Khóa luận Xác định hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm

LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật ứng dụng, đặc biệt là các ngành công nghệ sinh học, y học và công nghiệp chế biến thực phẩm thì việc đánh giá chất lượng thực phẩm đang rất được quan tâm và chú ý. Trong số các chỉ tiêu dùng để đánh giá chất lượng thực phẩm như hàm lượng đường, hàm lượng lipit, các chất khoáng, các chất Vitamin … thì hàm lượng protein chứa trong thực phẩm là chỉ tiêu quan trọng hơn cả. Trong những năm vừa qua, ở nước ta vấn đề vệ sinh và an toàn thực phẩm đang trở thành một đề tài nóng bỏng, thu hút được sự chú ý của rất nhiều nhà khoa học. Vì vậy, mục đích của khoá luận này là bước đầu xác định hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm. Nội dung nghiên cứu của bản khoá luận này bao gồm: * Xây dựng một phương pháp cho phép xác định nhanh và tương đối chính xác hàm lượng các axit amin và protein trong thực phẩm. * Ứng dụng phương pháp trên vào việc đánh giá sơ bộ chất lượng của một số loại thực phẩm. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. PROTEIN VÀ CÁC CHỨC NĂNG [1,2,3]. 1.1. Định nghĩa. Protein là polyme sinh học của L-ỏ-aminoaxit kết hợp với nhau bằng liên kết peptit. 1.2. Phân loại. Dựa vào thành phần hoá học các protein được phân thành hai nhóm lớn: * Protein đơn giản: - Các L-ỏ-aminoaxit. - Polypeptit gồm hai hay vài chục aminoaxit liên kết với nhau. - Protein gồm vài chục aminoaxit trở lên liên kết với nhau. * Protein phức tạp: Phân tử của nó bao gồm phần protein và phần không phải protein gọi là " nhóm ngoại ". Tuỳ theo bản chất hoá học của nhóm ngoại, có thể phân thành các nhóm nhỏ như : - Metaloprotein (nhóm ngoại là ion kim loại như Fe3+, Zn2+). - Lipoprotein (nhóm ngoại là lipit). - Glycoprotein (nhóm ngoại là gluxit). - Phosphoprotein (nhóm ngoại là phosphat, ví dụ casein sữa). - Nucleoprotein (nhóm ngoại là axit nucleic). - Cromoprotein(nhóm ngoại là các chất mang màu). 1.3. Hàm lượng. Ở động vật có hàm lượng cao hơn thực vật, ở người protein chiếm tới 45% trọng lượng khô. Tỷ lệ protein cũng khác nhau giữa các bộ phận trong cơ thể sống. Bảng 1: Hàm lượng protein trong một số nguyên liệu động vật và thực vật. Nguyên liệu % Protein Nguyên liệu % Protein Gan 18-19 Moi 13-16 Tim 16-18 Ốc 11-12 Thịt gia súc 16-22 Sò 8-9 Trứng gia cầm 13-15 Hến 4-5 Sữa bò 3-5 Đậu tương 34-40 Cá 17-21 Lạc 23-27 Tôm 19-23 Ngô 8-10 Mực 17-20 Gạo 7-8 1.4. Chức năng. Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống. Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vật. Dưới đây là một số chức năng quan trọng của protein: 1. Xúc tác. Các protein có chức năng xúc tác các phản ứng sinh học gọi là enzim. Hầu hết các phản ứng của cơ thể sống từ những phản ứng đơn giản nhất như phản ứng hydrat hoá, phản ứng khử nhóm cacboxyl đến những phản ứng phức tạp như sao chép mã di truyền … đều do enzim xúc tác. 2. Vận tải. Protein đóng vai trò như là các phương tiện vận tải chuyên chở các chất trong cơ thể sống. Ví dụ, hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống), hemoxiamin (ở động vật không xương sống) kết hợp với O2 rồi vận chuyển O2 đến khắp các mô và cơ quan trong cơ thể. Hemoglobin còn vận tải cả CO2 và H+. Glubolin lại vận tải Fe. 3. Vận động. Nhiều protein trực tiếp tham gia trong quá trình chuyển động như : co cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào, di động của tinh trùng. Ở động vật có xương sống, sự co cơ được thực hiện nhờ chuyển động trượt trên nhau của hai loại sợi protein: sợi to chứa protein miozin và sợi mảnh chứa các protein actin, troponiozin, troponin. 4. Bảo vệ. Đó là các kháng thể trong máu động vật có xương sống. Chúng có khả năng nhận biết , "bắt" những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như protein lạ, virut, vi khuẩn hoặc tế bào lạ và loại chúng ra khỏi cơ thể. Ví dụ, các interferon là những protein do tế bào động vật có xương sống tổng hợp và tiết ra để chống lại sự nhiễm virut. Tác dụng của các interferon rất mạnh, chỉ cần ở nồng độ 10-11M đã có hiệu quả kháng virut rõ rệt. Interferon kết hợp vào màng nguyên sinh chất của các tế bào khác trong cơ thể và cảm ứng trạng thái kháng virut của chúng. Các protein tham gia trong quá trình đông máu có vai trò bảo vệ cho cơ thể sống khỏi bị mất máu. Ở một số thực vật có chứa các protein có tác dụng độc đối với động vật, ngay cả ở liều lượng rất thấp chúng cũng có tác dụng bảo vệ thực vật khỏi sự phá hoại của động vật. 5. Điều hòa. Một số protein có chức năng điều hoà quá trình thông tin di truyền, điều hoà quá trình trao đổi chất. Protein điều hoà quá trình biểu hiện gen, như các protein reprexơ ở vi khuẩn có thể làm ngừng quá trình sinh tổng hợp enzim của các gen tương ứng. Ở cơ thể bậc cao sự điều hoà hoạt động biểu hiện gen theo một cơ chế phức tạp hơn nhưng các protein cũng đóng vai trò quan trọng. Các protein có hoạt tính hormon, các protein ức chế đặc hiệu enzim đều có chức năng điều hoà nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau. 6. Truyền xung thần kinh. Một số protein có vai trò trung gian cho phản ứng trả lời của tế bào thần kinh đối với các kích thích đặc hiệu. Ví dụ vai trò của sắc tố thị giác rodopxin ở màng lưới mắt. 7. Cấu trúc. Các protein này thường có dạng sợi như sclerotin trong lớp vỏ ngoài của côn trùng, fibroin của tơ tằm, tơ nhện, colagen, elastin của mô liên kết, mô xương. 8. Dự trữ dinh dưỡng. Protein còn là chất dinh dưỡng quan trọng cung cấp các axit amin cho phôi phát triển. Ví dụ, albumin trong lòng trắng trứng, casein trong sữa, gliadin trong hạt lúa mì, zein của ngô… 1.5. CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN [1,2,3]. 1.5.1. Thành phần các nguyên tố của protein. Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, H, O, N. Một số còn có chứa một lượng nhỏ S. Tỷ lệ phần trăm khối lượng các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C: 50 - 55% O: 21 - 24% N: 15 - 18% H: 6.5 - 7.3% S : 0 - 0.24% Ngoài các nguyên tố trên, một số protein còn chứa một lượng rất nhỏ các nguyên tố khác như: P, Fe,Zn, Cu, Mn, Ca … 1.5.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein: L-a-aminoaxit. Tuy protein rất đa dạng về cấu trúc và đảm nhận nhiều chức năng như vậy song hầu như đều xây dựng nên các đại phân tử của mình chủ yếu từ 20 L-a-aminoaxit bằng liên kết peptit. Do vậy, cũng có thể xem các aminoaxit này là sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân peptit và protein. Valin, một đại diện của a-aminoaxit ở dạng không ion a-aminoaxit và lưỡng tính ở pH trung tính Hình 1: Cấu trúc của a-aminoaxit Biểu diễn trên không gian 3 chiều Các đồng phân lập thể Hình 2: Cấu trúc lập thể của a-aminoaxit Như vậy cấu tạo của chúng giống nhau ở chỗ cùng có nhóm cacboxyl -COOH và nhóm amin - NH2 đều gắn vào nguyên tử C ở vị trí a, còn khác nhau bởi cấu tạo của mạch bên R. Khi thiếu thậm chí chỉ một trong các axit amin cần thiết có thể làm cho protein được tổng hợp ít hơn protein bị phân giải, kết quả dẫn đến mất cân bằng đối với nitơ. Hàm lượng các axit amin không thay thế và tỉ lệ giữa chúng trong phân tử protein là một tiêu chuẩn quan trọng để đánh giá chất lượng protein. Trong dung dịch, các aminoaxit thường ở dạng ion lưỡng tính mang cùng một lúc điện tích dương (+) do nhóm -NH2 ở dạng -NH3+ và điện tích âm (-) do nhóm -COOH ở dạng -COO-. Chúng hấp thụ ánh sáng, đặc biệt là dung dịch của 3 aminoaxit chứa nhân thơm: Tryptophan, tyrozin và phenylalanin hấp thụ khá mạnh ánh sáng UV ở bước sóng gần 280nm. Trong dung dịch, tuỳ thuộc vào pH của môi trường nó có thể là ion lưỡng tính, hoặc mang điện (+) hoặc (-). Giá trị pH mà ở đó amino axit tồn tại dạng ion lưỡng cực được gọi là điểm đẳng điện và pH dược gọi là pI. Vì các mạch bên R khác nhau giữa các aminoaxit nên mỗi aminoaxit có một điểm đẳng điện riêng. Tại điểm đẳng điện, tổng điện tích của aminoaxit bằng 0. Còn ở bất kỳ điểm pH nào thấp hơn pI hoặc cao hơn pI các aminoaxit đều mang điện tích dương hoặc âm, điều này tuỳ thuộc điện tích mạch bên R của chính nó. Vì vậy, trong thực tế đặc tính này được sử dụng để phân tách và xác định các aminoaxit. 1.5.3. Peptit. Peptit là những phân tử sinh học cấu tạo từ một vài cho tới hàng chục amino axit. Peptit tạo thành từ các aminoaxit thông qua phản ứng nối đầu -NH2 của phân tử này với đầu -COOH của phân tử kia tạo ra liên kết peptit. Hình 3: Sự hình thành của một dipeptit Lys C-điểm cuối Ala Gly N-điểm cuối Glu Hình 4: Sự hình thành của một tetrapeptit. Ocbital p a-cacbon a-cacbon Đặc trưng liên kết đôi của bộ khung peptit Các góc và độ dài liên kết Hình 5: Cấu trúc của bộ khung peptit. Cấu trúc của liên kết peptit cho thấy hầu hết các liên kết bất biến -C=O và -N-H là song song hoặc gần song song và hơi bị xoắn xung quanh liên kết C-N. Chính sự lai tạo của ocbital p trong liên kết đôi C=O với đôi điện tử còn lại của N đã làm cho mặt phẳng liên kết trở nên vững chắc (xem hình 7) và nhờ các mặt phẳng này đã tạo ra liên kết bậc 2 (phiến gấp b) đối với cấu trúc của protein. Ngoài liên kết peptit, đôi khi giữa các aminoaxit còn có liên kết đisunfua nối 2 gốc xystein với nhau. Liên kết này có vai trò quan trọng giúp hình thành cấu trúc không gian của rất nhiều protein, đặc biệt protein ngoại bào có chức năng sinh học quan trọng như hocmon, immunoglobulin và kháng thể. Peptit có tính chất lý hoá không khác nhiều so với aminoaxit vì cùng chứa một nhóm -NH2 và -COOH tự do giống như aminoaxit. Sự khác nhau ở đây chỉ là do các mạch bên R của gốc amino axit tham gia chuỗi peptit gây ra. Các peptit bị thuỷ phân hoàn toàn bởi dung dịch HCl 6N ở 1100C trong 24h, hoặc bởi dung dịch kiềm để cho các amino axit tự do. Liên kết peptit còn bị thuỷ phân bởi enzim thuỷ phân protein gọi là proteazơ. Chúng có mặt ở tất cả các tế bào và mô tế bào để thực hiện nhiệm vụ chủ yếu là phân giải protein. 1.5.4. Cấu trúc không gian của protein. Cấu trúc không gian của protein là tập hợp không gian của tất cả các nguyên tử trong phân tử. Người ta phân biệt 4 bậc cấu trúc của protein như sau: a. Cấu trúc bậc 1 là trình tự sắp xếp các aminoaxit và vị trí liên kết đisunfua trong chuỗi polypeptit. Cấu trúc bậc 1 không có cấu hình không gian đặc hiệu. b. Cấu trúc bậc 2 phản ánh sự sắp xếp có quy luật trong không gian của các aminoaxit trong chuỗi polypeptit, phổ biến hơn cả là cấu trúc xoắn a và cấu trúc phiến gấp nếp b . c. Cấu trúc bậc 3 phản ánh tương quan không gian của các aminoaxit trong chuỗi polypeptit. Trong đó bao hàm sự xoắn hoặc uốn của các cấu trúc bậc 2 tạo nên cấu hình không gian đặc thù riêng cho từng loại protein. d. Cấu trúc bậc 4 phản ánh tương quan không gian giữa các sợi polypeptit (hay các phần dưới đơn vị) trong phức hợp phân tử protein. 1.5.4.1. Cấu trúc bậc 1: Các gốc aminoaxit trên chuỗi polypeptit được sắp xếp theo một trật tự nhất định và liên quan với chức năng sinh học của protein một cách hết sức chặt chẽ. Với sự tổ hợp khác nhau của 20 aminoaxit đã dẫn đến các loại protein khác nhau. Các protein có chức năng sinh học giống nhau thường có cấu trúc bậc 1 khá giống nhau. Như vậy có thể thấy trong bất kỳ cấu trúc bậc 1 nào của protein bao giờ cũng có những đoạn quan trọng bắt buộc phải có trình tự sắp xếp amino axit không thay đổi, ngoài ra ở một số vị trí nào đó có thể có sự thay đổi mà vẫn không ảnh hưởng đến chức năng của protein. 1.5.4.2. Cấu trúc bậc 2: gồm xoắn a, phiến gấp nếp b và xoắn colagen a. Cấu trúc xoắn a : Đoạn mạch polypeptit xoắn chặt lại làm cho những nhóm peptit(-CO-NH-), Ca tạo thành phần bên trong của lõi xoắn, các mạch bên R quay ra phía ngoài. Cấu trúc này được giữ vững chủ yếu nhờ liên kết hiđro được tạo thành giữa nhóm cacbonyl của một liên kết peptit với nhóm -NH của liên kết tiếp sau cách nhau 3 gốc aminoaxit trên cùng một mạch polypeptit. Tất cả các nhóm -CO và -NH có trong liên kết peptit của mạch polypeptit đều tạo thành liên kết hiđro với nhau như vậy, nghĩa là cứ mỗi nhóm -CO-NH- đều có thể tạo thành 2 liên kết hiđro với 2 nhóm -CO-NH- khác. Các liên kết hiđro được tạo thành với số lượng tối đa, bảo đảm độ bền vững cấu trúc xoắn a. Chiều xoắn có thể xoắn phải (thuận chiều kim đông hồ) hoặc trái, nhưng xoắn a trong phân tử protein thường là dạng xoắn phải. Chiều dài các đoạn xoắn a trong phân tử protein thường không dài, ngắn hơn 40Å. b. Cấu trúc phiến gấp nếp b : Xuất hiện trong fibroin của tơ tằm, nó khác với xoắn a ở một số điểm chủ yếu sau: - Đoạn mạch polypeptit có cấu trúc phiến gấp nếp b thường duỗi dài ra chứ không cuộn chặt như xoắn a. Khoảng cách trên trục giữa 2 gốc aminoaxit kề nhau là 3,5Å, còn ở xoắn a là 1,5Å . - Liên kết hiđro còn được tạo thành giữa 2 mạch polypeptit khác nhau, ở kề nhau, có thể cùng hướng hay ngược hướng với nhau. Trong phân tử của nhiều protein hình cầu cuộn chặt còn gặp kiểu cấu trúc “quay b”. Ở đó mạch polypeptit bị đảo hướng đột ngột. Đó là do tạo thành liên kết hiđro giữa nhóm -CO của liên kết peptit thứ n với nhóm -NH của liên kết peptit thứ n+2. Hình 6a: Xoắn a Hình 6b: Phiến gấp nếp b c. Cấu trúc xoắn colagen : Kiểu cấu trúc này xuất hiện trong phân tử colagen. Thành phần aminoaxit của colagen rất đặc biệt so với các protein khác: glixin chiếm khoảng 35%, prolin chiếm khoảng 12% tổng số aminoaxit trong phân tử. Ngoài ra colagen còn chứa 2 aminoaxit ít gặp trong các protein khác là hiđroxiprolin và hiđroxilizin. Đơn vị cấu trúc của colagen là tropocolagen bao gồm 3 mạch polypeptit bện vào nhau thành một “dây cáp” siêu xoắn. (e) (d) (c) (b) (a) Hình 7: Cấu trúc của sợi colagen a. Cấu trúc bậc1 và 2 của phân tử tropocolagen. b. Phân tử tropocolagen gồm 3 chuỗi polypeptit bện với nhau. c. Sự sắp xếp của các phân tử tropocolagen trong sợi colagen. d. Vết vằn ngang thể hiện các phân tử ở các dãy kề nhau xếp lệch nhau một khoảng cách 64 nm. e. Hình ảnh thu được qua kính hiển vi điện tử. 1.5.4.3. Cấu trúc bậc 3: Cấu trúc này phản ánh tương quan trên phạm vi toàn bộ sợi polypeptit. Những aminoaxit nằm ở xa nhau và nằm trong những cấu trúc bậc 2 khác nhau lại thường hay tương tác tiếp cận với nhau trong cấu trúc bậc 3. Các liên kết và tương tác yếu có vai trò quyết định giữ ổn định cấu trúc bậc 3. Với liên kết này các phân tử có xu thế cuộn chặt lại, các gốc kỵ nước quay vào trong, các gốc ưa nước ở trên bề mặt phân tử. Khi biến tính phân tử protein bằng các tác nhân hoá học hoặc vật lý tức là phá vỡ liên kết Van đe Van, liên kết hiđro, khử cầu sunfua, phân tử protein sẽ bị duỗi ra đồng thời thay đổi một số tính chất của nó, đặc biệt là tính tan và hoạt tính sinh học. Sự biến tính này có thể thuận nghịch nếu như chúng có thể trở lại trạng thái cấu trúc ban đầu và không thuận nghịch nếu như vĩnh viễn không trở lại trạng thái cấu trúc ban đầu. Với nhiệt độ cao thường phá vỡ tất cả các liên kết làm cho phân tử protein bị biến tính hoàn toàn, ví dụ nấu riêu cua, canh trứng. Các dung môi hữu cơ, muối amoni, chất tẩy rửa thường tác động nhẹ nhàng hơn chỉ phá vỡ tương tác kỵ nước. Độ pH cũng làm thay đổi tổng điện tích của phân tử protein và phá vỡ một phần liên kết hiđro nên cũng được xem là một yếu tố gây biến tính. Biến tính nghịch (a) (b) Hình 8: Cấu trúc bậc 3 của phân tử protein tự nhiên (a) và biến tính (b) 1.5.4.4. Cấu trúc bậc 4: Rất nhiều protein chứa 2 hoặc nhiều sợi polypeptit còn gọi là phần dưới dơn vị (subunit) giống nhau hoặc khác nhau. Do vậy cấu trúc bậc 4 phản ánh tương tác không gian giữa các phần này trong phân tử protein, Đầu N Đầu C Đầu C Đầu N a b Hình 9: So sánh cấu trúc của myoglobin (a) và cấu trúc của hemoglobin (b) Cấu trúc bậc 4 Cấu trúc bậc 3 Cấu trúc bậc 2 Nhóm hem Cấu trúc bậc 1 Hình 10: 4 bậc cấu trúc của protein 1.6. MỘT SỐ TÍNH CHẤT QUAN TRỌNG CỦA PROTEIN. 1.6.1. Khối lượng và hình dạng phân tử protein. Protein có khối lượng phân tử tương đối lớn, có dạng hình cầu hoặc dạng sợi. Protein hình cầu tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, rất hoạt động về mặt hoá học. Các protein hình sợi tương đối trơ về mặt hoá học, chủ yếu có chức năng cơ học. Ví du, colagen của da, xương, sụn, gân, răng; keratin của tóc, lông, fibroin của tơ, miozin của cơ... [1,2,3]. 1.6.2. Tính chất lưỡng tính của protein. Cũng như aminoaxit, protein cũng là chất điện ly lưỡng tính vì trong phân tử protein còn nhiều nhóm phân cực của mạch bên. Có thể điều chỉnh pH để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Khi pH = pI các protein dễ dàng kết tụ lại với nhau làm cho protein kết tủa [1,3,6]. 1.6.3. Tính chất dung dịch keo protein, sự kết tủa protein. Khi hoà tan, protein tạo thành dung dịch keo. Các phần tử keo có kích thước lớn, không đi qua màng bán thấm. Người ta sử dụng tính chất này để tinh sạch protein khỏi các chất phân tử thấp bằng phương pháp thẩm tách. Hai yếu tố đảm bảo độ bền dung dịch keo protein là: - Sự tích điện cùng dấu của các phân tử protein ở (pH # pI). - Lớp vỏ hyđrat bao quanh phân tử protein. Người ta thường dùng các muối vô cơ như (NH4)2SO4 hay các dung môi hữu cơ như axeton, etanol để tạo kết tủa protein nhưng phải tiến hành ở nhiệt độ thấp. Các yếu tố gây biến tính không thuận nghịch thường được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi dung dịch: dùng nhiệt, các axit mạnh, các kim loại nặng...[1,3,5,6]. 1.6.4. Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein Dung dịch protein có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở vùng có bước sóng 180-220nm và 250-300nm [3,6]. 1.6.5. Khả năng thuỷ phân của protein Các phân tử protein có thể bị thủy phân bằng axit, kiềm hay enzim cho các polypeptit và cuối cùng là các aminoaxit [1,3,6]. 2. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMINOAXIT VÀ PROTEIN. 2.1. Các phản ứng màu của axit amin và protein. 2.1.1. Phản ứng Biure. Đây là phản ứng đặc trưng của liên kết peptit. Trong môi trường kiềm, các hợp chất có chứa từ hai liên kết peptit trở nên có thể phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu xanh tím, tím, tím đỏ tuỳ thuộc vào số lượng liên kết peptit nhiều hay ít. Các phản ứng xảy ra như sau: * Phản ứng tạo biure. * Phản ứng với protein. Cũng tương tự như trường hợp của biure, các liên kết peptit ở dạng enol (trong môi trường kiềm) của các phân tử protein tạo phức với Cu2+: Dạng phức hợp như trên (với bốn nguyên tử nitơ tham gia tạo liên kết phối trí) thường có màu đỏ (hấp thụ cực đại ở bước sóng 520-535nm). Trong trường hợp chỉ có hai hay ba nguyên tử N tham gia tạo liên kết thì phức sẽ có màu tím hoặc màu xanh (hấp thụ cức đại ở những bước sóng tương ứng là 540-580 và 615-670nm). Vì vậy, thông thường sản phẩm phản ứng của các polypeptit khác nhau sẽ có màu thay đổi từ xanh tím đến đỏ tím. Phản ứng biure thường được ứng dụng để định lượng protein [1,3,6,9]. 2.1.2. Phản ứng với ninhiđrin. Các aminoaxit khi phản ứng với ninhiđrin ở nhiệt độ cao cho sản phẩm có màu xanh tím (hấp thụ cực đại ở khoảng bước sóng 570nm). Đây là phản ứng chung cho tất cả các aminoaxit có chứa nhóm NH2 ở vị trí Cỏ. Ngoài a-aminoaxit, các peptit, protein, muối amoni và amoniac cũng cho phản ứng này. Cơ chế phản ứng khá phức tạp như sau: Đầu tiên do tác dụng của các aminoaxit với ninhiđrin sẽ xuất hiện phức chất dạng bazơ-schiff. Sau đó xảy ra sự chuyển nhóm, tiếp theo là sự đề cacboxyl hoá và sự phân tách phức chất thành anđehit và aminođixetohiđrinden. Aminođixetohiđrinden lại ngưng tụ với một phân tử ninhiđrin khác và hình thành nên một hợp chất mới, đồng thời bị enol hoá và chuyển thành dạng có màu. Khi có các dung môi hữu cơ (axeton, etanol,piriđin … thường được dùng để pha ninhiđrin) thì sẽ xảy ra phản ứng sau: Sản phẩm của phản ứng này có chứa gốc R của aminoaxit ban đầu. Gốc này sẽ quyết định màu sắc khác nhau (xanh da trời, đỏ…) của các hợp chất khi phản ứng với ninhiđrin. Đặc biệt phức chất được tạo thành giữa prolin (có chứa nhóm imin) và ninhiđrin có màu vàng tươi, khác biệt hẳn với màu do các aminoaxit khác tạo nên trong phản ứng. Do vậy, ninhiđrin còn được sử dụng cho phản ứng màu đặc trưng để phát hiện prolin: Phức màu vàng Phản ứng với ninhiđrin có độ nhạy cao, do đó thường được dùng để định tính và định lượng protein [1,3,6]. 2.1.3. Phản ứng với axit HNO2. Dưới tác dụng của HNO2, aminoaxit bị deamin hoá tạo thành nitơ ở dạng khí. Phản ứng này được sử dụng để định lượng các a-aminoaxit (phương pháp Van Slyke) [6]. Phản ứng xảy ra như sau: 2.1.4. Phản ứng Pauli để phát hiện histiđin và tirozin. Khi tác dụng với axit điazobenzensunfonic (thuốc thử diazo), histiđin tạo thành phức chất màu mận chín, còn tirozin tạo thành phức chất màu da cam [6]. Các phản ứng xảy ra như sau: * Sự tạo thành axit điazobenzensunfonic: * Phản ứng của tirozin: Phức màu da cam. 2.1.5. Phản ứng Millon đặc trưng cho tyrozin. Thuốc thử Millon chính là muối thuỷ ngân nitrat trong HNO3 đặc. Khi cho thuốc thử Millon tác dụng với nhân phenol của tirozin sẽ tạo nên hợp chất nitrotirozin-thuỷ ngân có màu đỏ. Phản ứng xảy ra như sau: Phản ứng Millon được sử dụng để phát hiện tyrozin và các hợp chất phenol. Chú ý không cho quá nhiều thuốc thử Millon vì HNO3 có trong thuốc thử sẽ tác dụng với protein cho màu vàng [6]. 2.1.6. Phản ứng của các axit amin chứa lưu huỳnh (Phản ứng Folia). Các axit amin chứa lưu huỳnh như xistin, xistein, methionin dưới tác dụng của kiềm bị phân huỷ tạo thành natri sunfua (Na2S): RSH + 2NaOH ® Na2S + ROH + H2O Thêm chì axetat vào Na2S sẽ phản ứng tạo thành kết tủa nâu đen của chì sunfua (PbS) [6]. Na2S + Pb(CH3COO)2 ® 2CH3COONa + PbS¯ (kết tủa nâu đen) 2.1.7. Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin. Đây là phản ứng dùng để phát hiện acginin. Khi cho acginin tác dụng với hipobromua (NaBrO) và ỏ-naphtol sẽ tạo thành sản phẩm có màu đỏ cam [6]. Phản ứng có thể được trình bày như sau: 2.1.8. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho tryptophan. Trong môi trường axit, tryptophan phản ứng với nhiều loại anđehit tạo thành những sản phẩm ngưng kết có màu đỏ tím đặc trưng [6]. Các phản ứng xảy ra như sau: 2.2.Định lượng axit amin và protein. 2.2.1. Xác định N-amin bằng phương pháp chuẩn độ focmol. Các aminoaxit có thể phản ứng với focmol trung tính để tạo thành metyl - aminoaxit. Focmol đã khoá nhóm amin (NH2) mang tính kiềm nên có thể chuẩn độ nhóm cacboxyl trong phân tử aminoaxit bằng kiềm. Dựa vào lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ sẽ tính được lượng Nitơ của aminoaxit [6,9]. Phản ứng được biểu diễn như sau: 2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Lượng nitơ tổng số trong các phẩm vật có nguồn gốc sinh vật thường được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Đó là hàm lượng tổng của các dạng nitơ hữu cơ và vô cơ có trong phẩm vật nghiên cứu. Để định lượng nitơ protein, người ta thường xác định nitơ tổng số và nitơ phi protein theo phương pháp Kjeldahl, sau đó lấy hiệu số giữa hai dạng nitơ này rồi nhân với hệ số tương ứng [6,9]. Lưu ý: Các protein thực vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16.8%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 5.95 (100 : 16.8). Các protein động vật có tỷ lệ nitơ protein khoảng 16%, do vậy trong trường hợp này hệ số nhân sẽ là 6.25 (100 : 16) [6]. 2.2.2.1. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl. Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ (N) bị phân huỷ và bị oxi hoá đến CO2 và H2O, còn nitơ chuyển thành amoniac và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sunfat. Quá trình được tiến hành qua các bước sau: * Vô cơ hoá nguyên liệu. R-CHNH2-COOH + H2SO4 ® CO2 + H2O + (NH4)2SO4 * Cất đạm. (NH4)2SO4 + 2NaOH ® Na2SO4 + 2H2O + 2NH3­ Phản ứng xảy ra trong bình hứng: 2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 Chuẩn độ H2SO4 dư ở bình hứng bằng NaOH 0.1N. 2.2.2.2. Xác định nitơ phi protein. Để xác định N-phi protein cần dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng N-phi protein (ví dụ dung môi là etanol 70%). Tuy nhiên, trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại protein, vì vậy cần dùng chất kết tủa để tách phần protein hoà tan trong quá trình chiết rút. Kết tủa protein có thể tiến hành theo nhiều cách như: bằng etanol, axeton, các muối kim loại nặng, axit hoặc đun ở nhiệt độ cao … nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau đây: TCA 10-20%, poly nhôm clorua (PAC) với chất trợ keo tụ dạng âm A101, polyme C310H (keo tụ dương) Pb(CH3COO)2 10-15%, CuSO4 10% trong hỗn hợp với NaOH 10%, tỷ lệ 1 : 1 [5,6]. Sau khi đã loại bỏ kết tủa, dịch lọc chỉ còn chứa các dạng N-phi protein. Đem vô cơ hoá dịch này và tiếp tục tiến hành xác định hàm lượng nitơ theo phương pháp Kjeldahl. 2.2.2.3. Định lượng protein trong nguyên liệu. N-tổng số bao gồm N-protein và N-phi protein. Muốn xác định hàm lượng protein trong nguyên liệu phải xác định N-tổng số và N-phi protein. Hàm lượng protein trong mẫu được tính theo công thức sau: Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).6,25 Hoặc Protein (mg) = (Ntổng số - Nphi protein).5,95 2.2.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford. Các protein khi phản ứng với xanh Coomassie (Coomassie Brilliant Blue - CBB) sẽ hình thành hợp chất màu có khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép phát hiện tới vài mg protein/ml, dễ thực hiện và tiết kiệm thời gian [6,9] 2.2.4. Định lượng protein theo phương pháp Lowry. Protein tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteux tạo thành sản phẩm màu xanh. Đây là sản phẩm khử của photphomolipđat-photphovolframat bởi phức chất Đồng-Protein và có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ Protein trong một phạm vi cho phép. Dùng máy so màu quang điện để xác định cường độ màu trong các mẫu và so sánh với dịch protein tiêu chuẩn. Phương pháp Lowry sử dụng kết hợp phản ứng Biure (tác dụng lên liên kết peptit, mục 2.1.1.) và phản ứng với thuốc thử Folin (tác dụng lên các gốc Tyrozin, Tryptophan, Histiđin) để tạo phức có màu đặc trưng. Phương pháp có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định được đến nồng độ vài chục mg protein, do vậy được sử dụng rộng rãi để xác định nhiều loại protein ở dạng tương đối tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là màu của phức chất bị ảnh hưởng nếu trong dung dịch có chứa một số chất như EDTA, sacarozơ, đệm Tris hay một số chất khử như xistein, ditiotreitol ... [4,6,9] 2.2.5. Định tính và định lượng aminoaxit bằng phương pháp sắc ký giấy. Phương pháp sắc ký phân bố trên giấy dựa vào sự khác nhau về hệ số phân bố các chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn. Người ta mang lên một điểm ở đầu bản giấy sắc ký một giọt dung dịch nghiên cứu rồi nhúng đầu giấy có mang dung dịch nghiên cứu đó vào chậu dung môi hữu cơ linh động bão hoà nước (như rượu butilic). Trong quá trình di chuyển chậm của dung môi qua ống mao dẫn của giấy, các cấu tử riêng biệt của hỗn hợp sẽ chuyển dịch theo với vận tốc khác nhau, nhờ vậy mà hỗn hợp được phân chia ra thành các cấu tử thành phần. Sự chuyển dịch của các chất trong khi tiến hành sắc ký có thể giải thích như sau: Các sợi xenlulozơ của giấy có ái lực lớn đối với nước và hấp phụ nước trong dung môi hữu cơ bão hoà nước ( đóng vai trò là chất mang ). Ở đây pha tĩnh là nước, có chứa trong nước khoảng 20%, còn dung môi hữu cơ là chất lỏng linh động khi dung môi chảy qua phần giấy có chứa dung dịch nghiên cứu thì một phần các chất chuyển vào dung môi ( pha động ). Khi dung môi tới phần giấy không có chứa các chất phân tích thì ở đó lại xảy ra quá trình phân bố các chất giữa pha tĩnh là nước và pha động là dung môi hữu cơ. Lần này, các chất lại chuyển từ ( dung môi ) pha hữu cơ sang pha nước. Như vậy, nếu cho dung môi chuyển dịch liên tục qua giấy, các chất phân tích sẽ được chuyển từ điểm mang ban đầu đến một điểm khác trên giấy theo hưưóng chảy của dung môi do kết quả của quá trình tách phân bố liên tục giữa hai pha tĩnh và động. Quá trình phân tích này được tiến hành trong thiết bị kín bão hoà của dung môi và nước. Khi tuyến dung môi đã đi được đoạn đường 30 – 40 cm, người ta lấy giấy ra sấy khô và phun thuốc nhuộm màu, nhờ đó xác định được vị trí của các cấu tử trên dải giấy. Dải giấy sau khi hiện màu gọi là sắc ký đồ. Trong thực tiễn, hệ số vận tốc chuyển dịch (ký hiệu là Rf ) có ý nghĩa rất lớn. Hệ số vận tốc chuyển dịch Rf là tỉ số giữa quãng đường đi được của chất so với quãng đường chuyển dịch của dung môi. Rf = Quãng đường dịch chuyển của chất / Quãng đường dịch chuyển của dung môi. Rf: Là đại lượng đặc trưng và không đổi đối với mỗi chất trong những điều kiện xác định. Tuỳ thuộc vào hướng hoặc chiều chuyển dịch của dung môi, người ta phân biệt một số dạng sắc ký như sau: * Sắc ký nghịch: Khi dung môi chảy dịch từ dưới lên trên. * Sắc ký thuận: Khi dung môi chảy từ trên xuống. * Sắc ký vòng tròn: Khi dung môi chuyển dịch từ tâm ra xung quanh. Ngoài ra, người ta còn phân biệt: Sắc ký một chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một hướng nhất định. Sắc ký hai chiều khi cho dung môi chuyển dịch theo một chiều nào đó, sau đấy sấy khô và cho dung môi chảy theo một chiều khác vuông góc với chiều ban đầu. Phương pháp sắc ký giấy một chiều ( có thể thuận hoặc nghịch ) là phương pháp đơn giản nhất, chỉ dùng một hệ dung môi nào đó. Khả năng phân tích kém hơn sắc ký hai chiều. Trong sắc ký thuận, hệ số vận tốc chuyển dịch Rf lớn, nhưng các vết màu thu được không gọn, còn trong sắc ký nghịch đại lượng Rf nhỏ hơn, nhưng vết màu lại gọn hơn. Để định lượng các axit amin người ta thường sử dụng các phương pháp sau: * So sánh bằng mắt thường cường độ màu và diện tích các vết màu của hợp chất đã cho với cường độ màu và diện tích các vết màu của hỗn hợp đối chứng đã biết rõ nồng độ. * Đo chiết suất của dịch chiết chất màu từ sắc ký đồ bằng một dung môi thích hợp. Sai số của phương pháp này khoảng 3 – 6 %. * Dùng densitomet đo mật độ màu của các vết trong khi cho ánh sáng xuyên qua. Độ chính xác của phép đo tăng lên đến 10 – 15% [8,9] 2.2.6. Xác định aminoaxit và peptit bằng sắc ký lỏng pha ngược và sắc ký lỏng khối phổ ( thầy xem và sửa giúp em mục này) [10]. Phương pháp mới cho phép xác định nhạy các aminoaxit và peptit là sử dụng thuốc thử 2-(9-carbazole)-ethyl chloroformate (CEOC) với máy dò huỳnh quang (FL) đã được phát triển. Sự phát hiện ra các dẫn xuất đã được tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Nhóm mang màu trong thuốc thử 2-(9-fluorenyl)-ethyl chloroformate (FMOC) đã được thay thế bằng carbazole,dẫn đến một tác nhân dẫn xuất có tính nhạy quang là CEOC. CEOC có thể phân loại các peptit và aminoaxit dễ dàng và nhanh chóng. Chất dẫn xuất đủ bền để có khả năng phân tích bởi phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hiệu suất tạo dẫn xuất cực đại (gần 100%) được quan sát với số mol thuốc thử vượt quá 3-4 lần và nằm trong khoảng pH = 8.8 ¸ 10. Các dẫn xuất có độ nhạy quang mạnh cho phép bơm thẳng vào hỗn hợp phản ứng mà không làm xáo trộn đáng kể bởi sản phẩm phụ trong quá trình phân huỷ tác nhân nhạy quang như là 2-(9-carbazole)-ethanol và 2-(9-carbazole)-ethyl carbonate. Thêm vào đó, quá trình phát hiện sự phản ứng với dẫn xuất CEOC được so sánh với quá trình phát hiện sự phản ứng thu dược bằng FMOC. Tỷ lệ ACCEOC /ACFMOC = 1.00 ¸ 1.82 cho sự cảm ứng phát huỳnh quang (FL) và AC'CEOC /AC'FMOC = 1.00 ¸ 1.21 cho sự cảm ứng tử ngoại - cực tím (UV). Ở đây AC và AC' là sự cảm ứng tương ứng giữa FL và UV. Sự phân tách các chất dẫn xuất của peptit và aminoaxit dã được tối ưu hoá trên cột Hypersil BDS C18. Phương pháp này được sử dụng thành công để phân tích protein thuỷ phân từ len và từ dẫn xuất trực tiếp của bia. CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ. 1.1. Chuẩn bị hoá chất. 1.1.1. Pha thuốc thử. * Thuốc thử Biure (còn gọi là tác nhân Gornal). Cân 5g CuSO4.5H2O hoà tan trong 495ml H2O ta được dung dịch A (dung dịch 5g CuSO4.5H2O 1%). Cân 10g KNaC4H4O6.4H2O (Kali Natri tactrat) hoà tan trong 490ml H2O ta được dung dịch B (dung dịch KNaC4H4O6.4H2O 2%). Cân 20.5g Na2CO3 và 4g NaOH hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch C (dung dịch Na2CO3 2% trong NaOH 0.1N). Pha thuốc thử Biure (chỉ pha trước khi dùng): Lấy 1ml dung dịch A + 1ml dung dịch B + 98ml dung dịch C. Thuốc thử Biure có màu xanh nhạt. Thuốc thử Biure không dùng được trong môi trường có NH4+ vì NH4+ tạo phức với Cu2+ không màu, bền nên không tạo phức sinh màu được với polypeptit. * Thuốc thử Folin-Ciocalteux. Hoà tan 100g Na2VO4.2H2O và 25g Na2MoO4.2H2O vào 800ml nước cất. Thêm 50 ml dung dịch H3PO4 80% và 100 ml HCl đậm đặc. Đun sôi hỗn hợp trong bình cầu đáy tròn dung tích 2000 ml với ống sinh hàn ngược trong vòng 10 giờ. Có thể đun ngắt quãng, không cần phải đun liên tục, nhưng phải đun sôi đủ 10 giờ. Sau khi đun xong thêm vào hỗn hợp 150g Li2SO4, 50 ml nước cất và 5 giọt nước Br2. Đun sôi 15 phút không có ống sinh hàn ngược để loại trừ lượng Br2 dư. Dung dịch thuốc thử phải có màu vàng, không được có màu xanh. Nếu thuốc thử có màu xanh thì phải xử lí với Brôm lần thứ hai. Sau khi làm nguội dung dịch, thêm nước cất cho tới vạch mức trong bình định mức dung tích 1000 ml. Xác định nồng độ của thuốc thử bằng cách chuẩn độ dung dịch Folin - Ciocalteux pha loãng 10 lần với dung dịch NaOH 0.1N (dùng chất chỉ thị là phenolphtalein). Bảo quản thuốc thử Folin trong bình thuỷ tinh màu, để trong tủ lạnh. Sau 2-3 tháng dung dịch ngả màu xanh thì thêm vài giọt Brôm và lại đun sôi 15 phút, dung dịch có màu vàng trở lại. Trước khi dùng, pha loãng thuốc thử bằng nước cất sao cho nồng độ thuốc thử bằng 1N. Protein hiện màu tím - xanh trong môi trường kiềm do sự oxy hoá của volframat và molipđat các gốc tirozin và triptophan trong protein. Các chất ure (0.5%), guanidin (0.5%), vonphramat natri (0.5%), sunfat natri (1%), nitrat natri (1%), clorat (0.5%), tricloaxetat (0.5%), rượu etylic (5%), ete (5%), axeton (0.5%), sunfat kẽm (0.1%), hydroxit bari (0.5%), sunfatamon (0.15%) - không làm giảm màu của phản ứng. Glixin (0.5%) làm giảm đến 50% màu của phản ứng. Đệm phosphat từ 0.1M trở lên gây kết tủa phản ứng màu. * Pha dung dịch đệm phosphat có pH=8. Cân 11.8660g Na2HPO4 hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch E. Cân 9.0780g KH2PO4 hoà tan trong 1000ml H2O ta được dung dịch F. Tiếp theo, dùng pipet lấy chính xác 5.5ml dung dịch F cho vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch E vào bình cho tới vạch mức ta được dung dịch đệm phosphat có pH=8. 1.1.2. Pha dung dịch casein chuẩn. Cân 0.6250g casein (chứa 80% là protein) chuyển vào bình định mức 500ml, thêm dung dịch đệm phosphat có pH=8 vào bình. Đặt bình trên máy khuấy từ và giữ nhiệt độ trong khoảng 50-600C. Sau khi casein đã tan hết, dùng nước cất định mức tới vạch ta được dung dịch casein chuẩn có nồng độ 1 mgprotein/ml. Pha dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein là 50mg/ml từ dung dịch casein chuẩn ở trên bằng cách dùng pipet hút chính xác 5ml dung dịch casein chuẩn 1 mg/ml cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất. Bằng cách tương tự ta sẽ pha được các dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein là 100, 150, 200, 300, 400, 500 mgprotein/ml. Các dung dịch casein chuẩn trên được dùng để lập đường chuẩn xác định hàm lượng các aminoaxit và protein trong thực phẩm. 1.1.3. Các hoá chất khác. Ngoài các hoá chấ trên, trong quá trình làm thực nghiệm còn dùng các loại hóa chất khác như: HCl đậm đặc, H3PO4 85%, Na2VO4.2H2O, Na2MoO4.2H2O, Li2SO4, NaOH 0.1N, nước Brôm … 1.2. Dụng cụ và thiết bị. * 10 ống nghiệm sạch, khô trong 1 giá gỗ. * 1 pipet 10 ml có chia vạch. * 1 pipet 5 ml có chia vạch. * 2 pipet 2 ml có chia vạch. * 4 pipet 1 ml có chia vạch. * 2 bình định mức 100 ml. * 1 bình định mức 500 ml. * 1 bình định mức 1000 ml. * 2 ống đong 100 ml. * 2 bình tam giác 250 ml. * 2 cốc dung tích 1000 ml. * 1 buret 25 ml. * 1 bình cầu 3 cổ + 1 bộ giá đỡ. * 1 sinh hàn hồi lưu. * 1 bếp điện. * Máy khuấy từ có điều chỉnh nhiệt độ. * 2 cuvet dày 1 cm. * Máy đo quang MC - 752. 2. Xác định hàm lượng axit amin và protein trong một số thực phẩm. Như đã trình bày ở phần tổng quan, các aminoaxit và protein phản ứng với hỗn hợp thuốc thử Biure + Folin-Ciocalteux tạo hợp chất màu xanh và được đo quang ở bước sóng 750 nm. Phương pháp này đã được hoàn thiện từ lâu, các điều kiện tối ưu đã được xác lập, vì vậy chúng tôi chọn phương pháp này để xác định hàm lượng của các aminoaxit và protein trong một số loại thực phẩm. 2.1. Quy trình phân tích chung. Mẫu thật: Lấy chính xác vào ống nghiệm sạch, khô 0.5 ml dung dịch nghiên cứu, thêm vào 0.5 ml H2O và 2.5 ml thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Từ số đọc của mẫu thí nghiệm, đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính ra hàm lượng protein trong 1 ml dịch nghiên cứu, từ đó tính ra hàm lượng % protein trong nguyên liệu. Mẫu trắng: Song song với mẫu thí nghiệm, làm ống đối chứng trong đó thay dung dịch protein bằng nước cất và tiếp tục làm như đối với mẫu thật.. 2.2. Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein. Để xác định được hàm lượng của các aminoaxit và protein trong thực phẩm ta phải xây dựng đường chuẩn. Dùng pipet lấy chính xác 1 ml các dung dịch casein chuẩn có nồng độ protein lần lượt là 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 mg/ml cho vào 7 ống nghiệm sạch khô. Thêm vào 2.5 ml dung dịch thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm được kết quả ở bảng được kết quả ở bảng 2. Bảng 2: Mật độ quang của các dung dịch protein chuẩn. Protein mg/ml 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.50 A750 0.124 0.136 0.147 0.159 0.178 0.209 0.231 So với mẫu trắng A750 = 0.106, ta được kết quả hiệu chỉnh như ở bảng 3. Bảng 3: Mật độ quang của các dung dịch protein chuẩn (đã hiệu chỉnh). Protein mg/ml 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.40 0.50 A750 0.018 0.030 0.041 0.053 0.072 0.103 0.125 Các kết quả trên được biểu diễn ở hình 11. Hình 11: Đường chuẩn xác định hàm lượng aminoaxit và protein. Khi xử lý trên máy tính theo phương trình hồi quy tuyến tính ta tìm được phương trình liên quan. A750 = 0.2381Cprotein + 0.0053 (1) Đường chuẩn thực tế khá thẳng nên phương trình (1) có thể sử dụng để tính nhanh kết quả khi phân tích các mẫu. 2.3. Phân tích nước mắm. 2.3.1. Quy trình phân tích nước mắm. Dùng pipet lấy chính xác 2 ml dung dịch nước mắm cần phân tích cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất (dung dịch mẫu). Tiếp theo lấy 0.5 ml dung dịch mẫu cho vào một ống nghiệm sạch, khô. Thêm tiếp vào ống nghiệm 0.5 ml H2O +2.5 ml Biure + 0.25 ml Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Hàm lượng aminoaxit và protein trong nước mắm được tính theo công thức sau: Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tính như sau: 2.3.2. Kết quả phân tích. Kết quả phân tích hàm lượng axit amin và protein trong nước mắm được thể hiện trong bảng 4: Bảng 4: Hàm lượng các axit amin và protein trong nước mắm. STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng Protein (mg/ml) 1 Nước mắm Knorr 0.201 37.67 2 Nước mắm Nhĩ cao cấp Nha Trang 0.186 31.37 3 Nước mắm Nhĩ đặc biệt Nha Trang 0.184 30.53 4 Nước mắm cao đạm Cát Hải 0.180 28.85 5 Xì dầu Trung Quốc (nước chấm đậu nấm) 0.176 27.17 6 Nước tương Bibom Việt Tiến 0.171 25.07 7 Nước mắm thường 0.159 20.03 Bình luận: Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong nước mắm là rất cao (khoảng 20-40 mg/ml). Hơn nữa, các loại nước mắm đều có màu khá đậm, do đó khi tiến hành phân tích ta cần pha loãng mẫu bằng nước cất để hạn chế sai số của phép đo. Cũng qua bảng số liệu phân tích ta thấy các loại nước mắm khác nhau thì hàm lượng aminoaxit và protein chứa trong nó là khác nhau và giá thành cũng khác nhau. 2.4. Phân tích bia. 2.4.1. Quy trình phân tích bia. Dùng pipet lấy chính xác 0.1 ml mẫu bia cần phân tích cho vào 1 ống nghiệm sạch, khô. Tiếp theo, thêm vào ống nghiệm 0.9 ml H2O và 2.5 ml dung dịch thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Hàm lượng aminoaxit và protein trong bia được tính theo công thức sau: Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tính như sau: 2.2.4.2. Kết quả phân tích. Kết quả phân tích hàm lượng các axit amin và protein trong bia được thể hiện trong bảng 5: Bảng 5: Hàm lượng các axit amin và protein trong bia. STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng Protein (mg/ml) 1 Bia lon Heliken 0.208 4.06 2 Bia lon Carberg 0.203 3.85 3 Bia lon Tiger 0.190 3.31 4 Bia lon Halida 0.180 2.84 5 Bia lon Hà Nội 0.174 2.63 6 Bia chai Hà Nội 0.171 2.51 7 Bia hơi Hà Nội 0.169 2.42 8 Bia thủ công Trung Hoà 0.151 1.67 Bình luận: Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong bia là không cao (dưới 5 mg/ml). Tuy vậy, các loại bia vốn đã trở thành thương hiệu nổi tiếng như Heliken, Carberg …thì lượng đạm hoà tan chứa trong nó là cao hơn hẳn so với các loại bia khác. Đó cũng là một cơ sở để giải thích tại sao các loại bia trên có hương vị đậm đà, lôi cuốn và giá thành cao như vậy. 2.5. Phân tích sữa uống. 2.5.1. Quy trình phân tích sữa. Dùng pipet lấy chính xác 2 ml dung dịch sữa cần phân tích cho vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất vào bình, lắc đều, sau đó định mức đến vạch bằng nước cất (dung dịch mẫu). Tiếp theo lấy 0.5 ml dung dịch mẫu cho vào một ống nghiệm sạch, khô. Thêm tiếp vào ống nghiệm 0.5 ml H2O +2.5 ml Biure + 0.25 ml Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Hàm lượng aminoaxit và protein trong nước mắm được tính theo công thức sau: Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tính như sau: 2.5.2. Kết quả phân tích. Kết quả phân tích hàm lượng các axit amin và protein trong sữa uống được thể hiện trong bảng 6: Bảng 6: Hàm lượng các axit amin và protein trong sữa uống. STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng Protein (mg/ml) 1 Sữa bò Mộc Châu 0.190 33.05 2 Sữa tươi tiệt trìng Vinamilk 0.189 32.63 3 Sữa tươi nguyên kem Izzi 0.185 30.95 4 Sữa Cô Gái Hà Lan 0.184 30.53 5 Sữa Nuvi 0.182 29.69 6 Sữa chua Yomost 0.142 12.89 7 Sữa Elovi (sữa pha nước cam tươi) 0.136 10.37 Bình luận: Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong sữa uống là khá cao. Các loại sữa khác nhau có hàm lượng đạm khác nhau và giá thành cũng khác nhau. Các loại sữa có pha thêm nước hoa quả (như sữa Elovi), các loại sữa chua (như sữa chua Yomost) hàm lượng đạm hoà tan nhỏ hơn hẳn. Hàm lượng đạm trong sữa chua nhỏ như vậy là do một phần protein bị kết tủa. Tuy nhiên, do trong sữa có chứa một lượng đường nhất định nên phép phân tích ít nhiều bị ảnh hưởng. Để đánh giá chính xác chất lượng của một loại sữa ta cần tiến hành phân tích thêm các chỉ tiêu quan trọng khác như hàm lượng cacbohyđrat (đường), hàm lượng lipit (chất béo), hàm lượng các chất khoáng, các chất Vitamin … 2.6. Phân tích sữa đậu nành. 2.6.1. Chuẩn bị mẫu phân tích. Cân 200g đậu tương chia làm 4 phần. Tiến hành ngâm hiếu khí các mẫu trong cùng điều kiện với khoảng thời gian tương ứng là1, 2, 3, 4 ngày đêm. Sau đó đem xay nát rồi thu lấy phần nước. 2.6.2. Quy trình phân tích. Dùng pipet lấy chính xác 2 ml sữa thu được đem định mức thành 100 ml (dung dịch mẫu). Tiếp theo lấy 0.5 ml dung dịch mẫu vào 1 ống nghiệm sạch, khô. Thêm vào ống nghiệm 0.5 ml H2O và 2.5 ml dung dịch thuốc thử Biure, lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng 10 phút. Sau đó thêm chính xác 0.25 ml dung dịch Folin-Ciocalteux nồng độ 1N, lắc đều, sau 30 phút đem so màu trên máy ở bước sóng 750 nm. Hàm lượng aminoaxit và protein được xác định theo công thức sau: Ghi chú: Hàm lượng protein tính theo phương trình đường chuẩn là số mg protein/ml và được tính như sau: 2.2.6.3. Kết quả phân tích. Kết quả phân tích hàm lượng các axit amin và protein trong sữa đậu nành được thể hiện trong bảng 7: Bảng 7: Hàm lượng các axit amin và protein trong sữa đậu nành. STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng Protein (mg/ml) 1 Sữa đậu nành (ngâm 1 ngày đêm có sục khí) 0.149 15.83 2 Sữa đậu nành (ngâm 2 ngày đêm có sục khí) 0.153 17.51 3 Sữa đậu nàmh (ngâm 3 ngày đêm có sục khí) 0.139 11.63 4 Sữa đậu nành (ngâm 4 ngày đêm có sục khí) 0.138 11.21 5 Sữa đậu nành Fami (mua ngoài thị trường - có đường) 0.157 19.19 Bình luận: Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong sữa đậu nành khá cao, do đó uống sữa đậu nành là rất tốt. Cũng qua bảng số liệu phân tích ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong mẫu 2 (ngâm 2 ngày đêm có sục khí) là cao nhất. Do vậy, khi làm sữa đậu nành tốt nhất là ngâm và cho hạt nảy mầm trong 2 ngày đêm (có sục khí). Nếu thời gian ngâm và cho hạt nảy mầm lâu hơn có thể khiến cho hạt bị thối và tiêu hao mất nhiều vật chất khô. 2.7. Phân tích đậu xanh và giá đỗ. 2.7.1. Quy trình phân tích. Mẫu 1 (đậu xanh ngâm): Cân 30g đậu xanh ngâm một đêm, tách vỏ, đem xay, lọc bỏ bã, thu phần nước và định mức thành 500 ml. Sau đó, lấy 1ml định mức thành 100 ml rồi tiến hành phân tích theo phương pháp Lowry (như ở trên). Mẫu 2 (giá đỗ tự làm): Cân 50g đậu xanh ngâm ủ trong 6 ngày được 253.8g giá. Cân 100g giá đem xay, lọc bỏ bã, thu phần nước và định mức thành 1000 ml. Sau đó, lấy 1 ml định mức thành 100 ml rồi tiến hành phân tích theo phương pháp Lowry (như ở trên). Mẫu 3 (giá đỗ mua ngoài chợ): Cân 100g giá đỗ đem xay, lọc bỏ bã, thu phần nước và định mức thành 1000 ml. Sau đó, lấy 1 ml rồi định mức thành 100 ml rồi tiến hành phân tích theo phương pháp Lowry (như ở trên). Mẫu 4(rễ giá tự làm): Cân 15.7 gam rễ giá tự làm đem xay lọc bỏ bã, thu phần nước và định mức thành 250 ml. Sau đó lấy 1ml định mức thành 100ml rồi tiến hành phân tích theo phương pháp Lowry (như ở trên). Ghi chú: Số gam protein tính theo phương trình đường chuẩn được tính theo công thức sau: 2.7.2. Kết quả phân tích. Kết quả phân tích hàm lượng các axit amin và protein trong đậu xanh và giá đỗ được thể hiện trong bảng 8: Bảng 8: Hàm lượng axit amin và protein trong đậu xanh và trong giá đỗ. STT Mẫu Mật độ quang A Hàm lượng protein (%) 1 Giá đỗ mua 0.124 54.15 2 Giá đỗ tự làm 0.120 37.09 3 Đậu xanh ngâm 12h 0.129 24.78 4 Rễ giá đỗ làm 0.114 3.61 Bình luận: Qua bảng số liệu phân tích và kết quả tính được ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein trong đậu xanh và giá đỗ là rất cao, do đó chúng dược xếp vào hàng các loại rau cao cấp. Cũng qua bảng số liệu phân tích ta thấy hàm lượng aminoaxit và protein chứa trong rễ giá đỗ chiếm một tỷ lệ đáng kể (3.61%). Điều đó có thể là một cơ sở để giải thích tại sao chỉ có ở cây họ đậu mới có vi khuẩn sống cộng sinh. Khi làm giá đỗ ta nên hạn chế sự phát triển của rễ. Hàm lượng aminoaxit và protein trong giá đỗ tự làm nhỏ hơn so với giá đỗ mua ngoài thị trường có thể là do kỹ thuật làm giá đỗ chưa được tốt nên để cho rễ mọc dài và nhiều [7]. CHƯƠNG 3. KẾT LUẬN 1. Đã xây dựng thành công phương pháp xác định hàm lượng các aminoaxit và protein để sơ bộ đánh giá chất lượng của một số loại thực phẩm. 2. Có thể dùng phương pháp Lowry để xác định nhanh hàm lượng các aminoaxit và protein trong đậu xanh, giá đỗ, trong bia, nước mắm, trong sữa uống nói chung cũng như trong một số loại thựcc phẩm khác. 3. Đã tiến hành phân tích hàm lượng aminoaxit và protein trong một số loại bia. Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng aminoaxit và protein hoà tan chứa trong bia là không cao (dưới 5 mg/ml). 4. Đã tiến hành phân tích hàm lượng aminoaxit và protein trong một số loại nước mắm. Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng đạm hoà tan chứa trong nước mắm là rất cao (koảng 20-40mg/ml). 5. Đã tiến hành phân tích hàm lượng aminoaxit và protein trong một số loại sữa uống. Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng đạm hoà tan chứa trong sữa uống rất cao. 6. Đã tiến hành phân tích hàm lượng aminoaxit và protein trong đậu tương, trong sữa đậu nành . Kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng đạm hoà tan chứa trong sữa đậu nành khá cao. 7. Đã tiến hành phân tích hàm lượng aminoaxit và protein trong đậu xanh và giá đỗ. Kết quả phân tích cho thấy, việc sử dụng đậu xanh và giá đỗ làm thực phẩm là rất tốt vì hàm lượng đạm chứa trong nó rất cao so với nhiều loại thực phẩm khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quuốc Thắng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi Đức Lợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Diên, Hoá sinh công nghiệp, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 1998. 2. Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Lợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn, Hoá học thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 1994. 3. Trịnh Lê Hùng, Bài giảng Cơ sở hoá sinh, Hà Nội 2004. 4.Trần Đình Thanh, Luận án tiến sĩ hoá học, "Phân tách papain và nghiên cứu sử dụng các chế phẩm của papain có hoạt tính sinh học cao", Hà Nội 2002. 5. Trần Mai Phương, Lê Văn Cát, Tách protein trong nước thải giết mổ bằng phương pháp kết tủa và keo tụ, Tạp chí Hoá học, T.43, Hà Nội 2005, 71-73. 6. Nguyễn Quang Vinh, Bùi Phương Thuận, Phan Tuấn Nghĩa, Thực tập hoá sinh học, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, 2004. 7. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu, Đánh giá chất lượng hạt của một số giống Đậu xanh, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 2003, 398-400. 8. Rodney F. Boyer, Modern Experimental Biochemistry, The Benjamin/Cummings Publishing Company, INC, 1986. 9. W.J. Stadelman, A. Watrins, Analysis of Food Constituents, WiLey-VCH, 1997. 10. Jinmao You, Yichu Shan, Liang Zhen, Lin Zhang, Yukui Zhang, Determination of peptides and amino acicds from wool and beer with sensitive fluorescent reagent 2-(9-carbazole)-ethyl chloroformate by reverse phase High-performance liquid chromotography and liquid chromotography mass spectrometry, 2002. MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Protein và các chức năng 1.1. Định nghĩa 1.2. Phân loại 1.3. Hàm lượng 1.4. Chức năng 1.5. Cấu tạo phân tử protein 1.5.1. Thành phần các nguyên tố của protein 1.5.2. Đơn vị cấu tạo cơ sở của protein: L-a-aminoaxit 1.5.3. Peptit 1.5.4. Cấu trúc không gian của protein 1.5.4.1. Cấu trúc bậc 1 1.5.4.2. Cấu trúc bậc 2 1.5.4.3. Cấu trúc bậc 3 1.5.4.4. Cấu trúc bậc 4 1.6. Một số tính chất quan trọng của protein 1.6.1. Khối lượng và hình dạng phân tử protein 1.6.2. Tính chất lưỡng tính của protein 1.5.3. Tính chất dung dịch keo protein, sự kết tủa protein 1.6.4. Khả năng hấp thụ tia tử ngoại của protein 1.6.5. Khả năng thuỷ phân của protein 2. Các phương pháp xác định hàm lượng axit amin và protein 2.1. Các phản ứng màu của axit amin và protein 2.1.1. Phản ứng Biure 2.1.2. Phản ứng với ninhiđrin 2.1.3. Phản ứng với axit HNO2 2.1.4. Phản ứng Pauli để phát hiện Histiddin và tyrozin 2.1.5. Phản ứng Millon đặc trưng cho Tyrozin 2.1.6. Phản ứng của các axit amin chứa S (phản ứng Folia) 2.1.7. Phản ứng Sakaguchi đặc trưng cho acginin 2.1.8. Phản ứng Adamkievic đặc trưng cho Tryptophan 2.2. Định lượng axit amin và protein 2.2.1. Xác định N-amin bằng phương pháp chuẩn độ focmol 2.2.2. Định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl 2.2.3. Định lượng protein theo phương pháp Bradford 2.2.4. Định lượng protein theo phương pháp Lowry 2.2.5. Định tính và định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký giấy 2.2.6. Xác định aminoaxit và peptit bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp (HPLC) CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 1. Dụng cụ và hoá chất 1.1. Chuẩn bị hoá chất 1.1.1. Pha thuốc thử 1.1.2. Pha dung dịch casein chuẩn 1.1.3. Các hóa chất khác 1.2 Dụng cụ và thiết bị 2. Xác định hàm lượng axit amin và protein trong mộ số thực phẩm 2.1. Quy trình phân tích chung 2.2. Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng axit amin và protein 2.3. Phân tích nước mắm 2.3.1. Quy trình phân tích nước mắm 2.3.2. Kết quả phân tích 2.4. Phân tích bia 2.4.1. Quy trình phân tích bia 2.4.2. Kết quả phân tích 2.5. Phân tích sữa uống 2.5.1. Quy trình phân tích sữa uống 2.5.2. Kết quả phân tích 2.6. Phân tích sữa đậu nành 2.6.1. Chuẩn bị mẫu phân tích 2.6.2. Quy trình phân tích 2.6.3. Kết quả phân tích 2.7. Phân tích đậu xanh và giá đỗ 2.7.1. Quy trình phân tích 2.7.2. Kết quả phân tích CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO