Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định Macrobrachium rosenbergii Nodavirus (MrNV) và Extra Small Virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM DUY LÃM Th.S. NGƠ XUÂN TUYẾN Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005 iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình dạy sỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tại trường. Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Hảo, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những vấn đề khó khăn và tạo điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Em xin cảm ơn Anh Ngô Xuân Tuyến, chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng đã nhiệt tình hướng dẫn, trợ giúp em về nguyên vật liệu, dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này. Em xin cảm ơn anh chị làm việc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, phòng lab DNA TRung Tâm Chẩn Đoán YKhoa Hoà Hảo, các anh chị ở Trại Thực Nghiệm Thủ Đức, đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, bản khoá luận này không tránh khỏi những khiếm khuyết nhất định, rất mong sự giúp đỡ chỉ bảo cũng như các ý kiến đóng góp của quý thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên. Sau cùng, em xin cảm ơn gia đình cùng bè bạn đã quan tâm, giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài. TpHCM, tháng 8 năm 2005 Sinh viên Phạm Duy Lãm iv TĨM TẮT Tơm càng xanh là một trong những đối tƣợng nuơi quan trọng của ngành nuơi trồng thủy sản. Ở Châu Á tơm càng xanh đƣợc mở rộng và tăng cƣờng nuơi với qui mơ cơng nghiệp ở một số nƣớc nhƣ Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nƣớc này chiếm sản lƣợng lớn tơm càng xanh của cả thế giới. Sự mở rộng và tăng cƣờng nuơi tơm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới. Một trong những bệnh mới đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ƣơng tơm càng xanh gây thiệt hại cho ngành cơng nghiệp nuơi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đĩ xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh thuộc Trung Quốc. Bệnh này cĩ biểu hiện hơi trắng ở đuơi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuơi ”. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Hiện nay, trong các bể ƣơng tơm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuơi, các bể này cĩ tỷ lệ chết rất cao. Để xác định nguyên nhân gây chết trong các bể ƣơng cĩ phải là do MrNV và XSV gây ra hay khơng. Chúng tơi tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác định cĩ hay khơng sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng đuơi. Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tơi đạt đƣợc cĩ kết quả nhƣ sau:  Xác định đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR  Khảo sát đƣợc hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và Trizol trên mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR.  Khảo sát đƣợc nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT- PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.  Khảo sát đƣợc nhiệt độ lai tối ƣu của hai virus cho phản ứng Single - Step PCR là 550C.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tơm càng xanh thu từ thực địa, kết quả phát hiện đƣợc 6 mẫu tơm mẹ, 1 mẫu tơm postlarvae cĩ sự hiện diện đồng thời của MrNV và XSV trong mẫu tơm bệnh trắng đuơi. v ABSTRACT Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture. However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India. The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China. The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease”. Lately, scientists have been detected a nodavirus - like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named Macrobrachium rosenbergii nodavirus. Subsequently a second virus - like particle, named XSV. XSV has always been found associated with the MrNV. Untill, The relationships between these two viruses remain unknown. Although White tail disease (WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam. Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed. et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam. To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. et al for the laboratory, positive control from India was used. We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed. The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg 2+ , 20 mol primer and 55 0 C annealing temperature. Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV. Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV. In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam. It is essential to carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed. vi Mục lục Lời cảm ơn ....................................................................................................................... iii Abstract ............................................................................................................................ iv Tĩm tắt ............................................................................................................................. v Mục lục ............................................................................................................................ vi Danh mục các hình và các bảng ....................................................................................... ix Danh mục các từ viết tắt .................................................................................................. x PHẦN 1. LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TƠM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM .......................................... 3 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tơm càng xanh trên thế giới ........... 3 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tơm càng xanh ở Việt Nam ............ 3 2.2. MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TƠM CÀNG XANH ............................... 5 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ ......................................................................................... 5 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng ........................................................................ 5 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn .......................................................................... 5 2.2.4. Bệnh phát sáng .......................................................................................... 5 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ ................................................................................. 6 2.2.6. Bệnh do Protozoa ...................................................................................... 6 2.2.7. Bệnh virus ................................................................................................. 6 2.2.8. Bệnh trắng đuơi ........................................................................................ 6 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH TRẮNG ĐUƠI DO VIRUS GÂY RA TRÊN TƠM CÀNG ........................................................................ 10 2.3.1. Phƣơng pháp mơ học ................................................................................ 10 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot-lot............................................................................ 10 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ........................................ 11 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) ................................................................................................. 12 2.3.5. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................... 12 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) ............... 15 vii PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................ 18 3.2. VẬT LIỆU ........................................................................................................... 18 3.2.1. Mẫu tơm .......................................................................................................... 18 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình ............................................................................... 18 3.2.3. Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) .................. 19 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit............................................................... 19 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) .......................... 20 3.2.6. Hố chất khác .................................................................................................. 20 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 21 3.3. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 21 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus ................................................................ 21 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol ................................................................ 21 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) .................... 22 3.3.2. Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV .............. 22 3.3.3. Phƣơng pháp điện di nucleic acid trên gel agarose .................................... 23 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM ........................................................................................ 24 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tơm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ ............................................ 24 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR ................... 24 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad)................................................................................. 24 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi ........................................................................ 25 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi .............................................................. 25 3.4.3. Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa ......................................................................................................................................... 25 viii PHẦN 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TƠM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ. .................. 26 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR ..................................................................................................................... 27 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết. .............................................. 27 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi .............................................................. 30 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi .................................................. 30 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TƠM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA ....................................................................................... 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 36 5.2. Tồn tại ................................................................................................................. 36 5.3. Đề xuất ................................................................................................................ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt .................................................................................................................. 38 Tiếng nƣớc ngồi ........................................................................................................ 39 ix Danh mục hình và các bảng Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuơi ở tơm càng xanh ............................................. 8 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirus ........................................... 8 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV ............................................ 11 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ........ 17 Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tơm càng xanh nhiễm MrNV, XSV ............................................................................................................................ 26 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách bằng bộ Kit và Trizol . .................................................................. 28 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau ........................................................................................................... 29 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV ............................................................................................................ 30 Hình 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tơm càng xanh ..... 33 Hình 4.6: Kết quả điện di mẫu tơm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức ........... 34 Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tơm càng xanh ở ĐBSCL từ 1999 - 2003. ........ .4 Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR ................................................. 18 Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III ............................................................... 20 Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR ............................ 22 Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi .................................................... 25 Bảng 3.5: Các loại mẫu tơm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau ..................... 25 Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol .................. 28 Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ .................. 31 Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tơm càng xanh ........ 35 x Danh mục các từ viết tắt DNA: Deoxyribonucleic acid ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid mRNA: Messenger ribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base) dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím TE: Tris-EDTA. DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat ĐBSCL: Đồng Bằng Sơng Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus XSV: Extra small virus PCR: Polymerase Chain Reaction RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai của mồi 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Kể từ năm 1990 đến nay, bên cạnh sự phát triển của nghề nuơi tơm sú thì tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) đƣợc xác định là một trong những đối tƣợng nuơi thủy sản quan trọng đối với thủy vực nƣớc ngọt Việt Nam, đặc biệt là Đồng Bằng Sơng Cửu Long, với lợi thế cĩ diện tích mặt nƣớc ngọt gần 600.000 ha, nhiều sơng ngịi, kênh rạch, ao, vƣờn, ruộng. ĐBSCL đƣợc xem là vùng cĩ tiềm năng rất lớn cho nghề nuơi tơm càng xanh. Ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Vĩnh Long, An Giang và Cần Thơ là những tỉnh cĩ nghề nuơi tơm càng xanh phát triển. Theo số liệu thống kê của Bộ Thủy Sản năm 1999, ĐBSCL cĩ 6000 ha diện tích nuơi tơm càng xanh với tổng sản lƣợng trên 2500 tấn và đến 2002 sản lƣợng tơm càng xanh đã tăng nhanh đáng kể với tổng sản lƣợng lên đến 10.000 tấn (Bộ Thủy Sản, 2003). Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất hiện nay đối với nghề nuơi tơm càng xanh ở nƣớc ta nĩi chung và ĐBSCL nĩi riêng là vấn đề con giống. Từ lâu, ngƣời nuơi vẫn quen sử dụng nguồn giống tự nhiên đƣợc thu gom từ sơng rạch, vì thế nguồn giống ngày càng khan hiếm, chất lƣợng khơng đảm bảo. Do đĩ, đã cĩ nhiều cơng nghệ sản xuất giống tơm càng xanh đƣợc đẩy mạnh nhƣ: cơng nghệ sản xuất giống tơm càng xanh trong ao đất ở vùng nhiễm mặn, sản xuất giống nƣớc xanh và nƣớc xanh cải tiến ở vùng nội đồng, sản xuất tơm càng xanh tồn đực bằng con cái giả thơng qua kỹ thuật vi phẫu. Sau những thành cơng của các cơng nghệ sản xuất giống, nối tiếp là hàng loạt những trang trại sản xuất giống nuơi thâm canh ra đời, sự khai khác tối đa nguồn nƣớc tự nhiên, sự đáp ứng khơng đủ về mặt năng lực chuyên mơn, nghiêm trọng hơn là áp dụng mơ hình nuơi bừa bãi dẫn đến sự giảm thiểu về mơi trƣờng, phá vỡ mơi trƣờng sinh thái làm phát triển nhanh chĩng sự lây lan dịch bệnh. Trong số những tác nhân gây bệnh tìm thấy trên tơm nuơi, virus là một tác nhân quan trọng nhất gây nên sự bùng nổ dịch bệnh (Lightner, 1993). Một trong những virus đƣợc ghi nhận gần đây xuất hiện đầu tiên ở Ấn Độ (Arcier và cộng sự, 1999) gây thiệt hại nghiêm trọng trên các đàn postlarvae ở các trại sản xuất giống (Bonami và cộng sự, 2005), tỷ lệ chết lên đến 100% (Vijayan và cộng sự, 2003). Bệnh do hai loại virus là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) 2 (Vijayan và cộng sự, 2003) và Extra small virus (XSV)(Qian và cộng sự, 2003) gây bệnh trắng đuơi (White tail disease). Ở Việt Nam chƣa tìm thấy một cơng bố nghiên cứu nào về hai loại virus trên nhiễm trên tơm càng xanh. Chính vì vậy đƣợc sự đồng ý của Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II, chúng tơi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ” với: Mục đích  Xác định sự hiện diện hai loại virus MrNV và XSV trên tơm càng xanh bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TƠM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 2.1.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tơm càng xanh trên thế giới Tơm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một lồi cĩ giá trị kinh tế cao trong nghề nuơi thủy sản nƣớc ngọt. Theo số liệu thống kê của FAO năm 1998, Đài Loan 14.000 tấn (1991), Thái Lan 10.000 tấn. Đến năm 2002 Trung Quốc chiếm 58% về sản lƣợng tơm càng xanh của thế giới. Vì tơm càng xanh mang lại lợi nhuận cao, dễ nuơi, ít bị bệnh hơn so với các loại tơm nuơi khác nên từ lâu đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về nuơi và ngày càng hồn thiện về quy trình kỹ thuật nuơi (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000). Sau thành cơng của Ling (1969) về sinh sản nhân tạo tơm càng xanh ở Malaysia. Năm1972, Fujimura và Okamoto đã cải tiến thành cơng phƣơng pháp sản xuất tơm càng xanh đại trà. Năm 1974, cũng Fujimura đƣa ra qui trình nƣớc xanh. Sau đĩ hàng loạt các tác giả khác đã cố cơng nghiên cứu việc sinh sản nhân tạo và phát triển nuơi chúng nhƣ Adisukressno (1980), Liao (1980), Malecha (1980), Sandifer (1977), Smith (1879) (Trần Thanh Phục, 2001). Hiện nay, trên thế giới cĩ ba qui trình sản xuất giống tơm càng xanh đã đƣợc phổ biến là qui trình nƣớc trong hở (clear open water system), qui trình nƣớc trong kín (clear closed water system), và qui trình nƣớc xanh (green water system) (Nguyễn Việt Thắng, 1993). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tơm càng xanh ở Việt Nam Ở Việt Nam tơm càng xanh cũng đƣợc nghiên cứu từ năm 1974, sau năm 1980 tiếp tục đƣợc nghiên cứu tại Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II. Đến năm 1982, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tơm Vũng Tàu (Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II) đã cho tơm càng xanh sinh sản nhân tạo thành cơng (Phạm Văn Tình, 2000). Từ 1987-1992, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tơm Vũng Tàu đã sản xuất tổng cộng đƣợc 2.1 triệu postlarvae (Trần Thanh Phục, 2001). 4 Ngồi ra cịn nhiều tác giả: Trần Đức Can (1987), Phan Hữu Đức (1988), Nguyễn Quang Ly (1988), Nguyễn Việt Thắng (1995), Phạm Văn Tình (1999)... đã nghiên cứu về đặc điểm sinh học, vùng phân bố, mùa vụ sinh sản của tơm càng xanh, cũng nhƣ kỹ thuật sản xuất giống và nuơi tơm càng xanh thƣơng phẩm ở các thủy vực ao, đầm, ruộng, lúa và mƣơng vƣờn (Trần Thanh Phục, 2001). Nguyễn Việt Thắng (1993), đã khảo nghiệm một số qui trình sản xuất giống tơm càng xanh và đạt kết quả khả quan: quy trình nƣớc trong hở đạt tỷ lệ sống trung bình 35,46% (10,5% - 66%), ƣơng với mật độ từ 60 - 100 ấu trùng/l; quy trình nƣớc trong tuần hồn kín đạt tỷ lệ sống trung bình 38,67% với mật độ 60 - 110 ấu trùng/l và quy trình nƣớc xanh đạt tỷ lệ sống trung bình 40,16% với mật độ 40 - 55 ấu trùng/l. Năm 1997, Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II đã chuyển giao thành cơng các cơng nghệ sản xuất giống và nuơi tơm càng xanh thƣơng phẩm ở một số tỉnh phía Nam nhƣ: Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, TPHCM (Nguyễn Việt Thắng, 1997). Biểu đồ 2.1: Số lƣợng trại giống và sản lƣợng tơm càng xanh ở ĐBSCL từ năm 1999- 2003 (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004). Từ năm 1998 đến nay, Viện Hải Sản - Trƣờng Đại Học Cần Thơ đã tiến hành nghiên cứu ƣơng nuơi ấu trùng tơm càng xanh theo mơ hình “nƣớc xanh cải tiến” và đang triển khai ứng dụng tại một số tỉnh nhƣ: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, An Giang (Trần Ngọc Hải, 2000). 5 Từ 1999 - 2003, số lƣợng trại sản xuất giống cũng nhƣ sản lƣợng tơm giống sản xuất ở ĐBSCL khơng ngừng gia tăng theo thời gian, năm 2003 cĩ 97 trại giống tăng 95 trại so với năm 1999 và tổng sản lƣợng tơm giống sản xuất đƣợc trong năm 2003 là 76.5 triệu con (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004). 2.2. MỘT SỐ BỆNH XẢY RA TRÊN ẤU TRÙNG TƠM CÀNG XANH 2.2.1. Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN) Bệnh hoại tử cơ đĩ là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt cho tơm ấu trùng trong trại giống. Nash và cộng sự (1987) đã báo cáo rằng bệnh hoại tử cơ là nguyên nhân gây tử vong nhanh chĩng đến 60% số hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong hệ thống ƣơng tơm thâm canh ở Thái Lan. Bệnh này biểu hiện với nhiều điểm trắng lan rộng trên cơ (Akiyama và cộng sự, 1982; Nash và cộng sự, 1987; Brock, 1988). 2.2.2. Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle Disease-MCD) Bệnh này thƣờng xảy ra trong các giai đoạn ấu trùng từ IV-XI. Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo hiện tƣợng tử vong hàng loạt ấu trùng tơm càng xanh ở Malaysia khoảng 16 ngày sau khi nở. Bệnh này tƣơng tự nhƣ bệnh hoại tử do vi khuẩn. Ấu trùng bỏ ăn và những cá thể bệnh sẽ bị các con khỏe ăn thịt. Ấu trùng nhiễm bệnh thƣờng cĩ màu xám xanh lơ, bơi lội yếu ớt và thƣờng bơi theo hình xoắn ốc. Nguyên nhân gây bệnh vẫn chƣa xác định đƣợc nhƣng cĩ lẽ do nhiễm tự nhiên. Nguyên nhân cĩ thể là vi khuẩn Enterobacter aerogenes (vi khuẩn sinh bọt khí trong đƣờng ruột) (Johnson, 1978; Brock, 1988). 2.2.3. Bệnh hoại tử do vi khuẩn Triệu chứng cấp tính của bệnh này là ấu trùng chuyển sang màu xanh lơ nhạt, dạ dày rổng, ấu trùng chìm xuống đáy bể và cĩ những chấm nâu trên râu và các phụ bộ mới hình thành. Các quan sát cho thấy cĩ sự nhiễm phức hợp vi khuẩn dạng sợi Leucothix spp, trực khuẩn và cầu khuẩn trên các tơ lơng, mang, và các phụ bộ. Ấu trùng càng nhỏ thì bệnh càng nghiêm trọng. Theo tạp chí Aquacop (1977) cho biết bệnh này ảnh hƣởng đến ấu trùng tơm càng xanh (giai đoạn IV-V) ở Tahiti dẫn đến tử vong 100% trong 48 giờ. 6 2.2.4. Bệnh phát sáng Ấu trùng ở giai đoạn nhỏ rất mẫn cảm đối với bệnh do Vibrio harveyi gây ra. Bệnh này rất phổ biến trong các trại giống đối với tơm càng xanh nƣớc ngọt và tơm biển. Biểu hiện của bệnh này là sự phát sáng cĩ thể quan sát dễ dàng vào ban đêm. Ấu trùng nhiễm bệnh bị đĩng rong, đục cơ và bơi lội chậm chạp, cắn xé nhau, tỷ lệ chết 100%. Vi khuẩn phát sáng (Vibrio harveyi) ở Thái Lan đã đƣợc phân lập đƣợc trên tơm ấu trùng càng xanh đƣợc xem là loại bệnh khá phổ biến (Tonguthai,1997). 2.2.5. Bệnh lột xác dính vỏ Bệnh này ảnh hƣởng đến các giai đoạn hậu ấu trùng và các giai đoạn đầu của hậu ấu trùng gây tử vong khi tơm lột xác. Ấu trùng nhiễm bệnh khơng thể rút các phụ bộ, mắt hoặc chủy ra khỏi vỏ lột. Nếu thốt ra đƣợc vỏ lột thì phụ bộ bị dị tật và khơng lâu sau thì chết (Brock, 1983, 1988). Sự tử vong do bệnh này thƣờng khơng nghiêm trọng. Nguyên nhân của bệnh vẫn chƣa biết nhƣng chất lƣợng nƣớc kém hoặc dinh dƣỡng thiếu cĩ khả năng dẫn đến bệnh. 2.2.6. Bệnh do Protozoa Các loại Protozoa cĩ thể gây bệnh cho tơm là Zoothamnium sp, Epystulis sp, Vorticella sp, và Acineta sp. Ấu trùng bị nhiễm Protozoa cĩ màu hơi đục. Nếu nhiễm nhẹ, bệnh cĩ thể hết sau khi lột xác, nhƣng nếu nhiễm nặng cĩ thể ngăn cản quá trình lột xác, đình trệ sự tăng trƣởng và làm tơm chết . Khi quan sát thấy Protozoa trên ấu trùng thì phải cải thiện chất lƣợng nƣớc. Ngâm formalin 20-30 ppm trong 24 giờ cĩ hiệu quả và an tồn trong việc trị bệnh Zoothamnium trên ấu trùng ( Roegge và cộng sự,1979). 2.2.7. Bệnh virus Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo một loại Parvo - like virus ở hậu ấu trùng tơm càng xanh trong các trại giống ở Malaysia. Đây là loại virus đƣợc báo cáo đầu tiên trên tơm càng xanh. Hậu ấu trùng bị nhiễm virus với triệu chứng nhƣ sự mờ đục ở các mơ, gây hoại tử cơ. 7 2.2.8. Bệnh trắng đuơi Bệnh trắng đuơi (White tail disease ) gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến đàn ấu trùng. Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV). Sự mở rộng và tăng cƣờng nuơi trồng thủy sản nhiều và nhiều bệnh mới sẽ xuất hiện. Những báo cáo gần đây về bệnh trắng đuơi (White tail disease) xuất hiện trong những bể ƣơng tơm càng xanh và những trang trại vừa gây thiệt hại cho ngành cơng nghiệp nuơi trồng thủy sản ở Ấn độ. Thơng tin này đƣợc đƣa ra từ hội nghị “Freshwater Prawn 2003 International Symposium” ở Cochin (Ấn Độ) (Sahul Hameed, 2003). Bệnh đƣợc ghi nhận đầu tiên ở Guadeoupe năm 1997 (Arcier và cộng sự,1999) sau đĩ ở Martinique (Ấn Độ), Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999) và 5 tỉnh khác thuộc Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003). Trong những bể ƣơng tơm càng xanh bị nhiễm bệnh, dấu hiệu chủ yếu của đàn hậu ấu trùng (postlarvae) là lờ đờ, biếng ăn và mờ đục ở vùng cơ đuơi. Trong những trƣờng hợp bệnh nặng sự mờ đục khắp cơ thể và dẫn đến thối hố phần phụ bộ đuơi. Khoảng 2 - 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100%. Tơm bệnh cĩ dấu hiệu hơi trắng ở đuơi nên đƣợc gọi là “bệnh trắng đuơi ” (Sahul Hameed, 2003; Salin và Nair, 2003; Vijayan và cộng sự, 2003). Khi làm thí nghiệm cảm nhiễm virus gây bệnh trắng đuơi vào tơm postlarvae và tơm trƣởng thành, các nhà khoa học nhận thấy dấu hiệu bệnh và tỷ lệ chết ở tơm postlarvae cảm nhiễm giống nhƣ tơm postlarvae đƣợc nghi ngờ là bệnh trắng đuơi trong tự nhiên. Nhƣng ở tơm trƣởng thành khi cảm nhiễm cĩ những dấu hiệu nhƣ vùng đầu ngực phình to chứa đầy chất lỏng (Sahul Hameed và cộng sự, 2004). Tuy nhiên dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuơi khơng là dấu hiệu đặc trƣng cho bệnh trắng đuơi ở giai đoạn sớm của postlarvae (Yoganadhan và cộng sự, 2005). Khi quan sát tổ chức học trên mẫu tơm bệnh cho thấy sự hiện diện các thể virus cĩ kích thƣớc nhỏ (25 nm - 30 nm) (Tung và cộng sự, 1999). Theo Acier và cộng sự (1999) bệnh này gây bởi nodavirus - like virus đƣợc đặt tên là Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV). Một dạng virus khác đƣợc phát hiện là cộng hƣởng với Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV) là Extra small virus (XSV) (Qian và cộng sự, 2003). 8 Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) vừa đƣợc tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuơi (Bonami và Widada, 2003). Hiện nay chƣa cĩ một biện pháp điều trị nào cho bệnh trắng đuơi. Vì vậy, các nơng trại và bể ƣơng phải đƣợc quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh trắng đuơi. Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuơi ở tơm càng xanh MrNV cĩ dạng lập thể 20 mặt (icosaherdral), trần khơng cĩ vỏ bọc, thƣờng định vị trong tế bào chất của tế bào chủ, phát triển trong tất cả các bộ phận của tơm càng xanh bị bệnh ngoại trừ gan và tụy tạng, MrNV cĩ kích thƣớc lớn hơn XSV và cĩ đƣờng kính 20 - 30 nm đƣợc quan sát trong kính hiển vi điện tử (Acier và cộng sự,1999). MrNV cĩ vật liệu di truyền là hai sợi đơn RNA (RNA -1 và RNA - 2), với kích thƣớc tƣơng ứng là 2,9 kb và 1,3 kb, và tham gia cấu trúc capsid với một chuỗi polypeptide cĩ kích thƣớc 43 kDa. Dựa vào đặc tính và kết quả giải trình tự đoạn RNA1 của MrNV, Bonami và cộng sự (2005) đề nghị MrNV là thành viên của họ Nodaviridae, nhƣng khác biệt với hai lồi Alphanodavirus và Betanodavirus. 9 Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005). Họ Nodaviridae chia làm hai nhĩm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho cơn trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá. Thể virus này khơng cĩ màng bao, hình đa mặt, đƣờng kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn. Trong đĩ, RNA - 1 (3,1 kb) mã hố cho một protein khơng cấu trúc cĩ kích thƣớc 100 kDa với chức năng nhƣ là RNA polymerase. RNA - 2 (1,4 kb) mã hố cho hai phân tử protein vỏ lớn cĩ kích thƣớc lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa đƣợc hình thành do quá trình đồng sao chép một chuỗi polypeptide. Một RNA - 3 cũng đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhƣng khơng tồn tại trong thể virus. Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chƣa xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992). XSV là một satellite virus cĩ kích thƣớc nhỏ hơn virus MrNV với đƣờng kính 15 nm, cĩ vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng sự, 2003). Sau khi giải trình tự bộ gen của XSV cho thấy virus cĩ chiều dài sợi đơn RNA dài 796 nucleotide và đuơi ngắn poly (A) khoảng 15 - 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3’(GenBank acc.no.AY247793). Phân tích protein bằng SDS - PAGE cho thấy thể XSV chứa hai polypeptide là capsid 17 kDa (CP - 17) và capsid 16 kDa (CP - 16) (Qian và cộng sự, 2003). So sánh trình tự của CP - 17 của XSV với cấu trúc protein của họ satellite virus đã biết từ trƣớc, kết quả cho thấy cĩ sự khác biệt rất xa với họ satellite virus (Ban,1995; Zhang và cộng sự, 1991). Sự hiện diện đồng thời của XSV và MrNV trong bệnh trắng đuơi đặt ra giả thuyết là vai trị mỗi virus nhƣ thế nào trong việc phát triển cũng nhƣ trong sự phát SjNNV AhNNV GNNV beta-nodaviruses MrNV1B5A PaV alpha-nodaviruses FHV BoV NoV o V BBV 10 sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV khơng cĩ gen mã hố cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng. Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này cĩ đƣờng kính 20 nm, cĩ vật liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhĩm virus khác là thể satellite virus, nhĩm virus này thì sống sĩt khi thiếu một gen polymerase cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hố một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh của MrNV thì khơng biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004). XSV liên quan gần phân nhĩm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân nhĩm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus. Đến bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát đƣợc những satellite virus trong những ký chủ là thực vật. XSV là kiểu virus satellite đầu tiên đƣợc báo cáo là gây bệnh trong động vật. XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và Bonami, 2004). 2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐỐN BỆNH ĐUƠI TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TƠM CÀNG XANH 2.3.1. Phƣơng pháp mơ học. Mẫu phải đƣợc cố định trong Davidson trong 24 giờ. Cắt thành từng lát mỏng rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus cĩ hình mắt lƣới trong mơ tế bào kế cận của tất cả các cơ quan và các mơ (Tung và cộng sự, 1999). Thể vùi của virus MrNV nằm trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green (Tung và cộng sự, 1999). 11 2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot - blot Probe sử dụng trong phƣơng pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu đƣợc từ RNA - 1 của MrNV. Đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp PCR với tác nhân digoxygenine. Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mơ bị nhiễm hoặc từ dịch chiết virus. Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai. Sau khi qua các cơng đoạn xử lý bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dị đƣợc thêm vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dị khơng lai ra khỏi màng lai. Tiếp đĩ thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) cĩ gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu cĩ sự hiện diện của mẫu dị thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dị. Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể khơng phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi cĩ RNA của MrNV trên màng lai (Widada và cộng sự, 2003). 2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) Mẫu tơm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu tơm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khơ trong tủ sấy ở (60 0C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dị DNA đƣợc đánh dấu digoxigenin cĩ gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dị đƣợc gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti - DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính cĩ màu vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Khơng cĩ dấu hiệu của virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mơ ống tiêu hố và biểu bì cơ (Widada và cộng sự, 2003). 12 Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003). Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tơm postlarvae bị nhiễm MrNV. Phần 1a: vùng mang khơng bị nhiễm cĩ màu vàng cam. Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV cĩ màu tím đen. Phần 3a: vùng tụy tạng khơng bị nhiễm cĩ màu vàng cam Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ. phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV cĩ màu tím đen. 2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đốn bệnh trắng đuơi của tơm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV. Kháng thể đa dịng sản xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đĩ tinh sạch dung dịch nổi của virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV đƣợc tinh sạch từ dịch tràng ở màng bụng của chuột. Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng thể thứ hai cĩ gắn cơ chất, dƣới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra. Đây là một phƣơng pháp chẩn đốn bệnh trắng đuơi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao. 2.3.5. Phƣơng pháp PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR 2a 3a 1a 1b 13 Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng enzyme (Bùi Trang Việt, 2002). Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuơn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đĩ của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đĩ cĩ nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải cĩ thơng tin tối thiểu về trình tự đĩ đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuơi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer). 2.3.5.2. Phản ứng PCR Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm của phân tử; thƣờng là 94 - 950C trong 30 - 60 giây. Mạch đơi DNA tách thành mạch đơn. Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuơn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây. Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Một phản ứng PCR khơng vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đĩ kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu. 2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 14 DNA mẫu: Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đốn bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Ngồi ra phƣơng pháp PCR cịn cĩ một số ƣu điểm là cĩ thể khuếch đại cả những mẫu DNA khơng đƣợc bảo quản tốt. Enzyme Taq - polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nĩng Thermus aquaticus. Enzym này khơng bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Tth polymerase là một enzym tách chiết từ Thermus thermophilus, cĩ khả năng hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi cĩ mạch RNA khuơn và ion Mn++, nhƣng với sự hiện diện của của DNA khuơn và ion Mg ++ , Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Enzym này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thơng qua sự hình thành cDNA. Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng. Mồi và nhiệt độ lai: Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt và cĩ đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:  Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho khơng thể cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuơi” và mồi “ngƣợc”, cũng khơng cĩ những cấu trúc kẹp tĩc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi.  Nhiệt độ nĩng chảy của mồi “xuơi” và mồi “ngƣợc”, khơng cách nhau quá xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.  Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Trình tự nằm giữa mồi “xuơi” và mồi “ngƣợc” khơng quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb. 2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. 15 Mg 2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg2+ ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhƣng lại hạn chế sự biến tính hồn tồn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuơn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm khơng đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg2+ phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR. Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR khơng vƣợt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng cĩ khuynh hƣớng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau:  Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng.  Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.  Các bản sao kết hợp với nhau. 2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) Phƣơng pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phƣơng pháp phiên mã ngƣợc và phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này cĩ thể phát hiện các mRNA tồn tại với lƣợng rất thấp, mà khơng thể phát hiện bằng phƣơng pháp nhƣ Northern blot. Ngồi ra, RT-PCR kết hợp với kỹ thuật RFLP cĩ thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu hiện ở mức độ rất thấp. Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thƣờng và mRNA đột biến tạo thành các DNA, sau đĩ dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002). Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR khơng hoạt động trên RNA nên trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse transcriptase). Sau đĩ cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000). Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose. 16 Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR  Oligo (dT) bắt cặp với đuơi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ , cĩ thể dùng nhƣ mồi ngƣợc khơng đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên. Sau đĩ, phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất cĩ hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều mồi xuơi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên cĩ thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại sau đĩ sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuơi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).  Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên cĩ thể dùng làm mồi để tổng hợp cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên tồn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai khơng thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và Caskey, 1990). Trong việc chẩn đốn bệnh trắng đuơi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada , 2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt khơng liên tục. Kỹ thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc cơng bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA của từng virus, sau đĩ sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV. 17 18 Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR ( Dieffenbach và Dveksler, 1995;Widada , 2003; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a). RNA tách chiết Tổng hợp cDNA MrNV XSV Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tạo cDNA Bất hoạt enzym RT Khuếch đại Tiếp tục chu kỳ Tiếp tục chu kỳ 681 bp 500 bp 19 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tơm càng xanh bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.  Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.  Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa. 3.1.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian nghiên cứu: từ 7/3-7/8/2005. Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Mẫu tơm Các mẫu tơm càng xanh gồm: 30 mẫu ấu trùng, 2 mẫu postlarvae và 10 mẫu tơm mẹ thu tại trại Thực Nghiệm Thủ Đức, 8 mẫu tơm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL. Trong các mẫu chúng tơi thu đƣợc cĩ 8 mẫu tơm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae cĩ triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuơi . Các mẫu tơm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 700C. 3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình tự của RNA virus (MrNV: Ac No. AY222840; XSV Ac No). Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR Virus Primer Trình tự GenBank AC Kích cỡ sản phẩm MrNV MrNV-RNA2-F 5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’ AY222840 681 bp MrNV-RNA2-R 5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’ XSV XSV-F 5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’ 500 bp XSV-R 5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’ 20 3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay) Sản phẩm này do cơng ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là chế phẩm cĩ sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng với thể tích cuối 50 µl. Thành phần của hạt bead gồm:  2 đơn vị Taq DNA polymerase  10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phịng)  60 nM KCl  1.5 mM MgCl2  20 M mỗi loại dNTP  M - MulV Reverse Transcriptase  RNA guard TM  Ribonuclease Inhibitor và chất ổn định khơng chứa Rnase/DNase 3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit. Bộ Kit này do cơng ty Bio - Rad sản xuất, dùng để tinh sạch RNA từ những tế bào vi khuẩn và mơ động vật. Thành phần của Bộ Kit gồm :  RNA Lysis Solution  Protein/DNA Precipitation Solution  RNA Hydration Solution 21 3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III STT vạch Kích thƣớc (bp) 1 1353 2 1078 3 872 4 603 5 310 6 281 7 271 8 234 9 194 10 118 11 72 3.2.6. Hố chất khác Trizol Phenol (pH 4) Guanidine thiocyanate 0,8 M Ammonium thiocyanate 0,4 M Sodium acetate, pH 5, 0,1 M Glycerol 5%  Ethanol 75%  Isopropanol 100%  Chloroform  DEPC (Diethyl Prycacbonat)  Ethidium bromide  Dung dịch đặt mẫu (bromophenol blue 0,25%, glycerol 40%, Tris HCL 200 mM, EDTA 200 mM)  Agarose.  TBE 1X (Tris - boric acid 40 nM, EDTA 0,1 mM). 22  Nƣớc cất 2 lần cĩ sử lý DEPC 1% (DEPC - H2O) 3.2.7. Dụng cụ và thiết bị  Tủ cấy vơ trùng (Laminar-Box)  Tủ lạnh - 200C (Liebherr)  Tủ sấy dụng cụ 1500C (Gallenkamp)  Máy Vortex (Zx3 Velp)  Máy ly tâm lạnh 15000 vịng/ phút (certrifuge 5415 C)  Máy PCR (Thermocycle - Biorad)  Bộ điện di (Biorab Hybaid)  Bàn đọc UV (White/UV Transillminator)  Pipetteman các loại 0,5 - 1000 l  Eppendorf các loại 0,2 - 0,5 ml.  Cân phân tích  Kéo, đèn, cồn, chày nhựa sử dụng một lần. 3.3. PHƢƠNG PHÁP 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus 3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số bằng Trizol theo Peter Walker và cộng sự (2000). Nghiền khoảng 100 mg mơ trong 1ml Trizol. Ủ nhiệt độ phịng trong 5 phút. Thêm vào 200 l Chloroform. Vortex 20 giây. Ủ ở nhiệt độ phịng trong 3 phút. Ly tâm 12000 vịng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi cĩ chứa RNA vào ống eppendorf 1,5 ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh. Ủ nhiệt độ phịng trong 10 phút (qua đêm - 200C hay để - 700C trong 1 giờ). Ly tâm 12000 vịng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol 70%. Vortex, ly tâm 7500 vịng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khơ cặn RNA ở 550C. Hịa cặn RNA trong 50 l H20 - DEPC. Sau đĩ bảo quản - 20 0 C. 23 3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad) Lấy 5 - 10 mg mơ tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis. Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (40C) ở 13000 vịng trong 6 phút, kết tủa protein và DNA sẽ cĩ màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5 ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm 13000 vịng trong 6 phút (40C) (RNA sẽ thấy dƣới dạng kết tủa sáng). Đổ bỏ dung dịch nổi và làm ráo nƣớc trên giấy thấm, cho vào 300 l 70% ethanol và đảo ống vài lần để rửa RNA. Ly tâm ở 13000 vịng trong máy ly tâm khoảng 2 phút (40C). Đảo và làm ráo nƣớc trên giấy thấm sạch và cho khơng khí làm khơ 10 - 15 phút. Thêm 50 l dung dịch RNA Hydration. Ủ 30 phút trên nƣớc đá (hoặc trữ - 700C -> - 800C đến khi sử dụng). Trƣớc khi sử dụng vortex mạnh 5s và spin down hoặc trộn mẫu lên xuống vài lần. 3.3.2. Phƣơng pháp SINGLE - STEP RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV Trƣớc khi tiến hành phiên mã ngƣợc, RNA bản mẫu phải biến tính ở 700C trong 10 phút nhằm phá vỡ tồn bộ cấu trúc bậc một và hai cho RNA của từng virus. Tiếp đĩ, quá trình phiên mã ngƣợc đƣợc tiến hành cho hai Mix riêng biệt của MrNV, XSV trong eppendorf cĩ bổ sung hạt Bead ở điều kiện 520C trong 30 phút. Thành phần hai Mix sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV: Bảng 3.3: Thành phần hai Mix của phản ứng Single - Step RT - PCR Hai virus Thành phần của hai Mix Tổng Thể tích ( 50 l ) MrNV H20 – DEPC 43 l MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l) 1 l MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l) 1 l Bản mẫu 5 l XSV H20 – DEPC 43 l XSV - F (20 pmol/ l) 1 l XSV - R (20 pmol/ l) 1 l 24 Bản mẫu 5 l Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 940C trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đĩ thực hiện quá trình khuếch đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:  Giai đoạn biến tính: 940C trong 40s  Giai đoạn bắt cặp: 550C trong 40s  Giai đoạn kéo dài mạch: 680C trong 1 phút  Hỗn hợp cuối của phản ứng đƣợc duy trì ở: 680C trong 10 phút Sản phẩm tạo thành cĩ kích thƣớc 681 bp của MrNV và 500 bp của XSV. 3.3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI ACID NUCLEIC TRÊN GEL AGAROSE Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic trong dung dịch. Đĩ là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng, chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của acid nucleic phụ thuộc phần lớn vào hai chỉ tiêu: kích thƣớc của acid nucleic và nồng độ của chất cấu thành gel. Gel agarose thƣờng rất thơng dụng để phân tách một đoạn cĩ kích thƣớc khoảng 0.5 - 10 Kb. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhĩm phân tử cĩ kích thƣớc khác nhau. Để đọc kết quả điện di ngƣời ta bổ sung một lƣợng ethium bromide. Ethidium bromide cĩ khả năng gắn xen vào giữa các nucleotide của phân tử DNA. Do đĩ, các phân tử DNA sẽ gắn kết với ethium bromide và phát huỳnh quang khi kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vết huỳnh quang này ngƣời ta biết đƣợc vị trí các đoạn DNA trên gel. Trong kỹ thuật điện di DNA, ngƣời ta thƣờng sử dụng các thang chuẩn với mục đích so sánh và ƣớc lƣợng kích thƣớc các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn hợp gồm nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA). Dựa vào kích thƣớc đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử mục tiêu. Cách tiến hành:  Đổ gel: 25 Cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vừa đủ 100 ml TBE 1X vào, đun nĩng cho tan agarose. Để nguội khoảng 50 - 550C, cho vào 2 l ethidium bromide (10 mg/ml). Trong thời gian chờ nguội ta lắp lƣợc vào khay, đổ gel vào khay, đợi 15 - 30 phút cho gel đơng lại. Đổ TBE 1X vào bồn điện di cho ngập (cao hơn gel khoảng 5 mm). Khi gel đã khơ, rút lƣợc ra khỏi giếng, đặt gel vào bồn điện di.  Nạp mẫu: Cho vào eppendorf (0,2 ml) 10 l mẫu và 2 l dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue). Trộn đều, hút khoảng 10 - 12 l mẫu đặt vào giếng. Tƣơng tự đối với DNA chuẩn chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dịng điện 2 Ampe, trong thời gian 40 phút.  Phát hiện vạch DNA sản phẩm: Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA (sản phẩm của PCR và của thang chuẩn) đƣợc nhuộm bởi ethidium bromide sẽ tập trung tại nơi cĩ DNA, xen vào giữa hai sợi DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này đƣợc xem dƣới tia tử ngoại. Phức DNA - ethidium bromide hấp thụ tia tử ngoại ở 300 nm, cịn lại một ít năng lƣợng và phát ra ở dạng tia sáng nhìn thấy đƣợc 590 nm. Dƣới tia tử ngoại, các đoạn DNA (sản phẩm của PCR) hiện ra cĩ màu đỏ cam trên gel. 3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tơm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Trong thử nghiệm này chúng tơi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra. Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tơm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp từ Ấn Độ, 1 mẫu tơm khơng bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mơ học, và 1 mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H20 - DEPC). Các mẫu đƣợc tách chiết theo bộ Kit. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR 3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad). 26 Tách chiết RNA từ mẫu chứng dƣơng bằng hai phƣơng pháp Trizol và bộ Kit, chúng tơi thực hiện phản ứng RT - PCR cho cả hai virus MrNV, XSV. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi Theo qui trình của Widada, Sahul Hameed và cộng sự, nồng độ mồi sử dụng cho phản ứng là 20 mol. Tiến hành khảo sát với dãy nồng độ mồi cho cả hai virus nhƣ sau : 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Thử nghiệm đƣợc thực hiện trên mẫu chứng dƣơng. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi Theo qui trình gốc nhiệt độ lai của mồi là 550C. Tiến hành phản ứng với dãy nhiệt độ từ 54 - 580C cho cả hai virus theo bảng sau: Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi Thí Nghiệm 1 2 3 4 5 Tm (MrNV) 54 0 C 55 0 C 56 0 C 57 0 C 58 0 C Tm (XSV) 54 0 C 55 0 C 56 0 C 57 0 C 58 0 C Các thành phần trong mỗi phản ứng thí nghiệm là nhƣ nhau đối với RNA bản mẫu tách chiết từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp tại Ấn Độ. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. 3.4.3. Ứng dụng qui trình Single - Step RT - PCR khảo sát đƣợc kiểm tra một số mẫu tơm càng xanh thu thực địa. Áp dụng thử nghiệm qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau, số lƣợng mẫu đƣợc thử nghiệm theo bảng sau: Bảng 3.5: Các loại mẫu tơm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau Giai đoạn Số lƣợng (mẫu) Địa điểm thu Ấu trùng 30 Trại Thực Nghiệm TĐ Postlarvae 2 Trại Thực Nghiệm TĐ 27 Tơm mẹ 10 Trại Thực Nghiệm TĐ Tơm mẹ 8 ĐBSCL PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TƠM BỆNH ĐUƠI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai lồi virus MrNV, XSV trên mẫu tơm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tơm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mơ học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phịng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, khơng cĩ sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tơm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV. MrNV XSV 500 bp 681 bp 1 2 3 M 4 5 5 6 5 28 Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tơm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm bình thƣờng khơng nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Mẫu tơm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit cĩ 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm cĩ kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự. Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tơi thực hiện một mẫu tơm bình thƣờng. RNA của tơm khơng nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5) khơng thấy cĩ sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu. Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tơi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này cĩ đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này khơng cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tơi thực hiện khơng bị ngoại nhiễm. Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tơi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc. 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết Trong phản ứng RT - PCR cơng đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đĩ chúng tơi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để cĩ thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 29 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol. Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++ Trizol MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 + (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tơi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit cĩ độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol. Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp cĩ ƣu và nhƣợc điểm riêng: MrNV 1 2 3 M 4 5 6 7 XSV 8 9 10 M 11 12 13 14 A B C D 30  Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hố chất cĩ thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác khơng cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hố chất Trizol cĩ thể tự pha nên cĩ thể sai sĩt trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol khơng đúng cách, khơng đủ thể tích, cân khơng đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đĩ ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.  Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit địi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hố chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, khơng nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và khơng gãy vụn, khơng cĩ sử dụng phenol và chloroform nên khơng độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết khơng bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, cơng việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian. Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tơm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tơm thịt bị nhiễm bệnh luơn tồn tại hai virus MrNV và XSV. 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi Tiến hành pha lỗng mồi từ ống gốc cĩ nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, khơng cĩ sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha lỗng khác nhau với kết quả nhƣ sau: 31 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Ở Hình A, chúng tơi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm cĩ độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này cĩ hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà cĩ thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tơi chọn ở nồng độ 20 mol. Ở Hình B, nồng độ 20 mol cĩ vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn cĩ thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tơi chọn nồng độ 20 mol. 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tơi lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12 A B 32 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV. Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm. (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tơi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 550C cĩ độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 550C , nên chúng tơi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tơi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên. Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tơi nhận thấy khơng cĩ sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 540C -> 580C, ngồi nhiệt độ 550C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 560C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV cĩ sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 540C -> 580C, ngồi nhiệt độ Nhiệt độ 540C 550C 560C 570C 580C Tín hiệu sản phẩm (MrNV) ++ +++++ +++ ++ ++ Tín hiệu sản phẩm (XSV) ++ ++++ + + +++ 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 M 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 XSV MrNV A B Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 33 55 0C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 580C sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại. Từ những nhận xét đĩ, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 550C chỉ tăng 10C (550C - 560C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 560C so với các nhiệt độ cịn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 30C (550C - 580C) thì mới thấy ở 58 0C là sáng nhất so với các nhiệt độ cịn lại trừ nhiệt độ 550C. Điều đĩ cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 560C, ta thấy cĩ sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 560C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngồi trừ cặp nhiệt độ 55 0C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều khơng cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 550C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV. 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TƠM THU THỰC ĐỊA. Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tơi tiến hành khảo sát 50 mẫu tơm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL. Chúng tơi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tơm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tơm postlarvae nghi là bệnh trắng đuơi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5. 34 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tơm càng xanh. Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV. Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm mẹ nhiễm MrNV. Giếng 10: mẫu chứng dƣơng. Giếng 11: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tơm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đĩ cĩ 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3. MrNV XSV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A B 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 35 Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tơm càng xanh cịn lại. Các mẫu này khơng thấy cĩ biểu hiện của bệnh trắng đuơi. 4.6: Kết quả điện di mẫu tơm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu). Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng. Giếng 12: mẫu chứng âm (H20 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tơm mẹ mà chúng tơi thu khơng cĩ mẫu tơm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuơi, nên chƣa thể xác định cĩ sự lây bệnh từ tơm mẹ cho đàn ấu trùng hay khơng. Chúng tơi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tơm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tơm postlarvae, tơm mẹ cĩ đƣợc kết quả nhƣ sau: 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 MrNV XSV 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 36 Bản g 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR trên 50 mẫu tơm càng xanh (+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuơi Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu Kết quả MrNV XSV 1 -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ - - 31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tơm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - - 43 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tơm mẹ ĐBSCL + - 46 Tơm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tơm mẹ ĐBSCL - - 48 Tơm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tơm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tơm mẹ ĐBSCL ++ ++ 37 Tĩm lại trong 50 mẫu mà chúng tơi thực hiện cĩ 7 mẫu tơm nhiễm đồng thời MrNV, XSV và 1 mẫu tơm nhiễm MrNV (giếng 3, hình 4.5). Ở mẫu này ta thấy chỉ cĩ sự hiện diện MrNV khơng cĩ sự hiện diện của XSV. Ở đây chúng tơi đƣa ra hai lý do đƣợc cho là thích hợp để giải thích kết quả này, theo Widada và Bonami (2004), XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên sẽ phụ thuộc vào khả năng sao chép của MrNV rất nhiều, ở mẫu này ta thấy sản phẩm khuếch đại của MrNV là rất yếu chứng tỏ lƣợng RNA khơng đủ nhiều, điều này chứng tỏ sự hiện diện MrNV trong mẫu bệnh là khơng cao, trong khi XSV sử dụng RNA Polymerase của MrNV nên lƣợng RNA của XSV sẽ ít hơn lƣợng RNA của MrNV rất nhiều nên khơng đủ sản phẩm khuếch đại đủ để thấy trên bảng điện di. Hoặc do thao tác tách chiết khơng đƣợc tốt nên chỉ phát hiện MrNV trong mẫu bệnh. Tuy nhiên kết quả này chỉ giải thích cho một mẫu bệnh trong khi mối quan hệ của MrNV và XSV vẫn chƣa đƣợc biết nên cần phải cĩ nhiều mẫu bệnh mới khẳng định đƣợc hai lý do trên cĩ hợp lý hay khơng. 38 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Cả hai phƣơng pháp tách chiết bằng bộ Kit và Trizol đều cho kết quả tƣơng thích nhau. Phát hiện đƣợc sự hiện diện đồng thời MrNV, XSV nhiễm trên những mẫu tơm mẹ bệnh trắng đuơi thu tại ĐBSCL và một mẫu tơm postlarvae thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Thử nghiệm thành cơng kỹ thuật Single - Step RT - PCR của Widada, Sahul Hameed và cộng sự với điều kiện hố chất tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Cảnh Báo Mơi Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II:  Nồng độ Mg2+ là 1,5 mM.  Nồng độ mồi 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV.  Nhiệt độ lai 550C. Ngồi ra chúng tơi cĩ thử nhiệt độ lai tạo cDNA ở 460C và thử nồng độ Mg2+ là 2 mM. Thì thấy ở nồng độ Mg2+ 2 mM làm cho Taq - polymerase hoạt động mạnh tạo ra sản phẩm khơng chuyên biệt và sản phẩm chính khơng thấy rõ, cịn ở nhiệt độ lai tạo cDNA 46 0C thì thấy sản phẩm khơng đặc hiệu, do nhiệt độ lai khơng đúng làm cho các mồi bắt cặp với RNA khơng chuyên biệt. Do đĩ nhiệt độ lai tạo cDNA và nồng độ Mg 2+ là một những nhân tố quan trọng cần đƣợc khảo sát thêm nếu phản ứng chƣa đạt tối ƣu. Trong quá trình thực hiện phản ứng RT - PCR chúng tơi phát hiện tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tơm bệnh trắng đuơi là rất cao. Cĩ thể khẳng định cĩ sự hiện của hai virus gây bệnh trắng đuơi trên tơm càng đã xuất hiện tại Việt Nam. 5.2. Tồn tại Chƣa xác định đƣợc cĩ hay khơng sự lây nhiễm từ tơm mẹ bị bệnh trắng đuơi cho đàn ấu trùng. Chƣa phát hiện đƣợc sự hiện diện của hai virus MrNV và XSV trên giai đoạn ấu trùng của tơm càng xanh. 39 Số lƣợng mẫu bệnh ít nên chƣa thể khẳng định tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tơm bệnh trắng đuơi là cao hay khơng. 5.3. Đề xuất Trong phạm vi của đề tài, chúng tơi thu đƣợc một số kết quả nhất định và mở ra một số vấn đề nghiên cứu sâu hơn. Do đĩ chúng tơi cĩ một số đề nghị:  Phát triển kỹ thuật multiplex để phát hiện đồng thời hai virus MrNV và XSV.  Ở nhiệt độ 550C là nhiệt độ lai tối ƣu cho cả hai virus, điều này rất thuận lợi phát triển kỹ thuật multiplex. Tuy nhiên khi sử dụng cùng một nhiệt độ tối ƣu cho cả hai virus sẽ cĩ hiện tƣợng cạnh tranh mồi. Vì vậy tơi đề nghị cần khảo sát dãy nhiệt độ lai lớn hơn để tìm nhiệt độ lai tối ƣu riêng của từng virus, ở nhiệt độ lai tối ƣu của MrNV chỉ cĩ mồi của MrNV bắt cặp, ở nhiệt độ lai tối ƣu của XSV chỉ cĩ mồi của XSV bắt cặp. Sau đĩ đƣa thêm nhiệt độ lai tối ƣu của mồi MrNV là một chu kỳ, và nhiệt độ lai tối ƣu của mồi XSV là một chu kỳ. Mục đích của việc này là phát kỹ thuật multiplex và để tránh hiện tƣợng cạnh tranh giữa hai cặp mồi, nếu thành cơng thì so sánh giữa hai phƣơng pháp, phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ tối ƣu chung cho cả hai virus là 550C và phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ lai tối ƣu của từng mồi, để xác định phƣơng pháp nào tối ƣu nhất cho việc phát hiện đồng thời MrNV và XSV.  Cần phải cĩ cảm nhiễm trên tơm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau để xem sự hiện của virus xuất hiện nhiều ở giai đoạn nào.  Cảm nhiễm trên tơm mẹ, sau lấy chân bơi tơm mẹ để kiểm tra bằng qui trình Single - Step RT - PCR để xác định cĩ sự hiện diện của virus hay khơng, nếu tơm mẹ bị nhiễm, ta cho tơm mẹ đẻ ra đàn ấu trùng, sau đĩ kiểm tra đàn ấu trùng xem cĩ sự hiện diện của virus hay khơng.  Cần tách riêng hai virus MrNV và XSV, sau đĩ thực hai lơ thí nghiệm, một lơ cảm nhiễm MrNV và một lơ cảm nhiễm đồng thời cả hai virus MrNV và XSV, các thí nghiệm này đƣợc tiến hành trên tơm thịt. Việc tiến hành thí nghiệm này với mục đích xác định vai trị của XSV nhƣ thế nào trong bệnh trắng đuơi.  Cần cĩ bƣớc giải trình tự của hai virus MrNV và XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus ở Việt Nam cĩ sự đột biến hay giống hồn tồn với sản phẩm PCR từ mẫu đối chứng dƣơng từ Ấn Độ. 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục. 2. Trần Ngọc Hải và ctv, 2000. Hiện trạng triển vọng và giải pháp phát triển sản xuất giống tơm càng xanh ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Viện Hải Sản, Đại Học Cần Thơ. 3. Trần Thanh Phục, 2001. Cải tiến cơng nghệ sản xuất, hạ giá thành con giống tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. BCKH. 50 trang. 4. Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tơm càng xanh. NXB Nơng nghiệp. 67 trang. 5. Nguyễn Việt Thắng, 1993. Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng quy trình sản xuất giống tơm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man (1879) ở đồng bằng Nam Bộ. Luận án PTS khoa học Nơng Nghiệp.Trƣờng Đại Học Thủy Sản Nha Trang. 175 trang. 6. Nguyễn Việt Thắng, 1997. Đặc điểm sinh học và kỹ thuật sản xuất giống tơm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. BCKH. 7. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. ĐH Quốc gia TPHCM. Khoa Sinh Học - Trƣờng ĐHKHTN.144 trang. 8. Báo Cáo Hội Thảo, 1999. Phát triển nuơi tơm càng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ. An Giang, 5/1999. 9. Bộ Thủy Sản, 2004. Tuyển tập hội Thảo tồn quốc Về Nghiên Cứu Và ứng Dụng Khoa Học Cơng Nghệ Trong Nuơi Trồng Thủy Sản. NXB Nơng Nghiệp 41 TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI 10. Akiyama D.M ., Brock J.A. and Haley S.R ., 1982. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man. Veterinary Medicine, Small Clinician: 1119 – 1121 11. Anderson I.G., Nash. and M. Shariff.,1990. Mass larval mortalities in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii De Man, cultured in Malaysian modified static “green water” systems. Jounal of Fish Diseases 13: 127 – 134 12. Aquacop ., 1977. Macrobrachium rosenbergii De Man Culture Polynesia: progress in the developing a mass intensive larval rearing technique in clear water. Proceedings of the World Mariculture Society 8: 311 - 326. 13. Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R ., Mari J ., Bonami, J.R ., 1999. A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 38: 177 - 181. 14. Ban N ., Larson S. B. and McPherson A. (1995). Structural comparison of the plant satellite viruses. Virology 214: 571 - 583. 15. Bespalova I.N ., Adkins S. and Burmeidter M ., 1998. 3’- Race Skewed Ratio of specific to general PCR primers improves yield and specificity. Biotechniques 24: 375 - 577. 16. Bonami J.R ., Shi Z ., Qian D. and Widada J.S ., 2005. White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new of nodavirus. Journal of Fish Disease 28 (1): 23 – 32 17. Brock J.A ., 1983. Diseases (infectious and non-infectious), metazoan parasites, predators and public health considerations in Macrobrachium culture and fisheries. CRC Handbook of Mariculture. 42 18. Brock J.A ., 1988. Diseases and husbandry problems of cultured Macrobrachium rosenbergii. . Disease Diagnosis and Control in North American Marin Aquaculture (C.J Sidermann ., and D.U Lightner ). p .134 - 180. 19. Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S ., 1995. PCR primer: A laboratory manual. Molecular cloning. (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, New York. p. 133 - 142 20. Forhman ., 1995. Rapid amplification of cDNA ends. In PCR primer: A Laboratory manual. Molecular cloning (J Sambrookp. and D W. Russell). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.p.381- 409. 21. Johnson S.K ., 1982. Diseases of Macrobrachium. In:Giant Prawn Farming. Developments in Aquaculture and Fisheries Science (M.B New ),Vol.10. p.269 - 277. 22. Lee C.C. and Caskey C.T., 1990. cDNA cloning using degenerate primers. In PCR protocols: A guide to methods and applications ( M.A Innis . et al) . p. 46 - 53. Academic Press, SanDiego, California. 23. Lightner D.V ., 1993. Diseases of culture penaeid shrimp. Handbook of Marine culture, (J.P Mevei ), vol 1 , Crustacean Aquaculture. 24. Mori K.I ., Nakai T ., Muroga ., Arimoto M ., Musiake.K. and Furusawa. I ., 1992. Properties of a new virus belonging to Nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocarnx dentex) with nervous necrosis. Virology 187: 368 - 371. 25. Nash G ., S.Chinabut. and Limsuwan C., 1987. Idiopathic Muscle Necrosis in the fresh prawn, Macrobrachium rosenbergii de man, Cultured in Thailand.Jounal of Fish Diseases 10: 109 - 120. 26. Qian D ., Shi Z ., Zhang S ., Cao Z ., Liu W ., Li L ., Xie Y ., Cambournac I. and Bonami J. R ., 2003. Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii. Journal of Fish Disease 26:521 - 527. 27. Roegge M.A ., Rutle W.P. and Guest W.C ., 1979. Chemical control of Zoothamnium on larval Macrobrachium acanthurus. In: Proceedings of the Second 43 28. Biennial Crustacean Health Workshop (ed. D.H Lewis .and J.K Leong). p 295-299. TAMU - SG - 117, College Station, Texas. 29. Romestand B ., and Bonami J.R ., 2003. A sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (S - ELISA) for detection of MrNV in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man). Journal of fish Diseases 26: 71 - 75. 30. Sahul Hameed A.S ., 2003. Studies on white tail disease of Macrobrachium rosenbergii. In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin, 20 - 23 August 2003. 31. Sahul Hameed A.S .,Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R ., 2004. Experimental transmission and tissue tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 62: 191 - 196. 32. Salin K.R . and Nair C.M ., 2003. Emerging diseases of giant freshwater prawn in India - a potential threat to sustainability. In the In Freshwater Prawns 2003, International Symposium, Cochin , 20 - 23 August 2003. 33. Sahul Hameed A.S ., Yoganandhan K ., Widada J.S. and Bonami J.S ., 2004a. Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus - like (XSV) associated with white tail disease (WTD) of Macrobrachium rosenbergii in India by RT - PCR detection. Aquaculture 238: 127 - 133. 34. Schaefer B.C ., 1995. Revolution in Rapid amplification of cDNA ends: New strategies for polymerase chain reaction cloning of full-length ends. Anal, Biochem 227: 255 - 273. 35. Tonguthai Kamonporn., 1997. Diseases of Fresh Prawn, Macrobrachium rosenbergii. The AAHRI Newsletter Article, Vol.4, No.2, December 1997 Bangkok 10900, Thailand. 36. Tung C. W ., Wang C. S. and Chen S. N ., 1999. Histological and electron microscopy study on Macrobrachium. 37. Muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de Man), cultured in Taiwan. Journal of Fish Disease 22 : 1 - 5. 44 42. Tung C.W., Wang CS. and Chen S.N ., 1999. Histologiacal and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (de man), cultures in Taiwan. Jounal of Fish Diseases 22: 319 - 324. 43. Van Regenmortel M.H.V ., Fauquer C.M ., Bishop D.H.L ., Cartens E.B ., Estes M.K ., Lemon S.M ., Maniloff. J ., Mayo M.A ., McGeoch D.J ., Pringle C.R. and Wickner R.B ., 2000. Virus taxaonomy:Classifisstion and Nomenclature of Viruses. Seventh Report of International Committee on Taxonomy of Viruses. Academic Press, San Diego, CA. 44. Vijayan K.K ., Raj V.S ., Alavandi S.V ., Sekhar V.T ., Vaseeharan.B. and Santiago T.C ., 2003. Need of novel diagnotics in the health management of Macrobrachium rosenbergii, with special reference to an emerging epizootic in India, the white muscle syndrome (WMS). In Freshwater Prawns 2003. 45. Walker P.J ., 2003. Molecular characteristic of Yellow head Virus (YHV) and White Spot Syndrome Virus. CSIRO Tropical Agriculture, Private Bag 3, Indooroopilly, Qld 4068, Australia 46. Widada J.S ., Durand S ., Cambournac ., Qian D ., Shi Z ., Dejonghe E ., Richard V ., Bonami J.R ., 2003. Genome - based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot - blot, in situ hybridization and RT - PCR. Jounal of Fish Diseases 26 : 583 - 590. 47. Widada J.S ., Richard V ., Shi Z ., Qian D. and Bonami J.R ., 2004. Dot - lot hybridization and RT - PCR detection of extra small virus (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii. Disease of Aquatic Organism 58: 83 - 87. 48. Yoganandhan K ., Widada J.S ., Bonami J.R. and Sahul Hameed A.S ., 2005. Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one - step multiplex RT - PCR assay. Journal of Fish Disease 28: 65 - 69.