Khóa luận Ứng dụng phương pháp in situ hybridization để chẩn đoán mầm bệnh wssv (white spot syndrome virus) trên tôm sú (penaeus monodon) và tsv (taura syndrome virus) trên tôm thẻ chân trắng (penaeus vannamei)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM THỊ TUYẾT ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình chỉ bảo, hƣớng dẫn và giải đáp những khó khăn, vƣớng mắc trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. CN. Phạm Văn Điền và CN. Hứa Đức Quới đã giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. TS. Lý Thị Thanh Loan và ThS. Đinh Thị Thủy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị làm việc tại phòng Mô Học, phòng Sinh Học Phân Tử và phòng Chất Lƣợng Nƣớc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Cô Linh, chị Lan thuộc Chi Cục Bảo Vệ Nguồn Lợi Thủy Sản Phú Yên đã giúp tôi thu mẫu hoàn thành đề tài. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Thành phố HCM, tháng 9 năm 2005 Sinh viên Phạm Thị Tuyết Anh iv TÓM TẮT PHẠM THỊ TUYẾT ANH, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 9 – 2005. ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION (ISH) ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO. Đề tài đƣợc thực hiện từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005, tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, trên hai đối tƣợng là TSV trên P. vannamei (Postlarvae và thƣơng phẩm) và WSSV trên P. monodon (Postlarvae và thƣơng phẩm). Hai loại virus này có mức độ nguy hiểm và khả năng tạo dịch bệnh lớn ở tôm nuôi tại Việt Nam. Do đó, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) hay lai tại chỗ nhằm mục tiêu phát hiện nhanh và chính xác các mẫu tôm nhiễm bệnh Taura và đốm trắng, để có biện pháp xử lý kịp thời, góp phần phòng ngừa sự lây lan và bùng phát hai loại dịch bệnh này. Đề tài gồm các thí nghiệm sau: 1. Các thí nghiệm trên P. vannamei Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán TSV trên P. vannamei. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ƣu, thực hiện trên 5 nghiệm thức. Kết quả nhiệt độ biến tính mẫu theo nghiệm thức thứ ba (probe đƣợc biến tính trƣớc ở 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C; khi lai thì cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút, sau đó ủ mẫu qua đêm ở 420C) là tốt nhất trên postlarvae và tôm thƣơng phẩm.  Thí nghiệm tìm thời gian cắt tối ƣu với Proteinase K, thực hiện trên 5 nghiệm thức: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. Kết quả thời gian cắt với Proteinase K tối ƣu trên postlarvae là 15 phút và trên tôm thƣơng phẩm là 17 phút.  Thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp, thực hiện trên 3 nghiệm thức: 100µl, 75µl và 50µl. Kết quả thể tích dung dịch lai thích hợp nhất trên tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm là 75µl. 2. Các thí nghiệm trên P. monodon Thí nghiệm theo quy trình chuẩn của bộ kit để ổn định phƣơng pháp ISH chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy v rằng phƣơng pháp ISH đƣợc ứng dụng rất hiệu quả trong chẩn đoán WSSV trên P. monodon. Thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện, gồm các thí nghiệm nhỏ sau:  Thí nghiệm thay đổi một số hóa chất thông dụng nhƣ cồn tuyệt đối, xylene và paraformaldehyde do Việt Nam và Trung Quốc sản xuất, nhằm giảm chi phí chẩn đoán. Kết quả thí nghiệm cho thấy không có sự khác biệt so với thí nghiệm dùng các hóa chất nhƣ bộ kit đã khuyến cáo sử dụng.  Thí nghiệm dùng quy trình xử lý mẫu nhanh: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm, kết quả lai thực hiện theo quy trình này không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn.  Thí nghiệm kết hợp xử lý mẫu nhanh với biến tính probe và mẫu đồng thời trên lame: thực hiện trên cả tôm postlarvae và thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả không khác với kết quả lai theo quy trình chuẩn. 3. Thí nghiệm so sánh phƣơng pháp ISH với mô học và PCR Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên P. vannamei (postlarvae và tôm thƣơng phẩm) và P. monodon (postlarvae và tôm thƣơng phẩm). Kết quả thí nghiệm cho thấy phƣơng pháp ISH có độ ổn định, độ chính xác và nhạy hơn mô học và PCR. Từ các kết quả thực nghiệm nhƣ trên, chúng tôi đã đƣa ra quy trình ISH có độ nhạy, độ ổn định, độ chính xác cao và thời gian chẩn đoán nhanh, đáp ứng đƣợc việc kiểm tra các mầm bệnh do WSSV và TSV gây ra trên tôm nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong các hệ thống nuôi tôm ở Việt Nam. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa ............................................................................................................................ i Trang tựa ............................................................................................................................ ii Lời cảm tạ .......................................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................................. xi Danh sách các hình và các sơ đồ ....................................................................................... xii Danh sách các bảng ........................................................................................................... xiv CHƢƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................................. 1 I.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1 I.2 Mục tiêu đề tài .............................................................................................................. 2 I.3 Yêu cầu của đề tài ........................................................................................................ 2 I.4 Nội dung của đề tài ...................................................................................................... 2 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới ................................................................................. 3 II.1.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 3 II.1.2 Các hình thức nuôi ................................................................................................... 3 II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới ..................................................................... 3 II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam ................................................................................ 4 II.2.1 Hiện trạng chung ...................................................................................................... 4 II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang đƣợc áp dụng .............................................................. 5 II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam .................................................................... 5 II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng ................................. 5 II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei.......... 5 II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng ..................................................... 6 vii II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú ............................................................................... 6 II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng ............................................................ 7 II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng ................................................... 7 II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú ............................................................................. 7 II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng .......................................................... 7 II.3.4 Dinh dƣỡng .............................................................................................................. 7 II.3.4.1 Dinh dƣỡng của tôm sú ......................................................................................... 7 II.3.4.2 Dinh dƣỡng của tôm thẻ chân trắng ...................................................................... 8 II.3.5 Các yếu tố môi trường tối ưu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển ................... 8 II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) 8 II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD .............................................................................................. 8 II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 8 II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 11 II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh ...................................................................... 11 II.4.1.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 12 II.4.1.5 Phòng bệnh ........................................................................................................... 12 II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) ................................................................ 12 II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................ 12 II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................... 13 II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh ................................................................................... 14 II.4.2.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ............................................................................... 14 II.4.2.5 Phòng và trị bệnh .................................................................................................. 14 II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ......................................................... 14 II.5.1 Sơ lƣợc về phƣơng pháp In situ hybridization ......................................................... 14 II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử .................................................................................... 15 II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử ........................................................................................... 16 II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA ......................................................... 16 II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA ..................................... 16 II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lai phân tử ................................................................. 17 viii II.5.5 Probe ........................................................................................................................ 17 II.5.5.1 Khái niệm .............................................................................................................. 17 II.5.5.2 Các loại probe ............................................................................................ 18 II.5.5.3 Các phƣơng pháp đánh dấu probe ............................................................. 18 II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai ........................... 19 II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH ............................................................................. 23 II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc ................................................................................................. 23 II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể .......................................................................................... 23 II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô ............................................................................................ 24 II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH ...................................................................................... 25 II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản.............................. 25 II.5.8.1 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng và Taura .................................. 25 II.5.8.2 Ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản .............................................................................................................................. 26 II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này .............................................................. 26 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM ...... 27 III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm .............................................................................. 27 III.2 Vật liệu sinh học ........................................................................................................ 27 III.3 Hóa chất thí nghiệm ................................................................................................... 27 III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ ................................. 27 III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán ................................... 28 III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................................................. 28 III.4.1 Thiết bị thí nghiệm ................................................................................................. 28 III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm ................................................................................................ 29 III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit ................................... 29 III.5.1 Chuẩn bị hóa chất ................................................................................................... 29 III.5.2 Chuẩn bị mẫu .......................................................................................................... 30 III.5.2.1 Cố định mẫu ........................................................................................................ 30 ix III.5.2.2 Cách xử lý mẫu .................................................................................................... 30 III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin ....................................................................................... 31 III.5.2.4 Cắt mẫu ................................................................................................................ 31 III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit ............................................................................. 31 III.5.3.1 Ngày thứ nhất ...................................................................................................... 31 III.5.3.2 Ngày thứ hai ........................................................................................................ 32 III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................... 34 III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu ............................................................................................. 34 III.6.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................................... 34 III.6.2.1 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei ............................................................................................................. 35 III.6.2.2 Phƣơng pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon ............................................................................................................................ 36 III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với mô học và PCR ............... 39 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei ........................................................... 41 IV.1.1Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH ............. 41 IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P. vannamei ......................... 43 IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai ............................. 43 IV.1.2.2 Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt thích hợp với Proteinase K ............. 46 IV.1.2.3 Kết quả thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai thích hợp ..................................... 49 IV.2 Kết quả trên tôm sú P. monodon ............................................................................... 52 IV.2.1 Kết quả thí nghiệm theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp ........................ 52 IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng trong phòng thí nghiệm ............................................................................................................... 54 IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit..................................................................... 54 IV.2.2.2 Trƣờng hợp xử lý mẫu nhanh .............................................................................. 56 IV.2.2.3 Trƣờng hợp biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai ............................................... 59 x IV.2.2.4 Trƣờng hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai ........................................................................................................................ 61 IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa ISH với mô học và PCR ....................................... 65 IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei ............................................................................. 65 IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae ................................................................................ 65 IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thƣơng phẩm ............................................................................ 66 IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon .............................................................................. 68 IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae .............................................................................................. 69 IV.3.2.2 Đối với tôm thƣơng phẩm ................................................................................... 70 IV.5 Nhận xét chung .......................................................................................................... 73 IV.6 Những thuận lợi và khó khăn .................................................................................... 74 IV.6.1 Thuận lợi ................................................................................................................ 74 IV.6.2 Khó khăn ................................................................................................................ 74 IV.7 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp In situ hybridization............................................ 75 IV.7.1 Ƣu điểm ................................................................................................................. 75 IV.7.2 Nhƣợc điểm ........................................................................................................... 75 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 76 V.1 Kết luận ....................................................................................................................... 76 V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV trên P. vannamei ............................................................................................................................ 76 V.1.2 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do WSSV trên P. monodon ............................................................................................................................ 76 V.2 Đề nghị........................................................................................................................ 77 CHƢƠNG VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................... 79 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid WSD : White Spot Disease WSSV : White Spot Syndrome Virus TS : Taura Syndrome TSV : Taura Syndrome Virus Bp : base pair UV : Ultra – Violet ISH : In Situ hybridization PCR : Polymerase Chain Reaction ELISA : Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay RT – PCR : Reverse – transcription polymerase chain reaction PBS : Phosphate Buffered Saline TBS : Tris Buffered Saline SSC : Sodium Chlorua/Sodium Citrate NTB/BCIP : Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate. TCT : Thẻ chân trắng TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ KHV : Kính hiển vi FAO : Food and Agriculture Organization of the United Nations RT : Room temperature ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long OD : Optimal density xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ CÁC SƠ ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng .................................................................... 10 Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng ..................................................................... 11 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV ........................................................................ 13 Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin ..................... 21 Hình 2.5: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu huỳnh quang .................. 21 Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG ....................... 22 Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc ............................................................................................. 23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum .................................... 23 Hình 4.1: Đối chứng dƣơng trên phụ bộ tôm lớn, X10 .................................................... 42 Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm lớn, X10 ............................................................ 42 Hình 4.3: Mẫu lai đƣợc thực hiện theo nghiệm thức thứ III, quan sát trên phụ bộ X10 và X40 .............................................................................................................. 46 Hình 4.4: Hiện tƣợng dƣơng tính giả trên phụ bộ tôm lớn, X10 ...................................... 51 Hình 4.5: Đối chứng âm trên gan tụy tôm lớn, X40 ......................................................... 53 Hình 4.6: Đối chứng dƣơng trên mang tôm lớn, X10....................................................... 53 Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10...................................... 53 Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV trên mẫu mang tôm lớn, X40......................................... 53 Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh ....................................... 58 Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40 ................................................................ 63 Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp .................................................................................................................. 68 Hình 4.12: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán WSSV đồng thời bằng ba phƣơng pháp .................................................................................................................. 72 xiii Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán ........................................ 30 Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất ............................................. 32 Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai ............................................... 33 Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh .............................................................................. 38 Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện ................ 64 xiv DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Các thông số tối ƣu cho tôm phát triển............................................................. 8 Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng ...................................... 9 Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV trong phòng thí nghiệm 38 Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. vannamei ...................... 40 Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. monodon ....................... 40 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng ISH .................................. 41 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm postlarvae ................ 44 Bảng 4.3: Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu trên tôm thƣơng phẩm ........... 45 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên postlarvae ... 47 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định thời gian cắt với Proteinase K trên tôm thƣơng phẩm ................................................................................................................. 48 Bảng 4.6: Kết quả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm postlarvae ............... 50 Bảng 4.7: Kếtquả thí nghiệm tìm dung dịch lai thích hợp trên tôm thƣơng phẩm ........... 50 Bảng 4.8: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và hóa chất của bộ kit ................ 52 Bảng 4.9: Kếtquả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất ............... 55 Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae ............................. 56 Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm ........................ 57 Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên postlarvae ...... 59 Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ................................................................................................................. 60 Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm postlarvae ................................................................................ 61 Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm ........................................................................... 62 xv Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae ............ 65 Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm 66 Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae ............ 69 Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng phẩm 70 1 CHƢƠNG I GIỚI THIỆU I.1 Đặt vấn đề Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lƣợng của các đối tƣợng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nƣớc ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhƣng do lợi nhuận cao của nghề này và do sự ƣu đãi của thiên nhiên nên nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi ngày càng đƣợc mở rộng hiện có hơn 260.000 ha dùng để nuôi tôm với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã đƣợc áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lƣợng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm đƣợc nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi chƣa đƣợc đảm bảo, việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chƣa đƣợc đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trƣờng nƣớc, phá vỡ môi trƣờng sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và gây ra nhiều thiệt hại lớn cho ngƣời nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể. WSSV (White Spot Syndrome Virus) là virus gây bệnh đốm trắng, một trong những bệnh quan trọng xảy ra trên rất nhiều các đối tƣợng tôm nuôi. Đặc trƣng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Còn TSV (Taura Syndrome Virus) là một trong những virus gây bệnh nghiêm trọng trên tôm thẻ chân trắng (TCT) là chủ yếu nhƣng cũng có khả năng lây lan và gây bệnh cho các loài tôm khác. Hiện nay, hai loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm trên thế giới và gây nhiều thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chƣa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phƣơng pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát hai mầm bệnh này từ lúc thả 2 giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phƣơng pháp sinh học phân tử trong đó có phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh và đƣợc sự đồng ý của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) để chẩn đoán mầm bệnh do WSSV (White Spot Syndrome Virus) trên tôm sú Penaeus monodon và TSV (Taura Syndrome Virus) trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei”. I.2 Mục tiêu đề tài Phát triển phƣơng pháp ISH để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon và mầm bệnh TSV trên thẻ chân trắng (TCT) Penaeus vannamei trong điều kiện phòng thí nghiệm nhằm xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán ổn định, có độ nhạy và độ chính xác cao. So sánh độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định và hiệu quả kinh tế của phƣơng pháp ISH so với phƣơng pháp mô học truyền thống và PCR. I.3 Yêu cầu của đề tài Xem xét khả năng ứng dụng vào thực tế để chẩn đoán bệnh của phƣơng pháp này. Đánh giá đƣợc hiệu quả của phƣơng pháp chẩn đoán này so với phƣơng pháp mô học và PCR. I.4 Nội dung của đề tài Phát triển phƣơng pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm sú. So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phƣơng pháp này với các phƣơng pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú. Phát triển phƣơng pháp ISH để phát hiện mầm bệnh do TSV trên tôm TCT. So sánh độ ổn định, độ chính xác và độ nhạy của phƣơng pháp này với các phƣơng pháp chẩn đoán bằng mô học và PCR để phát hiện mầm bệnh TSV trên tôm TCT. 3 CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU II.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới II.1.1 Hiện trạng chung Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh và trở thành một trong những ngành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nƣớc trên thế giới. Vào những năm cuối của thập kỷ 80, nghề nuôi tôm đã có những bƣớc phát triển nhanh chóng, các trại nuôi tôm đƣợc xây dựng ở gần 40 nƣớc, đƣa sản lƣợng tôm nuôi từ tỷ lệ 2,1% năm 1981 lên 22% năm 1988 so với tổng sản lƣợng tôm (Latscha, 1989). So với năm 1984, sản lƣợng tôm nuôi năm 1990 tăng 368% với gần 600.000 tấn (FAO, 1992). Năm 1995, sản lƣợng tôm nuôi đạt 712.000 tấn, chiếm 27% tổng sản lƣợng nuôi trồng thủy sản trên thế giới. Trong đó các nƣớc Đông Bán Cầu chiếm 78% tổng sản lƣợng tôm nuôi, còn lại là các nƣớc Tây Bán Cầu (Rosenberry, 1995). Hiện nay có khoảng 25 loài tôm đang đƣợc nuôi, nhƣng chỉ có 5 loài đạt sản lƣợng trên 10.000 tấn/năm và ba loài đạt sản lƣợng 100.000 tấn/năm (Bộ Thủy Sản, 1994). Trong đó loài tôm sú Penaeus monodon chiếm tới 53% tổng sản lƣợng tôm nuôi ở khu vực Châu Á – Thái Bình Dƣơng. Vùng nuôi tôm sú tập trung chủ yếu ở Châu Á (Fast, 1992) điển hình ở các quốc gia nhƣ Thái Lan, Indonesia, Trung Quốc, Việt Nam, Đài Loan. II.1.2 Các hình thức nuôi Hiện nay trên thế giới có khá nhiều hình thức nuôi tôm: nuôi quảng canh; nuôi quảng canh cải tiến; nuôi bán thâm canh; thâm canh và nuôi kết hợp với cua, cá…(Liao, 1989). Việc lựa chọn hình thức nuôi phù hợp phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ kích thƣớc ao, vốn đầu tƣ, kinh nghiệm quản lý, cơ sở vật chất hiện có, thị trƣờng tiêu thụ sản phẩm (Kungvankij và Kongkeo, 1988). II.1.3 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nƣớc nhất là ở vùng Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm biển là điều không thể tránh khỏi, tùy theo mô hình nuôi, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện (Nguyễn Mạnh Hùng, 1994). Trung Quốc là nƣớc có sản lƣợng tôm cao nhất thế 4 giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do dịch bệnh thiệt hại 50% tổng sản lƣợng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú nuôi, năm liền sau đó sản lƣợng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh. Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trƣờng xấu và do dịch bệnh. Trong quý ba năm 1994, sản lƣợng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%. Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nƣớc bị ô nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD (Phan Lƣơng Tâm, 1994). Để đối phó với dịch bệnh nhiều nƣớc có nghề nuôi tôm phát triển nhƣ Nhật Bản, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan, Thái Lan… đã đầu tƣ nhiều kinh phí cho các công trình nghiên cứu cơ bản và ứng dụng về lĩnh vực dịch bệnh tôm cá ở cấp quốc gia và trong khu vực. Thông qua các công trình đƣợc công bố ở trong và ngoài nƣớc, cho thấy có khoảng 30 loại bệnh xảy ra trên tôm. Tuy nhiên, các bệnh chƣa đƣợc tìm hiểu một cách rõ ràng và cặn kẽ. Ngoài các bệnh mà tác nhân là vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm, bệnh do môi trƣờng…thì virus là tác nhân gây tổn thất nặng nề nhất cho nghề nuôi tôm (Phan Lƣơng Tâm, 1995). II.2 Tình hình nuôi tôm tại Việt Nam II.2.1 Hiện trạng chung Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang, là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nƣớc mặn và nƣớc lợ. Nghề nuôi tôm ở nƣớc ta mà đặc biệt là ở đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chỉ mới phát triển mạnh mẽ vào cuối những năm 1980, dƣới sự phát triển của các hình thức nuôi quảng canh cải tiến và bán thâm canh. Tuy nhiên, kỹ thuật nuôi còn hạn chế, độ rủi ro về dịch bệnh càng cao. Năm 1997, mô hình nuôi tôm công nghiệp ở qui mô nông hộ 700 – 1.500 m2/ao (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 1997) đƣợc làm thí điểm tại Trà Vinh đạt năng suất trung bình 5 tấn/ha/vụ. Năm 1998, mô hình nuôi tôm sú công nghiệp qui mô trại nhỏ 6.000 m2/ao tại Gò Công Đông (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 1998) đạt năng suất 7 tấn/ha/vụ. Các mô hình nuôi tôm công nghiệp đạt kết quả cao, tạo tiền đề cho chƣơng trình phát triển thâm canh hóa nghề nuôi tôm ở Việt Nam trong tƣơng lai. 5 II.2.2 Các mô hình nuôi tôm đang đƣợc áp dụng Hiện nay, nƣớc ta cũng áp dụng các hình thức nuôi tôm trên thế giới nhƣ nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến, nuôi bán thâm canh và thâm canh. Ngoài ra nƣớc ta cũng đã phát triển hình thức nuôi sinh thái: nuôi tôm – rừng, tôm – lúa…Trong đó, hình thức nuôi quảng canh đƣợc áp dụng phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt là vùng ĐBSCL (Vũ Đỗ Quỳnh, 1992). II.2.3 Tình hình dịch bệnh tôm tại Việt Nam Tại Việt Nam, từ cuối năm 1993 dịch bệnh tôm đã đƣợc báo động trên toàn quốc, thiệt hại lớn nhất là ở các tỉnh ĐBSCL nhƣ Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng, Minh Hải, Kiên Giang, Tiền Giang, Long An…Ở các tỉnh này tôm nuôi đã bị bệnh và chết hàng loạt do môi trƣờng nuôi bị nhiễm bẩn, thời tiết diễn biến phức tạp, nguồn giống chƣa đảm bảo chất lƣợng (Phan Lƣơng Tâm, 1994). Tính đến 30 – 9 – 1994, tổng diện tích nuôi tôm bị chết là 84.850 ha với thiệt hại ƣớc tính 5.520 tấn trị giá 294 tỷ đồng (Bùi Quang Tề, 1995). Năm 1995, sản lƣợng tôm nuôi của Việt Nam là 50.000 tấn giảm còn 30.000 tấn năm 1997 (World Shrimp Farming, 1997). Theo Ts. Nguyễn Văn Hảo và ctv năm 1997, tác nhân chính gây bệnh ở tôm nuôi vùng ĐBSCL ngoài nhóm Vibrios còn có sự xuất hiện của hai tác nhân Virus gây bệnh quan trọng là MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrome Virus). Tác nhân gây bệnh virus hiện nay đƣợc xem là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng nhất, việc chữa trị bệnh do virus không hiệu quả vì hiện nay chƣa có một loại thuốc hay hóa chất nào có thể chữa bệnh virus (Ts. Nguyễn Văn Hảo, 2000). Từ năm 1996 – 1997, bệnh đốm trắng đã xuất hiện khắp các vùng nuôi tôm biển từ Hải Phòng đến các tỉnh miền Trung, các tỉnh ven biển Nam Bộ. Bệnh đốm trắng đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm biển Việt Nam vì chúng lan truyền rất nhanh qua nguồn nƣớc, đƣờng tiêu hóa…với tỷ lệ chết 90 – 100% (Bùi Quang Tề, 1998). II.3 Một số đặc điểm sinh học cơ bản của tôm sú và thẻ chân trắng II.3.1 Vị trí phân loại của tôm sú P. monodon và tôm thẻ chân trắng P. vannamei Đối với tôm sú Ngành chân đốt: Arthropoda 6 Lớp giáp xác: Crustacea Lớp phụ: Malacostraca Bộ: Decapoda Bộ phụ: Natantia Họ chung: Penaeidea Họ: Penaeidea Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Fabricius 1798 Tên tiếng Anh phổ biến là Giant Tiger Prawn, tên tiếng Pháp là Crevette geante Tigre, tên tiếng Australia là Jumbo Prawn…Ở Việt Nam P. monodon đƣợc gọi là tôm sú. Vị trí phân loại của TCT cũng giống nhƣ tôm sú nhƣng chỉ khác là TCT thuộc loài Penaeus vannamei Boone. Tên thƣờng gọi là tôm bạc Thái Bình Dƣơng, Camaron blanco, Whiteleg shrimp. Tên của FAO là Camaron patiblanco. Tên Việt Nam là tôm chân trắng, tôm he chân trắng. (Theo hệ thống phân loại của Hoilthus, 1989). II.3.2 Đặc điểm phân bố của tôm sú và thẻ chân trắng II.3.2.1 Đặc điểm phân bố của tôm sú Phân bố ngang: Tôm sú P. monodon phân bố rộng rãi ở Ấn Độ Dƣơng. Ở Thái Bình Dƣơng, tôm sú phân bố về phía Bắc tới Nhật Bản, Đài Loan; phía Đông tới Tahiti; phía Nam tới Úc và vùng biển phía Đông Châu Phi. Theo Motoh (1981), tôm sú phân bố từ kinh độ 300 Đông tới 1500 Đông và từ vĩ độ 350 Bắc đến 350 Nam nhƣng tập trung chủ yếu ở các nƣớc nhiệt đới, đặc biệt ở Indonesia, Malaisia, Philippine. Ở Việt Nam, tôm sú phân bố hầu hết ở các vùng ven biển từ Quảng Ninh đến Kiên Giang nhƣng mật độ tập trung cao hơn ở vùng biển từ Đà Nẵng đến Khánh Hòa (Trần Minh Anh,1989). Phân bố thẳng: Giai đoạn ấu trùng và ấu niên P. monodon sống nổi, dần dần thích nghi sống đáy. Ở vùng cửa sông, tôm ấu niên và thiếu niên sống ở tầng mặt, trong khi phần lớn tôm trƣởng thành sống ở mực nƣớc sâu khoảng 70 m. Ở ngoài khơi 7 Philippine, vịnh Thái Lan là 30 – 39 m và nhiệt độ là 340C và độ mặn là 35‰ (Trần Minh Anh, 1989). II.3.2.2 Đặc điểm phân bố của tôm thẻ chân trắng TCT hay còn gọi là tôm chân trắng Nam Mỹ, đƣợc phân bố tự nhiên từ các nƣớc ven bờ Thái Bình Dƣơng, Châu Mỹ - từ Mehico đến miền trung Peru, nhiều nhất là vùng biển Ecuador. II.3.3 Vòng đời phát triển của tôm sú và thẻ chân trắng II.3.3.1 Vòng đời phát triển của tôm sú Trong thiên nhiên, tôm sú sinh sản trên biển. Khi tới mùa sinh sản, tôm di cƣ ra vùng biển sâu có độ mặn cao để đẻ trứng. Trứng nở ra ấu trùng trải qua ba giai đoạn: Nauplius, Zoea và Mysis. Ấu trùng theo các làn sóng biển dạt vào các cửa sông, nơi có nƣớc biển và nƣớc sông pha trộn lẫn nhau nên độ mặn thấp hơn ngoài biển nên thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng. Ngƣời ta gọi đó là vùng nƣớc lợ, có độ mặn từ 13 - 30‰. Tại môi trƣờng nƣớc lợ, ấu trùng larvae chuyển sang thời kỳ hậu ấu trùng Postlarvae. Sau đó hậu ấu trùng sẽ chuyển sang thời kỳ ấu niên Juvenile đồng thời bơi ra biển tiếp tục tăng trƣởng, sinh sản và tiếp diễn chu kỳ sống (Vũ Thế Trụ, 1994). II.3.3.2 Vòng đời phát triển của tôm thẻ chân trắng Quá trình phát triển của tôm TCT trải qua sáu giai đoạn Nauplius kéo dài 1,5 ngày, ba giai đoạn Zoea kéo dài 5 ngày, ba giai đoạn Mysis kéo dài 5 ngày và cuối cùng là Postlarvae. Sau giai đoạn postlarvae tôm chuyển sang giai đoạn ấu niên Juvenile và tiếp diễn chu kỳ sống (Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lƣ, 2003). Tôm TCT rất linh hoạt và nhạy cảm với sự biến đổi của môi trƣờng sống. TCT có thể thành thục trong ao nuôi, đây là ƣu điểm của loài tôm này so với các loài tôm khác trong việc chủ động về nguồn tôm bố mẹ và giống thả nuôi. II.3.4 Dinh dƣỡng II.3.4.1 Dinh dưỡng của tôm sú Tôm sú ở giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với hai giống tảo Silic thích hợp là Chaetoceros và Skeletonema. Giai đoạn Mysis chuyển sang ăn một số loài động vật phù du, luân trùng và ấu trùng của Artemia. Giai đoạn postlarvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bả hữu cơ (Apud, 1984). Tôm sú là loài 8 ăn tạp, đặc biệt tôm sú trƣởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá, côn trùng (Hal, 1962). II.3.4.2 Dinh dưỡng của tôm thẻ chân trắng TCT là loài tôm ăn tạp. Giống nhƣ các loài tôm he khác, thức ăn của nó cũng cần các thành phần protid, lipid, glucid, vitamin và muối khoáng…Giai đoạn Nauplus không cần cho ăn, chúng tự nuôi bằng noãn hoàng có sẵn. Giai đoạn Zoea, tôm ăn thực vật phù du và đặc biệt là các loại tảo khuê. Giai đoạn Mysis, tôm ăn thực vật phù du lẫn động vật phù du. Khả năng chuyển hóa thức ăn của tôm rất cao, trong điều kiện nuôi lớn bình thƣờng, lƣợng cho ăn chỉ cần 5% thể trọng tôm (Thái Bá Hồ, Ngô Trọng Lƣ, 2003). Trong thời kỳ tôm sinh sản, lƣợng thức ăn hàng ngày tăng lên gấp 3 – 5 lần. II.3.5 Các yếu tố môi trƣờng tối ƣu cho tôm sú và thẻ chân trắng phát triển Bảng 2.1: Các thông số tối ƣu cho tôm phát triển STT Các thông số tối ƣu Penaeus monodon Penaeus vannamei 1. 2. 3. 4. 5. pH Nhiệt độ Oxy hòa tan Nitrite Độ mặn 7,7 – 8,5 25 0 C – 300C 4 mg/l < 0,1 mg/l 15 – 25‰ 7 – 9 26 0 C – 300C > 3 mg/l < 0,1 mg/l 15 – 28‰ (Theo Chanratchakook P., 1995 và Brock J.A., Main K.L., 1994). II.4 Bệnh đốm trắng (White spot desease – WSD) và bệnh Taura (Taura syndrome TS) II.4.1 Bệnh đốm trắng WSD II.4.1.1 Tác nhân gây bệnh (a) Phân loại Trƣớc năm 2002, có ba chủng Baculovirus gây bệnh đốm trắng hay còn gọi là virus Trung Quốc. Tùy từng nƣớc nghiên cứu mà chúng có tên gọi và kích thƣớc khác nhau. 9 Bảng 2.2: Các tên gọi khác nhau của virus gây bệnh đốm trắng Tên virus Kích thƣớc virus Kích thƣớc nhân Virus Trung Quốc (HHNBV) Virus Nhật 1 ( RVPJ – 1) Virus Nhật 2 ( RV – PJ – 2) Virus đốm trắng Thái Lan (SEMBV) Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 120 x 360 nm 84 x 226 nm 83 x 275 nm 121 x 276 nm 70 –150 x 350 –380 nm 54 x 126 nm 89 x 201 nm 58 – 67 x 330 – 350 nm (Theo Bùi Quang Tề, 2003) Virus gây bệnh đốm trắng WSSV đầu tiên đƣợc phân loại thuộc họ Baculovirdae (Francki và ctv, 1991). Tuy nhiên, trong những phân tích trình tự hệ gen WSSV gần đây cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của Baculovirus nhƣ protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv, 2000). Protein capsid (VP26, VP28) (van Hulten và ctv, 2000) của WSSV không giống bất kì một protein nào trong database. Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000). Trong Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002), các tác giả Just M. Vlak, Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner, Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J. Walker đã phân loại virus gây hội chứng đốm trắng thành một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae. 10 Hình 2.1: Virus WSSV gây bệnh đốm trắng A – Hình thái WSSV phóng to trên kính hiển vi điện tử, X100 B – Nuclecapside của WSSV trên kính hiển vi điện tử, X100 C – WSSV nhuộm âm trong huyết tƣơng tôm sú bị đốm trắng C (b) Hình thái Virus dạng hình trứng, kích thƣớc 120 x 275 nm, có một đuôi phụ ở một đầu kích thƣớc 70 x 300 nm (Woongteerasupaya C. và ctv, 1995; Wang và ctv, 1995). . (Theo Vlak và ctv, 2002). (c) Cấu trúc protein và vật chất di truyền Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: bao màng (envelope), nucleocapside và vật chất di truyền. Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 có trọng lƣợng phân tử tƣơng ứng là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa. Hiện nay virus WSSV đã đƣợc giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thƣớc thay đổi tùy theo các mẫu phân lập từ các vị trí địa lí khác nhau. (d) Phổ ký chủ Phổ ký chủ rộng, chủ yếu là các loại tôm: P. monodon, P. vannamei, P. indicus, P. japonicus,…các loại cua và các động vật thủy sinh khác (theo V.A. Graindorge và T.W. Flegel, 1999). (e) Cơ chế xâm nhiễm Khi xâm nhập vào tôm virus sẽ cƣ trú ở nhiều bộ phận của tôm nhƣ nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, tinh hoàn, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus tiến hành tự nhân bản dựa trên cơ sở vật chất và nguyên liệu của tế bào. Quá trình này làm cho số lƣợng virus tăng lên rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thƣờng của tế bào. Virus tiếp tục 11 Hình 2.2: Tôm sú bị nhiễm bệnh đốm trắng phát triển đến giai đoạn làm vỡ nhân và giết chết tế bào, sau đó virus đƣợc phóng thích ra môi trƣờng nƣớc, đi tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập, tấn công. Nếu nhƣ virus không tìm đƣợc ký chủ mới thì nó chỉ có thể sống tự do trong nƣớc khoảng 24 giờ. II.4.1.2 Dấu hiệu bệnh lý Tôm nhiễm bệnh có thể có màu hồng đến màu nâu đỏ (Guang Hsiung và ctv, 1998). Bên trong vỏ giáp xác xuất hiện những đốm trắng đƣờng kính từ 0,5 – 2,0 mm. Các đốm trắng này có thể do sự lắng đọng của muối canxi trên lớp biểu bì mặt trong của lớp vỏ kitin, các đốm trắng này xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp (carapace) và đốt bụng thứ V, VI. Gan tụy trƣơng to có màu trắng hoặc hơi vàng. Tôm có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ kém hoạt động, thƣờng có khuynh hƣớng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Y. G. Wang và ctv, 1998). Tôm bệnh có dấu hiệu trƣơng nhân trong tế bào bị nhiễm (Chou và ctv, 1995). Bệnh đốm trắng xảy ra kèm theo sự tiêu thụ thức ăn giảm nhanh (Takahashi và ctv, 1994). Một vài trƣờng hợp, tôm ở trạng thái hấp hối thƣờng chuyển sang màu đỏ hoặc hồng, tỷ lệ chết có thể lên đến 90 – 100% trong vòng 3 – 7 ngày nhiễm bệnh (Feng Yang và ctv, 2001). II.4.1.3 Lịch sử phân bố và lan truyền bệnh Phân bố: Bệnh đốm trắng WSD (white spot disease) xuất hiện lần đầu tại Bắc Á vào năm 1992 – 1993, đồng thời nhanh chóng lan rộng khắp khu vực Châu Á và thế giới nhất là các nƣớc có hình thức nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Bệnh đốm trắng đƣợc thông báo đầu tiên ở Trung Quốc, trong các đầm nuôi tôm sú với tỷ lệ chết cao (Chen, 1989). Năm 1992 – 1993, bệnh đốm trắng xuất hiện ở Thái Lan (Flegel T.W, 1996). Năm 1993, Nhật Bản nhập tôm Trung Quốc về nuôi đã xuất hiện bệnh đốm trắng. Năm 1994, đã có các báo cáo từ Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản và Thái Lan, tìm ra nguyên nhân gây bệnh đốm trắng. Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thƣờng xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam, hầu hết ở các tỉnh khi tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thì tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn cho nghề nuôi tôm. 12 Truyền bệnh: Bệnh đốm trắng lây truyền chủ yếu theo chiều ngang. Virus lây từ giáp xác khác nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trƣờng bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm. Bệnh đốm trắng không có khả năng lây lan theo đƣờng thẳng đứng, vì các noãn bào (trứng) khi phát hiện chúng bị nhiễm virus đốm trắng thì chúng không chín đƣợc (Bùi Quang Tề, 2003). Nhƣng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm. II.4.1.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh Dựa trên dấu hiệu bệnh đặc trƣng là xuất hiện các đốm trắng dƣới vỏ và phân lập vi khuẩn gây bệnh khi tôm bị đỏ thân. Chẩn đoán bằng phƣơng pháp mô bệnh học, quan sát các nhân của tế bào biểu bì dƣới vỏ, tế bào biểu bì tuyến anten, tế bào cơ quan bạch huyết, cơ quan tạo máu, tổ chức liên kết của vỏ… Khi nhuộm Hematoxylin và Eosin, các nhân tế bào có một thể vùi (inclusion body) lớn, bắt màu đỏ đồng đều. Chẩn đoán bằng phƣơng pháp PCR, Enzyme miễn dịch. II.4.1.5 Phòng bệnh Hiện nay chƣa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm, do đó phòng bệnh là chủ yếu. Để phòng đƣợc bệnh đốm trắng trên tôm, ta áp dụng các phƣơng pháp phòng bệnh tổng quát sau:  Lựa chọn Postlarvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (kiểm tra bằng mô học, PCR, sốc formalin).  Chẩn đoán chính xác, kịp thời, kiểm soát dịch bệnh, đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với virus đốm trắng.  Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh.  Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay. II.4.2 Hội chứng Taura – TS (Taura syndrome) II.4.2.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây ra hội chứng này là Taura Syndrome Virus (TSV) hay Picornavirus thuộc họ Picornaviridae (Bonami và ctv, 1997). Virus hình cầu có 20 mặt, đƣờng kính 30 – 32 nm, hệ thống gen là RNA mạch đơn có chiều dài 10,2 kb, cấu 13 Hình 2.3: Tôm bị nhiễm virus Taura TSV Hình A – tôm nhiễm ở giai đoạn cấp tính Hình B – đuôi tôm nhiễm TSV cấp tính đƣợc phóng to Hình C – tôm nhiễm TSV ở giai đoạn mãn tính C A B trúc capsid có ba phần (55, 40 và 24kD) và một đoạn polypeptide (phụ 58kD) tƣơng ứng với ký hiệu VP1, VP2, VP3 và VP4. Virus ký sinh tế bào biểu mô và dƣới biểu mô đuôi. Ký chủ chính: P. vannamei, P. setiferus, P. stylirostris (theo V.A. Graindorge và T.W. Flegel, 1999), các loài tôm nhiễm thực nghiệm nhƣ P. aztecus, P. duorarum (Lightner, 1996; Overstreet và ctv, 1997). II.4.2.2 Dấu hiệu bệnh lý Bệnh Taura có ba giai đoạn chính: cấp tính, chuyển tiếp và mãn tính đƣợc phân biệt rõ trên tôm bị nhiễm bệnh. Giai đoạn cấp tính: tôm yếu, lờ đờ, đuôi tôm phồng chuyển màu đỏ, mềm vỏ và ruột không có thức ăn. Giai đoạn chuyển tiếp: tôm yếu, có nhiều đốm đen trên cơ thể do biểu bì bị hoại tử, tôm có hoặc không có dấu hiệu phồng đuôi hoặc chuyển sang màu đỏ. Ở hai giai đoạn này, virus ký sinh trong các tổ chức trung bì và ngoại bì. Biểu mô biểu bì bị ảnh hƣởng nặng ở giai đoạn cấp tính. Giai đoạn mãn tính: trên cơ thể có những đốm đen nhƣng ít, virus ký sinh trong tổ chức lympho. Tôm P. vannamei ở giai đoạn nhiễm cấp tính thƣờng có tỷ lệ chết cao nhƣng tôm P. stylirostris bị nhiễm bệnh nhƣng có khả năng kháng lại virus gây bệnh. Mô biểu bì hoặc dƣới biểu 14 mô các tế bào nhiễm virus bị hoại tử, tế bào chất bắt màu hồng trong có chứa nhân kết đặc hoặc phân mảnh. Đặc điểm quan trọng là tế bào chất của biểu bì chuyển màu hồng hoặc xanh nhạt. II.4.2.3 Phân bố và lan truyền bệnh Phân bố: Bệnh do TSV lần đầu tiên phát hiện trên tôm P. vannamei nuôi ở Ecuador (6 – 1992). Ngay sau khi phát hiện, mầm bệnh này nhanh chóng lan rộng sang các nƣớc nuôi tôm ở Tây Bán Cầu nhƣ Peru, Colombia, Honduras, Guatemala, El Salvador, Brazil, tây Mexico và các bang của Châu Mỹ nhƣ Hawaii, Florida, Texas và Nam Carolina (Lightner, 1996). Hội chứng Taura thƣờng xảy ra trên tôm P. vannamei ở giai đoạn nuôi từ 14 – 40 ngày nuôi ở ao hoặc các bể ƣơng. Bệnh do TSV thƣờng gặp ở tôm giống cỡ nhỏ từ 0,05 – 5,0 gram, ở tôm lớn hơn cũng có thể xuất hiện. Nếu giai đoạn đầu bệnh chƣa phát thì giai đoạn giống lớn hoặc thƣơng phẩm bệnh có thể xảy ra. Bệnh TSV có thể gây chết từ 40 – 90% tổng số tôm nuôi trong ao (Bùi Quang Tề, 2003). Truyền bệnh: bệnh TSV có thể lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều thẳng đứng. II.4.2.4 Phương pháp chẩn đoán bệnh Phƣơng pháp truyền thống gồm các phƣơng pháp sau: dấu hiệu lâm sàng, mô học và xét nghiệm sinh học. Phƣơng pháp kháng thể đơn dòng trong xét nghiệm ELISA. Phƣơng pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction). II.4.2.5 Phòng và trị bệnh Áp dụng phƣơng pháp phòng bệnh tổng hợp tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp phòng bệnh do virus đốm trắng. II.5 PHƢƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION II.5.1 Sơ lƣợc về phƣơng pháp In situ hybridization Phƣơng pháp In Situ hybridization (ISH) đƣợc phát hiện đầu tiên vào năm 1969 do công của Gall và Pardue. Đây là một trong những phƣơng pháp lai phân tử nhằm phát hiện các trình tự acid nucleic đặc hiệu nằm ngay trong các tế bào hoặc trong mô bằng cách lai mẫu tế bào với các mẫu dò (probe) là RNA hoặc cDNA đã đƣợc 15 đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ hay bằng phƣơng pháp hóa học (John và ctv, Gall và Pardue, 1969). Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn trung gian là tách chiết chúng ra khỏi tế bào hay mô. Giống với phƣơng pháp Northern và Southern blot, ISH cũng có thể xác định đƣợc sự hiện diện của RNA hoặc DNA đặc biệt nào đó, nhƣng ISH khác với hai phƣơng pháp kia là nhờ các probe đã đƣợc đánh dấu nên ta có thể xác định vị trí của RNA và DNA đang hiện diện ở một vị trí xác định trong tế bào. Từ khi ra đời ISH đã trở thành một công cụ quan trọng để phát hiện các mRNA. Trong các tế bào có nhiều dạng mRNA biểu hiện ở mức độ cao nhƣng số lƣợng mRNA có chức năng thì tồn tại với số lƣợng rất thấp (Hahn và ctv, 1982). Vì phƣơng pháp ISH có độ nhạy và độ đặc hiệu cao nên có thể phát hiện đƣợc mRNA với số lƣợng thấp trong một tế bào cũng nhƣ phát hiện đƣợc mRNA ở các mức độ khác nhau giữa các tế bào khác nhau. Các ứng dụng của kiểu lai này rất đa dạng đi từ kỹ thuật định vị gen trên nhiễm sắc thể, phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phƣơng pháp tạo dòng đến việc nghiên cứu một mRNA chuyên biệt trong tế bào và mô. II.5.2 Khái niệm về sự lai phân tử Lai phân tử là hiện tƣợng tái bắt cặp trở lại của hai mạch đơn khi nhiệt độ xung quanh giảm từ từ và điều kiện thí nghiệm thích hợp. Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dƣới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trƣờng ở dạng mạch đơn với một cấu hình không gian vô trật tự. Ngƣợc lại, nếu sau khi hai mạch phân tử tách rời, nhiệt độ đƣợc làm giảm từ từ và điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại tạo nên hiện tƣợng lai. Lai phân tử có hai đặc điểm sau:  Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung mặc dù chúng chỉ có hai bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu các trình tự khác.  Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA nên hình thành các phân tử DNA – DNA, DNA – RNA hay RNA – RNA. 16 II.5.3 Cơ sở của sự lai phân tử II.5.3.1 Khái niệm về nhiệt độ nóng chảy của DNA Khi một phân tử DNA mạch đôi đƣợc đun lên ở một nhiệt độ vƣợt quá nhiệt độ nóng chảy Tm thì hai mạch sẽ tách rời nhau, do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch. Sự chuyển từ mạch đôi sang mạch đơn xảy ra đột ngột khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm do tính cộng hƣởng của phản ứng. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn đƣợc xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang OD ở bƣớc sóng 260 nm. Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành dạng mạch đơn, hiện tƣợng này gọi là “hiện tƣợng siêu sắc”. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song, cấu trúc đó che lắp một phần các base khiến chúng không hấp thụ ánh sáng. Khác với DNA mạch đôi, ở DNA mạch đơn thì hai mạch DNA đƣợc tách rời nhau nên các base không bị che khuất nên chúng hấp thu đƣợc ánh sáng tối đa và tạo ra hiện tƣợng siêu sắc nhƣ trên. II.5.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hydro. Sự tách rời hai mạch tƣơng ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy. Do đó, số lƣợng các liên kết và các yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi nhiệt độ nóng chảy của DNA. Ảnh hƣởng của thành phần các base trong phân tử DNA: trong phân tử DNA, A liên kết với T bằng hai liên kết hydro, G liên kết với C bằng ba liên kết hydro nên liên kết giữa C và G chặt hơn. Do đó thành phần các base cấu tạo nên một DNA mạch đôi có ảnh hƣởng rất quan trọng đến sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base C và G. Trong điều kiện chuẩn, Tm thƣờng đƣợc đánh giá bằng công thức sau: Tm = 2 0 C*(A + T) + 4 0C*(C + G), nếu các đoạn DNA <= 25 bp (Wallace, 1989). Hay Tm = 81,5 0 C + 16,6*(log Na + ) + 0,41*(%G + C) – (500/n) – 0,61*%FA, nếu các đoạn DNA > 25 bp, trong đó FA là formaldehyde (Meinkoth – Wahl,1989). 17 Ảnh hƣởng của độ dài đoạn DNA: đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lƣợng các liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó nhiệt độ nóng chảy cũng càng cao. Ảnh hƣởng của các điểm bắt cặp sai lệch (mismatch): những điểm bắt cặp sai lệch (A liên kết với G hay C thay vì liên kết với T…) làm giảm tính ổn định của một phân tử lai, do đó sẽ làm giảm Tm. Ảnh hƣởng của môi trƣờng phản ứng o Ảnh hƣởng của nồng độ muối: nồng độ muối của môi trƣờng giảm hay lực ion của môi trƣờng giảm sẽ làm cho nhiệt độ nóng chảy của DNA giảm đi rất mạnh. Nhƣ vậy, một dung dịch càng loãng thì càng mất tính ổn định chuỗi xoắn kép DNA. o Ảnh hƣởng của formamide: Formamide đƣợc sử dụng trong các phƣơng pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ formamide thƣờng dùng là 50% tƣơng ứng với việc hạ Tm xuống 30% (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). II.5.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự lai phân tử Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Để sự tái bắt cặp xảy ra giữa hai mạch đơn, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Nhƣ vậy, tần số gặp gỡ giữa hai trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp. Ở một nhiệt độ xác định, hai chỉ tiêu ảnh hƣởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng. Nồng độ DNA, nghĩa là số lƣợng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng; kết quả là tốc độ phản ứng lai càng tăng lên. Tƣơng tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất nói trên càng lớn hơn và số lƣợng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp. Hai thông số nói trên thƣờng đƣợc xem xét đồng thời. Tích số giữa nồng độ và thời gian đƣợc gọi là Cot (C: concentration - nồng độ, t: time - thời gian). Cot1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai. Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ. Thông thƣờng tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính acid nucleic đó khoảng 25%. Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 – 10 lần. Nồng độ NaCl vƣợt quá 1,2 M lại hoàn toàn không có tác dụng. 18 II.5.5 Probe II.5.5.1 Khái niệm Để phát hiện một trình tự xác định, ban đầu ta chỉ cần một bản sao trung thực của trình tự ấy. Bản sao này đƣợc đánh dấu để nhận biết khi có hiện tƣợng lai xảy ra và bản sao này đƣợc gọi là probe (mẫu dò). Qua sự lai giữa probe và trình tự bổ sung, ta có thể phát hiện và định vị đƣợc trình tự ấy trong bất kỳ hỗn hợp acid nucleic nào. II.5.5.2 Các loại probe Probe là một đoạn Oligonucleotide: Loại probe này đƣợc tổng hợp bằng phƣơng pháp hóa học, rất thuận lợi cho sử dụng vì nó có kích thƣớc nhỏ 40 – 50 cặp base và kháng lại RNase. Ngoài ra, vì đây là một probe đƣợc tổng hợp nhân tạo nên ta có thể tạo ra các probe theo mong muốn. Hơn nữa, oligonucleotide có dạng mạch đơn nên ta không cần giai đoạn biến tính trƣớc khi lai. Hiện nay, loại probe này đƣợc sử dụng rất nhiều trong phƣơng pháp ISH. Probe là DNA mạch đơn: Probe loại này có khoảng 200 – 500 cặp base. Các probe DNA mạch đơn có thể tạo ra bằng kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật sao chép ngƣợc của RNA. Nhƣợc điểm của loại probe này là cần nhiều thời gian để chuẩn bị, hóa chất đắc tiền và đòi hỏi phải có kiến thức sâu về sinh học phân tử. Probe là DNA mạch đôi: Các probe DNA mạch đôi có thể đƣợc tạo ra nhờ kỹ thuật PCR hoặc tạo ra trong vi khuẩn. Vì đây là DNA mạch đôi nên ta phải biến tính probe này trƣớc khi lai. Loại probe này có độ nhạy kém vì các mạch đơn của probe sau khi biến tính, hai mạch đơn luôn có khuynh hƣớng tái bắt cặp trở lại và hiện nay ngƣời ta ít sử dụng loại probe này. Probe là đoạn RNA (còn gọi là probe cRNA hoặc riboprobe): Loại probe này dùng trong việc phát hiện trình tự RNA. Probe là một mạch đơn bổ sung với RNA đƣợc tổng hợp từ RNA bằng cách nhân dòng vô tính ngƣợc (reverse cloning) (Polak và ctv, 1990). Liên kết giữa RNA-RNA thì rất bền và có thể kháng lại với RNase nên thuận tiện cho ta loại bỏ các tín hiệu lai không phải là RNA và các chất nền không cần thiết khác sau khi lai, tuy nhiên giai đoạn xử lý trƣớc khi lai thì rất khó thực hiện (Power và Versatility). II.5.5.3 Các phương pháp đánh dấu probe 19 Đánh dấu bằng Nick – translation: Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện nhƣ sau: DNAse I cắt các phân tử DNA ở những vị trí khác nhau tạo ra các “lỗ thủng” (Nick) phân bố một cách ngẫu nhiên trên cả hai mạch. Từ những lỗ thủng này DNA polymerase I một mặt gặm dần mạch bị cắt theo chiều 5’ – 3’ (nhờ hoạt tính exonuclease 5’ – 3’), mặt khác lại tổng hợp bù đoạn bị thiếu (nhờ hoạt tính polymerase). Do trong phản ứng có hiện diện của một loại nucleotide đã đƣợc đánh dấu, nên đoạn tổng hợp mới sẽ mang nhiều nucleotides đánh dấu. Kết quả cuối cùng là DNA sẽ đƣợc đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử. Đánh dấu bằng Random priming: Đầu tiên mẫu dò đƣợc biến tính bằng nhiệt rồi làm lạnh đột ngột. Ngƣời ta thêm vào phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp (thƣờng 6 nucleotide). Các hexanucleotide này tƣơng ứng với tất cả các trình tự tổ hợp có thể có trên lý thuyết. Nhƣ vậy chắc chắn một vài hexanucleotide trong số đó sẽ bắt cặp với hai mạch đơn của mẫu dò. Lúc đó chúng trở thành primer cho DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổ sung. Vì một trong bốn loại nucleotide thêm vào phản ứng đƣợc đánh dấu nên mạch mới tổng hợp đƣợc cũng sẽ đƣợc đánh dấu. DNA polymerase thƣờng đƣợc sử dụng là đoạn Klenow của DNA polymerase I hoặc T7 polymerase. Đánh dấu probe là RNA: Trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải đƣợc dƣa vào một vector có mang các promoter dạng SP6, T3, T7. Vector này đƣợc cắt ra thành dạng mạch thẳng, sau đó RNA polymerase thích hợp đƣợc thêm vào phản ứng cùng với các nucleotide đƣợc đánh dấu. RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từ promoter tạo ra một lƣợng lớn RNA đƣợc đánh dấu. Sau phản ứng vector có mang trình tự DNA gốc bị DNase I phân hủy, các enzyme đƣợc loại bỏ qua tách chiết bằng phenol và RNA đƣợc tinh sạch trên sắc ký lọc gel. Ngoài các phƣơng pháp đánh dấu chủ yếu trên, ngƣời ta còn dùng các phƣơng pháp nhƣ gắn đuôi vào đầu 3’ (3’ tailing), đánh dấu ở đầu 3’ (3’ end labeling) và phƣơng pháp PCR để đánh dấu các probe trƣớc khi thực hiện thí nghiệm. II.5.5.4 Các tác nhân đánh dấu probe và cách phát hiện các phân tử lai A. Probe đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 20 Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò là 32P, 35S và 3H. Trong đó 32P đƣợc sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lƣợng rất cao nên tín hiệu nhận đƣợc rõ. Nhƣng bên cạnh đó thì 32P có hai nhƣợc điểm lớn là: - Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh. Mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng 32P không sử dụng đƣợc nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao. - Do năng lƣợng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận đƣợc không tinh mà khuếch tán trên một vùng rộng. 35S phát tia có năng lƣợng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp giải quyết đƣợc nhƣợc điểm trên của 32P nhƣng năng lƣợng do 35S phát ra thấp nên ít đƣợc sử dụng để đánh dấu mẫu dò. Đối với một số phƣơng pháp đặc biệt nhƣ lai tại chỗ cần độ phân giải cao thì ngƣời ta sử dụng 3H để đánh dấu mẫu dò, mặc dù năng lƣợng do tia phát ra rất yếu nhƣng bù lại tín hiệu phát ra rất tinh. Nhìn chung, ƣu điểm của các đồng vị phóng xạ là có độ nhạy cao, cho tín hiệu mạnh với thời gian phát sáng ngắn. Nhƣng chúng có nhƣợc điểm là có hại cho sức khỏe của con ngƣời. Đặc biệt là 32P phát tia có độ xuyên sâu nên đòi hỏi nhiều biện pháp an toàn tốn kém trong thao tác và xử lý chất thải. Ngoài ra, các mẫu dò cũng không thể dùng đƣợc trong một thời gian dài do chu kỳ bán rã của các đồng vị phóng xạ. Các probe đƣợc đánh dấu theo phƣơng pháp này thì các phân tử lai đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography). B. Probe đƣợc đánh dấu bằng các chất hóa học khác Việc sử dụng các chất hóa học khác để đánh dấu mẫu dò giúp khắc phục đƣợc các nhƣợc điểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ. Tuy nhiên, ở đây lại vấp phải vấn đề về độ nhạy thấp hơn các phƣơng pháp trƣớc. Hiện nay, chúng ta có các hệ thống đánh dấu hóa học thông dụng nhất là: Hệ thống sử dụng avidin (hay streptavidin) – biotin: đây là một cặp ligand có hằng số ái lực cao nhất tìm thấy trong sinh học. Đầu tiên, mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng biotin theo hai cách: biotin đƣợc gắn vào DNA nhờ phản ứng hóa học hoặc DNA đƣợc tổng hợp từ những nucleotide có gắn biotin. Sau quá trình lai, biotin hiện diện trong 21 Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe đánh dấu huỳnh quang Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin. Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification). phân tử lai đƣợc phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản ứng. Avidin (hay streptavidin) trƣớc đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu. Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín hiệu màu nhận đƣợc trên màng lai. Hệ thống huỳnh quang: các probe đƣợc đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang sẽ phát sáng khi quan sát dƣới tia UV (ultra violet). Cách đánh dấu này rất hữu ích khi kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dƣới kính hiển vi. Thuận lợi của hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với các chất phát huỳnh quang khác nhau và các phân tử lai đƣợc phát hiện cùng một lúc. Hệ thống dùng kháng thể: ngƣời ta dùng một nhóm kháng nguyên gắn vào probe và phát hiện sự hiện diện của probe này bằng các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này phải đƣợc đánh dấu bằng các tác nhân đánh dấu nhƣ trên để nhận biết. Hệ thống này đƣợc dùng rộng rãi hiện nay nhất là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG 22 Hình 2.6: Cơ chế phát hiện phân tử lai có probe đƣợc đánh dấu với DIG. Hình a: dùng một kháng thể; hình b dùng hai kháng thể trong đó Anti – DIG là kháng nguyên của kháng thể thứ cấp. – AntiDIG/AP). Nếu probe đƣợc đánh dấu bằng DIG – AntiDIG/AP thì các phân tử lai đƣợc phát hiện bằng phản ứng tạo màu sau phản ứng. Ngƣời ta dùng cơ chất NTB/BCIP (Nitroblue Tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-idolyl-phosphate) tạo phản ứng với enzyme alkalin phosphatase có gắn trên AntiDIG, sau phản ứng tạo kết tủa màu xanh khi nhìn dƣới kính hiển vi quang học. Trong một số quy trình, AntiDIG không đƣợc gắn với enzyme nên muốn phát hiện tín hiệu sau khi lai ta phải nhờ vào cộng hợp enzyme với kháng thể thứ cấp kháng lại AntiDIG. Hệ thống sử dụng Enzyme: Trƣớc hết mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng alkaline phosphatase hay horseradish peroxidase (DNA và các enzyme này hình thành một phức hợp bền vững). Sau quá trình lai, ngƣời ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của hai enzyme và cơ chất đó có khả năng phát sáng khi bị biến đổi. Ánh sáng phát ra sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim. Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng các chất hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu. 23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc thể của nấm Thinopyrum ponticum Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. Ngân hàng gen (tức tập hợp các dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải trên mặt thạch của đĩa petri. Sau khi các khuẩn lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt các khuẩn lạc. Trƣớc khi thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và màng lai đều phải đƣợc đánh dấu trƣớc để làm căn cứ đọc kết quả sau này. Khi áp màng lai lên mặt các khuẩn lạc, mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai. Màng lai sau đó đƣợc xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA. Việc cố định DNA trên màng lai và thao tác lai diễn tiến theo các bƣớc tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp lai trên pha rắn nhƣ Southern Blot và Northern Blot. Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép xác định dòng vi khuẩn cần tìm trên đĩa petri ban đầu. Dòng vi khuẩn này sau đó đƣợc thu nhận và thực hiện các phân tích khác. II.5.6.2 Lai trên nhiễm sắc thể Phƣơng pháp lai này cung cấp những thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của một trình tự DNA cần tìm trên nhiễm sắc thể nhờ một mẫu dò (probe) chuyên biệt. 24 Các nhiễm sắc thể thƣờng có nguồn gốc từ các bạch cầu ở giai đoạn trung kỳ đƣợc xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. Sau công đoạn loại bỏ RNA bằng RNase và loại bỏ protein bằng Proteinase K, nhiễm sắc thể cố định trên lame đƣợc đem lai với probe có đánh dấu phóng xạ. Trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi để phát hiện phân tử lai, ngƣời ta phủ lên lame một huyền dịch nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch, lame đƣợc đem quan sát dƣới kính hiển vi. Kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai. II.5.6.3 Lai trên tế bào và mô Trong tế bào và mô, các DNA và RNA đặc biệt là các mRNA có sự phân bố không gian xác định. Sự phân bố không gian này liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng nhƣ tƣơng tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô. Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể. Trong trƣờng hợp đó ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai trên tế bào và mô. Mô đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin, cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai. Thao tác xử lý mẫu lai và phát hiện phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả đƣợc đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học. Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau: Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau nhƣ não bộ. Ở đây ngƣời ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó. Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt thông qua kháng thể đặc trƣng của nó. Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, ngƣời ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó. Từ đó xác định đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen. 25 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, ngƣời ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tƣơng tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống. Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn. Điều này đã tạo những bƣớc nhảy vọt lớn cho các phƣơng pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò đƣợc đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau. II.5.7 Ứng dụng chủ yếu của ISH Phát hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp trong phƣơng pháp tạo dòng. Định vị một gen xác định trên nhiễm sắc thể. Nghiên cứu sản phẩm phiên mã và dịch mã của một gen xác định trong mô hay tế bào, từ đó giúp ngƣời ta chẩn đoán đƣợc các bệnh nguy hiểm trên ngƣời nhƣ bệnh ung thƣ, bệnh viêm gan…Đây là một hƣớng ứng dụng rộng rãi nhất của phƣơng pháp ISH. II.5.8 Một số nghiên cứu trƣớc đây về bệnh đốm trắng, bệnh Taura và ứng dụng phƣơng pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh vật nuôi thủy sản II.5.8.1 Một số nghiên cứu trước đây về bệnh đốm trắng và Taura Mở đầu là công trình nghiên cứu về loại mô đích của virus gây bệnh đốm trắng do Lo và ctv thực hiện. Họ đã gây nhiễm nhân tạo virus gây bệnh đốm trắng WSBV (White spot baculovirus) trên tôm sú và đạt tỷ lệ nhiễm 100%. Sau 40 giờ nhiễm, họ phát hiện virus gây bệnh bằng phƣơng pháp In Situ hybridization và xác định đƣợc mang và gan tụy là cơ quan đích của virus này. Các kết luận sau đó cho rằng mô đích của virus đốm trắng chính là các mô có nguốn gốc trung bì (Lo và ctv, 1996). Một nghiên cứu khác của nhóm là sử dụng kỹ thuật PCR, Dot Blot và Southern Blot để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng cũng thu đƣợc nhiều kết quả tốt (Lo và ctv, 1996). Arun K. Dhar, Michelle M. Roux và Kurt R. Klimpel (2001) đã sử dụng kỹ thuật Real – Time Quantitative PCR và SYBR Green Chemistry để phát hiện và định lƣợng WSSV nhiễm trên Penaeus sp. Qua kết quả nghiên cứu này, các nhà khoa học 26 đã xác định đƣợc phƣơng pháp SYBR Green PCR phát hiện virus đốm trắng nhanh, nhạy và định lƣợng đƣợc lƣợng virus nhiễm vào tôm chính xác nhất. Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tƣơng đối ít hơn, Nunan L.M., Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV. Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome của TSV và khuếch đại đƣợc một gen có kích thƣớc 231 bp. Bằng kỹ thuật này, nhóm nghiên cứu đã phát hiện đƣợc TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P. vannamei và P. stylirostris. Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M., Lightner D.V. đã thực hiện nghiên cứu các phƣơng pháp khác nhau để chẩn đoán và phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung. Qua thí nghiệm này nhóm đã đƣa ra các phƣơng pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot, Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002). II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm, ngoài các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng trƣớc đây thì ISH đã phát huy đƣợc thế mạnh của một phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao. Một loạt các thí nghiệm đã đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt các dòng Baculovirus BP – type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J. và Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã xác định đƣợc 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R. và ctv, 2003); phát hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)… II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này Hiện nay, phƣơng pháp ISH đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đã đƣợc phát triển thêm một bƣớc mới, ngƣời ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với nhiều tác nhân khác nhau. Các tín hiệu sau khi lai sẽ đƣợc phát hiện dựa vào các phản 27 ứng tạo màu khác nhau. Nhƣợc điểm chính của phƣơng pháp dùng nhiều probe này là các trình tự đích này nằm trùng với nhau trên mẫu mô nên rất khó khăn khi phân biệt, làm sao để phân biệt các tín hiệu tạo ra do nhiều probe cùng liên kết với cùng một vị trí trên mô. Để khắc phục đƣợc nhƣợc điểm này, ngƣời ta gắn các chất nhuộm huỳnh quang vào các probe, các chất nhuộm huỳnh quang này phát ra tín hiệu ở các bƣớc sóng khác nhau, dựa vào đó ngƣời ta phát hiện các probe sau khi lai (Paddock, 2001). CHƢƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM III.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm  Thời gian thực hiện thí nghiệm từ 1 – 3 – 2005 đến 30 – 7 – 2005.  Địa điểm thực hiện thí nghiệm tại phòng Mô học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ (TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB) trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh. III.2 Vật liệu sinh học 1. Đối tƣợng thí nghiệm là P. monodon và P. vannamei ở các dạng sau: Tôm thƣơng phẩm Tôm giống Postlarvae 2. Các mẫu tôm sú P. monodon đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với WSSV. 3. Các mẫu tôm TCT P. vannamei đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác định dƣơng tính với TSV. 4. Các mẫu tôm sú và TCT ở dạng postlarve hay thƣơng phẩm có các dấu hiệu bệnh lý đƣợc lấy từ các trại giống và các ao nuôi thƣơng phẩm ở các tỉnh ĐBSCL và Phú Yên. Các mẫu này đƣợc thực hiện chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mô học, PCR và ISH. III.3 Hóa chất thí nghiệm III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ 28 Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer) Proteinase K (dạng bột) Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer) Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer) Dung dịch lai (Hybridization Solution) Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer) Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X Blocking Buffer) Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution) Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer) Dung dịch phát triển màu (Development Solution) Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer) Mẫu đối chứng dƣơng Mẫu đối chứng âm Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm: Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin) SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer Formamide 50% Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP) Dextran Sulfate 5% DNA cá hồi 0,5 mg/l Thành phần bộ kit chẩn đoán WSSV và TSV hầu nhƣ giống nhau chỉ khác nhau ở thành phần của dung dịch lai. Đối với bộ kit chẩn đoán WSSV, dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh đốm trắng và bộ kit chẩn đoán TSV thì dung dịch lai chứa probe đặc hiệu cho virus gây bệnh Taura. III.3.2 Hóa chất cần thiết nhƣng không có trong bộ kit chẩn đoán 29 Cồn tuyệt đối, xylene hoặc chất thay thế xylene, nƣớc cất hai lần, chloroform, paraffin, formalin, formaldehyde 37%, acid acetic nguyên chất, paraformaldehyde dạng bột, Bismark Brown Y dạng bột, keo dán (Boume du Canada). Các loại hóa chất này mua từ công ty Prolabo và Merck, có độ tinh khiết cao. III.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm III.4.1 Thiết bị thí nghiệm Máy xử lý mẫu tự động, bình rót paraffin, Electrothermal, bàn lạnh, máy cắt mẫu Microtome, bể nƣớc ấm có chỉnh nhiệt độ, bàn ấm cố định mẫu trên lame kính, tủ ấm có chỉnh nhiệt độ, buồng ẩm chuyên dụng cho lai tại chỗ Slide Moat, tủ lạnh âm 20 0C và tủ mát 40C – 70C, kính hiển vi quang học. III.4.2 Dụng cụ thí nghiệm Cassette chứa mẫu có nắp đậy, khung inox dùng để đúc mẫu, lame và lamelle, ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu, micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và 1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame dƣơng và các dụng cụ cần thiết khác. III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit III.5.1 Chuẩn bị hóa chất Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X, PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50%. Tất cả các dung dịch trên đƣợc pha loãng trong nƣớc cất hai lần. Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau. Sau cùng ta phân dung dịch vừa thu đƣợc vào các eppendorf và trữ ở -200C, 1 ml cho mỗi eppendorf. Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 370C cho đến khi nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn. Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 70C và dùng trong 2 tuần. 30 Pha dung dịch Bismark Brown Y 0,5% bằng cách thêm 0,5 gram bột Bismark Brown Y vào 100 ml nƣớc cất, hòa tan bột rồi lọc qua giấy Whatman#1. Trữ dung dịch này trong bình xám ở nhiệt độ phòng. Các dung dịch PBS 1X, PBS/Glycine 1X, TBS 1X, Stop buffer 1X, Blocking buffer 1X, paraformaldehyde 0,4% trữ ở 2 – 70C dùng trong 2 tuần. Cồn đã pha loãng và các dung dịch SSC có thể giữ đƣợc một tháng ở nhiệt độ phòng. III.5.2 Chuẩn bị mẫu III.5.2.1 Cố định mẫu Mẫu tôm tiến hành thí nghiệm là tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm. Mẫu tôm dùng để phân tích phải còn sống hoặc đang còn trong tình trạng hấp hối.  Để phát hiện WSSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch Davidson, thành phần gồm: Cồn 95% 330 ml Formalin 220 ml Acid acetic glacial 115 ml Nƣớc cất 335 ml  Để phát hiện TSV thì mẫu tôm phải đƣợc cố định trong dung dịch không acid R-F (RNA – friendly): Formaldehyde 37% 349ml Cồn 95% 407 ml Nƣớc cất 244 ml Chỉnh pH = 7 Ngâm mẫu cố định từ 12 – 24 giờ, sau đó lấy mẫu ra khỏi dung dịch cố định, rửa với nƣớc 1 – 2 giờ và đem xử lý mẫu. III.5.2.2 Cách xử lý mẫu: Mẫu sau khi rửa, ta tiến hành xử lý theo quy trình sau: 31 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán Tổng thời gian xử lý mẫu: 12,5 giờ Paraffin đƣợc dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong. III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định các mẫu sao cho nó nằm yên dƣới đáy và tách rời nhau. Sau đó đặt khuôn inox chứa mẫu và paraffin lên bề mặt của dụng cụ làm lạnh, đợi khuôn lạnh khối paraffin chứa mẫu đã cứng và tách khối paraffin ra khỏi khuôn. III.5.2.4 Cắt mẫu Dùng máy cắt Microtome cắt mẫu thành từng lát dày 5 – 6 m. Mẫu cắt đƣợc trải lên lame, nhỏ vài giọt cồn 70% lên mẫu rồi cho mẫu qua bể chứa nƣớc 400C để làm căng bề mặt mẫu. Sau đó đính mẫu lên lame dƣơng và giữ ấm ở 400C trong 4 – 6 giờ mới thực hiện chẩn đoán. III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit III.5.3.1 Ngày thứ nhất Cố định lát cắt mô trên lame kính bằng cách ủ lame ở 600C trong 30 phút. Xử lý mẫu trƣớc khi lai  Dùng xylene để khử paraffin trong mẫu, loại bỏ xylene trong mẫu bằng cồn tuyệt đối. Sau đó, ta giảm dần độ cồn và rửa lại nƣớc cất nhiều lần để đảm bảo mẫu tinh sạch. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ 32  Sau đó tiến hành xử lý mẫu với PBS 1X, tạo điều kiện cho Proteinase K hoạt động tốt.  Dùng enzyme Proteinase K để xử lý mô, phân hủy màng tế bào và màng nhân vì enzyme này chỉ có khả năng phân cắt protein có trong mẫu mô đã cố định trên lame và không ảnh hƣởng gì đến acid nucleic trong mẫu.  Rửa mẫu với dung dịch PBS/Glycine 1X để loại bỏ các enzyme còn thừa.  Sau đó cho mẫu vào trong hủ nhuộm sạch có chứa paraformaldehyde 0,4%, ủ 10 phút ở 40C giúp sợi DNA duỗi thẳng ra thuận lợi cho quá trình bắt cặp bổ sung. Tiến hành lai: Mẫu dò hay probe trong dung dịch lai trƣớc đó đã đƣợc biến tính bằng cách đun 10 phút ở 950C, làm lạnh nhanh và giữ lạnh ở 40C. Sau đó, ta cho dung dịch lai lên lame và biến tính mẫu mô ở 950C trong 6 phút. Phản ứng lai giữa hai thành phần trên xảy ra ở 420C trong 12 – 18 giờ (ủ qua đêm). 33 Xylene 5 phút, lặp lại 3 lần Thấm dung dịch trên lame nhƣng không đƣợc để khô mô (Đối với tất cả các bước trong kỹ thuật này) Hút lƣợng dung dịch lai cần thiết vào tube chịu đƣợc nhiệt độ cao, đun dung dịch lai trong 10 phút ở 950C. Sau đó cho ngay tube vào khay nƣớc đá 40C. 500 l Pro.K/lame 15 phút, ở 600C Dung dịch PBS 1X 5 phút, RT Dung dịch PFA 0,4%/PBS 1X, 10 phút, 40C Dung dịch PBS 1X/glycine 5 phút, RT 1. Hút 75 l dung dịch lai/lame, đậy lamelle lại 2. Đặt lame lên bàn lai ở 950C trong 6 phút 3. Tiếp tục cho lame vào phòng ẩm, ủ qua đêm ở 420C Mẫu trên lame ủ 60 0C trong 30 phút Cồn tuyệt đối 2 lần, 1 phút/lần Cồn 95% 2 lần, 1 phút/lần Cồn 80% 2 lần, 1 phút/lần Cồn 50% 1phút 1 lần Nƣớc cất 5 lần Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất III.5.3.2 Ngày thứ hai  Sau bƣớc ủ lai ngày thứ nhất, mẫu trên lame kính đƣợc rửa dung dịch lai để loại bỏ lƣợng mẫu dò thừa bằng một loạt dung dịch đệm Sodium Chloride/Sodium Citrate có nồng độ giảm dần.  Ủ mẫu với dung dịch Blocking buffer 1X, chất blocking trong dung dịch sẽ khóa các phân tử lai không đặc hiệu lại.  Ủ mẫu với dung dịch Anti – Digoxigenin (Anti – DIG) có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti – Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên – kháng thể. Sau bƣớc này, những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc gắn thêm Anti – DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. 34 Dung dịch SSC 2X 5 phút/lần, 2x Dung dịch SSC 1X 5 phút/lần, 2x Dung dịch SSC 0,5X 5 phút/lần, 2x Dung dịch Blocking buffer 1X 1ml, 10 phút Dung dịch Anti-DIG/AP conjugated, 10 phút Dung dịch TBS 1X 5 phút/lần, 2x Dung dịch phát triển màu 2 giờ, ủ trong tối Dung dịch stop buffer1X, 5 phút Thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, 60 giây Rửa màu thừa bằng nƣớc cất. Cồn 95% 1 phút, 3x Cồn 99,5% 1 phút, 3x Xylene 1 phút, 3x Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai  Rửa mẫu với dung dịch TBS 1X để loại bỏ những phân tử Anti – DIG gắn AP thừa.  Ủ mẫu với dung dịch phát triển màu 2 giờ, trong tối ở nhiệt độ phòng.  Kết thúc phản ứng hiện màu bằng dung dịch Stop buffer 1X.  Nhuộm màu bổ sung bằng thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, mẫu mô – những vùng không có phân tử lai dƣới kính hiển vi quang học có màu vàng nâu. Rửa sạch màu thừa bằng nƣớc cất hai lần. Chúng ta có thể quan sát kết quả lai dƣới kính hiển vi quang học ngay sau bƣớc này. Nếu muốn giữ mẫu lâu thì tiếp tục cho lame mẫu qua cồn 95%, cồn tuyệt đối, xylene và dán keo cytoseal 60. III.6 Phƣơng pháp nghiên cứu III.6.1 Phƣơng pháp thu mẫu Mẫu đƣợc thu theo từng đợt ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và mẫu nhận hàng ngày tại TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Cách thu mẫu đƣợc tiến hành nhƣ sau: 35 Đối với tôm Postlarvae: Đối với tôm Postlarvae thu khoảng 100 con/bể, thu ở nhiều nơi trong bể giống, sau đó trộn lại với nhau và thu khoảng 100 con cho trực tiếp vào dung dịch cố định. Ngoài ra, chúng ta có thể dùng nƣớc ngọt hoặc formol gây sốc tôm trong khoảng 10 – 15 phút, nồng độ formol 200 – 300 ppm, sau đó thu những con yếu và chìm dƣới đáy. Mẫu sau khi thu đƣợc chia thành hai phần cho vào hai lọ chứa dung dịch cố định khác nhau, một lọ có chứa cồn 950C để làm PCR và lọ còn lại có chứa dung dịch Davidson (đối với tôm sú) hoặc R-F (đối với TCT) để làm mô học và In situ hybridization. Khi thu mẫu thì tôm còn sống hoặc đang trong tình trạng hấp hối là tốt nhất. Đối với tôm thƣơng phẩm: Đối với tôm lớn thu mẫu bằng cách lấy tôm sống hoặc đang hấp hối, cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (trong đó có chứa mang và gan tụy), dùng dung dịch cố định (hai loại dung dịch: dung dịch cố định cho PCR và dung dịch cố định chung cho cả mô học và ISH) tiêm vào gan tụy và vùng xung quanh gan tụy. Lƣợng dung dịch cố định dùng từ 0,1 – 10 ml, thay đổi tùy theo kích thƣớc tôm. Sau đó cho mẫu vào lọ có chứa dung dịch cố định tƣơng ứng. Số tôm thu từ 5 – 10 con/ao. Tỷ lệ hóa chất dùng cố định mẫu là hóa chất : mẫu = 10 : 1. III.6.2 Bố trí thí nghiệm Chẩn đoán theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp. Thay đổi một số bƣớc trong quy trình để đƣa ra một quy trình tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR. Các bố trí cụ thể nhƣ sau: III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei A. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phƣơng pháp ISH, chúng tôi thực hiện thí nghiệm theo quy trình bộ kit đã nêu ở mục III.5 trên ba mẫu tôm dƣơng tính với TSV, một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm. Vì chúng 36 tôi không thu đƣợc những mẫu dƣơng tính điển hình nên thực hiện thí nghiệm này trên các mẫu cũ, đƣợc lƣu lại trong phòng thí nghiệm mô học từ năm 2004. Các mẫu tôm này dƣơng tính với TSV khi xét nghiệm bằng mô học và PCR, thực hiện thí nghiệm lặp lại 2 lần. B. Bố trí thí nghiệm để tìm quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên Penaeus vannamei Sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, chúng tôi thực hiện một số thí nghiệm tiếp theo để tìm ra quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên TCT trong phòng thí nghiệm, các thí nghiệm đó là: (a) Thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu thích hợp Chúng tôi thực hiện thí nghiệm này trên 10 mẫu tôm TCT đã đƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu postlarvae) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên năm nghiệm thức sau: Nghiệm thức I: probe và mẫu đƣợc biến tính chung trên lame ở 950C trong 6 phút, thực hiện trong buồng ẩm. Nghiệm thức II: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 800C trong 6 phút. Nghiệm thức III: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 700C trong 6 phút. Nghiệm thức IV: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 600C trong 6 phút. Nghiệm thức V: probe đƣợc biến tính riêng ở 950C trong 10 phút, làm lạnh đột ngột và giữ lạnh ở 40C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 500C trong 6 phút. (b) Thí nghiệm tìm thời gian cắt thích hợp với Proteinase K Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai đối tƣợng là tôm postlarvae và tôm thƣơng phẩm để tìm ra thời gian tối ƣu áp dụng trên từng đối tƣợng đó, mỗi đối tƣợng thực hiện 5 mẫu và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các mẫu 37 dùng trong thí nghiệm này đều đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV. Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên 5 nghiệm thức sau: 11 phút, 13 phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút. (c) Thí nghiệm tìm thể tích dung dịch lai sử dụng tốt nhất Nếu theo quy trình của bộ kit thì dùng thể tích dung dịch lai là 75 l/mẫu có nồng độ probe là 1 – 2 ng/ml dung dịch lai. Vì trong khi thực hiện lai có biến tính probe ở 950C trong 10 phút, sau khi cho dung dịch lai đã biến tính lên mẫu rồi thực hiện biến tính mẫu tiếp một lần nữa. Qua nhiều lần biến tính nhƣ vậy dung dịch lai có thể bị hao hụt do hiện tƣợng bốc hơi. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm để tìm ra thể tích dung dịch lai thích hợp nhất khi lai. Chúng tôi tiến hành trên 10 mẫu tôm TCT đã đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV (5 tôm postlarvae và 5 tôm thƣơng phẩm) và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại 2 lần trên các nghiệm thức sau: 100 l, 75 l, 50 l. III.6.2.2 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus đốm trắng WSSV trên tôm sú Penaeus monodon A. Bố trí thí nghiệm theo quy trình bộ kit ổn định phƣơng pháp Chúng tôi thực hiện chẩn đoán theo quy trình bộ kit khuyến cáo đã nêu ở mục III.5 trên 3 mẫu tôm (1, 2, 3) đã dƣợc phƣơng pháp mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm), thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. B. Bố trí thí nghiệm để tìm ra quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện Trong phần bố trí này, chúng tôi thực hiện thí nghiệm có thay đổi một số chỉ tiêu và hóa chất thông dụng để tìm ra quy trình ISH tối ƣu áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện theo cách bố trí sau: Bố trí 1: Chúng tôi lặp lại thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhƣ mục III.5 để ổn định phƣơng pháp, cũng thực hiện thí nghiệm trên ba mẫu 1, 2, 3 trên nhƣng có thay đổi một số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit nhƣ cồn tuyệt đối, xylene và paraformaldehyde mua của công ty Prolabo và Merck bằng cồn tuyệt đối, xylene và 38 paraformaldehyde do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất, nhằm giảm chi phí thực hiện chẩn đoán và phù hợp điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm Mô học của Viện. Bố trí 2: Chúng tôi tiến hành thay đổi một số chỉ tiêu trong quy trình chuẩn của bộ kit ở mục III.5, mỗi chỉ tiêu cải tiến là một thí nghiệm. Các thí nghiệm đƣợc thực hiện trên các mẫu tôm sú đã đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV và hai đối chứng kèm theo (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV trong phòng thí nghiệm Số thí nghiệm Các chỉ tiêu cần cải tiến Penaeus monodon Số lần lặp lại Post larvae Thƣơng phẩm 39 Cồn 70% 5 phút Cồn 80% 5 phút Cồn 95% 5 phút Cồn tuyệt đối (1) 5 phút Cồn tuyệt đối (2) 5 phút Xylene (1) 5 phút Xylene (2) 5 phút Xylene (3) 5 phút Sơ đồ 3.4: Quy trình xử lý mẫu nhanh 1. Áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh giảm thời gian 5 mẫu 5 mẫu 2 2. Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai 5 mẫu 5 mẫu 2 3. Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai 5 mẫu 5 mẫu 2 Trong đó: (a) Quy trình xử lý mẫu: Quy trình xử lý mẫu chuẩn theo bộ kit nhƣ đã nêu ở mục III.5.2.2 và sơ đồ 3.1. Quy trình xử lý mẫu nhanh trong thí nghiệm: là quy trình đã đƣợc Bộ môn Mô học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II áp dụng trong chẩn đoán mô học. Quy trình đƣợc thực hiện trong microwave, ở nhiệt độ thấp khoảng 40 – 500C và gồm các bƣớc sau: Cả quy trình xử lý chỉ mất khoảng 55 phút, sau khi xử lý xong ta ngâm mẫu trong paraffin khoảng 2 – 3 giờ, lấy mẫu ra đúc và cắt bình thƣờng. (b) Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai Biến tính mẫu và probe theo quy trình bộ kit: theo quy trình của kit thì probe trong dung dịch lai đƣợc biến tính trƣớc ở nhiệt độ 950C trong 10 phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 40C cho đến khi cho lên mẫu lai. Khi lai, ta cho dung dịch lai có probe đã 40 đƣợc biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính mẫu ở 950C trong 6 phút, sau đó ủ qua đêm ở 420C để probe bắt cặp với trình tự đích trên mẫu. Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trong thí nghiệm: trong thí nghiệm này, chúng tôi bỏ qua bƣớc biến tính probe trong dung dịch lai trƣớc khi lai. Khi thực hiện lai, chúng tôi cho dung dịch lai có probe chƣa biến tính lên mẫu và thực hiện biến tính đồng thời mẫu và probe ở 950C trong 6 phút, sau đó ổn định nhiệt độ ở 420C và ủ qua đêm. (c) Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trƣớc khi lai Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện kết hợp hai quy trình trên trong chẩn đoán WSSV bằng ISH. III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR Trong phần bố trí này, mẫu có dấu hiệu bệnh sau khi thu về phòng thí nghiệm đƣợc chia thành hai phần, một phần cố định trong cồn 950 để thực hiện chẩn đoán bằng PCR; phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson đối với tôm sú và cố định trong dung dịch R-F đối với TCT và dùng để kiểm tra mô học và ISH. Thí nghiệm đƣợc bố trí nhƣ sau: Đối với bệnh Taura trên tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei Bảng 3.2: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. vannamei Phƣơng pháp Cách cố định mẫu Số mẫu Penaeus vannamei Số lần lặp