Khóa luận Tìm hiểu quy trình phát hiện vibriotrong thủy hải sản đông lạnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐƠNG LẠNH Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ VI SINH Sinh viên thực hiện : Phạm Thị Bích Ngọc MSSV: 0811110055 Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  i LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khĩa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh” là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu sử dụng trong khĩa luận là trung thực và cĩ nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung khĩa luận cĩ tham khảo và sử dụng các tài liệu, thơng tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khĩa luận. Sinh viên thực hiện Phạm Thị Bích Ngọc Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc ii MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................1  1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1 1.2. Mục đích ...........................................................................................................2 1.3. Mục tiêu đề tài ..................................................................................................2 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN....................................................................................3 2.1. Vai trị của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới .....................................................................................................................3 2.1.1. Vai trị của thủy hải sản trong đời sống con người....................................3 2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới .................4 2.2. Giới thiệu về Vibrio spp...................................................................................7 2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp. ...................................................................7 2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố...............................................................9 2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp ...........................................................................9 2.2.2.2. Phân bố .............................................................................................10 2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. ...............................................................10 2.2.3.1. Đặc điểm chung ................................................................................10 2.2.3.2 Đặc điểm của từng lồi....................................................................11 2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp. ................................................................................14 2.2.5. Yếu tố độc lực ...........................................................................................15 2.2.6. Cơ chế gây bệnh ......................................................................................18 2.2.7. Triệu chứng gây bệnh.............................................................................21 2.2.7.1. Trên người.........................................................................................21 2.2.7.2 Trên động vật .....................................................................................23 2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh ở Việt Nam và trên thế giới ...................................................................................24 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh ở Việt Nam.......................................................................................................24 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iii 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh trên thế giới .....................................................................................................24 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐƠNG LẠNH ...........................................................................................................26 3.1. Phương pháp truyền thống.............................................................................26 3.1.1. Phương pháp định tính ............................................................................26 3.1.1.1. Nguyên tắc. .......................................................................................26 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ............................................................................26 3.1.1.3. Mơi trường và hĩa chất ....................................................................26 3.1.1.4. Quy trình phân tích. ..........................................................................28 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình .......................................................................29 3.2. Phương pháp hiện đại ....................................................................................42 3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) ................................................................................................................42 3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) ......................................................43 3.2.1.2. Sandwich ELISA................................................................................44 3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) ...........................................45 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) ...............................46 3.2.2.1 Nguyên tắc ........................................................................................47 3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR ...................................................47 3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) ...................................................51 3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray ......................................................................52 3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp ...................................................................53 3.2.4.2. Các bước thực hiện ..........................................................................54 3.2.5. Kỹ thuật RAPD ........................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59 PHỤ LỤC..................................................................................................................61 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADH: Antidiuretic hormone APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic DNA: Acid Deoxyribo Nucleic ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays EU: Liên minh Châu Âu FDA: Food and Drug Administration HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points HLG :Canh Hugh Leifson Glucose KCN:Khu cơng nghiệp KI:Thạch Kligler Iron KIA: : Klingler Iron Agar KL: Khuẩn lạc KNXK: Kiêm ngạch xuất khẩu LDC: Linguistic Data Consortium NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng NST: Nhiễm sắc thể NTTS: Nuơi trồng thủy sản OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside ORF: Open reading frame PCA: Polymerase Chain Reaction TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose TSA: Thạch Tryptone Soya TSI: Triple Sugar Iron agar WHO: Tổ chức Y tế Thế giới Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ ..................... 4 Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU............................. 4 Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhĩm vi khuẩn tả............................ 19 Bảng 2.4: Các lồi Vibrio bị cho là gây bệnh ở người............................................. 20 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hĩa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus .......................................................................................... 31 Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 ................................. 41 Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 .............................. 41 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Vibrio harvey........................................................................................... 9 Hình 2.2: V.parahaemolyticus.................................................................................. 12 Hình 2.3: V.cholerae ................................................................................................ 13 Hình 2. 4: V. vulnificus............................................................................................. 13 Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae.................................................................... 19 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người......................... 21 Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả................................................................................. 22 Hình 2.8: Đuơi tơm sú bị mịn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio……………………...23 Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tơm mềm và cĩ màu xanh............................................. 23 Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar........................................................... 29 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên mơi trường MacConkey.......................................... 30 Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên mơi trường TCBS……………..30 Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA.................................................................. 32 Hình 3.5: Vibrio cholerae ........................................................................................ 33 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí cĩ lên men carbohydrate .......................... 35 Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí cĩ lên men carbohydrate ............................. 35 Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate............................................................ 36 Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase ..................................... 37 Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea ........................................................................ 38 Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG……………………………………………..38 Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG ........................................................................ 39 Hình 3.13: ELISA gián tiếp. .................................................................................... 44 Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA.......................................................... 45 Hình 3.15: ELISA cạnh tranh................................................................................... 46 Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR........................................................ 48 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc  1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng, các chất dinh dưỡng cần thiết để con người sống và phát triển. Thế nhưng thực phẩm cũng là nguồn truyền bệnh nguy hiểm, nếu như khơng bảo đảm được vệ sinh và an tồn. Vệ sinh an tồn thực phẩm (VSATTP) là vấn đề xã hội đang được rất nhiều người quan tâm, bởi lẽ VSATTP tác động trực tiếp đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống con người và ảnh hưởng đến chất lượng phát triển của xã hội và nịi giống. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện cĩ hơn 400 căn bệnh lây truyền qua thực phẩm khơng an tồn. VSATTP đã được đặt lên hàng đầu nghị trình tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng tồn cầu, nhưng tình hình gần như khơng được cải thiện bao nhiêu, nhất là khi thế giới liên tiếp xảy ra thiên tai và nguồn nước sạch ngày càng hiếm. Khi người dân khơng cĩ đủ miếng ăn thì việc kiểm tra chất lượng những gì mà họ ăn đã trở thành điều khá xa vời. Tiến sĩ Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết mỗi tháng Liên hiệp quốc nhận được khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia về các trường hợp thực phẩm bị nhiễm độc. Chất lượng VSATTP hiện nay rất đáng lo ngại, đã được rất nhiều các phương tiện thơng tin đại chúng phản ánh. Việc sử dụng khơng an tồn về phân bĩn, thuốc bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hĩa chất trong chăn nuơi trồng trọt nơng nghiệp, thủy hải sản hiện nay cịn khá phổ biến. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm, nhưng chủ yếu là người bị ngộ độc đã hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn đã bị ơi thiu, thức ăn chế biến khơng hợp vệ sinh, khơng đạt yêu cầu hoặc do bảo quản khơng tốt. Khi đĩ, các loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc và ký sinh vật cĩ điều kiện hồnh hành. Vi sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ơ nhiễm, mất vệ sinh an tồn thực phẩm và cĩ tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong nhĩm vi sinh Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 2 vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum, Vibrio spp, E. Coli và Listeria là đáng sợ nhất. Một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại nhất hiện nay đĩ là ngộ độc do nhĩm vi khuẩn tả Vibrio spp gây ra trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh (tơm, cá, mực…). Chúng cĩ thể nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản bất kỳ lúc nào và được xem là nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng trên thế giới. Vibrio spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và mất nước. Bệnh tả do vi khuẩn này gây ra cĩ khả năng bùng phát thành đại dịch trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng. Dịch tả tấn cơng vào nước Anh vào năm 1848 – 1848 làm hơn 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 đã cướp đi 1/8 dân số thành phố London. Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador, Colombia, Mexico và Nicaragua kết quả hơn 12.000 người chết. Nếu hiểu biết đúng và kịp thời chúng ta cĩ thể ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ mình và cộng đồng xung quanh. Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của Khoa Mơi Trường và Cơng Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi xin tiến hành thực hiện khĩa luận “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh”. 1.2. Mục đích Nghiên cứu, đi sâu tìm hiểu về vi khuẩn Vibrio spp và đưa ra một số phương pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp. 1.3. Mục tiêu đề tài • Khảo sát về cấu trúc của Vibrio spp. • Khảo sát về sự phân bố của Vibrio spp. • Tình hình nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam hiện nay. • Một số phương pháp xác định Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 3 CHƯƠNG II: TỔNG QUAN 2.1. Vai trị của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới 2.1.1. Vai trị của thủy hải sản trong đời sống con người Trong những năm qua, ngành thủy sản luơn khẳng định là ngành kinh tế mũi nhọn cĩ những đĩng gĩp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo cơng ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hĩa lớn, sản phẩm thủy sản cĩ sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn định và bền vững. Thực phẩm thuỷ hải sản cịn giữ vai trị an ninh lương thực quốc gia và gĩp phần xố đĩi giảm nghèo. Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp chính đạm động vật cho người dân Việt Nam. Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình mặt hàng thuỷ sản của mỗi người dân Việt Nam là 19,4 kg, cao hơn mức tiêu thụ trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) và thịt gia cầm (3,9 kg/người). Số lao động của ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng 3,8 triệu người năm 2001 (kể cả lao động thời vụ), như vậy, mỗi năm tăng thêm hơn 100 nghìn người. Xuất khẩu thực phẩm thủy hải sản cũng gĩp phần giúp các quốc gia khác bù đắp lượng thiếu hụt về lương thực, thực phẩm. Kim ngạch xuất khẩu tồn ngành nơng nghiệp Việt Nam năm 2008 là 16,237 tỷ USD (Nơng sản: 8,42 tỷ; Thủy sản: 4,502 tỷ; Lâm sản: 2,996 tỷ). Trong những mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam thì thủy sản luơn đứng ở vị trí cao. Trong số các nước cĩ kim ngạch xuất khẩu thủy sản lớn thì Việt Nam là nước cĩ tốc độ tăng nhanh nhất. Tỷ lệ tăng trưởng trung bình thời kỳ 1992 - 2003 là 20,4%, mức tăng bình quân năm đạt 9,97%. Đến năm 2003, Việt Nam đứng thứ 7 trong số các nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Năm 1992 xuất khẩu thủy sản đạt 308 triệu USD, nhưng tới năm 2003 là 2,2 tỷ USD; năm 2005 vượt mức 2,5 tỷ USD và dự tính đến năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,8 tỷ USD. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 4 Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ (đơn vị: triệu USD) Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản. Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU Năm 2000 2001 2002 2003 2004 2005 Kim ngạch (triệu USD) 71,8 90,7 73,7 116,7 231,5 367,3 Khối lượng(tấn) 20.290,8 26.659,1 28.612,8 38.186,8 73.459,2 110.911,2 Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản 2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới Trong những năm qua, ngành thủy sản đã cĩ những bước chuyển biến hết sức căn bản về cơng tác quản lý an tồn vệ sinh trong khu vực chế biến để đáp ứng các yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sản phẩm thủy sản của các thị trường. Số lượng nhà máy chế biến thuỷ sản được cấp chứng nhận HACCP cũng như số doanh nghiệp được phép xuất khẩu thuỷ sản sang các thị trường tăng lên. Số lượng các lơ hàng bị nhiễm hố chất, dư lượng kháng sinh đã giảm đi rất nhiều so với các năm trước đây. Năm 1992 1996 2000 2001 2002 2003 2005 KNXK 308 697 1479 1778 2023 2200 2500 % tăng so với năm trước 126,3 112,2 20,2 13,8 8,7 13,6 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 5 • Ở Việt Nam Trong 3 tháng đầu năm 2006, thuỷ sản xuất khẩu qua kiểm tra chất lượng đạt 84.800 tấn, tăng 15% so với cùng kì năm trước trong đĩ khối lượng hàng kiểm tra chứng nhận chất lượng các chỉ tiêu dư lượng kháng sinh, hố chất là 54.400 tấn, chiếm 62,27%. Hàng xuất khẩu qua kiểm tra chiếm tỷ trọng lớn vẫn là thị trường EU (30%), Nhật Bản (17%), Mỹ (12%). Các trung tâm vùng cũng đã cấp 25 giấy chứng nhận xuất khẩu cho 337,35 tấn tơm xuất khẩu vào Mỹ, 17 giấy chứng nhận tơm khơng thu hoạch cho xuất khẩu tơm vào thị trường Oxtraylia. Chất lượng hàng thuỷ sản qua kiểm tra chất lượng chứng nhận ổn định. Trong 6 tháng đầu năm 2006, tổng sản lượng đạt 1.697.300 tấn bằng 49,34% kế hoạch năm 2007 và 108,1% so với cùng kì năm trước, xuất khẩu đạt 1,409 tỷ USD, bằng 50,32% so với kế hoạch, và tăng 29,03% so với cùng kì năm trước trong đĩ thị trường Nhật Bản chiếm 23,31%; EU: 23,26%; Mỹ: 18,21%, hai sản phẩm chính là tơm và cá trong đĩ tơm chiếm 38,3% và cá chiếm 37,4% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản. Chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều và đang dần ngang tầm với các nước lớn trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đạt được của ngành thủy sản về sản lượng sản xuất, giá trị thủy sản, kim ngạch xuất khẩu thì hiện nay ngành thủy sản cịn tồn tại những yếu kém chất lượng sản phẩm thủy sản Chất lượng và an tồn vệ sinh nguyên liệu thủy sản vẫn chưa đáp ứng được các yêu cầu ngày càng cao của thị trường, cơng tác quản lý đối với khu vực sản xuất và thương mại ở khâu trước chế biến thể hiện nhiều bất cập. Hậu quả là chất lượng sản phẩm thủy sản của Việt Nam chưa ngang tầm với thế giới, xuất khẩu tuy vẫn tăng hàng năm nhưng tỷ lệ tăng trưởng khơng ổn định và tiềm ần nhiều nguy cơ. Hiện nay vấn đề lớn nhất đối với chất lượng sản phẩm thuỷ sản Việt Nam đĩ là nguyên liệu thuỷ sản cĩ lẫn tạp chất hố học và việc sử dụng các loại hố chất, kháng sinh trong nguyên liệu thuỷ sản. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 6 Về thực trạng thuỷ sản nhiễm tạp chất vào nguyên liệu thuỷ sản. Đã xuất hiện hoạt động gian lận thương mại nhằm kiếm lời bất chính từ năm 1983- 1995, bắt đầu từ việc đưa đinh hoặc chì vào thân tơm tại 3 tỉnh Sĩc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu. Vào những năm 1996- 1997 tình trạng bơm các loại chất lỏng vào nguyên liệu tơm bắt đầu xuất hiện và lan nhanh đến mức trở thành phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long. Đầu năm 2005, thị trường EU đã phát hiện 30 lơ hàng bị nhiễm malachite green và leucomalachite green, 2 lơ hàng nhiễm fluoroquinolone; thị trường Canada phát hiện 48 lơ hàng nhiễm malachite green và leucomalachite, 5 lơ hàng nhiễm fluoroquinolone. Tại thị trường Hoa Kì, qua kiểm tra của Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho thấy hàng thuỷ sản nhập khẩu từ Việt Nam cĩ tỷ lệ nhiễm hố chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng. Đến tháng 11/2005 đã cĩ 9 lơ hàng nhiễm chloramphenicol, 7 lơ hàng nhiễm malachite green và leuco - malachite green, 7 lơ hàng nhiễm fluoroquinolone. Đến cuối năm 2005, chất lượng các lơ hàng xuất khẩu đã được cải thiện. Tuy nhiên, số lơ hàng đi EU vẫn được duy trì kiểm sốt dư lượng kháng sinh chloramphenicol (CAP), nitrfurans (NTRs) và malachite Green (MR), leucoma- lachite green (LMG). Tại thị trường Hoa Kì, thơng qua hoạt dộng kiểm tra chứng nhận đối với các lơ hàng thuỷ sản xuất khẩu vào Mỹ, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra 995 lơ hàng (14.473 tấn) phát hiện 12 lơ khơng đảm bảo chất lượng an tồn thực phẩm xuất khẩu, chủ yếu do bị phát hiện dư lượng MG, LMG, CAP, trong đĩ cĩ 3 lơ cá basa, 9 lơ tơm đơng lạnh. Tại thị trường Canada, NAFIQAVED đã thực hiện kiểm tra và cấp giấy chứng nhận đẻ xuất khẩu vào Canada cho 191 lơ hàng (2,739 tấn) và phát hiện 1 lơ tơm đơng lạnh cĩ chứa dư lượng CAP. Qua thực trạng về chất lượng thuỷ sản nĩi trên cĩ thể thấy chất lượng thuỷ sản Việt Nam nhìn chung chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn về chất lượng của các thị trường tiêu thụ, thuỷ sản cung cấp chưa đem lại lịng tin với các nhà nhập khẩu. Đĩ là cịn tồn tại nhiều lơ hàng cịn dư lượng kháng sinh, hố chất… những chất được coi là ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 7 • Trên thế giới Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản tồn cầu và 79% tổng sản lượng thuỷ sản thế giới. Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các nước đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các nước phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn. Tại Canada, người dân sống ven sơng và vùng duyên hải thường cĩ thú đào vớt nghêu sị. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đơi khi là mối đe dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ lồi thủy sản nào khác, sị ốc cũng cĩ thể bị nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus, Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus bệnh viêm gan A. Hiện nay, bệnh tả vẩn cịn xuất hiện trên thế giới quanh năm với số bệnh nhân nhỏ hơn. Năm 2005, cĩ 131.943 trường hợp bệnh xãy ra trong 52 quốc gia trên thế giới được báo cáo với tổ chức Y Tế Quốc Tế. 94% trường hợp bệnh xãy ra ở những quốc gia Phi Châu nghèo khổ. Năm 1992, một trận dịch hồn tồn bất ngờ của một thể bệnh giống như dịch tả, gây bởi Vibrio cholerae nhĩm O139. Bệnh khởi phát ở Madras, Ấn Độ và lan ra theo vịnh Bengal thuộc Bengladesh. Sau đĩ, dịch lan ra tồn Á Châu và vài trường hợp xâm nhập vào các quốc gia đã phát triển do người bệnh mang vào. 75% nguyên do dịch tả do sự yếu kém về vệ sinh phịng dịch liên quan đến nguồn nước được người dân sử dụng và kiểm sốt thực phẩm hải sản tươi sống, và 25% do thĩi quen xấu của người dân tại địa phương về cách ăn uống. 2.2. Giới thiệu về Vibrio spp. 2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp. Người ta cho rằng bệnh tả xuất hiện tại châu Á từ 600 năm trước Cơng nguyên. Bệnh tả được ghi nhận lần đầu tiên trong y văn vào năm 1563 tại Ấn Độ. Trận “đại chiến” đầu tiên của dịch tả với con người vào năm 1817- 1821 nổ ra tại nơi này. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 8 Dịch tả lan rộng ra theo các tuyến vận tải vào nước Nga, tiếp theo là châu Âu và Bắc Mỹ. Nĩ trở thành căn bệnh mang tính tồn cầu đầu tiên của nhân loại, hồnh hành khắp nơi chỉ trừ Nam cực. Trận đại dịch tả tấn cơng nước Anh vào năm 1848-1849 đã làm 70.000 người tử vong. Đại dịch năm 1854 đã cướp đi sinh mạng 1/8 dân số thành phố London chỉ trong một thời gian ngắn. Cũng trong khoảng thời gian này nước Pháp cũng hứng chịu những tổn thất nặng nề. Năm 1832, gần 40.000 người dân Paris đã mắc dịch tả và phân nửa trong số đĩ đã tử vong. Năm 1848-1849, một số lượng người tương tự cũng đã chết vì dịch bệnh. Phải đợi đến năm 1883, người ta mới biết được khuơn mặt của “kẻ giết người” nhờ cơng trình nghiên cứu của Robert Koch. Heinrich Hermann Robert Koch (1843 – 1910) là một bác sĩ người Đức. Ơng là người đã tìm ra trực khuẩn bệnh than, trực khuẩn lao và vi khuẩn bệnh tả. Trước đĩ (1854) nhà khoa học Ý Pacini đã nhắc đến loại vi khuẩn gây bệnh tả Vibrio chorelae khi đại dịch tả tấn cơng thành Florence. Năm 1883 Robert Koch được cử tới Ai Cập làm Chủ tịch Ủy ban về bệnh tả của Đức, để điều tra về dịch tả đang bùng phát ở đĩ. Ơng đã phát hiện ra vi khuẩn Vibrio chorela là nguyên nhân gây bệnh tả, ngồi ra ơng cũng nghiên cứu vụ vi khuẩn tả ở Ấn Độ. Ơng đã hệ thống hĩa nguyên tắc để kiểm sốt dịch tả (1893) và nĩ đã trở thành nền mĩng cho việc kiểm sốt dịch tả ngày nay. Ơng đã phát hiện ra vi khuẩn tả gây ra dịch tả ở người cĩ nhiều nhất ở trong phân của người bệnh, trong nước thải cĩ chứa phân. Ngồi ra cá, các thực phẩm khác từ nước nhiễm khuẩn nếu khơng được nấu chín cũng là nguồn gây bệnh. Vibrio parahaemolyticus : được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm 1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hào… Người ta đã xác định đuợc 21 lồi thuộc giống Vibrio, trong đĩ cĩ 4 lồi thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 9 2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố 2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp a. Phân loại theo khoa học Vibrio spp thuộc : • Giới (regnum): Bacteria • Nghành (phylum): Proteobacteria • Lớp (class) : Gamma Proteobacteria • Bộ (order): Vibrionale • Họ (family): Vibrionaceae • Chi (genus): Vibrio. • Lồi (species): Hiện nay cĩ khoảng 28 lồi Vibrio như Vibrio natriegens, Vibrio harveyi , Vibrio fischeri , Vibrio parahaemolytycus…Trong đĩ, 3 loại Vibrio thường gây bệnh cho người nhất là Vibrio parahaemolytycus, Vibrio cholera, Vibrio vulnificus. Hình 2.1: Vibrio harvey b. Phân loại theo kháng nguyên • Vibrio cholera nhĩm 01 (gọi tắt là V.cholerae 01): gồm các vi khuẩn gây dịch tả. • Vibrio cholerae non O1/non-O139: Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 10 Gồm các vi khuẩn cĩ tính chất sinh vật hố học giống V.cholerae O1, nhưng khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1. Cĩ thể gây bệnh lẻ tẻ và nhẹ, khơng thành dịch. Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là khơng sản xuất độc tố tả và khơng liên quan tới dịch tiêu chảy. Những chủng này được phân lập tình cờ từ những trường hợp tiêu chảy do ăn tơm cua hoặc từ những trường hợp nhiễm trùng ngồi ruột khác như: vết thương, tai, đờm, nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc nhĩm này được tìm thấy ở cửa sơng, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt nguồn từ ngoại cảnh. • Vibrio cholerae O139 (chủng Bengal): Lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nĩ khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và giống tả. Chủng Vibrio cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng Vibrio cholerae O1 và chủng non-O1. • Các Vibrio khác: Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, các Vibrio nhĩm F. 2.2.2.2. Phân bố Ngoại trừ V.cholerae cĩ thể hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loại Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường phân bố rộng ở các khu vực nước mặn, vùng nước ven biển, cửa sơng và các khu vực nuơi trồng thủy hải sản. Chúng tồn tại với số lượng lớn trong cả nước và trầm tích của hồ nuơi tơm, đặc biệt là trong nội tạng các sinh vật nuơi trồng thủy hải sản. 2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. 2.2.3.1. Đặc điểm chung Vibrio cĩ nguồn gốc từ “Vibrae” cĩ nghĩa là dao động, gồm các vi khuẩn cĩ dạng que uốn cong, cĩ dạng dấu phẩy, cĩ một tiên mao. Phần lớn các lồi Vibrio sống hoại sinh chỉ một số ít cĩ khả năng lây bệnh cho người. Vibrio cholerae (phẩy trùng tả) gây bệnh cho người, cĩ khả năng sống trong nước đến 3 tuần. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 11 Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những lồi vi khuẩn Gram (-), hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6μm. Chúng khơng sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn. Tất cả những lồi vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi khuẩn khơng phát triển trong mơi trường khơng muối (NaCl) và khơng sinh H2S. Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129. Một số chủng Vibrio cĩ khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc. Chúng sống trong nước ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nước lợ ven biển, vi khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng của tơm, cua… Đặc trưng của lồi Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH rất cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở mơi trường acid. Vibrio chứa các loại kháng nguyên O, K, H. 2.2.3.2 Đặc điểm của từng lồi a. V.parahaemolyticus: phát triển được ở mơi trường cĩ 1Ỉ 8% NaCl, tốt nhất 2Ỉ 4% NaCl và khơng sinh trưởng được trong mơi trường khơng cĩ muối (sẽ chết nếu đưa vào nước cất). Chúng khơng thể sống dưới 4oC nhưng phát triển tốt nhất ở 5Ỉ 9oC, pH tối ưu sống trong mơi trường 7% NaCl. - V.parahaemolyticus: cĩ phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh trypton ở 24oC. Phản ứng ADH (-), LDC (+), cĩ khả năng khử nitrate thành nitrite nhưng khơng lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để lên men nhưng khơng sinh hơi, khơng tăng trưởng được trong mơi trường khơng cĩ muối, tăng trưởng tốt trong mơi trường cĩ đến 8% muối nhưng bị ức chế trong mơi trường chứa 10% muối. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 12 Hình 2.2: V.parahaemolyticus b. V.cholerae: cĩ phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong mơi trường canh trypton ở 42oC, arginine dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, cĩ thể tăng trưởng được trong mơi trường chứ 0 – 3% NaCl, khơng phát triển được trong các mơi trường chứa 6, 8, 10% muối. - V.cholerae: là lồi vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên. Chúng gây bệnh dịch tả ở người (human cholerae). Bệnh gây ra do nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm bệnh. V.cholerae là những trực khuẩn ngắn mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 3.10-6 m. Khi mới phân lập, chúng cĩ hình phẩy di động rất nhanh. Trong điều kiện phịng thí nghiệm, chúng dễ dàng phát triển trong mơi trường bình thường mà khơng cần các yếu tố tăng trưởng. Ở nồng độ 5 - 15 mmol/l sẽ kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn. Vi khuẩn này ưa pH 8 – 9,5 nhiệt độ tối ưu là 37oC. Chúng cĩ thể phát triển được trong mơi trường cĩ chứa hàm lượng muối cao (trên 6% NaCl). - V.cholerae dễ chết trong mơi trường acid, bị tiêu diệt bới chất tẩy rửa, khơng chịu được độ ẩm thấp. Chúng cĩ thể tồn tại ở 55oC trong 10 phút. Thậm chí chúng cĩ thể sống trong mơi trường nước ngọt cĩ hàm lượng Na+ thấp. - V.chlolerae cĩ kháng nguyên H (trong tiên mao). Kháng nguyên này dễ bị tiêu hủy. Ngồi ra chúng cịn cĩ kháng nguyên O (phần lipopolysaccharide ở màng vi khuẩn), rất bền nhiệt. Kháng nguyên O (tế bào) là lipopolysaccharit, trong đĩ phần polysaccharit quy định tính đặc hiệu của kháng nguyên . Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 13 - V.cholera cĩ khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme. Trong đĩ cĩ enzyme mucinase. Enzyme này làm trĩc vãy biểu bì mơ ruột. Neuraminidase thủy phân ganglioside. GD1 và GT1 thành GM1. Vì thế số lượng thụ thể độc tố ruột tăng lên . Hình 2.3: V.cholerae c. V.vulnificus: khơng tăng trưởng được trong mơi trường cĩ muối và bị ức chế trong mơi trường cĩ 8 Ỉ 10% NaCl. Chúng được tìm thấy trong nước biển và hải sản, phần lớn chúng khơng phát triển được ở nhiệt độ lạnh nên vào mùa đơng rất khĩ phát hiện ra chúng. Chúng cĩ khả năng sinh tổng hợp nội độc tố cytotoxin với trọng lượng phân tử là 56Kda, hemolysin - 36Kda và cytoysin. Nước biển vùng nào cũng cĩ vi khuẩn này, nhưng cĩ nhiều nhất là vào tháng 5 và tháng 10. Chúng là nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu. Các bệnh nhân thường mắc phải ở lứa tuổi 40 (sức đề kháng của cơ thể giảm) và tỉ lệ tử vong là rất cao ( 60% ). Hình2. 4: V. Vulnificus Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 14 2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp. Cấu trúc genome của V. cholerae Khác với hầu hết các lồi thuộc chi Vibrio, genome của V. cholerae gồm 2 nhiễm sắc thể (NST) dạng vịng với kích thước tương ứng là 2961146 bp (NST I) và 1072314 (NST II). Cả 2 NST này chứa 3885 khung đọc mở (open reading frame, ORF) với hàm lượng G + C trung bình trên mỗi NST chiếm khoảng 41%. Heidelbeg cho rằng hai NST này cĩ nguồn gốc tiến hĩa khác hẳn nhau. NST lớn (NST I) chứa nhiều gen cần thiết cho việc thực hiện chức năng tế bào hơn NST nhỏ (NST II). Ví dụ như sự nhân đơi ADN, sự phân chia tế bào, sự phiên mã, dịch mã và sinh tổng hợp thành tế bào. NST I cũng mang hầu hết các locus gen liên quan đến tính gây độc, rất nhiều trong số đĩ là do thu nhận từ những lồi khác. Ví dụ yếu tố chính quyết định tính gây độc của tác nhân gây bệnh là độc tố tả (cholerae enterotoxin) được mã hĩa bởi gen của một virut và đã được gắn vào bên trong genome của V. cholerae trên NST I. Hay một nhân tố cần thiết cho sự xâm lấn ruột non là những vi lơng điều hịa độc tố (Toxin coregulated pili- TCP) đã được mã hĩa bởi những gen nằm trên vùng VPI (Vibrio Pathogenicity Island) quy định tính gây bệnh của Vibrio thuộc NST I. Vùng này được tìm thấy ở những chủng V. cholerae cĩ khả năng gây dịch. Sự biểu hiện của các gen liên quan đến tính gây độc được điều khiển bởi các protein giống ToxR và ToxT cùng với nhiều chất điều hịa khác được mã hĩa bởi những gen nằm trên NST I. Trên cơ sở nghiên cứu ở E.coli người ta thấy rằng ở mỗi tế bào vi khuẩn chứa một NST dạng vịng. Nhưng ở V. cholerae thấy cĩ sự thay đổi về số NST dạng thẳng hoặc dạng vịng. Sự cĩ mặt của các gen đặc trưng được xem như là một đặc điểm quan trọng nhận dạng các NST (ví dụ như gen mã hĩa cho các protein riboxom L20 và L35) đã cĩ mặt trên NST II. Vì vậy các gen này cho phép xác nhận NST II như là một NST thật. Sự tồn tại của những gen này chỉ ra rằng đây là trạng thái di truyền ổn định chứ khơng phải là Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 15 những chức năng cần thiết nhất thời được thực hiện từ một bản sao khơng ổn định trong xu thế tiến hĩa. Mặc dù tất cả các gen nằm trên NST II được xếp vào 16 nhĩm theo sự phân chia nhỏ các chức năng của tế bào, nhưng 8 nhĩm trong số đĩ chứa những gen ít quan trọng hơn những gen trên NST I. Những gen quan trọng trên NST II là những gen liên quan đến sự vận chuyển đường và năng lượng, sự truyền tín hiệu và sửa chữa ADN. 2.2.5. Yếu tố độc lực Vibrio cholerae sản xuất nhiều loại độc tố tác động với adenylate cyclase trong tế bào ruột và với nhiều thành phần của hệ thống điều hành ruột, bao gồm những tế bào thần kinh ruột và những tế bào Enterochromaffin (EC), để tạo ra tình trạng bài tiết và tiêu chảy với lượng lớn. Bên cạnh độc tố dịch tả (cholera toxin), vi khuẩn tả cịn sản xuất zonula occludens toxin (ZOT), độc tố này làm tăng sự thẫm thấu qua chỗ nối chặt chẽ giữa 2 tế bào ruột, và độc tố phụ (ACE: assessor cholera enterotoxin), chưa cĩ rõ phận sự trên những tế bào ruột. Độc tố cholerae toxin là một phức hợp protein do phẩy khuẩn Vibrio cholerae tiết ra. Độc tố cholerae toxin được tạo thành từ 6 tiểu đơn vị protein được gọi là oligomeric. Độc tố cholerae toxin hoạt hố enzyme adenylate cyclase trong các tế bào niêm mạc ruột dẫn hình thành cAMP và tiết nước, các ion Na+, K+, Cl-, HCO3- vào trong lịng ruột. Ảnh hưởng của độc tố phụ thuộc vào một thụ quan đặc biệt cĩ tên monosialosyl ganglioside (GM1 ganglioside) cĩ trên bề mặt các tế bào niêm mạc. Phẩy khuẩn sản xuất men tan nhầy và chất giúp nĩ xâm nhập vào tế bào đồng thời tác động làm ganglioside chuyển thành monosialosyl cĩ thể nhận độc tố. Độc tố cholerae toxin cĩ trọng lượng phân tử 84 kDa, bao gồm tiểu phần A và B. Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Tiểu phần B được kết hợp bởi 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết ở điểm thụ quan Ganglioside GM1 trên bề mặt tế bào eukaryote. Khi xâm nhập được vào tế bào, tiểu đơn vị A sẽ xúc tác quá trình chuyển đường ribose từ NAD đến protein cĩ tên gọi Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 16 Gs hoặc Ns. Protein này sẽ điều khiển hệ thống adenylate cyclase cĩ mặt ở phía trong màng tế bào. Adenylate cyclase là một enzyme liên kết với màng tế bào và cĩ khả năng chuyển ATP (adenosine triphosphate) thành dạng AMP vịng (cyclic adenosine monophosphate). Hình thành cAMP là một trong những bước đầu tiên để bất cứ một tín hiệu hố học nào tác động kích thích hay ức chế adenylate cyclase. Độc tố zonula occludens (ZOT) là một enterotoxin do vi khuẩn Vibrio cholera tiết ra, nĩ làm tăng tính thấm của tế bào niêm mạc ruột bằng cách gắn vào các thụ thể nằm trên tế bào cùa thành ruột. Một yếu tố độc hại chính thứ 2 của vi khuẩn tả giúp chúng sinh sơi nẩy nở trong ruột của chúng ta là toxin coregulated pilus (TCP). Một mảnh di truyền (operon) TCP cĩ chứa một số nhân di truyền, gồm tcpA là nhân di truyền mã hĩa cơ cấu chính (main structural gene) liên quan đến việc cấu tạo pilus. TCP khơng những liên quan tới khả năng giúp cho vi khuẩn tả sinh sơi nảy nở trong ruột con người nhưng nĩ cũng là nơi tiếp nhận (receptor) cho CTXφ. Độc tố đường ruột của vi khuẩn là sản phẩn của ctx gene. ctxA mã hố cấu phần A, ctxB mã hố cấu phần B. Thơng tin của các gene này được chuyển về cùng một mRNA sau khi sao mã (chúng là thành phần của một operon). mRNA này cĩ hai vị trí kết hợp với ribosome ở phía đầu 5' các đoạn gene tương ứng. Vị trí kết hợp ribosome của cấu phần B cĩ khả năng hoạt động mạnh hơn ít nhất 7 lần so với vị trí kết hợp ribosom của A chính vì thế mà lượng sản phẩm của quá trình dịch mã (các protein) của B sẽ gấp vài lần potein của A. Tỷ lệ protein A và B đảm bảo độc lực của vi khuẩn là 1A:5B. Sau khi được tổng hợp, protein A và B kết hợp với nhau tại vị trí giữa màng tế bào và màng ngồi của ribosom. Lượng protein B cịn dư sẽ được tiết ra khỏi tế bào. Tuy nhiên thành phần A phải được kết hợp với 5B để được vận chuyển ra ngồi tế bào. Thành phần A nguyên vẹn (chưa kết hợp với B) sẽ ở trạng thái bất hoạt và được giữ lại bằng cách hình thành hai phần A1 và A2 nối với nhau bằng liên kết disulfide. Khi độc tố vi khuẩn kết hợp với GM1 receptor của tế bào vật chủ, thành phần A1 được giải phĩng (bằng cách cắt liên kết disulfide) và xâm nhập vào tế bào. Cơ chế xâm nhập của A1 chưa được biết rõ. Cĩ giả thiết cho Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 17 rằng 5 đơn vị cấu phần B (5B) tạo thành một khe trên màng tế bào để giúp A1 xâm nhập. Quá trình sao mã của ctxAB được điều hồ bởi nhiểu yếu tố bao gồm cả các tín hiệu mơi trường trong đĩ vi khuẩn đang tồn tại như nhiệt độ, pH, tính thẩm thấu, các amino acid. Một số gene khác của phẩy khuẩn cũng được điều hồtheo cơ chế tương tự như các gene trong tcp operon. tcp được cho là quyết định quá trình tổng hợp "roi" hay "lơng" của vi khuẩn. Chính vì vậy mà cả ctx và tcp đều chịu ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường. Các protein đã được xác định liên quan đến quá trình điều hồ các gene nĩi trên bao gồm ToxR, ToxS và ToxT. ToxR là một protein màng với 2/3 amino acid nằm trong tế bào chất. Tổ hợp hai protein ToxR (ToxR dimer) kết hợp với vùng khởi sự của ctxAB và hoạt hố quá trình sao mã. ToxS protein được cho là cĩ chức năng đáp ứng với các tín hiệu mơi trường, làm thay đổi hình thái và cĩ thể thay đổi quá trình bắt cặp của ToxR qua đĩ xúc tiến sao mã. ToxS đĩng vai trĩ như bộ phận cảm biến, phosphoryl hố và chuyển ToxR sang trạng thái kết hợp với DNA. ToxT là protein trong tế bào chất cĩ chức năng hoạt hố tcp opeon dẫn đến tổng hợ thành phần của tcp pili. Biểu hiện của ToxT chịu ảnh hưởng của ToxR. Vì vậy, ToxR là một protein điều hồ thực hiện chức năng "khơi mào" hệ thống điều khiển. ToxR cũng được cho là tương tác với ToxS để thực hiện chức năng nhận biết các thay đổi của yếu tố mơi trường và chuyển các tín hiệu (ở mức phân tử) đến nhiễm sắc thể dẫn đến quá trình sao mã của các gene giúp vi khuẩn gắn kết với màng tế bào và sản xuất độc tố. Hồn tồn cĩ lý do để cho rằng mơi trường dạ dày- ruột (nhiệt độ 37 độ, pH thấp, tính thấm cao v.v.) khơng tương tự như các điều kiện trong mơi trường tồn tại tự nhiên của phẩy khuẩn (mơi trường nước) cĩ thể trở thành yếu tố tác động, kích kích sản sinh độc tố và gây nhiễm. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 18 2.2.6. Cơ chế gây bệnh Trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tả chỉ gây bệnh cho người. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống. Để xuống được ruột non, vi khuẩn phải vượt qua dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày cĩ độ pH thấp (mơi trường acid). Bình thường, pH của dạ dày đủ để gây chết cho vi khuẩn. Những vi khuẩn sống sĩt sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn cĩ khả năng tồn tại rất lâu. Phẩy khuẩn cĩ khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng nhầy trên niêm mạc ruột. Tuy nhiên, ở những người giảm tiết dịch vị acid hoặc uống NaHCO3 (hoặc các chất kiềm tính cĩ khả năng trung hịa dịch vị) thì cĩ thể mắc tả nếu trong thức ăn, nước uống cĩ vi khuẩn tả. Quá trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein thành các peptide. Do khả năng “tự bơi”, vi khuẩn cĩ thể chuyển động ngược chiều với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hố hướng động của chúng. Tại ruột non, chúng tiết ra nội độc tố “choleraetoxin” cĩ trọng lượng phân tử khoảng 84.000 gồm 2 tiểu đơn vị là A và B (do gen cĩ sẵn nằm trong DNA của vi khuẩn tổng hợp). Tiểu đơn vị B sẽ gắn vào thụ quan Ganglioside GM1. Việc gắn kết này sẽ hỗ trợ tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào ruột non. Chúng khơng xâm nhập vào biểu mơ ruột mà bám vào niêm mạc ruột. Tiểu đơn vị A cĩ chức năng enzyme chuyên biệt và hoạt động khi vào bên trong tế bào. Khi tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào, chúng sẽ kích hoạt adenylate cyclase liên tục để gia tăng sản sinh hàm lượng cAMP (Adenosine monophosphate vịng) nội bào bên trong tế bào, khiến cho ruột non khơng cịn chức năng hấp thu mà chuyển sang chức năng thải tiết dịch – làm phĩng thích hàng loạt ion, chất điện giải từ trong tế bào ra ngồi dịch ruột. Chính vì thế, tế bào sẽ mất rất nhiều điện giải ( K+, Cl-, Na+. . . ). Ngồi ra, chúng cũng tạo thành mơi trường ưu trương trong lịng ruột dẫn đến việc nước trong tế bào sẽ ra ồ ạt, gây tiêu chảy trầm trọng. Phẩy khuẩn cịn cĩ thể sở hữu protein bề mặt gây ngưng kết hồng cầu và nhĩm protein do gen acf mã hố. Nhĩm gen này quy định yếu tố hỗ trợ gắn kết của vi Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 19 khuẩn (accessory colonization factor). Đột biến gen acf dẫn đến giảm khả năng cố định của vi khuẩn vào niêm mạc ruột. Người nhiễm cĩ thể bị tiêu chảy ồ ạt, gây mất dịch nặng, người bệnh bị sốc do thể tích tuần hồn giảm, khả năng tử vong cao nếu khơng được xử lý kịp thời và đúng mức . Chúng chỉ xâm nhập vào đường ruột, khơng truyền nhiễm qua đường máu. Để phát bệnh, hàm lượng tế bào vi khuẩn tả trong ruột phải đạt nồng độ cao khoảng 108-1010 tb/ml. Trong khi đĩ bệnh do khuẩn Samonella hay Shigella chỉ cần nồng độ thấp cỡ 105-106 tb/ml là đã phát bệnh. Do đĩ, nếu người nào bị rối loạn tiêu hĩa, pH acid ở dạ dày khơng đủ kiềm hãm số lượng tế bào vi khuẩn thì chúng sẽ sống sĩt để di chuyển đến ruột non để gây bệnh. Sau khi xâm nhập được qua dạ dày và xuống ruột non, vi khuẩn tả bám vào niêm mạc nhưng khơng xâm nhập sâu vào mơ ruột, khơng gây tổn thương niêm mạc ruột. Chúng tiết độc tố ruột LT (thermolabile toxin) gắn vào niêm mạc ruột làm tế bào niêm mạc ruột giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và Cl- gây tiêu chảy cấp tính. Nếu khơng điều kịp thời trị, bệnh nhân sẽ tử vong vì mất nước và điện giải. Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae. Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhĩm vi khuẩn tả. Nhĩm vi khuẩn tả Khả năng gây bệnh V.cholerae serotype 01 Gây bệnh tiêu chảy nghiêm trọng, cĩ thể thành đại dịch V.cholerae serotype non-01 Gây tiêu chảy nhẹ, chỉ xâm nhiễm ngồi ruột non. V. parahaemolyticus Nhẹ, xâm nhiễm ngồi ruột no Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 20 Một số lồi khác: V. mimicus, V. vulnificus, V. hollisae, V. damsela… Khơng phổ biến, thường xâm nhiễm vết thương, mơ mềm Bảng 2.4: Các lồi Vibrio bị cho là gây bệnh ở người Bệnh Lâm Sàng Các lồi Vibrio Hệ tiêu hĩa Vết thương/Tai Nhiễm trùng máu V. cholerae V. cholerae O1 ++ (+) V. cholerae O139 ++ (+) V. cholerae non-O1, non-O139 ++ + (+) V. parahaemolyticus ++ + (+) V. fluvialis ++ ? V. mimicus ++ + V. hollisae ++ (+) V. furnissii ++ V. vulnificus + ++ ++ V. alginolyticus ? ++ ? V. damsela ++ ? V. cincinnatiensis + Hệ Tiêu Hĩa: ++, thường xãy ra nhất; +. Những thể lâm sàng khác: (+), hiếm Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 21 Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người. 2.2.7. Triệu chứng gây bệnh 2.2.7.1. Trên người - Thời kỳ đầu: Người bị bệnh sẽ thấy sơi bụng, đầy bụng, tiêu chảy vài lần. - Thời kỳ tồn phát: triệu chứng lâm sàng. Người bệnh tiêu chảy liên tục rất nhiều lần với khối lượng lớn, cĩ khi hàng chục lít một ngày (đi ngồi >3 lần/ngày). Phân tả điển hình tồn nước, màu trắng lờ đục như nước vo gạo, khơng cĩ nhầy máu, bệnh nhân nơn rất dễ dàng, lúc đầu ra thức ăn, sau tồn nước, ít khi đau bụng. Bệnh nhân khơng sốt. Mệt mỏi, khát, nhịp tim nhanh, huyết áp tụt, hạ thân nhiệt, mất nước nghiêm trọng. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 22 Phân ra liên miên chứa rất nhiều các chất muối sodium, potassium, chloride và bicarbonate; tình trạng mất những chất điện giải quan trọng này cĩ thể đưa đến các biến chứng nguy hiểm như tim loạn nhịp, kinh giật, đường trong máu cũng cĩ thể xuống thấp, và khi đường máu thấp quá, ĩc chúng ta sẽ mất sáng suốt, rồi chúng ta cĩ thể lên cơn kinh giật, vào hơn mê. Khơng chữa trị, tử vong bệnh lên đến 50-70%, nhất là ở trẻ em và phụ nữ mang thai; phụ nữ mang thai cũng rất dễ hư thai khi bị tả. Người bệnh cĩ thể chết trong vịng 2-3 tiếng đồng hồ sau khi bệnh phát ra. Hiện bệnh tả cĩ 4 thể: • Thể khơng cĩ triệu chứng; • Thể nhẹ giống tiêu chảy thường; • Điển hình nhất là thể cấp tính như miêu tả ở trên; • Thể tối cấp (diễn biến nhanh chĩng, bí tiểu, suy kiệt nhanh chĩng sau vài giờ và tử vong). Cận lâm sàng: Hematocrit tăng ở bệnh nhân khơng bị thiếu máu (do cơ đặc máu), pH máu động mạch giảm nhẹ, giảm mạnh mức bicarbonate, tăng urea máu, tăng nhẹ số lượng bạch cầu đa nhân trung tính. - Thời kỳ hồi phục: Bệnh diễn biến từ 1-3 ngày nếu được bù đủ nước và điều trị kháng sinh. Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 23 2.2.7.2 Trên động vật • Trên tơm Tơm bị nhiễm Vibrio spp ở trạng thái khơng bình thường, hơn mê, lờ đờ, kém ăn hoặc bỏ ăn. Tơm cĩ thể nổi lên mặt ao, dạt bờ hay kéo đang bơi lịng vịng. Vỏ tơm bị mềm và xuất hiện các vết thương hoại tử, ăn mịn trên vỏ và các phần phụ. Hình 2.8: Đuơi tơm sú bị mịn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio. Khi vi khuẩn này cảm nhiễm trên vỏ kitin và mang cĩ thể gây ra các vết thương tổn màu nâu đen do kitin đã bị ăn mịn và viêm nhiễm. Hội chứng này gọi là bệnh vỏ hay bệnh nhiễm nâu. Vỏ tơm cĩ sự biến đổi thành màu đỏ hay màu xanh. Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tơm mềm và cĩ màu xanh. • Trên cá Cá biếng ăn, hoạt động bơi bị rối loạn. Cơ thể cĩ màu đen đặc biệt ở vùng lưng và trên các vết thương tổn; da, vây cĩ thể sưng lên và bị lở loét. Cơ nổi hạch, mang nhợt nhạt, mắt cá lồi đục. Lớp cơ dưới da cĩ nhiều sắc tố melanin màu đen và thể hiện dấu hiệu hoại tử, cĩ hiện tượng lở loét của lớp biểu bì. Lá lách, gan, thận bị hoại tử, vết hoại tử này lan nhanh, hố lỏng và lá lách sẽ cĩ màu đỏ anh đào, rồi mất dần hình dạng ban đầu của Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 24 nĩ, gan chuyển từ màu xám nâu thành màu vàng. Các cơ quan bên trong khoang bụng xuất hiện mạch máu nổi rõ lên. Tim cá bị bệnh xuất hiện các vết nâu đen. 2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh ở Việt Nam và trên thế giới 2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh ở Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản là rất đáng báo động. Dịch tiêu chảy cấp năm 2007 xảy ra với diễn biến phức tạp và tốc độ lây lan nhanh chĩng: Đợt 1 (từ 23/10/2007-6/12/2007): xảy ra tại 14 tỉnh với 259 trường hợp (+) với phẩy khuẩn tả, đợt 2 (24/12/2007-5/2/2008): tại thành phố Hà Nội với 32 trường hợp (+). Dịch tiêu chảy cấp xuất hiện do yếu tố mơi trường bị ơ nhiễm, nguồn nước bị nhiễm khuẩn, bên cạnh đĩ cịn một yếu tố nguy cơ gây gia tăng tỷ lệ nhanh đĩ chính là việc nhiễm các lọai vi sinh: E.coli, V.chloera, Clostridium perfringens…của một số loại thức phẩm nguy cơ: các loại mắm, rau sống, thức ăn đường phố ăn liền, các loại thực phẩm hải sản tươi sống đơng lạnh. Trong năm 2009, cả nước đã xảy ra 147 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đĩ cĩ 5.026 người mắc, 3.938 người đi viện, 33 người tử vong. Vào năm 2010 các vụ ngộ độc thực phẩm thường xuyên xảy ra ở tập thể như: trong quý III/2010 cả nước đã cĩ 48 vụ ngộ độc thực phẩm trong đĩ cĩ 1.627 người mắc, 12 người tử vong, 75 cơng nhân của Xí nghiệp may Global (KCN Tiền Hải, huyện Tiền Hải) bị ngộ độc thực phẩm, Bình thuận 11/6/2010 cĩ 127 du khách bị ngộ độc thực phẩm. 2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đơng lạnh trên thế giới Trên thế giới các vụ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật chiếm khoảng 70% tổng số ca ngộ độc thực phẩm. Tại các nước châu Á Vibrio spp là nguyên nhân hàng đầu gây ra các vụ ngộ độc và các vụ nhiễm Vibrio spp chủ yếu ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và trong khu vực Đơng Nam Á. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 25 Theo thống kê ở Nhật Bản năm 1997 cĩ 1.960 vụ ngộ độc thực phẩm với 39.989 người mắc, ở Úc mỗi ngày cĩ 11.500 người mắc các bệnh cấp tính do ăn uống gây ra, ở Mỹ hàng năm cĩ đến con số hàng triệu trường hợp ngộ độc thực phẩm. Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Quốc Tế (WHO) cho biết cĩ 184.311 trường hợp bệnh tả được báo cáo từ 58 quốc gia (95% các quốc gia này thuộc Phi Châu) và cĩ 2.728 người chết do tiêu thụ thức ăn nhiễm Vibrio spp. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 26 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN ĐƠNG LẠNH 3.1. Phương pháp truyền thống 3.1.1. Phương pháp định tính 3.1.1.1. Nguyên tắc. Một lượng mẫu xác định (10g hoặc 25g) được tăng sinh trong mơi trường chọn lọc đặc trưng. Cấy phân lập từ mơi trường tăng sinh sang mơi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ trên mơi trường phân lập được khẳng đỉnh bằng các phản ứng sinh hĩa và huyết thanh học. Mơi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholerae, V. alginolytycus và V. vulnificus là nước peptone kiềm. Trong khi đĩ mơi trường Colistine Polymicine Borth thường được dùng để tăng sinh V. parahaemolyticus. Mơi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosalphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật len men được sucrose trong mơi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hĩa mơi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật khơng len men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ • Tủ ấm 37oC • Bể điều nhiệt 42oC • Cân điện tử cĩ độ chính xác 0,0001g • Mấy nghiền đồng thể • Mấy lắc ống nghiệm • Đĩa petri • Ống nghiệm với các kích cỡ 13, 16, 18mm • Một số thiết bị thơng thường khác như: máy đo pH, tủ sấy, nồi hấp thanh trùng, tủ lạnh. 3.1.1.3. Mơi trường và hĩa chất • Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water (APW). Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 27 • Canh Colistine Polymicine Broth (Colistine). • Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose (TCBS Agar). • Canh Tryptone. • Thạch Kligler Iron (KI). • Canh Hugh Leifson Glucose (HLG). • Canh Carbohydrate tím. • Mơi trường thử nghiệm Decarboxylase (Moeller). • Dung dịch oxidase. • Dung dịch thử nghiệm String (sodium desoxycholate 5%). • Kháng huyết thanh polyvalent O dùng cho V.cholerae. • Kháng huyết thanh O. • Dung dịch NaOH 1N. • Dung dịch HCl 1N. • Dung dịch dầu phủ vơ trùng. • Dung dịch Bromocresol tím. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 28 3.1.1.4. Quy trình phân tích. Dùng que cấy vịng lấy mẫu, cấy ria lên mặt đĩa mơi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn. Ủ trong 18 – 22 giờ.  Khuẩn lạc đặc trưng của Vibrio cĩ hình dạng: KL V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm,láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, cĩ quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. 25g mẫu + 225ml canh tăng sinh chọn lọc (APW) € đồng nhất trong 30 giây € độ pha lỗng 10-1 Chọn khuẩn lạc đặc trưng, cấy sang mơi trường khơng chọn lọc T1N1 (3% NaCl) hoặc TSA bổ sung 3% NaCl. Đem ủ 37 oC trong 18- 24h.  Thử nghiệm sinh hĩa và thử nghiệm kháng huyết thanh. Kết luận. Phát hiện hay khơng phát hiện Vibrio trong 25g (10g) mẫu. Ủ ở 37oC trong 6 – 8 giờ. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 29 3.1.1.5. Thuyết minh quy trình Ư Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g (10g) mẫu cho vào bao PE vơ trùng, sau đĩ thêm 225ml (90ml) dung dịch pha lỗng mẫu APW. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu. Thời gian dập mẫu là 30 giây. Tất cả các thao tác phải thực hiện trong điều kiện vơ trùng. Ư Tăng sinh chọn lọc Dùng nước peptone kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V.cholerae và V. alginolyticus, V. vulnificus. Dùng canh Colistine cho trường hợp V.parahaemolyticus. Sau đĩ đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ. Ư Phân lập Sau 24 giờ, dùng que cấy vịng lấy một ít sinh khối trên mơi trường APW và cấy lên bề mặt đĩa mơi trường thạch TCBS để phân lập khuẩn lạc đơn, ủ 37oC trong 18 – 22 giờ. Hình dạng khuẩn lạc đặc trưng của các lồi Vibrio trên mơi trường này như sau: khuẩn lạc V.cholerae và V. alginolyticus lớn, đường kính 2-3mm, láng, màu vàng, hơi phẳng, tâm đục, cĩ quầng trắng đục xung quanh. Khuẩn lạc V.parahaemolyticus và V. vulnificus lớn, đường kính 3-4mm, màu xanh đến xanh dương. Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 30 Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên mơi trường MacConkey Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên mơi trường TCBS Tiếp theo, cấy chuyền sinh khối từ các khuẩn lạc đặc trưng trên mơi trường phân lập TCBS thạch sang mơi trường khơng chọn lọc TSA 2% NaCl, ủ 37 oC trong 18- 24h để thu sinh khối sử dụng cho các thử nghiệm sinh hĩa. Ư Thử nghiệm sinh hĩa Thử nghiệm sinh hĩa quan trọng để phát hiện hay phân biệt các lồi Vibrio là: quan sát tính di dộng trên kính hiển vi, quan sát sự di động trên thạch mềm và các thử nghiệm khác. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 31 Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hĩa của Vibrio cholerea và Vibrio parahaemolyticus Thử nghiệm sinh hĩa Vibrio parahaemolyticus Vibrio cholerea ONPG (-) (+) Lactose (-) (-) ADH (-) (-) LDC (+) (+) TDA (-) (-) Indol (+) (+) Manose (+) (+) Sucrose (-) (+) Oxidase (+) (+) NaCl 0% (-) (+) NaCl 3% (+) (+) NaCl 6% (+) (-) NaCl 8% (+) / (-) (-) NaCl 10% (-) (-) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 32 + Thử nghiệm trên mơi trường TSI, KIA Nhằm xác định vi sinh vật sử dụng các nguồn carbohydrate nào, cĩ sinh ga hay khơng, cĩ sinh H2S hay khơng. Cấy chuyển các khuẩn lạc từ mơi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuơi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Trên mơi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của mơi trường chuyển màu vàng, khơng sinh hơi và khơng sinh H2S. Trên mơi trường KIA, phần thạch nghiêng cĩ màu đỏ và thạch đứng màu vàng, khơng sinh hơi và khơng sinh H2S. Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA + Thử nghiệm với các canh thang trypton muối Cấy khuẩn lạc từ mơi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton cĩ giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuơi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang cĩ nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục mơi trường. + Thử nghiệm lên men - oxy hố Cấy khuẩn lạc từ mơi trường TSA vào 2 ống mơi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucoza hoặc O/F glucoza. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khống vơ trùng vào một trong 2 ống, ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 ngày. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 33 V. cholerae lên men glucoza làm mơi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và mơi trường O/F từ màu xanh thành vàng. + Thử nghiệm oxidaza Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidaza. Dùng que cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vơ trùng lấy các khuẩn lạc từ mơi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidaza. V. cholerae làm vết ria cĩ màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây . Chú thích: khơng dùng que cấy bằng crơm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. + Nhuộm gram Kỹ thuật nhuộm Gram phát hiện hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn, với thành phần thuốc nhuộm gồm cĩ tím gentian, dung dịch lugol, Fucsin kiềm bằng cách cố định tiêu bản sau đĩ nhỏ thuốc nhuộm tím gentian lên trong 2 phút, rửa nước, sau đĩ nhỏ dung dịch lugol lên trong 2 phút, hất đi, tẩy mầu bằng cồn 90o tới khi bạc màu, rửa nước, nhỏ dung dịch Fucsin kiềm ( pha lỗng tỷ lệ 1/10 ) lên trong 1/2 phút, rửa nước, để tiêu bản khơ trong khơng khí hoặc dùng giấy thấm, soi tiêu bản bằng vật kính dầu. Nhận biết vi khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, cĩ hình thể mảnh, cong, hình dấu phẩy, khơng cĩ vỏ, khơng sinh nha bào, khi nuơi cấy lâu ngày sẽ cĩ sự thay đổi về hình thể so với ban đầu. V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy. Hình 3.5: Vibrio cholerae Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 34 + Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 42oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 42oC làm mơi trường bị đục. + Thử nghiệm lên men các nguồn cacbonhydrat Nguyên tắc: - Thử khả năng lên men carbohydrate của các chủng vi sinh vật khác nhau. - Những vi sinh vật khác nhau cĩ khả năng sử dụng các nguồn carbon khác nhau. Carbohydrate chia làm 3 nhĩm: - Nhĩm 1: Monosaccharide, polyhydroxylic, aldehyde hoặc ketone. - Nhĩm 2: polysaccharide và oligosaccharide. - Nhĩm 3: polyhydric alcohol và các cycitol. Lên men: Là quá trình trao đổi chất oxy hĩa khử, mà chất nhận điện tử cuối cùng khơng phải là oxy mà là các cơ chất hữu cơ khác. Sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men phụ thuộc vào: - Dịng VSV khác nhau. - Cơ chất tự nhiên dùng để lên men. - Thời gian, nhiệt độ, pH của mơi trường. Phát hiện vi sinh vật cĩ lên men carbohydrate: - Sản phẩm tạo thành Ỉ pH mơi trường giảm Ỉ sử dụng chất chỉ thị để phát hiện - Cĩ sinh hơi Phát hiện hơi sinh ra như thế nào? - Mơi trường lỏng (VSV hiếu khí) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 35 Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí cĩ lên men carbohydrate - Mơi trường đặc (VSV kỵ khí) Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí cĩ lên men carbohydrate Cách thực hiện: - Mơi trường sử dụng: phenol red broth base đối với VSV hiếu khí và phenol red agar đối với VSV kỵ khí - Nguồn carbon: tùy vi sinh vật - Đọc kết quả: (+): mơi trường chuyển sang vàng (-): khơng đổi màu Cấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol cĩ chứa một trong các lọai cacbohydrat: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton, D- Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 36 mannoza. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37oC. Phản ứng dương tính khi mơi trường cĩ màu vàng, âm tính khi mơi trường giữ nguyên màu đỏ. V. cholerae cho phản ứng sacaroza, manniton, mannoza dương tính và lactoza, cellobioza, arabinoza âm tính. Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate + Thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza Nguyên tắc: xác định khả năng của một vi sinh vật cĩ khả năng tổng hợp các enzyme khử nhĩm carboxyl hay tách hydrogen từ các aminoacid như ornithin, lysin hay arginin Ỉ làm kiềm mơi trường nuơi cấy. Cơ sở sinh hĩa: Lysine DeCarboxylase Lysine Cadavarine + CO2 Ornithine DeCarboxylase Ornithine Putrescine + CO2 Arginine DeCarboxylase Arginine Agmatine Putrescine + CO2 Cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng khơng cĩ axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khống vơ Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 37 trùng, ủ các ống ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi mơi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi tồn bộ ống canh thang cĩ màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng). V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính. Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decacboxylaza/dehydrolaza + Thử nghiệm urê Mục đích: xác định sự hiện diện của enzyme urease ở vi sinh vật thơng qua khả năng phân hủy urea. Cơ chế: Urea + H2O Œ CO2 + H2O + NH3 Sản phẩm tạo thành là ammonia carbonat làm đổi màu chất chỉ thị. Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu mơi trường giữ nguyên màu tím hồng. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 38 Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea + Thử nghiệm ONPG Để xác định sự hiện của enzyme β-galactosidase. Xét xem VSV cĩ thể sử dụng lactose như một nguồn carbohydrate. Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG β-galactosidase Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 39 Lấy vi khuẩn đã phát triển trên mơi trường TSI hoặc từ mơi trường khơng chọn lọc khác cĩ chứa 1,0% lactoza vào ống nghiệm cĩ chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hồ tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG, ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37oC. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch cĩ màu vàng. Cĩ thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hồ tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên. Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat. Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 cĩ chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đĩ, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae khơng phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vịng vơ khuẩn xung quanh các đĩa O/129. Hình 3.12: Kết quả thử nghiệm ONPG + Tính ưa mặn (NaCl): cấy chuyển từ TSA vào mơi trường canh trypton (khơng cĩ NaCl), canh trypton (3% NaCl), canh trypyon (6% NaCl) và canh trypton(8% NaCl), canh trypton (10% NaCl). Ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả tính ưa mặn của V.cholerae , V.parahaemolyticus như sau: Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 40 Tính ưa mặn V.cholerae V.parahaemolyticus V.culnificus 0% + - - 3% + + + 6% - + + 8% - + - 10% - - - + Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129Vibriostat Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 cĩ chứa 10 mg hoặc 150 mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đĩ, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37oC trong 18 - 24 giờ. V. cholerae khơng phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vịng vơ khuẩn xung quanh các đĩa O/129. + Thử nghiệm kháng huyết thanh. Mục đích: xác định các dịng Vibrio khác nhau. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vơ trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi cĩ hiện tượng ngưng kết ở giọt cĩ kháng huyết thanh và khơng cĩ hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 41 Tĩm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 3.2 và Bảng 3.3 Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1 Dung dịch muối sinh lý Kết luận Chủng cĩ kết quả sinh hố tương tự V. cholerae + - V.cholerae O1 Chủng cĩ kết quả sinh hố tương tự V. cholerae - - V.cholerae non- O1 Chủng cĩ kết quả sinh hố tương tự V. cholerae + + Chủng khơng đặc hiệu với kháng nguyên O nhĩm 1 Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba Kháng huyết thanh Ogawa Dung dịch muối sinh lý Kết luận V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima V.cholerae O1 - - - Chủng khơng đặc hiệu Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 42 3.1.1.6. Đọc kết quả Phát hiện hoặc khơng phát hiện được V. cholerae trong 25 g (10g) mẫu. 3.2. Phương pháp hiện đại 3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent Assays) ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hĩa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Kỹ thuật ELISA cĩ thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V.harveyi trên tơm, mẫu nước và cĩ thể xác định tất cả các dịng Vibrio spp. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể và gồm các bước cơ bản sau: - Kháng nguyên chưa biết được gắn trên một bề mặt. - Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đĩ. Kháng thể này được gắn kết với enzyme. - Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu cĩ thể xác định được. Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên – kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự cĩ mặt hay khơng cĩ mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu. Để tiến hành ELISA cần phải cĩ ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thơng thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm (polystyrene microtiter plate). Phương thức cố định khơng đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa. Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra. Kháng thể đặc hiệu sẽ được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng nguyên – kháng thể cĩ thể sảy ra. Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 43 quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thơng qua các liên kết cộng hĩa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này. Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể khơng đặc hiệu, kháng thể khơng gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch cĩ tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ cịn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng nguyên – kháng thể. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ sảy ra. Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Cĩ những phương pháp ELISA như sau: 3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng (được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết. Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hịa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn. Thêm dung dịch protein khơng tương tác (non – interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blocking" do protein huyết thanh cĩ tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. Rửa bề mặt đĩa sau đĩ chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà khơng kết hợp với protein của huyết thanh. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 44 Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng nguyên cịn dư (bước này cĩ thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme). Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme cịn dư sẽ được loại bỏ. Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hĩa học (enzyme cĩ tác dụng như yếu tố khuyếch đại). Hình 3.13: ELISA gián tiếp. 3.2.1.2. Sandwich ELISA Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình cĩ thể được thay đổi trong nhiều trường hợp): - Chuẩn bị bề mặt (microtiter) cĩ gắn kháng thể. - Khĩa tất cả những vị trí gắn kết khơng đặc hiệu trên bề mặt. - Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định. - Rửa đĩa, kháng kháng nguyên khơng được gắn kết sẽ bị rửa trơi. - Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đốn. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 45 - Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp). - Rửa đĩa, phần khơng gắn kết sẽ bị rửa trơi. - Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hĩa điện. Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hĩa... qua đĩ xác định sự cĩ mặt và hàm lượng kháng thể. Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng kháng thể (2) Thêm mẫu cần xác định kháng nguyên. Kháng nguyên (nếu cĩ) sẽ gắn với kháng thể; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với Kháng nguyên; (4) Thêm kháng thể thứ cấp liên kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu cĩ thể phát hiện và đo được. 3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) Các giếng trong kỹ thuật ELISA được gắn một kháng thể sơ cấp chống lại kháng nguyên. Các tác nhân phát hiện là một phức hợp đồng hĩa trị của kháng nguyên này và một enzyme thường sử dụng là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Các tác nhân này được trộn chung với mẫu dịch chiết của kháng nguyên và phức hợp này được cho vào trong giếng. Trong giếng đối chứng (khơng chứa kháng nguyên trong mẫu), phức hợp kháng nguyên – enzyme cĩ thể gắn lên các kháng thể Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 46 sơ cấp và sau đĩ thêm các cơ chất tạo màu, kết quả là hiện màu trong mẫu. Trong các giếng kiểm tra, các phân tử kháng nguyên tự do trong dịch chiết cạnh tranh với các phức hợp gắn trên các kháng thể sơ cấp. Nồng độ kháng nguyên càng cao, phức hợp gắn trên kháng thể sơ cấp càng tí dẫn đến màu trong giếng càng nhạt. Thí nghiệm này nhanh, dễ dàng thực hiện. Hình 3.15: ELISA cạnh tranh. 3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karl Mullis và cộng sự (Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đĩ đã tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên tồn thế giới. Ðây là phương pháp in vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao từ một trình tự DNA đặc biệt dựa trên hoạt động của các dNTP tự do là enzyme polymerase, sau 20-35 chu kì cĩ thể nhân được số bả sao rất lớn của đoạn DNA cần khuếch đại. Kỹ thuật PCR chuẩn chỉ thực hiện được khi biết rõ các trình đặc hiệu ở 2 đầu DNA cần nhân gen (đoạn khuơn) để cĩ thể thiết kế các cặp mồi đặc hiệu . Hiện nay cĩ thể sử dụng kỹ thuật khuếch đại DNA để chuẩn đốn nhanh bệnh do Vibrio spp trong vài giờ mà khơng mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 47 3.2.2.1 Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho Vibrio spp. Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới từ mạch khuơn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là những đoạn DNA ngắn cĩ khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuơn. Ðoạn mồi này sau đĩ sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hồn chỉnh. Trong một phản ứng PCR để khuyếch đại một trình tự đặc biệt nào đĩ, ta cần phải cĩ những thơng tin tối thiểu về trình tự đĩ để thiết kế các mồi bổ sung ở hai đầu mạch bao gồm một mồi xuơi (sense primer) và một mồi ngược (antisense primer) so với chiều phiên mã của gene. Một khi được cung cấp hai mồi bổ sung ở hai đầu, phản ứng sẽ cho ra hàng loạt bản sao của đoạn DNA nằm giữa hai mồi đĩ. 3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao trong vịng 30 giây – 1phút, thường là ở 940C. - Giai đoạn bắt cặp: ở giai đoạn này, nhiệt độ được hạ thấp cho phép các mồi bắt cặp với khuơn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng từ 30° – 70°C khoảng 40 giây – 1 phút. - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên đến 720C cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thưịng kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần làm tăng số lượng bản sao lên gấp đơi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số nhân và theo tính tốn, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bản mẫu ban đầu. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 48 Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR. Phát hiện gen cholerae toxin bằng phương pháp PCR: Gen cholera toxin hiện diện trong V.cholerae nhưng nĩ khơng biểu hiện trong điều kiện thí nghiệm bình thường. Vì vậy, kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại gen tcx được thực hiện để phát hiện V.cholerae. Phương pháp này cung cấp kết quả nhanh và chính xác hơn. • Các bước thực hiện : - Lấy 1ml mẫu mơi trường APW vào ống ly tâm 1.5ml và đun sơi trong 10 phút. Lysate cĩ thể sử dụng ngay lập tức cho PCR hoặc được lưu trữ ở -20oC cho đến khi sử dụng. - Mẫu DNA sau khi thu nhận được pha lỗng theo nồng độ thích hợp. - Lấy 2 ml mẫu them vào 18ml H2O cất khử ion ( tỷ lệ 1:9 ) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 49 - Pha lỗng mẫu DNA . - Thực hiện phản ứng PCR 50 ml .Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần sau : • 10X Tap buffer 5.0 ml • MgCl2 ( 25Mm ) 1.5 ml • Tris- HCl 10 ml • DATP , Dttp, Dgtp , dctp 4x0.2ml • Primer : • Primer xuơi : 5’-TGA AAT AAA GCA GTC AGG TG-3’ 0.5ml • Primer ngược : 5’-GGT ATT CTG CAC AAT CAG-3’ 0.5ml • Nước cất khử ion 31.5 ml • Tap polymerase ( 2,5 U) 0.2ml Thiết lập phản ứng PCR Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer 1 55 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 50 Sơ đồ phản ứng PCR: Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 51 3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) Kỹ thuật PCR phức là phương pháp PCR sử dụng đồng thời cùng 1 lúc nhiều cặp mồi đặc hiệu khác nhau, để nhận các đoạn DNA đặc trưng khác nhau trên một phân tử DNA, hoặc trên các phân tử DNA khác nhau. Kỹ thuật PCR phức thường sử dụng để nhân các exon của gen độc tố của Vibrio spp. Kỹ thuật này thường sử dụng để phát hiện sớm tơm, cá bị nhiễm bệnh do các lồi virus, vi khuẩn khác nhau. Các bước thực hiện tương tự như kỹ thuật PCR chuẩn, yêu cầu tính tốn tỉ lệ cặp mồi và lượng DNTP, enzyme DNA polymerase thích hợp để hiệu quả PCR chính xác . Các bước thực hiện : tương tự như PCR chuẩn . - Thực hiện multiplex PCR gồm 10 gen của DNA tinh khiết .Hỗn hợp phản ứng gồm : • Triphosphates deoxynucleoside. • DNA polymerase Amplitaq (3U). • Nước cất khử ion. • Bộ đệm PCR [60ml Tris-Cl (pH 9.0), 15ml(NH4)2 SO4, 2ml MgCl2] hay đệm C [50ml Tris-Cl (pH 8.9), 50ml KCl, 2.5 ml MgCl2] Các Oligonucleotide primer của đối tượng gene sử dụng là : • V.vulnificus : vvh và viuB • V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8. • V.cholera : ompU, toxR, tcpl • Vibrio cổ điển : hlyA Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 52 Multiplex PCR 3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray Kỹ thuật DNA microarray là kỹ thuật lai các đoạn cDNA mạch đơn ngắn được đánh dấu huỳnh quang , với tập hợp các đoạn oligonucleotid đã biết trình tự được gắn ở các vị trí được xác định trên GeneChip để kiểm tra và phát hiện 1 trình tự nucleotide (1 gene) nào đĩ . Kỹ thuật DNA microray dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu cĩ thể bắt cặp với các mẫu dị cĩ trình tự tương đồng nhau theo nguyên lý Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai. Dựa vào kỹ thuật phát Thiết lập phản ứng PCR phức Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC ) Giai đoạn 1 3 94 Giai đoạn 2 Biến tính 1 94 Primer + V.parahaemolyticus 1 55 + V.vulnificus 1 65 +V. cholera 1 60 Primer mở rộng 1 72 Giai đoạn 3 3 72 Số chu kỳ :20Ỉ 35 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 53 hiện huỳnh quang, với các máy quét scanner chuyên dụng cĩ thể xác định được vị trí của các phân tử lai. 3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp Các chủng được sử dụng trong phương pháp này là : V.cholerae 154 serovar 0:1 Inaba Tox (ATCC 14100), V.vulnificus M06-24 (0), V.prahaemolyticus F113 –A, và V.parahaemolyticus nhĩm huyết thanh (serotype) 03:K6 BCA 98-03372. Sử dụng mơi trường MCPC agar (Modified cellobiose – polymyxin-colistin) và TCBS agar (thiosulfate-citrate – bile-sucrose) dùng để thu nhận khuẩn lạc của 3 lồi Vibrio. • V.cholera được nuơi trên mơi trường Luria-Bertani agar ở 37oC. • V. vulnificus được nuơi trên mơi trường marine agar ở 37oC. • V.parahaemolyticus được nuơi trên mơi trường nutrient agar cĩ bổ sung 3 % NaCl ở 37oC. Gene AND xác định: gene AND được lấy từ 1ml khuẩn lạc đem ly tâm 9000xg, sau đĩ loại bỏ các tế bào bằng 550ml dung dịch TE (10mM Tris-Cl, 1mM EDTA [pH8]). Sau 1 giờ ủ, thêm vào 100ml NaCl 5M cùng với 80 ml cetyltrimethylammonium bromide (ACTAB)–NaCl để tạo phức với polysaccharides. Các mẫu dị của các đối tượng gene sử dụng là : • V.vulnificus : vvh và viuB • V.parahaemolyticus : tlh, tdh, trh, ORF8 • V.cholerae : ompU, toxR, tcpl • Vibrio cổ điển : hlyA Hỗn hợp PCR phức sau khi hợp thành biotin – CTP, phản ứng kết thúc khi cho 5ml dung dịch 0.2M EDTA và phản ứng hỗn hợp làm biến tính ở 95oC trong 5 phút. Chuẩn bị DNA array: pha lỗng đầu dị oligonucleotide trong đệm Spotting (0.1 M NaH2PO4, 0.2 NaCl, SDS 0.01 %). Mười hai DNA array độc tạo đốm giống 4 Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 54 sao chép trên mỗi mảng. Mỗi mảng gồm 1 oligonucleotide chuyên biệt ( khoảng 25 mer ) liên kết với biotin. 3.2.4.2. Các bước thực hiện • Thu thập các mẫu, phá vỡ màng tế bào và tách RNA thơng tin . • Phiên mã ngược: thực hiện mã ngược với các mồi oligo, enzyme phiên mã ngược và dNTP các lồi tạo nên các phân tử cDNA tương ứng với các mRNA. • Phiên mã in-vitro tạo các mạch RNA đánh dấu huỳnh quang: sử dụng T7 RNA polymerase, biotin – CTP, từ mỗi mạch đơn cDNA tạo nên khoảng 50 - 100 cRNA – Biotin. • Cắt đoạn: đun cRNA – Biotin ở 98oC trong 3 phút trong dung dịch đệm hybridization (4x SSC [1x SSC gồm 15mM NaCl cộng với 0.15 mM sodium citrate] [pH 7.0 ], 5x Denhardt’s soludition [0.1% Ficoll, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1 % bovine serum albumin]), cắt thành các đoạn cRNA – biotin khoảng 35-200 ribonucleotide. • Lai: các đoạn cRNA – biotin được chuyển lên các Genechip chứa các mẫu dị cDNA mạch đơn đã biết trình tự thực hiện phản ứng lai. • Nhuộm: rửa genechip để loại bỏ các cRNA đánh dấu huỳnh quang khơng được lai, sau đĩ nhuộm các phân tử lai bằng strepavidin-phycoerythrin. • Phân tích: các GeneChip đã nhuộm được đưa vào các thiết bị scanner chuyên dụng quét dự liệu phân tích kết quả . 3.2.5. Kỹ thuật RAPD RAPD là kỹ thuật phát hiện tính đa dạng của ADN nhân bản ngẫu nhiên dựa trên nguyên lý của kỹ thuật PCR. Khác với PCR thơng thường cần phải biết thơng tin về trình tự ADN của đoạn gen cần nhân bản để thiết kế đoạn mồi, kỹ thuật RAPD chỉ cần một lượng nhỏ ADN cĩ nguồn gốc genom là đủ. Các đoạn mồi được tổng hợp dưới dạng decamer, tức là các oligonucleotit chỉ dài 10 nucleotit theo những trình tự nhất định. Đoạn mồi được bắt cặp với ADN khuơn ở nhiệt độ khơng cao (khoảng 36oC) cho nên sẽ cĩ nhiều đoạn ADN khác nhau được nhân bản. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 55 Chu trình nhiệt để phát hiện tính đa hình ADN nhân bản ngẫu nhiên: 95oC – 5 phút, 95oC – 1 phút, 36oC – 1 phút, 72oC – 2 phút, 45 chu kỳ (từ bước 2 đến bước 4), 720C – 8 phút, kết thúc ở 4oC. Mồi được sử dụng cho phản ứng RAPD ký hiệu là RAPD1 cĩ trình tự như sau: RAPD1: 5’- GGTGCGGGAA-3’ (Mồi RAPD1 đã được sàng lọc trong tổng số 6 mồi vì nĩ cho kết quả đa hình gen cao nhất) Thành phần tham gia phản ứng RAPD gồm: Nước khử ion vơ trùng (18,2 μl), Đệm cho Tag-polymerase (2,5μl), dNTP (2 μl), Mồi RAPD (1μl), Tag-polymerase (0,3 μl), ADN khuơn (ADN tổng số của mỗi chủng V. cholerae – 1 μl). Tổng thể tích cho một phản ứng là 25 μl. Điện di ADN trên gel agaroza Các đoạn ADN cĩ khối lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện trường cĩ điện thế và cường độ thích hợp. Hố chất điện di: agaroza 1-1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử ADN); dung dịch đệm TAE 50X (60,5g Tris base; 14,3ml axit axetic; 25ml EDTA 0,5M, pH 8.0), 10mg/ml bromit ethidium (ethidium bromide -EtBr), đệm tra mẫu 10X (Loading buffer: 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3% glyxerol 100% và dẫn bằng nước đến 1 ml). Quy trình điện di như sau: • Chuẩn bị gel agaroza: Cho 1g agaroza (đối với điện di ADN tổng số và sản phẩm PCR) hoặc 1,5g (đối với điện di sản phẩm RAPD) vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun cho agaroza tan hồn tồn, để nguội khoảng 50-600C, đổ dung dịch agaroza vào khay gel điện di cĩ cài sẵn răng lược. Sau 30-60 phút, khi gel đã đơng cứng, gỡ lược ra, đặt bản gel vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel từ 1-2mm. • Mẫu ADN được trộn với đệm tra mẫu theo tỉ lệ 5:1 cĩ tác dụng tạo mầu và để mẫu lắng xuống dưới, tra mẫu vào các giếng nhỏ trên gel, chạy điện di ở điện thế ổn định 100V cùng chỉ thị ADN chuẩn để xác định trọng lượng phân tử, quan sát sự di chuyển của màu để ngừng quá trình điện di. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 56 • Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuơn, ngâm khoảng 10 phút trong dung dịch TAE 1X cĩ EtBr (2mg/ml) trên một máy lắc nhẹ, sau đĩ rửa bằng nước, quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254nm trên máy soi ADN và chụp ảnh. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 57 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình làm bài khĩa luận này chúng tơi nhận ra rằng Vibrio spp là 1 lồi vi khuẩn nguy hiểm cho cả con người và động vật, nhĩm vi khuẩn này cĩ thể lây nhiễm trên tất cả các giai đoạn phát triển của động vật thủy sản, trên tất cả các giai đoạn chế biến thực phẩm thủy hải sản và đã gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành thủy hải sản trên thế giới và tại Việt Nam, ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân. Vi khuẩn này rất nguy hiểm đặc biệt là các độc tố đường ruột của nĩ. Nĩ gây ra các vụ nhiễm khuẩn đường ruột cịn được coi là 1 siêu kháng nguyên rất nguy hiểm và là sự bắt đầu của các triệu chứng sốc độc hại. Tĩm lại, trên thế giới hiện nay cĩ rất nhiều loại vi khuẩn nguy hiểm khơng chỉ là Vibrio spp mà cịn là S.aureus, Clostridium botulinum, E.coli, Salmonella. Đây đều là những vi khuẩn nguy hiểm đến sức khỏe của con người. Việc tìm hiểu và nghiên cứu về chúng là rất cần thiết để đề ra các biện pháp phịng ngừa thích hợp nhưng cĩ lẽ ý thức của mỗi con người là biện pháp phịng ngừa hiệu quả nhất. Cĩ những phương pháp thơng dụng để xác định vi khuẩn Vibrio spp. như là phương pháp nuơi cấy trên mơi trường đặc trưng, phương pháp ELISA dựa theo nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể, phương pháp PCR dựa vào việc phát hiện đoạn DNA đặc hiệu của vi khuẩn Vibrio sp. và cĩ thể đưa đến những biện pháp phịng ngừa, điều trị thích hợp. 4.2. Kiến nghị Trên cơ sở được biết những mối nguy hại của Vibrio spp gây ra trên hải sản, chúng tơi mong rằng các nhà chức trách cần tiến hành những biện pháp kiểm tra nghiêm khắc đối với những người làm ăn lấy lợi ích kinh tế đặt lên hàng đầu sử dụng những thực phẩm khơng tươi ngon, khơng đảm bảo chất lượng trong kinh doanh hải sản cho người tiêu dùng, nhà chức trách nên thường xuyên kiểm tra các cơ sở kinh doanh, các mặt hàng hải sản để tiến hành ngăn chặn kịp thời những hành vi khơng đúng qui định. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 58 Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn Vibrio spp khác nhau để tổng hợp, đưa ra các phương pháp xác định chính xác và biện pháp phịng ngừa thích hợp cho bệnh ở động vật thủy sản. Nghiên cứu phát triển và ứng dụng chế phẩm vi sinh vào trong lĩnh vực nuơi trồng thủy sản nhằm nâng cao chất luợng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an tồn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của xã hội. Quá trình kiểm tra chất lượng cần tiến hành thường xuyên ở tất cả các cơng đoạn sản xuất cuối cùng, kể cả giai đoạn phân phối và bảo quản. Các giai đoạn của thủ tục kiểm tra bao gồm : - Nhận diện các chuẩn mực về chất lượng . - Thiết lập các tiêu chuẩn chất lượng cho mỗi một chuẩn mực . - So sánh các kết quả với tiêu chuẩn . - Đánh giá và phân tích các sai biệt quan sát thấy. - Đề ra các biện pháp sữa chữa . Bên cạnh đĩ, chúng tơi mong rằng người tiêu dùng hãy thật cảnh giác trước khi lựa chọn các loại thực phẩm nĩi chung và hải sản nĩi riêng. Các nhà khoa học cũng cần cĩ thêm nhiều nghiên cứu hơn nữa và thong tin rộng rãi trên các phương tiện thơng tin đại chúng để người dân cĩ những kiến thức cơ bản nhằm giảm thiếu những vụ ngộ độc thực phẩm . Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu trong nước 1. Bùi Quang Tề, (1996). Bệnh tơm cá và giải pháp phịng trị.Tạp chí thuỷ sản số 4/1996. 2. Đỗ thị Hịa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội (2004). Bệnh học thủy sản. NXB Nơng Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Trần Linh Thước, (2007). Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục. 4. PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật trong thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá chất lượng an tồn thực phẩm. Tài liệu tiếng Anh 1. Tom Defoirdt, Peter Bossier, Patrick Sorgeloos and Willy Verstraete, (2004). The impact of mutations in the quorum sensing systems of Aeromonas hydrophila, Vibrio anguillarum and Vibrio harveyi on their virulence towards gnotobiotically cultured Artemia franciscana. Ghent University, Belgium. Tài liệu web 1. _t%E1%BB%AD 2. 3. php?storyid=236 4. 5. cholerae-trong-san.html Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 60 6. %20cua%20ong%20To%20Viet%20Chau%20- %20Bo%20Nong%20Nghiep%20va%20PTNT.pdf 7. 3 8. 1&ID=3669 9. trong-san-pham-thuy-san-Phuong-phap-dinh-tinh.thuoc 10. s%E1%BB%B1-da-hinh-gen-c%E1%BB%A7a-cac-ch%E1%BB%A7ng- vibrio-cholerae-b%E1%BA%B1ng-k%E1%BB%B9-thu%E1%BA%ADt-rapd/ 11. 45.pdf 12. 13. cal-AnalyticalManualBAM/UCM070830 14. 15. dinhtenvk02.htm. 16. 17. Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 61 PHỤ LỤC Một số mơi trường chính trong phương pháp truyền thống nuơi cấy và phân lập Vibrio spp ™ Canh thang bromcresol • Pepton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Cao thịt bị : 3,00 g • Tím bromcresol : 0,04 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,0 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho mơi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rĩt 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacaroza, lactoza, D-cellobioza, arabinoza, D-manniton và D-mannoza) trong nước cất rồi lọc vơ trùng. Thêm 0,278 0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml mơi trường cơ bản. Mơi trường cuối cùng cĩ nồng độ carbohydrat là 5%. ™ Canh thang muối trypton: cĩ giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10) Hồ tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đĩ, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100 g NaCl để được các canh thang trypton cĩ giải nồng độ NaCl như trên. Sau đĩ, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho mơi trường sau khi hấp cĩ pH = 7,2 (ở nhiệt độ 250C). Tiến hành rĩt 5 ml mơi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Chú thích: các ống mơi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối. ™ Canh thang urê • urê : 20,00 g • Dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) : 9,50 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 9,10 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 62 • Cao nấm men : 0,10 g • Ðỏ phenol : 0,01 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 0,1 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan các thành phần. Khơng được hấp khử trùng, lọc vơ trùng bằng màng lọc cĩ đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đĩ, rĩt khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vơ trùng. ™ Dầu khống vơ trùng • Rĩt khoảng 20 - 50 ml dầu khống vào bình cĩ nắp xốy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 0C trong 30 phút. ™ Dung dịch nước muối sinh lý Hồ tan 8,5 g NaCl trong 1 lít nước cất. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút rồi để nguội. ™ Hugh - Leifson Glucoza • Pepton : 2,00 g • Cao nấm men : 0,50 g • Natri clorua (NaCl) : 30,00 g • Dextroza : 10,00 g • Tím bromcresol : 0,015 g • Thạch : 3,00 g • Nước cất : 1 ,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun nĩng để hồ tan hồn tồn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. ™ Mơi trường phân lập: thạch Thiosunfat Citrat Bile - muối Sacaroza (TCBS thạch). • Pepton: 10,00 g • Cao nấm men: 5,00 g • Natri xitrat: 10,00 g • Natri thiosunfat (Na2S2O3): 10,00 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 63 • Mật bị: 5,00 g • Sacaroza: 20,00 g • Natri clorua (NaCl): 10,00 g • Sắt (III) xitrat (FeC6H5O7): 1,00 g • Natri cholate: 3,00 g • Xanh bromthymol: 0,04 g • Xanh thymol: 0,04 g • Thạch: 15,00 g • Nước cất vơ trùng: 1,00 lít pH = 8,6 (ở nhiệt độ 25oC). • Đun sơi để hịa tan hồn tồn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng 50oC. Rĩt 15 – 20 ml vào các đĩa petri vơ trùng. Trước khi sử dụng phải làm khơ đĩa mơi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ phịng hoặc đặt đãi trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 39oC – 45oC. (Khơng hấp khử trùng mơi trường) ™ Mơi trường thử decarboxylaza (Mơi trường cơ bản) • Pepton : 5,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Glucoza : 1,00 g • Tím bromcresol : 0,02 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,5 (ở nhiệt độ 250C) • Tuỳ theo loại mơi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L- lysin hoặc L-arginin hoặc L-ornithin vào mơi trường cơ bản trên. Sau đĩ, rĩt 5 ml mơi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy. ™ Nước pepton kiềm: Ancalin peptone water (APW). • Pepton: 10,00g • Natri clorua (NaCl): 10,00g • Nước cất: 1,00 lít, pH=8.5 (ở nhiệt độ 25oC) Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 64 • Hịa tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp. Hấp ở nhiệt độ 121oC trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình , để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi. ™ Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar –TSI • Pepton: 15,00 g • Proteose pepton : 5,00 g • Cao thịt bị : 3,00 g • Cao nấm men : 3,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 10,00 g • Sacaroza : 10,00 g • Glucoza : 1,00 g • Sắt (II) sunphat (FeSO4) : 0,20 g • Natri thiosunphat (Na2S2O3) : 0,30 g • Ðỏ phenol : 0,024 g • Thạch : 12,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi mơi trường đơng, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm. ™ Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar – KIA • Polypepton pepton : 20,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Lactoza : 20,00 g • Dextroza : 1,00 g • Sắt ammoni xitrat : 0,50 g • Natri thiosulphat (Na2S2O3) : 0,50 g Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 65 • Phenon đỏ : 0,025 g • Thạch : 15,00 g • Nước cất : 1,00 lit pH = 7,4 (ở nhiệt độ 250C) • Hồ tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Trước khi mơi trường đơng, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm. ™ Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl • Trypton : 10,00 g • Natri clorua (NaCl) : 20,00 g • Thạch : 20,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sơi để hồ tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đĩ, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rồi rĩt ra đĩa hoặc ống nghiệm. ™ O/F Glucoza • Trypton : 2,00 g • Natri clorua (NaCl) : 5,00 g • Dikali hydro phosphat (K2HPO4) : 0,30 g • Xanh bromthymol : 0,03 g • Thạch : 2,00 g • Glucoza : 10,00 g • Nước cất : 1,00 lít pH = 6,8 (ở nhiệt độ 250C) • Ðun sơi để hồ tan các thành phần rồi rĩt 5 ml mơi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút ™ Thuốc thử ONPG • Dung dịch đệm: + Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90g + Nước cất : 45,00 ml Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 66 + Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml + Hồ tan NaH2PO4.H2O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C. • Dung dịch ONPG: + ONPG (o-nitrophenyl