Khóa luận Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (immunohistochemistry) trong chẩn đoán bệnh đốm trắng (white spot disease – wsd) trên tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC ÁNH MAI Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO TRẦN NGỌC ÁNH MAI ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 - iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TPHCM và quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm qua. Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Vì vậy xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: - TS. Nguyễn Văn Hảo. - ThS. Ngô Xuân Tuyến. - BSTY Lê Thị Bích Thủy. - Các anh chị phòng Mô Học và phòng PCR thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II. - Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm và toàn thể nhân viên Trại Thực Nghiệm Nuôi Thuỷ Sản - Thủ Đức – TPHCM. Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên. Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của thầy cô và các bạn. iv TÓM TẮT Virus WSSV (White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam. Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X, 1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X. Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30 mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2 phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống, IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản, mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ chính xác. v ABSTRACT White spot syndrome virus (WSSV), member of a new virus family called Nimaviridae, is an invertebrate virus causing considerable mortality in penaeid shrimp. This study was undertaken to develop a stable, accurate and sensitive monoclonal antibody (mAb)-based immunohistochemistry (IHC) test process for detection of WSSV in Penaeus monodon in Vietnam laboratories. The standard operating protocol for IHC test using the WSSV VP28 mAb 8B7 on paraffin-embedded and frozen section was developed by Gent University. To be more suitable in Vietnam condition, this protocol was modified in some details. Four different concentrations of mAb (standard - 1X, 0.5X, 1.5X and 2X) and three different ones of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (1X, 1.5X and 2X) were tested on paraffin embedded sections from tissues of infected and uninfected black tiger shrimp Penaeus monodon and the standard concentration of mAb still proved to be efficient with the 1.5X concentration of DAB. To compare IHC method with Polymerase Chain Reaction (PCR) and traditional histology about accuracy, sensitivity and economic efficiency, 25 samples of post-larvae tissues and 30 samples of adult tissues of Penaeus monodon were tested with these three methods. Of the three, in some cases, IHC was considered to be the most reliable technique because of the specificity of the WSSV VP28 mAb 8B7. Unlike the traditional histology, IHC is not too dependent on the professionalism of the technicians to recognize the infected cells as the color signal (brown) is very clear and easily seen. Besides, IHC seldom gives false positive and negative signals because the manipulation is simple, the samples are not easily contaminated by various factors in process like PCR and the mAb is highly sensitive. For all of the advantages of IHC, we suggest using this method for WSSV diagnostics on Penaeids in research experiments in which accuracy is the prerequisite. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT ............................................................................................................. v MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................. 1 1.2. Nội dung.................................................................................................... 2 1.3. Mục đích ................................................................................................... 2 1.4. Yêu cầu ..................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 3 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú .................................................................. 3 2.1.1. Phân loại ........................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố .......................................................................................... 3 2.1.3. Vòng đời ....................................................................................... 3 2.1.4. Sinh trưởng .................................................................................... 4 2.1.5. Dinh dưỡng .................................................................................... 4 2.1.6. Môi trường sống ............................................................................ 5 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam ................... 5 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng .......................................... 6 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam ....................... 6 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng ............................................................ 9 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng .................................. 9 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi ........................................................... 10 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hoá ................................................................................. 11 2.2.2.4. Độc lực .............................................................................. 12 2.2.2.5. Hình thái ............................................................................ 12 2.2.2.6. Cấu trúc .............................................................................. 12 2.2.2.7. Vật chất di truyền .............................................................. 13 2.2.2.8. Đa dạng di truyền .............................................................. 15 2.2.2.9. Vật chủ ............................................................................... 16 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm ........................................................... 17 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan ............................................................. 18 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích ..................................................... 19 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh ............................................ 19 2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác ................. 20 2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) .......................... 21 2.4.1. Lịch sử phát triển ........................................................................... 21 vii 2.4.2. Nguyên lý ...................................................................................... 22 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) ..................................... 22 2.4.4. Kháng thể (antibody) ..................................................................... 23 2.4.5. Các phương pháp nhuộm .............................................................. 25 2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản .......................................................................... 28 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................................... 30 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 30 3.2. Vật liệu ...................................................................................................... 30 3.2.1. Mẫu xét nghiệm ............................................................................. 30 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC ...................................................................... 32 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 32 3.2.4. Hoá chất......................................................................................... 32 3.3. Phương pháp ............................................................................................. 33 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ........................................................................... 33 3.3.2. Quy trình thực hiện ...................................................................... 36 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 41 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC ................................. 41 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau .............................................................................................. 41 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác nhau .............................................................................................. 44 4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả ............................................................................................... 49 4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC ............................................................................ 49 4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC ............................................................................ 57 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 59 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 59 5.2. Đề nghị ...................................................................................................... 59 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 61 6.1. Tài liệu tiếng Việt ..................................................................................... 61 6.2. Tài liệu tiếng Anh ..................................................................................... 61 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 70 Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm. Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC. viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TPHCM : Thành phố Hồ Chí Minh. ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long. DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride. FAO : Food and Agriculture Organization. IHC : Immunohistochemistry. MBV : Monodon Baculovirus. mAb : monoclonal Antibody. PCR : Polymerase Chain Reaction. ppt : parts per thousand ppm : parts per million WSSV : White Spot Syndrome Virus. YHV : Yellow Head Virus. ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG NỘI DUNG TRANG Bảng 2.1. Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids ..............................................7 Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng ................................................................11 Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 ....................................................30 Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 ....................................................31 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 ..........................................................34 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 ..........................................................35 Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả ............................................................................40 Bảng 4.1. Kết quả thống kê chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm ..............................................41 Bảng 4.2. Kết quả thống kê chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm ............................................44 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb ..45 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm ....................................................................................................50 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC ..........51 Bảng 4.6. So sánh ưu khuyết điểm của 3 phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC .......................................................................................57 x DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH HÌNH NỘI DUNG TRANG Hình 2.1. Sơ đồ vòng đời tôm sú ..........................................................................4 Hình 2.2. Sản lượng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng ...........................8 Hình 2.3. Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới ..........................9 Hình 2.4. Virus đốm trắng ....................................................................................12 Hình 2.5. Protein của WSSV ................................................................................13 Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV ....................................................................14 Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV .........................................19 Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng ..........................................23 Hình 2.9. Các phương pháp nhuộm .....................................................................26 Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC ...................................36 Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu ...................................................................................37 Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D .......................................................................................43 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và đối chứng (không có mAb) trên mẫu 103 ............................................48 Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm Sau khi nhuộm IHC ..............................................................................54 Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và Mô học truyền thống ............................................................................55 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm ngày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận to lớn cho nền kinh tế quốc dân. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây, phong trào nuôi tôm phát triển rất nhanh, đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu, Trà Vinh, Bến Tre …, và tôm sú (Penaeus monodon) là một đối tượng nuôi chủ lực của ngành nuôi trồng thủy sản nước ta. Tuy nhiên, việc phát triển ồ ạt không định hướng, kỹ thuật quản lý ao chưa tốt, không quan tâm đúng mức đến vấn đề môi trường làm phát sinh nhiều yếu tố rủi ro, trong đó chủ yếu là bệnh tật. Trong nhiều năm gần đây, nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam phải đối đầu với dịch bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Disease – WSD) do virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây nên, một loại bệnh nguy hiểm do tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994), khả năng lây nhiễm rất cao, dễ thành dịch bệnh và cho đến hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng và trị hiệu quả. Mức thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra đã lên đến hàng trăm tỷ đồng. Vấn đề quan trọng là diễn biến bệnh xảy ra nhanh, khi người dân nhận biết được những biểu hiện bên ngoài của bệnh trên tôm thì chỉ một thời gian ngắn sau tôm sẽ chết hàng loạt mà không thể chữa được. Vì vậy, việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh ở đầu vào của qui trình nuôi, cũng như xác định sự hiện diện mầm bệnh WSSV trên tôm trong quá trình nuôi là hết sức cần thiết. Điều này sẽ giúp người dân kiểm soát được mối nguy đầu vào và kịp thời triển khai những biện pháp đối phó khi có mầm bệnh WSSV trên tôm đang nuôi. Cho đến nay đã có nhiều phương pháp xác định WSSV trên tôm sú và giáp xác đã được phát triển và ứng dụng như: Phương pháp mô học truyền thống, một số phương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch đặc hiệu (ELISA, Western blot), phương pháp kính hiển vi điện tử, các kỹ thuật PCR (one-step, two-step nested, realtime-PCR), in situ hybridization…Tuy nhiên việc tìm ra một phương pháp tối ưu vừa nhanh, vừa chính xác, đồng thời có độ tin cậy cao hơn luôn là mối quan tâm lớn của các nhà 2 nghiên cứu bệnh thủy sản. Việc kết hợp kết quả xét nghiệm của hai phương pháp IHC (Immunohistochemistry) và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trên cùng một mẫu tôm sẽ đáp ứng được mục tiêu trên. Trên cơ sở thiết thực này, được sự phân công của khoa Công Nghệ Sinh Học và được sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” 1.2. Nội dung 1.2.1. Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú. 1.2.2. So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và tính hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR. 1.3 Mục đích Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán ổn định, có độ nhạy và độ chính xác cao, thích hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam. So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác, tính hiệu quả và hiệu quả kinh tế với các phương pháp khác. 1.4 Yêu cầu Phương pháp phải đạt độ chính xác theo tiêu chuẩn ngành. Phải được xây dựng trên một cơ sở khoa học xác định. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 2.1.1. Phân loại Theo hệ thống phân loại của Hothuis (1980) và Barnes (1987) tôm sú thuộc Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Lớp phụ: Malacostraca Bộ: Decapoda (Mười chân) Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội) Họ: Penaeidae (Tôm he) Giống: Penaeus Loài: Penaeus monodon Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp 2.1.2. Phân bố Theo chiều ngang: Phân bố rộng rãi trên thế giới, ở vùng Ấn Độ Dương, Tây Thái Bình Dương, từ Pakistan tới Nhật, từ quần đảo Malaysia đến Úc, đặc biệt phân bố tập trung ở vùng Đông Nam Á như Việt Nam, Philipines, Indonesia và Malaysia (Trần Minh Anh, 1989). Theo chiều dọc: Ở giai đoạn ấu trùng và ấu niên Penaeus monodon sống nổi, dần thích nghi sống đáy. Ở vùng cửa sông, ấu niên và thiếu niên tôm sống ở tầng mặt trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 70 m (ngoài khơi Philippines), hay 30 – 39 m (vịnh Thái Lan) , ở nhiệt độ là 340 C và độ mặn là 35 ppt. 2.1.3. Vòng đời: Theo Vũ Thế Trụ (1995) Tôm mẹ họ Penaeidae đẻ trứng ngoài biển sâu. Trứng nở thành ấu trùng, trôi nổi theo dòng nước và được sóng biển đưa vào gần bờ, nơi có nước sông ngòi đổ ra tạo thành môi trường nước lợ với độ mặn 15 – 25 ppt. Ấu trùng trải qua nhiều giai 4 đoạn biến thái để thành post-larvae (Hình 2.1). Tổng thời gian từ khi nở đến post- larvae 1 (PL1) kéo dài khoảng 10 – 12 ngày. Tại môi trường nước lợ post-larvae sống khoảng vài tuần rồi bơi ngược ra biển, tiếp tục tăng trưởng và sinh đẻ, hoàn tất chu trình tăng trưởng của loài tôm. Hình 2.1: Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon 2.1.4. Sinh trƣởng Tôm gia tăng kích thước bằng cách lột bỏ lớp vỏ cũ của cơ thể. Solid (1988) cho biết tôm sú thường lột xác vào ban đêm. Thời gian để vỏ mới của tôm con cứng lại cần một vài giờ, ở tôm trưởng thành phải cần 1 đến 2 ngày (Viladolid và ctv, 1981). 2.1.5. Dinh dƣỡng Tôm sú ăn tạp (Hall, 1962). Giai đoạn ấu trùng tôm bắt mồi thụ động bằng các phụ bộ với các loại thức ăn phù hợp với cỡ miệng. Apud (1984) nhận định tôm sú ở giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với 2 giống tảo Silic thích hợp là Chaetoceros và Skeletonema. Ở giai đoạn Mysis tôm chuyển sang ăn một số loài động vật phù du, luân trùng và ấu trùng Nauplius của Artermia. Giai đoạn post-larvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bã hữu cơ. Hall (1962) cho biết tôm trưởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá, Biển Cửa sông Cửa sông Bờ biển Biển 5 côn trùng. Như vậy tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú khác nhau theo giai đoạn sinh trưởng. 2.1.6. Môi trƣờng sống  Nhiệt độ: Theo Vũ Thế Trụ (1995), nhiệt độ tối ưu cho tôm Penaeus spp. tại các ao hồ vùng nhiệt đới khoảng 28 – 300C. Trên 300C, tôm lớn nhanh nhưng dễ nhiễm bệnh, nhất là bệnh MBV (Monodon Baculovirus). Dưới 280C, tôm chậm lớn.  Độ mặn: Theo Valencia (1977) nhiệt độ và độ mặn tạo nên ảnh hưởng kết hợp. Các loài tôm có tỷ lệ sống cao ở nhiệt độ trung bình thấp và độ mặn trung bình cao nhưng sinh trưởng nhanh hơn ở điều kiện ngược lại.  Hàm lượng oxy hoà tan trong nước: Theo Chiu (1992) tôm sú chết khi hàm lượng oxy hoà tan nhỏ hơn 3,5 mg/l. Theo Chanratchakool và ctv (1995) thì khi hàm lượng oxy nhỏ hơn 4 mg/l tôm sử dụng thức ăn kém và dễ nhiễm bệnh.  Độ pH: Độ pH có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi, pH thấp có thể làm tổn thương các phần phụ, mang, quá trình lột xác và cứng vỏ của tôm (Bauman và Jamandro, 1990).  H2S và NH3-N: Theo Lê Xân (1996), H2S dạng tự do hình thành do sự phân huỷ của các vi khuẩn dị dưỡng trong điều kiện yếm khí. Kungvankji và Chua (1986) khẳng định H2S rất độc hại đối với các sinh vật sống đáy và các loài tôm có đặc tính vùi mình như tôm sú.  Độ kiềm: Độ kiềm tổng cộng trong nước liên quan đến những chất baz (chủ yếu là bicarbonate và carbonate), được tính bằng mg calcium carbonate tương đương trong 1 lit. Mặt nước có lượng kiềm tổng cộng 20 – 150 mg/l thì thích hợp cho sự phát triển của phiêu sinh và loài thủy sản trong đó (Vũ Thế Trụ, 1995). 2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Theo FAO (1995), sản lượng tôm khai 6 thác hằng năm trên thế giới là 2 triệu tấn, trong đó có 30% là tôm nuôi. 50% sản lượng tôm sú được cung cấp từ Châu Á (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998). Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nước mặn và nước lợ. Ông Nguyễn Việt Thắng, Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản cho biết nuôi trồng thuỷ sản đang có bước phát triển nhanh, đóng góp quan trọng cho sự tăng trưởng kinh tế chung của ngành thuỷ sản. Diện tích nuôi trồng thuỷ sản liên tục tăng: Từ 887.500 ha năm 2001 lên khoảng 995.400 ha năm 2004. Theo đó, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản tăng từ 879.000 tấn năm 2001 lên 1.420.000 tấn năm 2004, đạt mức tăng bình quân trên 20%/năm. Tỷ lệ giá trị xuất khẩu so với tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản không ngừng tăng, đến nay đạt khoảng 50%. Tỷ lệ sản lượng nuôi trồng trong tổng sản lượng thuỷ sản chiếm 39% năm 2001 đã tăng lên 48% năm 2004 (Kim Oanh, 2005). Nghề nuôi tôm ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), tuy đã xuất hiện từ lâu nhưng chỉ mới thực sự phát triển từ những năm cuối thập niên 80. Hằng năm, ĐBSCL đóng góp trên 80% sản lượng thủy sản chung của toàn ngành. Tại đây, diện tích nuôi quảng canh chiếm 88%, nuôi bán thâm canh và thâm canh không đáng kể (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998). Theo Nguyễn Thanh Phương (2002), hiện nay ở ĐBSCL đã phát triển và ứng dụng các mô hình nuôi tôm chủ yếu sau: Quảng canh (Extensive culture), quảng canh cải tiến (Improved extensive culture), bán thâm canh (Semi-intensive culture), thâm canh (Intensive culture) và nuôi sinh thái. 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam A. Trên thế giới Việc phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm sú trên thế giới là nguyên nhân dẫn đến sự suy thoái môi trường và dịch bệnh xảy ra khắp nơi (từ Đông Bán Cầu sang Tây Bán Cầu) gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng. Trong đó các bệnh do virus gây ra đang là một thách thức lớn cho sự phát triển nghề nuôi tôm toàn cầu. Các bệnh truyền nhiễm do nhóm virus WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) và 7 MBV là những bệnh điển hình về mức độ gây thiệt hại nghiêm trọng nhưng cho đến nay vẫn chưa có một loại thuốc hay vaccin nào điều trị hiệu quả. Bảng 2.1. Các bệnh thƣờng gặp trên tôm penaeids (Lightner và Redman, 1998). Mầm bệnh virus Vi khuẩn Nấm Kí sinh trùng Loại khác WSSV YHV BMN MBV IHHNV HPV REO TSV Vibriosis: -Septic HP necrosis -Hatchery vibriosis -Luminescent vibrio -‘Syndrome Gaviota’ -Shell disease NHP bacterium Rickettsia Larval mycosis Fusariosis Epicommensals: -Leucothrix mucor -Peritrich protozoans Gregarines Microsporidian Mất cân bằng dinh dưỡng. Bệnh do độc tố Bệnh do môi trường One month death syndrome Zoea II syndrome Do ảnh hưởng của dịch bệnh năng suất tôm toàn cầu trong năm 1993 chỉ đạt 639.000 tấn, giảm 12% so với năng suất của năm 1992 (Lavilla – Pitogo,1996). Trong năm 1994, tổng thiệt hại gây ra do WSD (White Spot Disease) và YHD (Yellow Head Disease) khoảng 1 tỷ USD đối với các nước có nghề nuôi tôm đang phát triển như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia, Bangladesh, Malaysia, Đài Loan, Việt Nam và Nhật (World Shrimp Farming, 1998). Dịch bệnh do WSSV gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia như: Ấn Độ (1994 – 1995) làm cho nhiều trang trại nuôi lớn phải đóng cửa (Murthy , 1997), Thái Lan (1996 – 1997) với thiệt hại ước tính lên đến 1 tỷ USD, Trung Quốc (1993) làm sản lượng xuất khẩu tôm từ 115.000 tấn năm 1992 giảm xuống còn 50.000 tấn năm 1993 (Flegel, 2000). Trong 10 năm trở lại đây, WSSV đã khiến ngành công nghiệp nuôi tôm tiêu tốn 20 – 30 tỉ USD (Caleb, 2004). 8 Hình 2.2. Sản lƣợng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng (Caleb, 2004). B. Việt Nam: Ở Việt Nam, tình hình cũng diễn ra tương tự. Cuối năm 1993, tôm nuôi đã chết hàng loạt ở các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau và Bạc Liêu. Hiện tượng này tiếp tục xuất hiện trong hai năm 1994 – 1995 và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994). Gần đây, bệnh đốm trắng đã khiến cho nhiều gia đình nuôi tôm mất trắng, gây thiệt hại hàng trăm tỉ đồng. Dịch bệnh nổ ra ở các tỉnh trên khắp đất nước nhất là tại các tỉnh nuôi tôm trọng điểm như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Tiền Giang … Tại ĐBSCL năm 1999 diện tích là 173.510 ha và sản lượng nuôi là 49.624 tấn, đến năm 2001 diện tích tăng lên thành 404.911 ha và sản lượng đạt 143.822 tấn. Tuy nhiên, đến vụ một năm 2002 mức lây nhiễm bệnh là 30 - 60% trên tổng diện tích thả nuôi, mà bệnh đốm trắng do virus đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây tổn thất lớn. Trong 1 – 2 năm trở lại đây nghề nuôi tôm đã phát triển tới miền Bắc và trên những vùng nuôi tôm mới này bệnh đốm trắng vẫn xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng. Năm Sản lượng (tấn) 9 2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng Hình 2.3: Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới (CSIRO, 2002). Kể từ khi xuất hiện đầu tiên vào năm 1992-1993 tại Đông Bắc Châu Á, bệnh đốm trắng đã lan nhanh, rộng khắp khu vực Châu Á và khu vực Châu Á-Thái Bình Dương, nhất là các nước có nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh được phát hiện trước tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc (1993), sau đó là Nhật Bản (1993), Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên (Wang và ctv, 1998). Bệnh xuất hiện bất thường và được xem như là một hiện tượng của năm 1991 và đầu năm 1992 tại một điểm riêng lẻ ở đông bắc Đài Loan. Bệnh được phát hiện đầu tiên trên Marsupenaeus japonicus nhưng sau đó lan rộng đến Penaeus monodon và Fenneropenaeus penicillatus (Walker, 2000). Chưa phát hiện Đã phát hiện Chưa có số liệu 10 Tháng 3/1992, WSSV lần đầu tiên được phát hiện tại Trung Quốc. Có giả thuyết rằng virus được du nhập vào Trung Quốc từ Đài Loan thông qua nhập khẩu nauplius và post-larvae. Trong 5 tháng sau đó bệnh nhanh chóng lan rộng ở nhiều tỉnh dọc theo bờ biển Trung Quốc (Walker, 2000). Tháng 3 năm 1993, WSSV xuất hiện trên tôm nuôi P. japonicus ở Nhật. Ngay đầu tiên, bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với tất cả các trang trại ở Hiroshima, Yamagushi, Ohita, Kumamoto, Kagoshima và Okinawa (Walker, 2000). Năm 1993, WSSV cũng được phát hiện trên loài P. orientalis ở vùng biển phía Nam và Tây Triều Tiên (Walker, 2000). Vùng Tây bán cầu: Năm 1995, báo cáo đầu tiên về WSSV xảy ra trên ao nuôi tôm Litopenaeus setiferus ở Texas, Hoa Kỳ. Các quốc gia sau đó phát hiện đốm trắng lần lượt là Guatamela, Elsalvador, Panama, Ecuador và Columbia năm 1999, Nicaragua và Mexico năm 2000 (Walker , 2000). 2.2.2.2. Phân loại và tên gọi A. Phân loại WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ Baculoviridae (Francki và ctv, 1991). Tuy nhiên những phân tích trình tự gần đây của hệ gen WSSV cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của Baculovirus như protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv, 2000b), protein VP26, VP28 (van Hulten và ctv, 2000c) của WSSV không giống bất kì một protein đã biết nào trong database. Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000a). Gần đây nhất, M.A.Mayo (2002) công bố phân loại mới nhất được thẩm định trong Hội nghị Quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of Virus - ICTV), trong đó xếp WSSV là bộ phận của chi Whispovirus trong họ virus mới gọi là Nimaviridae. 11 B. Tên gọi: Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng Tên Vị trí Tài liệu tham khảo Penaeid Hemacytic Rod Shaped Virus (PHRV) Owens và ctv, 1993 China Baculovirus (CBV) Trung Quốc Chamberlain, 1994 Hypodermal and hematopoietic necrosis baculovirus (HHNBV) Trung Quốc Huang và ctv, 1994 Rod-shaped Virus of Penaeus japonicus (RV- PJ) Nhật Inouye và ctv, 1994 Penaeus chinesis Baculovirus (PCBV) Trung Quốc Zhan và ctv, 1995 Penaeus monodon non-occluded Baculovirus II (PmNOII) Thái Lan Woongteerasupaya và ctv, 1995 Penaeus monodon non-occluded Baculovirus III (PmNOIII) Đài Loan Wang, 1995 Systemic ectodermal and mesodermal baculovirus (SEMBV) Thái Lan Woongteerasupaya và ctv, 1995 China Baculo-like virus (CBV) Trung Quốc Tapay và ctv, 1996 Penaeid Rod-shaped DNA virus (PRDV) Nhật Inouye và ctv, 1996 White Spot Baculovirus (WSBV) Đài Loan Chang và ctv, 1996 Yellow head disease-like virus Đài Loan Wang và ctv, 1996a Prawn White Spot Baculovirus (PWSBV) Trung Quốc Yang và ctv, 1997 White Spot Syndrome Baculovirus (WSSB) Thái Lan Durand và ctv, 1997 White Spot Syndrome Virus (WSSV) Đài Loan Lo và Kou, 1998 2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hóa Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu đựng yếu với các yếu tố môi trường. Theo Chang và ctv (1998):  Sau 48 –72 giờ sau khi tiếp xúc môi trường nước mà không tìm được vật chủ thì WSSV sẽ bị phân hủy.  Virus mất khả năng gây nhiễm sau 60 phút dưới tia UV (Ultraviolet) 9 x 105 µWs/cm2.  Trong khoảng nhiệt độ 55 – 750C trong 5 – 90 phút, virus mất khả năng gây nhiễm.  Ozone ở nồng độ 0,5 µg/ml sẽ làm bất hoạt WSSV ở 250C. 12 2.2.2.4. Độc lực Thí nghiệm gây nhiễm mầm bệnh đốm trắng trên giáp xác gồm: 5 loài tôm biển (trong đó có tôm sú), 2 loài tôm nước ngọt (có tôm càng xanh), 4 loài cua và 3 loài tôm hùm, bằng cách cho tiêm hoặc cho ăn WSSV được tách chiết từ tôm sú (P.monodon) nhiễm bệnh cho thấy tất cả các loài đều bị nhiễm đốm trắng với nhiều mức độ gây chết khác nhau. Tôm càng xanh sau khi tiêm 20 ngày tỷ lệ chết 20%, nếu cho ăn tỷ lệ này là 10%. Không có dấu hiệu lâm sàng hoặc chỉ nhìn thấy những chấm nhỏ dưới kính hiển vi. Tôm sú bị nhiễm trong thí nghiệm có cùng triệu chứng lâm sàng như tôm tự nhiên bị nhiễm (Rajendran và ctv, 1999). Tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thường chết hàng loạt, bệnh này có khả năng gây thành dịch trong vòng 2-7 ngày với tỷ lệ chết từ 20-70%. Nếu thu hoạch chậm tỷ lệ chết sẽ lên đến 70 -100% trong vòng 3-7 ngày kể từ khi có dấu hiệu phát bệnh mạnh (Wang và ctv, 1998). Bệnh này có tốc độ lây lan rất nhanh và nhiễm trên mọi giai đoạn trong vòng đời của tôm sú đặc biệt nhạy cảm từ sau 1-2 tháng nuôi (Lightner, 1996) 2.2.2.5. Hình thái Virion có dạng hình que đến elip hay hình trứng, một đầu bẹt (Vlak và ctv, 2002). Virion có kích thước lớn (80-120 x 250 – 380nm). Virion tinh sạch từ tôm sau khi nhuộm cho thấy có một phần phụ giống như đuôi. (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Wang, 1995). Hình 2.4. Virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002) (A) Ảnh hiển vi điện tử của hạt virus WSSV. (B) Ảnh hiển vi điện tử của nucleocapsid. 2.2.2.6. Cấu trúc Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: Bao màng (envelope), nucleocapsid và vật chất di truyền. 13 Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 (trọng lượng phân tử là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa). VP28 và VP19 kết hợp với phần envelope, còn VP26, VP24, VP15 gắn với nucleocapsid của virion (van Hulten, 2002). VP24 – có 41 aminoacid tận cùng bằng đầu N – đã được phân tích sinh hóa và xác định gen mã hóa (vp24) trên genome. Phân tích cho thấy VP24, VP26, VP28 rất giống nhau ở mức aminoacid và nucleotide (van Hulten, 2000a). Trong một phát hiện mới nhất, các nhà khoa học đã công bố một protein cấu trúc khổng lồ của WSSV, protein VP664, có chức năng chưa rõ, có thể là tham gia vào quá trình lắp ráp virion. Nhiều kháng huyết thanh đa dòng kháng protein này được tạo ra và một trong số đó đã được ứng dụng thành công trong phân tích immunoelectron microscopy để định vị protein này trên virion (Leu và ctv, 2005). Hình 2.5. Protein của WSSV (Vlak và ctv, 2002). (A) Điện di protein của WSSV đã được tinh sạch 1: Marker; 2: protein tinh sạch từ tôm sông (P. clarkii) không nhiễm WSSV; 3: WSSV đã tinh sạch; 4: Nucleocapsid của WSSV (B) Mô hình cấu trúc đơn giản của virion WSSV 2.2.2.7. Vật chất di truyền WSSV là virus trên động vật không xương sống biển đầu tiên được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thước thay đổi tùy theo các mẫu phân lập khác nhau: 305107 bp (GenBank Accession No. AF332093), 292967 bp (GenBank Accession No. AF369029) và 307287 bp (GenBank Accession No. AF440570) tuần tự ứng với virus phân lập từ Trung Quốc, Thái Lan và Taipei China. 14 Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV.(Yang và ctv, 2001) Hình mũi tên (vòng ngoài): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ hướng dịch mã khác nhau). Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs. B: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI (vòng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí) Genome virus chứa 184 khung đọc mở (open reading frame – ORFs) (van Hulten và ctv, 2001). Theo Yang và ctv (2001), genome WSSV có 9 vùng đồng dạng chứa 47 tiểu phần lặp lại, gồm lặp trực tiếp (direct repeat), lặp đảo ngược không điển hình (atypical inverted repeat), và những trình tự thuận nghịch không hoàn chỉnh. Tuy WSSV tương tự như Baculovirus về hình thái nhưng hai loại virus này lại không liên hệ đáng kể ở mức amino acid. Vài gen của WSSV lại giống với gen của eukaryote hơn là với gen virus. Phân tích trình tự cho thấy WSSV khác với tất cả những virus đã biết trước đây dù có một số gen tương đồng yếu với gen herpesvirus. Hầu hết các ORFs mã hoá protein không tương đồng với bất cứ protein đã biết nào, cho thấy WSSV đại diện cho một lớp virus mới hay một khoảng tiến hoá quan trọng giữa virus biển và virus mặt đất. Điểm đặc biệt nhất của WSSV là sự hiện diện của một gen mã hoá colagen 15 nguyên vẹn, vốn là gen mã hoá một protein matrix ngoại bào của tế bào động vật chưa bao giờ thấy trong bất cứ virus nào. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện genome của WSSV có một ORF khổng lồ chứa 18.234 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 6.077 aminoacid với chức năng chưa biết. Polypeptide này được gọi là protein VP664 và thuộc nhóm protein cấu trúc của virus (Leu và ctv, 2005). 2.2.2.8. Đa dạng di truyền Theo Marks và ctv (2003) cho đến nay virus WSSV phân lập từ tôm penaeids ở các vùng địa lý khác nhau thì rất giống nhau về hình thái và proteome, chỉ khác nhau một chút trong sự đa hình về độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) chủ yếu do có nhiều đoạn chèn nhỏ (insertions) và một đoạn loại bỏ (deletion) lớn (khoảng 12 kbp) (Chen và ctv, 2002). Mark và ctv (2003) đã xác định được trên bản đồ di truyền những khác biệt giữa ba dòng WSSV: Dòng Thái Lan (WSSV – TH), dòng Trung Quốc (WSSV – CN) và dòng Đài Loan (WSSV – TW). Các dòng virus này có nucleotide tổng số giống nhau đến 99,32%. Sự khác biệt chủ yếu là trên cùng một vùng gen tương ứng của 3 dòng có sự loại bỏ khoảng 13 kb ở dòng WSSV – TH, 1 kb ở dòng WSSV – CN và không có gì thay đổi ở dòng WSSV – TW. Sự khác biệt thứ hai liên quan đến một vùng biến đổi di truyền khoảng 750 bp. Tất cả những sai biệt khác > 2 bp giữa 3 dòng đều nằm ở những vùng lặp lại dọc theo genome, chủ yếu ở những ORFs (trừ vùng đồng dạng hr1, hr3, hr8 và hr9). Theo Dieu và ctv (2004), sự khác biệt nói trên đã đưa đến một giả thuyết là đã có một sự phân nhánh virus từ một dòng tổ tiên bắt nguồn từ eo biển Đài Loan đến Thái Lan nhưng cần tiến hành thêm nhiều phân tích khác biệt giữa nhiều dòng ở các vùng địa lý khác nữa mới khẳng định được giả thuyết. Các nhà khoa học này đã phân tích RFLP tám dòng WSSV Việt Nam (VN), trong đó có 6 dòng thu từ bờ biển miền Trung và 2 dòng từ bờ biển miền Nam và cho thấy sự khác biệt trình tự ở các vị trí biến đổi đã được đề cập. Những vị trí này được phân tích chi tiết bằng PCR, tạo dòng và đọc trình tự. Tương ứng với dòng WSSV-TW, tất cả những dòng từ miền Trung đều mất 85 kb ở vùng biến đổi chính ORF23/24, trong khi đó những dòng từ miền Nam thì lại mất 115 hay 122 kb tương tự như sự loại bỏ 12 hay 132 kb ở WSSV-CN 16 và WSSV-TH. Ở vùng biến đổi phụ ORF14/15, so với dòng WSSV-TH, tất cả các dòng Việt Nam đều mất đoạn với kích thước khác nhau. Dữ liệu cho thấy các dòng VN và dòng WSSV-TH có cùng nguồn gốc từ WSSV-TW và WSSV-CN, và WSSV đã xâm nhập vào Việt Nam theo nhiều đường khác nhau. 2.2.2.9. Vật chủ Cho đến nay đã tìm thấy sự hiện diện mầm bệnh đốm trắng (WSSV) trên:  Tôm he :15 loài  Các loài tôm khác :7 loài  Cua :12 loài  Tôm hùm :9 loài  Copepoda Vật chủ chính: P.monodon; P.japonicus; P.penicillatus; P.chinensis Đã có nhiều báo cáo về nhóm vật chủ của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV.  WSSV gây nhiễm trên các loài tôm He ở Châu Á như: Penaeus monodon, P. japonicus, P. merguiensis, P. chinensis, P.semiculatus, P. indicus, P. penicillatus, Trachypenaeus cuvirostris, Metapenaeus ensis (Lightner, 1996, 1997).  WSSV hiện diện trên một số bộ phận cơ thể của một số loài cua : Charypdis feriatus, C. natator, Portunus pelagicus, P. sanguilonentus (Kou và ctv, 1998), Scylla serrata (Chen và ctv, 2000).  Qua sử dụng kỹ thuật PCR đã phát hiện có sự hiện diện của WSBV trên các loài tôm: P. monodon ; P. japonicus; P. penicillatus; P. semiculatus; và Metapenaeusensis ( Lo và ctv, 1996).  Một thí nghiệm về tính mẫn cảm đối với WSBV trên một số loài tôm và giáp xác khác của Rajendra và ctv (1999) đã kết luận, 5 loài tôm biển ở vùng Đông Nam Ấn Độ: Penaeus monodon, P. japonicus, P. merguiensis, P. semiculatus, P. indicus, Metapenaeus monoceros, M. 17 dobsoni; hai loài tôm nước ngọt: Macrobranchium rosenbergii và M. idella; 4 loài cua: Sylla serrata, S. tranquebarica, Metapograpus sp., Sesarma sp.; 3 loài tôm hùm: Panulirus homarus, P.ornatus, P. polyphagus đều bị nhiễm WSBV sau khi cho tiêm hoặc cho ăn dịch tôm hoặc tôm bị nhiễm đốm trắng. 2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm Cơ quan đích của WSSV: WSSV xuất hiện ở hầu hết các mô hoặc cơ quan có nguồn gốc ngoại bì hoặc trung bì như biểu mô thành dạ dày, biểu mô dưới lớp vỏ cutin, mô liên kết, mang, buồng trứng, lõi dây thần kinh bụng, mô tạo máu, cơ quan lymphoid, các tế bào máu, tim (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Lightner, 1996; Wang và ctv, 1999). Tuy chưa có báo cáo về đường xâm nhập của WSSV vào tế bào nhưng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trưởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân. Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (có thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống như màng. Sau đó có thể quan sát thấy những ống dài và rỗng. Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Durand và ctv, 1997; Wang và ctv, 2000). Có hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV. Theo một số tác giả (Durand và ctv, 1997), trước khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã được bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở. Protein nhân (nucleopotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này. Khi phần lõi hoàn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuôi của virion trưởng thành. Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hoàn chỉnh được lắp ráp đầu tiên, sau đó mới được bao lại (Wang và ctv, 2000). Sau khi lắp ráp, virion trưởng thành có thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân. Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chưa được biết rõ nhưng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thoát ra ngoài, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trường ngoài. Tôm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nước sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2001). 18 2.2.2.11. Cơ chế truyền lan Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh được truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ môi trường ngoài) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh. Mầm bệnh WSSV có thể truyền lan theo hai trục:  Trục ngang: là con đường chủ yếu. Từ nguồn nước, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tôm khỏe ăn tôm chết do bị bệnh đốm trắng trong ao, đây là con đường lây lan rất nhanh gây chết tôm hàng loạt (Tookwinas, 1998). Một số loài tôm hoang dã và giáp xác khác được xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuôi khi chúng xâm nhập vào thông qua con đường thay nước (Limsuwan và ctv,1997). Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mô học cho thấy cua, tôm nước ngọt, tôm hùm có thể đóng vai trò như là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh không triệu chứng (asymtomatic). Tôm hùm đóng vai trò chính như là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nó có thể bị nhiễm từ phân chim, nước thải ra biển và có thể mang WSSV trong thời gian dài mà không bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tôm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999). Ngoài ra còn có những tác nhân khác như các loài vật ăn thịt như cá, chim, chó, mèo sẽ đưa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con người qua thao tác trong quá trình nuôi. Sử dụng phương pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tôm sú là đường xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996) .  Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên khả năng truyền theo trục dọc vẫn chưa được chứng minh mặc dù SEMBV đã được phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998). 19 2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích Tôm bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Takahashi và ctv, 1994; Wang và ctv, 1998). Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 – 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp và đốt bụng thứ V, VI. Những đốm này chính là sự tích tụ calcite (Wang và ctv, 1996b), sự tạo thành chúng cần các tế bào biểu bì cutin bị nhiễm virus nặng (Chang và ctv, 1998) và sự bao bọc các sợi trong tế bào chất và các kênh trong biểu bì (Wang và ctv, 1999). Đốm trắng thường xuất hiện cùng với sự đổi màu thành tái hay đỏ hồng (Nakano và ctv, 1994). Tuy nhiên, những biểu hiện như xuất hiện đốm trắng và đổi màu cũng có thể xảy ra do điều kiện môi trường hay bệnh vi khuẩn (Charatchakool và ctv, 1995). Gan tụy trương, có màu trắng hoặc hơi vàng. Tôm bệnh có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm do tích tụ hạt virus (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung). Tỉ lệ tôm chết lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994). Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV. (Vlak., 2002) (A) Tôm bị nhiễm WSSV. (B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông. 2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh : Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm nên phòng là chủ yếu. Biện pháp phòng trừ tổng hợp được dùng rộng rãi trên thế giới.  Lựa chọn post-larvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (mô học, PCR, sốc formalin). 20  Chẩn đoán chính xác, kịp thời, lập chương trình kiểm soát dịch bệnh đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với WSSV.  Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh: + Sử dụng biện pháp thay nước có kiểm soát + Mỗi trại phải có hệ thống xử lý nước riêng, nước phải được khử trùng trước khi vào ao nuôi. + Chất lượng nước được duy trì ở điều kiện ổn định. + Giảm các tác nhân gây stress trong ao nuôi: pH, DO, nhiệt độ, độ mặn, amonia và sản phẩm thải, dư thừa trong ao. + Sử dụng một cách chọn lọc các chế phẩm vi sinh (probiotic) để tăng cường sức đề kháng của tôm đối với WSSV. + Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng bằng vitamin. + Phòng ngừa bệnh lây lan từ trại này sang trại khác. + Loại trừ tôm, cua, ruốc xâm nhập vào ao nuôi (lưới lọc, lưới ngăn bờ ao). + Có ao trữ nước chiếm 20 - 30% ao nuôi, nước được trữ lắng 7 ngày trước khi dùng + Ngăn ngừa và kiểm soát sự lan truyền của bệnh trong cộng đồng. 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác Theo Hőstein (2000), mục tiêu chính trong việc phát hiện virus WSSV là nhằm khẳng định có xảy ra bệnh hay không và kiểm tra xem tôm bố mẹ và con giống có mang mầm bệnh hay không.  Để chẩn đoán có hay không có bệnh trong ao phải tiến hành phân tích mô học bằng cách nhuộm mô tôm bằng Hematoxylin và Eosin, sau đó xem dưới kính hiển vi (Hőstein, 2000). Nếu tôm bệnh sẽ quan sát được các thể vùi trong nhân bị trương to của các tế bào biểu mô cutin và tế bào mô liên kết (Lightner, 1996). 21  Để khẳng định chẩn đoán và xác định tình trạng nhiễm WSSV của nguồn tôm bố mẹ và con giống nên dùng kĩ thuật PCR (Hőstein, 2000). Các kỹ thuật PCR đã được phát triển gồm 1-step, 2-step PCR (Lo và ctv, 1996), one-tube nested PCR (Lo và ctv, 1998). Ngoài ra cũng có thể chẩn đoán bằng:  Transmission eletron microscopy (TEM). Mặc dù WSSV có thể phát hiện được bằng phương pháp này nhưng kĩ thuật này chủ yếu dùng trong chẩn đoán khẳng định (Lightner, 1996)  In situ DNA hybridisation (cho phép xác định WSSV khi không có những dấu hiệu mô bệnh học – Chang và ctv, 1996): Xử lý và cố định mô theo phương pháp mô học truyền thống, lai và phát hiện virus WSSV bằng probe có đánh dấu, quan sát dưới kính hiển vi.  Western blot analysis (Nadala và ctv, 1997).  Dot blot (Nadala and Loh, 2000). Ngoài những phương pháp xác định WSSV dựa trên vật liệu di truyền, các xét nghiệm dựa trên miễn dịch cũng được sử dụng, một trong số đó là phương pháp hóa mô miễn dịch. Từ khi kháng thể đơn dòng nhận diện epitope trên vỏ virus hay trên capsid được sản xuất thành công và xuất hiện test kit hóa mô miễn dịch thương phẩm sử dụng kháng thể đơn dòng, kĩ thuật này càng phát huy được thế mạnh của nó về độ chính xác, độ nhạy và hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm. Trong khoá luận này, dựa vào những điều kiện sẵn có, chúng tôi tiến hành ứng dụng hoá mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú 2.4. Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemmistry) 2.4.1. Lịch sử phát triển Coons và cộng sự (1941) là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô. Kĩ thuật hoá mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammons, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) và 22 có thể sử dụng để phát hiện phản ứng hoá mô miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography). Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC world, 2005). 2.4.2. Nguyên lý Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu. Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất. 2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại). Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein. Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987). Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lượng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987). 23 2.4.4. Kháng thể (antibody) Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch. Có hai loại kháng thể (Hình 2.8) A B Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002). A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên  Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi những tế bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên 24  Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một dòng tế bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu. Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh. Phương pháp tạo ra kháng thể này như sau:  Một phần của gen VP28 (VP28F118) được clone vào vector  Chuyển vector vào E. Coli, mục đích là tạo ra một protein (rVP28F118) thiếu vùng liên màng tận cùng bằng đầu N.  Protein VP28F118 được tinh sạch bằng SDS-FAGE và dùng để gây miễn dịch trên chuột Swiss thu kháng huyết thanh.  Chọn một dòng tế bào plasma từ kháng huyết thanh thu được cho lai với tế bào u tuỷ bằng phương pháp cell fusion. Tế bào lai (hybridoma) tạo thành được dòng hoá. Thu kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 từ dòng tế bào lai này. Trong bài khóa luận chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 trong phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện mầm bệnh virus WSSV trên tôm sú Penaeus monodon. Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể  Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ và nhiệt độ. Nếu không có những thông tin từ nhà cung cấp kháng thể ta phải chuẩn độ để xác định nồng độ thích hợp nhất cho các chất tham gia phản ứng hóa mô miễn dịch. Kháng thể được pha loãng ở nồng độ thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm. Người ta thường xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố 25 định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm. Kháng thể đơn dòng có khoảng pI và cấu tạo phân tử giới hạn hơn kháng thể đa dòng nên chúng nhạy cảm hơn với pH và ion trong dung dịch đệm. Vì vậy để ước lượng kháng thể đơn dòng cần chuẩn độ ở pH 6,0 và 8,6 và không có NaCl. Độ pha loãng cao nhất và pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch và ctv, 2002).  Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn. Tuy nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp trước khi xác định độ pha loãng tối ưu. Nồng độ kháng thể đặc hiệu càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch và ctv, 2002).  Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên – kháng thể đạt được nhanh ở 370C. Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể. Tuy nhiên không thể biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền. Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam chúng tôi chọn thử nghiệm một chỉ tiêu quan trọng quyết định kết quả nhuộm là độ pha loãng kháng thể và 1 yếu tố phụ là nồng độ DAB. 2.4.5. Các phƣơng pháp nhuộm Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). 26 Hình 2.9. Các phƣơng pháp nhuộm A: Phương pháp trực tiếp (direct method). B: Phương pháp gián tiếp hai bước (two-step indirect method). C: Phương pháp gián tiếp ba bước (three-step indirect method). D: Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan (APAAP) E: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (ABC). F: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (LAB hay LSAB). A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Vì phương pháp này chỉ dùng một kháng thể nên tiết kiệm thời gian và rất ít phản ứng không đặc hiệu. Tuy nhiên cũng vì phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay (Hình 2.8.A) ( Boenisch và ctv, 2002). A B Enzyme Khángnguyên Kháng thể 1 Kháng thể 2 Kháng thể 3 Biotin (Strept)avidin Chú thích C D E F 27 B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ cùng một loài có thể được sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp. Quy trình này cũng nhạy hơn nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuyếch đại tín hiệu lên nhiều lần vì nhiều enzyme được cố định trên mỗi vị trí đích (Hình 2.8.B) (Boenisch và ctv, 2002). Thông thường, kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng và kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng. C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Trong phương pháp này người ta bổ sung thêm 1 kháng thể đánh dấu enzyme nữa vào phương pháp B. Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tự như hình 2.8.C. Ví dụ như nếu kháng thể thứ cấp thứ 1 tạo ra từ dê, thì kháng thể thứ cấp thứ 2 phải đặc hiệu với globulin miễn dịch của dê. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope (Boenisch và ctv, 2002). D. Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan: còn được gọi là phương pháp không đánh dấu kháng nguyên. Quá trình nhuộm cần có kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hòa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp miễn dịch được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nó, loại bỏ kết tủa, thu dịch hòa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó. Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme. 28 Kĩ thuật này được đặt tên theo phức hợp miễn dịch enzyme sử dụng.Ví dụ: Phương pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase, APAAP (alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) sử dụng phức hợp alkaline phosphatase – kháng alkaline phosphatase. Phức hợp PAP gồm 3 phân tử peroxidase và 2 kháng thể, phức hợp APAAP gồm 2 phân tử alkaline phosphatase và 1 kháng thể (Hình 2.8.D) (Boenisch và ctv, 2002). E. Kỹ thuật (strept)avidin-biotin: Hầu hết những phương pháp nhuộm ngày nay đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà) với biotin. Kỹ thuật này có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin- biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB nhạy hơn phương pháp ABC (Hình 2.8.E, F) (Boenisch và ctv, 2002). Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB). 2.4.6. Ứng dụng phƣơng pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản Kể từ khi ra đời phương pháp IHC đã chứng tỏ tính ưu việt trong chẩn đoán bệnh, các thí nghiệm khẳng định trong nhân y (chẩn đoán bệnh ung thư vú, ung thư phổi) (Hayat, 2004), thú y và trong thủy sản hay ứng dụng trên lĩnh vực nghiên cứu cơ bản về hệ miễn dịch (dùng IHC để phát hiện kháng thể kháng Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa) trong cá bơn Scophthalmus maximus L. (Sitja-Bobadilla và ctv, 2005) Đối với thủy sản, xác định nhanh mầm bệnh quyết định tính hiệu quả trong kiểm soát bệnh. Phát hiện mầm bệnh không những quan trọng với cá nhiễm bệnh mà còn với môi trường (giữa thời kì thu hoạch và tái xuống giống) và như là một hệ thống 29 cảnh báo sớm. Ứng dụng probe kháng thể và probe/primer DNA đã có những ảnh hưởng quan trọng trong phát triển những phương pháp chẩn đoán nhanh mới (Hiney và Smith, 1998). Phương pháp IHC và một số phương pháp dựa trên kháng thể khác như miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (flourescence antibody tests – FAT), gián tiếp (indirect flourescence antibody tests – IFAT), ELISA (enzyme link immunosorbent assays) được ứng dụng trên nhiều dạng mầm bệnh khác nhau gồm vi khuẩn (Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Photobacterium damsela subspecies piscicida, Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp., Vibrio anguillarum và Flavobacterium psychrophilum; (Adams và Thompson, 1990; Adams, 1995; Bakopoulos và ctv., 1997; Adams và ctv., 1996), kí sinh trùng (Morris và ctv., 1997), virus (infectious salmon anaemia virus), và rickettsia trên cá Piscirickettsia salmonis (Alday-sanz và ctv., 1994). Trong một số trường hợp các phương pháp dựa trên kháng thể rất hiệu quả và đạt được độ nhạy, độ đặc hiệu cần thiết. Tuy nhiên trong những trường hợp khác, như với mẫu nước và bệnh sau lâm sàng, cần có những phương pháp dựa trên DNA (PCR, in situ hybridisation) với độ nhạy cao hơn. Đối với tôm (tôm nước mặn và tôm nước ngọt), phương pháp IHC cũng chứng tỏ tính hiệu quả khi được ứng dụng trong chẩn đoán các loại mầm bệnh, đặc biệt là khi sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies – mAbs).  Với mầm bệnh virus, IHC dùng trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng WSSV với kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng kháng protein VP28 (Liu và ctv, 2002; Poulos và ctv, 2001; Yoganandhan và ctv, 2004), phát hiện và phân biệt các dạng khác nhau của phức hợp virus đầu vàng (Yellow head complex virus – YHV) bằng kháng thể đơn dòng V – 3 – 2B, Y – 18, Y – 19 (Soowannayan và ctv, 2003), virus hội chứng Taura (Taura syndrome virus – TSV) với kháng thể đơn dòng TSV – 1A1 (Anil và ctv, 2002; OIE, 2003).  Với mầm bệnh vi khuẩn nhiều kháng thể đơn dòng kháng các loại vi khuẩn (15 kháng thể đơn dòng kháng một dòng vi khuẩn nguy hiểm là Vibrio harveyi 639 – Phianphak và ctv, 2005) đã được xác định nhằm phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch như IHC. 30 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2005 – 8/2005. B. Địa điểm thực hiện: Phòng Mô Học - Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh). 3.2. Vật liệu 3.2.1. Mẫu xét nghiệm: - 10 mẫu tôm sú thương phẩm thu từ các ao nuôi tại tỉnh Cà Mau và tỉnh Sóc Trăng (nội dung 1). Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 Kí hiệu Nơi thu Loại mẫu Ngày thu 45D 45P 101 53 103 97 50 98 453 99 Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau 30 ngày tuổi 30 ngày tuổi 3 tháng tuổi 45 ngày tuổi 3 tháng tuổi 2 tháng tuổi 28 ngày tuổi 2 tháng tuổi 50 ngày tuổi 2 tháng tuổi 10/4/2005 10/4/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 17/3/2004 21/1/2005 - 25 mẫu tôm sú post-larvae chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu thu từ các trại giống ở khu vực miền Trung (Đà Nẳng, Phan Rang, Bình Định), miền Nam (Vũng Tàu, Cà Mau). 30 mẫu tôm sú thương phẩm chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu 31 thu ở các ao nuôi tại Cà Mau, Sóc Trăng, Kiên Giang, Vũng Tàu, Trà Vinh trong đó thử nghiệm PCR trên 20 mẫu, thử nghiệm IHC và Mô học trên cả 30 mẫu (nội dung 2). Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu Nơi thu Ngày thu Kí hiệu Nơi thu Ngày thu 7683 7787 7661 7781 7536 7786 7718 7769 7768 7764 7684 7691 7650 7722 7725 2682 2741 2708 3122 2752 2745 12964 2794 2746 7755 Phan Rang Cà Ná Bình Định Đà Nẵng Cà Mau Cà Ná Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Vũng Tàu Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Phan Rang Cà Ná Cà Mau Cà Mau Cà Mau 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 2/7/2005 14/2/2005 15/2/2005 15/2/2005 25/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 9/12/2004 19/2/2005 18/2/2005 3/7/2005 101 97 98 99 336 341 342 340 339 338 103 44 55 57 49 94 136 134 137 135 159 161 152 153 156 178 179 181 182 185 Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Kiên Giang Sóc Trăng Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Cà Mau Trà Vinh Trà Vinh Kiên Giang Kiên Giang Kiên Giang Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu Vũng Tàu 21/1/2005 21/1/2005 21/1/2005 21/1/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 15/4/2005 21/1/2005 11/4/2005 10/4/2005 10/4/2005 10/4/2005 21/1/2005 17/2/2005 17/2/2005 17/2/2005 17/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 18/2/2005 1/3/2005 1/3/2005 1/3/2005 32 3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC: - Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đơn dòng 8B7 của chuột kháng protein WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4 C) - công ty Diagxotics - Kháng thể thứ cấp: Kháng thể của cừu có gắn biotin kháng kháng thể chuột (kháng thể sơ cấp) (Anti-mouse Ig biotinylated species-specific whole antibody) (4 C) - công ty Amersham Biosciences UK. - Huyết thanh cừu (Normal sheep serum) (4 C) - Công ty CalBioChem. - Streptavidine-biotinylated horseradish peroxidase complex (HRP) (4 C) - Công ty Amersham Biosciences UK. - 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (-20 C ). - Sodium azide, H2O2 30% (4 C). 3.2.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy xử lý mẫu tự động - Máy cắt microtome - Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính - Bộ phận làm lạnh mẫu - Nồi nước có điều chỉnh nhiệt độ - Bình rót paraffin Electrothermal - Kính hiển vi quang học - Găng tay y tế, lam, lamel, cassette và nắp, đèn cồn, kéo, panh, khuôn inox, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác. 3.2.4. Hóa chất - Cồn 50%; 70%; 95%; 99,6%. - Chloroform, Paraffin, nước cất 2 lần, nước cất khử ion, xylene, NaCl. - Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada. 33 - Dung dịch Davidson với thành phần như sau: Cồn 95% : 330 ml Formalin : 220 ml Acid acetic glacial : 115 ml Nước cất : 335 ml - Hoá chất làm lam dương: Aceton : 250 ml (3-aminopropyl) triethoxysaline : 5 ml 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu tạo khối đầy đủ ngẫu nhiên (Randomized complete block design - RCBD). Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics 7.0. Dùng trắc nghiệm LSD (Least significant different) 95% để so sánh các nghiệm thức. A. Với nội dung 1: Phát triển phương pháp IHC phù hợp với điều kiện tại Việt Nam dựa trên qui trình đề nghị của Nauwynck và cộng sự (Đại Học Gent - Bỉ) thông qua bố trí thử nghiệm:  Khả năng nhuộm màu của các nồng độ DAB khác nhau (1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 5 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 3 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ.  Độ nhạy và tính đặc hiệu của mAb ở các nồng độ pha loãng khác nhau (0,5X; 1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 10 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin được bố trí trên 4 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ. Kết quả được ghi nhận trên 3 đặc tính của mẫu sau khi nhuộm: Cường độ cảm nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét. Ghi chú: 1X: Nồng độ đề nghị của Đại học Gent. 34 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 Yếu tố thử nghiệm Nồng độ DAB Nồng độ mAb 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X K í h iệ u m ẫ u 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45D 45P 45P 45P 45P 45P 45P 45P 101 101 101 101 101 101 101 53 53 53 53 53 53 53 103 103 103 103 103 103 103 97 97 97 97 50 50 50 50 98 98 98 98 453 453 453 453 99 99 99 99 B. Với nội dung 2: So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và PCR qua bố trí thử nghiệm khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV trên 25 mẫu tôm post-larvae và 30 mẫu tôm thương phẩm. Mỗi mẫu được chia thành 2 phần, một phần cố định trong cồn dùng cho PCR, phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson cho Mô học và IHC (sau khi cố định trong paraffin, mỗi mẫu được cắt và bố trí trên 2 lam, một cho IHC và 1 cho Mô học). Kết quả được ghi nhận dựa trên tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm của mẫu sau khi xét nghiệm. 35 Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 Đối tƣợng Tôm post-larvae Tôm thƣơng phẩm Loại xét nghiệm PCR Mô học IHC PCR Mô học IHC K í h iệ u m ẫ u 7638 7638 7638 101 101 7787 7787 7787 97 97 7661 7661 7661 98 98 7781 7781 7781 99 99 7536 7536 7536 336 336 7786 7786 7786 341 341 7718 7718 7718 342 342 7769 7769 7769 340 340 7768 7768 7768 339 339 7764 7764 7764 338 338 7684 7684 7684 103 103 103 7691 7691 7691 44 44 44 7650 7650 7650 55 55 55 7722 7722 7722 57 57 57 7725 7725 7725 49 49 49 2682 2682 2682 94 94 94 2741 2741 2741 136 136 136 2708 2708 2708 134 134 134 3122 3122 3122 137 137 137 2752 2752 2752 135 135 135 2745 2745 2745 159 159 159 12964 12964 12964 161 161 161 2794 2794 2794 152 152 152 2746 2746 2746 153 153 153 7755 7755 7755 156 156 156 178 178 178 179 179 179 181 181 181 182 182 182 185 185 185 36 3.3.2. Quy trình thực hiện: Quy trình thực hiện gồm 3 giai đoạn chính Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (tương tự như phương pháp mô học truyền thống) Bước 1: Cố định mẫu trong dung dịch Davidson Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng nhỏ, bỏ vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson. Ngâm mẫu 24 giờ. Với tôm thương phẩm: Lấy tôm sống, cắt giữa phần đầu ngực và bụng, giữ phần đầu ngực lại (chứa mang và gan tụy), tiêm dung dịch Davidson vào Nhận mẫu Cố định mẫu Đúc mẫu Cắt mẫu Làm lạnh Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ Chuyển mẫu lên lam Nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi Ủ mẫu ở 400C đến khi mẫu dính chặt vào lam Xử lý mẫu 12,5 giờ 37 gan tụy và vùng xung quanh gan tụy, lượng thuốc dùng từ 0,1 – 10 ml (thay đổi tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ chứa dung dịch Davidson. Ngâm mẫu từ 24 – 72 giờ. Hoặc có thể cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch Davidson, ngâm như với tôm post-larvae. Tỷ lệ chất cố định: mẫu =10:1 Bước 2: Xử lý mẫu. Rửa nước 1 – 2 giờ dưới vòi nước chảy. Sau đó xử lý theo quy trình như hình 3.2. Quy trình này được thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu Bước 3: Đúc mẫu Đặt mẫu nằm sát đáy khuôn chứa nến có tỉ lệ parafin: sáp ong = 1:5, đậy cassette lên khuôn để khi nến đông lại và dính vào cassette. Quá trình này cần có bàn nóng và bình rót nến. Đặt khuôn lên bề mặt bộ phận làm lạnh, đợi đến khi khuôn mẫu lạnh, tách khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bề mặt làm lạnh sao cho mặt cắt lạnh cứng lại. Bước 4: Cắt mẫu: Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt microtome, kích thước mỗi lát cắt là 5 μl. Bước 5: Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 400C, dùng lam dương vớt lát cắt. Cồn 70% 30 phút Cồn 95% (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Cồn 95% (2) 30 phút Cồn 95% (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ 38 Giai đoạn 2: Nhuộm lát cắt theo phương pháp IHC Bước 1: Làm mẫu dính chặt vào lam: Đặt lam chứa mẫu vào bàn ấm ở nhiệt độ 45 0C đến khi khô hết nước và mẫu không di chuyển được. Bước 2: Khử paraffin cho mô Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần Nhúng trong Tris buffer pH 7,6 + NaCl 1 lần trong 5 phút. Bước3: Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10%), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lượng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lượng lam muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lam). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu. Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần). Bước 4: Ủ với kháng thể thứ nhất: Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10%(100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3. Ủ mẫu 1 giờ ở 370C . Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần). Bước 5: Ủ với kháng thể thứ hai: Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3. Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370C. Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/lần) 39 Bước 6: Ủ với treptavidine-biotin HRP: Pha phức hợp streptavidine- biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3. Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần). Bước 7: Làm hiển thị màu bằng DAB: Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trước khi dùng H2O2 (30%) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer. Nhúng lam mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng. Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lam vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lam trong tris buffer pH 7,6 + NaCl. Bước 8: Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam vài lần vào dung dịch hematoxylin pha loãng. Rửa cẩn thận với nước máy trong 1 phút. Bước 9: Khử nước Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần. Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần. Bước 10: Dán lamel với Baume Canada. Lam sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamel lên lam kính, tránh hiện tượng có bọt khí bên trong. 40 Giai đoạn 3: Đọc kết quả. Cách đọc tiêu bản xác định thể ẩn và ghi nhận kết quả như sau:  Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 10x, 40x, 100x. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng với nhân trương to, sau đó hạch nhân trương to hơn, chiếm hết nhân, bắt màu nâu.  Các kết quả được khảo sát dựa trên: + Tỷ lệ cảm nhiễm là số tôm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra. + Cường độ cảm nhiễm là % tế bào nhiễm virus. + Cường độ bắt màu là % tế bào nhiễm bắt màu nâu (vì ngoài màu nâu, tế bào nhiễm còn có thể bắt màu nâu nhạt hay vàng). + Độ sắc nét là % tế bào nhiễm bắt màu sắc nét.  Kết quả xét nghiệm được mã hoá thành kí hiệu và giá trị có ý nghĩa về mặt toán học (Bảng 3.1). Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả Nội du g Số liệu Cường độ Kí hiệu mã hoá cảm nhiễm - 0 0% 0% 0% +/- 1 0 - 25% 0 - 25% 0 - 25% + 2 25 - 50% 25 - 50% 25 - 50% ++ 3 50 - 75% 50 - 75% 50 - 75% +++ 4 75 - 100% 75 - 100% 75 - 100% Cường độ bắt màu Độ sắc nét  Sau khi đọc kết quả, các lam chứa mẫu và các thông số đều được lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh dấu mẫu cẩn thận để tránh nhầm lẫn 41 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC Tất cả các thí nghiệm so sánh trên cùng một mẫu được ghi nhận kết quả trên các lát cắt liên tiếp nhau. 4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau Bảng 4.1. Kết quả so sánh chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm Kí hiệu Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 1X 1,5X 2X 45P + + + - - +/- - - +/- 45D +/- + + - + ++ - +/- +/- 101 +/- + + - + + - + + 53 +/- + + - + ++ - + ++ 103 +/- + + - + + - + + - Nồng độ 1X: Tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu vàng nhạt hay nâu rất nhạt, một số tế bào bắt màu DAB rất mờ không thể xác định rõ có phải là tế bào nhiễm virus hay không, vì vậy mà cường độ cảm nhiễm của 4/5 mẫu thấp hơn 2 nồng độ còn lại. Nhân tế bào bắt màu DAB không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus.  Ở vật kính 10x: Phải quan sát rất kĩ mới nhận ra màu nhuộm.  Ở vật kính 40x: Có thể nhận thấy màu vàng nhạt ở một số tế bào nhưng tất cả các tế bào bắt màu đều không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus (nhân không tròn và trương to), không sắc nét.  Ở vật kính 100x: Một số tế bào có nhân trương to và khá tròn nhưng không sắc nét. Hình dạng nhân tạo thành bởi những chấm màu vàng hay nâu nhạt khá rời rạc. 42 - Nồng độ 1,5X: Lượng tế bào bắt màu DAB có màu nâu tăng lên đáng kể so với nồng độ 1X, một số tế bào còn có màu nâu đậm. Hình dạng đặc trưng của nhân tế bào nhiễm virus thể hiện rõ ở nhiều tế bào. Vì vậy có thể xác định thêm một số tế bào nhiễm.  Ở vật kính 10x: Có thể nhận thấy rõ màu nhuộm khác biệt so với màu nền.  Ở vật kính 40x: Phần lớn tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu nhạt. Hình dạng nhân khá rõ ràng và sắc nét.  Ở vật kính 100x: Nhân tế bào trương to, tròn, rõ nét. - Nồng độ 2X: Gần như tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu đậm, một số tế bào có màu nâu rất đậm, gần như đen, phần lớn tế bào có nhân rất đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV, trương to và tròn.  Ở vật kính 10x: Màu nhuộm thể hiện rất rõ, có thể xác định ngay tế bào nhiễm.  Ở vật kính 40x: Nhân tế bào bắt màu nâu rõ nét. Nhiều tế bào có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV  Ở vật kính 100: Màu nâu thể hiện rất đậm ở một số mẫu, ngay cả ở những tế bào không có hình dạng đặc trưng vẫn rất sắc nét. Nhìn chung, kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự khác biệt đáng kể về cường độ cảm nhiễm của mẫu, cường độ bắt màu, và độ sắc nét của tế bào nhiễm khi nhuộm với DAB 1X so với nồng độ 1,5X và 2X. Nồng độ 1X có khả năng nhuộm rất kém, không thể nhận biết rõ tế bào nhiễm WSSV với nồng độ này. Nồng độ 1,5X và 2X thể hiện kết quả nhuộm tốt, nồng độ 2X có ưu thế hơn về cường độ bắt màu và độ sắc nét nhưng nhiều tế bào lại bắt màu quá đậm, không cần thiết. Ở nồng độ 1,5X chỉ có mẫu 45P bắt màu kém và không sắc nét. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân như không đủ lượng DAB, lượng virus nhiễm ít, mẫu nhuộm không tốt làm trôi màu, không đủ lượng kháng thể ... Nhưng khi so sánh kết quả nhuộm với DAB 2X, cường độ cảm nhiễm và độ sắc nét được cải thiện không đáng kể. Do đó mẫu 45P bắt màu không tốt chắc chắn không phải vì nồng độ DAB không đủ để cho phản ứng. 43 Như vậy, nồng độ 1,5X biểu hiện tốt nhất với quy trình nhuộm này vì không mất nhiều DAB một cách không cần thiết như nồng độ 2X nhưng vẫn cho kết quả nhuộm tốt. Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một vị trí mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1X (100x), (400x), (1000x). - Hình A1: Tế bào nhiễm bắt màu nâu nhạt, lẫn với màu nền, rất khó nhận ra. - Hình A2: Có thể nhận thấy sự khác biệt giữa màu DAB và màu nền nhưng không rõ, hình dạng tế bào nhiễm không sắc nét. Một số tế bào (mũi tên) không thể xác định được có nhiễm virus hay không. - Hình A3: Màu DAB nhạt, không rõ nhân tế bào nhiễm A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 44 B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1,5X (100x), (400x), (1000x). - Hình B1: Có thể nhận thấy rõ vị trí tế bào nhiễm, màu DAB thể hiện rõ. - Hình B2: Tế bào nhiễm (mũi tên) thể hiện màu sắc và hình dạng đặc trưng. - Hình B3: Vị trí X - nhân tế bào nhiễm WSSV điển hình. Vị trí Y: hạch nhân trương to, có thể thấy rõ mép nhân. Vị trí Z: tế bào nhiễm phóng thích virus. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 2X (100x), (400x), (1000x). - Hình C1:Dễ dàng nhìn thấy tế bào nhiễm do màu DAB quá đậm, gần như đen. - Hình C2, C3: Nhận thấy tế bào nhiễm rất rõ và sắc nét. 4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau Bảng 4.2. Kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 0,5X 1X 1,5X 2X 45P Sóc Trăng +/- + + + +/- - + ++ - - + + 45D Sóc Trăng + + + + + + ++ ++ - - - + 101 Cà Mau + + + +/- +/- + + + - + - + 53 Sóc Trăng + + + + +/- + ++ +++ + + + ++ 103 Cà Mau +/- + + + + + + +++ +/- - - + 97 Cà Mau + + + + + ++ + +++ +/- ++ + +++ 50 Sóc Trăng - - - - - - - - - - - - 98 Cà Mau + ++ ++ ++ + ++ ++ +++ + ++ ++ ++ 453 Cà Mau - - - - - - - - - - - - 99 Cà Mau +/- + + + + + ++ +++ +/- + + ++ Kí hiệu Nơi thu Cường độ bắt màuCường độ cảm nhiễm Độ sắc nét 45 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb. Nồng độ kháng thể Lượng mẫu Trung bình có ý nghĩa nhỏ nhất Nhóm giống nhau Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 0,5X 1X 1,5X 2X 10 10 10 10 1,3 1,7 1,7 1,6 1,3 1,6 2 2,8 0,7 1,2 1,1 2,1 X X X X X XX X X X X X X So sánh đối chiếu Giới hạn +/- khác biệt Cường độ cảm nhiễm Cường độ bắt màu Độ sắc nét 0,5X – 1X 0,5X – 1,5X 0,5X – 2X 1X – 1,5X 1X – 2X 1,5X – 2X -0,4 0,28889 * -0,4 0,28889 * -0,3 0,28889 * 0 0,28889 0,1 0,28889 0,1 0,28889 -0,3 0,54657 -0,7 0,54657 * -1,5 0,54657 * -0,4 0,54657 -1,2 0,54657 * -0,8 0,54657 * -0,5 0,60612 -0,4 0,60612 -1,4 0,60612 * 0,1 0,60612 -0,9 0,60612 * -1,0 0,60612 * Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Về cường độ cảm nhiễm Dựa trên kết quả sau khi xử lý số liệu (Bảng 4.1), có thể kết luận được là về khả năng phát hiện tế bào nhiễm, nồng độ mAb 0,5X kém hơn so với 3 nồng độ còn lại. Khi đọc mẫu, ở nồng độ 0,5X, có thể nhận thấy nhiều tế bào có biểu hiện nhiễm WSSV nhưng lại bắt màu nền (tím) hoặc có màu tím pha nâu rất khó nhận ra, vì vậy có thể đã xác định không đúng về cường độ cảm nhiễm. Ở 3 nồng độ còn lại không có hiện tượng này không có hoặc có rất ít. Nguyên nhân: Độ đặc hiệu của mAb cao, chất lượng tốt nên ngay ở nồng độ đề nghị của Đại học Gent đã có thể phát hiện tốt những tế bào nhiễm virus. 46 Nồng độ mAb càng giảm, lượng kháng thể bắt cặp với kháng nguyên trên tế bào nhiễm càng giảm, kết quả là không đủ kháng thể để kết hợp với kháng nguyên (nồng độ 0,5X) nên một số nhân tế bào nhiễm không có màu nâu (âm tính giả). Nồng độ mAb càng cao, lượng kháng thể đủ để kết hợp hết với kháng nguyên nên nhân tế bào nhiễm có màu nâu rõ nét. Nhưng nếu lượng kháng thể quá cao mà lượng kháng nguyên không thay đổi thì kháng thể cũng sẽ bị rửa trôi khi thao tác do không có kháng nguyên để kết hợp. Chính vì vậy mà không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm của nồng độ 1X, 1,5X và 2X. B. Về cường độ bắt màu: Không có sự khác biệt giữa hai nồng độ 0,5X và 1X, giữa 1X và 1,5 X, nhưng lại có sự khác biệt giữa nồng độ 2X với ba nồng độ còn lại (Bảng 4.3, Hình 4.2.). - Nồng độ 0,5X: Một số tế bào nhiễm bắt màu không rõ ràng, lẫn với màu nền hoặc có màu nâu nhạt.  Ở vật kính 10x: Khó nhận ra tế bào nhiễm.  Ở vật kính 40x, 100x: Tế bào nhiễm có màu nâu rõ ràng hơn, nhân trương to nhưng một số tế bào lại có nhân màu tím, xuất hiện những vết màu nâu nhạt ở trong nhân hoặc nhân có màu nâu pha tím. - Nồng độ 1X và 1,5X: Khả năng bắt màu của tế bào nhiễm đều rất tốt. Phần lớn tế bào nhiễm có màu nâu đặc trưng. Người đọc dễ dàng nhận ra tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x. - Nồng độ 2X: Gần như toàn bộ các tế bào nhiễm đều bắt màu nâu, nhiều tế bào còn bắt màu nâu rất đậm (gần như đen), thể hiện rõ ở cả 3 vật kính. Tuy nhiên ở ba nồng độ này vẫn có những tế bào bắt màu vàng hoặc nâu nhạt nhưng chiếm tỉ lệ thấp. Nguyên nhân: Do sự khác biệt về nồng độ kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng thể cao, tất cả kháng nguyên đều kết hợp với kháng thể thì tín hiệu khuyếch đại sẽ lớn, cho màu đậm và ngược lại. 47 Tuy nhiên sự khác biệt về màu sắc của tế bào nhiễm virus còn phụ thuộc vào trạng thái nhiễm WSSV của tế bào. Có 4 pha nhiễm của tế bào ứng với 4 pha của virus: Pha sớm (tế bào mới nhiễm virus), pha tăng sinh (lượng virus trong hạch nhân tăng nhanh chiếm hết nhân, dùng cơ chất trong nhân để sao chép vật liệu di truyền), pha cấp (virus phá vỡ màng nhân xâm nhiễm vào tế bào chất, sử dụng cơ chất trong tế bào chất để hoàn chỉnh cấu trúc), pha phóng thích (tế bào vỡ và phóng thích virus). Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân sẽ có màu vàng đến nâu nhạt. Nếu tế bào ở pha tăng sinh, hạch nhân trương to chiếm hết nhân và bắt màu nâu. Nếu tế bào ở pha cấp sẽ nhận thấy tế bào trương to và nâu sậm. Nếu tế bào ở pha phóng thích sẽ thấy có màu vàng, lan ra. Vì vậy ở bất kì nồng độ kháng thể nào cũng có những tế bào bắt màu vàng hay nâu nhạt, chỉ tuỳ vào lượng mAb nhiều hay ít, kết hợp đủ với kháng nguyên thì tín hiệu khuyếch đại sẽ nhiều, có thể giảm lượng tế bào có màu vàng hay nâu nhạt. C. Về độ sắc nét: Ở các nồng độ 0,5X, 1X và 1,5X, độ sắc nét của màu nhuộm thể hiện trên tế bào nhiễm không cao. Nồng độ 2X khác hẳn 3 nồng độ còn lại, trên tất cả các mẫu dương tính (8/10), phần lớn nhân tế bào trương to và tròn, có thể nhận thấy rõ mép nhân (25 - 75% tế bào có trên mẫu), những tế bào không có hình dạng đặc trưng là tròn to thì vẫn sắc nét (Bảng 4.4, Hình 4.2). - Nồng độ 0,5X; 1X và 1,5X: Kết quả được ghi nhận chủ yếu ở vật kính 40x và 100x vì ở vật kính 10x gần như tất cả các tế bào nhiễm đều không thể hiện được độ sắc nét. - Nồng độ 2X: Nhiều tế bào thể hiện sự sắc nét ngay ở vật kính 10x. Nguyên nhân: Thời gian giữ mẫu sau khi đúc trong nến và điều kiện lưu giữ ảnh hưởng lớn đến độ sắc nét. Những mẫu thí nghiệm do được thu, cố định và vùi trong nến cách đây khá lâu nên hình dạng tế bào và nhân tế bào không còn rõ nét. Tuy nhiên ở nồng độ 2X do lượng mAb quá cao, có thể đã kết hợp với toàn bộ kháng nguyên nên hình ảnh tế bào nhiễm sắc nét hơn. Ngoài ra độ sắc nét cũng phụ thuộc vào giai đoạn nhiễm WSSV của tế bào. Nếu tế bào ở pha sớm, hạch nhân trương lên nhưng chưa to. Ở pha tăng sinh và pha cấp thì 48 nhân sẽ có hình dạng đặc trưng. Ở pha phóng thích, hình dạng tế bào không rõ do có sự vỡ tế bào. A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 D1 D2 D3 E1 E2 E3 49 Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và không có mAb trên mẫu 103 (tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một mang). A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0X (100x), (400x), (1000x). - Hình A1: Không thể nhận ra tế bào nhiễm - Hình A2: Vị trí mũi tên có thể là tế bào nhiễm - Hình A3: Tế bào nhiễm có nhân trương to và bắt màu hematoxylin. B1, B2, B3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 0,5X (100x), (400x), (1000x). - Hình B1: Nhận thấy những vị trí bắt màu vàng đến nâu nhạt trên mẫu - Hình B2, B3: Tế bào nhiễm có màu sắc khá rõ ràng, chỉ có tế bào ở vị trí mũi tên mới có hình dạng đặc trưng. C1, C2, C3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1X (100x), (400x), (1000x). - Hình C1: Có thể nhận thấy rõ vi trí tế bào nhiễm có màu nâu. - Hình C2, C3: Tế bào nhiễm bắt màu đẹp, sắc nét. D1, D2, D3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 1,5X (100x), (400x), (1000x). Tế bào nhiễm biểu hiện rõ ràng, dễ nhận biết E1, E2, E3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với mAb 2X (100x), (400x), (1000x). - Hình E1: Các tế bào nhiễm bắt màu nâu rất đậm, gần như đen. - Hình E2, E3: Màu DAB quá đậm, hình dạng nhân sắc nét 4.2. Kết quả nội dung so sánh phƣơng pháp IHC với phƣơng pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả. 4.2.1. So sánh độ chính xác và độ nhạy của 3 phƣơng pháp PCR, mô học và IHC. 50 Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của ba phƣơng pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thƣơng phẩm. Tôm post-larvae Tôm thương phẩm Kí hiệu PCR Mô học IHC Kí hiệu PCR Mô học IHC 7683 - - - 101 + + 7787 - - - 97 + + 7661 + - - 98 ++ ++ 7781 - - - 99 + + 7536 + - - 336 ++ + 7786 - - - 341 ++ + 7718 - - - 342 ++ + 7769 - - - 340 + + 7768 - - - 339 ++ + 7764 - - - 338 + + 7684 - - - 103 + + + 7691 - - - 44 ++ + ++ 7650 + - - 55 +++ ++ + 7722 - - - 57 - - - 7725 - - - 49 - - - 2682 + - - 94 + + + 2741 + - - 136 - - - 2708 + - - 134 - - - 3122 - - - 137 - - - 2752 + - - 135 - - - 2745 + - - 159 +++ ++ +++ 12964 - 5%(+) 20%(++) 161 - - - 2794 - 10%(++) 10%(+++) 152 + ++ ++ 2746 + - - 153 ++ + + 7755 ++ - - 156 + + + 178 - - - 179 - - - 181 - - - 182 - - - 185 - - - 51 Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phƣơng pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC Loại xét nghiệm Lượng mẫu Trung bình có ý nghĩa nhỏ nhất Nhóm giống nhau Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm Tôm post- larvae Tôm thương phẩm PCR Mô học IHC 25 25 25 20 30 30 0,84 0,2 0,28 1,59167 1,46667 1,36667 X X X X X X So sánh đối chiếu Khác biệt +/- Giới hạn Tôm post-larvae Tôm thương phẩm PCR – Mô học PCR – IHC Mô học - IHC 0,64 0,50112 * 0,56 0,50112 * -0,08 0,50112 * 0,125 0,25026 0,225 0,25026 0,1 0,25026 Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê A. Trên đối tượng tôm post-larvae: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy không có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế bào nhiễm virus giữa phương pháp IHC và phương pháp mô học nhưng sự khác biệt này lại rất rõ nét giữa phương pháp PCR và 2 phương pháp còn lại. Như vậy, độ nhạy của PCR là khá cao và độ nhạy của IHC và mô học khác nhau không đáng kể. Theo quan sát dưới kính hiển vi, các mẫu nhuộm IHC biểu hiện nhân nhiễm WSSV rất rõ ràng, có thể nhận biết ngay ở vật kính 10x, nhưng với phương pháp Mô học cần phải tập trung và tìm thật kĩ mới nhận biết được những tế bào nhiễm. Trên 2 mẫu 12964 và 2794, IHC và mô học đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ cảm nhiễm thấp và cường độ cảm nhiễm khá cao nhưng PCR lại cho kết quả âm tính. Khi xét nghiệm bằng IHC, cường độ cảm nhiễm và tỉ lệ cảm nhiễm của 2 mẫu này cao hơn xét nghiệm bằng Mô học. Có 10 mẫu (7661, 7536, 7650, 2682, 2741, 2708, 2752, 2745, 52 2746, 7755) PCR cho kết quả dương tính nhưng IHC và Mô học đều cho kết quả âm tính. Nguyên nhân: - Phương pháp PCR: Tôm post-larvae do chưa phải tuổi mẫn cảm nên thường nhiễm WSSV ở dạng tiềm ẩn, lượng virus trong mẫu rất ít, chỉ có phương pháp PCR với khả năng khuyếch đại một lượng rất nhỏ DNA của virus mới nhận biết được. Hơn nữa, trong quá trình xét nghiệm bằng PCR mẫu được đồng nhất nên tất các các bộ phận của cá thể tôm trong mẫu đều được kiểm tra, lượng tôm trong mẫu xét nghiệm có thể nhiều nên khả năng phát hiện mầm bệnh cao hơn. Vì vậy trên đối tượng tôm post-larvae phương pháp PCR có độ nhạy cao nhất (phát hiện ra 10 mẫu dương tính trong khi Mô học và IHC không thể phát hiện được). Tuy nhiên, tính chính xác của phương pháp PCR lại phụ thuộc rất nhiều vào tính đặc hiệu của primer và nhiều yếu tố khách quan và chủ quan khác như chất lượng hoá chất, thao tác của người làm thí nghiệm … Độ nhạy và tính chuyên biệt cao của phương pháp PCR vừa là ưu điểm vừa là trở ngại của phương pháp này vì có thể cho kết quả âm tính giả do chất lượng hoá chất, primer giảm trong quá trình bảo quản …hay do mầm bệnh mới xuất hiện, lượng tôm nhiễm ít, ngẫu nhiên không có cá thể bệnh trong số tôm làm xét nghiệm. - Phương pháp mô học và IHC: Khả năng phát hiện tế bào nhiễm phụ thuộc rất nhiều vào quá trình đúc mẫu (lượng tôm được vùi trong nến nhiều hay ít, các cá thể được đúc có nhiễm virus hay không, cơ quan đích của virus có nằm gần mặt cắt hay không), chất lượng lát cắt (cắt có đúng vị trí có nhiều mẫu hay không, cơ quan đích của virus có nằm trên lát cắt hay không). Phương pháp IHC (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) không bằng PCR về độ nhạy (vì không thể khuyếch đại DNA virus) nên không phát hiện mầm bệnh trên 10 mẫu tôm post-larvae. Tuy nhiên, IHC nhờ khả năng hoạt động tốt của kháng thể sơ cấp, kháng thể thứ cấp và HRP nên nếu có mầm bệnh virus với một lượng có ý nghĩa thì chắc chắn sẽ có tín hiệu màu (kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng sẽ phản ứng với lượng lớn epitope trên kháng thể sơ cấp, từ đó khuyếch đại tín hiệu virus vì nhiều 53 phân tử enzyme được gắn trên một vị trí đích). Với IHC người đọc mẫu dễ dàng nhận biết tế bào nhiễm trên mang và cả trên những cơ quan khác như các phụ bộ gần mang, dạ dày, ruột, biểu mô, cơ quan lymphoid (Hình 4.3, 4.4) do đó phát hiện nhiều cá thể nhiễm và nhiều tế bào nhiễm hơn Mô học (mẫu 12964 và 2794). Phương pháp mô học truyền thống: Tất cả các tế bào nhiễm mầm bệnh đều có những biểu hiện khác biệt (với WSSV, tín hiệu đặc trưng là nhân trương to, tròn và bắt màu tím đậm) (Hình 4.4) nhưng nếu lượng virus nhiễm ít hay ở dạng tiềm ẩn (trên tôm post-larvae) và tế bào nhiễm chưa có biểu hiện đặc trưng rõ ràng thì rất khó xác định chính xác mầm bệnh (có thể nhầm lần với mầm bệnh khác). Ngoài mang là cơ quan đích chủ yếu của WSSV thì mô học truyền thống khó phát hiện được mầm bệnh ở những cơ quan khác. Vì vậy, mô học kém hơn PCR và IHC về độ nhạy. Độ nhạy của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc mẫu. B.Trên đối tượng tôm thương phẩm: Bảng kết quả (Bảng 4.2) cho thấy trên đối tượng tôm thương phẩm, khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của cả 3 phương pháp là như nhau. Biểu hiện của tế bào nhiễm khi kiểm nghiệm bằng mô học truyền thống và IHC khá rõ ràng. Với IHC, người đọc mẫu có thể dễ dàng phát hiện tế bào nhiễm ngay cả ở vật kính 10x nhờ biểu hiện màu sắc (nâu) khác biệt rõ với màu nền (tím). Với Mô học truyền thống, phải tập trung hơn mới nhận ra tế bào nhiễm nhưng nhờ lượng tế bào nhiễm nhiều, hình dạng đặc trưng nên cũng không quá khó để nhận ra. Nguyên nhân: Tôm sú thương phẩm khi nhiễm WSSV thường mang một lượng lớn virus do ở tuổi mẫn cảm. Vì vậy lượng tế bào nhiễm nhiều và biểu hiện rất rõ trên mang tôm lớn nên