Khóa luận Tìm hiểu phương pháp bảo quản cà chua bằng màng bao chitosan

SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 1 CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề: Sản phẩm trái cây của nước ta, đặc biệt trái cây của các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long có nhiều lợi thế về chủng loại, sản lượng và chất lượng của trái cây miền nhiệt đới nhưng việc bảo quản để xuất khẩu vào các thị trường lớn như Nhật, Mỹ, EU… chưa ngang tầm với sản lượng thu hoạch hàng năm. Hiện nay, Nước ta chỉ có một số doanh nghiệp lớn và các siêu thị có phương thức tồn trữ trái cây ở nhiệt độ lạnh. Còn lại đa số các vựa thu mua trái cây cũng như nông dân đều thu hoạch và bán trái cây theo tập quán, không có qui trình bảo quản sau thu hoạch. Điều này gây ảnh hưởng không nhỏ đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế. Có nhiều nguyên nhân trong vấn đề này, trong đó việc bảo quản chưa được đầu tư về công nghệ và hệ thống thiết bị bảo quản một cách tương xứng với doanh nghiệp có thương hiệu trái cây xuất khẩu. Thời gian gần đây vấn đề này được các nhà vườn rất quan tâm và các công trình nghiên cứu bảo quản trái cây sau thu hoạch cũng đang cho những kết quả khả quan. Rau quả chúng ta có sản lượng rất cao nhưng về mặt chất lượng thì rất kém như thường được thu hoạch khi chưa đến thời điểm thu hoạch, đa số trái cây thường không qua khâu kiểm tra chất lượng và vệ sinh an toàn thực phẩm…Trong đó chỉ một số lượng trái tươi đủ tiêu chuẩn phẩm cấp được phân loại bảo quả ở kho lạnh có nhiệt độ và độ ẩm thích hợp cho từng loại trái. Đáng chú ý, hiện do nước ta có rất ít các kho bảo quản nên chí phí bảo quản trong các khâu thu hái, bao gói và vận chuyển lạnh để xuất khẩu rất cao. Sự hư hỏng trong quá trình bảo quản rau quả do các nguyên nhân sau đây: do hiện tượng chín sinh lý tự nhiên và hiện tượng nhiễm bệnh. Đồng thời các yếu tố như vi sinh vật thâm nhập từ môi trường bên ngoài và cường độ hô hấp của quả nếu hô hấp càng mạnh mẽ thì quá trình chín càng chóng xảy ra và thời hạn bảo quả càng bị rút ngắn. Rau quả trong quá trình bảo quản bị mất nước và bị tổn thương cơ học. Bệnh cũng gây tổn thương tạo điều kiện cho nhiễm vi sinh vật thứ cấp càng gây hư SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 2 hỏng nhanh chóng hơn. Thuốc bảo vệ thực vật sử dụng bừa bãi dẫn đến giảm giá trị cảm quan và không an toàn. Vì vậy tìm được phương pháp bảo quản rau quả sau thu hoạch đơn giản và tiết kiệm là nhiệm vụ trước mắt quan trọng để đẩy mạnh xuất khẩu rau quả. Cà chua là loại rau màu được trồng và sử dụng khá phổ biến ở nước ta. Chúng có tuổi thọ ngắn do cấu trúc nhiều nước và không có vỏ cứng bảo vệ. Thời vụ thu hái cà chua kéo dài từ tháng 11 đến tháng 2 năm sau. Trong thời gian này do thu hoạch cùng lúc nên giá cà chua rất thấp (có thời điểm chỉ 500 VND một kilogam), đôi khi người nông dân không muốn thu hái vì giá bán không bù đủ công sức. Nhưng khi trái vụ giá cà chua lại khá cao, các nhà máy không có cà chua để sản suất. Từ trước tới nay biện pháp bảo quản cà chua chủ yếu là sản xuất bán sản phẩm (nuớc ép, bột, cà chua cô đặc…) dù công nghệ đã có nhiều cải tiến song các tính chất quý của cà chua trong các sản phẩm này đều bị mất đi, đặc biệt là mùi vị và vitamin. Trong những hướng nghiên cứu công nghệ bảo quản sau thu hoạch trái cây, rau quả nói chung và cà chua nói riêng thì việc kéo dài được thời gian bảo quản và quan trọng nhất là giữ được trạng thái, tính chất như của rau quả tươi được quan tâm hơn cả. Chitosan là một polyme được sản xuất từ đầu tôm, vỏ tôm, mai mực đó là những phụ phế phẩm của ngành chế biến thủy sản. Chitosan thể hiện nhiều đặc tính đáng chú ý như có khả năng tạo màng thấm khí, khả năng diệt khuẩn cao và không hại cho người tiêu dùng khi sử dụng gói rau quả tươi, khi sử dụng đặc biệt phù hợp cho bảo quản rau quả tươi. Do đó người ta nghiên cứu sử dụng chitosan làm màng bao trong bảo quản rau quả vì nó vừa thân thiện với môi trường vừa an toàn thực phẩm. 1.2. Mục đích khóa luận: Tìm hiểu phương pháp bảo quản cà chua bằng màng bao chitosan. 1.3. Mục tiêu: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 3  Quy trình sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm. Trong đó qúa trình thủy phân vỏ tôm được thực hiện bằng enzyme protease.  Tổng quan về ứng dụng của chitosan trong bảo quản cà chua.  Xây dựng quy trình để bảo quản cà chua bằng chitosan đơn giản và tiết kiệm. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 4 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN 2.1.1 Lịch sử phát hiện Chitin được Bracannot phát hiện lần đầu tiên vào năm 1811 trong cặn dịch chiết của một loại nấm và đặt tên là “fungine” để ghi nhớ nguồn gốc tìm ra nó. Năm 1823 Odier đã phân lập được một chất từ bọ cánh cứng và ông gọi là chitin hay “chitine” có nghĩa là lớp vỏ. Nhưng không phát hiện sự có mặt của Nitơ, cuối cùng cả Bracannot và Odier đều cho rằng cấu trúc của chitin giống cấu trúc của xenluloza[21]. Năm 1929 Karrer đun sôi chitin 24h trong dung dịch KOH 5% và đun tiếp 50 phút ở 160ºC với kiềm bão hòa ông thu đựơc sản phẩm có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử, chất đó chính là Chitosan[21]. Việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất lý hoá ứng dụng của chitosan đã được công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Những nước đã thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan đó là: Nhật, Mỹ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp. Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới năm 1973 sản xuất 20 tấn/năm, và đến nay đã lên tới 700 tấn/năm, Mỹ sản xuất trên 300 tấn/năm. Theo Know năm 1991 thì thị trường có nhiều triển vọng của chitin, chitosan là Nhật Bản, Mỹ, Anh, Đức. Nhật được coi là nước dẫn đầu về công nghệ sản xuất và buôn bán chitin, chitosan. Người ta ước tính sản lượng chitosan sẽ đạt tới 118000 tấn/năm: trong đó Nhật, Mỹ là nước sản xuất chính[14]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan và ứng dụng của chúng trong sản xuất phục vụ đời sống là một vấn đề tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những năm 1978-1980, trường Đại học Thủy sản Nha Trang đã công bố quy trình sản xuất chitosan của tác giả Đỗ Minh Phụng đã mở đầu bước ngoặc quan trọng trong việc nghiên cứu, tuy nhiên chưa có ứng dụng nào thực tế trong sản xuất[7]. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 5 2.1.2. Nguồn chitosan Chitosan là sản phẩm từ vỏ tôm cua, mai mực …phụ phế phẩm chế biến thủy sản trước kia nó là chất thải rắn gây ô nhiễm môi trường. Phát hiện từ phụ phế phẩm này có thể sản xuất chitin và chitosan là những polysaccharide tự nhiên có nhiều đặc tính quý gồm kháng khuẩn, tạo màng bao để bảo quản trái cây rau quả…Từ các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên toàn thế giới đã chứng minh trong vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chitin này họ có thể chiết tách thành chất chitosan. Nước ta có bờ biển dài sản lượng khai thác thủy sản là 2.45 triệu tấn, sản lượng nuôi trồng thủy hải sản là 2.57 triệu tấn ước tính hàng năm Việt Nam. Tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của nghành thủy sản Việt Nam chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của bộ thủy sản dự báo sản lượng tôm năm 2011 là 403600 tấn tùy thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lượng nguyên liệu. Tương ứng với sản lượng hàng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm được tạo ra.Việt Nam lượng phế thải vỏ tôm từ các nhà máy tôm đông lạnh khoảng 30.000 tấn (theo Nguyễn Ngọc Tú-“Báo cáo tại hội nghị bỏng toàn quốc lần thứ 3”). Ngày nay, nghề nuôi tôm và chế biến tôm đông lạnh ở nhiều nước trên thế giới đang phát triển và nhất là ở Việt Nam. Song song với nó, mỗi năm lại có hàng triệu tấn vỏ tôm bị vứt bỏ, nhưng bên trong nó lại chứa cả một kho tàng quý báu chất Chitosan- hữu dụng cho nhiều ngành kinh tế. Trữ lượng chitin trong thiên nhiên ước tính 100 tỉ tấn/ năm nhưng lượng tiêu thụ chỉ có 1100-1300 tấn/năm, điều này chứng tỏ, nguyên liệu để khai thác là rất dồi dào. Sản phẩm tôm đông lạnh chiếm sản lượng lớn nhất trong các sản phẩm đông lạnh. Chính vì vậy, vỏ tôm là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất dồi dào, rẻ tiền, có sẵn quanh năm, nên rất thuận tiện cho việc cung cấp chitin và chitosan. Các công trình nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới đã chứng minh, trong vỏ tôm có chứa 27% chất Chitin, từ chất Chitin này, họ có thể chiết tách thành chất Chitosan[3]. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 6 Chitin được xem là polymer tự nhiên quan trọng thứ hai của thế giới, có nhiều thứ hai thế giới (chỉ sau xenlulo). Là một polymer động vật được tách chiết và biến tính từ vỏ các loài giáp xác (tôm, cua, hến, trai, sò, mai mực, đỉa biển…), màng tế bào nấm họ Zygemycetes, các sinh khối nấm mốc, một số loài tảo … Chitosan thương mại có nguồn gốc từ vỏ tôm và động vật giáp xác biển khác. Chitosan được sản xuất bằng khử acetyl (deacetylation) của chitin, đó là yếu tố cơ cấu trong các bộ xương ngoài của của động vật giáp xác (cua, tôm, mai mực…) và thành tế bào của nấm. Mức độ deacetylation (%DD) có thể được xác định bằng phổ NMR, và DD% trong chitosan thương mại là khoảng 6- 10%. 2.1.3. Công thức cấu tạo 2.1.3.1. Cấu trúc hóa học của chitin Chitin là polysaccarit mạch thẳng, có thể xem như là dẫn xuất của xenlulozơ, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm axetyl amino (- NHCOCH3) (cấu trúc I). Như vậy chitin là poly (N-axetyl-2-amino-2-deoxi-β-D- glucopyranozơ) liên kết với nhau bởi các liên kết b-(C-1-4) glicozit. Trong đó các mắt xích của chitin cũng được đánh số như của glucozơ: Hình 2.1: Cấu trúc hoá học của chitin Phụ thuộc vào nguồn gốc đặc điểm từng vùng, chitin xuất hiện với hai loại cấu trúc đặc trưng, gọi là dạng α và dạng β. Sự khác nhau giữa hai dạng này được nhận biết bằng các phương pháp phổ nghiệm như phổ hồng ngoại, phổ NMR chụp trạng thái rắn kết hợp với XRD. Một dạng thứ ba kém phổ biến hơn là γ-chitin, nhưng xuất phát từ các số liệu phân tích, người ta vẫn cho rằng dạng thứ ba chỉ là một loại khác trong cấu trúc của α-chitin. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 7 α-chitin phổ biến nhất trong tự nhiên, nó có mặt trong vỏ tôm, trong các loài nhuyễn thể thức ăn của cá voi, trong dây chằng (tendon) và vỏ của tôm hùm và cua cũng như trong biểu bì của các loại côn trùng … Hiếm hơn là dạng β-chitin, được tìm ra trong protein của mực ống[5]. Hình 2.2: Sắp xếp các mạch trong phân tử chitin 2.1.3.2. Cấu trúc hoá học của chitosan và một vài dẫn xuất Chitosan là dẫn xuất đề axetyl hoá của chitin, trong đó nhóm (–NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C(2). Chitosan được cấu tạo từ các mắt xích D- glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit, do vậy chitosan có thể gọi là poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxi-D-glucozơ hoặc là poly β-(1-4)-D- glucozamin (cấu trúc III). Hình 2.3: Cấu trúc chitosan (poly b-(1-4)-D- glucozamin)  Công thức phân tử: (C6H11O4N)n  Phân tử lượng: Mchitosan =(161,07)n Tuy nhiên, trên thực tế thường có mắt xích chitin đan xen trong mạch cao phân tử chitosan (khoảng 10%). Vì vậy công thức chính xác của chitosan được thể hiện như sau: β chitin α chitin γ chitin SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 8 Trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa chế phẩm này còn có tên là PDP: Poly-  - (1  4) – D- glucosamin Hay còn gọi là Poly- - (1- 4) – 2 – amino – 2- desoxy – D- glucosa Dưới đây là công thức cấu tạo của các dẫn xuất:  Dẫn xuất N,O- Cacboxymetylchitin: Hình 2.4: Dẫn xuất N,O- Cacboxymetylchitin  Dẫn xuất N,O-cacbonxymetylchitosan: Hình 2.5: Dẫn xuất N, O-cacbonxymetylchitosan  Dẫn xuất: N,O-axylchitosan: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 9 Hình 2.6: Dẫn xuất: N, O-axylchitosan  Dẫn xuất N-metylchitosan: Hình 2.7: Dẫn xuất N-metylchitosan  So sánh cấu trúc chitin, chitosan, xenluloza: Hình 2.8: Cấu trúc chitin, chitosan, xenluloza 1: Chitin, 2: Chitosan, 3: Xenluloza. 2.1.4. Độ deaxetyl hóa- DD (Degree of deaxetylation) Là tỷ lệ thay thế nhóm (-NHCOCH3) bằng nhóm (-NH2) trong phân tử Chitin SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 10 Hình 2.9: Quá trình deaxetyl hoá Nếu: DD < 50%_ chitin DD ≥ 50%_ chitosan Các phương pháp xác định:  Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (H-NMR)  Phổ hồng ngoại IR  Chưng cất chitin, chitosan với axit photphoric  Phản ứng tạo màu với ninhidrin  Xác định theo Nitơ 2.1.5. Tính chất chung. - Khi hoà tan trong dung dịch acid acetic loãng sẽ tạo thành dung dịch keo dương, nhờ đó mà keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb3+, Hg+… - Nhiệt độ nóng chảy 309- 311oC. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 11 - Trọng lượng phân tử trung bình: 10.000- 500.000 Dalton (Li, 1997- Onsoyen và Skaugrud, 1990) tùy loại. Loại PDP có trọng lượng phân tử trung bình (M) từ 200.000 đến 400.000 hay được dùng nhiều nhất trong y tế và thực phẩm [3]. - Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH< 6.5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, aminopolysaccharide (alginate), acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (NH2) - Chitosan thương mại ít nhất phải có mức DD (degree of deacetylation) hơn 70% - Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể. 2.1.6. Tính chất vật lý của chitosan Là một chất rắn, xốp, nhẹ, hình vảy, có thể xay nhỏ theo các kích cỡ khác nhau. Chitosan có tính kiềm nhẹ, Có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị, không tan trong nước, dung dịch kiềm và acid đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt. Chitosan có màu trắng hay vàng nhạt, không mùi vị. Không tan trong nước, dung dịch kiềm và axit đậm đặc nhưng tan trong acid loãng (pH6), tạo dung dịch keo trong, có khả năng tạo màng tốt, nhiệt độ nóng chảy 309 – 311 0C. Chitosan và các dẫn xuất của chúng đều có tính kháng khuẩn, như ức chế hoạt động của một số loại vi khuẩn như E.Coli, diệt được một số loại nấm hại dâu tây, cà rốt, đậu và có tác dụng tốt trong bảo quản các loại rau quả có vỏ cứng bên ngoài. Khi dùng màng chitosan, dễ dàng điều chỉnh độ ẩm, độ thoáng không khí cho thực phẩm (Nếu dùng bao gói bằng PE thì mức cung cấp oxy bị hạn chế, nước sẽ bị ngưng đọng tạo môi trường cho nấm mốc phát triển) Màng chitosan cũng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn được dùng làm bao gói. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 12 Màng chitosan làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả. Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị. Rau quả bị thâm là do quá trình lên men tạo ra các sản phẩm polyme hóa của oquinon. Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của anthocyamin, flavonoid và tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn. 2.1.7. Tính chất hoá học của chitin/chitosan Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N-axetyl-D-glucozamin và nhóm –OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N. Mặt khác chitin/chitosan là những polime mà các monome được nối với nhau bởi các liên kết β-(1-4)-glicozit; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các chất hoá học như: acid, bazơ, tác nhân oxy-hóa và các enzyme thuỷ phân. 2.1.7.1. Các phản ứng của nhóm –OH - Dẫn xuất sunfat. - Dẫn xuất O-axyl cuả chitin/chitosan. - Dẫn xuất O–tosyl hoá chitin/chitosan. 2.1.7.2. Phản ứng ở vị trí N - Phản ứng N-axetyl hoá chitosan. - Dẫn xuất N-sunfat chitosan. - Dẫn xuất N-glycochitosan (N-hidrroxy-etylchitosan) - Dẫn xuất acroleylen chitossan. - Dẫn xuất acroleylchitosa 2.1.7.3. Phản ứng xảy ra tại vị trí O, N - Dẫn xuất O, N–cacboxymetylchitosan. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 13 - Dẫn xuất N, O-cacboxychitosan. - Phản ứng cắt đứt liên kết β-(1-4) glicozit - Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan. - Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan. 2.1.7.4. Khả năng hấp phụ tạo phức với các ion kim loại chuyển tiếp của chitin/ chitosan - Trong phân tử chitin/chitosan và một số dẫn xuất của chitin có chứa các nhóm chức mà trong đó các nguyên tử Oxi và Nitơ của nhóm chức còn cặp electron chưa sử dụng, do đó chúng có khả năng tạo phức, phối trí với hầu hết các kim loại nặng và các kim loại chuyển tiếp như: Hg2+, Cd2+, Zn2+, Cu2+,Ni2+,Co2+....Tuỳ nhóm chức trên mạch polyme mà thành phần và cấu trúc của phức khác nhau. - Ví dụ: với phức Ni(II) với chitin có cấu trúc bát diện với số phối trí bằng 6, còn phức Ni(II) với chitosan có cấu trúc tứ diện với số phối trí bằng 4. trong đó là mạng polime Hình 2.10: Phức của chitosan với kim loại 2.1.7.5 Phản ứng đặc trưng khác của chitosan SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 14  Phản ứng Van-Wisselingh: chitosan tác dụng với Lugol tạo dung dịch màu nâu trong môi trường axit sunfuric có màu đỏ tím.  Phản ứng Alternative: tác dụng với acid sunfuric tạo tinh thể hình cầu chitosan sunfat làm mất màu dung dịch fucsin 1%.  Khử amin nhờ: Ba(BrO)2, AgNO3, N2O2….  Cắt mạch bởi acid, enzyme, bức xạ.  Chitosan phản ứng với acid đậm đặc tạo muối khó tan.  Chitosan tác dụng với Iốt trong môi trường H2SO4 cho phản ứng lên màu tím. Đây là phản ứng dùng trong phân tích định tính chitosan. 2.1.8. Tính chất sinh học của chitosan - Vật liệu Chitosan có nguồn gốc tự nhiên, không độc, dùng an toàn cho người. - Chúng có tính hòa hợp sinh học cao với cơ thể, có khả năng tự phân huỷ sinh học. - Chitosan có nhiều tác dụng sinh học đa dạng như: có khả năng hút nước, giữ ẩm, tính kháng nấm, tính kháng khuẩn với nhiều chủng loại khác nhau, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, có khả năng nuôi dưỡng tế bào trong điều kiện nghèo dinh dưỡng, tác dụng cầm máu, chống sưng u. - Chitosan không những ức chế các vi khuẩn gram dương, gram âm mà cả nấm men và nấm mốc. Khả năng kháng khuẩn của chitosan phụ thuộc một vài yếu tố như loại chitosan sử dụng (độ deacetyl, khối lượng phân tử), pH môi trường, nhiệt độ, sự có mặt của một số thành phần thực phẩm. Khả năng kháng khuẩn của chitosan và dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu bởi một số tác giả, trong đó cơ chế kháng khuẩn cũng đã được giải thích trong một số trường hợp. Mặc dù chưa có một giải thích đầy đủ cho khả năng kháng khuẩn đối với tất cả các đối tượng vi sinh vật, nhưng hầu hết đều cho rằng khả năng kháng khuẩn liên quan đến mức độ hấp phụ chitosan lên bề mặt tế bào. Trong đó, chitosan hấp phụ lên bề mặt vi khuẩn gram âm tốt hơn vi khuẩn gram dương. Một số cơ chế đã được giải thích như sau: + Nhờ tác dụng của những nhóm NH3+ trong chitosan lên các vị trí mang điện âm ở trên màng tế bào vi sinh vật, dẫn tới sự thay đổi tính thấm của màng tế bào SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 15 làm cho quá trình trao đổi chất qua màng tế bào bị ảnh hưởng. Lúc này, vi sinh vật không thể nhận các chất dinh dưỡng cơ bản cho sự phát triển bình thường như glucose dẫn đến mất cân bằng giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào và cuối cùng dẫn đến sự chết của tế bào. + Chitosan có thể ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn do có khả năng lấy đi các ion kim loại quan trọng như Cu2+, Co2+, Cd+ của tế bào vi khuẩn nhờ hoạt động của các nhóm amino trong chitosan có thể tác dụng với các nhóm anion của bề mặt thành tế bào. Như vậy vi sinh vật sẽ bị ức chế phát triển do sự mất cân bằng liên quan đến các ion quan trọng [16]. + Điện tích dương của những nhóm NH3+ của glucosamine monomer ở pH< 6.3 tác động lên các điện tích âm ở thành tế bào của vi khuẩn, dẫn đến sự rò rỉ các phần tử ở bên trong màng tế bào. Đồng thời gây ra sự tương tác giữa sản phẩm của quá trình thuỷ phân có khả năng khuếch tán bên trong tế bào vi sinh vật với AND dẫn đến sự ức chế mARN và sự tổng hợp protein tế bào. + Chitosan có khả năng phá huỷ màng tế bào thông qua tương tác của những nhóm NH 3+ với những nhóm phosphoryl của thành phần phospholipid của màng tế bào vi khuẩn. - Có tác dụng làm giảm đáng kể số lượng vi sinh vật tổng số trên bề mặt thực phẩm. Với hàm lượng 1,5% đã giảm số lượng vi sinh vật trên bề mặt cam là 93%, trên bề mặt quýt là 96%, trên bề mặt cà chua là 98% … - Ngoài ra, Chitosan còn có tác dụng làm giảm cholesterol và lipid máu, làm to vi động mạch và hạ huyết áp, điều trị thận mãn tính, chống rối loạn nội tiết. - Chitosan là chất thân mỡ có khả năng hấp thụ dầu mỡ rất cao có thể hấp thu đến gấp 6-8 lần trọng lượng của nó. Chitosan nhỏ phân tử có điện tích dương nên có khả năng gắn kết với điện tích âm của lipid và acid mật tạo thành những chất có phân tử lớn không bị tác dụng bởi các men tiêu hóa và do đó không bị hấp thụ vào cơ thể mà được thải ra ngoài theo phân qua đó làm giảm mức cholesterol nhất là LDL- cholesterol, acid uric trong máu nên có thể giúp ta tránh các nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh gút, kiểm soát được tăng huyết áp và giảm cân. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 16 - Với khả năng thúc đẩy hoạt động của các peptide- insulin, kích thích việc tiết ra insulin ở tuyến tụy nên Chitosan đã dùng để điều trị bệnh tiểu đường. Nhiều công trình đã công bố khả năng kháng đột biến, kích thích làm tăng cường hệ thống miễn dịch cơ thể, khôi phục bạch cầu, hạn chế sự phát triển các tế bào u, ung thư, HIV/ AIDS. - Chitosan chống tia tử ngoại, chống ngứa. 2.1.9.Độc tính Để dùng trong y tế và thực phẩm, đã có nhiều công trình nghiên cứu về độc tính của Chitosan và đưa ra các kết luận sau: - Chitosan hầu như không độc, không gây độc trên xúc vật thực nghiệm và người, không gây độc tính trường diễn [7]. - Chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn ứng dụng an toàn trong ghép mô. - Chitosan với trọng lượng phân tử thấp để tiêm tĩnh mạch, không thấy có tích lũy ở gan. Loại Chitosan có DD =50 %, có khả năng phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, Chitosan không phân bổ tới gan và lá lách. - Những lợi điểm của Chitosan: tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học, hoà hợp sinh học không những đối với động vật mà còn đối với các mô thực vật, là vật liệu y sinh tốt làm mau liền vết thương. - Chitosan không độc hoặc độc tính rất thấp trên xúc vật thực nghiệm và nó có thể được sử dụng an toàn trên cơ thể người. 2.1.10. Sản xuất chitosan 2.1.10.1 Nguyên liệu Nguồn nguyên liệu phong phú nhất để sản xuất chitosan là từ phế liệu của ngành thủy sản: từ vỏ các loài giáp xác (tôm, cua, hến, trai, sò, mai mực, đỉa biển....) [1] SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 17 Bảng 2.1: Hàm lượng chitin trong vỏ một số động vật giáp xác (Theo: Chitosan-Its productinal and potential zakaria M.B) 2.1.10.2. Quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học STT Phân loại Hàm lượng chitin theo trọng lượng (%) 1 Đầu tôm 11 2 Vỏ tôm 27 3 Vỏ tôm phế thải hỗn hợp 12-18 4 Vỏ tôm hùm 37 5 Càng cua tuyết 24 6 Chân cua tuyết 32 7 Mai mực ống 30-35 8 Đỉa biển 34-49 SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 18 Quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phƣơng pháp hóa học Rửa và sấy Nghiền và lọc Loại Protein Dung dịch NaOH 3%, nhiệt độ 90-95 0 C trong 3-4h Rửa Khử khoáng HCL 1N trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Rửa xong rồi khử màu Rửa và sấy Deacetyl hóa NaOH 50% trong 4 giờ, 110-120 0 C Rửa sấy Nguyên liệu Chitin Chitosan SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 19 Hiện nay sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương pháp hóa học bao gồm các quá trình chính sau:  Qúa trình loại protein Ta tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung dịch NaOH 3%, protein bị kiềm thủy phân thành các amin tự do tan và được loại ra theo quy trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ vỏ tôm và kiểm tra pH = 11 – 12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở nhiệt độ 90 - 950C trong 3.5 – 4h (trong quá trình nung lưu ý vấn đề trào dung môi do tạo bột nhiều và mùi bay ra khó chịu ) sản phẩm sau khi nung được rửa sạch bằng nước thường hoặc nước cất đến Ph = 7. Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các , muối natri, các amin tự do và NaOH dư. Sấy khô ở 600C thu được chitin thô.  Qúa trình khử khoáng Trong vỏ tôm thành phần chủ yếu là muối CaCO3, MgCO3 và rất ít Ca3(PO4)2, nên người ta thường dùng các loại acid như HCL, H2SO4...để khử khoáng. Khi khử khoáng, nếu dùng H2SO4 sẽ tạo muối khó tan nên ít sử dụng, người ta dùng HCL để khử khoáng theo các phả ứng sau: MgCO3 + 2HCl = MgCl2 + CO2 + H2O. CaCO3 + 2HCl = CaCl2 + CO2 + H2O Ca3(PO4)2 + 6HCl = 3CaCl2 + 2H3PO4 Trong quá trình rửa thì muối Cl- tạo thành được rửa trôi, nồng độ acid HCL có ảnh hưởng lớn đến chất lượng của chitosan thành phẩm, đồng thời có ảnh hưởng lớn đến thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nếu nồng độ HCL cao sẽ rút ngắn được thời gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt mạch do có hiện tượng thủy phân các liên kết β- (1-4) glucozit để tạo thành tạo ra các polymer có trọng lượng phân tử trung bình thấp, có khi thủy phân triệt để đến glucosamin. Ngược lại nếu nồng độ HCL SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 20 quá thấp thì quá trình khử khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết các muối, acid dư tan trong nước. Qúa trình rửa kết thúc khi dịch rửa cho PH = 7.  Phƣơng pháp cơ học: Nguyên liệu được sấy khô và nghiền sau khi đã tách tạp chất, sau đó dùng quạt gió để phân loại, phần protein nặng hơn được tách ra khỏi hỗn hợp. Ưu điểm của phương pháp này là có thể thu được lượng protein để tái sử dụng vào việc khác nhưng nhược điểm chính là tách không triệt để nên chitin thu được có độ tinh khiết không cao.  Qúa trình tẩy màu ( loại bỏ astaxanthin ) Chitin thô có màu hồng nhạt do có sắc tố astaxanthin. Do chitin ổn định với các chất oxy hóa như thuốc tím (KMnO4) oxy già (H2O2) nước javen (NaOCl + NaCl), Na2S2O3, CH3COCH3…lợi dụng tính chất này ta sử dụng để khử màu chitin.  Điều chế chitosan Qúa trình điều chế chitin thành chitosan thực chất là quá trình deaety hóa chitin, chuyển hóa nhóm –NHCOCH3 thành nhóm NH2 và loại bỏ nhóm –CH3CO, chuyển hóa thành muối natri CH3COONa. Để thực hiện được quá trình deacetyl hóa hoàn toàn, người ta sử dụng NaOH đậm đặc 50% thời gian 4h nhiệt độ ở 110 – 120 0 C. Ở dây dựa vào tính chất chitosan tan được trong dung dịch acid loãng tạo thành dung dịch keo trong suốt, trong khi chitin không tan do đó ta có thể sơ bộ kiểm tra mức độ chuyển hóa chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào CH3COOH 1%. Nếu sản phẩm tan tạo thành dung dịch keo trong suốt là được. Sau đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng. Qúa trình điều chế chitosan từ chitin cho hiệu suất tương đối cao ( 60 –75%). 2.1.10.3. Quy trình công nghệ sản xuất chitosan sử dụng enzyme prtease SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 21 Quy trình công nghệ sản xuất chitosan sử dụng enzyme protease Rửa và sấy Nghiền và lọc Rửa Khử khoáng HCL 1N trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Rửa xong rồi khử màu Rửa và sấy Deacetyl hóa NaOH 50% trong 4 giờ, 110-120 0 C Rửa sấy Nguyên liệu Chitin Thủy phân protein (dùng enzyme protease 13% tỷ lệ w/v = 1/5, pH =5- 5.5 nhiệt độ 70 -800C trong thời gian 4 giờ Chitosan SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 22  Giải thích quy trình Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hóa học cũng thực hiện theo các bước: khử protein, khử khoáng và deacetyl. Chúng ta thấy công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương pháp hóa học. Công đoạn khử Protein ở đây chúng ta dùng phương pháp sinh học, đó là khử protein bằng enzyme protease với nồng độ 13% tỷ lệ w/v = 1/5 với nồng độ pH thích hợp từ 5- 5.5 ở nhiệt độ 70 -800C trong thời gian 4 giờ. Trong phương pháp này người ta có thể dùng các chế phẩm enzyme protease hoặc hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng các chủng vi vật để phân hủy protein. Ưu điểm của phương pháp sinh học là sạch, giảm chi phí, tạo những chất thải hữu cơ dễ phân hủy nhưng lượng protein tách ra không triệt để. Qúa trình khử khoáng được thực hiện tương tự như quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học. Phương pháp cơ học được thực hiện tương tự như quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học. Qúa trình tẩy màu được thực hiện tương tự như quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học. Qúa trình deacetyl hóa được thực hiện tương tự như quy trình công nghệ sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học. Ngoài ra quá trình deacetyl bằng enzyme deacetylase nhưng hiệu quả không bằng phương pháp hóa học.  Quy trình phân tích nguyên liệu :  Xác định độ ẩm của vỏ tôm khô chi tiết theo mục A trong phụ lục.  Xác định hàm lượng tro trong vỏ tôm khô tuyệt đối chi tiết theo mục B trong phụ lục.  Xác định hàm lượng Ca và P trong mẫu tôm khô tuyệt đối chi tiết theo mục C trong phụ lục. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 23  Xác định hàm lượng Nito tổng số bằng phương pháp Kjeldahl chi tiết theo mục E trong phụ lục.  Một số cơ sở đang nghiên cứu và sản xuất chitin-chitosan ở Việt Nam  Trung tâm chế biến trường đại học thủy sản Nha Trang: sản xuất chitin chất lượng cao.  Viện khoa học Việt Nam kết hợp với xí nghiệp thủy sản Hà Nội: sản xuất chitin ứng dụng trong nông nghiệp.  Trung tâm công nghệ sinh học và sinh học thủy sản phối hợp với đại học y dược thành phố Hồ Chí Minh, phân viện khoa học Việt Nam, viện khoa học nông nghiệp Việt Nam. 2.1.11. Ứng dụng của chitosan 2.1.11.1. Các ứng dụng của Chitosan trong công nghệ thực phẩm Trong công nghệ thực phẩm, vật liệu Chitosan được dùng để bảo quản đóng gói thức ăn, để bảo quản hoa quả tươi vì nó tạo màng sinh học không độc. Người ta đã tạo màng Chitosan trên quả tươi để bảo quản quả đào, quả lê, quả kiwi, dưa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho... Là một polyme dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính sinh học đa dạng, Chitosan đã được đưa vào thành phần trong thức ăn: sữa chua, bánh kẹo, nước ngọt... Nhật bản đã có những sản phẩm ăn kiêng có chứa Chitosan để làm giảm cholesterol và lipid máu, giảm cân nặng, chống béo phì, dùng để tránh nguy cơ mắc bệnh tim mạch, tiểu đường (bánh mỳ, khoai tây chiên, dấm, nước chấm...) đã có bán rộng rãi trên thị trường . Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ (USEPA) đã cho phép Chitosan không những được dùng làm thành phần thức ăn, mà còn dùng cả trong việc tinh chế nước uống. Năm 1983, Bộ thuốc và thực phẩm Mỹ (USFDA) đã chấp nhận Chitosan được dùng làm chất phụ gia trong thực phẩm và dược phẩm [14]. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 24 Chitosan đã chính thức được Tổ chức y tế thế giới (WHO) cho phép dùng trong y học và thực phẩm [15]. N-cacboxymetyl chitosan còn được dùng như antioxidant để bảo quản thực phẩm do chúng có khả năng kết hợp với kim loại (Fe) là những chất xúc tác của quá trình ôi hóa dầu mỡ, ngăn cho các sản phẩm chứa dầu mỡ khỏi bị ôi hóa. Tóm lại, chế phẩm Chitosan đƣợc dùng trong thực phẩm  Dùng để bảo quản thực phẩm, hoa quả, rau tươi...  Lọc trong các loại nước quả ép, bia, rượu vang, nước giải khát...  Là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm, thức ăn, bánh kẹo, nước giải khát.  Dùng làm thuốc bổ dưỡng cơ thể (functional food, functional drug) để giảm cholesterol máu, lipid máu, hạ huyết áp, giảm cân nặng, chống béo phì, tăng cường miễn dịch cơ thể, điều trị bệnh tiểu đường, phòng chống u và ung thư.  Là phụ gia không độc để bảo quản thực phẩm khỏi thiu thối. 2.1.11.2 Ứng dụng trong y học - Chitosan được ứng dụng trong điều trị bỏng. - Khống chế sự gia tăng của tế bào ung thư. - Chống viêm cấp trên mô lành. - Ngăn chặn sự phát triển của chứng nhồi máu cơ tim và bệnh đột quỵ - Hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông tụ máu, tăng sức đề kháng, chữa xương khớp, hỗ trợ chữa bệnh tiểu đường… - Dược phẩm. 2.1.11.3.Ứng dụng trong các lĩnh vực khác Chitin/chitosan và các dẫn xuất của chúng có nhiều đặc tính quý báu như: có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, có khả năng tự phân huỷ sinh học cao, không gây dị ứng, không gây độc hại cho người và gia súc, có khả năng tạo phức với một số kim loại chuyển tiếp như: Cu(II), Ni(II), Co(II)... Do vậy chitin và một số dẫn SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 25 xuất của chúng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: Trong lĩnh vực xử lí nước thải và bảo vê môi trường, dược học và y học, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học, mỹ phẩm, công nghệ giấy, dệt… 2.2. ỨNG DỤNG CHITOSAN BẢO QUẢN RAU QUẢ 2.2.1. Thực trạng vấn đề bảo quản trái cây ở Việt Nam  Vấn đề trong nƣớc: Nước ta hiện nay chỉ có một số doanh nghiệp lớn và các siêu thị có phương thức tồn trữ trái cây ở nhiệt độ lạnh. Còn lại, đa số các vựa thu mua trái cây cũng như nông dân đều thu hoạch và bán trái cây theo tập quán, không có qui trình bảo quản sau thu hoạch. Điều này gây ảnh hưởng không nhỏ đến chất lượng sản phẩm và hiệu quả kinh tế. Thời gian gần đây vấn đề này được các nhà vườn rất quan tâm và đặc biệt các công trình nghiên cứu bảo quản trái cây sau thu hoạch cũng đang cho những kết quả khả quan…  Vấn đề bảo quản trái cây xuất khẩu: Sản phẩm trái cây của nước ta, đặc biệt trái cây của các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long có nhiều lợi thế về chủng loại, sản lượng và chất lượng của trái cây miền nhiệt đới nhưng việc bảo quản để xuất khẩu vào các thị trường lớn như Nhật, Mỹ, EU… chưa ngang tầm với sản lượng thu hoạch hàng năm. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến vấn đề này, trong đó việc bảo quản chưa được đầu tư về công nghệ và hệ thống thiết bị bảo quản một cách tương xứng với doanh nghiệp có thương hiệu trái cây xuất khẩu. Tại thị trường trong nước từ nhiều năm nay giá bán trái cây vào thời điểm thu hoạch rộ thường bấp bênh, do sản phẩm cùng chủng loại nhiều vào thời điểm thu hoạch, bình quân khoảng 2 tháng/vụ, làm cho việc điều tiết tiêu thụ sản phẩm gặp nhiều khó khăn, sản phẩm trái cây được tiêu thụ ở dạng tươi là chủ yếu ở tại địa phương và trong nước, nên thường gây ứ đọng, sản phẩm thường bị hư hỏng. Trong thực tế sản phẩm trái cây thường được thu hoạch thậm chí khi chưa đến thời điểm thu hoạch, đa số trái cây thường không qua khâu kiểm tra chất lượng SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 26 và vệ sinh an toàn thực phẩm…Trong đó chỉ một số lượng trái tươi đủ tiêu chuẩn phẩm cấp được phân loại bảo quả ở kho lạnh có nhiệt độ và độ ẩm thích hợp cho từng loại trái. Đáng chú ý, hiện do nước ta có rất ít các kho bảo quản nên chí phí bảo quản trong các khâu thu hái, bao gói và vận chuyển lạnh để xuất khẩu rất cao. Đây cũng là nguyên nhân hạn chế việc ứng dụng các tiến bộ kỹ thuật về bảo quản sản phẩm ở các trung tâm phát triển cây ăn quả trong cả nước. 2.2.2. Cơ sở khoa học ứng dụng chitosan trong bảo quản trái cây 2.2.2.1.Các quá trình xảy ra khi bảo quản rau quả tươi  Quá trình biến đổi vật lý:  Sự bay hơi nước: Trong rau quả thì phần chiếm nhiều nhất đó là nước từ 65- 95% tùy thuộc vào từng loại quả. Sau khi thu hái rau quả bị mất hàm lượng nước trong suốt quá trình bảo quản do tham gia vào quá trình hô hấp hoặc bay hơi vào môi trường. Đây là nguyên nhân chính làm cho rau quả bị hao hụt khối lượng so với ban đầu. Sự mất nước còn làm tăng khả năng nhạy cảm với sự biến đổi nhiệt độ và kết quả là làm tăng cường độ hô hấp của quả. Khi rau quả mất đi 5-10% khối lượng chúng sẽ bị héo và hư hỏng nhanh chóng. Do sự chênh lệch độ ẩm giữa quả và môi trường. Tốc độ bay hơi phụ thuộc vào:  Cấu tạo và hình thái của mô che chở: nếu phần vỏ cấu tạo bởi tế bào cứng, chắc, nguyên vẹn sẽ làm giảm tốc độ mất nước  Điều kiện môi trường: nhiệt độ càng cao, độ ẩm không khí càng thấp thì tốc độ bay hơi nước càng nhanh  Tốc độ chuyển động của không khí: càng cao thì mức bay hơi càng nhiều  Sự giảm khối lượng tự nhiên: Nguyên nhân là trong quá trình bảo quản quả bị mất nước và mất chất khô do hô hấp.  Quá trình hóa học: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 27  Đường: Bị giảm đáng kể do hô hấp, tuy nhiên ở những loại quả mà khi thu hái hàm lượng đường chưa cao thì trong thời gian bảo quản đường có thể tăng lên do tinh bột chuyển hóa thành.  Tinh bột: Có thể tăng hoặc giảm tùy thuộc vào từng loại rau quả. Nếu tinh bột đã đạt tới hạn thì trong quá trình bảo quản hàm lượng tinh bột sẽ giảm (ví dụ: chuối xanh) còn nếu chưa cao thì trong bảo quản lại tăng do tinh bột được tổng hợp (ví dụ: đậu non).  Protopectin: Có thể bị phân giải thành pectin hòa tan làm yếu các liên kết và quả bị mềm ra.  Các acid hữu cơ: Hàm lượng acid hữu cơ giảm dần làm độ chua của rau quả giảm.  Các vitamin: Giảm đi rất nhanh do tác động của enzyme nội bào và sự oxi hóa  Các chất màu: (clorofil, carotenoit, flavonoit) dưới tác dụng của oxi không khí sẽ bị chuyển hóa làm biến đổi màu sắc tự nhiên của quả, một số chất màu mới được tổng hợp. Lượng chlorophill bị mất đi thay vào đó là sự tăng lên của các cấu tử mang màu khác như carotenoid (tạo cho quả có màu vàng, da cam và màu đỏ). Các quá trình này đều có sự tham gia của enzyme.  Các hợp chất phenon: polyphenon bị oxi hóa bởi men PPO tạo thành flobafin có màu nâu làm mất màu sắc tươi của quả khi bảo quản.  Quá trình hô hấp Trong quá trình sinh trưởng và phát triển của quả luôn luôn xảy ra các quá trình đồng hóa và dị hóa: khi quả bắt đầu phát triển và còn đang ở trên cây thì chủ yếu xảy ra quá trình đồng hóa là chủ yếu, là quá trình tổng hợp các chất hữu cơ cho quả như tinh bột, đường, chất khoáng….quả ngày càng phát triển đầy đủ cho tới khi chín: kích thước quả tăng lên, màu sắc quả thay đổi rõ ràng… Khi quả được thu hái vẫn xảy ra quá trình sống của rau quả nhưng lúc này trong rau quả chủ yếu xảy ra quá trình dị hóa: đó là quá trình sử dụng các chất hữu cơ đã có sẵn để duy trì sự sống của quả. Trong rất nhiều những biến đổi xảy ra sau khi thu hái rau quả thì hô hấp là chủ yếu. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 28 Hô hấp sử dụng tinh bột hoặc đường và các hợp chất khác. Dưới tác dụng của oxi không khí, các mạch hidrocacbon bị bẻ gãy và sản phẩm thu được là CO2 và nước, phản ứng này tỏa ra năng lượng dưới dạng nhiệt. Khi lượng oxi trong không khí được cung cấp đầy đủ thì quá trình trên xảy ra rất mạnh mẽ và biến thiên theo từng thời kỳ bảo quản, và kết quả của các quá trình này là rau quả ngày càng bị biến đổi sâu sắc cho tới khi hỏng hẳn. Cũng trong quá trình này có những phản ứng làm tăng chất lượng của rau quả như sự chuyển thành đường của tinh bột… Quá trình này là hô hấp hiếu khí: có sự tham gia của oxi không khí, sản phẩm của quá trình là CO2, H2O và nhiệt. Tiêu biểu là phản ứng: C6H12O6 + 6O2 = 6CO2 + 6H2O + 673 KCal Khi oxi trong môi trường giảm xuống khoảng thấp hơn 2 % thì quá trình lên men sẽ thay thế cho quá trình hô hấp hiếu khí. Quá trình hô hấp yếm khí này tạo ra một lượng lớn các chất trung gian trong đó đáng kể nhất là quá trình biến đổi đường thành rượu và khí cacbonic. Chính những sản phẩm trung gian này đã làm quá trình hư hỏng của quả xảy ra nhanh hơn bằng việc làm biến đổi màu sắc, mùi vị và trạng thái quả một các sâu sắc. Tiêu biểu là phản ứng: C6H12O6 → 2C2H5OH +2CO2 +28 Kcal Như vậy khi sự thông khí trong khi bảo quản kém sẽ làm tăng nồng độ khí CO2, nhiệt độ xung quanh quả và tạo môi trường thuận lợi cho hô hấp yếm khí và các vi sinh vật phát triển, kết quả là quả sẽ bị hư hong nhanh chóng. Vì vậy việc đảm bảo sự thông khí một cách thích hợp tránh hô hấp yếm khí và đảm bảo hô hấp hiếu khí xảy ra thích hợp là rất quan trọng và có ý nghĩa quyết định đến chất lượng của quá trình bảo quản. Những loại quả có quá trình hô hấp tăng lên rất nhanh chóng và sau đó lại giảm xuống gọi là hô hấp đột biến (Climacteric), ví dụ như cà chua và xoài. Còn những loại quả mà trong suốt quá trình bảo quản sự hô hấp luôn giảm thì cường độ hô hấp không có điểm đột biến (non-climacteric) như táo, nho…Khí etylen tạo ra trong suốt quá trình hô hấp là nguyên nhân quan trọng thúc đẩy quá trình chín của SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 29 quả. Etylen là một hormone thực vật tự nhiên liên quan đến quá trình sinh trưởng, phát triển, chín và sự lão hóa của thực vật. Người ta cho rằng phytohormone này thúc đẩy quá trình chín của rất nhiều loài quả như: chuối, dứa, cà chua, xoài, dưa hấu và đu đủ. Nó được tạo ra ở nhiều nồng độ khác nhau phụ thuộc vào nhiều loại quả. Nhưng khi nồng độ ethylene đạt từ 0.1 đến 1.0 ppm (phần triệu) thì bắt đầu xảy ra quá trình chín của quả vùng nhiệt đới. Sản phẩm ethylene trong quả là tín hiệu cho hoạt động của nhiều loại enzyme khác nhau dẫn đến những thay đổi sinh lý như: quả có sự thay đổi màu sắc từ xanh sang đỏ, trạng thái quả chuyển sang mềm và có mùi vị khác nhau. Như vậy trong quá trình bảo quản quả cần phải hạn chế hô hấp để tránh tổn thất chất khô đồng thời phải tuyệt đối tránh hô hấp yếm khí. Đây là một bài toán tối ưu quan trọng quyết định lớn tới chất lượng bảo quản. 2.2.2.2 Sự hư hỏng trong quá trình bảo quản  Do vi sinh vật: Vi sinh vật thâm nhập từ môi trường  Do hô hấp  Do sự bay hơi nước  Do hoạt động của enzyme  Do sự tự biến đổi các chất  Do tác động cơ học  Do tác động của những hóa chất bảo vệ thực vật. 2.2.2.3. Bảo quản rau quả  Nguyên lý bảo quản rau quả: Khi lưu trữ rau quả tươi sau khi thu hái trong điều kiện khí quyển bình thường, chất lượng của chúng sẽ giảm dần và tiến tới hư hỏng hoàn toàn do thối rữa. thời gian từ khi thu hái cho tới khi rau quả hỏng hoàn toàn dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như: giống, loại rau quả, thời gian thu hái, độ chín và điều kiện môi trường bảo quản… Nguyên nhân trực tiếp và cơ bản dẫn tới rau quả bị hư hỏng là do hiện tượng chín và hiện tượng nhiễm bệnh. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 30 Quá trình chín của rau quả phụ thuộc vào cường độ hô hấp, hô hấp càng mạnh mẽ thì quá trình chín càng nhanh chóng xảy ra và thời hạn bảo quản của rau quả càng bị rút ngắn. Quả càng chín thì càng trở nên mềm và giảm khả năng chịu tác động cơ học. Quá trình tiến tới giai đoạn chín của rau quả là quá trình phân hủy các chất dinh dưỡng trong đó có cả các chất có khả năng ức chế vi sinh vật như các acid, phitonxit….tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật phát triển mạnh gây thối rữa và hư hỏng nhanh chóng. Như vậy, để kéo dài thời hạn bảo quản của rau quả trước hết là kìm hãm hoạt động sống, tức là ức chế cường độ hô hấp, từ đó kìm hãm tốc độ chín của quả. Nhưng chỉ được kìm hãm chứ không được đình chỉ nếu không sẽ dẫn tới hư hỏng nhanh chóng hơn do hô hấp yếm khí. Trong trường hợp hô hấp được hạn chế tới mức thấp nhất nhưng khi vi sinh vật nhất là nấm mốc có điều kện phát triển mạnh thì rau quả cũng sẽ bị hư hỏng nhanh chóng. Vì vậy nguyên tắc tiếp theo đó là ngăn ngừa, loại bỏ hoạt động của vi sinh vật [8]. Dựa trên những nguyên lý sinh học, giáo sư Nikitin chia các phương pháp bảo quản thành 3 nhóm:  Nhóm thứ nhất bao gồm các phương pháp dựa trên nguyên lý bảo toàn sự sống- Bioza: rau quả được giữ nguyên trạng thái sống bình thường không cần tác động bất cứ giải pháp xử lý nào ngoài một vài tác động hạn chế cường độ sống nhằm giảm mức phân hủy thành phần dinh dưỡng do hô hấp và giảm tổn hao khối lượng tự nhiên do bay hơi.  Nhóm thứ hai: gồm các phương pháp dựa trên nguyên lý tiềm sinh-Anabioza. Làm chậm, ức chế hoạt động sống của quả và của vi sinh vật nên làm chậm thời gian hư hỏng và thối rữa của rau quả. Trong nhóm này gồm các phương pháp: bảo quản lạnh, lạnh đông, cô đặc, sấy điều chỉnh thành phần khí quyển, muối chua, dầm giấm….đặc điểm chung của các phương pháp này là tạo ra môi trường không thuận lợi cho hoạt đông sống của quả và của vi sinh vật. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 31  Nhóm thứ ba là nhóm dựa trên nguyên lý phi tiềm sinh-Abioza. Đó là các phương pháp loại bỏ sự sống của quả cũng như của vi sinh vật. Khi không còn hoạt động sống thì quả cũng mất tính kháng bệnh tự nhiên chính vì thế chúng trở thành môi trường thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật, muốn giữ sản phẩm khỏi hư hỏng thì phải tiêu diệt hay ức chế hoàn toàn vi sinh vật có trong sản phẩm. Các phương pháp thuộc nhóm này có: thanh trùng, tiệt trùng, các phương pháp bảo quản bằng hóa chất hay bằng kháng sinh, phương pháp lọc vi sinh, chiếu xạ…  Những yếu tố ảnh hưởng tới thời hạn bảo quản rau- quả: Thời gian bảo quản rau quả tươi phụ thộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau trong đó đáng kể nhất đó là nhiệt độ, độ ẩm và thành phần khí quyển. - Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng có yếu tố quyết định tới thời hạn bảo quản của rau quả, sự thay đổi nhiệt độ trước hết ảnh hưởng tới cường độ hô hấp. Nhiệt độ càng cao tốc độ phản ứng sinh hóa xảy ra trong rau quả càng nhanh, tuy nhiên sự phụ thuộc tỉ lệ thuận đó chỉ đến giới hạn nhất định, cụ thể khi tăng nhiệt độ từ 25 oC trở lên thì cường độ hô hấp lại giảm. Chúng ta muốn ức chế hoạt động sống của rau quả thì bảo quản ở nhiệt độ càng thấp càng tốt, tuy nhiên nhiệt độ quá thấp không hẳn đã kéo dài được thời gian bảo quản của rau quả vì tế bào thực vật bị phá hủy do dịch bào bị đóng băng mặt khác nhiệt độ thấp làm rối loạn một số quá trình sinh lý, sinh hóa của quả, ví dụ như chuối xanh bảo quản dưới 12oC chuối sẽ không chín, chuối chín dưới 11oC thì sẽ bị thâm.  Như vậy, mỗi loại rau quả thích hợp với một nhiệt độ nhất định nào đó và nhiệt độ bảo quản tối ưu. - Độ ẩm tương đối của không khí quyết định tới tốc độ bay hơi nước của rau quả. Độ ẩm càng thấp thì cường độ hô hấp và tốc độ bay hơi nước càng cao làm giảm khối lượng và làm quả bị héo. Nhưng độ ẩm thấp làm giảm khả năng hoạt động của vi sinh vật nên hạn chế bệnh cho quả. Ngược lại nếu độ ẩm cao làm giảm quá trình bay hơi nước và hô hấp, tuy nhiên nếu độ ẩm quá cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển ngoài ra còn làm ngưng tụ nước trên bề mặt rau quả dẫn đến SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 32 rối loạn hô hấp. Vì thế cần chọn độ ẩm thích hợp cho từng loại quả khi bảo quản - độ ẩm tối ưu. -Thành phần khí quyển đó là thành phần khí O2 và CO2. Hai thành phần này phải thích hợp với từng loại quả để giảm tối đa hô hấp hiếu khí nhưng phải tránh điều kiện để xảy ra hô hấp yếm khí, từ đó hạn chế tối đa quá trình sống cũng như không sinh ra những chất có hại sinh ra do hô hấp yếm khí đầu độc quả.  Các phương pháp bảo quản rau quả [8]:  Bảo quản ở điều kiện thường.  Bảo quản lạnh và lạnh đông.  Bảo quản trong môi trường thay đổi thành phần khí quyển và một số phương pháp xử lý.  Bảo quản CA (Controled Atmosphere) thay đổi thành phần không khí.  Bảo quản trong môi trường khí quyển cải biến (MA_ Modified atmosphere) quả được đựng trong túi hay tạo màng bao polyme.  Bảo quản bằng hóa chất.  Bảo quản bằng tia bức xạ. 2.2.2.4. Ưu điển của chitosan trong bảo quản trái cây  Có khả năng tạo màng dẻo, dai: Ở nồng độ thích hợp chitosan có khả năng tạo màng khá dai, khó xé rách, có độ bền tương đương với một số chất dẻo vẫn dùng làm bao gói.  Có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn cao  Tránh mất ẩm của quả khi bảo quản lạnh  Hạn chế oxi cung cấp, giảm hô hấp hiếu khí và tránh yếm khí  Làm chậm lại quá trình bị thâm của rau quả: Rau quả sau khi thu hoạch sẽ dần dần bị thâm, làm giảm chất lượng và giá trị. Rau quả bị thâm là do quá trình oxi hoá tạo ra các sản phẩm polyme hóa của orthoquinon. Nhờ bao gói bằng màng chitosan mà ức chế được hoạt tính oxy hóa của các polyphenol, làm thành phần của SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 33 anthocyamin, flavonoid và sự tổng lượng các hợp chất phenol ít biến đổi, giữ cho rau quả tươi lâu hơn.  Có khả năng kết hợp với các chất bảo quản khác (axit benzoic…)  Dễ phân hủy sinh học và thân thiện với môi trường  Có khả năng hấp phụ màu mà không hấp phụ mùi, hấp phụ một số kim loại nặng. 2.2.3. Các nghiên cứu đã đạt được Đã có rất nhiều nghiên cứu về việc ứng dụng chitosan để bảo quản trái cây, một số nghiên cứu đã thu được những thành công nhất định. Sau đây là một số nghiên cứu tiêu biểu: 2.2.3.1. Các nghiên cứu trong nước  Qui trình nghiên cứu bảo quản xoài được Sở Khoa học và Công nghệ TP Cần Thơ nghiệm thu đầu năm 2007. Nông trường Sông Hậu – nơi nghiên cứu hiện có 150.000 cây xoài cát Hòa Lộc, trung bình, mỗi hộ có 80-100 cây. Với sản lượng hàng năm lên đến cả hàng nghìn tấn xoài sản phẩm. Xoài Cát Hòa Lộc có vỏ mỏng nên khó bảo quản lâu và vận chuyển xa, gây khó khăn cho việc xuất khẩu. Tiến sĩ Toàn cùng các cộng sự đã nghiên cứu khắc phục hạn chế trên bằng cách xử lý chần nước nóng để ngăn bệnh thán thư và ruồi đục trái. Biện pháp này giúp đảm bảo sản phẩm đạt chất lượng theo yêu cầu kiểm dịch thực vật cho cây ăn trái. Sau đó, trái được nhúng vào dung dịch Chitosan, tạo nên một lớp màng bao phủ mỏng có tác dụng chống mất ẩm, giảm hao hụt trọng lượng và kéo dài thời gian tồn trữ. Qua các thí nghiệm, xoài được tồn trữ tốt nhất là ở nhiệt độ lạnh từ 10-12 0C. Kết luận: “Qua quá trình xử lý và tồn trữ, trái xoài được bảo quản tốt nhất trong 4 tuần, thậm chí có khả năng kéo dài 6 tuần, có thể vận chuyển và phân phối đi xa”.  Qua nhiều nghiên cứu các nhà khoa học đã đưa ra qui trình bảo quản trái quýt đường với thời gian tồn trữ đến 8 tuần. Đó là bảo quản trái bằng cách bao màng Chitosan ở nồng độ 0,25% kết hợp với bao Polyethylene (PE) đục 5 lỗ với đường kính mỗi lỗ 1 mm và ghép mí lại bằng máy ép. Sau đó, bảo quản ở nhiệt độ 12○C. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 34 Với phương pháp này, phẩm chất bên trong trái như: hàm lượng đường, hàm lượng vitamin C... luôn ổn định, tỷ lệ hao hụt trọng lượng thấp, màu sắc vỏ trái đồng đều và đẹp.  Đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các hoạt chất sinh học biển để thay thế các chất độc hại trong bảo quản nông thủy sản sau thu hoạch và chế biến thực phẩm” của PGS. TS Trần thị Luyến Khoa Chế Biến, Trường Đại Học Nha Trang đã đưa ra một số kết luận sau: Lần dầu tiên các dẫn liệu khoa học được đưa ra trên cơ sở nghiên cứu một cách chi tiết đầy đủ về khả năng bảo quản nông thủy sản của chitosan, COS (chitosanolygosacharide) trên các đối tượng cá ồ, cam, quýt, cà chua, hành tím và dứa quả, thịt heo, thịt bò, cá ngân, và xúc xích  Qua nghiên cứu của Châu Văn Minh và cộng sự thuộc Viện hoá học các hợp chất tự nhiên, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia đã điều chế được chế phẩm BQ-1 với nguyên liệu chính là chitosan có tác dụng bảo quản quả tươi (cà chua, nho vải, chuối,…) rất tốt. Chế phẩm này có tác dụng chống mốc, chống sự phá huỷ của một số nấm men, vi sinh vật gram âm trên các loại hoa quả.  Mới đây nhất, tại Đại học Thủy Sản Nha Trang, các kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trần Thị Luyến, Nguyễn Trọng Bách cho thấy chitosan có thể kết hợp với các phụ liệu tinh bột hồ hóa, sorbitol và PVA (polyvinyl acetate) để tạo màng bao có đặc tính cơ lý khá tốt (mềm dẻo và độ bền đứt cao) có khả năng đáp ứng yêu cầu bao gói thực phẩm. Đồng thời khi sử dụng màng bao chitosan tạo thành để bao gói thịt bò tươi, kết quả cũng cho thấy màng bao chitosan đã làm giảm đáng kể nồng độ vi sinh vật tổng số trên bề mặt thịt bò khi bảo quản ở nhiệt độ 0-5ºC [5]. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 35 CHƢƠNG III: TỔNG QUAN CHITOSAN TRONG BẢO QUẢN CÀ CHUA. 3.1. Lựa chọn giống cà chua cho bảo quản Qua khảo sát về các giống cà chua hiện nay có trên thị trường các tỉnh phía Bắc Việt Nam, tác giả đã lựa chọn giống cà chua hồng Đài Loan P375 do Xí Nghiệp Rau Quả - Viện Nông Nghiệp Công Nghệ Cao cung cấp vì giống này có những đặc điểm sau:  Đang được trồng và sử dụng phổ biến nhất trên thị trường.  Cho chất lượng quả tốt và ổn định.  Quả đều rất thích hợp cho bảo quản cũng như cho quá trình cơ giới, tự động hóa nếu bảo quản ở quy mô lớn.  Kích thước quả phù hợp cho việc tạo màng bao chitosan. Mỗi quả có đường kính từ 4-5cm.  Bề mặt quả nhẵn bóng và đều đẹp rất thích hợp cho việc ăn tươi.  Quả chín đều. 3.2. Xác định độ chín thích hợp cho bảo quản Tuỳ đặc trưng giống và điều kiện thời tiết, quả cà chua chín ở độ tuổi 30-35 ngày. Trong quá trình chín cà chua phải qua các thời kỳ sau đây: - Thời kỳ quả xanh: Quả và hạt phát triển chưa hoàn chỉnh. Màu quả xanh hoàn toàn. Nếu thu hái quả ở thời kỳ này và thông qua các phương pháp thúc chín thì quả chín không bình thường, quả không có hương vị, không có màu sắc đặc trưng của giống nên không thích hợp cho việc thu hái và bảo quản. - Thời kỳ chín xanh (Green): Chất keo bao quanh hạt được hình thành. Quả phát triển đầy đủ về kích thước, quả chưa có màu hồng hoặc màu vàng. Nếu đem thúc chín thì quả sẽ thể hiện màu sắc của giống. Do trong giai đoạn này khi trải qua quá trình chín quả sẽ chịu được nhiệt độ lạnh khác nhau nên không thích hợp cho bảo quản. - Thời kỳ chín vàng (Breaker): Đỉnh quả xuất hiện màu vàng hoặc màu hồng với diện tích bề mặt chiếm khoảng 10%. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 36 - Thời kỳ chuyển màu (Turning): Diện tích bề mặt từ 10-30% có màu vàng hoặc đỏ. - Thời kỳ chín hồng (Pink): 30-60% diện tích bề mặt quả có màu hồng nhạt hoặc màu vàng. Quả đạt độ chín cao nên đã trải qua các giai đoạn sinh lý quan trọng nên rất khó đánh giá hiệu quả của bảo quản thông qua các chỉ tiêu có liên quan tới các quá trình sinh lý như hô hấp, biến đổi màu sắc…Vì vậy dùng độ chín này để bảo quản trong thí nghiệm là không thích hợp. - Thời kỳ quả hồng hoặc đỏ (Light Red): 60-90% diện tích bề mặt quả có màu vàng hoặc đỏ. Quả chín quá nên không thể phân tích được hiệu quả bảo quản. - Thời kỳ quả chín đỏ (Red): Trên 90% diện tích bề mặt có màu đỏ. Trong thời kỳ này cũng không thể phân tích được hiệu quả bảo quản. Qua đánh giá cho thấy thích hợp nhất cho quá trình thu hái để bảo quản là khi quả đạt độ chín vàng (Breaker) và thời kì chuyển màu (Turning). Để chọn ra một độ chín thích hợp nhất cho bảo quản bằng chitosan, tôi đã tiến hành làm thí nghiệm khảo sát sơ bộ: thu hái hai độ chín dự kiến và tiến hành nhúng vào dung dịch chitosan đã chuẩn bị để bảo quản. Bảo quản ở cùng một điều kiện trong phòng thí nghiệm. Sau 14 ngày trên cơ sở đánh giá màu sắc, trạng thái sơ bộ rút ra được một số kết luận sau:  Hai độ chín khảo sát đều có màu biến đổi đồng đều.  Quả ở độ chín vàng có độ cứng cao hơn. Như vậy cả hai độ chín đều thích hợp cho việc đánh giá hiệu quả bảo quản, song độ chín vàng (Breaker) cho thời gian bảo quản lâu hơn do quả còn “xanh” hơn thời kỳ chuyển màu (Turning). Vì vậy độ chín thích hợp cho việc bảo quản cũng như đánh giá hiệu quả bảo quản bằng chitosan là thời kỳ chín vàng (Breaker). Tuy nhiên đây mới chỉ là những khảo sát sơ bộ do thời gian nghiên cứu chưa đáp ứng được, vì vậy một kiến nghị cho việc khảo sát chính xác độ chín của cà chua phù hợp nhất cho việc bảo quản bằng chitosan là cần thiết. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 37 3.3. Chitosan và các nồng độ tạo màng bao Chitosan phục vụ thí nghiệm được cung cấp từ trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang- (Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Khánh hòa, Việt Nam) có những đặc tính sau Bảng 3.1: Đặc tính của chitosan Đặc tính Giá trị Độ ẩm 10% Hàm lượng ion Ca2+ 0.01% Độ nhớt 265cps Hàm lượng chất không tan 0.18% Hàm lượng Nitơ tổng số 8,42% Độ Deacetyl 87.8% Độ tan (trong dung dịch CH3COOH 1%) 99,82% Phản ứng Biure Âm tính Hàm lượng chitosan 89,82% Qua các tài liệu nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan tan tốt trong dung dịch axit axetic 1%. Thí nghiệm đã tiến hành pha chitosan trong dung dịch axit axetic 1% để thu được dung dịch chitosan: 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5% ở các nồng độ này chitosan đều tan hết sau 24h cho dung dịch trong có màu vàng ngà nhạt, dung dịch không có vẩn đục hay vón cục. Độ nhớt tăng lên theo nồng độ của chitosan. Riêng dung dịch chitosan ở nồng độ 3.0% chitosan không tan hết và có vón cục. Nên ở nồng độ 3.0% chitosan không tan hết trong dung dịch axit axetic 1%. Để xác định chitosan thích hợp làm màng bao theo thí nghiệm được cung cấp từ trường Đại Học Thủy Sản Nha Trang- (Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam) tiến hành thí nghiệm theo sơ đồ sau : SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 38 Hình 3.1: Sơ đồ bố trí tiến hành thí nghiệm  Qua sơ đồ bố trí thí nghiệm trên các tác gái kết luận rằng nồng độ chitosan ở 1.5% và 2% thì cho kết quả tốt nhất với tỉ lệ hao hụt thấp, màu sắc sản phẩm đẹp, thời gian bảo quản được kéo dài . 3.4. Khảo sát sơ bộ số lần nhúng chitosan phù hợp cho bảo quản Dung dịch chitosan có độ nhớt nên có khả năng bám dính trên bề mặt quả cà chua và tạo màng khi để khô. Tuy nhiên do bề mặt quả nhẵn nên khó tạo điều kiện tốt cho việc tạo một lớp màng đều trên bề mặt quả, vì thế sẽ ảnh hưởng không nhỏ tới hiệu quả cũng như sự đánh giá khả năng ứng dụng chitosan trong bảo quản cà chua. Nhiệt độ lạnh 12-13 o C Nhiệt độ thường Xác định các chỉ tiêu: Hao hụt khối lượng, đường khử, axit, vi sinh vật tổng số, chất khô hoà tan, mằu sắc, độ cứng, cường độ hô hấp, cảm quan. Nhận xét-Kết luận Lựa chọn-Rửa sạch Để khô 0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% Bảo quản Nhúng vào dung dịch chitosan 0% SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 39 Do thời gian còn hạn chế nên việc đánh giá số lần nhúng chỉ dựa trên sự quan sát lớp màng tạo được trên bề mặt quả sau khi nhúng vào chitosan và để khô. Qua khảo sát nhận thấy rằng: với chỉ 1 lần nhúng thì ở tất cả các nồng độ màng chitosan tạo được đều không đều (soi nghiêng trên ánh sáng thấy những vệt loang không bao phủ toàn bộ bề mặt quả). Các nồng độ 0.5%; 1.0% do độ nhớt của các dung dịch này thấp nên phải nhúng đến lần thứ 3 thì màng chitosan mới bao phủ hết toàn bộ bề mặt quả, sau mỗi lần nhúng để khô trong 15 phút. Các nồng độ 1.5%; 2.0%; thì nhúng 2 lần, riêng ở nồng độ 2.5% do độ nhớt khá cao nên chỉ cần nhúng một lần là màng chitosan đã bao phủ toàn bộ bề mặt quả. 3.5. Điều kiện bảo quản 3.5.1. Bảo quản ở nhiệt độ thường Quả được bảo quản và theo dõi ở môi trường phòng thí nghiệm với nhiệt độ biến đổi trong khoảng từ 22-28 0C độ ẩm nằm trong khoảng 80-85% (Điều kiện khí hậu biến đổi từ tháng 2 tới tháng 5). 3.5.2. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh Theo dõi ảnh hưởng của chitosan kết hợp với bảo quản lạnh bằng cách bảo quản trong ngăn dưới tủ lạnh với nhiệt độ trong khoảng 12-130C là khoảng nhiệt độ tối ưu để bảo quản cà chua. Trong điều kiện tủ lạnh để khống chế nhiệt độ này cần hạn chế việc mở tủ thường xuyên và luôn duy trì độ ẩm 90%. 3.6. Biến đổi độ cứng của quả trong quá trình bảo quản Trong quá trình bảo quản trong quả protopectin bị thủy phân thành pectin hòa tan làm cho quả mềm dần. Thí nghiệm được thực hiện với các nồng độ chitosan nhu bên dưới và chỉ dùng một lần nhúng. 3.6.1 Biến đổi độ cứng trong mẫu bảo quản thường Kết quả đo độ cứng mẫu bảo quản thường được biểu diễn thông qua biểu đồ sau: Bảng 3.2: Biến đổi độ cứng (mẫu bảo quản thƣờng- kg/cm2) SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 40  Nhận xét: Với mẫu đối chứng (0%) độ cứng giảm rất nhanh sau 15 ngày đầu tiên bảo quản (từ 5.5-1.2 kg/cm2). Do trong giai đoạn này quả chín rất nhanh nên lượng protopectin có trong quả xanh bị biến đổi rất nhiều. Diễn biến này cũng trùng với thời kỳ quả hô hấp mạnh nhất (trình bày trong phần biến đổi cường độ hô hấp) nên các hợp chất bị biến đổi nhanh chóng. Sau 20 đến 25 ngày bảo quản quá trình giảm độ cứng diễn ra chậm dần do lượng protopectin có sẵn trong quả xanh ban đầu không còn nhiều và giai đoạn này hô hấp của quả cũng giảm dần, quả bắt đầu bị biến phân hủy sâu sắc và hư hỏng. Các mẫu 0.5%; 1.0% cũng biến đổi tương tự mẫu đối chứng nhưng độ cứng của quả ở cùng thời điểm luôn cao hơn. Chứng tỏ khi bảo quản bằng chitosan quả có cứng hơn khi không dùng. Với mẫu 1.5% và 2.0% thì ban đầu sau 15 ngày bảo quản thì độ cứng của mẫu 2.0% giảm nhanh hơn mẫu 1.5% nhưng sau đó thì mẫu 2.0% giảm ít hơn nhiều so với mẫu 1.5% điều này có thể được giải thích do cường độ hô hấp ban đầu của mẫu 2% diễn ra mạnh hơn mẫu 1.5% nhưng sau đó quá trình này bị hạn chế dẫn tới độ cứng của quả ít biến đổi hơn. Riêng mẫu 2.5% thì ban đầu độ cứng biến đổi ít nhất nhưng sau 25 ngày bảo quản thì độ cứng giảm thấp hơn mẫu 2.0%  Kết luận: Nồng độ Ngày 0% 0.50% 1.00% 1.50% 2.00% 2.50% 0 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 6 3.13 2.86 3 3.8 3.5 4 15 1.166 2.25 2.25 2.733 2.433 3.6 25 0.5 1.9 1.875 1.833 2.5 2.366 SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 41  Nhìn vào biểu đồ ta có thể nhận thấy ở cùng một thời điểm thì biên độ thay đổi độ cứng của mẫu có dùng chitosan so với mẫu đối chứng là rất rõ rệt. Điều này chứng tỏ chitosan có thể làm giảm sự biến đổi độ cứng của quả.  Hiệu quả làm giảm sự biến đổi độ cứng quả cà chua khi bảo quản bằng màng chitosan có nồng độ 2% và 2.5% là tốt nhất. 3.6.2 Biến đổi độ cứng mẫu bảo quản lạnh Độ cứng của mẫu bảo quản lạnh cũng được đo bằng máy đo độ cứng ở thời điểm ban đầu, sau 6 ngày, 15 ngày, 30 ngày bảo quản. Khi bảo quản cà chua bằng chitosan kết hợp với bảo quản ở nhiệt độ lạnh thì độ cứng của quả biến đổi ít hơn so với bảo quản ở nhiệt độ thường. So sánh với sự biến đổi độ cứng của mẫu bảo quản thường ta thấy mẫu bảo quản lạnh biến đổi ít hơn ở cùng thời điểm với tất cả các nồng độ. Điều này là do tác dụng hạn chế hô hấp và biến đổi chất trong môi trường bảo quản lạnh, ở nhiệt độ lạnh tất cả các quá trình sống của quả diễn ra chậm hơn ở nhiệt độ cao và vấn đề này đã được rất nhiều nghiên cứu chứng minh. 3.7. Qúa trình biến đổi màu sắc quả Khi chín cà chua chuyển dần từ màu xanh sang màu vàng rồi màu đỏ. Điều này là do clorophil chuyển thành carotin…tạo nên màu sắc của quả chín. Tốc độ biến đổi các thành phần hóa học trong đó có biến đổi về màu sắc tỷ lệ thuận với cường độ hô hấp. Màu sắc của quả được khảo sát thông qua sự sai khác về màu (ΔE) trước và sau thời gian bảo quản, được xác định bằng máy đo màu. Đánh giá tại thời điểm ban đầu và sau 6 ngày, 15 ngày, 25 ngày bảo quản. Thời gian bảo quản càng lâu thì màu sắc biến đổi càng nhiều do quả càng chín. Do quá trình chín tỉ lệ thuận với cường độ hô hấp nên màu sắc quả biến đổi điều này có được là do cường độ hô hấp khi bảo quản bằng chitosan được hạn chế hơn. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 42 Nhưng ở đây chủ yếu là hô hấp yếm khí do màng chitosan quá dày đã hạn chế tối đa lượng khí oxi trao đổi với quả và tới ngưỡng làm quá trình hô hấp yếm khí xảy ra mạnh mẽ kết hợp với lượng nhiệt sinh ra không tỏa ra ngoài một cách hiệu quả nên quả biến đổi nhiều hơn các mẫu khác. Để so sánh ảnh hưởng của màng chitosan trong bảo quản thường kết hợp với bảo quản lạnh tới cường độ màu của cà chua chúng tôi đã tiến hành đo sự biến thiên cường độ màu tại cùng một thời điểm (15 ngày sau bảo quản) ở cả hai chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường và kết quả thu được như sau: Qúa trình bảo quản cà chua bằng chitosan ở nhiệt độ thường và nhiệt độ lạnh thì khả năng làm giảm sự biến đổi màu sắc khi kết hợp với bảo quản lạnh là rất rõ rệt. Ta thấy sự biến đổi màu của mẫu bảo quản lạnh đều thấp hơn mẫu bảo quản thường. Như vậy ở nhiệt độ thấp cường độ hô hấp giảm hẳn đã làm màu sắc quả biến đổi ít hơn, điều này một lần nữa minh chứng cho sự phụ thuộc của sự biến đổi màu sắc vào cường độ hô hấp. Như vậy khả năng làm giảm cường độ hô hấp của màng chitosan đã được chứng minh một phần thông qua màu sắc quả khi bảo quản.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm giảm sự biến đổi màu quả một cách rõ rệt.  Sự kết hợp màng chitosan với bảo quản lạnh làm giảm sự biến đổi màu sắc ở tất cả các nồng độ.  Ở nồng độ 2.0% màng chitosan cho hiệu quả làm giảm khả năng biến đổi màu tốt nhất của quả cà chua ở cả 2 chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường. 3.8.Ảnh hƣởng của màng chitosan tới cƣờng độ hô hấp của cà chua Khi bảo quản mọi rau quả khác cũng như cà chua luôn có các hoạt động sống, trao đổi chất. Trong đó điển hình nhất là quá trình hô hấp đó cơ bản là quá trình sử dụng các hợp chất đã được tổng hợp khi quả còn ở trên cây để duy trì sự sống của quả. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 43 Cà chua khi bảo quản phụ thuộc vào thành phần không khí bên ngoài mà sự hô hấp có thể là hiếu khí hoặc yếm khí. Cả hai quá trình này đều làm biến đổi các chất trong quả, nhưng hạn chế tối đa hô hấp yếm khí và giữ hô hấp hiếu khí ở mức tối thiểu đó chính là bài toán tối ưu của phương pháp bảo quản này. Chitosan là chất có khả năng tạo màng, tùy theo nồng độ mà khả năng thấm khí (O2) của chúng khác nhau, và khi làm màng bao thì khả năng điều chỉnh hô hấp của chúng theo đó cũng khác nhau. Để đánh giá khả năng điều chỉnh hô hấp của màng chitosan, thông qua các kết quả nghiên cứu về độ cứng, biến đổi màu và hao hụt khối lượng chúng tôi nhận thấy nồng độ chitosan cho kết quả tốt là 1,5% và 2,0%, kết hợp với điều kiện thiết bị không cho phép. Vì vậy trong phần nghiên cứu xác định cường độ hô hấp của quả chỉ xác định tại ba mẫu: mẫu đối chứng, mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % với cùng thời gian và điều kiện bảo quản (nhiệt độ thường).  Kết quả thu được như sau: Cƣờng độ hô hấp 0 10 20 30 40 50 60 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ngày m g C O 2 /k g. h Mẫu DC Mẫu 1,5% Mẫu 2% Hình 3.2: Ảnh hƣởng của màng chitosan tới cƣờng độ hô hấp  Nhận xét: Nhìn vào biểu đồ ta thấy cà chua là loại quả có hô hấp đột biến (Climacteric). Cường độ hô hấp biến đổi lên xuống theo thời gian bảo quản. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 44 Tất cả các nồng độ biểu đồ đều giống nhau, chứng tỏ diễn biến hô hấp của chúng là như nhau nhưng chỉ khác nhau về cường độ. Ban đầu do quả còn ương nên cường độ hô hấp giảm dần trong 4 ngày đầu bảo quản giai đoạn này là thời kỳ ngủ tĩnh của quả, quả kết thúc giai đoạn tích lũy dinh dưỡng như khi còn trên cây mẹ và chuẩn bị quá trình chín nên các phản ứng tổng hợp diễn ra chậm hơn và lượng CO2 thoát ra giảm đi. Sau thời gian ngủ tĩnh hô hấp bắt đầu tăng lên và quả bắt đầu chín. Lúc này hàng loạt các phản ứng mà chủ yếu là các phản ứng phân hủy (chủ yếu là phân hủy đường) và biến đổi chất này thành chất khác (tinh bột biến thành đường) xảy ra mạnh mẽ và lượng CO2 thoát ra nhiều. Cường độ hô hấp đạt cực đại (điểm climacteric cực đại) sau 8 ngày bảo quản lúc này quả chín hoàn toàn. Trái cây sau khi chín hoàn toàn thì bắt đầu giai đoạn phân hủy và chết. Giai đoạn này chủ yếu là các phản ứng tự phân không không sinh ra nhiều CO2. Cường độ hô hấp giảm dần sau 9 ngày bảo quản. Dựa vào biểu đồ ta thấy mẫu 2.0 % có cường độ hô hấp thấp nhất, ở giai đoạn hô hấp cực đại mẫu 1.5 % có cường độ hô hấp mạnh hơn mẫu đối chứng nhưng ở giai đoạn sau thì thấp hơn. Điều này có thể giải thích như sau: Màng chitosan 1.5% có khả năng tích luỹ khí ethylen sinh ra do quá trình hô hấp nhiều hơn mẫu 2% nên khả năng kích thích của khí này tới các hệ enzyme hô hấp, đặc biệt là amylaza làm chuyển hoá tinh bột thành đường, lượng đường tăng lên làm cho hô hấp và quá trình chín tăng lên. Ở mẫu 2% khí ethylen cũng được tích luỹ song do màng chitosan dầy hơn nên lượng O2 cung cấp cho hô hấp ít hơn nên hô hấp vẫn thấp hơn. Do màng chitosan có khả năng thấm khí nên lượng không khí trao đổi giữa môi trường và quả bị thay đổi dẫn tới cường độ hô hấp thay đổi. Cường độ hô hấp càng thấp quả càng chín chậm hơn. Mẫu 2.0 % có khả năng làm giảm cường độ hô hấp tốt nhất, quá trình thấm khí O2 và thoát CO2 tránh yếm khí diễn ra rất có lợi cho bảo quản. Thời kỳ hô hấp cực đại của mẫu đối chứng diễn ra lâu hơn hai mẫu còn lại là do nhu cầu O2 luôn được đáp ứng từ môi trường, trong khi đó do có khả năng thấm SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 45 khí từ từ nên lượng này cung cấp cho quả ở mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % bị hạn chế hơn. Cường độ hô hấp của mẫu 2.0 % thấp nhất chứng tỏ lượng O2 vẫn đủ duy trì hô hấp hiếu khí và không xảy ra hô hấp yếm khí.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm biến đổi thành phần không khí cung cấp cho quá trình hô hấp của quả.  Màng chitosan nồng độ 2.0 % có khả năng hạn chế hô hấp ở mức thấp nhất. Quả chín chậm nhất.  Màng chitosan 2.0 % không làm quả bị hô hấp yếm khí mạnh mẽ. 3.9. Biến đổi hàm lƣợng acid chung trong quá trình bảo quản Acid cũng tham gia một phần rất nhỏ vào quá trình hô hấp, nhưng chủ yếu là quá trình tổng hợp nên acid là hợp chất trung gian của các quá trình. Các giai đoạn phát triển khác nhau cho hàm lượng acid biến đổi khác nhau. Để đánh giá sự ảnh hưởng của màng bao chitosan tới hàm lượng acid chung khi bảo quản cà chua tác giả đã tiến hành đo ở tất cả các nồng độ sau mỗi 5 ngày bảo quản đối với mẫu bảo quản thường.  Nhận xét: Tất cả các mẫu đều có sự biến thiên hàm lượng acid chung giống nhau và chỉ khác nhau về cường độ. Những ngày đầu của quá trình bảo quản hàm lượng acid tăng lên nhanh chóng, sau 5 ngày bảo quản hàm lượng acid đạt cực đại. Do ban đầu khi quả còn xanh và bắt đầu chuyển sang giai đoạn chín, các hoạt động hóa sinh xảy ra mạnh mẽ, cường độ hô hấp chưa cao nên lượng acid được tổng hợp không bị mất đi. Chính vì vậy cùng với quá trình chín của quả thì hàm lượng acid tăng lên. Sau khi đạt cực đại thì hàm lượng acid bắt đầu giảm xuống (sau 5 ngày bảo quản) do lúc này cường độ hô hấp bắt đầu tăng mạnh mẽ, các chất hữu cơ dự trữ tham gia nhiều vào quá trình hô hấp. Sau giai đoạn này lượng acid lại tăng lên rất SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 46 nhanh cho đến cuối giai đoạn bảo quản. Do trong quá trình hô hấp một số acid là các hợp chất hữu cơ trung gian được hình thành làm độ chua của quả tăng lên và quả càng chín thì độ chua càng tăng. Điều này cũng một phần là do hàm lượng đường khử đã được sử dụng phần lớn cho hô hấp. Và một số quá trình phân hủy khi quả hư hỏng cũng sinh ra acid (Protein tự phân hủy cũng tạo ra acid, sự thủy phân đường, chất béo có nhiều trong hạt cà chua thành những mảnh 2 cacbon trong chu trình Kreb cũng tạo ra những hợp chất trung gian là các acid hữu cơ) . Như vậy quả chín càng nhanh thì lượng acid càng tăng, cho tới khi quả bị hư hỏng. Ta thấy nồng độ chitosan trong mẫu bảo quản cà chua càng cao thì cường độ biến đổi acid chung lớn nhất điều này cho ta thấy do màng chitosan quá đặc nên sự khuếch tán khí oxi từ môi trường vào bị hạn chế làm quả hô hấp yếm khí, thực chất là các quá trình phân hủy không có mặt của oxi, kết quả của quá trình này tạo ra nhiều chất trung gian, trong đó phải kể đến là các nhóm rượu và acid hữu cơ. Ban đầu thì acid ở tất cả các mẫu còn lại đều tăng với tỉ lệ khác nhau không nhiều. Đây vẫn là thời kỳ tích lũy của quả xanh nên màng chitosan không ảnh hưởng nhiều tới kết quả đó. 3.10. Biến đổi hàm lƣợng đƣờng khử trong quá trình bảo quản Trong quá trình hô hấp cả hiếu khí và yếm khí cơ chất được sử dụng chủ yếu là các đường khử (chủ yếu là Glucoza), nhưng cùng với quá trình này là sự biến đổi các polysacaride khác mà quan trọng nhất là tinh bột chuyển hóa thành đường nhờ các enzyme thủy phân.  Kết quả biến đổi hàm lượng đường khử được mô tả thông qua biểu đồ sau: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 47 0 1 2 3 4 5 6 0 5 10 15 20 25 30 Ngày bảo quản % đ ƣờ ng k hử 0% 0.50% 1% 1.50% 2.00% 2.50% Hình 3.3: Biến đổi đƣờng khử theo thời gian bảo quản (mẫu bảo quản thƣờng)  Nhận xét: Hàm lượng đường khử biến thiên rất nhiều theo thời gian bảo quản. Sau 6 ngày đầu bảo quản lượng đường khử giảm xuống thấp nhất là do trong giai đoạn quả còn xanh lượng đường khử trong quả không nhiều, các enzyme thủy phân vẫn còn nằm ở dạng liên kết nên tinh bột chưa bị chuyển hóa thành đường, mặt khác trong giai đoạn này hô hấp bắt đầu tăng lên, quả không còn ở giai đoạn ngủ tĩnh nên lượng đường giảm đi nhanh chóng. Hàm lượng đường khử bắt đầu tăng lên khi hô hấp giảm đi và tới 14 ngày thì đạt cực đại, điều này trùng khớp với thời điểm hô hấp giảm mạnh. Mặt khác trong giai đoạn này các enzyme đã bị hoạt hóa và quá trình chuyển hóa tinh bột thành đường diễn ra mạnh mẽ. Sau khi đạt cực đại hàm lượng đường khử giảm xuống ở tất cả các mẫu tương ứng với thời kỳ phân hủy của quả. Lúc này quá trình phân hủy đường diễn ra chiếm ưu thế hơn hẳn quá trình tổng hợp. Quả bắt đầu đi vào giai đoạn hư hỏng. Ta thấy mẫu bảo quản cà chua bằng chitosan với nồng độ 2.0 % sau thời gian bảo quản có hàm lượng đường khử vẫn cao, điều này có được là do hô hấp của mẫu này bị hạn chế hơn so với các mẫu khác, hô hấp hiếu khí không xảy ra vì nếu xảy ra SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 48 thì lượng đường sử dụng cho hô hấp tăng lên làm cho tổng lượng đường khử giảm đi. Ở mẫu đối chứng sau thời gian bảo quản hàm lượng đường khử giảm đi nhanh chóng do sau quá trình hô hấp quả chuyển sang giai đoạn phân huỷ (quá chín). Điều này một lần nữa chứng tỏ tác dụng của màng bao chitosan tới quá trình bảo quản. Sau 8 ngày bảo quản khi hô hấp của mẫu 2.0 % đạt cực đại thì lượng đường khử giảm, nhìn vào biểu đồ ta thấy mẫu đối chứng lượng đường khử giảm nhiều nhất, mẫu 2.0 % lại có xu hướng tăng là do hô hấp bị hạn chế hơn.  Kết luận:  Sau thời gian bảo quản hàm lượng đường khử mẫu 2.0 % là nhiều nhất.  Cũng tại điểm Climacteric lượng đường khử của mẫu đối chứng thấp nhất chứng tỏ hô hấp mạnh nhất. Như vậy tác dụng của màng chitosan tới cường độ hô hấp lại một lần nũa được khẳng định. 3.11. Hao hụt khối lƣợng trong quá trình bảo quản Trong quá trình bảo quản có những biến đổi và phản ứng xảy ra hết sức phức tạp, những biến đổi sinh hóa này không những làm thay đổi về chất mà còn dẫn tới biến đổi nhiều về lượng. Cà chua là một loại quả có chứa nhiều nước (84%-88%) nên luôn xảy ra hiện tượng bay hơi nước ra môi trường bên ngoài, bên cạnh đó có quá trình hô hấp của quả làm giảm hàm lượng chất khô. Cả hai yếu tố này đều làm hao hụt khối lượng của quả trong suốt quá trình bảo quản, trong đó 75-85% sự giảm khối lượng là do bay hơi nước còn lại là do hô hấp làm tiêu hao hàm lượng chất khô. 3.11.1 Hao hụt khối lượng mẫu bảo quản lạnh Để khảo sát sự hao hụt khối lượng khi bảo quản, tôi đã dùng phương pháp cân khối lượng quả trước và sau mỗi thời gian bảo quản, sự hao hụt được đánh giá theo phần trăm khối lượng.  Nhận xét: SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 49 Thời gian bảo quản càng lâu thì khối lượng hao hụt càng nhiều, điều này xảy ra ở tất cả các mẫu. Nồng độ chitosan trong màng bao càng lớn thì khối lượng hao hụt càng ít, do màng bao càng dầy và kín nên sự bay hơi nước ra ngoài môi trường bị hạn chế. Ngoài ra còn kể tới cường độ hô hấp bị hạn chế một phần nên khối lượng quả cũng ít mất đi. Ở bất kỳ thời điểm bảo quản nào mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % cũng có hao hụt ít nhất, chứng tỏ màng bao kín và hạn chế tốt sự bay hơi nước của quả. Sau 21 ngày bảo quản thì mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % chỉ mất đi 3.34%. Điều này đã nói lên tính hiệu quả của màng chitosan tới việc ngăn chặn khả năng bay hơi nước của quả ra ngoài môi trường.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng làm giảm đáng kể sự hao hụt khối lượng quả khi bảo quản.  Nồng độ chitosan càng cao thì khả năng hạn chế hao hụt khối lượng càng nhiều. Mẫu 2.0 % và mẫu 2.5 % ít hao hụt khối lượng nhất. 3.11.2. Hao hụt khối lượng mẫu bảo quản thường  Nhận xét: Thời gian bảo quản càng dài thì khối lượng mất đi càng nhiều. Ở cùng một thời điểm mẫu bảo quản thường mất nhiều khối lượng hơn mẫu bảo quản lạnh ở tất cả các nồng độ. Điều này chứng tỏ hiệu quả của bảo quản lạnh tới độ hao hụt khối lượng. Do trong điều kiện bảo quản lạnh của thí nghiệm có độ ẩm không khí lạnh lớn hơn nên chênh lệch độ ẩm giữa quả và môi trường ngoài ít đi và động lực bay hơi nước giảm đi. Tại cùng một thời điểm bảo quản khối lượng bị mất đi tỉ lệ nghịch với nồng độ chitosan là do màng chitosan ngăn cản sự bay hơi và hạn chế một phần hô hấp.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng hạn chế sự bay hơi nước của quả. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 50  Nồng độ chitosan càng cao hao hụt khối lượng càng ít.  Cà chua được bảo quản lạnh hao hụt ít hơn bảo quản ở điều kiện thường.  Màng chitosan có nồng độ thích hợp khoảng 1.5%; 2.0 % và 2.5% có khả năng làm giảm sự mất khối lượng ít nhất. 3.12. Biến đổi chất khô hòa tan theo thời gian bảo quản Trong quá trình bảo quản chất khô hòa tan của quả biến đổi do hai quá trình ngược nhau xảy ra đồng thời: quá trình hô hấp và các phản ứng sinh hóa khác làm giảm chất khô hào tan cùng với nó là quá trình biến đổi những chất không tan thành chất tan. 3.12.1. Biến đổi chất khô hòa tan mẫu bảo quản thường Chất khô hòa tan biến đổi theo thời gian bảo quản. Cà chua sau 30 ngày bảo quản thì chất khô hòa tan chung giảm đi. Do tại thời điểm này quả đã hư hỏng nhiều nên các chất hòa tan bị phân hủy nhiều. Với nồng độ chitosan 2.0 % sự biến đổi chất khô hòa tan theo thời gian bảo quản là ít nhất. Sau 15 ngày chất tan gần như không thay đổi là do hô hấp của mẫu này bị hạn chế hơn các mẫu khác nên chất tan giảm đi ít hơn các mẫu khác. 3.12.2. Biến đổi chất khô hòa tan mẫu bảo quản lạnh  Nhận xét: Sau thời gian bảo quản lượng chất khô tan giảm do lúc nào quả đã bị hư hỏng nên các chất tan bị phân hủy nhiều, các mẫu còn lại chất tan đều tăng. Điều này có thể có được là do hô hấp bị hạn chế nên quá trình chuyển hóa các chất làm tăng chất khô hòa tan chiếm ưu thế hơn.  Kết luận: Sau thời gian bảo quản mẫu 1.5 % và mẫu 2.0 % chất khô hòa tan tăng nhiều nhất, quả đang ở giai đoạn chín đầy đủ, trong khi mẫu đối chứng đã chuyển sang giai đoạn hư hỏng, phân hủy. SVTH: BÙI THANH TRUNG TRANG 51 3.13. Xác định vi sinh vật tổng số Vi sinh vật tổng số là tổng tất cả các vi sinh vật sống trên môi trường dinh dưỡng chung khi nuôi cấy trong thời gian 48h. Để đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng chitosan chúng tôi tiến hành xác định vi sinh vật tổng số trên bề mặt quả cà chua ở mẫu đối chứng và mẫu có bảo quản bằng chitosan 2% ở cả điều kiện bảo quản thường và bảo quản lạnh. 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 450000 500000cfu/g Ban đầu Sau 14 ngày ngày bảo quản Đối chứng Chitosan 2% Hình 3.4: Lƣợng vi sinh vật tổng số (mẫu bảo quản thƣờng) 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7 8 9 10000 cfu/g Ban đầu Sau 14 ngày ngày bảo quản Đối chứng Chitosan 2% Hình 3.5: Lƣợng vi sinh vật tổng số (mẫu bảo quản lạnh) SVTH: BÙI THANH TRUNG 52  Nhận xét: Thời gian bảo quản càng lâu thì lượng vi sinh vật tổng số càng nhiều do vi sinh vật phát triển và sinh sôi, ngoài ra còn có một lượng lớn thâm nhập từ môi trường bảo quản. Cà chua khi còn xanh có khả năng đề kháng mạnh hơn khi quả đã chín. Sau 14 ngày bảo quản lượng vi sinh vật tăng lên rất nhiều ở cả mẫu đối chứng và mẫu có bảo quản bằng chitosan. Tuy nhiên mẫu bảo quản bằng màng chitosan tỷ lệ tăng này ít hơn rất nhiều so với mẫu không bảo quản bằng chitosan. Điều này chứng tỏ khả năng kháng khuẩn rất tốt của màng chitosan. Các khuẩn lạc quan sát được hầu hết là các nấm mốc, chứng tỏ chitosan có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc khá mạnh. Ở mẫu bảo quản lạnh lượng vi sinh vật tổng số phát triển ít hơn hẳn mẫu đối chứng điều này có được là do nhiệt độ lạnh đã có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt quả. Vi sinh vật chủ yếu trên bề mặt là loại ưa ấm và kém chịu lạnh nên ở nhiệt độ thấp chúng bị ức chế nên hoạt động sống và sinh sản kém hơn nhiều so với điều kiện thường.  Kết luận:  Màng chitosan có khả năng kháng khuẩn cao. Có thể diệt được 96% vi sinh vật trên bề mặt quả.  Nhiệt độ thấp có khả năng ức chế vi sinh vật phát triển trên bề mặt cà chua.  Vi sinh vật trên bề mặt cà chua chủ yếu là nấm mốc. 3.14. Kết luận chung  Qua các chỉ số phân tích trên ta nhận thấy:  Tác dụng bảo quản của màng chitosan rất rõ rệt.  Mẫu bảo quản bằng màng chitosan 2% cho chất lượng tốt nhất ở cả chế độ bảo quản lạnh và bảo quản thường.  Chitosan kết hợp với bảo quản lạnh cho hiệu quả cao hơn bảo quản thường ở tất cả các chỉ tiêu 3.15. Đánh giá cảm quan mẫu 3.15.1 Đánh giá cảm quan mẫu bảo quản ở điều kiện thường SVTH: BÙI THANH TRUNG 53 Bảng 3.3: kết quả mẫu bảo quản thƣờng 0% chitosan sau 20 ngày bảo quản Bảng 3.4: Kết quả mẫu bảo quản thƣờng 2.0% chitosan sau 20 ngày bảo quản Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 2 1 0 0 1 4 0.8 2 1.6 Trạng thái 0 1 0 0 0 1 0.2 2 0.4 Điểm chất lượng: 2.0 Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 5 5 4 5 4 23 4.6 2 9.2 Trạng thái 5 4 4 5 4 22 4.4 2 8.8 Điểm chất lượng: 18.00 SVTH: BÙI THANH TRUNG 54 3.15.2 Đánh giá cảm quan mẫu bảo quản ở điều kiện lạnh Bảng 3.5: Kết quả mẫu bảo quản lạnh 2.0% chitosan sau 30 ngày bảo quản Bảng 3.6: Kết quả mẫu bảo quản lạnh 0% chitosan sau 30 ngày bảo quản  Kết luận: Sau 30 ngày bảo quản kết quả cảm quan đã chỉ ra rằng: nồng độ chitosan 2% cho chất lượng cảm quan tốt nhất ở cả 2 chế độ bảo lạnh và bảo quản thường 3.16. Chi phí nguyên liệu cho bảo quản Số liệu thực tế khi tiến hành làm thí nghiệm thu được như sau:  Trọng lượng trung bình của quả:83,33g Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 5 5 5 5 5 25 5 2 10 Trạng thái 4 4 5 4 4 21 4.4 2 8.4 Điểm chất lượng: 18.4 Chỉ tiêu Điểm từng thành viên TỔNG Trung bình chưa có trọng lượng Hệ số trọng lượng Trung bình có trọng lượng T1 T2 T3 T4 T5 Màu sắc 1 2 0 1 2 6 1.2 2 2.4 Trạng thái 0 1 0 0 3 4 0.8 2 1.6 Điểm chất lượng: 4.0 SVTH: BÙI THANH TRUNG 55  Lượng dung dịch chitosan 2.0 % tiêu tốn cho 2kg quả là: 20ml  500ml dung dịch có thể bảo quản được 50kg cà chua. Bảng 3.7: Tính giá thành phụ thuộc vào chi phí nguyên liệu chính: Số lượng Đơn giá Giá thành Cà chua 50kg 3.000đ/kg 150.000 đ Chitosan 0.01kg 500.000 đ/kg 5.000 đ Axit axetic 0.005l 100.000 đ/l 500 đ - Tổng giá thành chi phí nguyên liệu cho bảo quản 50kg cà chua là: 155.500 đ. - Chi phí nguyên liệu để bảo quản 1kg cà chua là: 110 VND. - Hao hụt khối lượng sau thời gian bảo quản bằng chitosan là 7%. Tương ứng với cứ 1kg cà chua bảo quản bằng chitosan sẽ mất đi 210 VND. - Tổng chi phí cộng hao hụt khối lượng khi bảo quản bằng chitosan là: 320 VND.  Trong khi đó: - Độ hao hụt khối lượng quả khi bảo quản nếu không dùng chitosan là 11.72%. - Vậy cứ 1kg cà chua không được bảo quản bằng chitosan sẽ mất đi 0.1172 kg tương ứng với 351.6 VND.  Tóm lại - Nếu dùng chitosan để bảo quản mất 320VND, trong khi nếu không dùng chitosan sẽ mất 351.6 VND cho mỗi kg cà chua. - Mặt khác dùng chitosan còn kéo dài được thời gian bảo quản nên giá trị gia tăng thu được rất lớn từ sản phẩm trái vụ. SVTH: BÙI THANH TRUNG 56 3.17. Xây dựng quy trình bảo quản cà chua bằng chitosan 3.17.1. Sơ đồ quy trình bảo quản Thời gian từ 1- 2 phút Hình 3.6: Sơ đồ quy trình công nghệ bảo quản cà chua bằng chitosan 3.17.2. Thuyết minh quy trình bảo quản  Nguyên liệu: - Cà chua được lựa chọn theo giống được trồng và cung cấp ổn định tại vùng nguyên liệu. Bảo quản ở 12- 13 oC Dịch chitosan hồi lưu Pha dịch chitosan 2% Chitosa n Dung dịch axit axetic 1% Nguyên liệu Lựa chọn-Phân loại Rửa sạch Để khô Nhúng chitosan lần 1 Để khô trong 15 phút Nhúng chitosan lần 2 Để khô Xếp vào khay bảo quản SVTH: BÙI THANH TRUNG 57 - Chọn độ chín thu hái để bảo quản khi quả chín vàng (Breaker) - quả bắt đầu xuất hiện màu vàng hoặc hồng với diện tích chiếm 10% bề mặt.  Lựa chọn và phân loại: Cà chua được lựa chọn bằng máy dựa vào kích thước của quả với mục đích tạo sự đồng đều để hiệu quả bảo quản cao hơn và dễ cơ giới hóa.  Rủa sạch: cà chua được rửa sạch bằng máy, có thể kết hợp giữa quá trình rửa và phân loại quả. Sau khi rửa sạch quả được để khô để màng chitosan bám tốt trên bề mặt.  Chuẩn bị dịch chitosan 2%: dung dịch chitosan 2% được pha trong axit axetic 1% cho tới khi không còn vón cục và không có vẩn đục. Sau khi pha dung dịch được lọc qua vải lọc nhằm loại bỏ những cặn bẩn.  Nhúng quả vào dung dịch chitosan: quả sau khi để khô được nhúng vào dung dịch chitosan từ 1- 2 phút được nhúng theo hai lần, giữa mỗi lần cứ để se bề mặt trong 15 phút (tránh làm khô hoàn toàn bề mặt khi đó sẽ tạo hai lớp màng dầy). Dung dịch chitosan thừa chảy từ quả ra được thu hồi, lọc cặn bẩn và dùng lại cho lần nhúng tiếp theo.  Xếp khay: sau khi màng chitosan tạo được trên bề mặt quả khô hết thì tiến hành xếp quả vào khay. Mỗi khay có thể xếp 3-4 lớp quả, không xếp quá chặt để quá trình trao đổi khí diễn ra dễ dàng. Sử dụng khay có lỗ làm bằng tre hoặc nhựa dẻo. Các khay có thể được xếp trồng lên nhau trên các giá sai cho quả ở khay dưới không bị đè lên khay trên. Mỗi giá tối đa nên là 5 khay để quá trình tỏa nhiệt diễn ra tốt và tránh hô hấp yếm khí.  Bảo quản: Các giá được xếp vào kho bảo quản với khoảng cách hợp lý để đảm bảo điều kiện cho quả hoạt động sống bình thường, tránh tăng nhiệt cục bộ và CO2 thoát ra dễ dàng. Có thể bảo quản trong kho có thông khí cưỡng bức hoặc kho lạnh thì thời gian bảo quản lâu hơn nhưng tốn kém hơn. Cà chua có thể bảo quản được 24-26 ngày ở nhiệt độ thường và 35-38 ngày ở nhiệt độ lạnh 12- 13 oC tùy theo điều kiện bảo quản, mà vẫn cho chất lượng tốt có thể dùng cho ăn tươi hoặc chế biến. SVTH: BÙI THANH TRUNG 58 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chitosan là một polysaccharide được sản xuất từ phụ phế phẩm thủy sản có nhiều tính chất vật lý, hóa học và sinh học đáng quý như khả năng kháng khuẩn, khả năng tạo màng bao có độ thoáng khí … Quy trình sản xuất chitosan đơn giản gồm các quy trình chính như thủy phân protein, khử khoáng và deacetyl hóa trong đó một số quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học đang được nghiên cứu thay thế bằng quy trình sinh học hay sử dụng enzyme thân thiện với môi trường. Những nghiên cứu nhằm sử dụng chitosan làm màng bảo quản trái cây, rau quả nói chung và cà chua nói riêng cho thấy chỉ cần nhúng trái cây, rau quả trong dung dịch chitosan với nồng độ 2% thì cà chua có thể bảo quản được 28 ngày ở nhiệt độ thường và 35 ngày ở điều kiện lạnh nhiệt độ khoảng 12 – 13 oC. 4.2. Kiến nghị  Hoàn thiện nghiên cứu sử dụng chitosan trong bảo quản cà chua như: o Xác định các chất dinh dưỡng khác trước và sau khi bảo quản. o Khảo sát giống cà chua để bảo quản cho hiệu quả cao hơn trong từng lĩnh vực sản xuất và xuất khẩu. o Nghiên cứu kết hợp các hóa chất bảo quản khác với chitosan để nâng cao hiệu quả bảo quản rau quả. o Nghiên cứu các quy trình áp dụng công nghệ sinh học vào sản xuất chitosan từ phụ phế phẩm của ngành thủy sản như đầu tôm, mai ghẹ …  Xây dựng mô hình, lựa chọn thiết bị, đánh giá hiệu quả kinh tế để đưa phương pháp bảo quản cà chua bằng chitosan vào thực tế.  Khảo sát tính chất và lựa chọn chitosan phù hợp nhất cho bảo quản rau quả.  Ứng dụng chitosan để bảo quản loại quả khác. SVTH: BÙI THANH TRUNG 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: 1. Châu Văn Minh: “ sử dụng chitosan làm chất bảo quản quả tươi” Tạp chí khoa học, trang 34, số 4-1996 2. Lưu Văn Chính. Tổng hợp và nghiên cứu hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất từ chitin. Luận án tiến sĩ 3. Nguyễn Thị Đông. Tách chitin từ phế thải thủy sản bằng phương pháp lên men axit lactic. Luận án tiến sĩ 4. Ðặng Văn Luyến, Ðặng Mai Hương. Phương pháp sản xuất chitosan, 1992. (Ðề cập công nghệ sản xuất biopolyme, cụ thể là đề cập đến phương pháp thu nhận chitin từ vỏ tôm rồi chuyển hóa tiếp thành chitosan). 5. Nguyễn Hoàng Hà, Hoàng Lê Sơn. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm, 1993. (Ðề cập đến lĩnh vực công nghệ sản xuất biopolyme, cụ thể là đề cập đến quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm). 6. PGS-TS Trần Thị Luyến; GVC Đỗ Minh Phụng; TS Nguyễn Anh Tuấn. Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản, NXB Nông Nghiệp 7. Hà Văn Thuyết, Trần Quang Bình. Bảo quản rau quả tươi và bán chế phẩm-NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Quách Đĩnh, Nguyễn Vân Tiếp, Nguyễn Văn Thoa. Công nghệ sau thu hoạch và chế biến rau quả-NXB Khoa Học Kỹ Thuật Hà Nội. 9. Phan Hiếu Hiền. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu-NXB Nông Nghiệp Tp HCM 10. Hà Duyên Tư. Kỹ thuật phân tích cảm quan thực phẩm. _NXB KH&KT 11. Nguyễn Xuân Phương. Kỹ thuật lạnh thực phẩm, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 12. Hà Duyên Tư. Quản lý chất lượng trong công nghiệp thực phẩm- NXB Khoa học và kỹ thuật. 13. Phạm Thị Ánh Hồng. 2003. Kỹ thuật sinh hóa. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Tp.HCM. SVTH: BÙI THANH TRUNG 60 14. Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền và các cộng sự. 1997. “Vật liệu sinh học từ chitin”. Viện Hóa Học – Viện Công Nghệ Sinh Học, Trung tâm khoa học và Công nghệ quốc gia Hà Nội. SVTH: BÙI THANH TRUNG 61 Tài liệu tiếng Anh: 15. Production of chitosan oligosaccharide. (Sản xuất chitosan oligosaccharide và ứng dụng của nó trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm). 16. Joint FAO/WHO Food standards Progaramme Codex Alimentarius Commission (1994) 17. Alvarez, Review: Active food packating. Food Sci. Tech Page 97-108. 18. Argaiz A 2004 Mechanical, physical and barrier of edible chitosan film, Food Packating: Role of film, edible coating. 19. Caner, C. Vergano, PJ. And wiles. 1998 Chitosan film mechanical and permeatin propertes as affected by axid. Các website: 20. 21. 22. 23. www.compchem.hcmuns.edu.vn 24. www.fistenet.gov.vn 25. và một số website khác SVTH: BÙI THANH TRUNG 62 PHỤ LỤC A.Xác định độ ẩm của vỏ tôm khô A.1. Thiết bị  Cân phân tích có độ chính xác 10-4  Cốc sứ, Bình hút ẩm  Tủ sấy bằng điện, có khả năng kiểm tra nhiệt độ 105 0C A.2.Nguyên tắc  Cân mẫu thử chính xác đến 0.001g, cho vào bình (m1)  Cốc đã được sấy khô và cân đo trước (m0)  Để cốc có chứa mẫu thử vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 0C thời gian 3 giờ. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác đến 0.001g (m2). Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đến khi lượng mất đi của hai lần cân lien tiếp không chênh lệch nhau quá 2mg hoặc 4mg tùy theo khối lượng của phần mẫu thử A.3.Tính toán Độ ẩm tính bằng % khối lượng được tính theo công thức sau: [(m1 – m2) * 100]/ (m1 – mo)  Trong đó :  mo : khối lượng cốc không (g)  m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy  m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g) B. Xác định hàm lƣợng tro trong vỏ tôm khô tuyệt đối B.1.Dụng cụ  Cân phân tích có độ chính xác 10-4  Chén nung bằng sứ chiệu nhiệt hoặc bạch kim có dung tích từ 30 – 50 ml  Bếp điện  Bình hút ẩm  Lò nung điều chỉnh nhiệt độ SVTH: BÙI THANH TRUNG 63  Lò sấy điều chỉnh nhiệt độ 105 0C B.2. Nguyên tắc Chén cho vào lò nung trong 3 giờ ở nhiệt độ 500–550 0C. Sau khi lấy chén ra làm nguội trong bình hút ẩm và đem cân để xác định khối lượng với độ chính xác 0.001g. Dàn đều mẫu trên đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi mẫu bốc hết khói, sau đó đặt chén mẫu vào lò nung ở nhiệt độ 500– 550 0C trong khoảng từ 1 – 2 giờ. Sau đó lấy ra ngoài làm nguội trong bình hút ẩm, đem mẫu đi cân ta có khối lượng m1, làm lại quá trình nung mẫu cho đến khi khối lượng không đổi. B.3.Tính toán  Hàm lượng tro thô của mẫu ( X ) được tính bằng % theo công thức : X = [(m1 – m2) *100]/m  Trong đó :  X: hàm lượng tro thô của mẫu (%)  m1: khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)  m2: khối lượng chén (g)  m: khối lượng mẫu thử trước khi nung (g) C. Xác định hàm lƣợng Ca và P trong mẫu tôm khô tuyệt đối C.1.Xác định hàm lƣợng calcium C.1.1.Nguyên tắc Dùng trilon B xác định calcium trong dung dich mẫu với chỉ thị murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu chất chỉ thị murexid là H3I - Trong môi trường có pH = 12, H3I - Có màu tím và khi kết hợp với calcium tạo thành phức chất có màu hồng: H3I - + Ca 2+ CaH3I + Tím hồng Chất phức hợp của Ca với muruxid không bền bằng chất phức hợp bởi Ca và trilon B đẩy chỉ thị murexid ra khỏi chất phức hợp bởi dạng tự do có màu tím: SVTH: BÙI THANH TRUNG 64 CaH3I + + H2Y 2- CaY 2- + H3I - + 2H + Hồng tím C.1.2.Dụng cụ và hóa chất  Dụng cụ :  Bình tam giác 100 ml  Ống chuẩn độ 25 ml  Ống hút 2, 5, 10 ml  Hóa chất  Dung dịch NaOH 10%  Dung dịch KCN 3 %  Chỉ thị murexid: cân 0.1g murexid + 50g tinh khiết. Nghiền nhuyễn bằng cối, cho vào chai thủy tinh có đậy nút kín.  Dung dịch trilon B 0.02 N C.1.3.Cách tiến hành Tùy theo hàm lượng Ca có trong mẫu,cân chính xác 2 – 5g mẫu, nung thành tro trắng, hòa với 5ml HCL tinh khiết, đun cách thủy tới khô trên nồi cách thủy sôi – thực hiện tương tự them một lần nữa. Tiếp đó cho thêm 5ml HCL 20% hòa tan, lọc trên giấy lọc không tro. Rửa chén nung nhiều lần bằng nước cất nóng. Dịch lọc và nước rửa cho cả vào bình định mức, cuối cùng cho thêm nước cất đủ 100ml, ta có được dịch thử. Hút 20ml dung dịch thử cho vào bình tam giác 100ml thêm 2ml dung dịch NaOH 10%, 5 giọt KCN 3% và khoảng nữa hạt gạo chỉ thị murexid. Chẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0.02 N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím, cần thực hiện song song một sự thử không (đối chứng) C.1.4.Tính toán: V1 = (v1*100)/a (ml/100g mẫu khô) Lượng calcium (tính bằng mg) trong 100g mẫu thô là: m1 = (v1*C*20.04*100)/a SVTH: BÙI THANH TRUNG 65  Trong đó:  V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng calcium trong dung dịch mẫu tương đương với 100g mẫu khô.  v1: thể tích Trilon B 0.02 N dùng để chuẩn độ.  a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ.  20.04 : đương lượng của calcium  C : độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B C.2.Định lƣợng phosphor C.2.1.Nguyên tắc Phương pháp dựa vào khả năng của ion Orthophosphate phản ứng với amomonium Molybdate tạo thành Phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ 2(MoO24MoO3) + H3PO4 (MoO24MoO3).2H3PO4.4H20 Hàm lượng phosphor phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650ml với cuvet có chiều dày 10mm, dung dịch đối chứng là dung dịch không. C.2.2.Dung dịch và hóa chất  Dụng cụ  Thời gian chuẩn bị là một giờ, độ nhạy của phương pháp cao do đó các dụng cụ thủy tinh đòi hỏi phải thật sạch.  Máy quang phổ có bước sóng 650nm và cuvet bằng 10mm.  Bình định mức 50,100 ml.  Ống nghiệm.  Hóa chất : Tất cả các hóa chất sử dụng trong tiêu chuẩn này phải có tinh khiết phân tích  Nước sử dụng phải là nước cất hay có độ tinh sạch tương đương  HCL đậm đặc  HNO3 đậm đặc SVTH: BÙI THANH TRUNG 66  Amobi Molybdate  Hydriquinone [ C6H4(OH)2] pha khi sử dụng  Kali Dihydrophotphat (KH2PO4)  Sodium sulfite (KH2PO4) C.2.3.Cách tiến hành  Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu theo TCVN 4325 – 86  Nếu mẫu khô không khí, đã xử lý sơ bộ và bảo quản lạnh  Nếu mẫu tươi, xử lý sơ bộ cô cạn, sấy ở 60 0C, sấy 105 0C nghiền lấy mẫu trung bình.  Chuẩn bị dịch thuốc thử Dung dịch (1) = dung dịch chuẩn gốc (có chứa 100µg phosphor/ ml). Hòa tan 0.394g KH2PO4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml. Chuẩn bị dung dịch chuẩn để lập thang chuẩn (có chứa 25µg phosphor/ml ). Lấy 25ml dung dịch vào bình định mức bằng nước cất đúng 100ml ta có dung dịch 1A. Dung dịch Acid Chlohydric 10% (pha loãng tỉ lệ 1: 3 ) 250ml HCL đậm đậc thêm 750 ml nước cất. Dung dịch (2) = dung dịch Sodium Sulfite (Na2SO3) 20% trong ít nước và thêm cho đủ 100ml, dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch (3) = dung dịch Hydroquinone [C6H4(OH)2] 0.5%. Hòa tan 0.5g Hydroquinone trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm tiếp nước cho đủ 100ml. Dung dịch chuẩn bị khi sử dụng. Dung dịch (4) = thuốc thử Brigg = dung dịch Amoni Molybdate 5% hòa tan 50g Amoni Molybdate trong 600ml nước. Cho 150ml H2SO4 đậm đậc vào trong 400ml nước để nguội thêm tiếp dung dịch Amoni Molybdate 5% đã chuẩn bị cho vào hổn hợp, để nguội thêm nước cho đủ 1000ml. Hỗn hợp thuốc thử chuẩn bị khi sử dụng. Trộn lẫn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1: 1: 1 SVTH: BÙI THANH TRUNG 67  Chuẩn bị dung dịch tro phân tích Cân chính xác 1 – 5g mẫu ( tùy vào hàm lượng phosphor nhiều hay ít ), vô cơ hóa ở 550 0C trong 4h, để nguội đến nhiệt độ phòng thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCL 10% + 0.5ml HNO3 . Đun nhẹ trong 5 phút (đến bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro 250ml.  Phản ứng lên màu  Lấy 10ml dung dịch tro cho vào bình nón dung dịch 100ml, định mức đủ 100ml ta có dung dịch thứ 2.  Lấy 1ml dung dịch thứ 2 cho vào ống nghiệm.  Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử và nước đủ 10ml, hỗn hợp lắc đều để 30 phút, đo ở bước sóng 650 nm. D. Xác định hàm lƣợng Nito tổng số bằng phƣơng pháp Kjeldahl D.1.Nguyên tắc Chất đạm được vô cơ hóa bằng đậm đặc và chất xúc tác thành muối ammonium sulphate (NH4)2SO4. Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ giải phóng NH3 H2SO4 đậm đặc Nguyên liệu (NH4)2SO4 xúc tác , t 0 (NH4)2SO4 + NaOH 2NH3 + 2H2O + Na2SO4 Sau đó lượng được lôi cuốn bằng hơi nước sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3, mà ở đó H3BO3 tự phân ly: H3BO3 HBO2 + H2O Khi cất đạm, NH3 bay ra sẽ phản ứng với HBO2 NH4OH + HBO2 NH4 + + BO2 - + H2O BO2 - là một bazo mạnh, bởi vậy dung dịch của bình phản ứng chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ. Lượng BO2 - được tạo thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm. Xác định lượng BO2 - bằng cách SVTH: BÙI THANH TRUNG 68 chuẩn độ ngược với HCL 0.25N. Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu tím đỏ. D.2.Dụng cụ và hóa chất  Máy kjeldahl  NaOH 32%  HCl 0.25N  Chất xúc tác là hỗn hợp của 60g Se: 75g CuSO4: 865g K2SO4.  Hỗn hợp chất chỉ thị màu :  Hòa tan 0.264g methyl đỏ trong 250ml cồn tuyệt đối.  Hòa tan 1.28g bromocreseol blue trong 50ml cồn tuyệt đối.  Trộn đều hai dung dịch trên, bổ sung 96ml HCL 0.25N rồi định mức đến 1000ml bằng cồn tuyệt đối.  Dung dịch acid boric 4% với chỉ thị màu: hòa tan 80g acid boric trong 1000ml nước, đun nóng một chút. Để nguội và bổ sung 25ml hỗn hợp chất chỉ thị màu rồi thêm nước cất cho đủ 2000ml. D.3.Cách tiến hành  Vô cơ hóa mẫu Cân 0,1g mẫu đã nghiền kỹ và thêm 5ml đậm đặc và 1g chất xúc tác cho vào bình kjeldahl. Sau khi thêm chất xúc tác cho vào bình Kjeldahl và sau khi thêm chất xúc tác đun nhẹ hỗn hợp, tránh sôi trào và chỉ đun mạnh khi hỗn hợp đ