Khóa luận Tuyển non dòng vô tính cao su (hevea brasiliensis muell. arg.) kháng bệnh rụng lá corynespora (corynespora leaf fall disease)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN VĂN CẢNH NGUYỄN NGỌC THANH TRANG ThS. PHAN THÀNH DŨNG TS. PHAN PHƢỚC HIỀN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phước Hiền đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Ban Giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. KS. Vũ Thị Quỳnh Chi, KS. Nguyễn Ngọc Mai và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Các cô, chú, anh, chị tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè thân yêu của lớp DH03SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Con xin cảm ơn bố mẹ đã sinh thành, nuôi dưỡng và giáo dục. Bố mẹ và anh chị luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần cho con vượt qua mọi khó khăn. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 08 năm 2007 NGUYỄN NGỌC THANH TRANG iv TÓM TẮT NGUYỄN NGỌC THANH TRANG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. “TUYỂN NON DÕNG VÔ TÍNH CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) KHÁNG BỆNH RỤNG LÁ CORYNESPORA (Corynespora Leaf Fall Disease)”. Thực hiện từ 03/03/2007 đến 30/07/2007 tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Văn Cảnh, ThS. Phan Thành Dũng và TS. Phan Phƣớc Hiền. Đối tượng nghiên cứu: Mẫu lá cao su (10 – 12 ngày tuổi) của một số dvt bị nhiễm CLFD và mẫu lá hoàn toàn sạch bệnh. Nội dung nghiên cứu: Đánh giá tính kháng CLFD trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo; Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su; Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. Kết quả đạt được: Đánh giá tính kháng: + Là phương pháp tin cậy. + 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng, 12/60 dvt nhiễm nặng, 22/60 dvt nhiễm trung bình và 11/60 dvt nhiễm nhẹ. Khảo sát hoạt tính POD: Dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau; Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh; Không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính mẫn cảm với CLFD của các dvt.  Khảo sát mật độ khí khổng: Dvt khác nhau có số lượng khí khổng khác nhau; Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều càng dễ bị nhiễm bệnh. v SUMMARY NGUYEN NGOC THANH TRANG, Nong Lam University. “SCREENING RUBBER CLONES (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) RESISTANT TO CORYNESPORA LEAF FALL DISEASE”. The research was carried out from 03/03/2007 to 30/07/2007 at the laboratoy of Crop Protection Division, Molecular biology laboratory, laboratory of Experiment’s Rubber Technology Center – Rubber Research Institute of Vietnam (RRIV). Supervisors: PhD. Tran Van Canh, Msc. Phan Thanh Dung and PhD. Phan Phuoc Hien. Materials and Methods: + Corynespora disease rubber leaflets (10 – 12 days old) used for estimation of POD activity. + Free – diseased leaflets (10 – 12 days old) used for artificial inoculation with Corynespora cassiicola and estimation of the number of stomas. + 60 rubber clones were screened for resistance to Corynespora leaf fall disease using detached leaflets technique and droplets of spore suspension. Results: + Screening rubber clones resistant to CLFD using detached leaflets technique is a reliable method. + 100% clones investigated were infected to CLFD at various susceptible levels. Among 60 clones, 15 clones are very severely infected; 12 clones are severely infected; 22 clones are moderately infected and 11 clones are lightly infected. + POD activities and the number of stoma are different from various clones. Generally, the more susceptible clones are, the more the number of stoma they have. The more POD activities the clones have, the less they are susceptible to the disease. But there is no linear correllation found between POD activity or the number of stoma and the disease severity. vi MỤC LỤC TÊN MỤC TRANG LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. x DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ xi DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. xii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ ......................................................................................... xiii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu ...................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ............................................................................................... 3 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 4 2.1. Sơ lược về cây cao su .................................................................................... 4 2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó ...................................................... 4 2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su .......................................................... 5 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola ........................................................................ 6 2.2.1. Phân loại học ............................................................................................ 6 2.2.2. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 7 2.2.3. Đặc điểm sinh lý ...................................................................................... 7 2.2.4. Khả năng tồn tại ....................................................................................... 7 2.2.5. Khả năng phát tán .................................................................................... 8 2.2.6. Con đường xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh của nấm C. cassiicola ................................................................................. 8 vii 2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su ............................... 9 2.3.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 9 2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su .............................. 10 2.3.2.1. Trên vườn ươm .............................................................................. 10 2.3.2.2. Trên vườn khai thác ....................................................................... 11 2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới ................................................................ 12 2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nước về phương pháp tuyển non dvt ......... 13 2.4. Sơ lược về enzyme ...................................................................................... 13 2.4.1. Định nghĩa ............................................................................................. 13 2.4.2. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 13 2.4.3. Cơ chế tác động ..................................................................................... 14 2.4.4. Các nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme ................................ 14 2.4.5. Một số phương pháp xác định hoạt tính của enzyme ............................ 14 2.4.6. Sơ lược về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật .............. 16 2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su ....................... 17 2.4.8. Peroxidase .............................................................................................. 17 2.4.8.1. Sơ lược về peroxidase .................................................................... 17 2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su ..................................... 18 2.5. Sơ lược về khí khổng ................................................................................... 18 2.5.1. Cấu tạo ................................................................................................... 18 2.5.2. Sự phân bố ............................................................................................. 19 2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật .................................................. 20 2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng ............................................ 20 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .................................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................ 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 21 3.2. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 21 viii 3.2.1. Phương pháp lấy mẫu lá ........................................................................ 21 3.2.2. Phương pháp phân lập nấm C. cassiicola .............................................. 22 3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 22 3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm .......................................................................... 22 3.2.2.3. Nhân số lượng bào tử ..................................................................... 22 3.2.3. Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo ................................................................. 23 3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ ........................................................................ 23 3.2.3.2. Phương pháp .................................................................................. 23 3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện .................................................... 25 3.2.4. Phương pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt ....... 25 3.2.4.1. Mục đích ........................................................................................ 25 3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất ......................................................... 25 3.2.4.3. Phương pháp .................................................................................. 25 3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 27 3.2.5. Phương pháp đếm số lượng khí khổng trên lá của một số dvt cao su ... 27 3.2.5.1. Mục đích ........................................................................................ 27 3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ ....................................................................... 27 3.2.5.3. Phương pháp .................................................................................. 27 3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm .................................. 28 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 29 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê ........................................ 29 4.2. Kết quả phân lập .......................................................................................... 31 4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................................................................................. 32 4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng bệnh CFLD trên một số dvt cao su ............................................................. 36 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .. 36 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt ................................... 38 ix 4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su ..................................................... 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 43 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 43 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 x DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT BVTV Bảo Vệ Thực Vật C. cassiicola Corynespora cassiicola CLFD Corynespora Leaf Fall Disease CRD Completely Randomized Design Dvt Dòng vô tính H. brasiliensis Hevea brasiliensis NT Nghiệm thức PDA Potato Dextrose Agar POD Peroxidase PR proteins Pathogenesis Related Proteins PSA Potato Sucrose Agar UV Ultra Violet VNCCSVN Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam xi DANH SÁCH BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên ................... 24 Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vườn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê ................ 31 Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su ................................. 33 Bảng 4.3: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ mẹ .............................................................................................................................. 34 Bảng 4.4: Phân bố phổ hệ ảnh hưởng đến mức độ mẫn cảm của con lai di truyền từ bố ............................................................................................................................... 34 Bảng 4.5: Bảng kết quả đo hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng .......... 37 Bảng 4.6: Bảng kết quả đo POD trên mẫu lá bệnh ................................................... 38 Bảng 4.7: Bảng kết quả đếm số lượng khí khổng ..................................................... 41 xii DANH SÁCH HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng ..................................................................................... 19 Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng........................................................... 20 Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên ........................................... 24 Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non ...................... 30 Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già ..................... 30 Hình 4.2a: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trường PSA ....... 32 Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo PSA ................................. 32 Hình 4.4: Dvt LH 94/612 sau 5, 7 và 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD.......... Error! Bookmark not defined. Hình 4.5: Khí khổng của một số dvt cao su .............................................................. 41 xiii DANH SÁCH BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Hoạt tính POD trên mẫu đối chứng và mẫu bệnh của 12 dvt cao su ... 38 Biểu đồ 4.2: Mối tương quan giữa hoạt tính POD và mức nhiễm bệnh CLFD ........ 39 Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ giữa số lượng khí khổng và tính mẫn cảm với CLFD của 12 dvt cao su .............................................................................................................. 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là loại cây công nghiệp dài ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm chính từ chúng là mủ. Mủ cao su đứng thứ 3 trong các mặt hàng xuất khẩu của nước ta sau lúa và cà phê, đóng góp không nhỏ vào nền kinh tế quốc gia. Cũng như nhiều loại cây trồng khác, cây cao su bị nhiều loại mầm bệnh tấn công, một trong những loại bệnh hại trên cây cao su được quan tâm là bệnh rụng lá Corynespora (CLFD) do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei. gây ra. Bệnh xuất hiện đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949, nhưng đến năm 1985 mới bùng phát thành đại dịch. Cho đến nay bệnh càng trở nên nghiêm trọng cả về mức độ, phạm vi gây bệnh và số lượng các dòng vô tính (dvt) cao su cao sản nhiễm bệnh ngàng càng tăng. Tuy nhiên, khi xây dựng chiến lược quản lý CLFD thì lại gặp những khó khăn do nấm C. cassiicola có khả năng gây bệnh quanh năm trên mọi tuổi lá và mọi giai đoạn sinh trưởng của cây; ngoài ra, nó còn gây bệnh trên cả cuống lá và chồi. Tác hại của bệnh rất lớn, cây thực sinh trong giai đoạn vườn ươm bị nhiễm bệnh làm cây chậm phát triển và không đạt được đường kính gốc ghép theo đúng thời điểm (Jacob, 2006). Trên vườn khai thác, trường hợp bệnh nghiêm trọng có thể làm cho cây bị chết và giảm sản lượng mủ từ 20 – 25%. (Nguồn: Report/Report2000.htm#Corynespora). Ở nước ta, CLFD được ghi nhận vào năm 1999, Cho đến nay bệnh chưa bùng phát thành đại dịch nhưng mức độ và phạm vi tác hại của bệnh đã gia tăng đáng kể. Nếu không có biện pháp quản lý và ngăn chặn kịp thời thì bệnh có thể bùng phát thành đại dịch sẽ gây thiệt lớn về kinh tế. Hiện nay, trên thế giới đã sử dụng nhiều chiến lược quản lý CLFD như kiểm soát về mặt di truyền, hoá học, sinh học... Phương pháp hóa học tương đối tốn kém 2 hiệu quả lại không cao. Những năm gần đây biện pháp kiểm soát sinh học đang được nghiên cứu ứng dụng ở một số nước trồng cao su nhằm hạn chế những tác hại của biện pháp hóa học. Phương pháp tuyển chọn các dvt có khả năng kháng hoặc ít mẫn cảm với bệnh đang được sử dụng ở môṭ số nước trồng cao su và Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) là một trong những phương pháp chi phí thấp nhưng có độ tin cậy cao nhằm xác định sớm các dvt kháng và dễ mẫn cảm với bêṇh. Phương pháp này có ý nghĩa trong công tác tuyển chọn giống cao su nói chung và kháng CLFD nói riêng. Với sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh và được sự hướng dẫn, giúp đỡ của ThS. Phan Thành Dũng, TS. Trần Văn Cảnh, TS. Phan Phước Hiền và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam, tôi thực hiện đề tài: “Tuyển non dòng vô tính cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) kháng bệnh rụng lá Corynespora (Corynespora Leaf Fall Disease)”. 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo. Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su. Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. 1.2.2. Yêu cầu Nhận dạng được các triệu chứng đặc trưng của bệnh và phân biệt được bệnh gây ra bởi nấm C. cassicola với một số bệnh khác trên cây cao su; Phân lập nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Nắm vững phương pháp lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá cắt rời bằng cách nhỏ giọt bào tử nấm và phương pháp đánh giá mức độ cảm nhiễm của mẫu lá sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm. 3 Nắm vững phương pháp ly trích, đo hoạt tính POD và cách vận hành các thiết bị và máy móc phục vụ cho thí nghiệm. Nắm vững phương pháp đếm khí khổng. 1.3. Giới hạn đề tài Thời gian thực tập ngắn (từ tháng 03/03/2007 – 30/07/2007), cũng như hạn chế về điều kiện thí nghiệm nên một số thí nghiệm chỉ tiến hành ở mức độ khảo sát. Mặt khác, các nghiên cứu về mối quan hệ giữa enzyme và tính kháng cũng như mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với bệnh trên cây cao su đã được nghiên cứu ở một số nước. Tuy nhiên, đây là lần đầu tiên phương pháp này được áp dụng tại VNCCSVN. Do đó, phương pháp chỉ được thực hiện trên một số lượng ít dvt. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây cao su 2.1.1. Cây cao su và tầm quan trọng của nó Cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là cây công nghiệp nhiệt đới thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae) và là loại cây sản xuất cao su thiên nhiên chính hiện nay trên thế giới (Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991). Ngay từ khi Columbo, nhà thám hiểm người Bồ Đào Nha, khám phá ra châu Mỹ đã thấy người thổ dân bản xứ sử dụng mủ cao su trong một số hoạt động sinh hoạt hàng ngày của họ. Đến năm 1736, Charles de Condamine – người Pháp phát hiện cây cao su ở lưu vực sông Amazon – Nam Mỹ. Năm 1939, Charles Goodyear đã phát hiện phương pháp “lưu hóa” mủ cao su làm tăng tính năng tác dụng của cao su rất lớn (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Sau nhiều lần cố gắng du nhập cây cao su từ Nam Mỹ sang các nước Á và Phi đều thất bại. Năm 1876, Henry Wickham, nhà thám hiểm người Anh, đã thành công trong việc đưa cao su phát triển ở nhiều vùng trên thế giới, chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như một loại cây trồng độc canh. Cho đến nay nó đã và đang góp phần rất lớn vào nguồn xuất khẩu và tạo công ăn việc làm cho người lao động, đặc biệt là ở khu vực Đông Nam Á (Phan Thành Dũng, 2004). Từ năm 1910, cây cao su phát triển rất mạnh và nhanh ở nhiều nơi, tập trung chủ yếu ở các nước như Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Trung Quốc… (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Cây cao su được đưa vào trồng ở nước ta nhờ công của Bác sĩ Yersin. Vào năm 1897, những hạt cao su đầu tiên đưa về được trồng tại Suối Dầu, Nha Trang. Đến đầu thế kỷ 20, những đồn điền cao su được thiết lập tại Gia Định và một số nơi ở Đông Nam Bộ. Đến thập niên 50, một số diện tích cao su cũng định hình tại 5 Tây Nguyên. Diện tích cao su nước ta đạt khoảng 492.000 ha vào năm 2006 và dự kiến đạt 700.000 ha vào năm 2010 (Phan Thành Dũng, 2004). Sản lượng cao su thiên nhiên của Việt Nam đã tăng vượt bậc, từ 220.000 tấn năm 1996 lên 560.000 tấn năm 2006 (Nguồn: Xuất khẩu cao su Việt Nam dự báo sẽ tăng 7 – 10% đạt 750.000 – 780.000 tấn trong năm 2007 (Nguồn: Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày cho sản lượng mủ cao, phẩm chất mủ tốt nhất trong các loại cây có nhựa mủ. Cao su là một trong bốn nguyên liệu cơ bản của nền công nghiệp hiện đại (than đá, gang thép, dầu hỏa, cao su). Cao su vốn là hydratcacbon cao phân tử (C5H8), là chất dẻo có độ bền cơ học cao, tính đàn hồi lớn. Gỗ cao su được dùng làm ván ép, đồ gia dụng, bàn ghế và nguyên vật liệu chế biến giấy. Hạt cao su có chứa tinh dầu, tỷ lệ khoảng 47% trọng lượng hạt, được dùng làm sơn mài, xà phòng, chế biến nhựa dán gỗ. Ngoài ra, nó còn đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ đất và làm cân bằng hệ sinh thái, phủ xanh đồi núi trọc, tăng độ ẩm không khí, chắn gió và qua quang hợp làm sạch bầu không khí... (Tổng Công ty Cao su Việt Nam, 2005). 2.1.2. Tình hình bệnh hại trên cây cao su Cây trồng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công như virus, nấm, côn trùng… Trong đó, khoảng hơn 250.000 loài nấm có khả năng gây bệnh cho cây (Nguồn: .daff.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009/146925/management_of_plant_pathogen_collec tions_vietnamese.pdf). Cây cao su được trồng chủ yếu trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa phong phú nên bị rất nhiều loại bệnh gây hại, nhất là những loại bệnh do nấm gây ra. Chúng có thể gây hại trên tất cả các bộ phận của cây như lá, cành, thân và rễ. Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công. Nguyễn Hải Đường (1997), ở Việt Nam, cây cao su bị 24 loại bệnh hại (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2004). Đến năm 2006, P. T. Dung và ctv cho biết có 8 loại bệnh cao su chính gây ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng và sản lượng cây cao su trong nước bao 6 gồm bệnh phấn trắng, bệnh héo đen đầu lá, bệnh rụng lá mùa mưa, bệnh Corynespora, bệnh nấm hồng, bệnh loét sọc mặt cạo, bệnh nứt vỏ, bệnh rễ nâu. Trong các loại sinh vật và vi sinh vật gây bệnh cho cây cao su, bệnh lá do nấm gây ra được xem là một trong những tác nhân gây thiệt hại lớn nhất. Chúng không chỉ làm giảm sản lượng mà còn làm giảm cả chất lượng mủ. Đặc biệt là bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz) gây ra, bệnh phấn trắng do nấm Odium hevea Steinm gây ra. Nghiêm trọng nhất là bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei. gây ra. Loài nấm này có khả năng gây hại quanh năm trên mọi tuổi lá, mọi giai đoạn sinh trưởng của cây. Là một trong những nguyên nhân làm cây chậm phát triển, kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản thêm 1 – 2 năm và ảnh hưởng trực tiếp làm giảm sản lượng mủ từ 20 – 30% đối với vườn khai thác (Bộ môn BVTV, 2006). 2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola 2.2.1. Phân loại học Đặc điểm chung của nấm gây hại cho cây trồng là tế bào có nhân thực (Eucaryotae), cơ quan sinh trưởng có cấu tạo dạng sợi, sinh sản bằng bào tử, sống dị dưỡng, không có diệp lục. Nấm có thành phần loài rất phong phú (Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998). Nấm gây bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su có hệ thống phân loại như sau: Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Dothideomycetes Lớp phụ: Pleosporomycetidae Bộ: Pleosporales Họ: Corynesporascaceae Giống: Corynespora Loài: Corynespora cassiicola (Nguồn: 7 2.2.2. Đặc điểm hình thái Chee (1988), kích thước trung bình của đính bào tử phân lập từ cây cao su (H. brasiliensis) là 64,4 x 5,52 µm (23,42 – 132,6 x 2,60 – 7,80 µm). Bào tử nảy mầm tạo ra một hoặc nhiều ống mầm giữa các vách ngăn, nhưng các ống mầm thường mọc nhiều ở các tế bào tận cùng của bào tử. P. T. Dung (1995; 2004), đã ghi nhận sự biến thiên về kích thước và hình dạng của đính bào tử phân lập từ lá cao su bị nhiễm bệnh ngoài tự nhiên và nuôi cấy trên môi trường Potato Sucrose Agar (PSA). Chiều rộng trung bình của đính bào tử và cuống bào tử lớn hơn và số vách ngăn trung bình nhiều hơn. Đính bào tử phân lập từ lá cao su thường dài, thon và có hình que trong môi trường nuôi cấy nhưng có đáy hơi rộng. Theo Spencer và Walters (1969), sự khác nhau về hình thái học một phần phụ thuộc vào sự sống khác nhau ở mức độ loài. Các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các ký chủ khác nhau có sự khác biệt rất lớn về đặc điểm nuôi cấy. 2.2.3. Đặc điểm sinh lý Theo Sarma và Nayudu (1970), C. cassiicola phát triển và hình thành bào tử tốt trên môi trường PSA. Vào năm 1974, Onesirosan và ctv đã tìm thấy điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của C. cassiicola là 28ºC. Ở 32 – 36ºC nấm phát triển chậm và khuẩn lạc hình thành không đều. P. T. Dung (1995), C. cassiicola phân lập từ cây cao su nảy mầm trên môi trường PSA nhiều hơn trên môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) và Rubber Leaf Extract Agar và điều kiện nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 28ºC. Chee (1988) cho rằng C. cassiicola phân lập từ cây cao su (H. brasiliensis) nuôi trên môi trường PSA được đặt trong bóng tối 3 ngày sau đó đặt dưới ánh sáng 3 ngày ở 26ºC thì bào tử đính hình thành nhiều hơn. Ẩm độ thích hợp nhất để phân lập C. cassiicola là 90%. Tuy nhiên, sự hình thành bào tử vẫn xảy ra ở ẩm độ 80, 90 và 100% (Mushrif, 2006). 2.2.4. Khả năng tồn tại Pernezny và Simone (1993), C. cassiicola là tác nhân gây ra bệnh đốm lá trên các loại cây trồng bằng cách sống và lan truyền mầm bệnh trên đồng ruộng. Nó có thể sống tới 2 năm trên xác bã cây trồng phổ ký chủ rộng. Ở các vườn trồng cao 8 su, sự có mặt của các loại cỏ giúp tăng sự sống của mầm bệnh và kiểm soát các loại cỏ có thể giảm bớt được sự tác động của bệnh. Tuy nhiên, chúng có thể sống trên tất cả các bộ phận của cây cao su bị nhiễm bệnh và xác bã cây trồng tiềm tàng dưới dạng sợi nấm có màu nâu đậm. Đặc điểm này góp phần quan trọng trong thiết lập hệ thống bảo vệ và điều chỉnh việc kiểm soát nhằm giảm sự tích lũy nguồn bệnh. Năm 2004, Anonymous đã công bố rằng C. cassiicola có thể sống trên xác bã và hạt đậu nành trên đất bỏ hoang hơn 2 năm. Nấm có thể sống trên các loại cây trồng còn sót lại trên đồng ruộng cũng như trên xác bã cây trồng và xác bã giun tròn (trích dẫn bởi Mushrif, 2006). Bào tử có khả năng tồn tại trong đất với thời gian dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 tháng (Phan Thành Dũng, 2004). P. T. Dung (1995), C. cassiicola phân lập từ cây cao su là loại gây bệnh chuyên biệt trên cây cao su và không gây bệnh trên lá cây tiêu, đu đủ và cà chua. 2.2.5. Khả năng phát tán Theo Peries và Liyanage (1987), trên cây cao su, C. cassiicola tạo số lượng bào tử lớn với các vách ngăn nằm ngang (trung bình là 2 – 16 vách ngăn) và xác định chu kỳ ngày đêm của sự phóng thích bào tử, bắt đầu vào lúc 6 giờ sáng, dễ nhận thấy nhất là vào khoảng 10 – 11 giờ, vào ban đêm thì bào tử phóng thích ít hoặc không có sự phát tán (trích dẫn bởi Mushrif, 2006). Theo Phan Thành Dũng (2004), bào tử phóng thích cao điểm vào lúc 8 – 11 giờ. Thời gian sau khi mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất. Sự phóng thích bào tử và sự lan truyền mầm bệnh từ nguồn đã biết, đã chỉ ra rằng bào tử không có khả năng di chuyển xa; có thể do kích thước của chúng lớn và tương đối nặng. Đây có thể là nguyên nhân mà bệnh lan truyền chậm giữa các khu vực cách xa nhau (Mushrif, 2006). 2.2.6. Con đƣờng xâm nhập, phạm vi phân bố, phổ kí chủ và khả năng gây bệnh của nấm C. cassiicola Vi sinh vật xâm nhập vào cây trồng qua 3 con đường chủ yếu: qua "lỗ mở" tự nhiên, qua vết thương, vết trầy xước trên cây và do chính vi sinh vật tự có cơ chế 9 để xuyên thủng tầng cutin, cellulose vào tế bào thực vật. Rất nhiều vi sinh vật xâm nhập vào cây chủ qua lỗ khí, khí khổng, qua các lỗ mở trên hoa hay xâm nhập vào hạt phấn (hạt phấn thụ tinh sẽ đem theo cả vi sinh vật vào hợp tử mới). Một số vi sinh vật như nấm bệnh Magnaporthe grisea hay Botrytis cinerea sử dụng cơ chế riêng với appressorium để xuyên thủng lớp bảo vệ cutin, cellulose và xâm nhập vào tế bào chủ (Nguồn: Theo Phan Thành Dũng (2004), nấm C. cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng, ngoài ra nấm còn tiết ra enzyme (cellulase) giúp phân hủy màng tế bào. Ngoài cây cao su, nấm còn là ký sinh của trên 150 loại cây trồng thuộc nhiều họ khác nhau trên 80 nước thuộc nhiều vùng khí hậu từ nhiệt đới đến ôn đới và có khả năng gây hại trên tất cả các bộ phận của cây từ lá đến rễ. Chưa có ghi nhận nấm từ cây cao su gây hại cho cây khác và ngược lại (Phan Thành Dũng, 2000). 2.3. Giới thiệu về bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su 2.3.1. Lịch sử phát hiện Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su gây ra bởi nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei., xuất hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (Châu Phi) năm 1949, tiếp theo lần lượt ghi nhận tại Ấn Độ năm 1958; Malaysia năm 1961; Nirgeria năm 1968; Thái Lan, Sri Lanka và Indonesia năm 1985; Brazil và Bangladesh năm 1988 (Phan Thành Dũng, 2004), gần đây nhất tại Trung Quốc năm 2007 (Jinji và ctv, 2007). Tại Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào tháng 8 năm 1999 tại Trạm thực nghiệm Cao Su Lai Khê – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (P. T. Dung và N. T. Hoan, 2000). Tuy thời gian xuất hiện tại Việt Nam chưa lâu và được xem là loại bệnh mới nhưng có tầm quan trọng vì nấm có khả năng gây hại quanh năm trên mọi tuổi lá, mọi giai đoạn sinh trưởng của cây. Là một trong những nguyên nhân làm cây chậm phát triển, kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản thêm 1 – 2 năm và ảnh hưởng trực tiếp làm giảm sản lượng mủ từ 20 – 30% đối với vườn khai thác. Ở nước ta, mức độ và phạm vi tác hại của bệnh đã gia tăng đáng kể. Năm 2005 và 10 2006, bệnh rụng lá Corynespora gây hại trên một số dvt cao sản được trồng tại nhiều công ty cao su ở vùng Đông Nam Bộ như Đồng Nai, Phú Riềng, Phước Hoà… Nếu không được quan tâm đúng mức, ngăn chặn kịp thời thì bệnh có nhiều khả năng sẽ bùng phát trở thành mối nguy hại cho ngành cao su trong tương lai không xa (Phan Thành Dũng, 2006). 2.3.2. Triệu chứng của bệnh Corynespora trên cây cao su 2.3.2.1. Trên vƣờn ƣơm Triệu chứng bệnh trên cây con thường gặp là các đốm tròn, rất hiếm khi có sự bất thường về hình dạng và kích thước vết bệnh trên phiến lá có đường kính biến thiên từ 1 – 8 mm. Ở tâm của các vết bệnh mỏng như giấy có màu trắng nâu hoặc nâu nhạt, có viền màu nâu đậm và được bao quanh bởi quầng vàng, sự phân hủy lục lạp tại trí trung tâm đôi khi dẫn đến hình thành lỗ (Jacob, 2006). Ở cây con, hầu hết các lá non mới hình thành đều bị mầm bệnh này tấn công và chúng làm cho đầu lá bị quăn lại do các đốm bệnh và gây ra sự rụng lá. Bệnh xảy ra vào cuối mùa khô và gây rụng lá nghiêm trọng (Rajalakshmy và Kothandaraman, 1996). Đối với cây thực sinh, mầm bệnh tấn công trên các lá non và gây rụng lá. Quá trình rụng lá liên tục và ra lá mới ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Cây thực sinh trong giai đoạn vườn ươm bị nhiễm bệnh thường chậm phát triển và không đạt được đường kính gốc ghép đúng thời hạn. Đối với cây thực sinh phát triển trong bầu, vết bệnh có hình tròn hoặc không có hình dạng nhất định và chúng có kích thước rất biến thiên (Jayasinghe, 2000). Các triệu chứng đốm lá đã mô tả thường gặp ở cây con bị nhiễm bệnh nhẹ đến trung bình. Dạng bệnh nặng là nguyên nhân làm cho lá non bị rụi trên cây thực sinh và bầu đã ghép. Sự nhiễm bệnh xảy ra trong suốt thời gian từ cuối thời kỳ lá có màu nâu rủ đến đầu thời kỳ lá có màu xanh nhạt, nếu điều kiện thời tiết khô hạn thì sẽ xảy ra hiện tượng cháy lá vài ngày. Nếu bệnh xảy ra ở cuống lá và đế cuống lá sẽ làm cho lá non bị khô. Lá bị rụi vẫn có thể ở lại trên cây vài ngày trước khi rụng. Những lá non khô mỏng như giấy bị rụi vẫn có thể nhìn thấy được từ xa và dễ dàng xác định 11 được những cây bị ảnh hưởng nặng trong vườn ươm. Trên vườn cây gỗ ghép, triệu chứng bệnh thường gặp là các đốm trên lá. Tuy nhiên, thỉnh thoảng vẫn bắt gặp triệu chứng cháy rìa lá hay rụng lá. Trên lá bánh tẻ bị nhiễm bệnh, thường gặp các vết bệnh có đường tròn điển hình hoặc không theo quy luật với tâm vết bệnh mỏng như giấy có viền nâu và quầng vàng bao quanh. Ngay cả lá già cũng bị nhiễm bệnh nhưng các vết bệnh thường rất nhỏ. Ngoài triệu chứng cháy rìa lá và các vết thương, triệu chứng thường gây rụng lá là các gân lá chuyển sang màu nâu đậm được mô tả như đường ray xe lửa hay xương cá. Những triệu chứng này xuất hiện do nấm tiết ra độc tố tại vị trí nhiễm, độc tố lan dọc theo các gân lá và làm đổi màu của gân lá. Vì độc tố lan nhanh hơn sợi nấm nên nó phá hủy mô và hạn chế sự phát triển của nấm. Nếu bị nhiễm nấm trên gân chính, lá non bị biến dạng và sau đó rụng đi, nếu nhiễm trên gân phụ thì sự tồn tại của lá non tùy thuộc vào mức độ nhiễm và tạo ra hình dạng đường ray xe lửa (hay xương cá). Bệnh nặng làm cho chồi ngọn bị chết, chồi ở giai đoạn hóa nâu dễ bị tấn công hơn. Chồi ở giai đoạn xanh nhạt thỉnh thoảng mới bị nhiễm bệnh nhưng khi chồi đã xanh đậm hoặc nâu và trưởng thành thì ít nhiễm bệnh hơn và triệu chứng bệnh chỉ có dạng đốm. Cây con bị nhiễm bệnh thường yếu và còi cọc. Nấm phát triển mạnh trên vùng đất có ẩm độ cao và có thể tồn tại đến mùa mưa năm sau. Cây bị nhiễm nặng có thể không đủ dinh dưỡng dự trữ để ra lá mới và do đó làm cho cây chết khô (Jacob, 2006). 2.3.2.2. Trên vƣờn khai thác Bệnh Corynespora trên vườn khai thác được biết đến như một đại dịch từ hai thập kỷ trở lại đây. Trong suốt mùa bệnh, vùng bị bệnh được ghi nhận là các lá non bị khô với nhiều vết tròn làm cho cây bị rụi lá tới rụng toàn bộ lá. Cành bị rụng lá có dạng tương tự như các sừng hươu (stag – horn). Mùa bệnh bắt đầu với sự xuất hiện của nhiều vết tròn hoặc không tuân theo quy luật trên các lá non có màu xanh nhạt mọc sau mùa đông. 12 Bệnh nhiễm trên lá bánh tẻ tạo ra các vết bệnh lớn xuất hiện trên phiến lá như các vết màu nâu nhạt có viền màu nâu đậm và được bao quanh bởi quầng màu vàng. Đôi khi ta có thể thấy ở tâm của vết bệnh có các vòng tròn đồng tâm. Trên gân lá, chúng ta dễ nhận thấy dạng xương cá có chiều dài từ vài mm đến cm. Gân chính và gân phụ đều có thể bị nhiễm. Nếu các cuống lá, gân phụ hoặc gân chính ở đế lá non bị nhễm bệnh thì lá bị rụng chỉ trong vòng 2 ngày. Trong một số trường hợp, lá non vẫn có thể tồn tại lâu hơn và nếu bệnh không nặng thì trên lá sẽ xuất hiện nhiều lỗ (do sự chết của mô bệnh). Khi nhiễm trên lá trưởng thành, triệu chứng dễ nhận thấy là xương cá. Khi bệnh nặng sẽ tạo ra nhiều đốm và lá chuyển thành màu vàng, sau đó chuyển sang màu nâu đồng và cuối cùng có thể bị rụng. Một số lá biến dạng tạo lỗ trên vết bệnh trong một khoảng thời gian dài và cuối cùng là bị rụng. Lá trưởng thành với các vết bệnh rất nhỏ thì có thể tồn tại đến khi rụng lá qua đông. Ngoài phiến lá, cuống lá và chồi của cây trưởng thành cũng bị nhiễm bệnh. Trên cuống lá vết bệnh xuất hiện dạng đường sọc màu nâu có chiều rộng và dài rất khác nhau. Ở phần thân còn xanh, nấm tấn công làm nứt vỏ cây. Bệnh nặng làm cho chồi bị khô. Chồi khô vẫn có thể tồn tại trên cây, dạng triệu chứng như vậy gọi là dạng sừng hươu. Nấm có thể tồn tại trên chồi đến năm sau và bắt đầu gây bệnh trên lá mới mọc. Thân cây gãy rơi xuống đất cũng là nguồn gây bệnh (Jacob, 2006). 2.3.3. Khả năng hình thành nòi mới Nấm hình thành nhiều nòi nên vượt qua tính kháng của một số dvt cũng như đáp ứng khác nhau với thuốc trừ nấm (Jayasinghe và Silva, 1996; Jayasinghe, 2000). Nòi mới hình thành dựa trên 3 yếu tố sau: Đáp ứng với điều kiện địa lí. Đáp ứng với cây ký chủ khác. Đáp ứng với dvt cao su. Trong đó yếu tố đầu và cuối có vai trò quan trọng bằng mức độ gây hại của nấm với cao su tại từng vùng (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2000). Theo Phan Thành Dũng (2004), đã có 6 nòi nấm gây hại cho cây cao su. 13 2.3.4. Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về phƣơng pháp tuyển non dvt cao su Theo Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật (2006), cho đến nay đã có một số phương pháp tuyển non như sau: Wastie (1973), đề ra phương pháp xây dựng vườn kiểm định bệnh đánh giá mức độ mẫn cảm của các dvt mới với bệnh lá. Lim (1972), giới thiệu kỹ thuật lây nhiễm bệnh trên lá cắt rời được thực hiện ở điều kiện phòng thí nghiệm mục đích đánh giá tính mẫn cảm của các dvt cao su đối với nấm Oidium heveae Steinm, dựa trên mật độ ra bào tử. Đây là một phương pháp nhanh, có hệ thống trong việc tuyển chọn giống in vitro kháng bệnh. Năm 1988, Chee xây dựng phương pháp đánh giá bệnh rụng lá Corynespora bằng cách điều tra, theo dõi chặt chẽ bệnh trên vườn kiểm định bệnh và lá cắt rời. Hiện nay các phương pháp tuyển non dvt với các bệnh lá được áp dụng phổ biến ở các nước trồng cao su. Phan Thành Dũng và ctv sử dụng phương pháp in vivo kết hợp với điều tra 86 dvt trên vườn kiểm định bệnh tại An Lộc – Đồng Nai từ năm 2000 – 2005. Kết quả cho thấy có sự tích lũy bệnh vì tỷ lệ và mức độ bệnh của các dvt trên tăng dần theo thời gian. 2.4. Sơ lƣợc về enzyme 2.4.1. Định nghĩa Enzyme là chất xúc tác sinh học, do tế bào sống tổng hợp nên, có tác dụng điều chỉnh tốc độ và tính đặc hiệu của phản ứng hoá học xảy ra trong tế bào, mà không làm ảnh hưởng đến hướng phản ứng và sự cân bằng phản ứng. Enzyme làm giảm năng lượng hoạt hoá cần cho phản ứng thực hiện (Lê Ngọc Thông và HuỳnhTiến Dũng, 2003). 2.4.2. Tính đặc hiệu Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 14 2.4.3. Cơ chế tác động Bản chất của cơ chế tác động bởi enzyme trong phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Cơ chất tương tác với nhau do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn tới cơ chất trở nên dễ dàng tham gia vào các phản ứng hơn. Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme và cũng nhỏ hơn so với các phản ứng được xúc tác bởi các chất xúc tác khác. Quá trình xúc tác xảy ra qua 3 giai đoạn: E + S → ES → P +E Trong đó: + E: enzyme. + S: cơ chất. + P: sản phẩm. Ở giai đoạn thứ nhất: enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền. Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng. Ở giai đoạn thứ hai: cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị. Ở giai đoạn thứ 3: sản phẩm tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do (Nguyễn Đức Lượng, 2001). 2.4.4. Các nhân tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme Enzyme rất nhạy cảm với nhiều nhân tố: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH, chất kìm hãm, các anion. 2.4.5. Một số phƣơng pháp xác định hoạt tính của enzyme Theo Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa (2006), để phân tích hoạt độ enzyme có thể tiến hành bằng một trong hai cách là phân tích liên tục và phân tích gián đoạn. Tuy nhiên, dù phân tích theo cách nào thì cũng phải dựa trên nguyên tắc 15 chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme đó là phân tích sự biến đổi theo thời gian trong những điều kiện phản ứng xác định của cơ chất còn lại, hoặc sản phẩm tạo thành, hoặc cả cơ chất và sản phẩm. Phân tích liên tục Là phương pháp đo cơ chất bị biến đổi hay sản phẩm tạo thành một cách liên tục theo thời gian. Dựa vào sự hấp thụ ánh sáng của cơ chất ở bước sóng , người ta có thể tiến hành phản ứng trong một cuvette và đo sự biến đổi của cơ chất bằng quang phổ kế theo thời gian ngay từ khi bổ sung enzyme vào dung dịch phản ứng có chứa sẵn cơ chất, hay bổ sung cơ chất vào hỗn hợp đã chứa sẵn enzyme. Phương pháp đo liên tục thường hay áp dụng khi không có chất, hay cách làm ngừng phản ứng thích hợp hoặc được áp dụng đối với một số enzyme dễ bị mất hoạt tính xúc tác ở điều kiện phân tích. Ngoài ra, các phương pháp phân tích liên tục còn được dùng phổ biến với các nghiên cứu động học enzyme. Tuy nhiên, yêu cầu đối với thiết bị đo là phải có bộ phận ổn định nhiệt để phản ứng có thể được thực hiện ở các nhiệt độ mong muốn. Đây cũng là một hạn chế của phương pháp. Ngoài ra, phải theo dõi sự biến đổi của chất phản ứng một cách liên tục nên khó có thể thực hiện phân tích hoạt độ của nhiều mẫu enzyme trong cùng một lúc. Phân tích gián đoạn Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì làm ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành. Đây là cách được sử dụng phổ biến nhấttrong các phân tích hoạt độ enzyme hiện nay. Để làm ngừng phản ứng enzyme có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt như nhiệt độ cao, thay đổi pH (bổ sung acid hoặc kiềm), dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp phản ứng… Phương pháp này khắc phục được những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể ổn nhiệt, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu… Tuy vậy, vấn đề là phải tìm ra cách làm ngừng phản ứng thích hợp. 16 Dựa trên nguyên tắc xác định hoạt độ enzyme bằng cách đo liên tục hay gián đoạn, hoạt độ enzyme có thể xác định theo một hay một số phương pháp chính sau đây: Phương pháp đo độ nhớt. Phương pháp phân cực kế. Phương pháp đo áp suất hay áp kế. Phương pháp quang phổ kế. Phương pháp chuẩn độ. Phương pháp sắc ký. Phương pháp hoá học. Phương pháp phóng xạ. Phương pháp huỳnh quang. Tuỳ theo các đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp phân tích, yêu cầu về độ chính xác của phép đo cũng như điều kiện của phòng thí nghiệm mà có thể lựa chọn cách xác định nào là thích hợp nhất. Tuy vậy cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian, bởi vì có các trường hợp, hoạt độ enzyme cần xác định có thể rất thấp, sự chuyển hoá cơ chất vốn phải có ở mức bão hoà có thể xảy ra nhưng rất khó đo được một cách chính xác. Khi đó, sự xuất hiện của sản phẩm phản ứng được xác định bằng những cách đo đặc hiệu, cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách đáng tin cậy. 2.4.6. Sơ lƣợc về enzyme liên quan đến tính kháng bệnh ở thực vật Để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó. Ký chủ có thể gia tăng thành tế bào của chúng bằng cách hình thành thêm thành tế bào, lignin… và tạo ra các hợp chất kháng vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp như phenol, quinone, alkaloid. Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Các enzyme này thường xuất hiện dưới các dạng đồng hình khác nhau và thường liên quan đến quá trình tổng hợp các chất phòng vệ hoặc có tác động trực tiếp đến sự kháng khuẩn. Nhiều loại PR proteins (Pathogenesis Related Proteins) được xem như là enzyme. Khi không có sự xuất hiện của các chất từ sự nhiễm bệnh thì sự hoạt động của các enzyme này sẽ bị ức chế. PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh thì chúng mới có biểu hiện kháng. Một số PR proteins điển hình là -1,3-glucanase, chitinase, peroxidase, polyphenol oxidase… (Joseph, 2006). 17 2.4.7. Một số nghiên cứu về enzyme phòng vệ của cây cao su Breton và ctv (1996), hoạt tính -1,3-glucanase khác nhau giữa các dòng vô tính khác nhau: GT 1, PB 235 và PB 260. Đồng thời ông cũng nhận thấy hoạt tính peroxidase cao hơn trong dòng kháng GT 1 và hoạt tính của chitinase của dvt GT 1 cũng tăng lên trong khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora. Hoạt tính của enzyme -1,3-glucanase của dvt GT 1 cũng được ghi nhận là tăng lên sau 24 tới 96 giờ lây bệnh Corynespora nhân tạo (Philip và ctv, 2001). Năm 2006, Kurma và Jacob đã nghiên cứu sự thay đổi của các enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ trên cả dvt cao su cảm nhiễm (RRII 105 và PB 260) và kháng (RRIM 600 và GT 1) khi chủng bệnh Corynespora và thấy rằng hoạt tính của enzyme oxy hoá liên quan đến khả năng phòng vệ ở các dòng kháng cao hơn ở các dòng cảm nhiễm. 2.4.8. Peroxidase 2.4.8.1. Sơ lƣợc về peroxidase Dunford và Stillman (1976); Gray và Montgomery (1997) đã cho rằng peroxidase (POD) là enzyme oxy hoá khử phân bố rộng khắp mà sử dụng hydrogen POD hoặc các hydroperoxide hữu cơ như là các chất oxy hoá. Phần lớn POD là các glycoprotein chứa liên kết N – oligosaccharide (Miranda và ctv dẫn nhập, 2003). Theo Chatchamon Daengkanit và Wallie Suvachittanont (2005), peroxidase là một hemeprotein xúc tác oxy hoá electron của các cơ chất khác nhau (phenol, các amine thơm) bởi H2O2. Heme peroxidase tồn tại ở nhiều nơi trong tự nhiên với nhiều chức năng sinh lý học và đã được phân thành 3 lớp dựa vào trình tự amino acid của chúng. Lớp I bao gồm các peroxidase nội bào, đó là cytochrome c peroxidase, ascorbate peroxidase. Lớp II chứa các enzymes kích thích sự bài tiết của nấm, như là manganese peroxidase và lignin peroxidase. Lớp thứ III bao gồm các peroxidase kích thích bài tiết của thực vật. Johann Putter (1974), thuật ngữ peroxidase (POD) trong nó mang một ý nghĩa rộng lớn bao gồm một nhóm enzyme chuyên biệt như NAD – POD, NADP – POD, acid béo – POD, cytochrome – POD và glutathione – POD cũng 18 như một nhóm enzyme không chuyên biệt từ các nguồn khác nhau, mà chúng được biết đến nhiều nhất là POD. POD xúc tác phản ứng khử hydro của một số lượng lớn các hợp chất hữu cơ như phenol và các amine thơm, các hydroquinone, các amine dehydroquinone, các dẫn xuất của benzidine. Đặc biệt là o-toluidine, guaiacol... 2.4.8.2. Vai trò của peroxidase đối với cây cao su Theo Geiger và ctv (1989), hoạt tính peroxidase tăng lên khi cây chịu nhiều loại stress khác nhau. Ví dụ như bị tổn thương, sốc nhiệt hoặc sốc thẩm thấu và ô nhiễm không khí. Phản ứng này đã được nghiên cứu trong trường hợp nhiễm bệnh nơi mà thường xuyên liên quan đến kích thích hoạt tính POD để kháng lại mầm bệnh. Trong trường hợp này, peroxidase được xem là nhân tố điều khiển bước cuối cùng của quá trình sinh tổng hợp lignin bằng cách tạo chất đồng trùng hợp cinnamyl alcohol dẫn đến sự gỗ hoá của mô tăng cao bất thường. Phản ứng lignin hoá này có thể hạn chế sự xâm nhiễm của mầm bệnh và sự phát triển mầm bệnh trong mô. POD liên quan đến sự hóa gỗ của thành tế bào và trong quá trình biến dưỡng của sự oxy hoá hormone thực vật indole-3-acetic acid (IAA). Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn cơ chế tấn công của mầm bệnh, giúp chống mặn và giảm stress. Trong cây cao su, POD được tìm thấy nhiều ở gần lớp võ cây, có thể ngăn chặn được các vết thương (Daengkanit và Suvachittanont, 2005). Joseph và ctv (2006), POD là một enzyme quan trọng tìm thấy trong thực vật. Nó đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp lignin và nó được biết đến như là chất xúc tác cho quá trình oxy hoá của mono và diphenol, các amine thơm để tăng độc tố quinone khi có sự hiện diện của hydrogen. POD được xem là độc tố của vi sinh vật. 2.5. Sơ lƣợc về khí khổng 2.5.1. Cấu tạo Tế bào bảo vệ có một nhân lớn và nhiều lục lạp bé. Nó là tế bào biểu bì duy nhất có lục lạp ở cây sống trên cạn. Vách nối giữa tế bào bảo vệ với tế bào phụ mỏng và sự dẫn truyền giữa chúng không cần sự có mặt của sợi liên bào. Tế bào bảo vệ dính với tế bào phụ và treo lơ lửng trên xoang dưới lỗ khí. 19 Hình 2.1: Cấu tạo khí khổng (Nguồn: và Tế bào bảo vệ dạng elip có vách phía bụng hóa dày nằm sát lỗ, vách phía lưng mỏng nằm xa lỗ. Toàn bộ bộ máy lỗ khí được phủ bằng một lớp cutin dày nên ngăn sự mất nước khỏi tế bào bảo vệ (Nguyễn Ngọc Trì, 2005). 2.5.2. Sự phân bố Theo Phạm Thị Lộc (2002), khí khổng gặp ở lớp biểu bì của tất cả các cơ quan, trừ rễ. Tuy nhiên, theo Nguyễn Ngọc Trì (2005), khí khổng có ở tất cả thực vật bậc cao, hầu hết ở thực vật bậc thấp (rêu, dương xỉ) ngoại trừ các cây thủy sinh mọc trong nước. Ở khỏa tử và bí tử, khí khổng có hầu hết ở các bộ phận cơ quan trên không như lá, thân, hoa, quả mặc dù trong vài trường hợp khí khổng không hoạt động. Kích thước, số lượng và sự phân bố khí khổng tùy thuộc rất nhiều vào loài, vào vị trí lá, vị trí trên từng bản lá, bội thể và điều kiện sống. Thông thường trên mỗi mm2 lá có 20 – 400 khí khổng. Tuy nhiên đôi khi có đến 1.000 khí khổng/mm2 hoặc hơn nữa. Lá của các loại thân thảo một lá mầm như họ hòa bản thường mang khí Vách mỏng Lỗ khí Tế bào bảo vệ Nhân Lục lạp Không bào Tế bào thịt lá Xoang dưới lỗ khí Tế bào bảo vệ Tế bào phụ Lỗ khí Tế bào biểu bì 20 khổng bằng nhau ở cả hai mặt lá. Ở loài thân thảo hai lá mầm, số lượng khí khổng ở mặt dưới lá nhiều hơn mặt trên. Hầu hết cây thân gỗ hai lá mầm khí khổng chỉ có ở mặt dưới lá trong khi ở các lá nổi trên mặt nước ở những loài cây thủy sinh thì khí khổng chỉ có ở mặt trên của lá, lá chìm trong nước thường không có khí khổng. Trong phần lớn trường hợp, khí khổng phân bố rải rác ngẫu nhiên trên phiến lá. Tuy nhiên, ở cây một lá mầm với lá có hệ mạch dẫn chạy song song, khí khổng được sắp xếp thành hàng nằm giữa các mạch dẫn. 2.5.3. Vai trò của khí khổng đối với thực vật Khí khổng là con đường chủ yếu xâm nhập CO2 trong quang hợp và là con đường chủ yếu trong thoát hơi nước. 2.5.4. Chu kỳ đóng mở ngày đêm của khí khổng Nét đặc trưng quan trọng của khí khổng là nó mở khi phản ứng với ánh sáng và đóng lại trong tối. Cũng có khi lỗ khí đóng lại một phần hay hoàn toàn giữa ngày khi cây bị mất nước nghiêm trọng, lá bị héo. Ngoại trừ cây mọng nước như xương rồng thì lỗ khí mở suốt đêm và đóng lại suốt ngày (Nguyễn Ngọc Trì, 2005). Cây cao su là loại thực vật bậc cao nên cơ chế đóng mở khí khổng của chúng cũng tương tự như các loại thực vật khác. Khí khổng mở ra khi phản ứng với ánh sáng và đóng lại trong tối, đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho mầm bệnh xâm nhập qua khí khổng khi chúng mở ra. Theo Phan Thành Dũng (2004), bào tử C. cassiicola phóng thích cao điểm vào lúc 8 – 11 giờ. Mặt khác, đây cũng là thời điểm khí khổng mở ra nên rất thuận lợi cho nấm C. cassiicola xâm nhập. Hình 2.2: Cấu tạo mở và đóng của khí khổng (Nguồn: 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Từ tháng 03/03/2007 đến 30/07/2007. 3.1.2. Địa điểm Địa điểm lấy mẫu: Vườn Dự án giống cao su Quốc gia và Vườn Sơ tuyển 03 – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) tại Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. 3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu lá cao su của một số dvt bị nhiễm bệnh Corynespora và mẫu lá hoàn toàn sạch bệnh. Mẫu lá được sử dụng trong tất cả các thí nghiệm là khoảng 10 – 12 ngày tuổi. 3.2. Phƣơng pháp tiến hành 3.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu lá a. Đối với lá bệnh (10 – 12 ngày tuổi) Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên vết bệnh chưa phóng thích vào không khí. Chọn những mẫu lá có vết bệnh đặc trưng. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng thí nghiệm. b. Đối với mẫu lá sạch bệnh (10 – 12 ngày tuổi) Mẫu lá phải được lấy trước 8 giờ sáng. Phải xem kỹ và chắc chắn rằng trên gân lá và phiến lá không có bất kỳ một vết bệnh nào dù lớn hay nhỏ. Ghi rõ tên dvt 22 lấy mẫu. Sau đó giữ ẩm để đưa về phòng thí nghiệm. 3.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm C. cassiicola 3.2.2.1. Hoá chất và dụng cụ Dụng cụ: becher, bình tam giác, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, autoclave, tủ sấy, hộp plastic đựng mẫu, giấy thấm nước, bút lông, băng keo. Hoá chất: Môi trường PDA, PSA (cách pha chế Phụ lục 2). Thuốc nhuộm Methylene blue. 3.2.2.2. Phân lập mẫu nấm Lấy mẫu lá bệnh từ vườn đem về phòng thí nghiệm. Trước khi phân lập phải xác định hình thái sợi nấm và bào tử dưới kính hiển vi bằng cách dùng băng keo trong dán vào mặt dưới của lá bệnh sau đó ép lên lam kính. Tại vị trí vết bệnh đặc trưng trên mẫu lá, cắt thành những miếng nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh có kích thước 5 mm x 5 mm. Tiến hành rửa lá 1 lần với cồn 70ºC trong 30 giây. Sau đó rửa lại 2 lần với nước cất (cất 2 lần), khử trùng que kẹp trên ngọn đèn cồn, để nguội, dùng que kẹp gắp các mẫu lá đặt vào 5 vị trí trên đĩa môi trường (mặt dưới của lá tiếp xúc với bề mặt môi trường). Sau 2 ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassicola được cấy chuyền sang đĩa petri chứa môi trường PDA và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày ở điều kiện nhiệt độ 26 – 30ºC/2 – 3 ngày. Khi nấm phát triển, tiếp tục cấy chuyền sang môi truờng mới cho đến khi tạo được nguồn nấm thuần chủng. 3.2.2.3. Nhân số lƣợng bào tử Từ nguồn nấm thuần chủng, lấy mẫu nấm với đường kính 0,8 cm cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA. Nấm C. cassiicola khó tạo bào tử trong môi trường nhân tạo, để có được một số lượng lớn bào tử trên môi trường nhân tạo ta có thể tiến hành như sau: đặt các đĩa petri này trong bóng tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển. Tiếp theo, dùng lam kính cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày. 23 3.2.3. Phƣơng pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên mẫu lá nguyên bằng cách lây bệnh nhân tạo Thực hiện theo phương pháp của Chee (1988) và phương pháp này hiện đang được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN. 3.2.3.1. Vật liệu và dụng cụ Nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng (60 đĩa petri), micropipette, nước cất 2 lần, thuốc chống mốc (2 g/lít nước), giấy thấm nước, lưới sắt (24 cm x 14 cm), ống hút nhựa (có đường kính 1 cm), hộp plastic trong suốt có nắp đậy với kích thước: dài 25 cm, rộng 15 cm, cao 8 cm. Mẫu lá sạch bệnh (60 dvt) lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNCCSVN. 3.2.3.2. Phƣơng pháp a. Bố trí thí nghiệm Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD). Số nghiệm thức: 60 (60 dvt), số lần lặp lại: 3, mỗi lần lặp lại 2 lá. Tổng số mẫu: 180, mỗi mẫu (1 hộp plastic). Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 2 đợt. b. Phương pháp tiến hành Đặt lớp giấy thấm nước xuống đáy hộp, cho nước cất (cất 2 lần) vào hộp đến khi vừa thấm ướt giấy là đủ, tiếp theo đăṭ môṭ lớp ống hút nhựa lên trên lớp giấy, sau đó đặt tấm lưới sắt lên (lớp ống hút có tác dụng là làm cho lá không tiếp xúc trực tiếp với nước, tấm lưới sắt giúp cho lá giữ được thăng bằng để có thể nhỏ giọt dung dịch bào tử ở trên mặt lá). Mẫu lá được rửa với thuốc chống mốc 1 lần trong 30 giây, sau đó rửa lại 3 lần với nước cất, thấm khô, đặt vào hộp đã được chuẩn bị sẵn ở trên (mặt trên của lá tiếp xúc với tấm lưới sắt). Dùng micropipette hút dịch bào tử đã qua lưới lọc, nhỏ lên hai bên gân chính của lá, mỗi bên 4 giọt (1 giọt = 20 µl). Sau khi lây nhiễm, đặt các hộp plastic dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12 giờ/ngày. Nhiệt độ phòng 26 ± 2ºC. 24 c. Các chỉ tiêu, chu kỳ theo dõi và cách phân cấp mức độ bệnh.  Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận cấp bệnh (gồm 4 cấp từ 0 – 3) trên mỗi mẫu lá dựa vào số lượng và diện tích vết bệnh như Hình 3.1. Hình 3.1: Minh họa phân cấp bệnh trên mẫu lá nguyên (Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN). Theo dõi 3 lần vào các thời điểm 5, 7 và 10 ngày sau khi lây nhiễm. Cấp bệnh dựa theo bảng phân cấp bệnh đang sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN (Bảng 3.1). Bảng 3.1: Bảng phân cấp bệnh gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên Cấp bệnh Triệu chứng Cấp 0 Cấp 1 Cấp 2 Cấp 3 Không bệnh Lá có màu hơi ngăm đen ngay bên dưới giọt dung dịch bào tử Vết bệnh lan rộng và rõ nhưng chưa có sợi nấm Vết bệnh lan rộng và rõ, xuất hiện nhiều sợi nấm (Nguồn: Bộ môn BVTV – VNCCSVN).  Phân hạng thống kê mức độ bệnh sau 10 ngày lây nhiễm theo cách tính sau: Rất nặng: X ≥ + 25 Nặng: ≤ X < + Trung bình: – ≤ X < Nhẹ: X ≤ – Trong đó: X: cấp bệnh của mỗi dvt. : cấp bệnh trung bình của 60 dvt. : độ lệch chuẩn quần thể. d. Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel. 3.2.3.3. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian thực hiện: từ 15/03 – 30/05/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN. 3.2.4. Phƣơng pháp đo hoạt tính peroxidase (POD) từ lá của một số dvt cao su Thưc̣ hiêṇ theo phương pháp của Thankamony và Philip (2006). 3.2.4.1. Mục đích Khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao. 3.2.4.2. Vật liệu, dụng cụ và hoá chất a. Vật liệu và dụng cụ Mẫu lá cao su bị bệnh rụng lá Corynespora và mẫu lá sạch bệnh lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 – VNNCSVN. Máy đo quang phổ DR 5000, cối, chày, đá lạnh, micropipette các loại, eppendorf, cân điện tử, kéo, nước cất 2 lần, máy ly tâm lạnh, autoclave, tủ sấy, tủ lạnh. b. Hoá chất:Phosphate buffer 0,1 M (pH = 7,0), dung dịch guaiacol 20 mM, dung dịch H2O2 4,2%. 3.2.4.3. Phƣơng pháp  Bố trí thí nghiệm Từ 60 dvt sau khi gây bệnh nhân tạo, chia thành 4 cấp bệnh, từ mỗi cấp bệnh chọn ngâũ nhiên 3 dvt để xác định hoạt tính POD. 26 Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), trong mỗi nghiệm thức gồm 2 yếu tố: hoạt tính POD trên mẫu lá bệnh và mẫu lá không bệnh (đối chứng), mỗi yếu tố lặp lại 3 lần. Tổng số mẫu: 72.  Điều kiện thí thiệm: ly trích enzyme ở điều kiện lạnh (khoảng 4ºC), bảo quản enzyme ở 0 – 4ºC, đo hoạt tính enzyme ở 25ºC.  Phương pháp ly trích peroxidase từ lá cao su.  Phương pháp đo hoạt tính peroxidase Phương pháp Cho 3 ml dung dịch buffer + 0,05 ml dung dịch guaiacol + 0,1 ml dung dịch enzyme + 0,03 ml dung dịch hydrogen peroxide (H2O2) vào trong cuvette. Trộn đều và đặt cuvette vào trong máy đo quang phổ kế. Đo ở bước sóng 436 nm. Thêm 3ml phosphate buffer Cân 1 gam mẫu lá, cắt nhỏ, cho vào cối Cho dịch nghiền vào eppendorf Ly tâm 18.000 vòng/15 phút ở 5ºC. Thu dịch nổi, cất giữ enzyme ở 0 – 4ºC. Nghiền trong điều kiện lạnh Mẫu lá bệnh (hoặc mẫu đối chứng), rửa 2 lần với nước cất 2 lần 27 Chỉ tiêu quan sát Sau khi đặt cuvette vào máy đo quang phổ. Ghi nhận thời gian cần để sự hấp thu tăng thêm 0,05 ( t). Họat tính enzyme được tính theo công thức sau: Trong đó: 3,18: thể tích cuối (ml). 0,1: lượng enzyme đem đo (ml). 1000: đổi đơn vị ml sang lít. 6.39: tương đương với 1 đơn vị enzyme tạo thành ở bước sóng 436 nm. 1: độ dài ánh sáng đi qua cuvette (cm2).  Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0. 3.2.4.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm Thời gian thực hiện: 01/06 – 10/07/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Phòng Thí nghiệm của Trung Tâm Công Nghệ Cao Su – VNCCSVN. 3.2.5. Phƣơng pháp đếm số lƣợng khí khổng trên lá của một số dvt cao su Thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Kim Linh (2005). 3.2.5.1. Mục đích Khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. 3.2.5.2. Hoá chất và dụng cụ Hoá chất collodium, đũa thuỷ tinh, lame, lamelle, kính hiển vi quang học. Mẫu lá sạch bệnh của 12 dvt được chọn ra từ 4 cấp bệnh, mỗi cấp bệnh 3 dvt sau khi đánh giá khả năng kháng bệnh rụng lá Corynespora. 3.2.5.3. Phƣơng pháp  Bố trí thí nghiệm: Từ 60 dvt cao su sau khi gây bệnh nhân tạo in vivo, phân về 4 cấp bệnh, mỗi Hoạt tính enzyme (đơn vị / lít) 28 cấp bệnh chọn ra 3 dvt để tiến hành đếm mật độ khí khổng. Kiểu thí nghiệm: hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Số nghiệm thức: 12 (12 dvt), đơn yếu tố (số lượng khí khổng trên mẫu lá sạch bệnh), số lần lặp lại 3 (1 lần lặp lại là một vị trí đếm trên 1 lá/1 dvt). Tổng số mẫu: 36.  Phương pháp tiến hành Thoa một lớp mỏng collodium (khoảng 1cm2) ở mặt dưới của lá cao su. Đợi cho collodium khô, bóc ra đem quan sát dưới kính hiển vi giữa hai lớp lam và lamelle. Đếm số khí khổng thấy được trong diện tích thị trường vật kính X40.  Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm MS – Excel và Statgraphics Ver. 7.0. 3.2.5.4. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm Thời gian thực hiện: 10/07 – 30/07/2007. Địa điểm thực hiện: Phòng Thí nghiệm Bộ môn BVTV – VNCCSVN. 29 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh rụng lá Corynespora tại Lai Khê Bệnh rụng lá Corynespora do nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei., họ Moniliales gây ra, xuất hiện lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1999 tại Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương. Triệu chứng bệnh ban đầu khá đặc trưng như trên lá già là dạng xương cá dọc theo gân chính và gân phụ, lá chuyển dần sang màu đỏ cam, trên lá non là những vết tròn có tâm mỏng như giấy, bao quanh vết bệnh là vòng màu nâu hoặc đen có quầng vàng ở ngoài, đôi khi hình thành lỗ thủng tại tâm vết bệnh... Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm và lượng mưa nhiều đó là điều kiện rất thuận lợi cho nấm gây CLFD phát triển cả về mức độ lẫn quy mô, đồng thời cũng có những biến đổi lớn về triệu chứng bệnh, kích thước vết bệnh và vị trí gây bệnh. Mặt khác, cũng tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt, tuổi lá, thời điểm nấm xâm nhiễm hoặc yếu tố môi trường đối với mầm bệnh mà chúng hình thành những triệu chứng không đặc trưng làm cho chúng ta khó xác định trực tiếp ngoài đồng ruộng mà phải đem về phòng thí nghiệm quan sát hình thái bào tử qua kính hiển vi. Có một số triệu chứng không đăc̣ trưng của bệnh rụng lá Corynespora dễ gây nhầm lẫn với một số bệnh khác nhưng nếu quan sát kỹ vẫn có thể phân biệt được. Ví dụ, triệu chứng quăn đầu lá gần giống như bệnh héo đầu lá do nấm Colletotricum gloeosporioides (Penz) gây ra, điểm khác biệt lớn là bề mặt các đốm bệnh bằng phẳng, không có u lồi và có những viền màu nâu được bao quanh bởi quầng vàng. Một số triệu chứng CLFD tại Vườn Dư ̣án giống cao su Quốc gia – Lai Khê, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương (Hình 4.1a và Hình 4.1b). 30 Hình 4.1a: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá non Hình 4.1b: Một số triệu chứng bêṇh ruṇg lá Corynespora trên lá già Qua các đợt điều tra của Bộ môn BVTV tại các Vườn Sơ tuyển của VNCCSVN (Bảng 4.1) cho thấy hầu hết các vườn này đều bị nấm C. cassiicola tấn công và không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt trên Vết tròn có viền nâu được bao quanh bởi quầng vàng Cháy phiến lá Quăn đầu lá Dạng xương cá Lá biến dạng tạo lỗ trên vết bệnh 31 vườn đều nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Tuy nhiên, trên cuống và chồi rất ít gặp, bệnh gây trên lá là chủ yếu. Bảng 4.1: Kết quả điều tra CLFD ở vƣờn sơ tuyển 03 và 04 tại Lai Khê Tên vƣờn Ngày điều tra Số dvt Số dvt nhiễm bệnh Vườn sơ tuyển 2003 Từ ngày 18/04/2006 đến 08/08/2006 72 72 Vườn sơ tuyển 2004 76 76 (Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – VNCCSVN). Thực tế cho thấy, bệnh đã phát triển rất mạnh và hình thành nhiều triệu chứng khác nhau nếu không có biện pháp quản lý chặt chẽ thì bệnh sẽ có khả năng tích lũy và có cơ hội gây hại trên diện tích lớn cao su trong nước. 4.2. Kết quả phân lập Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (5 mm x 5 mm) trên môi trường PDA, từ mẫu bệnh sẽ xuất hiện sợi nấm mọc lan ra môi trường. Tiến hành tách một phần môi trường có sợi nấm sang đĩa môi trường khác, tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 – 4 ngày có thể xác định được sơ bộ nấm đó có phải là C. Cassiicola hay không nhờ những đặc điểm đó là khuẩn lạc có màu xám, mặt dưới đĩa petri có màu đen (màu của độc tố được tiết ra môi trường). Làm tiêu bản bào tử và quan sát dưới kính hiển vi quang học, so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971) để có thể khẳng định chắc chắn rằng mẫu nấm thu được là C. cassiicola. Khi đã có nguồn nấm thuần chủng, tiến hành nhân số lượng bào tử C. cassiicola để thực hiện thí nghiệm lây bệnh nhân tạo. Trên môi trường nhân tạo nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử. Do vậy, để thu được số lượng lớn bào tử C. cassiicola phục vụ cho việc lây bệnh nhân tạo cần tiến hành kích thích sợi nấm sinh bào tử theo phương pháp của Chee (1988) và các tác giả khác được mô tả như sau: Đặt các đĩa petri này trong tối 5 ngày liên tiếp để sợi nấm phát triển, dùng lamelle cạo nhẹ trên bề mặt của khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang liên tục trong 3 ngày. Sau 8 ngày nhân số lượng bào tử nấm C. cassiicola trên môi trường nhân tạo. 32 tiến hành tách bào tử từ các đĩa nấm nguồn (cho vào mỗi đĩa 10 ml nước cất, cạo nhẹ trên bề mặt thạch để nấm tách ra khỏi môi trường nuôi cấy và hoà lẫn vào trong nước, thu dịch nấm trên đĩa thạch vào bình tam giác có lưới lọc). Hình 4.2a: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 5 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA Hình 4.2b: Khuẩn lạc C. cassiicola sau 8 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng PSA Kết quả: Phân lập được nguồn nấm C. cassiicola thuần chủng. Số lượng bào tử trung bình: 8 bào tử/giọt (1 giọt = 20 µl). Hình 4.3: Bào tử C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo PSA 4.3. Kết quả đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên Đánh giá tính kháng CLFD bằng phương pháp in vivo hiện có hai cách đang được sử dụng tại Bộ môn BVTV – VNCCSVN là: lây bệnh nhân lá nguyên và lá tròn. 33 Tuy nhiên, qua nhiều đợt làm thí nghiệm của Bộ môn BVTV cho thấy mặc dù phương pháp gây bệnh trên mẫu lá tròn đem lại kết quả không sai lệch lớn so với kết quả gây bệnh trên mẫu lá nguyên. Nhưng khi so sánh kết quả của hai phương pháp trên với kết quả điều tra ngoài đồng ruộng cho thấy phương pháp thực hiện trên mẫu lá tròn cho kết quả không chính xác bằng phương pháp lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên. Do một số nguyên nhân sau: Thứ nhất, lây bệnh trên mẫu lá tròn sử dụng mẫu lá không còn nguyên vẹn làm cho mẫu lá dễ bị úng nước. Thứ hai, đối tượng của phương pháp gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá tròn là mẫu lá bánh tẻ nên độ mẫn cảm không cao bằng trên lá non (mẫu lá 10 ngày tuổi, đối với phương pháp gây bệnh trên mẫu lá nguyên). Vì vậy, tôi chỉ tiến hành phương pháp đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora bằng cách lây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên. Sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm nhân tạo bệnh rụng lá Corynespora, thu được kết quả về mức độ nhiễm bệnh (Phụ lục 1) và phân hạng mức độ nhiễm bệnh (Bảng 4.2) của 60 dvt cao su. Bảng 4.2: Phân hạng mức độ nhiễm CLFD của 60 dvt cao su Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính* Nhẹ LH 94/481, LH 94/342, LH 94/592, LH 97/542, PB 235, PB 260, LH 94/286, LH 97/697, LH 94/337, LH 94/501, LH 97/563 Trung bình LH 91/999, LH 94/62, LH 98/1366, LH 94/475, LH 95/395, LH 97/267, LH 91/1119, LH 94/626, LH 95/115, LH 96/305, LH 94/374, LH 94/544, LH 95/113, LH 98/444, LH 97/165, LH 94/105, LH 94/267, LH 95/88, LH 91/489, LH 96/133, LH 97/80, LH 97/647 Nặng LH 96/345, LH 91/579, LH 94/133, LH 96/115, LH 98/274, LH 91/1111, LH 97/196, LH 88/185, LH 96/128, LH 94/359, LH 95/206, LH 98/241 Rất nặng LH 94/612, LH95/345, LH 96/308, LH 97/646, LH 97/657, LH 95/174, LH 98/239, LH 97/117, LH 82/182, LH 95/109, LH 95/208, LH 98/807, LH 98/42, LH 98/377, LH 95/228 Ghi chú: Trong cùng một mức độ nhiễm, dvt nào đứng trước bị nhiễm bệnh nhẹ hơn dvt đứng sau. 34 Qua bảng 4.2 cho thấy, không một dvt nào có được tính kháng hoàn toàn với bệnh, 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng chiếm tỷ lệ 25%, 12/60 dvt nhiễm nặng chiếm tỷ lệ 20%, 22/60 dvt nhiễm trung bình chiếm tỷ lệ 36,67%, 11/60 dvt nhiễm nhẹ chiếm tỷ lệ 18,33%. Sau khi phân hạng mức độ nhiễm bệnh, dựa trên phổ hệ của 60 dvt để xác định đặc tính di truyền (DT) con lai. Trong 60 dvt thì có tới 58/60 dvt (chiếm tỷ lệ 96,7%) được lai tạo trong nước bằng phương pháp lai hoa hữu tính. Bảng 4.3: Phân bố phổ hệ ảnh hƣởng đến mức độ mẫn cảm của con lai DT từ mẹ Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính sử dụng làm mẹ Nhẹ PB, LH, VQ, RRIC Trung bình RRIC, PB, LH, IAN, FX, RRIV, IRCA, RO, GT 1 Nặng PB, RRIM, RRIC, GU Rất nặng HK, LH, IRCA, RRIC, TU, PB Qua Bảng 4.3 cho thấy, nhóm PB và RRIC dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai có mức độ mẫn cảm từ nhẹ đến rất nặng. Nhóm VQ được đánh giá là nhóm dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai ít mẫm cảm nhất. Trong khi đó, nhóm HK và TU dùng làm nguồn mẹ lại cho thế hệ con lai rất dễ mẫm cảm với bệnh. Qua Bảng 4.4 cho thấy, nhóm RRIC và FX dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai có mức độ mẫm cảm từ nhẹ đến rất nặng. Nhóm TU cho thế hệ con lai mẫn cảm nhẹ đến trung bình. Nhóm LH và RO cho thế hệ con lai có độ mẫm cảm trung bình đến rất nặng. Nhóm VM dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai ít mẫn cảm với bệnh nhất. Bảng 4.4: Phân bố phổ hệ ảnh hƣởng đến mức độ mẫn cảm của con lai DT từ bố Mức nhiễm bệnh Dòng vô tính sử dụng làm bố Nhẹ RRIC, VM, RRIV, FX, IAN, PB, TU Trung bình IAN, LH, RRIM, RRIC, RRIV, TU, FX, GU, RO, AC Nặng LH, RRIC, FX, AC, GU, RO Rất nặng RRIV, RRIC, LH, FX, IAN, PB, RO Phân tích phổ hệ từ Bảng 4.3 và Bảng 4.4 cho thấy nhóm RRIC dùng làm nguồn bố hay mẹ đều cho thế hệ con lai có độ mẫn cảm từ nhẹ đến rất nặng, RRIC 35 là dvt mẫn cảm với bệnh đã được biết rõ không những ở trong nước mà còn ở các nước trồng cao su khác. Nhóm TU dùng làm nguồn mẹ cho thế hệ con lai mẫn cảm rất nặng nhưng dùng làm nguồn bố lại cho thế hệ con lai mẫn cảm nhẹ đến trung bình. Nhóm VM dùng làm nguồn mẹ và nhóm VQ dùng làm nguồn bố cho thế hệ con lai ít mẫn cảm với bệnh nhất. Nhóm PB trước đây được xem là dvt ít mẫn cảm nhưng gần đây nhóm PB, đặc biệt là PB 260, nhiễm bệnh nhiều hơn với các triệu chứng rất biến thiên và không đặc trưng cũng xuất hiện trong nhóm bị nặng. Cũng tương tự như nhóm PB, nhóm RRIV cũng có những biến đổi đáng kể về khả năng mẫn cảm. Hiện nay, số lượng dvt nhiễm bệnh đã gia tăng đáng kể (kết quả gây bệnh nhân tạo trên mẫu lá nguyên của 60 dvt đã cho thấy 100% dvt đều nhiễm bệnh), so với năm 1999, khi bệnh mới xuất hiện tại Việt Nam thì chỉ có 6 dvt bị nhiễm bệnh. Theo Bộ môn BVTV (2006), nấm có khả năng vượt qua tính kháng của dvt cao su theo thời gian, cũng như bệnh đang tích lũy và có khả năng bùng phát khi gặp điều kiện thuận lợi. Cần được theo dõi chặt chẽ để có biện pháp hạn chế đến mức thấp nhất những thiệt hại do nấm gây ra. Hình 4.4: Dvt cao su sau 5, 7 và 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (a) Dvt LH 94/612 sau 5 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (b) Dvt LH 95/208 sau 7 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (c) Dvt LH 95/88 sau 10 ngày lây bệnh nhân tạo CLFD (c) (b) (a) 36 4.4. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su POD là một trong những PR proteins và có rất nhiều phương pháp để xác định hoạt tính của POD. Phương pháp quang phổ là một trong những phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính POD vì đây là một trong những phương pháp tốn ít thời gian, rẻ tiền và có độ tin cậy cao. Theo Johann Putter (1974), khi tiến hành xác định hoạt tính POD cần phải chú ý một số yếu tố sau:  Điều kiện tối ưu để xác định hoạt tính pH thích hợp 7,0, nhiệt độ 25ºC, độ bão hoà của enzyme với H2O2 hoặc với cơ chất không đạt được dưới điều kiện thường. Sự phân huỷ GDHP (guaiacol dehydrogenation product) tối đa ở 418 nm. Ở 436 nm sự phân huỷ về cơ bản không khác nhau; đo ở bước sóng này có thuận lợi là nó có thể được đưa ra ngoài với đầu lọc quang kế thường. GDHP có màu nâu thì độ ổn định không lâu; trong 10 phút đầu, sau đó giảm 4 – 5 . Để đo chính xác, người ta đề nghị thêm vừa đủ enzyme do đó thời gian cần cho phản ứng không được vượt quá 5 phút.  Sự ổn định của dung dịch Dung dịch guaiacol có khả năng ổn định ở phòng lạnh khoảng 24 giờ và có thể ổn định nhiều tháng trong tủ lạnh.  Sự ổn định của enzyme trong mẫu Trong quá trình làm hoặc cất trữ thì enzyme nên được giữ ở 0 – 4ºC. 4.4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng Theo Joseph (2006), để hạn chế sự phát triển của các mầm bệnh do nấm gây ra thì các loại thực vật cũng tạo ra nhiều cơ chế để chống lại các mầm bệnh đó bằng cách gia tăng tổng hợp lignin hoặc tạo ra các hợp chất kháng khuẩn… Tăng cường tạo các enzyme và hoạt tính của chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng của thực vật. Sau khi ly trích, đo hoạt tính POD bằng máy quang phổ DR 5000 ở bước sóng 436 nm. Ghi nhận thời gian hấp thụ từ khi đặt cuvette vào máy quang phổ cho đến khi độ hấp thụ tăng thêm 0,05. 37 Xử lý kết quả bằng phần mềm Excel và Statgraphics Ver. 7.0. Thu được kết quả hoạt tính POD (Bảng 4.5) như sau: Bảng 4.5: Bảng kết quả đo hoạt tính POD trên mẫu bệnh và mẫu đối chứng DVT POD trên mẫu đối chứng (đơn vị/lít) POD trên mẫu bệnh (đơn vị/lít) LH 94/481 54,33 e 317,67 ab LH 94/592 36,00 abc 657,33 bc LH 94/286 51,67 de 897,33 c LH 94/475 38,67 abcd 273,33 ab LH 95/395 46,67 bcde 743,33 c LH 97/267 41,00 abcde 197,33 a LH 94/359 39,33 abcd 827,33 c LH 95/206 48,00 cde 233,33 a LH 98/241 33,33 ab 658,00 bc LH 98/377 39,33 abcd 179,33 a LH 98/42 29,33 a 668,67 bc LH 98/807 41,00 abcde 242,67 a Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Qua Biểu đồ 4.1 cho thấy, hoạt tính POD của 12 dvt khảo sát đều tăng lên khi bị nhiễm bệnh. Dvt LH 94/286 khi bị nhiễm bệnh có hoạt tính POD cao nhất (897,33 đơn vị/lít), dvt LH 98/377 khi bị nhiễm bệnh có hoạt tính POD thấp nhất (179,33 đơn vị/lít). Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh. Điều này có thể được giải thích do sau khi tiếp xúc lên bề mặt cây ký chủ, nấm bệnh tiết ra một số chất như pectic enzymes, hemicellulases, cellulolytic enzymes… hỗ trợ cho nấm xâm nhập vào bên trong cây. Chính những chất đó đã cảm ứng tiết POD ở phần mô bị bệnh tham gia vào quá trình tổng hợp lignin giúp cây ký chủ chống lại sự tấn công của mầm bệnh. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu sự ảnh hưởng của PR proteins đến tính kháng bệnh CLFD của Joseph (2006), tức là PR proteins có thể chỉ xuất hiện sau khi đã phát sinh bệnh. 38 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00 LH 94/481 LH 94/592 LH 94/286 LH 94/475 LH 95/395 LH 97/267 LH 94/359 LH 95/206 LH 98/241 LH 98/377 LH 98/42 LH 98/807 Dòng vô tính Ho ạt tín h P OD (đ ơn vị /lít ) Hoạt tính POD ĐC Họat tính POD bệnh Biểu đồ 4.1: Hoạt tính POD trên mẫu đối chứng và mẫu bệnh của 12 dvt cao su 4.4.2. Kết quả khảo sát hoạt tính POD giữa các dvt Qua Bảng 4.6 cho thấy, trong cùng phân hạng mức độ nhiễm bệnh, các dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau. Sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy có thể kết luận hoạt tính POD thay đổi tùy thuộc vào dvt. Bảng 4.6: Bảng kết quả đo POD trên mẫu lá bệnh NT DVT Hoạt tính POD (đơn vị/lít) Cấp bệnh TB Phân hạng mức độ nhiễm bệnh NT1 LH 94/481 317,67 ab 0,25 Nhẹ NT2 LH 94/592 657,33 bc 0,50 NT3 LH94/286 897,33 c 0,67 NT4 LH 94/475 273,33 ab 1,42 Trung bình NT5 LH 95/395 743,33 c 1,42 NT6 LH 97/267 197,33 a 1,42 NT7 LH 94/359 827,33 c 2,17 Nặng NT8 LH 95/206 233,33 a 2,42 NT9 LH 98/241 658,00 bc 2,50 NT10 LH 98/377 179,33 a 3,00 Rất nặng NT11 LH 98/42 668,67 bc 3,00 NT12 LH 98/807 242,67 a 3,00 Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 39 Tuy nhiên, khi thiết lập mối tương quan tuyến tính giữa mức độ nhiễm bệnh và hoạt tính enzyme của 12 dvt cao su (Biểu đồ 4.2) cho thấy không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính kháng. R 2 = 0.0477 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 1000.00 0.25 0.50 0.67 1.42 1.42 1.42 2.17 2.42 2.50 3.00 3.00 3.00 Mức nhiễm bệnh của 12 dvt H oạ t t ín h PO D (đ ơn v ị/l ít) Họat tính POD bệnh Linear (Họat tính POD bệnh) Biểu đồ 4.2: Mối tƣơng quan giữa hoạt tính POD và mức nhiễm bệnh CLFD Kết quả này không phù hợp với một số nghiên cứu trước đây của Berton và ctv (1996), nhận thấy hoạt tính peroxidase trong dòng kháng GT 1 cao hơn dòng mẫn cảm PB 235 và PB 260 khi lây nhiễm nhân tạo bệnh Corynespora. Điều này có thể giải thích như sau: Berton và ctv (1996) đã sử dụng mẫu lá lây bệnh nhân tạo để đo hoạt tính POD nên có thể kiểm soát được thời gian nhiễm bệnh. Còn trong thí nghiệm này, mẫu lá được lấy tại Vườn Sơ tuyển 03 (địa điểm lấy mẫu lây bệnh nhân tạo in vivo) nên không kiểm soát được thời gian bị nhiễm bệnh của các dvt. Theo Joseph và ctv (2006), khi lây bệnh nhân tạo CLFD trong nhà lưới, hoạt tính PR protiens tăng dần theo thời gian bị nhiễm bệnh. Điều này cho thấy, lấy mẫu ở thời điểm cây bị nhiễm bệnh khác nhau sẽ cho kết quả khác nhau. Đây là một trong những nguyên nhân làm ảnh hưởng đến kết quả đo hoạt tính POD của các dvt. POD chỉ là một enzyme thuộc nhóm PR proteins nên POD chưa đủ quyết 40 định tính kháng hay mẫn cảm của các dvt. Do đó, phải kết hợp khảo sát POD với các enzyme khác thuộc nhóm PR proteins mới có thể khẳng định được tính kháng bệnh của các dvt. Ngoài ra, yếu tố pH của buffer và nhiệt độ phản ứng cũng ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của enzyme. Vì vậy, chưa thể kết luận được mức độ nhiễm bệnh và hoạt tính POD có mối tương quan với nhau. 4.5. Kết quả thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su Vi sinh vật xâm nhập vào cây trồng qua 3 con đường chủ yếu: qua "lỗ mở" tự nhiên, qua vết thương, vết trầy xước trên cây và do chính vi sinh vật tự có cơ chế để xuyên thủng tầng cutin, cellulose vào tế bào thực vật. Rất nhiều vi sinh vật xâm nhập vào cây chủ qua lỗ khí, khí khổng, qua các lỗ mở trên hoa hay xâm nhập vào hạt phấn (Nguồn: Theo Phan Thành Dũng (2004), nấm C. cassiicola xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua biểu bì và khí khổng. Từ các nghiên cứu trên tôi đặt ra giả thiết: dvt cao su có số lượng khí khổng nhiều sẽ tạo nhiều cơ hội cho nấm xâm nhập nên dễ bị bệnh hơn các dvt cao su có mật độ khí khổng ít. Để khẳng định giả thiết trên đây tôi thực hiện thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với bệnh rụng lá Corynespora của một số dvt cao su. Theo Nguyễn Ngọc Trì (2005), số lượng và sự phân bố khí khổng tùy thuộc rất nhiều vào loài, vào vị trí lá, vị trí trên từng bản lá, bội thể và điều kiện sống. Mẫu lá của các dvt được sử dụng để khảo sát mật độ khí khổng trong thí nghiệm này có cùng tuổi lá (khoảng 10 ngày tuổi), trồng tại cùng một địa điểm (Vườn Sơ tuyển 03), vị trí đếm khí khổng (giữa phiến lá). Do đó có thể loại trừ được một số yếu tố ảnh hưởng đến mật độ khí khổng của các dvt. Sau khi tiến hành đếm số lượng khí khổng trên toàn diện tích thị trường vật kính X40, xử lý thống kê đã thu được kết quả (Bảng 4.7) như sau: 41 Hình 4.5: Khí khổng của một số dvt cao su Trong cùng một phân hạng mức độ nhiễm bệnh, các dvt khác nhau có số lượng khí khổng khác nhau, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Nhưng giữa các mức độ nhiễm bệnh thì sự khác biệt về số lượng khí khổng của các dvt lại có ý nghĩa về mặt thống kê. Bảng 4.7: Bảng kết quả đếm số lƣợng khí khổng NT DVT Số khí khổng TB/diện tích thị trƣờng vật kính X40) Cấp bệnh TB Phân hạng mức độ nhiễm bệnh NT1 LH 94/481 57,00 a 0,25 Nhẹ NT2 LH 94/592 58,00 a 0,50 NT3 LH 94/286 58,33 a 0,67 NT4 LH 94/475 59,67 a 1,42 Trung bình NT5 LH 95/395 59,33 a 1,42 NT6 LH 97/267 60,67 ab 1,42 NT7 LH 94/359 67,67 c 2,17 Nặng NT8 LH 95/206 66,67 c 2,42 NT9 LH 98/241 66,63 bc 2,50 NT10 LH 98/377 75,00 d 3,00 Rất nặng NT11 LH 98/42 78.33 d 3,00 NT12 LH 98/807 74,67 d 3,00 Ghi chú: o Tương ứng với mỗi nghiệm thức là một dvt cao su. o Trong cùng một cột, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). LH 98/42 LH 97/267 Khí khổng 42 Qua Biểu đồ 4.3 cũng cho thấy, dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 0.25 0.50 0.67 1.42 1.42 1.42 2.17 2.42 2.50 3.00 3.00 3.00 Mức nhiễm bệnh của 12 dvt Số k hí k hổ ng /th ị t rư ờn g vậ t k ín h X4 0 Số khí khổng Biểu đồ 4.3: Mối quan hệ giữa số lƣợng khí khổng và tính mẫn cảm với CLFD của 12 dvt cao su Từ kết quả trên cho thấy các dòng vô tính cao su có số lượng khí khổng nhiều dễ bị nhiễm bệnh hơn các dòng vô tính cao su có số lượng khí khổng ít. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với giả thiết ban đầu đặt ra. Kết luận: Dvt khác nhau có mật độ khí khổng khác nhau. Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 43 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đánh giá tính kháng CLFD trên mẫu lá nguyên của 60 dvt cao su bằng cách lây bệnh nhân tạo. Là phương pháp tin cậy. 100% dvt nhiễm bệnh Corynespora ở mức độ mẫn cảm khác nhau. Trong đó, 15/60 dvt nhiễm rất nặng, 12/60 dvt nhiễm nặng, 22/60 dvt nhiễm trung bình, 11/60 dvt nhiễm nhẹ. Hầu hết các dvt bị nhiễm bệnh nặng đều có nguồn gốc di truyền từ các dvt mẫn cảm. Tuy nhiên, di truyền là yếu tố cần nhưng không phải là quyết định đối với tính nhiễm bệnh của các dvt. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính peroxidase và tính kháng CFLD trên một số dvt cao su. Dvt khác nhau có hoạt tính POD khác nhau. Trên cùng một dvt, hoạt tính POD trên mẫu đối chứng thấp hơn trên mẫu bệnh. Không có mối tương quan tuyến tính giữa hoạt tính POD và tính mẫn cảm với CLFD của các dvt. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa mật độ khí khổng và tính mẫn cảm đối với CLFD của một số dvt cao su. Dvt khác nhau có mật độ khí khổng khác nhau. Dvt cao su có mật độ khí khổng càng nhiều thì càng dễ bị nhiễm bệnh. 5.2. Đề nghị Mở rộng phương pháp thực hiện trong phòng bệnh Corynespora với các 44 dvt mới. Tiếp tục đánh giá tính nhiễm bệnh của các dvt bằng phương pháp in vivo (trong phòng) kết hợp với theo dõi trên vườn kiểm định bệnh trong thời gian dài để có kết luận chắc chắn hơn. Nên kết hợp thêm việc khảo sát các đặc tính sinh học của nấm bệnh. Thí nghiệm khảo sát mối quan hệ giữa hoạt tính POD và khả năng kháng bệnh CLFD mới là bước đầu nghiên cứu nên có những hạn chế nhất định. Để tăng thêm độ tin cậy nên tiếp tục khảo sát hoạt tính POD trên mẫu lá được lây bệnh nhân tạo để có thể kiểm soát được thời gian nhiễm bệnh, từ đó sẽ xác định được hoạt tính POD chính xác hơn, đồng thời kết hợp với các yếu tố khác liên quan đến khả năng kháng bệnh của các dvt cao su để có được phương pháp quản lý bệnh chặt chẽ hơn. Đối với phương pháp khảo sát mối quan hệ mật độ khí khổng và tính cảm nhiễm với bệnh. Là phương pháp hoàn toàn mới nên có những hạn chế nhất định, để tăng thêm độ tin cậy nên tiếp tục khảo sát trên nhiều dvt hơn nữa. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, 2006. Báo cáo công trình tuyển non dvt cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora. Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. 2. Lê Ngọc Thông và Huỳnh Tiến Dũng, 2003. Sinh học đại cương. Tủ sách Đại học Nông Lâm. 199 trang. 3. Nguyễn Đức Lượng, 2001. Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh. 344 trang. 4. Nguyễn Ngọc Trì, 2005. Bài giảng Sinh lý Thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trang 28 – 33. 5. Nguyễn Thị Kim Linh, 2005. Đề cương thực hành môn Sinh lý thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 6. Nguyễn Văn Bình, Vũ Đình Chính, Nguyễn Thế Côn, Lê Song Dự, Đoàn Thị Thanh Nhàn (chủ biên) và Bùi Xuân Sửu, 1996. Giáo trình cây công nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Nguyễn Văn Trương và Trịnh Văn Thịnh, 1991. Từ điển Bách khoa Nông nghiệp. Trung tâm quốc gia biên soạn từ điển Bách khoa Việt Nam. 8. Phạm Thị Lộc, 2002. Bài giảng Sinh học thực vật. Tủ sách Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trang 12 – 14. 9. Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2006. Công nghệ sinh học Enzyme và Ứng dụng. Tập ba. Nhà xuất bản Giáo Dục. 195 trang. 10. Phan Thành Dũng, 2000. Bệnh rụng lá Corynespora, đối tượng nguy hiểm lần đầu tiên trên cây cao su tại Việt Nam. Kết quả hoạt động khoa học công nghệ năm 2000. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 135 – 149. 11. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 124 trang. 12. Phan Thành Dũng, 2006. Báo cáo kết quả công trình tuyển non dòng vô tính cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora. Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. 46 13. Tổng Công Ty Cao su Việt nam, 2005. 30 năm Tổng Công Ty Cao Su Việt nam. NXB Giao Thông Vận Tải. 14. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Giáo trình Bệnh Cây Nông Nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 295 trang. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 15. Breton, F., d’ Auzac, J., Garcia, D., Sanier, C and Eschbach, J.m., 1996. Recent researches on Corynespora cassiicola/Hevea brasiliensis Interaction. Proceeding of Workshop on Corynespora Leaf Fall Diseases of Hevea Rubber. (Eds. Asril Darussamin, Sowkirman Pawirosoemardjo, Basuki, Rasidin Azwar, Sadaruddin). Medan, Indonesia, 16 – 17 December 1996. Indonesia Rubber Reseach Institute. pp 49 –78. 16. Chatchamon Daengkanit and Wallie Suvachittanont., 2005. Peroxidase from Hevea brasiliensis (B.H.K) Mull. Arg. Leaves and its Applications. Science Asia 31 : 55 – 63. . 17. Chee, K. H., 1988. Studies on sporulation, pathogenicity and epidemiology of Corynespora. Journal of Natural Rubber research 3(1): 21 – 29. 18. Dung P.T., 1995. Studies on C. cassiicola (Berk. & Curt) Wei. on rubber. M. Agr. Sc. Thesis, Universiti Pertanian Malaysia. 19. Dung, P.T. and Hoan, N.T., 2000. Current Status of Corynespora Leaf Fall in Vietnam. IRRDB Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of rubber. Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 5 – 16 June 2000. International Rubber Research and Development Board. 20. Dung, P.T., Pha, T.A. and Son, M.V., 2006. Current Status of diseases on rubber tree and their control in Vietnam. Preprints of Papers International Natural rubber Conference. (Eds. Mai Van Son, Nguyen Ngoc Bich, Tong Viet Thinh). Ho Chi Minh City, Vietnam, 13 – 14 November 2006. International Rubber Research and Development Board and Rubber Research Institute of Vietnam. 21. Geiger J. P., Rio B., Nandris D. and Nicole M., 1989. Peroxidase production in tissues of the rubber tree following infection by root rot fungi. Physiological and Molecular Plant Pathology 34: 241 – 256. < fdi_51-52/010015911.pdf>. 47 22. Jacob K.C., 2006. Symptoms of Corynespora leaf disease on rubber (Hevea brasiliensis). Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. Jacob K.C.). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. pp. 17 – 24. 23. Jayasinghe, C.K., 2000. Corynespora Leaf Fall Disease of rubber in Sri Lanka: Diversity of the pathogen and pathogenesis. IRRDB Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of rubber. Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 5 – 16 June 2000. International Rubber Research and Development Board. 24. Jinji P., Xin Z., Yangxian Q., Yixian X., Huiqiang Z. and He Z., 2007. First record of Corynespora leaf fall disease of Hevea rubber tree in China. Australian Plant Disease Notes 2(1): 35 – 36. < 8&f=DN07017>. 25. Joseph A., 2006. Enzymes in host – pathogen interactions. Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. C. Kuruvilla Jacob). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. p. 54 – 62. 26. Miranda M.V., Magri M.L., Cabrera R.B., Fernández Lahore H.M. and Cascone O., 2003. Optimisation of peroxidase adsorption on concanavalin A – Agarose. Latin American Applied Research 33: 67–71. . 27. Mushrif S.K., 2006. Morphology, physiology and survival of Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Corynespora leaf disease of Hevea brasiliensis Strategies for management. (Ed. C. Kuruvilla Jacob). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam, Kerala, India. pp. 26 – 31. 28. Onesirosan, P.T., Arny, D.C. and Durbin, R.D., (1974). Host specificity of Nigerian and North Amarican isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology 64: 1364 –1367. 29. Philip, S., Joseph, A., Kumar, A., Jacob, C.K. and Kothandaraman, R., 2001. Detection of –1,3–glucanase isoforms against Corynespora Leaf Fall Diseases of Rubber (Hevea brasiliensis). Indian Journal of Natural Rubber Research 14 (1): 1 – 6. 48 30. Putter J., 1974. Peroxidases. Methods of enzymatic analysis 2. (Ed. Bergmeyer). Academic Press, New York. p. 685. 31. Rajalakshmy, V.K. and Kothandaraman, R., 1996. Current Status of Corynespora Leaf Fall in India the occurrence and management. Prosiding of Workshop on Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea Rubber. (Eds. Asril Darussamin, Sowkirman Pawirosoemardjo, Basuki, Rasidin Azwar and Sadaruddin). Medan, Indonesia, 16 – 17 December 1996. Indonesia Rubber Reseach Institute. p. 38. 32. Sarma, Y.R. and Nayudu, M.V., 1971. New host of Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei.. Current Sciences 74(2): 92 – 97. 33. Spencer, J.A. and Walters, H.J., 1969. Variation in certain isolates of Corynespora cassiicola. Phytopathology 59: 58 – 60. 34. Suresh Kumar, K.K. and Kuruvilla Jacob, C., 2006. Post – infectional change of enzymes and proteins in Hevea brasiliensis and their role in resistance to Corynespora cassiicola. Preprints of Papers International Natural rubber Conference. (Eds. Mai Van Son, Nguyen Ngoc Bich, Tong Viet Thinh). Ho Chi Minh City, Vietnam, 13 – 14 November 2006. International Rubber Research and Development Board and Rubber Research Institute of Vietnam. Pp 440 – 449. 35. Thankamony S. and Shaji Philip., 2006. Enzyme and PR Proteins. A Laboratory Manual for International Training on Strategies for Management of Corynespora Leaf Fall Disease of Hevea brasiliensis. (Eds. C. Kuruvilla Jacob, P. Srinivas, C. Bindu Roy). Rubber Reseach Institute of India, Kottayam 686 009, India. p 17 – 18. Tài liệu Internet 36. 37. 38. _plant_pathogen_collections_vietnamese.pdf. 39. 40. 49 41. 42. 43. 44. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Số liệu thô Mức độ nhiễm bệnh của 60 dvt cao su sau 5, 7 và 10 ngày lây nhiễm STT DVT TB Phân hạng STT DVT TB Phân hạng 1 LH 94/481 0,25 Nhẹ 31 LH 96/133 1,75 Trung bình 2 LH 94/342 0,42 Nhẹ 32 LH 97/80 1,75 Trung bình 3 LH 94/592 0,50 Nhẹ 33 LH 97/647 1,75 Trung bình 4 LH 97/542 0,50 Nhẹ 34 LH 96/345 1,83 Nặng 5 PB 235 0,58 Nhẹ 35 LH 91/579 1,83 Nặng 6 PB 260 0,58 Nhẹ 36 LH 94/133 1,83 Nặng 7 LH 94/286 0,67 Nhẹ 37 LH 96/115 1,83 Nặng 8 LH 97/697 0,67 Nhẹ 38 LH 98/274 1,83 Nặng 9 LH 94/337 0,75 Nhẹ 39 LH 91/1111 1,92 Nặng 10 LH 94/501 0,83 Nhẹ 40 LH 97/196 1,92 Nặng 11 LH 97/563 0,83 Nhẹ 41 LH 88/185 1,92 Nặng 12 LH 91/999 1,33 Trung bình 42 LH 96/128 1,92 Nặng 13 LH 94/62 1,33 Trung bình 43 LH 94/359 2,17 Nặng 14 LH 98/1366 1,33 Trung bình 44 LH 95/206 2,42 Nặng 15 LH 94/475 1,42 Trung bình 45 LH 98/241 2,50 Nặng 16 LH 95/395 1,42 Trung bình 46 LH 94/612 2,75 Rất nặng 17 LH 97/267 1,42 Trung bình 47 LH95/345 2,75 Rất nặng 18 LH 91/1119 1,58 Trung bình 48 LH 96/308 2,83 Rất nặng 19 LH 94/626 1,58 Trung bình 49 LH 97/646 2,83 Rất nặng 20 LH 95/115 1,58 Trung bình 50 LH 97/657 2,92 Rất nặng 21 LH 96/305 1,58 Trung bình 51 LH 95/174 2,92 Rất nặng 22 LH 94/374 1,67 Trung bình 52 LH 98/239 2,92 Rất nặng 23 LH 94/544 1,67 Trung bình 53 LH 97/117 3,00 Rất nặng 24 LH 95/113 1,67 Trung bình 54 LH 82/182 3,00 Rất nặng 25 LH 98/444 1,67 Trung bình 55 LH 95/109 3,00 Rất nặng 26 LH 97/165 1,67 Trung bình 56 LH 95/208 3,00 Rất nặng 27 LH 94/105 1,75 Trung bình 57 LH 98/807 3,00 Rất nặng 28 LH 94/267 1,75 Trung bình 58 LH 98/42 3,00 Rất nặng 29 LH 95/88 1,75 Trung bình 59 LH 98/377 3,00 Rất nặng 30 LH 91/489 1,75 Trung bình 60 LH 95//228 3,00 Rất nặng Ghi chú: Độ lệch chuẩn = 0,8; Cấp bệnh trung bình: = 1,83. PHỤ LỤC 2: Phƣơng pháp pha chế một số môi trƣờng  Môi trƣờng PDA (tổng hợp) – hãng sản xuất: Merck. Pha 39 g môi trường PDA tổng hợp vào 1 lít nước, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, phân phối vào 4 bình tam giác. Sau đó đem hấp khử trùng ở 121ºC/15 phút. Để nguội (khoảng 40 – 45ºC), phân vào mỗi đĩa petri vô trùng khoảng 10 ml.  Môi trƣờng PSA Tư ̣pha chế theo công thức của Chee (1988). Bảng: Thành phần môi trƣờng PSA Thành phần g/lít Khoai tây Đường sucrose Thạch agar Nước cất 100 10 15 Nước cất vừa đủ 1 lít Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cân đủ 100 gam, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nước cất 2 lần, đun sôi. Lọc lấy nước trong. Thêm 15 g agar và bổ sung nước cất 2 lần vào dung dịch đã lọc cho tới khi đạt 1.000 ml, đun sôi trong 30 phút, khuấy đều. Chia môi trường vào các bình tam giác (khoảng 250 ml/bình), đem hấp khử trùng ở 121ºC trong 15 phút. Sau đó để cho nhiệt độ môi trường xuống khoảng 40 – 45ºC, rót vào mỗi đĩa petri vô trùng khoảng 10 ml. PHỤ LỤC 3: Xử lý số liệu thống kê POD bệnh One-Way Analysis of Variance -------------------------------------------------------------------------------- Data: PODBENH.HTINHPOD Level codes: PODBENH.DVT Labels: Means plot: LSD Confidence level: 95 Range test: LSD Analysis of variance -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- Between groups 2453640.3 11 223058.21 3.811 .0030 Within groups 1404573.3 24 58523.89 -------------------------------------------------------------------------------- Total (corrected) 3858213.6 35 0 missing value(s) have been excluded. Table of means for PODBENH.HTINHPOD by PODBENH.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. Error Stnd. Error 95 % LSD Level Count Average (internal) (pooled s) intervals for mean -------------------------------------------------------------------------------- LH94/286 3 897.33333 45.66667 139.67091 693.44951 1101.2172 LH94/481 3 317.66667 65.70726 139.67091 113.78284 521.5505 LH94/592 3 657.33333 124.48873 139.67091 453.44951 861.2172 LH94/475 3 273.33333 26.07894 139.67091 69.44951 477.2172 LH95/395 3 743.33333 342.85387 139.67091 539.44951 947.2172 LH97/267 3 197.33333 15.34420 139.67091 -6.55049 401.2172 LH94/359 3 827.33333 270.77071 139.67091 623.44951 1031.2172 LH95/206 3 233.33333 7.83865 139.67091 29.44951 437.2172 LH98/241 3 658.00000 120.50035 139.67091 454.11618 861.8838 LH98/377 3 179.33333 18.12304 139.67091 -24.55049 383.2172 LH98/42 3 668.66667 50.03443 139.67091 464.78284 872.5505 LH98/807 3 242.66667 54.77631 139.67091 38.78284 446.5505 -------------------------------------------------------------------------------- Total 36 491.30556 40.31952 40.31952 432.44936 550.1617 Multiple range analysis for PODBENH.HTINHPOD by PODBENH.DVT -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count Average Homogeneous Groups -----------------------------