàng loạt. Nghiêm trọng nhất tại Cà Mau có khoảng 34.000 ha tôm bị nhiễm bệnh, thiệt hại từ 10% đến 70%. Việc tăng trưởng quá nhanh chóng về diện tích nuôi tôm đã nảy sinh nhiều bất cập về ô nhiễm, kiểm soát dịch bệnh, chất lượng sản phẩm dẫn đến thiệt hại không nhỏ về kinh tế cũng như môi trường. [20] 2.1.2. Tại Thừa Thiên Huế Năm 2007, diện tích nuôi tôm của Thừa Thiên Huế khoảng 3.712,1 ha. Ở vụ nuôi này thời tiết diễn biến phức tạp, nắng nóng kéo dài xen giữa có 3 đợt gió mùa kèm theo mưa dẫn đến nhiệt độ, các yếu tố môi trường biến động quá cao rất bất lợi cho sự phát triển tôm nuôi. Qua kiểm tra cho thấy tôm bị nhiễm virus đốm trắng ở các vùng Quảng An, Quảng Phước huyện Quảng Điền. Sau đó dịch bệnh lây lan trên diện rộng ở các xã thuộc huyện Phú Lộc, Phú Vang. Theo thống kê diện tích tôm bệnh: Khoảng 1.052,98 ha chiếm tỷ lệ 36,91% tổng diện tích nuôi, tăng 31,28% so với năm 2006. Huyện Phú Lộc có diện tích nuôi tôm lớn nhất với 900 ha, cũng là huyện thiệt hại nặng nhất với 600 ha bị bệnh, chiếm tỷ lệ 66,67% tổng diện tích nuôi. Trong đó bệnh đốm trắng trên 138,83 ha chiếm tỷ lệ 11,07% tổng diện tích nuôi, các bệnh vi khuẩn khác trên 166,7 ha chiếm tỷ lệ 14,37%. Huyện Phong Điền thiệt hại thứ hai, với 22,9 ha nhiễm bệnh, chiếm 39,76%. Trong đó bệnh đốm trắng xảy ra với tỷ lệ rất cao, trên 21 ha, chiếm 38,02%. Hai huyện Phú Vang và Quảng Điền cũng bị thiệt hại nặng, với tỉ lệ xấp xỉ 26%. Bệnh đốm trắng ở Phú Vang chiếm 11,9 %, bệnh vi khuẩn khác chiếm 14,37%. Tỷ lệ này ở Quảng Điền là 25,46% và 0,12%. Huyện Hương Trà có diện tích nuôi tôm thấp nhất với 276 ha, đồng thời tỷ lệ xảy ra bệnh thấp nhất với 4,5 ha chiếm tỷ lệ 1,63%. Đặc biệt ở Hương Trà bệnh đốm trắng hầu như không xảy ra.[20] Trong báo cáo tình hình sản xuất nông nghiệp của sở Nông nghiệp, tính đến ngày 27/11/2008 toàn tỉnh có 112,1 ha nuôi tôm thẻ chân trắng đạt sản lượng 1.208,9 triệu tấn với diện tích bị bệnh 4 ha chiếm 1,28% diện tích nuôi. Diện tích nuôi tôm sú lớn hơn với 3609,2 ha đạt sản lượng 2560,35 triệu tấn, trong đó diện tích bị bệnh khoảng 166,05 ha chiếm 4,62%. Qua thống kê cho thấy tỷ lệ bị bệnh của tôm sú cao hơn tôm thẻ chân trắng. Điều này chứng tỏ tôm thẻ có sức đề kháng, thích nghi với môi trường tốt hơn tôm sú. Năm 2008, tình hình thời tiết diễn biến ít bất lợi, người nuôi đã có kế hoạch phòng bệnh nên tỷ lệ bị bệnh giảm đáng kể so với năm 2007. 2.2. Tình hình nghiên cứu bệnh vi khuẩn trên tôm của thế giới và Việt Nam 2.2.1. Trên thế giới Bệnh truyền nhiễm được xem như yếu tố quan trọng nhất góp phần làm giảm sút sản lượng tôm nuôi. Việc khống chế các mầm bệnh bằng cách dùng hóa chất theo phương pháp truyền thống cho thấy ngày càng mang lại hiệu quả thấp đối với các mầm bệnh mới xuất hiện. Điều này tạo điều kiện cho công nghệ sinh học gia tăng vai trò hữu hiệu của mình trong chẩn đoán các mầm bệnh, giải thích rõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán, phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh (Subasinghe, 1998). Hiện nay bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn phát sáng, nhóm virus MBV (Monodon Baculovirus), YHV (Yellow Head Virus), WSSV (White Spot Syndrom Virus) được xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm nhất đã làm ảnh hưởng đến sản lượng tôm nuôi hàng năm. [20] Đối với bệnh do vi khuẩn gây nên, các nghiên cứu cho thấy trong hệ thống nuôi kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăng khả năng nhiễm các bệnh do vi khuẩn. Mặt khác, nhằm hạn chế việc đưa các chất hữu cơ trong ao nuôi tôm làm ô nhiễm môi trường vùng duyên hải, việc phát triển hệ thống nuôi hoặc hoàn toàn không thay nước hoặc nuôi theo phương pháp tuần hoàn cũng rất cần thiết (Nygaard, 1992). Tuy nhiên trong hệ thống kín hoặc tuần hoàn sẽ làm gia tăng vấn đề có liên quan đến bệnh  do vi khuẩn. [20] Nhóm vi khuẩn vibrio, một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu đối với động vật thủy sản. Bệnh do vi khuẩn vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash. Đến năm 1977, Fisher đã phát hiện ra vi khuẩn vibrio gây bệnh trên các loài tôm hùm châu Mỹ, châu Á. Kết quả này cũng được công bố bởi Roald và Bowser, 1981. Năm 1996, Lightner phát hiện các loài tôm he (Penaeus spp), tôm thẻ (Metapenaeus spp) cũng bị nhiễm vibrio. Năm 1990, Hassawai cho rằng phẩy khuẩn đã gây bệnh đỏ thân ở Thái Lan. Hầu như tất cả các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ mặn đều có thể nhiễm và chịu tác hại của bệnh vibrio.[20] Các nghiên cứu cho thấy việc giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987). Vấn đề này dường như khá phổ biến ở các nước châu Á nơi mà việc nuôi tôm được xem như hoạt động chính yếu trong sinh kế của người dân. Bệnh do nhóm vi khuẩn phát sáng đã gây thiệt hại kinh tế trong nuôi tôm công nghiệp ở Philippines (Fernandez và Mayo, 1994), Ấn Độ (Raju, 1994) và Indonesia (Sulasmi, 1994; Taslihan và Wijayati, 1994). [20] Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông, vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996). Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào, thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Sae-Oui, 1987; Songsrem, 1990; Ruangpan, 1997). Chất thải từ hệ thống tiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi ngờ có chứa vi khuẩn phát sáng (Shariff và Subasinghe, 1992). [20] Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng, hậu ấu trùng, các tác gia đã phân lập được những loại khác nhau của giống vibrio. Ở Philippin, C.L.Pilogo, M.C.L Baticados, E.R.Crus và L.de Lapena đã phân lập được hai loài: Vibrio harveyi và Vibrio splendidus. Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại tìm thấy Vibrio parahaemolyticus.[22] Trước đây, nhóm vibrio được xem như nhóm vi khuẩn cơ hội (Lightner, 1988). Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn vibrio gây ra cho thấy loài này đóng vai trò gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải vi khuẩn cơ hội (Lightner, 1992). Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm, kể cả tôm trưởng thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100% (Lightner, 1983).[22] Năm 1985, lần đầu tiên phát hiện bệnh hoại tử gan ở tôm he tại vùng Taxas, sau đó dịch bệnh được tìm thấy ở Peru, Ecuador, Venezuala, Pacma, Costarica. Năm 1996, D.Lighter đã nghiên cứu tìm thấy tác nhân gây bệnh hoại tử gan ở tôm he nuôi được xác định là một giống vi khuẩn thuộc lớp Proteobacteri. Đây là một dạng vi khuẩn gram (-), đa dạng, sống ký sinh trong nội bào.[4] Các kỹ thuật chẩn đoán trước đây chủ yếu dựa vào phương pháp phân lập vi khuẩn kết hợp với các triệu chứng bệnh tích cũng như mô bệnh học. Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại ADN để chẩn đoán nhanh bệnh do vi khuẩn trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn (Dalsgaard, 1996).[19] 2.2.2. Tại Việt Nam Ở Việt Nam, bệnh thuỷ sản được nghiên cứu chậm hơn so với các nước trên thế giới. Việc nghiên cứu bệnh thuỷ sản ở nước ta bắt đầu từ những năm của thập niên 60 và ngày càng được chú trọng. Lúc này, nghề nuôi tôm đã bắt đầu phát triển tại Việt Nam. Năm 1985, các nhà khoa học, các chuyên gia về thuỷ sản bắt đầu nghiên cứu đi sâu vào lĩnh vực bệnh tôm, tuy còn non trẻ, nhưng do nhu cầu của thực tiễn, nên chỉ trong một thời gian ngắn hàng loạt công trình lớn đã được áp dụng rộng rãi vào sản xuất, đem lại hiệu quả cao. Từ những năm 1989-1990, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng: bệnh vibrio, đặt biệt bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống, trong ao nuôi thương phẩm ở Việt Nam, có thể gặp bất kỳ một cơ sở sản xuất nào (Đỗ Thị Hòa, 1995-1997).[4], [8] Năm 1991, Nguyễn Trọng Nho cùng cộng sự khi nghiên cứu một số bệnh trên tôm sú ở Khánh Hoà đã thông báo một số dấu hiệu bệnh lý trên tôm sú nuôi. Đỗ Thị Hoà năm 1994, với đề tài nghiên cứu một số bệnh do tác nhân vi khuẩn, nấm nguyên sinh, động vật và giun tròn. Trong đó một số bệnh gây tác hại lớn được tác giả cho biết đó là: bệnh phát sáng, bệnh đỏ dọc thân trên tôm sú, bệnh mềm vỏ, bệnh do động vật đơn bào. Năm 1994, khi dịch bệnh tôm gây chết hàng loạt ở đồng bằng sông Cửu Long. Nguyễn Việt Thắng và cộng tác viên đã nghiên cứu đề tài “Tìm hiểu nguyên nhân tôm chết ở đồng bằng sông Cửu Long”. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Việt Thắng cho thấy vi khuẩn hiện diện khá cao trên tổng số mẫu thu xét nghiệm, nhiều loại Vibrio xuất hiện với tần số lớn, 2/3 xã điều tra cho thấy hiện tượng nhiễm khuẩn (Pycnozec nhân) chiếm tỷ lệ 80-100%, điều này cho thấy các mô hình nuôi quảng canh, đặc biệt mô hình nuôi tôm sú trên ruộng lúa. Bên cạnh tác nhân virus, vi khuẩn cũng là một tác nhân khá nguy hại khác cho tôm nuôi nếu đàn tôm bị nhiễm khuẩn với cường độ cao, số lượng lớn. [20] Năm 1996, Đỗ Thị Hoà cùng cộng sự đi sâu vào nghiên cứu các tác nhân gây bệnh trên tôm sú ở khu vực Nam Trung Bộ phát hiện vi khuẩn cảm nhiễm trên tôm, kết quả này mở ra nhiều triển vọng cho nghề nuôi tôm tại Việt Nam. Năm 1997, Đỗ Thị Hòa nghiên cứu và phát hiện ra vi khuẩn vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới. Năm 2002, Đỗ Thị Hòa thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ: Homarus americarus, H.gammarus và tôm hùm châu Á: Panulirus hormarus, P.ornatus,...đều bị cảm nhiễm vibrio.[4], [8] Ở Việt Nam, đã tìm thấy loại vi khuẩn dạng sợi bám, gây bệnh cho tôm nuôi khu vực miền Trung, đặc biệt trong các bể ấp ấu trùng, trong các ao nuôi thâm canh.[4] Kết quả điều tra bước đầu về dịch tễ học của bệnh hoại tử gan tại vùng nuôi tôm thịt tỉnh Khánh Hòa cho thấy bệnh xảy ra từ tháng 2 cho đến hết chu kỳ nuôi. Bệnh phát triển vào mùa khô, mùa có nhiệt độ cao (28 - 350C), độ mặn cao (30 - 40%).[4] Theo phân lập của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I, đã phân lập được cầu khuẩn gram dương, trực khuẩn dung huyết mạnh, gram âm từ mẫu tôm bị bệnh đục thân ở Hải Phòng.[22] Gần đây công trình nghiên cứu lớn là đề tài cấp nhà nước mang mã số : KN -04-12 do Hà Ký đã nghiên cứu được 13 loại bệnh vi khuẩn tôm. Ông đã công bố đầy đủ các khâu từ phân lập vi khuẩn, tác nhân gây bệnh, dấu hiệu bệnh lý, phân bố và lan truyền, biện pháp phòng trị với một số bệnh được đi sâu nghiên cứu như: bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm sú, bệnh đỏ dọc thân ở ấu trùng tôm sú, bệnh hoại tử đốm nâu ở tôm càng xanh.[5] 2.3. Tình hình sử dụng hợp chất chiết xuất từ thảo dược 2.3.1. Trên thế giới Việc tăng năng suất, sản lượng Nuôi trồng thủy sản bằng cách ồ ạt phát triển nghề nuôi tôm khiến dịch bệnh ngày càng trở thành một vấn đề gây nhức nhối cho người nuôi. Để xử lý vấn đề này, các loại hoá chất, kháng sinh được xem như biện pháp đầu tiên được con người sử dụng để điều trị cho các loại thuỷ sản. Tuy nhiên, việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh không đúng quy cách, liều lượng đang gây ảnh hưởng lớn tới sinh thái môi trường. Bên cạnh đó, việc tồn dư kháng sinh còn ảnh hưởng rất lớn tới sức khoẻ của con người. Trong những năm gần đây, xu hướng sử dụng thảo dược trong điều trị cho bệnh thuỷ sản đang được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị bệnh trên động vật thuỷ sản. Hơn nữa việc sử dụng thảo dược có biên độ an toàn lớn, ít ảnh hưởng tới môi trường sinh thái cũng như môi trường nuôi, đồng thời không ảnh hưởng tới sức khỏe của con người [15]. Các chiết xuất từ thảo dược như hinokiticol, citral, allylisocyanate được sử dụng rộng rãi trong bảo quản, điều trị bệnh do nấm, vi khuẩn gây ra . [15] Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt vi khuẩn của tỏi. Năm 1944, nhà hóa học Chester J. Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh. Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu hay chế hóa. Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốc penicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xua đuổi hoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc. Năm 1948, Marchado cùng cộng sự đã chiết suất từ tỏi được garcilin, chất này không có mùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella, Salmonella hoặc các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc. Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn vi khuẩn. Năm 1880, Davaine đã bắt đầu nghiên cứu tính kháng khuẩn của lá hồ đào đối với Bacillus anthracis. R.Koch (1887) nghiên cứu chứng minh tính kháng khuẩn của nhiều loại tinh dầu. Cũng trong thời gian này Chamberland chứng minh nhiều loại tinh dầu có tính kháng khuẩn, các thí nghiệm này được nhiều người như: Cadeae, Mennic, Bering, Reilling,...tiếp tục nghiên cứu. Năm 1959, Horak và Santavi chiết xuất từ cannabit sativa - Cannabinnacea, được chất cannabiriolic, dung dịch 10 - 15µg/ml có tác dụng diệt khuẩn với vi khuẩn gây bệnh lao ở người, vi khuẩn Gram (+), đặc biệt vi khuẩn kháng lại penicillin. [15], [20] Một nghiên cứu khác của Tokin (1928) đã chứng minh nhiều chất bay hơi từ cây xanh như Phytocid có tác dụng với vi khuẩn, nhiều công trình nghiên cứu đã xác nhận rằng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc từ thực vật rất phong phú, có phạm vi ứng dụng rất rộng rãi. [21 ] Từ củ của cây stephania cepharantha - Menispermaceae. Năm 1934 Kondo và cộng sự tách chiết một alcaloid có tên cepharantin, chất này có tác dụng với vi khuẩn lao ở nồng độ 10 - 20mg/ml. Năm 1944 Gupta và Kahali đã chiết suất từ cây berberis vulgaris chất berberin, chất này có ảnh hưởng tốt đối với các bệnh ký sinh trùng do Leishmannia tropica, Trypanosoma equiperdum gây ra. Theo Schlederer (1962) có thể tiêm dung dịch berberin 2% trị khỏi bệnh bouton d’orient. Ukita Mizuno và Tamura (1949) nhận thấy berberin có tác dụng tốt hơn sunfathiazon đối với Staphylococcus auraus, Shigella, Gonococcus. [15] Năm 1985, Khuê Lập Trung đã đưa ra 22 loài thảo dược, chủ yếu phòng trị các bệnh về vi khuẩn, ngoại ký sinh trùng, bệnh đường ruột cho tôm, cá và nhuyễn thể như: Xuyên tâm liên, địa niên thảo, lưu xổ tử, quản trọng, ngủ bội tử, tiền thảo,... [14] [15] Tại Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự (1997) đã thử nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: O.sanctum, C.alata, Tinospora cordifolia, Eclipa alba, Tinospora cripspa, Psidium guajava, Clinacanthus nutans, Andrographic panniculata, Momordica charatina, Phyllanthus reticulates, P. pulcher, P. acidus, P. debelis, P. amarus, P. debelis và P. urinaria đối với vi khuẩn Vibrio spp. Tuy nhiên, chỉ có hai cây P.guajava và M.charantina có hiệu quả ức chế đối với Vibrio spp. Nồng độ ức chế tối thiểu của P. guajava là 0,625 mg/ml và M. charantina là 1,25 mg/ml. [15] Gần đây, Trung Quốc đã chiết tách được một loại Ankanoid từ cây xoan rừng có tên Yanatren hoặc sử dụng hạt với tên kosam, enkosam có tác dụng điều trị lỵ amip. [20] Các kết quả trên chỉ mới bước đầu thử nghiệm sàng lọc các loại thảo dược chưa xác định được thành phần nào trong thực vật có tác dụng trên virus và vi khuẩn. 2.3.2 Tại Việt Nam Từ xa xưa, dân ta đã biết dùng những cây cỏ quen thuộc trong vườn nhà để trị các bệnh thông thường như một số bệnh đường ruột, bệnh đường hô hấp, tiết niệu, trị mụn nhọt, rửa vết thương,... [2], [3], [6] Theo y học cổ truyền, phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnh nhiễm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc, thanh nhiệt, táo thấp, thuốc khử hàn,.... như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ,... [2], [6] Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc như tỏi , hẹ , tô mộc, hạt cải, trầu không... để trị một số bệnh viêm nhiễm. [6] Từ giữa thế kỉ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956) trên 500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng khuẩn rất lớn. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự (1959), trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất an toàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trị bệnh tiêu chảy Ở Miền Bắc, Hà Ký (1995) và cộng sự trong chương trình KN 04 - 12 đã nghiên cứu một số loài thảo dược dùng để phòng trị bệnh trên cá. Bước đầu đã chọn được 9 loài cây thuốc sau: Rau nghể (Polygonum hydropiper), rau sam (Portulaca cleracea), cây cỏ sữa lá to (Euphorbia hirta), cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolis), sài đất (Wedelia calendu lacae), nhọ nồi (Eclipta alba), bồ công anh (Lactuca indica), cây vòi voi (Heliotropium indicum), cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria) có thể sử dụng trong phòng trị bệnh trên động vật thuỷ sản. [14] Ở miền Nam, các cây cỏ được dùng trong phòng trị bệnh cho vật nuôi thuỷ sản chủ yếu từ kinh nghiệm dân gian người dân đã biết dùng cây cỏ mực (Eclipta alba), cây trầu (Piper betel) để trị bệnh kí sinh trùng cho động vật thuỷ sản, một số địa phương khác theo kinh nghiệm người dân cũng biết dùng một số loài thực vật quen thuộc để chữa bệnh cho tôm cá đem lại hiệu quả như ở Nghệ An, Huế. Ngoài ra một số địa phương dùng cây tỏi (Allium sativum) để phòng, trị bệnh cho động vật thủy sản. [14], [15] Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên đã nghiên cứu thành công hai loại chế phẩm thảo dược VTS1-C, VTS1-T phối chế từ các hoạt chất chiết tách từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho tôm cá, kết quả cho thấy tỏi, sài đất đều có tác dụng với cả 6 loài vi khuẩn: Vibrio parahaemolyticus, V.harveyi, V.alginolyticus, Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei gây bệnh ở nước ngọt, nước lợ mặn. Từ năm 2000, Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu thử nghiệm thành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như hepato và alixin có tác dụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, có khả năng chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan. Trong đó hepato có công dụng hỗ trợ và bảo vệ gan phòng và trị bệnh về gan như MBV và teo gan. [15] Nghiên cứu khác của Phan Xuân Thanh (năm 2002) đã xác định được chất 2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảo dược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra. Nhằm mục đích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hoá chất độc hại, kháng sinh bị cấm sử dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản. [19] Gần đây khi nghiên cứu khả năng kháng nấm của dịch chiết lá trầu, Nguyễn Ngọc Phước và cộng sự (2006) kết luận chiết xuất từ lá trầu có khả năng tiêu diệt các loài nấm thuộc họ Lagenladium, chủng nấm này gây bệnh phổ biến trên tôm nước lợ, mặn. Dịch chiết lá trầu có khả năng ức chế, tiêu diệt các loại vi khuẩn Aeromonas hydrophyla và Vibrio sp. Năm 2008, Nguyễn Anh Tuấn đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết tỏi và lá húng đối với vi khuẩn Areomonas gây bệnh đốm đỏ ở cá Trắm Cỏ tại Thừa Thiên Huế. 2.4. Một số thảo dược sử dụng trong nuôi trồng thủy sản 2.3.1. Cây thuốc cá (Derris spp) Dùng cây thuốc cá để diệt cá tạp trong ao, đầm nuôi tôm: lấy rễ cây đập giập nát để ra chất nhựa trắng, sau đó đem ngâm nước, lấy nước đó té đều xuống ao, hoặc ngâm xuống ao với liều lượng 3-5kg rễ tươi/1.000m2 ao ở mức nước 15-20cm. [2] ,[3], [6] 2.3.2. Cây xoan (Melia azedarach) Dùng lá xoan để diệt trùng mỏ neo và trùng bánh cho cá rất tốt: lấy cành lá xoan non bó thành bó ngâm trong lồng nuôi cá đang bị bệnh trùng mỏ neo, trùng bánh xe, hoặc ngâm trong cá nuôi ở phía đầu nguồn nước với lượng 150-200kg lá xoan/1.000m2 ao có mức nước 1,5 - 2m hoặc 20-25kg lá xoan/lồng cá 8m2. [2] ,[3], [6] 2.3.3. Cây thàn mát (Milletia ichthyochtona) Quả khi già hạt có chứa 30-40% dầu và chất gây độc (như rotenon, sapotoxin) đối với cá. Có thể dùng hạt thàn mát để diệt cá tạp trong ao nuôi tôm. Cách dùng: nghiền nát hạt rồi hoà vào nước, dùng nước đó tưới đều lên ao; hoặc đập nát cho vào bao tải ngâm ở ao, tác dụng chậm hơn. Liều lượng cứ 0,5-1 kg hạt dùng cho một ao 1.000 m2 ở mức nước 15 -20 cm. [2] ,[3], [6] 2.3.4. Cây sở (Cammellia sasanqua) Sở là cây ép lấy dầu, bã làm thành bánh (khô dầu sở) có chứa chất saponozit gây độc làm chết cá và có tác dụng diệt khuẩn. Khô dầu sở có tác dụng để cải tạo ao đầm nuôi tôm. Khi dùng, cần nghiền nát khô dầu sở rồi rải xuống ao, hay ngâm trong nước. [2] ,[3], [6] 2.3.5. Cây bồ hòn (Sapindus mukorossi) Quả bồ hòn có nhân, hạt rất độc. Người nuôi cá, tôm dùng hạt để diệt cá tạp khi cải tạo ao đầm. Khi dùng, giã hạt thật nhỏ, hoà tan với nước, dùng nước này té đều khắp ao với liều lượng 0,5-1kg hạt/1.000 m2 ao có mức nước 15-20cm. [2] ,[3], [6] 2.3.6. Cây thầu dầu tía (Ricinus communis L.) Lá thầu dầu có chất đắng, dùng để chữa bệnh loét mang, đốm đỏ cho cá rất hiệu quả: Lấy lá thầu dầu bó thành từng bó ngâm xuống ao với lượng 250-300kg lá thầu dầu/ha ao, với mức nước sâu 1,5 – 2 m. [2] ,[3], [6] 2.3.7. Cây nghể (Polygonum hydropipe L.) Nghể là cây có vị cay nóng, hắc. Dùng cây này chữa bệnh viêm ruột, loét mang cho cá trắm cỏ, rô phi, có hiệu quả nhất đối với cá giống: Lấy thân cây và lá băm nhỏ, nấu kỹ lấy nước, sau đó trộn với thức ăn cho cá ăn, với liều lượng 3 kg thân lá nghể tươi/100 kg cá giống, cho cá ăn liên tục từ 3 - 6 ngày. Cũng có thể dùng lá nghể khô xay thành bột trộn với thức ăn cho cá, 1 – 2 kg nghể khô/100 kg cá giống. [2] ,[3], [6] 2.3.8. Cây rau sam (Portulacaoler acea L.) Dùng rau sam để chữa bệnh viêm ruột do vi khuẩn đối với cá trắm cỏ. Khi dùng, rửa sạch rau rồi vô trùng bằng nước muối 3%, rải rau trong khung nổi ở ao hoặc trong lồng cá, mỗi ngày cho ăn một lần, liên tục trong 6 ngày với liều lượng 1,5-3kg rau sam/100kg cá. Đối với cá giống cần băm nhỏ rau, rắc đều trên mặt ao hoặc trong lồng cá. [2] ,[3], [6] 2.3.9. Cây tía đỏ ( Ricinus communis L.) Cây tía đỏ thường được dùng để chữa bệnh đường ruột cho động vật thuỷ sản. Khi dùng lấy thân và lá cây băm nhỏ, nấu kỹ, lấy nước trộn với thức ăn tinh rồi cho ăn lượng 0,2 - 0,5 kg lá/kg thức ăn, cho ăn liên tục trong 3 - 5 ngày. [2] ,[3], [6] 2.3.10. Tỏi (Allium sativum L.) Tỏi được dùng chữa bệnh đường ruột cho cá nuôi. Khi dùng cần nghiền nát củ tỏi, trộn lẫn với thức ăn tinh cho cá ăn, liều lượng 0,5 - 1,5 kg tỏi, trộn với thức ăn/100 kg cá, cho cá ăn liên tục 6 ngày. [2] ,[3], [6] 2.3.11. Cây cau (Areca catechu) Chất arecolin trong hạt cau có tác dụng oxy hoá protein của tế bào kí sinh trùng làm tê liệt thần kinh của giun sán, làm tê liệt cả cơ trơn làm giun sán không bám vào thành ruột được nên dễ bị đẩy ra ngoài Dùng hạt cau với liều lượng 4g hạt cau/1kg cá/1 ngày, cho ăn trong 3 ngày để trị giun tròn kí sinh trong ruột cá trê (Spinitectus clariasi). [2] ,[3], [6] PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: 1/2008 – 5/2009 - Địa điểm: Phòng thí nghiệm khoa Thủy sản – Trường Đại học Nông Lâm Huế. - Địa điểm thu mẫu: Xã Quảng An, huyện Quảng Điền, tỉnh Thừa Thiên Huế. 3.2. Đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Tôm Thẻ Chân Trắng Penaeus Vannamei Phân loại: Ngành: Arthropoda Lớp: Crustacea Bộ: Decapoda Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeus Fabricius   Giống: Penaeus Hình 3.1. Tôm thẻ chân trắng Loài: Penaeus vannamei 3.2.2. Các loại thảo dược - Tỏi (Allium sativum L.). Hình 3.2. Tỏi Thành phần kháng thuốc chủ yếu là chất alicin (C6H10OS2) có khả năng diệt khuẩn mạnh, ở động vật thủy sản nó có tác dụng rất tốt với các vi khuẩn gam (-). Trong tỏi tươi không có chất alicin, nó chỉ được hình thành khi tỏi đã được phơi khô. Trong tỏi tươi có chứa aliin dưới tác dụng alinase có trong tỏi để tạo thành alicin.[6] Lá húng (Ocimum basilicum L). Rau húng là cây thân thảo, thân nhẵn hoặc có lông, thường phân cành ngay từ dưới gốc. Cây cao 50-60 cm. Lá mọc đối, có cuống, phiến lá hình thuôn dài. Có loại màu xám lục, có loại màu tím đen nhạt. Hình 3.3. Lá húng Hoa nhỏ màu trắng hay hơi tía, mọc thành chùm đơn hay phân nhánh, với những hoa mọc thành vòng, 5-6 hoa một vòng. Thành phần hoá học: Lá chứa nhiều hợp chất flavonoid (heterosid của flavon), triterpen, carotenoid. Tinh dầu chiếm đến 1-3% trọng lượng khô. Tinh dầu có thành phần chính: Eugenol (70%), methyleugenol (12%), beta-caryophyllen. Các thành phần chính: Menthol (30-50%), menthon (20-35%), acetat menthyl (4-10%). Thành phần tinh dầu thay đổi tuỳ theo nhiều yếu tố: Di truyền, thời vụ trồng, cách trồng, điều kiện khí hậu.[6] - Cây rau má (Centell asiatica). Rau má có tên khoa học là Centella asiatica (L.) thuộc họ hoa tán umbelliferae. Rau má còn có tên là tích tuyết thảo. Loại thực vật nầy mọc lan trên mặt đất có lá trông giống như những đồng tiền tròn được xếp nối tiếp nhau nên còn gọi là liên tiền thảo. Là một thứ rau dại ăn được thường mọc ở những nơi ẩm ướt như thung lủng, bờ mương thuộc những vùng nhiệt đới như Việt nam, Lào, Cambuchia, Indonesia, Malasia, Srilanka, Ấn độ, Pakistan, Madagascar . . . Cây rau má có thân nhẳn , mọc lan trên mặt đất, có rể ở các mấu. Lá có cuống dài mọc ra từ gốc hoặc từ các mấu. Lá hơi tròn, có mép khía tai bèo. Phiến lá có gân dạng lưới Hình 3.4. Cây rau má hình chân vịt. Hoa mọc ở kẻ lá. Cánh hoa màu đỏ hoặc tía. Tuỳ theo khu vực trồng hoặc mùa thu hoạch tỷ lệ các các hoạt chất có thể sai biệt. Thành phần của rau má bao gồm những chất sau: Beta caroten, sterols, saponins, alkaloids, flavonols, saccharids, calcium, iron, magnesium, manganese, phosphorus, potassium, zinc, các loại vitamins B1, B2, B3, C và K.[6] - Cây diếp cá (Houttuynia cordata). Cây diếp cá còn có tên là cây giấp cá, dấp cá. Tên khoa học là Houttuynia cordata. Họ lá giấp Saururaceae. Tên tiếng Anh của nó là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn). Hình 3.5. Cây diếp cá Diếp cá có nguồn gốc ở Nhật Bản, miền nam Trung Quốc và Đông Nam Á, là một loại cỏ nhỏ, mọc lâu năm, ưa chỗ ẩm ướt, có thân rễ mọc ngầm dưới đất. Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân mọc đứng cao 40 cm, có lông hoặc ít lông. Lá mọc cách, hình tim, đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn. Hoa nhỏ, không có bao hoa, mọc thành bông, có 4 lá bắc màu trắng; trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá giống như một cây hoa đơn độc. Toàn cây vò có mùi tanh như mùi cá.[6] Theo Đỗ Tất Lợi, trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axit caprinic và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh ở tôm thẻ chân trắng. Thử nghiệm tác dụng của các thảo dược lên chủng vi khuẩn phân lập được. So sánh khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược. 3.4. Dụng cụ - Hoá chất - Môi trường 3.4.1. Dụng cụ thí nghiệm Tủ ấm để nuôi cấy vi khuẩn. Kính hiển vi có vật kính: 10x, 20x, 40x, 100x. Que cấy, bộ giải phẫu: Kéo, dao, panh, kim tiêm. Hộp lồng, ống nghiệm, pipets, lam, lamen, đèn cồn. Bông lau, băng dính, bông không thấm nước. Dầu soi kính, nước muối sinh lí 0,9%, nước cất vô trùng. 3.4.2. Môi trường , hoá chất Môi trường phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm: môi trường chọn lọc TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt sucrose). Môi trường nuôi cấy tăng sinh: Pepton Môi trường nuôi cấy chuyên biệt: TCBS Các môi trường dùng cho phản ứng sinh hoá: + Môi trường cơ bản O/F. + Môi trường KIA (Kligler Iron Agar) + Môi trường đường các loại (Glucose, sucrose, mantose, manitol) + Môi trường Simon Citrate Agar. + Môi trường khử Nitrate. + Môi trường MR-PV Broth. + Môi trường Tryptophan Broth Agar. + Môi trường Tryptone. Một số thuốc thử và thuốc nhuộm cần thiết: + Dung dịch Kovac’S dùng cho phản ứng Indol. + Thuốc thử Methyl Red, dùng cho phản ứng Methyl Red. + Thuốc thử dùng cho phản ứng V-P: Dung dịch KOH 20%. Dung dịch Alphanapthol 10%. + Thuốc thử cho dung dịch Nitrate: Dung dịch Naphthylamine. Dung dịch Acid Sunlfamilic. + Thuốc dùng cho nhuộm Gram: Dung dịch tím Gentian hay tím Crystal. Dung dịch Lugol. Dung dịch Cồn-Aceton hay cồn-Acid. Dung dịch Fuchsin hoặc Safranin. + Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh. Dung dịch Sulfua Cromic. Dung dịch KOH trong cồn. 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Mẫu bệnh phẩm Quan sát dấu hiệu bệnh lý Đo chiều dài, trọng lượng Cơ quan có dấu hiệu bệnh lý Nuôi cấy trong môi trường TCBS Chọn khuẩn lạc ưu thế Nuôi cấy thuần trên môi trường TCBS Nhuộm Gram Thử test sinh hóa Định danh vi khuẩn Nuôi cấy tăng sinh trong môi trường pepton lỏng Xác đinh nồng độ (106) Thử nghiệm dịch chiết các loại thảo dược ở nồng độ khác nhau Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 3.5.2. Phương pháp thu mẫu Tôm có biểu hiện bất thường, được thu nguyên con, còn sống hoặc mới chết. Tôm được đo chiều dài, cân trọng lượng khi lấy mẫu phân lập. Mẫu bệnh phẩm đem nuôi cấy lấy từ các cơ quan có dấu hiệu bị bệnh. Hình 3.6. Cân trọng lượng, đo chiều dài tôm bị bệnh 3.5.3. Phương pháp nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn Phương pháp phân lập xác định vi khuẩn gây bệnh dựa trên phương pháp nghiên cứu của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006). 3.5.3.1. Nuôi cấy phân lập Lấy mẫu bệnh phẩm: Cơ, mang, chân bơi, gan tụy của mẫu tôm được phân nhỏ, nghiền trong ống nghiệm chứa 2ml dung dịch nước muối sinh lý. Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm vạch trên đĩa thạch TCBS một số đường để được vùng 1. Hơ nóng đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội bằng cách ấn dần que cấy vào mép đĩa thạch. Đặt que cấy lên đĩa thạch tại vùng 1, vạch một số đường liên tiếp để được vùng 2. Tiếp tục như vậy ta được vùng 3. Lật ngược đĩa lồng, nuôi cấy ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Sau 24 giờ, kiểm tra sự phát triển của các khuẩn lạc. Dựa vào màu sắc, hình dạng, kích thướt khuẩn lạc để phân biệt các loại khuẩn lạc có trên đĩa lồng, từ đó chọn ra khuẩn lạc nghi ngờ. Khuẩn lạc nghi ngờ là khuẩn lạc chiếm ưu thế trên đĩa phân lập. 3.5.3.2. Nuôi cấy thuần chủng Mở đĩa các khuẩn lạc nghi ngờ (dưới ngọn đèn cồn). Dùng que cấy vô trùng, lấy bệnh phẩm từ một khuẩn lạc nghi ngờ riêng rẽ. Cấy lên đĩa thạch mới, để ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h sẽ có một đĩa lồng chứa vi khuẩn thuần chủng. 3.5.3.3. Phương pháp nhuộm vi khuẩn Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc. Dùng que cấy phết, dàn một lớp mỏng trên tấm lam sạch. Để mẫu tự khô ở nhiệt độ phòng, sau đó hơ cao tấm lam trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm Gram theo các bước sau: + Nhỏ dung dịch tím Crystal lên mẫu để 30 - 60 giây. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước. + Nhỏ dung dịch Lugol lên mẫu để 1 phút. + Rửa nhanh rảy khô nước. + Nghiêng lam kính, nhỏ cồn 96% lên tẩy màu. + Rửa nhanh bằng nước, rảy khô nước. + Nhỏ dung dịch Fuchsin lên mẫu, để 1 - 2 phút. Rửa nước, rảy khô nước, có thể dùng khăn giấy thấm làm khô tiêu bản nhưng không để xước mẫu. Nhỏ dầu lên tiêu bản, đem soi dưới kính hiển vi (vật kính dầu). Nếu mẫu giữ nguyên màu xanh tím là vi khuẩn Gram dương, nếu mẫu chuyển màu hồng là vi khuẩn Gram. 3.5.3.4. Phương pháp thử các phản ứng sinh hóa - Thử phản ứng trên môi trường KIA. Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy vi khuẩn nghiên cứu ria một đường thẳng ở phần thạch nghiêng. Sau đó cắm thẳng que cấy xuống phần thạch đứng (không chạm đáy). Nuôi cấy ở nhiệt độ 30 - 370C, trong 24 giờ rồi đọc kết quả. Đọc khả năng lên đường glucose: Nếu (+), phần thạch đứng chuyển sang màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch đứng vẫn giữ màu vàng môi trường. Đọc khả năng lên men đường lactose: Nếu dương tính (+), phần thạch nghiêng chuyển màu vàng. Nếu âm tính (-), phần thạch nghiêng không chuyển màu. Nếu có khả năng lên men cả hai loại đường: Toàn bộ ống nghiệm chuyển sang màu vàng. Nếu không có khả năng len men cả 2 loại đường thì toàn bộ ống nghiệm vẫn giữ nguyên màu của môi trường ban đầu Đọc khả năng sinh hơi: (+) khi thạch bị nứt hay bị đẩy lên trên. Âm tính (-) khi không có hiện tượng nứt thạch. Đọc khả năng sinh H2S: (+) khi môi trường có màu đen. (-) khi môi trường không có màu đen. - Thử khả năng sinh Indol. Dùng môi trường Trypton lỏng cho phản ứng này. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường chứa Tryptone lỏng. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24 giờ. Dùng thuốc thử Kovac nhỏ 0,2-0,3 ml vào ống nghiệm đã nuôi cấy vi khuẩn, lắc đều, sau đó đọc kết quả: Dương tích (+): Có một vòng đỏ sẫm nổi lên trên bờ mặt môi trường. Âm tính (-): Có một vòng màu vàng sẫm nổi lên trên môi trường. Đó là màu của thuốc thử Kovac. - Thử khả năng di động. Dùng môi trường Manitol di động. Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy một đường thẳng đứng chính giữ ống nghiệm. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C, trong 24h, đọc kết quả: Khả năng lên men đường Manitol: (+) môi trường có màu vàng, (-) môi trường giữ nguyên màu ban đầu. Khả năng di động: (+) vi khuẩn mọc thành một đường thẳng, (-) vi khuẩn mọc lan ra ngoài đường cấy. - Thử phản ứng Nitrate. Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Nitrate. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h. Nhỏ thuốc thử: 1ml Acid Sulfalinic và 1ml Naphthyllamiue. Đọc kết quả: (+) xuất hiện màu đỏ 1-2 phút. (-) không xuất hiện màu đỏ. - Thử phản ứng Citrate. Dùng môi trường Simoms Citrate Agar đựng trong các ống nghiệm. Cấy vi khuẩn nghiên cứu vào ống nghiệm chứa môi trường Simoms Citrate Agar. Nuôi ở nhiệt độ 30 - 370C trong 24 – 48 giờ. Đọc kết quả: (+) Sẽ xuất hiện màu xanh blue. (-) Vẫn giữ nguyên màu xanh lá cây của môi trường. - Thử phản ứng Methyl Red. Dùng ống nghiệm chứa môi trường lỏng MR-VP để thử phản ứng này. Dùng que cấy vô trùng, lấy vi khuẩn cần nghiên cứu, cấy vào môi trường trên. Để ở nhiệt độ 30-370C trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Methyl Red, lắc đều và đọc kết quả: (+) Xuất hiện màu đỏ, (-) Xuất hiện màu vàng, vừa âm vừa dương tính – xuất hiện màu vàng cam. - Thử phản ứng V-P (Voges – Proskaner test). Dùng một ống nghiệm chứa môi trường MR-VP lỏng. Cấy vi khuẩn lên môi trường cần nói trên. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24 – 48 giờ. Nhỏ vào ống môi trường đã cấy vi khuẩn: 1ml Alpha – Naphthol 10% và 1ml KOH 20%. Lắc nhẹ sau ít phút rồi đọc kết quả. (+): Xuất hiện màu đỏ da cam ở bờ mặt môi trường trong ống nghiệm (-): Xuất hiện màu xanh đồng. - Kiểm tra khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn. Dùng các ống nghiệm có chứa môi trường đường khác nhau: Mantose, sucrose, glucose,... Cấy vi khuẩn cần nghiên cứu vào các môi trường đường nói trên. Nuôi ở nhiệt độ 30-370C trong 24h. Đọc kết quả: (+) Môi trường chuyển từ màu hồng sang màu vàng, (-) Môi trường không thay đổi màu sắc. 3.5.3.5. Phương pháp định danh vi khuẩn Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kết quả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) 3.5.4. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinh lý. Lấy 1ml mẫu nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiêm thứ nhất làm đồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1). Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độ pha loãng 100 lần (10-2). Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n. Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấy trên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt. Mỗi độ pha loãng nuôi cấy từ 2 – 3 đĩa lồng. Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng. Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: X = Trong đó: X: mật độ vi khuẩn A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãng V: Thể nước đưa vào nuôi cấy K: Hệ số pha loãng Phương pháp so màu: Dùng dung dịch Macphalan để so màu xác định nồng độ vi khuẩn. 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Dd gốc 10-1 10-2 ... . 10-(n-1) 10-n Sơ đồ 3.2. Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 3.5.5. Phương pháp chiết xuất thảo dược Thảo dược thí nghiệm được rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng, rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, có thể thêm một ít nước cất làm dung môi nhằm thuận tiện cho việc vắt lấy dịch chiết qua lưới lọc. Các loại thảo dược thử nghiệm được chiết xuất với dung môi nước cất vô trùng. Dịch chiết được bảo quản ở nơi khô thoáng với nhiệt độ luôn bảo đảm dưới 500C tránh hiện tượng tác dụng dược lý của thảo dược bị mất đi bởi nhiệt độ. 3.5.6. Phương pháp thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của thảo dược Tiến hành thử nghiệm dịch chiết thảo dược trên vi khuẩn phân lập được theo phương pháp thạch lỗ của Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội, 1998. Các thao tác trong điều kiện vô trùng bằng đèn cồn. Hình 3.7. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược Phương pháp tiến hành: Lấy 0,1ml dung dịch ở ống nghiệm chứa vi khuẩn có mật độ 106CFU/ml dàn đều trên mặt thạch bằng que gạt, để khô tự nhiên. Sau 1 phút, mỗi đĩa thạch đục 5 lỗ trên mặt thạch với đường kính 3mm/lỗ (mỗi nồng độ thảo dược thử nghiệm được lặp lại 5 lần). Nhỏ vào mỗi lỗ 0.1ml dịch chiết dược liệu rồi giữ ở nhiệt độ 300C – 370C. Sau 24 giờ lấy ra xác định độ dài đường kính vòng tròn kháng khuẩn. Mỗi loại thảo dược được thử nghiệm với nồng độ gốc (100%) và các nồng độ pha loãng (75%, 50%, 25%). 3.6. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. Trọng lượng, chiều dài tôm thẻ chân trắng bị bệnh Kiểm tra trọng lượng, chiều dài mẫu bệnh phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản do mỗi loại tác nhân thường cảm nhiễm ở một giai đoạn nhất định của đối tượng nuôi. Tôm thẻ chân trắng dễ mẫn cảm với nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau nên việc xác định giai đoạn phát triển của tôm sẽ giúp khoanh vùng được tác nhân gây bệnh để đưa ra kết quả chính xác hơn trong quá trình phân lập. Kết quả kiểm tra trọng lượng, chiều dài được thể hiện qua bảng 4.1. Bảng 4.1: Trọng lượng, chiều dài mẫu tôm bị bệnh Trọng lượng (g/con) MD ± SD Chiều dài (cm/con) MD ± SD 8,18 ± 1,81 11,04 ± 0,59 Kết quả bảng 4.1 cho thấy tôm có Ptb 8,18 g/con, Ltb 11,04 cm/con . Trong giai đoạn này tôm gần thu hoạch nếu bị các tác nhân gây bệnh xâm nhập sẽ gây thiệt hại nặng nề. Theo Đỗ Thị Hòa, 2004 giai đoạn này tôm rất dễ bị cảm nhiều bởi nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau do lượng thức ăn dư thừa trong ao nuôi tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh. 4.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn gây bệnh. 4.2.1 Kết quả quan sát dấu hiệu bệnh lý Hình 4.1. Dấu hiệu bên ngoài của tôm bị bệnh Mẫu bệnh phẩm có hiện tượng bẩn mình, bẩn mang, xuất hiện màu hồng đỏ trên cơ thể. Một số khác xuất hiện các vùng mềm trên vỏ kitin, tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng hoặc vỏ kitin bị ăn mòn, các phần phụ như chân bò, chân bơi, râu, đuôi tôm phòng lên, mòn cụt, gan tụy hoại tử từng phần. 4.2.2. Kết quả phân lập, định danh vi khuẩn Bảng 4.2. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng Đặc điểm sinh hoá Kết quả Chủng 1 Chủng 2 Màu sắc khuẩn lạc Vàng Xanh Hình dạng khuẩn lạc Tròn, bóng Tròn, bóng Nhiệt độ phát triển 370C 370C Nhuộm Gram - - Hình dạng vi khuẩn Que, ngắn Que, ngắn Đặc điểm khuyếch tán Làm biến đổi màu của môi trường nuôi cấy Không làm biến đổimôi trường nuôi cấy Lên men: Glucose Lactose Maltose Saccharose Manitol + - + + + + + + - + Khả năng di động + + Khả năng sinh hơi + - Khả năng sinh Indol + + Phản ứng trên môi trường KIA -/+ -/+ Phản ứng Methyl red - + Phản ứng Citrate ... - α – Naptol - - Phản ứng V-P + - Khả năng phát sáng - + Khả năng sinh H2S - - Tên vi khuẩn Vibrio alginolyticus Vibrio harvey Qua các đợt thu mẫu tôm thẻ chân trắng bị bệnh, đã tiến hành phân lập, thử phản ứng sinh hoá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.2. Dựa vào kết quả thu được trong quá trình nuôi cấy phân lập kết hợp khóa phân lập của Bergey (1957) và Nguyễn Lân Dũng (2006) đã xác định được 2 chủng vi khuẩn Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus từ các mẫu tôm thẻ có dấu hiệu bệnh lý. Hai chủng vi khuẩn này thuộc vi khuẩn Gram (-) (hình 4.2 và 4.3), tế bào có dạng hình que ngắn, có khả năng di động, phát triển trên môi rường thạch chọn lọc TCBS, cho khuẩn lạc có màu đặc trưng rõ rệt: Màu vàng của V.alginolyticus (Hình 4.4), màu xanh của V.harveyi (Hình 4.5). Hình 4.2. Vibrio alginolyticus Hình 4.3. Vibrio harveyi Theo Bùi Quang Tề (năm 2002), các loài vi khuẩn Vibrio xuất hiện ở nhiều thủy vực mặn lợ đặc biệt trong các vùng nuôi tôm thâm canh, gây ra các bệnh chủ yếu trên tôm như: Bệnh đỏ dọc thân, bệnh ăn mòn vỏ giáp xác, bệnh mềm vỏ... Những vi khuẩn này thường đóng vai trò tác nhân cơ hội, khi tôm sốc do môi trường biến đổi, hoặc bị nhiễm các bệnh khác như virus, nấm, kí sinh trùng. Khi sức đề kháng của động vật thuỷ sản giảm, các loài vi khuẩn vibrio này có khả năng gây bệnh nặng, gây chết hàng loạt. Vi khuẩn Vibrio harveyi thường phân bố trong nước biển, ven bờ...gây bệnh cho giáp xác, đặc biệt ở tôm nước mặn, lợ. Theo Đỗ Thị Hòa (2004), sự khác nhau về sự khuếch tán màu sắc trên môi trường TCBS của hai chủng vi khuẩn này do khác nhau về khả năng lên men loại đường Saccarose. Vi khuẩn V.alginolyticus có khả năng lên men đường Saccarose làm thay đổi màu sắc của môi trường từ màu xanh sang màu vàng (Hình 4.4). Trong khi đó, vi khuẩn V.harveyi không có khả năng lên men loại đường này nên không làm thay đổi màu sắc của môi trường (Hình 4.5). Kết quả phân lập không thấy sự có mặt của các loài vi khuẩn khác, điều này cho thấy hai chủng vi khuẩn phân lập được là tác nhân chính gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của D. Lightner (1996) khi phân lập các tác nhân gây bệnh viêm ruột trên tôm sú nuôi ở Philippin, ông cũng bắt gặp các loài V.harveyi, V.alginolyticus, V. parahaemolyticus trên các mẫu bệnh phẩm. Hình 4.5. Khuẩn lạc của vi khuẩn V.harveyi trên môi trường TCBS Hình 4.4. Khuẩn lạc của vi khuẩn V.alginolyticus trên môi trường TCBS 4.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược Các thí nghiệm được tiến hành đối với vi khuẩn nuôi cấy ở mật độ 106 CFU/ml. Thảo dược thử nghiệm ở 4 nồng độ: 100%, 75%, 50%, 25%. Qua kết quả thử nghiệm thảo dược ở nồng độ 25%, tất cả thảo dược đều không có tác dụng kháng khuẩn (vi khuẩn mọc tràng đĩa). Đặc biệt đối với hai loại thảo dược diếp cá, rau má ở nồng độ 50% cũng không có tác dụng kháng khuẩn. 4.3.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng tỏi lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện ở đồ thị 4.1 và đồ thị 4.2. Đồ thị 4.1. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.alginolyticus (a, b, c: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.2. Khả năng kháng khuẩn của tỏi đối với V.harvey (a, b, c, : Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Hình 4.6. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ đồ thị 4.1 cho thấy tỏi ở 3 nồng độ: 100%, 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 20,4 ± 0.82 mm, tỏi ở nồng độ 50% kháng khuẩn kém nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 12,8 ± 2,41 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,0060; 0,0006; 0,0031<0.05). Hình 4.7. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của tỏi khi thử nghiệm trên V.harveyi Đối với vi khuẩn Vibrio harvey, qua đồ thị 4.2 chỉ rõ, tỏi nguyên chất và tỏi pha loãng 75%, 50% đều có khả năng kháng khuẩn. Tỏi ở các nồng độ khác nhau cho khả năng kháng khuẩn khác nhau. Tỏi nguyên chất có khả năng kháng khuẩn tốt nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 22,1 ± 3,11mm, tỏi 75% kháng khuẩn kém hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 18,6 ± 1,95mm, thấp nhất ở tỏi nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 12,9 ± 1,52 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Mức độ kháng khuẩn của thảo dược được quyết định bởi thành phần, tính chất của các hợp chất được chiết xuất. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong tỏi có một ít iốt và tinh dầu. Thành phần chính của tỏi có chứa một hợp chất kháng sinh có tên alixin C6H10OS2, một hợp chất sunfua có tác dụng diệt vi khuẩn rất mạnh. Trong tỏi không có chất alixin ngay mà có chất aliin, một loại axit amin, chất aliin chịu tác dụng của men alinaza cũng có trong tỏi mới tạo thành alixin. Chất alixin tinh khiết không màu, hòa tan trong cồn, benzen, ete, không ổn định trong nước, dễ thủy phân. Độ thủy phân chừng 2,5%. Điều này giải thích vì sao tỏi nồng độ 75%, 50% có tác dụng kháng khuẩn kém hơn tỏi nguyên chất. Chất alixin bị nhiệt sẽ chóng mất tác dụng, gặp kiềm cũng bị mất tác dụng. Chất alixin rất dễ mất oxy do đó mất tác dụng kháng sinh, vì vậy nhiều tác giả đã cho rằng tác dụng kháng sinh của alixin chủ yếu do oxy trong phân tử. Chất alixin rất dễ kết hợp với một axit amin cystein có gốc SH để tạo thành một hợp chất khác. Gốc SH có tính chất kích thích sự sinh sản của vi sinh vật hay tế bào. Do đó tỏi có ức chế sự sinh sản của vi khuẩn bằng cách phá hoại khâu SH của chất cystein. 4.3.2. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) lên sự phát triển của các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4. Đồ thị 4.3. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.alginolyticus (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.4. Khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) đối với V.harvey (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Hình 4.8. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng khi thử nghiệm trên V.alginolyticus Kết quả từ đồ thị 4.3 chỉ rõ đối với vi khuẩn V.alginolyticus, hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 16,3 ± 1,30 mm, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p 0,05). Hay nói cách khác khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 75% tương đương hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50%. Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua đồ thị 4.4 cho thấy hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) ở 3 nồng độ đều có khả năng kháng khuẩn. Hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 100% có khả năng kháng khuẩn cao nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 13,7 ± 1,09 mm, kém nhất hợp chất tỏi, lá húng (tỉ lệ 1:1) nồng độ 50% với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 11,7 ± 1,79 mm. Sự khác biệt giữa hai nồng độ này có ý nghĩa thống kê (p = 0,035 0,05). Thành phần hóa học của lá húng chứa ít tinh dầu (0,05 - 0,12%), trong tinh dầu có đến 65,2% các hợp chất phenolic trong đó có salicylat, thymol, carvacrol, eugenol và chavicol. Các thành phần này có tác dụng diệt khuẩn. Trong lá húng còn có một chất màu đỏ có tên colein. Colein trong lá có tác dụng kháng sinh mạnh đối với một số vi khuẩn. Theo Nguyễn Anh Tuấn, 2008 hợp chất tỏi, lá húng có tác dụng kháng khuẩn Aeromonas sp phân lập được từ mẫu cá trắm cỏ bị bệnh nhiễm khuẩn. Như vậy, tỏi và lá húng có tác dụng diệt khuẩn đối với cả vi khuẩn nước ngọt và nước lợ, mặn. 4.3.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với các chủng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua bảng 4.3 và 4.4. Bảng 4.3. Khả năng kháng khuẩn của diếp đối với V.alginolyticus Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD 100% 7,2±0,57a 75% 5,1±1,02b (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Bảng 4.4. Khả năng kháng khuẩn của diếp cá đối với Vibrio harvey Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 100% 7,4 ± 0.82a 75% 5,1 ± 0,74b (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p<0,05) Đối với V.alginolyticus, kết quả bảng 4.3 thể hiện rõ diếp cá ở nồng độ 100% , 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Ở nồng độ 100% hiệu quả kháng khuẩn của diếp cá cao hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 7,2±0,57 mm, ở nồng độ 75% khả năng kháng khuẩn của diếp cá thấp hơn với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 5,1 ± 1,02 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê(p = 0,004 < 0,05). Đối với V.harveyi, qua bảng 4.4 thấy rõ diếp cá nồng độ 100% và 75% có khả năng kháng khuẩn. Diếp cá nồng độ 100% kháng khuẩn mạnh hơn diếp cá nồng độ 75%. Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt ở hai nồng độ 7,4 ± 0.82; 5,1 ± 0,74. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,001< 0,05. Theo Đỗ Tất Lợi, 2004, trong cây diếp cá có chừng 0,0049 % tinh dầu, một ít chất ancaloit có tên cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu có chứa mertylnonylxeton CH3CO(CH2)8CH3 (có mùi rất khó chịu), chất miêcxen C10H46, axit caprinic C9H19COOH và laurinaldehyt. Hoa quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Những hợp chất này có tính kháng khuẩn mạnh, đặc biệt đối với nhũng vi khuẩn gây bệnh trên người. 4.3.4. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Kết quả thử nghiệm tác dụng rau má lên sự phát triển V.alginolyticus, V.harveyi được thể hiện bảng 4.5 và 4.6. Bảng 4.5. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio alginolyticus Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS ± SD 100% 6,6 ± 0,96a 75% 4,9 ± 0,89b (a,b: Thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê với p < 0,05) Bảng 4.6. Khả năng kháng khuẩn của rau má đối với Vibrio harvey Nồng độ thảo dược Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MS±SD 100% 6,9 ± 1,14a 75% 5,4 ± 0,96b (a,b: Thể hiện sự khác biệt về mặt thống kê với p < 0,05) Đối với vi khuẩn V.alginolyticus, kết quả từ bảng 4.5 thể hiện rõ khả năng kháng khuẩn của rau má ở nồng độ 100% và nồng độ 75%. Rau má nồng độ 100% tiêu diệt vi khuẩn mạnh hơn rau má nồng độ 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,6 ± 0,96 mm, 4,9 ± 0,89 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,01< 0,05. Đối với vi khuẩn V.harveyi, qua bảng 4.6 thấy rõ, rau má nồng độ 100% và 75% đều có khả năng kháng khuẩn. Hiệu quả kháng khuẩn khi thử nghiệm nồng độ 100% tốt hơn 75%. Với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình lần lượt 6,9 ± 1,14 mm, 5,4 ± 0,96 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê với p = 0,027 < 0,05. Rau má được nhiều người nghiên cứu nhưng kết quả chưa thống nhất. Theo Basu và Lamsal (1947), trong rau má có một ancaloit hydrocotylin C22H33O8N, có độ nhạy 210 - 2120C. Ancaloit này cho các muối oxalat với độ chảy 2950C, muối picrat với độ chảy 110 - 1120C, muối cloroplatinat với độ chảy 134 - 1360C. Theo Bửu Hội, Rakoto Ratsimamaga và Boiteau, trong cây rau má có chứa một glucozit có tên asiaticozit sẽ cho axit aisiatic và glucoza. Chất glucozit này có tinh thể, tan trong rượu, độ chảy 230-2330C, có thể cho một dẫn xuất tan trong nước gọi là oxyasiaticozit. Chất này có khả năng kháng khuẩn. Một số tác giả khác (Lythoe và Trippet) nghiên cứu rau má đã chiết xuất được một glucozit khác đặt tên là xentelozit có tính chất gần giống như aisiaticozit. Theo y học cổ truyền, rau má có vị đắng, hơi ngọt, tính bình. Có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng. Từ những năm 1940, y học hiện đại bắt đầu nghiên cứu những tác dụng của rau má. Rau má có những hoạt chất thuộc nhóm saponins (còn được gọi là tripernoids) bao gồm asiaticoside, madecassoside, madecassic acid và asiatic acid. Hoạt chất asiaticoside đã được ứng dụng trong điều trị bệnh phong, bệnh lao ở trên người. Đối với những bệnh này, vi khuẩn dược bao phủ bởi một màng ngoài giống như sáp khiến cho hệ kháng nhiểm của cơ thể không thể tiếp cận. Chất asiaticoside trong dịch chiết rau má có thể làm tan lớp màng bao này để hệ thống miễn dịch của cơ thể tiêu diệt chúng. 4.4. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện qua bảng 4.7 Bảng 4.7. So sánh khả năng kháng khuẩn của thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được. Chủng vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) MD ± SD Tỏi Tỏi + húng Diếp cá Rau má V.alginolyticus 20,4 ±0,82a 16,3 ± 1,30a 7,2 ± 0,57a 6,6 ± 0,96a V.harveyi 21,1±3,11a 13,7 ± 1,09b 7,4 ± 0.82a 6,9 ± 1,14a (a,b trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0,05) Kết quả từ bảng 4.7 cho thấy, tất cả thảo dược khi thử nghiệm trên V.alginolyticus và V.harveyi đều có sự chênh lệch đường kính vòng kháng khuẩn. Tỏi, diếp cá, rau má khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.harvey cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn so với thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus. Tuy nhiên, không có sự khác biệt thống kê khi so sánh khả năng kháng khuẩn của tỏi, diếp cá, rau má khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus và V.harveyi (p > 0,05). Ngược lại, đối với hợp chất tỏi, húng (tỷ lệ 1:1), khi thử nghiệm trên vi khuẩn V.alginolyticus cho hiệu quả kháng khuẩn cao hơn khi thử nghiệm trên V.harveyi với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt 16,3 ± 1,30 mm, 13,7 ± 1,09 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p = 0,005 < 0,05. Trong cùng một loài vi khuẩn khả năng kháng khuẩn của thảo dược không giống nhau đối với các chủng vi khuẩn khác nhau. Thảo dược có tác dụng tiêu diệt chủng vi khuẩn này, nhưng lại không có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn khác. Điều này có thể giải thích do cấu tạo tế bào của các chủng vi khuẩn có sự sai khác dẫn đến tác dụng của các hợp chất trong thảo dược lên màng tế bào vi khuẩn không có sự đồng nhất giữa các chủng vi khuẩn. Vì vậy, khả năng tiêu diệt vi khuẩn của thảo dược cũng khác nhau ở mỗi chủng vi khuẩn trong cùng một loài 4.5. Kết quả so sánh khả năng kháng khuẩn giữ các loại thảo dược khác nhau đối với các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng kháng khuẩn lớn nhất của mỗi loại thảo dược đối với các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng để so sánh hiệu quả giữa chúng. Kết quả được thể hiện ở đồ thị 4.5 và 4.6. Đồ thị 4.5. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược khác nhau đối với Vibrio alginolyticus (a, b, c: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Đồ thị 4.6. Khả năng kháng khuẩn của các loại thảo dược đối với Vibrio harvey (a, b: Thể hiện sự khác biệt thống kê với p < 0.05) Kết quả từ đồ thị 4.5 cho thấy, đối với vi khuẩn V.alginolyticus, trong 4 loại thảo dược được thử nghiệm, tỏi có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 20,4 ± 0,82 mm. Hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) nồng độ 75% khả năng kháng khuẩn tương đối mạnh với trung bình đường kính vòng kháng khuẩn 16,3 ± 1,3 mm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p = 0,05. Đối với vi khuẩn V.harvey, kết quả từ đồ thị 4.6 chỉ rõ trong các loại thảo dược thử nghiệm, tỏi có khả năng kháng khuẩn mạnh nhất với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 22,1 ± 3,11mm, hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) khả năng kháng khuẩn kém hơn tỏi nhưng hiệu quả hơn diếp cá, rau má với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,7 ± 1,10 mm. Sự sai khác này có ý nghĩa thống kê (p 0.05. Hình 4.9. Kết quả tạo vòng kháng khuẩn của các thảo dược Qua kết quả so sánh, có thể thấy tỏi nguyên chất khả năng kháng khuẩn mạnh hơn hợp chất tỏi, lá húng. Kết quả này trái ngược với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Anh Tuấn (2008) khi thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các thảo dược trên vi khuẩn gây bệnh cá trắm cỏ, cho kết quả khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá húng mạnh hơn tỏi nguyên chất. Như vậy, khả năng kháng khuẩn của hợp chất tỏi, lá hung đối với các vi khuẩn gây bệnh trên đối tượng nuôi nước ngọt có thể cao hơn các vi khuẩn gây bệnh trên nước mặn. Thành phần các chất trong thảo dược và thành phần cấu tạo trong vi khuẩn quyết định khả năng kháng khuẩn của thảo dược. Tùy thuộc vào cấu tạo của các loài vi khuẩn mà tác dụng của thảo dược lên nó khác nhau, do đó khả năng kháng khuẩn khác nhau. PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận - Kết quả phân lập cho thấy 2 chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi đã được phát hiện trong mẫu tôm bị bệnh. - Trong 4 loại thảo dược được thử nghiệm cho thấy 4 loại đều có khả năng tiêu diệt chủng vi khuẩn phân lập được. - Trong 4 loại thảo dược có khả năng kháng khuẩn, tỏi có khả năng kháng khuẩn cao nhất với đường kính vòng kháng khuẩn 23,6 ± 0,89 mm, diếp cá và rau má có đường kính vòng kháng khuẩn nhỏ nhất. - Nồng độ thảo dược có tác dụng kháng khuẩn cao nhất là 100%. Các nồng độ tỏi 25%, hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) nồng độ 25%, diếp cá nồng độ 50%, 25%, rau má nồng độ 50%, 25% không có khả năng kháng khuẩn. 5.2. Kiến nghị - Phân tích thành phần hóa học của các loại thảo dược để hiểu rõ hơn về cơ chế kháng khuẩn. - Tiến hành cảm nhiễm ngược trở lại trên tôm, dùng chiết xuất thảo dược để thử nghiệm khả năng trị bệnh. - Nhân rộng kết quả nghiên cứu, áp dụng vào thực tiễn. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Tôn Thất Chất, 2006. Giáo trình Kỹ thuật nuôi giáp xác, trường Đại Học Nông Lâm Huế. [2]. Võ Văn Chi, 2000. Cây thuốc trị bệnh thông dụng, NXB Thanh Hóa. [3]. Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội. [4]. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004. Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [5]. Hà Ký và ctv, 1995. Phòng và trị bệnh cho tôm cá, Báo cáo tổng kết cấp Nhà nước mã số KN - 04 - 12, Hà Nội. [6]. Đỗ Tất Lợi, 1968. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội [7]. Chu Viết Luân, 2003. Thủy sản Việt nam phát triển và hội nhập, NXB Chính trị quốc gia Hà Nội [8]. Nguyễn Ngọc Phước, 2002. Bài giảng bệnh học thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm Huế. [9]. Nguyễn Ngọc Phước, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Quang Linh, Ngô Thị Hương Giang, Nguyễn Nam Quang, 2007. Sử dụng thảo dược và chế phẩm từ thảo dược trong điều trị bệnh vi khuẩn cho động vật thủy sản. Kỷ yếu Khoa học Công nghệ, 2007. Liên hiệp khoa học Kỹ thuật Việt Nam. Hà nội. [10]. Mai Văn Tài, 2004. Điều tra đánh giá hiện trạng các loại thuốc và hoá chất dùng trong nuôi trồng thuỷ sản nhằm đề xuất các giải pháp quản lý. [11]. Bùi Quang Tề, 2002. Bệnh của tôm nuôi và biên pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. [12]. Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám, 1999. Những bệnh thường gặp của tôm cá và biện pháp phòng trị, NXB Nông Nghiệp, TP Hồ Chí Minh. [13]. Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên, 2006. Kết quả nghiên cứu chế phẩm ( VTS1-C) ( VTS1 – T) tách chiết từ thảo dược phòng trị bệnh cho tôm sú và cá tra. [14]. Nguyễn Thị Vân Thái, 2004. Xây dựng bài thuốc y học cổ truyền ứng dụng trong phòng và chữa bệnh cho tôm cá. Bệnh viện Y học cổ truyền TW, Tuyển tập Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong NTTS (22 - 23/12/2004 tại Vũng Tàu), NXB Nông Nghiệp. [15]. Nguyễn Thị Vân Thái và cộng tác viên, 2006. Bàn về tiềm năng phòng và chữa bệnh nhiễm khuẩn bằng kháng sinh thảo mộc trong nuôi trồng thuỷ sản. [16]. Khuê Lập Trung, 1985. Kỹ thuật phòng trị bệnh tôm, cá và nhuyễn thể. NXB Nông Thôn Trung Quốc. [17]. Trần Linh Thước, 2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục. [18]. Tổng kêt tình hình nuôi trồng thuỷ sản năm 2002. Báo cáo của Bộ Thuỷ Sản. Các website: [19]. Website chuyên về Nông nghiệp và Thuỷ sản: www.vietlinh.com.vn [20]. Website của Bộ Thuỷ Sản www.fishtenet.gov.vn [21]. Bách khoa toàn thư mở www.en.wikipedia.org [22]. Website của Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản I www.ria1.mofi.gov.vn. PHỤ LỤC T 100% T 75% Mean 20,4 17,7 Variance 0,675 2,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 6 t Stat 3,560654556 P(T<=t) one-tail 0,005958871 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,011917741 t Critical two-tail 2,446911846 T 100% T 50% Mean 20,4 12,8 Variance 0,675 5,825 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 6,665640947 P(T<=t) one-tail 0,000573656 t Critical one-tail 2,015048372 P(T<=t) two-tail 0,001147313 t Critical two-tail 2,570581835 T 75% T 50% Mean 17,7 12,8 Variance 2,2 5,825 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 3,86775149 P(T<=t) one-tail 0,00307477 t Critical one-tail 1,8945786 P(T<=t) two-tail 0,00614953 t Critical two-tail 2,36462425 TH 100% TH 75% Mean 16,3 13,9 Variance 1,7 1,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 3,098386677 P(T<=t) one-tail 0,007350815 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,014701629 t Critical two-tail 2,306004133 TH 100% TH 50% Mean 16,3 13,1 Variance 1,7 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 4,31487912 P(T<=t) one-tail 0,001281859 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,002563719 t Critical two-tail 2,306004133 TH 75% TH 50% Mean 13,9 13,1 Variance 1,3 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 1,16691993 P(T<=t) one-tail 0,13842313 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,27684626 t Critical two-tail 2,30600413 DC 100% DC 75% Mean 7,2 5,1 Variance 0,325 1,05 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 6 t Stat 4,004542875 P(T<=t) one-tail 0,003541123 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,007082245 t Critical two-tail 2,446911846 RM 100% RM 75% Mean 6,6 4,9 Variance 0,925 0,8 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 2,894272205 P(T<=t) one-tail 0,010033604 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,020067207 t Critical two-tail 2,306004133 T 100% TH 100% Mean 20,4 14,12 Variance 0,675 34,4001 Observations 5 7 Hypothesized Mean Difference 0 Df 6 t Stat 2,794755706 P(T<=t) one-tail 0,015690055 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,03138011 t Critical two-tail 2,446911846 T 100% DC 100% Mean 20,4 7,2 Variance 0,675 0,325 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 29,5160973 P(T<=t) one-tail 6,59962E-09 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 1,31992E-08 t Critical two-tail 2,364624251 T 100% RM 100% Mean 20,4 6,6 Variance 0,675 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 24,395184 P(T<=t) one-tail 4,2548E-09 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 8,5095E-09 t Critical two-tail 2,30600413 TH 100% DC 100% Mean 16,3 7,2 Variance 1,7 0,325 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 14,29927046 P(T<=t) one-tail 1,50734E-05 t Critical one-tail 2,015048372 P(T<=t) two-tail 3,01469E-05 t Critical two-tail 2,570581835 TH 100% RM 100% Mean 16,3 6,6 Variance 1,7 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 13,38727185 P(T<=t) one-tail 1,52094E-06 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 3,04188E-06 t Critical two-tail 2,364624251 DC 100% RM 100% Mean 7,2 6,6 Variance 0,325 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 1,2 P(T<=t) one-tail 0,13458597 t Critical one-tail 1,8945786 P(T<=t) two-tail 0,26917194 t Critical two-tail 2,36462425 T 100% T 75% Mean 22,1 18,6 Variance 9,675 3,8 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 2,132007164 P(T<=t) one-tail 0,035230525 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,070461049 t Critical two-tail 2,364624251 T 100% T 50% Mean 22,1 12,9 Variance 9,675 2,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 6 t Stat 5,944770162 P(T<=t) one-tail 0,000506217 t Critical one-tail 1,943180274 P(T<=t) two-tail 0,001012435 t Critical two-tail 2,446911846 T 75% T 50% Mean 18,6 12,9 Variance 3,8 2,3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 5,16053752 P(T<=t) one-tail 0,00043154 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,00086309 t Critical two-tail 2,30600413 TH 100% TH 75% Mean 13,7 12,4 Variance 1,2 3,175 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 1,389758458 P(T<=t) one-tail 0,103598793 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,207197586 t Critical two-tail 2,364624251 TH 100% TH 50% Mean 13,7 11,7 Variance 1,2 3,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 7 t Stat 2,132007164 P(T<=t) one-tail 0,035230525 t Critical one-tail 1,894578604 P(T<=t) two-tail 0,070461049 t Critical two-tail 2,364624251 TH 75% TH 50% Mean 12,4 11,7 Variance 3,175 3,2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 0,61993042 P(T<=t) one-tail 0,27627379 t Critical one-tail 1,85954803 P(T<=t) two-tail 0,55254757 t Critical two-tail 2,30600413 DC 100% DC 75% Mean 7,4 5,1 Variance 0,675 0,55 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 Df 8 t Stat 4,646701705 P(T<=t) one-tail 0,000825874 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,001651748 t Critical two-tail 2,306004133 RM100% RM 75% Mean 6,9 5,4 Variance 1,3 0,925 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 2,248595067 P(T<=t) one-tail 0,027343534 t Critical one-tail 1,859548033 P(T<=t) two-tail 0,054687067 t Critical two-tail 2,306004133 T 100% TH 100% Mean 22.1 13.7 Variance 9.675 1.2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 5.69573343 P(T<=t) one-tail 0.001163646 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.002327293 t Critical two-tail 2.570581835 T 100% DC 100% Mean 22.1 7.4 Variance 9.675 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 10.21720629 P(T<=t) one-tail 7.70976E-05 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.000154195 t Critical two-tail 2.570581835 T 100% RM100% Mean 22.1 6.9 Variance 9.675 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat 10.2595031 P(T<=t) one-tail 7.5582E-05 t Critical one-tail 2.01504837 P(T<=t) two-tail 0.00015116 t Critical two-tail 2.57058183 TH 100% DC 100% Mean 13.7 7.4 Variance 1.2 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 10.28785692 P(T<=t) one-tail 8.8692E-06 t Critical one-tail 1.894578604 P(T<=t) two-tail 1.77384E-05 t Critical two-tail 2.364624251 TH 100% RM 100% Mean 13.7 6.9 Variance 1.2 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 9.616652224 P(T<=t) one-tail 5.67795E-06 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 1.13559E-05 t Critical two-tail 2.306004133 DC 100% RM 100% Mean 7.4 6.9 Variance 0.675 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat 0.79555728 P(T<=t) one-tail 0.22620896 t Critical one-tail 1.8945786 P(T<=t) two-tail 0.45241791 t Critical two-tail 2.36462425 T1 100% T2 100% Mean 20.4 22.1 Variance 0.675 9.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 5 t Stat -1.18158168 P(T<=t) one-tail 0.145251527 t Critical one-tail 2.015048372 P(T<=t) two-tail 0.290503054 t Critical two-tail 2.570581835 TH1 100% TH2 100% Mean 16.3 13.7 Variance 1.7 1.2 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat 3.413967254 P(T<=t) one-tail 0.004584626 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 0.009169252 t Critical two-tail 2.306004133 DC1 100% DC2 100% Mean 7.2 7.4 Variance 0.325 0.675 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 7 t Stat -0.4472136 P(T<=t) one-tail 0.33411552 t Critical one-tail 1.8945786 P(T<=t) two-tail 0.66823104 t Critical two-tail 2.36462425 RM1 100% RM2 100% Mean 6.6 6.9 Variance 0.925 1.3 Observations 5 5 Hypothesized Mean Difference 0 df 8 t Stat -0.44971901 P(T<=t) one-tail 0.332424134 t Critical one-tail 1.859548033 P(T<=t) two-tail 0.664848268 t Critical two-tail 2.306004133 Ghi chú: T : tỏi TH: hợp chất tỏi, lá húng (tỷ lệ 1:1) RM: rau má DC: diếp cá T1: tỏi thử nghiệm trên vi khuẩn Vibrio alginolyticus T2: tỏi thử nghiệm trên vi khuẩn Vibrio harveyi