Khóa luận Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn e. coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cơ trong Bộ mơn Cơng nghệ sinh học cùng các Thầy Cơ đã luơn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tơi. - TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Dỗn Thị Sim thuộc phịng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tơi trong suốt thời gian thực hiện khố luận. - Thầy Lê Anh Phụng, cơ Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phịng thí nghiệm Vi Sinh và các thầy cơ thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian qua. - Tồn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luơn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2005 Nguyễn Vân Anh iv TĨM TẮT NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli” Hội đồng hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Ngọc Hải 2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005 Địa điểm nghiên cứu:  Viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp. HCM  Phịng thí nghiệm Vi Sinh. Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn dịch ngắn ngày và dài ngày. Đề tài thực hiện trên 2 lơ thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hịa và cĩ thể phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngồi ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88+. Kết quả đạt đƣợc: 1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ. 2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. 3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn ngày. 5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium sulfate bão hịa. 6. Hấp phụ các kháng thể khơng đặc hiệu trong kháng huyết thanh. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tĩm tắt ................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x Danh sách các bảng .............................................................................................. xi Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xii Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU ................................................................................. 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ................................................................................. 3 2.1.1. Khái niệm miễn dịch ................................................................................ 3 2.1.2. Kháng nguyên .......................................................................................... 3 2.1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................ 3 2.1.2.2. Khái niệm về epitop ........................................................................... 3 2.1.3. Kháng thể dịch thể ................................................................................... 4 2.1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin ....................................... 4 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật .... 5 2.1.4.1. Lồi động vật ..................................................................................... 5 2.1.4.2. Yếu tố di truyền .................................................................................. 5 vi 2.1.4.3. Kháng nguyên ..................................................................................... 6 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch ..................................................................... 7 2.1.4.5. Chất bổ trợ ......................................................................................... 8 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể .......................................................... 9 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể............................... 9 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể ............................... 11 2.2. VI KHUẨN E. coli ........................................................................................ 14 2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................. 14 2.2.2. Đặc tính sinh hĩa .................................................................................... 14 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên ............................................................................. 14 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O ...................................................................... 14 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K .............................. 15 2.2.3.3. Kháng nguyên lơng roi H ............................................................... 15 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE ............................ 15 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH .............. 16 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ ...................................... 17 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) ........................... 17 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT ........................................... 17 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT .................................................................. 18 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha ............................... 18 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT ................ 19 2.6. PROTEIN A .................................................................................................. 19 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 21 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................ 21 3.1.1. Thời gian thực nghiệm ........................................................................... 21 3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 21 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................ 21 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 22 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ ............................................................. 22 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm .......................................................................... 22 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm ....................................................................... 22 vii 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 23 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh .................................................................. 25 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hồ .............................. 26 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể ......................................................................... 26 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh ......................................................................... 27 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể khơng đặc hiệu ................................................. 28 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus ............... 29 3.4.4. Đánh giá ................................................................................................. 30 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) ......... 30 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) .................................................................................................... 31 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI ................................................................................... 32 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ .......................................................................................... 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33 4.1. KẾT QUẢ ....................................................................................................... 33 4.1.1. Định tính ................................................................................................ 33 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày ........................................................................ 33 4.1.1.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 34 4.1.2. Định lƣợng ............................................................................................. 34 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 35 4.1.2.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 36 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình ................................ 37 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh............................................. 38 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus ........................................................................................................ 38 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 40 4.2. THẢO LUẬN ................................................................................................. 42 4.2.1. Định tính ................................................................................................ 42 4.2.2. Định lƣợng ............................................................................................. 43 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 43 4.2.2.2. Qui trình dài ngày ........................................................................... 43 viii 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh .............................................. 44 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 46 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 49 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APC Antigen-presenting cell (Tế bào trình diện kháng nguyên) E. coli Escherichia coli Ig Immunoglobulin (Globulin miễn) IL Interleukine KHT Kháng huyết thanh KN Kháng nguyên KT Kháng thể KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể MHC II Major histocompatibility complex class II antigens (các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II) S. aureus Staphylococcus aureus. SIg Surface immunoglobulin (Globulin miễn màng tế bào) TCR T cell receptor (Thụ quan bề mặt tế bào T) TH lympho T helper cell (tế bào lympho T hỗ trợ) x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ...................................................... 4 Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tĩm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào ......................................................................................... 10 Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế bào TH ................................................................................................... 10 Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng ...................................................... 11 Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh .................................. 12 Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN khơng phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B .................................................. 13 Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay khơng phụ thuộc tuyến ức. KN khơng phụ thuộc vào tuyến ức khơng gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích cĩ các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngồi cịn KT bị giữ lại .................................................................................. 17 H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19 Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20 Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh ........................................................................... 26 Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích ........................................................................................................ 27 Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32 Hình 7.1 Thỏ nuơi thí nghiệm ............................................................................... 50 Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50 Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23 Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24 Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33 Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34 Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35 Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 ...................................................................................................... 36 Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày ............................................................ 37 Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau ....................................................... 38 Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và khơng đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 ............................................................................................................ 39 Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và khơng đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ...................................................................................................... 39 Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) ........................................ 40 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) ........................................... 41 xii DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu ............................................. 35 Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 2 ........................................................................... 36 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau ...................................................... 36 Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích của thỏ 4 ........................................................................... 37 Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc khơng đƣợc hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 ở qui trình ngắn ngày .................. 41 Biểu đồ 4.6 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc khơng đƣợc hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 ở qui trình dài ngày ..................... 42 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................ 22 Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh ......................................... 25 Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể khơng đặc hiệu ................................. 28 Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus .... 29 Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................................................ 31 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong chăn nuơi việc chẩn đốn, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng. Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà cĩ các phƣơng pháp chẩn đốn bệnh khác nhau. Thơng thƣờng để chẩn đốn bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là nuơi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) cĩ độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đĩ giúp chẩn đốn nhanh và chính xác hơn. Nhƣng kĩ thuật này địi hỏi phải cĩ trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ thuật thực hiện cịn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải cĩ trình độ kĩ thuật nhất định. Các kĩ thuật chẩn đốn miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme- linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đốn nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh khơng thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đốn phát hiện vi sinh vật gây bệnh để ngƣời chăn nuơi cĩ thể tự mình kiểm tra xem vật nuơi cĩ mang mầm bệnh hay khơng nhƣ bộ kit chẩn đốn bệnh đốm trắng cho tơm... Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho việc chẩn đốn bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuơi cịn ít, chỉ mới áp dụng cho một số bệnh. Xuất phát từ yêu cầu thực tế đĩ chúng tơi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đốn nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngồi ra cĩ thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác. 2 1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích Xây dựng và hồn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho cơng tác chẩn đốn bệnh. 1.2.2. Yêu cầu  Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm.  Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.  Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 2.1.1. Khái niệm miễn dịch Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các chất mang trên bản thân chúng với những dấu hiệu thơng tin di truyền ngoại lai. Khả năng miễn dịch của một cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố di truyền của lồi, sức đề kháng của mỗi cá thể, điều kiện ngoại cảnh (dinh dƣỡng, vệ sinh, mơi trƣờng…). 2.1.2. Kháng nguyên [2] 2.1.2.1. Định nghĩa Kháng nguyên (KN) là tất cả các chất, đơi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp một phân tử đặc biệt gọi là kháng thể dịch thể hoặc kháng thể tế bào và chúng cĩ đặc tính liên kết đặc hiệu với KN đĩ. 2.1.2.2. Khái niệm về epitop (biểu vị) Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử KN, cĩ khả năng tạo kháng thể riêng biệt hoặc những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho. Epitop cĩ 2 đặc tính: Tính KN: là đặc tính của một epitop cĩ cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể (KT). Phần cấu trúc này của phân tử KT hoặc của thụ thể đƣợc gọi là paratop. Tính miễn dịch: của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch trong một cơ thể. Nếu KN là protein thì kích thƣớc của một epitop KN vào khoảng 5-10 gốc acid amin. Một phân tử KN cĩ thể cĩ một hoặc nhiều epitop. Số lƣợng epitop phụ thuộc vào kích thƣớc của phân tử KN và thƣờng cĩ khoảng 1 epitop cho mỗi 5 kDa. 4 2.1.3. Kháng thể dịch thể [2] 2.1.3.1. Định nghĩa Kháng thể dịch thể hay immunoglobulin (Ig) là protein “dạng cầu” đƣợc tổng hợp bởi tế bào tƣơng (plasma cell) khi bị kích thích bởi KN. Nĩ đƣợc tạo ra để giúp sinh vật chống đỡ các yếu tố KN cĩ hại xâm nhập vào cơ thể. 2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin Phân tử Ig gồm một hay nhiều đơn vị với cấu trúc tƣơng đối giống nhau. Mỗi đơn vị là một phân tử protein cĩ 4 chuỗi polypeptid giống nhau từng đơi một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng, chúng đƣợc nối với nhau bằng những cầu nối disulfua (-S-S-) (hình 2.1). Chuỗi nhẹ L (light chain) Chuỗi nhẹ cĩ trọng lƣợng phân tử khoảng 23.000 Da. Cĩ hai loại chuỗi nhẹ chung cho tất cả các lớp Ig: Chuỗi nhẹ Kappa (kí hiệu K hay κ) Chuỗi nhẹ Lambda (kí hiệu λ) Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác nhau giữa các lồi. Chuỗi nhẹ đƣợc chia thành hai phần dài bằng nhau:  Phần hằng định: kí hiệu CL (constant) cĩ tận cùng –COOH với trình tự acid amin tƣơng đối khơng đổi.  Phần thay đổi: kí hiệu VL (variable) cĩ tận cùng là –NH2. Trật tự acid amin trong vùng này thay đổi từng nhĩm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu Vκ (cho type kappa) và Vλ (cho type lambda). Chuỗi nặng H (heavy chain) Chuỗi nặng cĩ trọng lƣợng phân tử từ 50.000 Da đến 70.000 Da tùy theo lớp Ig (IgM, IgG, IgA, IgE…). Chuỗi nặng cũng chia thành 2 vùng: vùng hằng định (CH) và vùng thay đổi (VH). Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ( RC/VL/GG/antiBD_mol.html) 5 Ngƣời ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch polypepptid trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig cĩ các chuỗi: Gamma (γ) thì Ig đĩ đƣợc gọi là IgG Muy (μ) thì Ig đĩ đƣợc gọi là IgM Alpha (α) thì Ig đĩ đƣợc gọi là IgA Delta (δ) thì Ig đĩ đƣợc gọi là IgD Epsilon (ε) thì Ig đĩ đƣợc gọi là IgE Ngồi các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng cịn một nhĩm glucid đƣợc gọi là oligosaccharide cĩ nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề mặt của tế bào thực bào và quyết định tính KN của phân tử KT. Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham gia vào sự hình thành cấu trúc bổ sung đặc hiệu trong sự kết hợp với KN (paratop). Paratop khơng phải là một đoạn peptid liên tục, dài mà chỉ là một (hoặc một số) acid amin nằm cách quãng. Đĩ là những “điểm” mà paratop tiếp xúc với epitop, thơng thƣờng mỗi paratop cĩ từ 3-6 “điểm” nhƣ vậy. 2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú [2] [13] 2.1.4.1. Lồi thú Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi cĩ sự khác biệt di truyền giữa thú gây miễn dịch (túc chủ) với lồi đƣợc sử dụng làm kháng nguyên càng lớn vì kháng nguyên sẽ cĩ nhiều epitop lạ đối với túc chủ. Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú thuận tiện để gây miễn dịch thực nghiệm. 2.1.4.2. Yếu tố di truyền Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú cịn phụ thuộc vào yếu tố di truyền vì với cùng một loại kháng nguyên nếu đƣa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau. Thơng thƣờng các thú lai khác dịng cĩ khả năng kích thích miễn dịch cao hơn các thú lai cùng dịng. 6 2.1.4.3. Kháng nguyên a. Tính lạ của kháng nguyên Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên cĩ tính sinh miễn dịch cao là sự khác biệt chủng lồi giữa túc chủ và kháng nguyên. Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với túc chủ bao nhiêu, khả năng sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Cịn trong miễn dịch qua trung gian tế bào, chỉ cần sự khác nhau giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao. b. Cấu tạo hĩa học của kháng nguyên  Protein và polysaccharide Là 2 nhĩm kháng nguyên thơng thƣờng nhất vì các vỏ vi khuẩn hoặc các độc tố là các protein hoặc glycoprotein. Chúng đều cho tính miễn dịch cao khi ở dạng hịa tan hay liên kết trong các cấu trúc phức tạp. Đặc tính kháng nguyên của nhiều loại glycoprotein trƣớc hết đƣợc biểu hiện bởi các phần gốc đƣờng của chúng. Protein ở dạng kết tụ (aggregation) gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn protein ở dạng hịa tan.  Lipid và acid nucleic Là 2 nhĩm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch kém. Thơng thƣờng, lipid chỉ biểu hiện tính kháng nguyên khi ở dạng kết hợp với polysaccharide hoặc protein… c. Kích thước của phân tử kháng nguyên Kháng nguyên cĩ kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì chúng càng dễ bị đại thực bào phát hiện và xử lí nên cĩ tính sinh miễn dịch cao, những kháng nguyên cĩ cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên cĩ tính sinh miễn dịch thấp. Ngồi ra, các KN cĩ kích thƣớc nhỏ cĩ thể gắn với các protein mang để tạo đáp ứng miễn dịch. d. Khả năng bị chuyển hĩa của phân tử kháng nguyên Sự chuyển hĩa kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính sinh miễn dịch, vì khi đƣợc chuyển hĩa các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định KN ra ngồi. Các phân tử khơng bị phân hủy bởi tế bào (khơng đƣợc tế bào nhận biết và cải biến) thì khơng gây ra đáp ứng miễn dịch. 7 Ví dụ: D-amino acid là một kháng nguyên yếu vì enzyme của động vật hữu nhũ khơng phân hủy amino acid dạng này. e. Liều lượng kháng nguyên Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì khơng đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch. Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên. f. Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp vào hạch bạch huyết vùng kheo của thú. Tuy nhiên cách này địi hỏi trình độ tay nghề cao. Tiêm kháng nguyên nhiều mũi dƣới da, trong da hoặc tiêm một mũi trong bắp thịt đƣợc áp dụng rộng rãi hơn vì đơn giản dễ thực hiện và cho kết quả mong muốn. Ngồi ra với các kháng nguyên mạnh (vi khuẩn, virus, tế bào…) khi đƣa vào đƣờng mạch máu cĩ thể dễ dàng gây ra đáp ứng miễn dịch. Nhƣng với kháng nguyên hịa tan thì phải cĩ qui trình gây đáp ứng miễn dịch thích hợp, tốt nhất là tiêm trong da, dƣới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần. g. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đĩ kích thích một mình. Hiện tƣợng này gọi là sự cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên. Tuy nhiên cũng cĩ trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì con thú cĩ thể chỉ phản ứng với kháng nguyên liều mạnh. Hiện tƣợng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên, chỉ xảy ra ở hai kháng nguyên cĩ cấu trúc hĩa học gần giống nhau. 2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch Qui trình gây miễn dịch cĩ ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch đối với phân tử kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lơ thí nghiệm qua hai qui trình chủng ngừa khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loại kháng nguyên thích hợp với một loại qui trình gây miễn dịch riêng. Với những kháng nguyên yếu thƣờng phải chủng ngừa bằng qui trình hết sức nghiêm ngặt và chủng 8 nhiều lần mới cĩ đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong khi đĩ, những kháng nguyên mạnh cĩ khi chỉ cần chủng ngừa một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch. Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã đƣợc mẫn cảm với kháng nguyên đĩ một lần, thì hàm lƣợng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu (cĩ những trƣờng hợp gấp hàng trăm lần). Ngồi ra khi tiêm nhắc lại nhiều lần thì sẽ cĩ sự chọn lọc các dịng tế bào lympho B sản xuất kháng thể và chỉ tăng sinh những dịng sản xuất kháng thể cĩ ái lực cao với kháng nguyên nếu giới hạn tối đa kháng nguyên đƣa vào. Thƣờng tiêm mũi nhắc lại lần một sau khi đáp ứng miễn dịch ở mũi gây mẫn cảm giảm xuống (đối với thỏ khoảng 4-6 tuần). Các mũi tiêm nhắc lại tiếp theo nên cách nhau một khoảng thời gian nhất định để thú cĩ khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất với kháng nguyên. Khoảng 10-15 ngày sau mỗi lần tiêm nhắc lại ta cĩ thể lấy máu (20-40 ml), kháng huyết thanh nên đƣợc kiểm tra sự hiện diện của kháng thể. Nếu thú đáp ứng miễn dịch yếu sau mũi nhắc lại lần hai thì nên loại bỏ. 2.1.4.5. Chất bổ trợ Các tá chất đƣợc sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccine, tăng khả năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngồi ra, tá chất cịn gây một phản ứng viêm khơng đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch. Các nghiên cứu gần đây đã kết luận tá chất cĩ tác dụng làm tăng lympho hỗ trợ (lympho T helper - TH). Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên đƣợc giải phĩng dần dần cĩ tác dụng giống nhƣ kích thích miễn dịch nhiều lần. Một số loại tá chất: Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA), Aluminum hydroxide (ALUM), Rabi Adjuvant System (RAS), Syntex Adjuvant Formulation (SAF)… 9 2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể [3] [6] [8] [13] 2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen-presenting cell) Tế bào trình diện kháng nguyên cĩ 2 đặc tính: cĩ các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II antigens) trên bề mặt tế bào và tiết interleukine 1 (IL-1) (ngồi ra nĩ cịn tiết nhiều cytokine khác. Cĩ 2 nhĩm tế bào trình diện kháng nguyên:  Tế bào trình diện kháng nguyên “chuyên nghiệp” (“professional” APC): chủ động bắt và trình diện KN. Bao gồm các tế bào: đại thực bào, tế bào tua (dendritic cell), tế bào B.  Các tế bào khác, chỉ trình diện kháng nguyên khi tế bào bị nhiễm. Khi xâm nhập vào cơ thể các KN đƣợc các APC “chuyên nghiệp” tĩm bắt bằng cách thực bào (đại thực bào) hay gắn với các thụ quan đặc hiệu (specific receptor) Ig trên bề mặt tế bào (tế bào B). Đối với KN protein ngoại bào Sau khi các APC bắt giữ KN, KN sẽ đƣợc đƣa vào các nang endosome bên trong tế bào. Các APC cũng cĩ thể ẩm bào để hút các protein hịa tan (kích thƣớc ≤ 1 µm) vào các endosome này. Ở đây, các KN sẽ đƣợc xử lí trong khu vực acid nội bào nhờ các protease phân cắt protein thành các peptid ngắn. Các peptid thẳng này gắn với phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – MHC (KN – MHC) và đƣợc biểu lộ trên bề mặt tế bào (hình 2.2). Đối với KN cĩ bản chất là lipid hoặc polysaccharide (KN khơng phụ thuộc tuyến ức) Các KN này chỉ trình diện đƣợc với tế bào B và khơng thể xử lí đến dạng kết hợp đƣợc với các phân tử MHC nên khơng đƣợc các tế bào T nhận biết, khơng gây đƣợc các đáp ứng miễn dịch tế bào. Ngồi ra khi KN bị bắt giữ vào trong tế bào APC nĩ sẽ kích thích tế bào tiết ra interleukin 1 hay cịn gọi là yếu tố hoạt hĩa tế bào lympho LAF (lymphocyte activating factor) là một trong hai yếu tố cần thiết để hoạt hĩa tế bào lympho TH (yếu tố kia là sự nhận biết phức hợp KN-MHC của thụ thể tế bào T). 10 b. Tế bào lympho TH Quần thể tế bào lympho T đƣợc kháng nguyên trình diện gọi là tế bào lympho T hỗ trợ (helper T cell – TH) Tế bào lympho T đƣợc hoạt hĩa khi cĩ khoảng 200 – 300 phức hợp KN – MHC gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên bề mặt tế bào lympho T (T cell receptor – TCR) và sự hiện diện của yếu tố đồng kích thích interleukin 1 (tùy loại tế bào lympho TH). Khi đƣợc kích thích, tế bào TH tiết ra hỗn hợp các cytokine cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hĩa tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể. c. Tế bào lympho B Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể, quá trình biệt hĩa tế bào B thành tế bào tƣơng (plasma cell) sản xuất kháng thể cĩ thể chia thành 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1: các tế bào nguồn trong tủy xƣơng đƣợc biệt hĩa thành tiền lympho B, sau đĩ thành các lympho B chƣa chín và cuối cùng phát triển thành lympho B chín với các immunoglobulin bề mặt SIg (Surface immunoglobulin). Giai đoạn này khơng cần sự kích thích của kháng nguyên và sự cĩ mặt của tế bào lympho TH. Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tĩm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên bề mặt tế bào. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tĩm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4+ trên tế bào TH. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tĩm bắt, 11  Giai đoạn 2: các tế bào lympho B chín biệt hĩa thành tế bào tƣơng sản xuất kháng thể. Quá trình này cần sự kích thích của kháng nguyên, một số interleukin và sự kết hợp của tế bào TH với lympho B. Tế bào plasma là những tế bào hình trứng, đƣờng kính 8-9 µm, cĩ nhân trịn lập dị với các chromatin khơng đồng dạng. Chúng cĩ tế bào chất lớn với mạng lƣới nội chất hạt dày đặc (hình 2.4). Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào plasma (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể a. Đối với kháng nguyên phụ thuộc vào tuyến ức (KN cĩ bản chất protein) Khi KN xâm nhập vào cơ thể, chúng bị các tế bào trình diện KN bắt giữ, phân cắt chúng thành những đoạn nhỏ và gắn vào các phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – phân tử MHC (KN-MHC) biểu lộ trên bề mặt tế bào APC. Đồng thời KN cũng kích thích APC tiết IL-1. Phức hợp KN-MHC và IL-1 đƣợc nhận biết bởi phức hợp thụ thể TCR/CD4+ và thụ thể IL-1 trên bề mặt tế bào TH. Khi đĩ tế bào lympho T đƣợc hoạt hĩa sẽ tăng sinh và tiết IL-2, IL-4, IL-5 để kích thích sự phát triển của tế bào B thành tế bào plasma sản xuất immunoglobulin. Khi kháng nguyên gắn với SIg thích hợp trên tế bào B chín với sự hiện diện của tế bào TH, IL-2, IL-4 thì tín hiệu đƣợc truyền vào trong tế bào. Lúc này tế bào B sẽ trải qua quá trình tăng sinh và biệt hĩa thành dịng tế bào plasma tổng hợp kháng thể dịch thể hay immunoglobulin, chúng cĩ cấu trúc giống nhƣ SIg mà KN đã chọn lọc để gắn 12 nhƣng với ái tính cao hơn khi kết hợp với KN đặc hiệu. Tế bào plasma cĩ khả năng tổng hợp 300 phân tử Ig mỗi giây. IgM là loại KT xuất hiện đầu tiên khi cơ thể bị kích thích bởi KN, sau đĩ một vài ngày thì IgG, IgA và IgE xuất hiện (trong đĩ IgG là chủ yếu) và dần thay thế IgM. Thơng thƣờng khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng cũng cĩ trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ KT IgM chống lại KN O của vi khuẩn Samonella). Trong khi một số biệt hĩa thành tế bào plasma thì một số tế bào B khác chuyển thành tế bào nhớ giúp cho đáp ứng lần sau với chính KN đĩ nhanh hơn và mạnh hơn. Đáp ứng thứ phát: khi cĩ sự tiếp xúc với kháng nguyên lần đầu và nếu cho tiếp xúc lần sau với chính kháng nguyên đĩ thì KN gắn với các thụ thể tƣơng ứng là các phân tử KT trên bề mặt của tế bào B nhớ làm tế bào nhớ tăng sinh và biệt hố thành tế bào plasma sản xuất KT do đĩ chúng ta sẽ thấy rõ hàm lƣợng kháng thể tăng nhanh và cao hơn nhiều lần so với lần đầu. Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh. ( 20Course.jpg) 13 b. Đối với kháng nguyên khơng phụ thuộc vào tuyến ức KN khơng phụ thuộc vào tuyến ức thƣờng là các trình tự polimer lặp lại nhƣ lipopolysaccharide của Escherichia coli, flagellin của Salmonella, vỏ polysaccharide của vi khuẩn Pneumococcus, dextrans, levans và polyglutamic acid. Bởi vì chúng là những trình tự polimer lặp lại nên một phân tử cĩ thể gắn với nhiều thụ thể immunoglobulin trên bề mặt tế bào B do đĩ khơng cần tế bào T helper cung cấp thêm tín hiệu để gây ra đáp ứng tạo kháng thể của tế bào B nhƣ KN phụ thuộc vào tuyến ức (hình 2.6). KN khơng phụ thuộc tuyến ức gắn trực tiếp vào các SIg trên bề mặt tế B và kích thích tế bào B tiết ra kháng thể. Kháng nguyên khơng phụ thuộc vào tuyến ức chỉ gây ra đáp ứng tạo IgM ở tế bào B và khơng biệt hĩa thành tế bào nhớ vì chúng khơng kích hoạt tế bào T helper tiết interleukine nên khơng chuyển từ sản xuất IgM sang IgG. Nhƣ vậy, đối với KN khơng phụ thuộc tuyến ức, đáp ứng thứ phát khơng tạo ra lƣợng KT nhiều hơn đáp ứng nguyên phát (hình 2.7). Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay khơng phụ thuộc tuyến ức. KN khơng phụ thuộc vào tuyến ức khơng gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN khơng phụ thuộc tuyến ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B. (trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13] 14 2.2. VI KHUẨN E. coli [1] [9] 2.2.1. Định nghĩa Escherichia coli cịn đƣợc gọi là faecal coli, thuộc nhĩm coliform phân, cĩ hình que, gram âm, cĩ kích thƣớc khoảng 2-3 x 1,5 ; cĩ khả năng di động nhờ các tiên mao, khơng tạo bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Chúng cĩ mặt thƣờng xuyên trong ruột của động vật và ngƣời, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già. 2.2.2. Đặc tính sinh hĩa Cĩ khả năng phát triển ở 44oC. Lên men đƣờng glucose, lactose, manitol, sorbitol, phản ứng -galactosidase dƣơng tính. Indol dƣơng tính, methyl red dƣơng tính, Voges-Proskauer âm tính, citrate âm tính. Khơng sử dụng phenylalanin, ure, gelatin, KCN (potasium cyanic), malonate, adonitol, inositol, khơng sinh H2S. Do đĩ, E. coli đƣợc phát hiện do khả năng lên men lactose và sinh hơi ở 44oC, cĩ kết quả nghiệm pháp IMViC phù hợp. 2.2.3. Yếu tố kháng nguyên 2.2.3.1. Kháng nguyên thân O Các kháng nguyên O cĩ bản chất lipopolysacharide (LPS). Những kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn. Theo Leminor, kháng nguyên O thƣờng đặc trƣng cho từng lồi (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). Các kháng nguyên O cĩ thể đƣợc phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Để thực hiện phản ứng này, huyễn dịch vi khuẩn phải đƣợc đun nĩng ở nhiệt độ 100oC trong vịng 1 giờ, sau đĩ cho thử với phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu. Chúng giữ vai trị nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dịng vi khuẩn và một trong số các kháng nguyên này cĩ tính chất chuyên biệt cho từng lồi vật chủ. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 160 loại kháng nguyên O (R.J.Gross và B.Rowe, 1985) [9]. 15 2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K Kháng nguyên K nằm ở bề mặt tế bào nên là nguyên nhân khơng tạo ra phản ứng ngƣng kết kháng nguyên O. Hiện nay ngƣời ta đã phát hiện hơn 100 loại kháng nguyên K (Øiskov et al, 1971) [9]. Kauffmann chia kháng nguyên K thành 3 nhĩm dựa vào ảnh hƣởng của nhiệt độ đến phản ứng ngƣng kết, tính kháng nguyên và khả năng vi khuẩn gắn kết với kháng thể. a. Kháng nguyên K type L Là kháng nguyên vỏ cĩ bản chất protein, giúp vi khuẩn cĩ khả năng bám dính và cho phản ứng ngƣng kết với hồng cầu. Là kháng nguyên khơng chịu nhiệt, bị phá hủy sau khi đun nĩng 100oC trong 1h. Do đĩ, sau khi đun nĩng huyễn dịch vi khuẩn cĩ thể gây ngƣng kết với kháng huyết thanh O mà khơng gây ngƣng kết với kháng huyết thanh K. b. Kháng nguyên K type A Là kháng nguyên vỏ cĩ bản chất là polysaccharide, vi khuẩn cĩ kháng nguyên này khi mọc trên mơi trƣờng sẽ cho khuẩn lạc dạng nhầy và chỉ cho kết quả ngƣng kết của kháng nguyên O sau khi huyễn dịch vi khuẩn đã đƣợc đun nĩng 121oC trong 2h. c. Ngồi ra cịn một nhĩm kháng nguyên K type B, nhƣng sự tồn tại của nhĩm KN này chƣa đƣợc xác định chính xác. 2.2.3.3. Kháng nguyên lơng roi H Là kháng nguyên cĩ bản chất protein, khơng bền với nhiệt độ, bị hủy bởi cồn nhƣng đề kháng với formone. Kháng nguyên này cĩ ở những dịng E. coli di động. Theo Morris J.A. (1985) và Sussman M. (1985), hiện nay ngƣời ta đã phát hiện đƣợc 56 loại kháng nguyên H (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Hải, 1999). 2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE [10] [11] Kháng huyết thanh thu đƣợc khơng những chứa kháng thể mà cịn cĩ một số chất khác. Để tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh ta cĩ thể dùng phƣơng pháp sắc kí, kết tinh hay tủa trong muối… Phƣơng pháp tủa kháng thể trong amonium sulfate là một trong những phƣơng pháp phổ biến nhất để tách protein ra khỏi dung dịch. Trong dung dịch, protein liên kết với nƣớc bằng các liên kết hydrogen thơng qua các nhĩm ion tích điện của chúng. Khi ta thêm vào một lƣợng lớn các ion nhỏ, tích điện lớn nhƣ amonium hay sulfate thì 16 những nhĩm này cạnh tranh với protein để gắn vào các phân tử nƣớc, do đĩ làm giảm khả năng hịa tan của protein và chúng kết tủa lại. Protein kết tủa cĩ thể hịa tan lại trong mơi trƣờng cĩ nồng độ amonium sulfate thấp hơn. Khả năng kết tủa của các protein khác nhau thì khác nhau tùy thuộc vào số lƣợng và vị trí các nhĩm cực tích điện, trọng lƣợng phân tử của protein, pH của dung dịch, nhiệt độ xảy ra sự kết tủa. Để tủa kháng thể ngƣời ta thƣờng sử dụng amonium sulfate (đơi khi dùng sodium sulfate). Nồng độ muối để kháng thể kết tủa ở các lồi khác nhau thì khác nhau. Hầu hết các kháng thể của thỏ cĩ thể kết tủa ở dung dịch muối bão hịa 40%, cịn ở chuột phải từ 45-50%. Bởi vì hầu hết các thành phần khác của huyết thanh khơng kết tủa ở khoảng nồng độ muối này và khơng cĩ sự khác biệt lớn giữa hai nồng độ trên nên nồng độ muối bão hịa 50% là mức thích hợp nhất cho hầu hết các ứng dụng khác nhau. Một điểm bất lợi của kháng thể tủa trong amonium sulfate bão hịa là kháng thể khơng đƣợc tinh sạch vì khi kết tủa ngồi kháng thể cịn cĩ các phân tử protein cĩ trọng lƣợng phân tử lớn khác. Do đĩ, ngồi việc tủa trong muối amonium sulfate cần phải kết hợp với một số phƣơng pháp khác nếu yêu cầu kháng thể cuối cùng phải đƣợc tinh sạch hồn tồn. 2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH [7] Một trong các phƣơng pháp cổ điển để loại muối ra khỏi protein kháng thể là thẩm tích. Dung dịch protein đƣợc chứa trong bao thẩm tích làm bằng cellulose cĩ thắt nút ở hai đầu. Bao này đƣợc đặt trong cốc lớn chứa dung dịch đệm cĩ ái lực thấp và để ở nhiệt độ lạnh cĩ khuấy trộn vừa phải. Trên bao thẩm tích cĩ những lỗ nhỏ cho phép những phân tử muối cĩ kích thƣớc nhỏ đi ra ngồi cịn các phân tử protein kháng thể cĩ kích thƣớc lớn đƣợc giữ lại trong bao thẩm tích. Sự khuếch tán các phân tử muối vào trong dung dịch đệm thẩm tích vẫn tiếp tục cho đến khi nồng độ muối bên trong và bên ngồi bao thẩm tích đạt trạng thái cân bằng (thƣờng khoảng 5-6 giờ). Nếu sau khi đạt trạng thái cân bằng mà dung dịch protein chƣa loại hết muối thì ta đặt bao thẩm tích trên vào một dung dịch đệm mới và cứ tiếp tục nhƣ thế cho đến khi loại hết muối ra khỏi dung dịch protein. Trong quá trình thẩm tích, ngồi muối cịn cĩ các chất chuyển hĩa cĩ kích thƣớc nhỏ nhƣ ATP, coenzyme… cũng bị loại ra khỏi bao thẩm tích. 17 Hình 2.8 Trên bao thẩm tích cĩ các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngồi cịn KT bị giữ lại. ( 2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ [2] [5] 2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) Sự liên kết một paratop của KT với một epitop của KN tƣơng ứng đƣợc thiết lập và duy trì nhờ các lực hấp dẫn cĩ năng lƣợng nhỏ (<10 Kcal/mol) nhƣng khơng phải là liên kết cộng hĩa trị. Các lực liên kết KN-KT:  Lực tĩnh điện giữa các nhĩm COO- và NH3 + đối diện nhau của acid amin trong các chuỗi polypeptid.  Các liên kết hydro giữa các nguyên tử H+ và N- hoặc O-  Các liên kết kị nƣớc giữa các acid amin kị nƣớc.  Lực Van der Waals do sự di động của các điện tử giữa hai phân tử . 2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT Sự liên kết KN-KT cĩ 3 đặc điểm là: phản ứng phát nhiệt, cĩ tính đặc hiệu và thuận nghịch  Phản ứng phát nhiệt Sự liên kết giữa các KN-KT là một phản ứng phát nhiệt, giải phĩng ra năng lƣợng từ khoảng 2 đến 40 Kcal/mol. 18  Tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của phản ứng KN-KT thể hiện ở chỗ một vị trí paratop của KT chỉ kết hợp với một epitop của KN do đĩ nếu ta biết một trong hai yếu tố của phản ứng KN-KT thì cĩ thể nhận biết đƣợc yếu tố cịn lại. Tuy nhiên tính đặc hiệu của phản ứng chỉ là tƣơng đối.  Tính chất thuận nghịch Phức hệ KN-KT cĩ thể bị phân li do nhiệt, mơi trƣờng acid (pH<3), hoặc do mơi trƣờng cĩ lực ion cao. Do đĩ cĩ thể rửa chiết để tách riêng KT in vitro ngay cả khi phức hệ KN-KT đƣợc hình thành in vivo. 2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT Vì KT hịa tan trong dung dịch nên đặc tính của phản ứng KN-KT phụ thuộc rất lớn vào hình dạng KN. Nếu KN ở dạng hạt (vi khuẩn hoặc hồng cầu) kết hợp với KT tƣơng ứng sẽ tạo thành các hạt ngƣng kết thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. 2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha Pha thứ nhất: đặc trƣng bởi sự gắn phần Fab của KT với các quyết định KN trên bề mặt KN dạng hạt nên khơng nhìn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra nhanh đƣợc gọi là pha đặc hiệu hay pha khơng nhìn thấy. Pha thứ hai: đặc trƣng bởi sự liên kết chéo của các kháng thể đa hĩa trị, các KN dạng hạt đa hĩa trị để tạo thành dạng khối đủ lớn cĩ thể quan sát bằng mắt thƣờng. Pha này xảy ra chậm hơn và theo nguyên lí lí hĩa đơn thuần, nên cịn gọi là pha khơng đặc hiệu hay pha nhìn thấy đƣợc. Mạng lƣới ngƣng kết chỉ cĩ thể hình thành đối với các KT cĩ ít nhất hai hĩa trị. KT IgG khĩ xảy ra phản ứng ngƣng kết hơn so với KT IgM, vì IgG chỉ cĩ hai vị trí gắn kết với KN trong khi đĩ IgM cĩ tới năm vị trí liên kết với KN. Khả năng ngƣng kết của IgM cao hơn 100 lần so với IgG. 19 (A) Khơng xảy ra khi cả hai vị trí của IgG đều gắn vào một thể vi khuẩn. (B) Xảy ra khi IgG trở thành cầu nối giữa các thể vi khuẩn. (C) Rất dễ xảy ra khi kháng thể là loại IgM. Hình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên (trích dẫn liệu của Lê Văn Hùng, 2002) [2] 2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT  pH  Thời gian và nhiệt độ ủ KT IgM phản ứng tốt ở 4 – 22oC KT IgG phản ứng tốt ở 37oC.  Nồng độ KN và KT  Lực ion (nồng độ của muối): nếu giảm lực ion thì sự hấp thụ KT đƣợc tăng cƣờng.  Trở ngại do sự sắp xếp các phân tử trong khơng gian (Steric Hindrance): khi các KN khác nhau nằm sát nhau thì các KT tƣơng ứng với mỗi loại KN cĩ thể cản trở sự gắn kết do sự cạnh tranh với các phân tử khác. 2.6. PROTEIN A Protein A là một loại protein bề mặt của thành tế bào Staphylococcus aureus cĩ khối lƣợng phân tử 42 kDa. Nĩ gắn với vùng hằng định của immunoglobulin. Phân tử này cĩ thể gắn với KT ở hai vị trí Fcγ (vùng hằng định của IgG liên quan đến chức 20 năng phản ứng lại kích thích) và Fab (đoạn Ig chịu trách nhiệm cho việc nhận biết KN). Protein A gắn vào vùng hằng định thứ hai và thứ ba trên mảnh Fc của chuỗi nặng (Deisenhofer, 1981) nên mỗi phân tử IgG cĩ hai vị trí gắn với protein A. Bởi vì mỗi protein A cĩ 4 vị trí cĩ thể gắn kết với IgG (Sjưdahl, 1997) nên sự kết hợp hai dạng protein này tạo ra nhiều dạng phức hợp khác nhau. Khơng phải tất cả các immunoglobulin gắn protein A với cùng ái lực. KT của ngƣời, thỏ và chuột lang gắn với ái lực mạnh nhất và giảm dần ở heo, chuột, ngựa, bị cái (Kronvall et al. 1970; Goudswaard et al. 1978). KT từ dê, chuột (rat), gà, chuột đồng (hamster) gắn với lực yếu hơn nhiều. Ngồi ra trong một lồi các lớp immunoglobulin khác nhau gắn protein A cũng với ái lực khác nhau. Ví dụ trong lớp IgG của ngƣời thì IgG1, IgG2, IgG4 gắn protein A với ái lực cao trong khi đĩ IgG3 gắn với ái lực rất yếu. Tƣơng tự ở chuột IgG2a gắn với ái lực cao, IgG2b, IgG3 gắn với ái lực trung bình cịn IgG1 gắn với ái lực rất yếu (Ey et al, 1978). Nhƣng sự khác biệt này khơng quan trọng đối với KT đa dịng vì trong kháng huyết thanh đa dịng cĩ chứa tất cả các phân lớp của IgG chống lại KN. Sự gắn kết KT với protein A đƣợc ứng dụng để tinh sạch KT bằng phƣơng pháp sắc kí. Protein A đƣợc gắn vào giá đỡ bằng cyanogen bromide đƣợc cung cấp bởi nhà sản xuất ( ví dụ: protein A – Sepharose CL- 4B; Pharmacia). Mỗi ml phức hợp trên cĩ thể gắn với 10-20 mg IgG (tƣơng đƣơng với 1-2 ml kháng huyết thanh). Kháng thể gắn với protein A chủ yếu là nhờ các tƣơng tác kị nƣớc (Deisenhofer, 1981) và cĩ thể bị phá vỡ ở pH thấp. Ngồi ra sử dụng KT gắn với protein A để thực hiện phản ứng ngƣng kết với KN thì hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn rất nhiều lần so với khi khơng cĩ protein A. Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus. vp331/Staphylococci/proteinA.gif 21 PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian: từ 2/2005 đến 8/2005 3.1.2. Địa điểm  Phịng Miễn dịch viện Pasteur Tp. HCM  Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nơng Lâm Tp. HCM  Phịng thí nghiệm Vi Sinh. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Thu nhận và tinh sạch kháng thể.  Hiệu quả đáp ứng miễn dịch theo các quy trình tiêm khác nhau: ngắn ngày và dài ngày. 3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM  Thỏ: 6 con  Vi khuẩn E.coli gây bệnh phù đầu ở heo (chủng O139:K82 hay H28), vi khuẩn E. coli gây tiêu chảy trên heo (K88+ hay E68).  Vi khuẩn Staphylococcus aureus  Hố chất mơi trƣờng Muối amonium sulfate (NH4)2SO4 NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.12H2O Natri clorua NaCl Sodium azide NaN3 PBS Mơi trƣờng TSB  Thiết bị và dụng cụ Máy khuấy từ Máy li tâm Syringe loại 1 ml, 20 ml 22 Ống falcon 50 ml 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm Dịch vi khuẩn đƣợc chuẩn bị theo sơ đồ 3.1 Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli (theo rskov, 1977) 3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm  Đƣờng tiêm: tiêm dƣới da  Hàm lƣợng vi khuẩn khoảng 109 CFU/ml dịch tiêm.  Thỏ thí nghiệm đƣợc tiêm theo 2 qui trình ngắn ngày và dài ngày. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày qua bảng 3.1 và 3.2 Nuơi E. coli chủng gốc (O139:K82) trong mơi trƣờng canh TSB Cấy trên đĩa petri mơi trƣờng thạch TSA ủ 37oC qua đêm ủ 37oC qua đêm Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Dịch rửa Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vịng/phút trong 30 phút) Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hịa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin Dịch huyền phù kháng nguyên E. coli Hịa tan trong nƣớc muối sinh lí, điều chỉnh sao cho đạt nồng độ 109 tế bào/ml để 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi 23 3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm  Thí nghiệm 1: qui trình ngắn ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 1) Số thỏ thí nghiệm: 2 con (thỏ 1 và 2) Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày (theo rskov, 1977) Ngày Tiêm (ml) Lấy máu (ml) 0 1 Mũi gây mẫn cảm 1 0,5 4 1 Mũi nhắc lại 1 5 1 9 1 Mũi nhắc lại 2 10 2 14 1 Mũi nhắc lại 3 15 2 19 1 Mũi nhắc lại 4 20 2 25 40 30 40 35 Lấy hết Các lần lấy máu 1 ml để kiểm tra sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính.  Thí nghiệm 2: qui trình dài ngày gây đáp ứng miễn dịch (qui trình 2) Số thỏ thí nghiệm: 4 con (thỏ 2,3,4 và 5) 24 B ả n g 3 .2 G â y m iễ n d ịc h t h u k h á n g t h ể th eo q u i tr ìn h d à i n g à y ( q u i tr ìn h v iệ n P a st eu r T p . H C M ) L . m áu = l ấy m áu L ấy m áu k iể m t ra k h án g t h ể v ào c ác n g ày : 0 , 1 4 , 4 2 , 7 0 , 9 8 , 1 2 6 , 1 5 4 . M ũ i n h ắc l ại 5 1 5 4 L .m áu (m l) L ấy h ết 1 4 0 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 4 1 2 6 L .m áu (m l) 5 0 1 1 2 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 3 9 8 L .m áu (m l) 5 0 8 4 T iê m (m l) 1 ,5 1 ,5 1 0 ,7 5 M ũ i n h ắc l ại 2 7 0 L .m áu (m l) 1 5 6 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 M ũ i n h ắc l ại 1 4 2 L .m áu (m l) 1 2 8 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 M ũ i m ẫn c ảm 1 4 L .m áu (m l) 1 1 T iê m (m l) 2 2 1 ,5 1 0 L .m áu (m l) 1 N g ày T h ỏ 6 5 4 3 25 3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh Kháng huyết thanh thu vào các ngày 25, 30, 35 ở qui trình 1 (bảng 3.1) và ở các ngày 98, 126, 154 ở qui trình 2 (bảng 3.2)  Trƣớc khi lấy máu tráng ống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85% Vnƣớc muối sinh lí = 0,1 % thể tích máu  Lấy máu ở tĩnh mạch tai  Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống  Cho NaN3 vào VNaN3 = 0,05% Vmáu  Để qua đêm ở 4oC  Tách lấy huyết thanh, sau đĩ li tâm bỏ phần cặn. Kháng huyết thanh đƣợc chia làm 2 phần: Phần 1: để nguyên kháng huyết thanh, bổ sung glycerol (Vglycerol = 10% VKHT). Bảo quản ở 4oC. Phần 2: kháng huyết thanh đƣợc tủa trong amonium sulfate bão hịa. KHT nguyên đƣợc sử dụng trực tiếp trong phản ứng ngƣng kết hoặc cho gắn với protein A của Staphylococcus aureus hoặc xử lí hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn E. coli E68 và sau đĩ dùng cho phản ứng ngƣng kết đánh giá hiệu giá kháng thể. Việc xử lí KHT đƣợc tiến hành theo sơ đồ 3.2 Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh KHT KHT nguyên (bổ sung glycerol) KHT kết tủa, thẩm tích Hấp phụ Gắn protein A Định tính Định lƣợng 26 3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hồ  Máu sau khi để ở 4oC qua đêm, đem li tâm tách kháng huyết thanh  Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh lƣợng PBS 1X (VPBS = 3Vhuyết thanh)  Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch amonium sulfate 100%S V (NH4)2SO4 = Vhuyết thanh + VPBS Huyết thanh thỏ / PBS 1X đƣợc để trong nƣớc đá bào trên máy khuấy từ Nhỏ từng giọt (NH4)2SO4 100%S. Sau khi cho hết lƣợng (NH4)2SO4 vào tiếp tục khuấy 45 – 60 phút  Để 4oC qua đêm  Li tâm tách kết tủa  Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH4)2SO4 45%  Cho vào ống 50 ml, giữ tủa / amonium sulfate 45% ở 4oC Đối với trƣờng hợp lấy 1 ml máu: sau khi lấy máu cho 0,01 ml NaN3 để ở 4 o C qua đêm. Sau đĩ đem li tâm tách huyết thanh và cho glycerol vào (Vglycerol = 10 % Vh. thanh). 3.4.2.2. Phục hồi kháng thể Kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% đƣợc phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích.  Chuẩn bị bao thẩm tích Bao thẩm tích đƣợc cắt ra và rửa qua nƣớc cất, sau đĩ cho vào cốc nƣớc cất chứa 2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nƣớc cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứa cồn 30o, bảo quản ở 4oC. Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh 27  Thực hiện thẩm tích Cho kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% vào bao thẩm tích  dùng kẹp kẹp 2 đầu bao thẩm tích lại  đặt bao thẩm tích vào dung dịch buffer PBS  để 5-6 giờ ở 4 oC. Thực hiện 3 lần thẩm tích nhƣ trên sau đĩ thu kháng thể để xác định hiệu giá. Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm tích 3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh Kháng huyết thanh nguyên và kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate, thẩm tích đƣợc xử lí để loại bỏ các kháng thể khơng đặc hiệu hoặc gắn với protein A của S. aureus. trƣớc thẩm tích sau thẩm tích 28 3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể khơng đặc hiệu Kháng thể khơng đặc hiệu trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí hấp phụ theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.3 Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể khơng đặc hiệu Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa thạch TSA đƣờng kính 15 cm Ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Pha với 1 ml kháng huyết thanh (hoặc kháng thể đã thẩm tích) + 6 ml dung dịch phenol 0,25% Ủ 50oC trong 2h Li tâm 4000 vịng/phút trong 1h Thu dịch kháng thể trong Nuơi E. coli chủng gốc (K88+) trong mơi trƣờng canh TSB 5-6h ở 37oC 29 3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus Kháng thể cĩ trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với protein A của Staphylococcus aureus theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.4 Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus Nuơi Staphylococcus aureus trong mơi trƣờng canh TSB ủ 5-6h ở 37oC Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa petri mơi trƣờng TSA ủ 37oC qua đêm Rửa vi khuẩn bằng 10 ml nƣớc muối sinh lí 0,85% thu dịch huyền phù vi khuẩn Li tâm (4000 vịng/phút trong 30 phút) bỏ dịch nổi Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí Li tâm bỏ dịch nổi Hịa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin Pha lỗng trong nƣớc muối sinh lí để đạt nồng độ thử nghiệm Li tâm bỏ dịch nổi ủ 4oC qua đêm Ủ 50oC trong 2h Cho kháng huyết thanh vào với tỉ lệ KHT : dịch VK là 1:4 hoặc 1:9 Dịch kháng thể gắn với protein A của S. aureus 30 3.4.4. Đánh giá 3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng cĩ tính chất định tính, thƣờng sử dụng KN đã biết và đƣợc nhuộm màu để phát hiện KT tƣơng ứng trong huyết thanh, thƣờng dùng trong chẩn đốn bệnh truyền nhiễm. a. Cách thực hiện Nhỏ tách riêng trên phiến kính 1 giọt kháng huyết thanh (nguyên hoặc gắn S. aureus) thu đƣợc sau khi tiêm kháng nguyên gây miễn dịch và 1 giọt kháng huyết thanh thu đƣợc trƣớc khi tiêm kháng nguyên để làm đối chứng âm. Sau đĩ nhỏ thêm 1 giọt dịch vi khuẩn (vi khuẩn O139:K82 đƣợc cấy trên mơi trƣờng canh TSB và ủ 37oC qua đêm) và lắc nhẹ để trộn đều vi khuẩn với KHT, kết quả đƣợc đọc sau đĩ khoảng 30 giây đến 1 phút . b. Đọc kết quả  Nếu trong huyết thanh cĩ kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn thì trong huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh sẽ hình thành nên rất nhiều hạt ngƣng kết lớn màu trắng đục và đều khắp giọt huyễn dịch, nhìn thấy rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính (+). Tùy theo kích thƣớc hạt ngƣng kết lớn hay nhỏ mà ta đánh giá phản ứng dƣơng tính là: + nếu hạt ngƣng kết nhỏ, ít nhƣng vẫn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng +++ nếu hạt ngƣng kết rất lớn, nhiều màu trắng đục và thấy rất rõ bằng mắt thƣờng ++ nếu hạt ngƣng kết ở dạng trung gian giữa + và +++  Nếu huyễn dịch vi khuẩn vẫn đồng nhất, khơng thấy cĩ sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (-). Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (-) (+++) 31 3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm) Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm là phản ứng vừa cĩ tính định tính, vừa cĩ tính định lƣợng hàm lƣợng kháng thể (bán định lƣợng). Phản ứng này thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đốn y học, thú y học nhƣ chẩn đốn giang mai, thƣơng hàn, bạch lị gà, sẩy thai truyền nhiễm gia súc… a. Chuẩn bị dịch kháng nguyên Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm b. Cách thực hiện Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch KHT (nguyên, kết tủa và thẩm tích cĩ hoặc khơng cĩ hấp phụ E68) pha lỗng trong PBS 1X theo cơ số 2. Sau đĩ cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch kháng nguyên  ủ 37oC trong 2 giờ và để 4oC qua đêm. Ngồi ra cần phải cĩ ống đối chứng chứa 0,3 ml dịch kháng nguyên và 0,3 ml PBS 1X. Cấy E. coli chủng gốc O139:K82 vào mơi trƣờng canh TSB ủ 37oC qua đêm Cho formalin vào (Vformalin = 0,3% Vdịch VK ) Để 4oC qua đêm Li tâm bỏ dịch nổi (4000 vịng / phút trong 30 phút) Hịa tan phần rắn trong PBS 1X (VPBS = Vdịch VK) Dịch kháng nguyên 32 Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm c. Đọc kết quả Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc là: (+) khi các hạt ngƣng kết tạo thành mạng lƣới lắng đều khắp đáy ống nghiệm. (-) khi vi khuẩn lắng tập trung giữa đáy ống nghiệm. Kháng thể đƣợc định hiệu giá ở nồng độ kháng huyết thanh pha lỗng cao nhất cĩ xảy ra phản ứng ngƣng kết và ống đối chứng thì khơng ngƣng kết. 3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI  Thời điểm xuất hiện kháng thể.  Hiệu giá kháng thể. 3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ So sánh hiệu giá kháng thể thu đƣợc từ 2 qui trình trên. 33 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ 4.1.1. Định tính Để xác định thời điểm xuất hiện và thời gian tồn tại của kháng thể trong kháng huyết thanh (KHT) ta thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với KHT thu đƣợc sau khi li tâm tách huyết thanh. 4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày (35 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều tăng dần từ 0,5 ml đến 2 ml dịch vi khuẩn. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 5 ngày. Sau khi tiêm mũi nhắc lại thứ 4 tiến hành lấy máu thu kháng thể, lấy máu 3 lần mỗi lần cách nhau 5 ngày và lần cuối cùng lấy hết máu. Trƣớc khi gây miễn dịch và sau mỗi lần tiêm kháng nguyên vi khuẩn 4 ngày tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính, kết quả đƣợc trình bày bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trƣớc khi tiêm - - Sau mũi mẫn cảm - - Sau mũi nhắc lại 1 - - Sau mũi nhắc lại 2 + + Sau mũi nhắc lại 3 + + Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + + Lấy máu lần 2 + + Lấy máu lần 3 + + Ghi chú:  Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 34 Dựa vào bảng kết quả ta thấy qui trình ngắn ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu đã gây đƣợc đáp ứng miễn dịch trên thỏ, tạo kháng thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Kháng thể xuất hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) và vẫn tồn tại cho đến lần lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần cuối – mũi 4 ). 4.1.1.2. Qui trình dài ngày (154 ngày) Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều từ cao xuống thấp. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 28 ngày. Kể từ khi tiêm mũi nhắc lại thứ 3 tiến hành lấy máu thu kháng thể sau mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày. Trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm mũi mẫn cảm, các mũi nhắc lại 14 ngày tiến hành lấy máu để thử phản ứng ngƣng kết xác định sự hiện diện của kháng thể trong kháng huyết thanh. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 4.2. Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 (liều tiêm 1 ml) Thỏ 4 (liều tiêm 1,5 ml) Thỏ 5 (liều tiêm 2 ml) Trƣớc khi tiêm - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± - Sau mũi nhắc lại 1 ± ± Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± ± Sau mũi nhắc lại 3 ± + Sau mũi nhắc lại 4 + ++ Kết quả cho thấy sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Qui trình dài ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu cũng đã tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ với kháng thể cĩ thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 4.1.2. Định lƣợng Để xác định hiệu giá kháng thể ta thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với KHT lúc đầu và KHT đã thẩm tích (KHT tủa trong ammonium sulfate và thẩm tích) ở các độ pha lỗng khác nhau. 35 Trong thí nghiệm này chỉ tiến hành định hiệu giá kháng thể của KHT thu đƣợc ở lần lấy máu thứ 1,2,3 sau mũi nhắc lại 4 (qui trình ngắn ngày) và sau mũi nhắc lại thứ 3, thứ 4 (qui trình dài ngày). 4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Trung bình Lần 1 Huyết thanh 1/1600 1/1600 1/1600 KHT đã thẩm tích 1/960 1/480 1/720 Lần 2 Huyết thanh 1/960 1/1280 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/240 1/640 1/440 Lần 3 Huyết thanh 1/480 1/960 1/720 KHT đã thẩm tích 1/640 1/480 1/560 Ghi chú:  Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4  Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4 Dựa vào kết quả bảng 4.3 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh giảm dần ở các lần lấy máu, lƣợng kháng thể nhiều nhất trong mẫu máu lấy lần 1 và thấp nhất ở lần 3. Kết quả cũng cho thấy hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi tủa trong amonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn kháng huyết thanh lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệ u g iá K T Thỏ 1 Thỏ 2 Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu. 36 0 500 1000 1500 2000 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.2 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình ngắn ngày 4.1.2.2. Qui trình dài ngày Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và thỏ 4 Thỏ Lấy máu Thỏ 3 Thỏ 4 Trung bình Sau mũi nhắc lại 3 Huyết thanh 1/1280 1/960 1/1120 KHT đã thẩm tích 1/960 1/640 1/800 Sau mũi nhắc lại 4 Huyết thanh 1/1280 1/2560 1/1920 KHT đã thẩm tích 1/320 1/1920 1/1120 Dựa vào kết quả bảng 4.4 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở mũi nhắc lại 4 bằng hoặc cao hơn mũi nhắc lại 3. Hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 4 khơng giảm so với mũi nhắc lại lần 3 mà đặc biệt tăng cao 1/2560 so với 1/960 ở thỏ 4. 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Thỏ 3 Thỏ 4 Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau. 37 Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cĩ hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tủa bằng ammonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh thơ lúc đầu. 0 500 1000 1500 2000 2500 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT huyết thanh KHT đã thẩm tích Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã thẩm tích ở qui trình dài ngày 4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ 4 ở qui trình ngắn ngày và sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ 4 ở qui trình dài ngày. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 4.5. Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở qui trình ngắn ngày và dài ngày Qui trình ngắn ngày Qui trình dài ngày Lần 1 1/1600 Sau mũi nhắc lại 3 1/1120 Lần 2 1/1120 Sau mũi nhắc lại 4 1/1920 Lần 3 1/720 Trung bình 1/1147 Trung bình 1/1520 Kết quả cho thấy trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 4 ở qui trình ngắn ngày thấp hơn trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 3 và 4 ở qui trình dài ngày. 38 4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta cho kháng thể trong KHT gắn với protein A của Staphylococcus aureus. 4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh KHT thỏ 1 thu đƣợc ở lần lấy máu cuối cùng (lấy máu lần 3) đƣợc gắn với S. aureus ở các nồng độ khác nhau theo quy trình 3.4. Thực hiện phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau VKHT : VS. aureus Nồng độ S. aureus (tế bào / ml) 1:4 1:9 10 9 ++ + 10 10 ++ + 10 11 ++ + 10 12 ++ + 10 13 ++ ++ 10 14 +++ ++ 10 15 +++ ++ Ghi chú: Đối chứng  KHT của lần lấy máu thứ 3 (thỏ 1) khơng xử lí với S. aureus cho kết quả (+)  KHT trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch đƣợc xử lí với S. aureus cho kết quả (-) Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy: Phản ứng ngƣng kết thấy rõ nhất khi KHT gắn với S. aureus cĩ nồng độ 1014, 1015 tế bào/ ml. Trong đĩ, nồng độ S. aureus 1014 cho kết quả khơng khác nồng độ 1015. Tỉ lệ thể tích KHT kết hợp với S. aureus là 1:4 cho kết quả ngƣng kết trên phiến kính rõ hơn tỉ lệ 1:9. Nhƣ vậy việc xử lí gắn kháng thể với protein A của S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, giúp cho việc đọc kết quả đƣợc dễ dàng hơn. 4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn S. aureus Việc xử lí kháng huyết thanh với S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, điều này cĩ thể sẽ cho phép xác định chính xác hơn thời điểm xuất hiện 39 kháng thể. Dựa vào kết quả ở mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết thanh với dịch vi khuẩn S. aureus cĩ nồng độ 1014 tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn là 1:4. Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7 a. Qui trình ngắn ngày Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và khơng đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 Khơng xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Khơng xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - Sau mũi mẫn cảm - - - - Sau mũi nhắc lại 1 - - - - Sau mũi nhắc lại 2 + + + ++ Sau mũi nhắc lại 3 + ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 (lấy máu lần 1) + ++ + ++ Lấy máu lần 2 + + + ++ Lấy máu lần 3 + +++ + + So với KHT khơng gắn S. aureus thì KHT gắn S. aureus cho kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính rõ ràng hơn. Tuy nhiên khơng cĩ sự khác biệt về thời điểm phát hiện kháng thể. Ở cả hai trƣờng hợp đều cho kết quả phản ứng ngƣng kết dƣơng tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần 2. b. Qui trình dài ngày Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết thanh đƣợc xử lí và khơng đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ L.máu Thỏ 3 Thỏ 4 Thỏ 5 Khơng xử lí với S.aureus Xử lí với S. aureus Khơng xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Khơng xử lí với S. aureus Xử lí với S. aureus Trƣớc khi tiêm - - - - - - Sau mũi mẫn cảm ± ± ± + - + Sau mũi nhắc lại 1 ± ± ± + Chết Sau mũi nhắc lại 2 ± + ± + Sau mũi nhắc lại 3 ± ++ + ++ Sau mũi nhắc lại 4 + +++ ++ +++ 40 Kết quả cho thấy kháng thể nếu đƣợc gắn với protein A của S. aureus sẽ cho phản ứng ngƣng kết rõ hơn so với kháng thể khơng gắn protein A. Sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Đặc biệt ở thỏ 5, sau khi xử lí với S. aureus đã cĩ thể phát hiện đƣợc kháng thể ngƣng kết ngay sau mũi tiêm mẫn cảm trong khi với kháng huyết thanh khơng xử lí cho kết quả (-). 4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ cĩ các kháng thể đặc hiệu chung cho các lồi vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng huyết thanh. Nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ các kháng thể đặc hiệu chung này. Trong thí nghiệm, chúng tơi đã thử cho KHT hấp phụ với kháng nguyên chủng vi khuẩn E. coli E68 để trong KHT chỉ cịn lại những kháng thể đặc hiệu cho H28. KHT đƣợc hấp phụ với vi khuẩn E. coli E68, sau đĩ định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) Thỏ Lấy máu T1 T2 Trung bình H. thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Lần 1 Khơng h. phụ (n=2) 1/1600 1/960 1/1600 1/480 1/1160 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/48 1/48 1/20 1/41 Lần 2 Khơng h. phụ (n=2) 1/960 1/240 1/1280 1/640 1/780 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/6 1/48 1/48 1/38 Lần 3 Khơng h. phụ (n=2) 1/480 1/640 1/960 1/480 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/24 1/10 1/32 1/20 1/22 41 Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) Thỏ Lấy máu T3 T4 Trung bình H. thanh KT đã thẩm tích H. thanh KT đã thẩm tích Mũi nhắc lại 3 Khơng h. phụ (n=2) 1/1280 1/960 1/960 1/640 1/960 Hấp phụ E68 (n=2) 1/16 1/12 1/64 1/24 1/29 Mũi nhắc lại 4 Khơng h. phụ (n=2) 1/1280 1/320 1/2560 1/1920 1/1520 Hấp phụ E68 (n=2) 1/48 1/6 1/128 1/96 1/70 Dựa vào kết quả bảng 4.9 và 4.10 ta thấy cĩ sự giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của KHT đã hấp phụ so với KHT khơng hấp phụ. 0 200 400 600 800 0 00 40 lần 1 lần 2 lần 3 thời điểm lấy máu hi ệu gi á K T Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc khơng đƣợc hấp phụ ở qui trình ngắn ngày 42 0 500 1000 1500 2000 mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4 thời điểm lấy máu hiệ u g iá KT Huyết thanh HT hấp phụ E68 Biểu đồ 4.6 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc khơng đƣợc hấp phụ ở qui trình dài ngày 4.2. THẢO LUẬN 4.2.1. Định tính Khi tiêm kháng nguyên lần đầu thì khoảng 7 ngày sau kháng thể xuất hiện trong huyết thanh nhƣng ở hàm lƣợng thấp nên khĩ phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp thơng thƣờng đặc biệt là phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính cĩ độ nhạy rất thấp. Kháng thể chỉ đƣợc phát hiện bằng phƣơng pháp này khi nồng độ kháng thể lên đến đỉnh điểm (khoảng 12-15 ngày sau khi tiêm kháng nguyên). Ở qui trình ngắn ngày, kháng thể chỉ phát hiện đƣợc trong huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày). 14 ngày là thời gian đủ để hàm lƣợng kháng thể trong máu lên cao nên cĩ thể phát hiện bằng phản ứng ngƣng kết. Kháng thể vẫn tiếp tục tồn tại trong máu ở các mũi nhắc lại tiếp theo (khoảng cách giữa 2 mũi nhắc lại cách nhau 5 ngày). Trong KHT của lần lấy máu cuối cùng (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) vẫn cịn sự hiện diện của kháng thể. Ở qui trình dài ngày, kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với KHT sau khi tiêm mũi gây mẫn cảm và các mũi nhắc lại 1,2 khơng rõ ràng. Cĩ thể kháng thể xuất hiện trong KHT sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày nhƣng do hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh cịn thấp nên khĩ phát hiện đƣợc. Ở các mũi nhắc lại thứ 3 và thứ 4 thì phản ứng ngƣng kết cho kết quả rõ hơn. Cĩ thể do tiêm nhắc lại cùng một loại kháng nguyên vào cơ thể giúp tăng cƣờng việc chọn lọc các dịng kháng thể cĩ ái lực cao với kháng nguyên phát triển tạo ra các kháng thể cĩ ái lực mạnh hơn và nhiều hơn. 43 Để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch, mũi gây mẫn cảm nên tiêm thêm vi khuẩn lao và vaccine ho gà vì hai loại kháng nguyên này kích thích sự tổng hợp một số cytokin cần thiết giúp kích thích miễn dịch mạnh hơn. Ngồi ra, sử dụng tá chất cũng làm tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch. 4.2.2. Định lƣợng 4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày Kháng thể phát hiện trong kháng huyết thanh sau mũi nhắc lần 2 (14 ngày sau khi tiêm mũi mẫn cảm). Do số lƣợng KHT thu đƣợc sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 quá ít khơng đủ để định lƣợng nên khơng thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại lần 2, lần 3 mà chỉ định lƣợng đƣợc KHT sau mũi nhắc lại lần 4 (tiêm lần cuối) ở các thời điểm khác nhau (5, 10, 15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh giảm dần qua các lần lấy máu. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao nhất ở đợt lấy máu lần 1 (5 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng) và thấp nhất ở đợt lấy máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm mũi nhắc lại cuối cùng). Đáp ứng miễn dịch giảm dần cĩ thể do việc ngừng cung cấp kháng nguyên. Qui trình ngắn ngày khơng tạo đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và kéo dài. Với cùng một liều tiêm, ở lần lấy máu thứ nhất, hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 1 và thỏ 2 bằng nhau. Nhƣng ở lần lấy máu thứ 2, thứ 3 hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 2 cao hơn thỏ 1 cĩ lẽ do ở mỗi cá thể cĩ sức đề kháng, trạng thái thể chất và thần kinh của cơ thể khác nhau nên khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. 4.2.2.2. Qui trình dài ngày Thơng thƣờng hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh ở các mũi nhắc lại sau phải cao hơn mũi nhắc lại trƣớc nhƣng ta thấy hiệu giá kháng thể ngƣng kết của thỏ 3 ở các mũi nhắc lại lần 3 và lần 4 bằng nhau cĩ thể do đáp ứng miễn dịch của thỏ 3 đã đạt đến ngƣỡng cao nhất nên khơng tăng lên nữa hoặc do thỏ bị bệnh nên sức để kháng giảm làm giảm đáp ứng miễn dịch, ngồi ra việc tiêm thuốc trị bệnh thỏ cũng ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch. Ở mũi nhắc lại lần 3, hiệu giá kháng thể ngƣng kết thỏ 3 (liều tiêm mẫn cảm 1ml) cao hơn thỏ 4 (liều tiêm mẫn cảm 1,5 ml). Điều đĩ chứng tỏ liều tiêm 1 và 1,5 ml khơng ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch mà phụ thuộc chủ yếu vào khả năng đáp ứng miễn dịch của từng cá thể . 44 Ở thỏ 4, hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở mũi nhắc lại lần 4 cao hơn mũi nhắc lại lần 3 rất nhiều so với thỏ 3. Điều này cho thấy đặc điểm cá thể giữ vai trị nhất định trong đáp ứng miễn dịch với các yếu tố kháng nguyên xâm nhập. Ở cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày, hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh nguyên cao hơn hiệu giá kháng huyết thanh đã tủa với ammonium sulfate và thẩm tích. Điều này cĩ thể do trong quá trình tủa và rửa tủa thì một số protein kháng thể bị biến tính hoặc bị trơi mất. So với qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày cho lƣợng kháng thể cao (tăng dần ở các lần lặp lại). Do đĩ nếu gây miễn dịch để thu kháng huyết thanh nên chọn qui trình dài ngày vì thu đƣợc lƣợng KHT nhiều hơn (cĩ thể lặp lại đến mũi nhắc lại thứ 7) và kháng thể tạo ra cĩ ái lực cao với kháng nguyên hơn. Tuy nhiên số thú thí nghiệm chƣa nhiều vì vậy việc lặp lại là cần thiết để cĩ những kết luận chắc chắn hơn. 4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng cĩ độ nhạy rất thấp, chỉ phát hiện đƣợc kháng thể trong KHT ở nồng độ cao. Do đĩ để tăng độ nhạy nhằm xác định chính xác hơn sự hiện diện của kháng thể trong huyết thanh ta cĩ thể cho kháng thể gắn với protein A của S. aureus. Protein A trên thành vi khuẩn S. aureus cĩ khả năng gắn với IgG của thỏ rất tốt. Khi cho kháng thể đã gắn với protein A phản ứng với kháng nguyên thích hợp thì kháng thể cùng với S. aureus ngƣng kết với kháng nguyên do đĩ hạt ngƣng kết sẽ lớn hơn nhiều lần so với kháng thể khơng gắn protein A. Do đĩ việc gắn kháng thể với protein A của S. aureus sẽ làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy tỉ lệ kết hợp giữa kháng huyết thanh và S. aureus cũng tác động đến kết quả của phản ứng ngƣng kết. Thử nghiệm cho thấy tỉ lệ thích hợp giữa KHT và dịch vi khuẩn S. aureus trong nghiên cứu là 1:4 với nồng độ S. aureus là 1014 tế bào/ ml. 4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh Khi đƣa kháng nguyên vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra kháng thể chống lại các quyết định kháng nguyên (các epitop). Nếu kháng nguyên cĩ một quyết định KN thì cơ thể chỉ tạo ra một loại kháng thể đặc hiệu với quyết định KN đĩ. Nếu KN cĩ nhiều quyết định KN khác nhau thì ứng với một quyết định KN thì cơ thể sẽ tạo ra một KT phù hợp. 45 Vi khuẩn E. coli là kháng nguyên gồm nhiều quyết định KN khác nhau, trong đĩ cĩ một số quyết định KN giống nhau cho tất cả các chủng E. coli . Kháng thể tạo ra sẽ cĩ một số kháng thể đặc hiệu cho tất cả các chủng E. coli do đĩ việc định tính kháng thể kháng một chủng E. coli nào đĩ sẽ khơng chính xác. Chủng O139:K82 (H28) và chủng K88+ (E68) đều thuộc nhĩm E. coli gây bệnh trên heo nên chúng cĩ một số yếu tố kháng nguyên giống nhau. Do đĩ khi dùng chủng E68 để hấp phụ huyết thanh sẽ loại đi kháng thể chung cho E68 và H28 nên trong huyết thanh chỉ cịn lại các kháng thể đặc hiệu cho H28. Vì vậy việc thực hiện phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh đã hấp phụ E68 sẽ cho hiệu giá thấp hơn. 46 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 1. Kháng thể ngƣng kết phát hiện đƣợc trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày. 2. Hiệu lực gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên biến đổi tùy theo qui trình gây miễn dịch. 3. Khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc kháng nguyên E. coli trên thỏ là 28 ngày tạo hiệu giá kháng thể ngƣng kết cao hơn so với khoảng cách giữa 2 lần tiêm nhắc là 5 ngày. 4. Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính KHT cĩ thể đƣợc xử lí gắn với S. aureus (nồng độ 1014 tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4. 5. Xử lí kháng huyết thanh bằng cách kết tủa và thẩm tích làm giảm đáng kể hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh. 5.2. ĐỀ NGHỊ 1. Với qui trình ngắn ngày cần định lƣợng KHT sau mũi nhắc lại thứ 2, thứ 3 để xác định thời điểm kháng thể trong KHT nhiều nhất. 2. Nên thử nghiệm sử dụng chất bổ trợ để tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch của thỏ. 3. Lặp lại thí nghiệm với số lƣợng thú thí nghiệm lớn hơn để đánh giá chính xác hơn hiệu quả đáp ứng miễn dịch ở hai qui trình trên. 47 PHẦN 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng việt 1. Nguyễn Ngọc Hải, 1999. Phân lập vi khuẩn E. coli gây bệnh phù trên heo sau cai sữa và khảo sát khả năng nhạy cảm của chúng đối với một số kháng sinh. Luận án Thạc sĩ Khoa học Nơng nghiệp, Đại học Nơng Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Lê Văn Hùng, 2002. Giáo trình miễn dịch học thú y. NXB Nơng Nghiệp, TP.HCM. 191 trang. 3. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Miễn dịch học cơ sở. NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội. tr 3-119. 4. Đỗ Ngọc Liên, Thực hành hĩa sinh miễn dịch. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 5. Nguyễn Nhƣ Thanh, 1996. Miễn dịch học. NXB Nơng Nghiệp Hà Nội. 6. Bộ mơn miễn dịch - sinh lí bệnh trƣờng đại học Y Hà Nội, 1997. Miễn dịch học. NXB Y học Hà Nội. Phần tiếng Anh 7. Cooper G. Terrance, 1977. The Tools of Biochemistry. John Wiley & Sons, New York, USA. p 257-277, 355-405. 8. Dress W. D. Immunization of experimental animals. Applications of Immunological Methods in Biomedical Sciences, Volume 1 (Edited by D. M. Weir, Co-editors L. A. Herzenberg, Caroline black well, Leonone A. Herzenberg). Black well Scientific Publications. p 8.1-8.18. 9. Gross J. R. and Rowe B., 1985. Serotyping of Escherichia coli. The Virulence of Escherichia coli (M. Sussman). Academic Press, London, England. p 345- 356. 10. Harlow Ed and Lane David, 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. p 92-137, 286-299. 11. Mahler R. Henry and Cordes H. Eugene, 1967. Biological chemistry. Harper & Row, New YorK, USA. p 63-69 12. Sojka J. W., M.R.C.V.S, 1965. Escherichia coli in domestic animals and poultry. Commonwealth Agricultural Bureaux Farham Royal, Bucks, England. p 205-212. 48 13. Tizar Ian R., 1992. Immunology: an introduction, Third Edition. Sauders College Publishing, New York, USA. p 13-25, 112-128, 167-189, 219-236. Internet me%20Course.jpg RC/VL/GG/antiBD_mol.html 49 PHẦN 7 PHỤ LỤC Thành phần mơi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) tổng hợp: Casein enzymic hydrolysate 17 g/l Popaic digest of soyabean meal 3 g/l Sodium chloride 2,5 g/l Dipotassium phosphate 2,5 g/l Dextrose 2,5 g/l pH = 7,3 ± 0,2 (ở 25oC) Pha chế: cân 30g bột TSB hịa trong 1l nƣớc cất, đun sơi cho tan sau đĩ đem hấp khử trùng 121oC trong 15 phút. Nếu pha mơi trƣờng TSA thì bổ sung thêm 17,5g agar. Thành phần đệm PBS 10X NaCl 84,74g NaH2PO4.2H2O 10,14g Na2HPO4.12H2O 51,93g NaN3 5g Pha đệm: cân tất cả thành phần trên hịa tan trong nƣớc cất để đƣợc 1l dung dịch đệm PBS 10X Pha PBS 1X: 100 ml đệm PBS 10X + 900 ml nƣớc cất  1000 ml PBS 1X Pha amonium sulfate bão hịa 100%S: cân 767g (NH4)2SO4 hịa trong 1l nƣớc cất. Hỗn hợp đƣợc khuấy từ cĩ đun nĩng cho tan hết muối, bảo quản ở nhiệt độ phịng. Pha amonium sulfate bão hịa 45%S: 450 ml (NH4)2SO4 100%S + 550 ml PBS 1X  1000 ml (NH4)2SO4 45%S 50 Hình 7.1 Thỏ nuơi thí nghiệm Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai Hình 7.3 Tiêm dƣới da 51 Bảng 1: Kết quả phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với kháng huyết thanh ở độ pha lỗng cao nhất cĩ phản ứng ngƣng kết xảy ra của thỏ 1 và thỏ 2 Bảng 2: Kết quả phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm với kháng huyết thanh ở độ pha lỗng cao nhất cĩ phản ứng ngƣng kết xảy ra của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 Thỏ Lấy máu Thỏ 3 Thỏ 4 H. thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Mũi nhắc lại 3 Khơng h. phụ (n=2) 1/1280 1/1280 1/1280 1/640 1/1280 1/640 1/640 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/16 1/16 1/8 1/16 1/64 1/64 1/32 1/16 Mũi nhắc lại 4 Khơng h. phụ (n=2) 1/1280 1/1280 1/320 1/320 1/2560 1/2560 1/2560 1/1280 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/4 1/8 1/128 1/128 1/128 1/64 Thỏ Lấy máu Thỏ 1 Thỏ 2 H thanh KHT đã thẩm tích H. thanh KHT đã thẩm tích Lần 1 Khơng h. phụ (n=2) 1/1600 1/1600 1/1280 1/640 1/640 1/2560 1/640 1/320 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/32 1/64 1/32 1/64 1/8 1/32 Lần 2 Khơng h. phụ (n=2) 1/640 1/1280 1/320 1/160 1/1280 1/1280 1/640 1/640 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/64 1/8 1/4 1/64 1/32 1/64 1/32 Lần 3 Khơng h. phụ (n=2) 1/320 1/640 1/640 1/640 1/640 1/1280 1/640 1/320 Hấp phụ E68 (n=2) 1/32 1/16 1/4 1/16 1/32 1/32 1/8 1/32