Khóa luận Thử nghiệm khả năng ứng dụng protease từ nội tạng tôm trong sản xuất chitin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS - TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TRẦN THỊ NGỌC HÀ ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã giúp con có sự thành đạt nhƣ hôm nay. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. PGS – TS. Nguyễn Tiến Thắng, ThS. Nguyễn Lệ Hà, CN. Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Các anh chị tại phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Bạn Lê Minh Thông, Trƣơng Minh Dũng, Ngô Thị Thu Ngân và Cao Thị Thanh Loan. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Sinh học nhiệt đới, thời gian từ tháng 4 đến tháng 7/2007 với mục đích xem xét Enzyme từ nội tạng tôm có thể dùng để thủy phân, loại protein thay thế cho việc dùng NaOH hay không. Thử nghiệm sản xuất Chitin đƣợc bố trí trên cả 2 loại nguyên liệu là vỏ tôm khô và tƣơi, dƣới cả 2 hình thức khử: khử khoáng trƣớc và khử protein trƣớc. Công đoạn khử khoáng thực hiện bằng cách: xử lý với HCl 10%; trong 5 giờ; ở nhiệt độ phòng; tỷ lệ giữa nguyên liệu vỏ tôm tƣơi và dung dịch HCl là 1:5 (W/V), đối với vỏ tôm khô là 1:10 (W/V). Đối với công đoạn tẩy màu: với KMnO4 1%, H2SO4 10%; trong 1,5 giờ và với Na2S2O3 2%; trong 15 phút. Kết quả đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm tắt .......................................................................................................................... iv Mục lục ........................................................................................................................... v Danh sách các hình ...................................................................................................... viii Danh sách các bảng ....................................................................................................... ix Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 1.2. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme ....................................................................... 3 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme ........................................................................................ 3 2.1.1.1. Lịch sử phát triển ........................................................................................ 3 2.1.1.2. Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme ................................................................................... 4 2.1.1.4. Phân loại ....................................................................................................... 5 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme ......................................................................................... 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease .......................................................................... 6 2.1.2.1. Định nghĩa .................................................................................................... 6 2.1.2.2. Nguồn thu nhận ............................................................................................ 7 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme ........ 8 2.1.2.4. Ứng dụng .................................................................................................... 10 2.2. Đại cƣơng về tôm và Enzyme protease từ tôm .................................................... 11 2.2.1. Đại cƣơng về tôm ............................................................................................. 11 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm ................................................... 14 2.2.3. Enzyme protease từ tôm ................................................................................... 15 2.2.3.1. Tính chất ..................................................................................................... 15 2.2.3.2. Phân loại ..................................................................................................... 17 2.3. Chitin ..................................................................................................................... 17 vi 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin ......................................................................................... 17 2.3.2. Đặc tính lý hoá học .......................................................................................... 19 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác................................................................... 20 2.3.4. Ứng dụng của Chitin ....................................................................................... 21 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam ............................... 23 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới ................ 23 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam .................................................. 24 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin .................................................................. 26 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học ................................................................................. 26 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 30 Chƣơng 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm .............................................................................................. 32 3.2. Nguyên liệu ........................................................................................................... 32 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng ....................................... 33 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 34 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu .................................................. 34 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford .......................... 34 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano)36 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease .................................... 38 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm ............ 40 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm ................................................................................... 42 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp ........................................ 42 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp ...................................................... 43 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp ............................................................. 43 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp ..................................................... 44 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................. 44 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc ................................................................................ 45 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân .................................................... 45 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 47 vii 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân .......................................................................... 49 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................. 51 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc ......................................................................................... 52 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân ................................................................. 52 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân ......................................................................... 54 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân ................................................................ 55 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc ........................................................................................................................ 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 58 5.2. Đề xuất ý kiến ....................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 60 PHỤ LỤC .................................................................................................................... 61 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Tôm .............................................................................................................. 12 Hình 3.1: Nội tạng tôm ................................................................................................. 33 Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh ........................................................................................... 33 Hình 3.3: Bể ổn nhiệt ................................................................................................... 33 Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis ......................................................................... 34 Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 46 Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 46 Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 48 Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 48 Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 50 Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 50 Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 51 Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 51 Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 52 Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 53 ix Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 54 Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 55 Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......... 56 Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm ............................................................................. 57 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein .................................................................................... 61 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease .................................................................................. 61 x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô ......................................................................................................................... 62 Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................................................................................ 62 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ........................................................ 63 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ........................................................ 63 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ..................................................................... 64 Bảng 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi .................................................................... 64 Bảng 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô ...................................... 65 Bảng 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi ..................................... 65 Bảng 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng .............................. 66 Bảng 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ............................. 66 Bảng 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ......................................... 67 Bảng 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng .......................................... 67 Bảng 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng ........... 68 xi Bảng 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng ........... 68 xii 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Chitin là polysaccharide đứng thứ hai về lƣợng trong tự nhiên, chỉ sau cellulose. Chitin/Chitosan và các sản phẩm từ chúng hiện nay đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ y - dƣợc học, nông nghiệp, bảo vệ môi trƣờng… Chitin đã đƣợc chiết tách từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. Phƣơng pháp này có nhƣợc điểm là tốn nhiều hóa chất, chất lƣợng của sản phẩm lại không cao, độc hại cho ngƣời lao động và gây ô nhiễm môi trƣờng. Điều này các nhà môi trƣờng học đã lên tiếng cảnh báo. Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, bằng phƣơng pháp công nghệ Enzyme đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học trong sản xuất Chitin nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Với mức đóng góp 70-80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam, nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein theo nghiên cứu của TS. Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣơc ƣa chuộng trên thị trƣờng thế giới. Theo báo cáo của Bộ Thủy Sản, sản lƣợng tôm năm 2003 là 193.973 tấn. Tùy thuộc vào phƣơng pháp chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu tôm có thể chiếm từ 40-70% khối lƣợng tôm nguyên liệu. Tƣơng ứng với sản lƣợng tôm nƣớc ta, hằng năm sẽ có một khối lƣợng tôm khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm đƣợc tạo ra. Đặc biệt trong đầu tôm có nội tạng chứa Enzyme protease, Enzyme có hoạt tính rất cao, có khả năng thủy phân protein rất tốt. Ở nƣớc ta hiện nay, nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chƣa đƣợc tận dụng triệt để hoặc chƣa tận dụng những phế liệu này trên quy mô lớn hay không có hƣớng tận dụng trực tiếp nguồn phế liệu này, đầu tôm đƣợc bán với giá rất rẻ hoặc cho, bán không hết phải bỏ đi. 2 Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học, công nghệ ngành thủy sản là: sử dụng hợp lý và hiệu quả lƣợng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến thủy sản tạo ra hằng ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao. Một trong những hƣớng giải quyết yêu cầu trên là chiết rút chế phẩm protease có hoạt tính cao từ đầu và nội tạng tôm rồi sử dụng chế phẩm này để tạo ra những sản phẩm mới cho xã hội, vừa giảm thiểu chất thải, vừa thoả mãn nhu cầu mở rộng mặt hàng thủy sản, nâng cao hiệu quả kinh tế ngành chế biến thủy sản. Với mong muốn góp phần giải quyết những yêu cầu trên và tận dụng nguồn Chitin dồi dào trong phế liệu tôm, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” 1.2. Mục đích nghiên cứu Mục đích chung của đề tài là: Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm thô protease nội tạng tôm để thủy phân vỏ tôm sản xuất Chitin. Để đạt đƣợc các mục đích này, các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xác định nồng độ chế phẩm Enzyme cần thiết cho quá trình thủy phân protein. - Xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein nhƣ: Nhiệt độ quá trình Điều kiện pH Thời gian xử lý vỏ tôm (khô hoặc tƣơi) bằng Enzyme. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme ([1], [3], [4]) 2.1.1.1. Lịch sử phát triển Enzyme đã đƣợc sử dụng từ rất lâu. Nƣớng bánh mì, nấu rƣợu vang, sản xuất dấm, tƣơng, chao,… ở các mức độ khác nhau là những quá trình sinh học xƣa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Cho đến nay, ở đa số các nƣớc đang phát triển, các hình thức sản xuất trên vẫn còn tiếp tục phổ biến ở dạng cải biến nhờ sự hổ trợ của công nghệ Enzyme hiện đại. Chế phẩm Enzyme trong dịch chiết xuất từ động vật, thực vật đã đƣợc sử dụng rất lâu trƣớc khi ngƣời ta biết đƣợc bản chất của Enzyme. Ngay từ đầu thế kỷ 19 đã có những nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học – Enzyme trong quá trình tiêu hóa ở nƣớc bọt, dạ dày và ruột. Năm 1850, Pasteur vĩ đại đƣa ra nhận định là quá trình lên men đƣờng thành rƣợu bởi nấm men đƣợc tác nhân xúc tác sinh học gọi là ferment (fermentation – sự lên men) xúc tác. Sau này tác nhân trên đƣợc gọi thống nhất là Enzyme. Đặc biệt Buchner vào 1897 đã chứng minh chính dịch chiết nấm men (chứ không phải toàn bộ tế bào nấm men) có khả năng lên men đƣờng thành rƣợu. Đó là bằng chứng xác thực về sự tham gia của chính bản thân Enzyme trong quá trình lên men. Năm 1926, lần đầu tiên Sammer nhận đƣợc tinh thể Enzyme urease. Năm 1930, Northrop nhận đƣợc tinh thể pepsin và trypsin và đã chứng minh bản chất của Enzyme là protein và đặt nền móng cho những nghiên cứu cơ bản về Enzyme. Cũng vào thời kỳ này Haldane viết quyển “Enzyme”, mặc dù lúc đó bản chất phân tử của Enzyme còn là bí mật, nhƣng tác giả đã đƣa ra dự đoán tuyệt vời về vai trò của các tƣơng tác và liên kết yếu giữa Enzyme và cơ chất trong cơ chế hoạt động của Enzyme. Điều này vẫn giữ nguyên tính thời sự trong thời đại của chúng ta. Tuy nhiên, việc sử dụng Enzyme cho mục đích sản xuất công nghiệp lại đƣợc bắt đầu trên cơ sở Enzyme vi sinh vật đƣợc ngƣời Mỹ gốc Nhật tên là Okishi 4 Takamine khởi xƣớng đầu tiên dựa trên nguồn Enzyme từ nấm mốc. Năm 1894 ông đƣợc nhận bằng sáng chế về sản xuất Enzyme diastase từ nấm sợi và ông đặt tên cho sản phẩm là Takadiastase, là hỗn hợp chứa Enzyme carbohydrase và protease đƣợc sản xuất bằng kỹ thuật lên men bán rắn bề mặt hay còn gọi là kỹ thuật koji trên cám lúa mì ẩm có bổ sung muối và vi lƣợng. Trong giai đoạn cuối thế kỷ 20, các nghiên cứu trong lĩnh vực này tập trung vào nghiên cứu vai trò xúc tác của Enzyme trong các quá trình trao đổi chất của tế bào. Đã tinh sạch đƣợc hàng ngàn Enzyme và nhờ vậy đã làm sáng tỏ cấu trúc không gian và chức năng xúc tác của hàng trăm Enzyme khác nhau. 2.1.1.2. Định nghĩa Enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. (Theo tiếng Hi Lạp: -en có nghĩa là trong, còn -zyme có nghĩa là bột chua). Sự hiểu biết về Enzyme có ý nghĩa thực tiễn rất lớn. Rất nhiều dạng bệnh lý liên quan trực tiếp đến sự vắng mặt hoặc xáo trộn mật độ của Enzyme. Ngoài ra, càng ngày Enzyme càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, trong công nghiệp hóa học, trong công nghiệp vi sinh vật, trong chế biến thực phẩm và sản xuất nông nghiệp. 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme Ngoài nhóm nhỏ phân tử RNA có hoạt tính xúc tác, tuyệt đại đa số Enzyme có bản chất là protein và sự thể hiện hoạt tính xúc tác phụ thuộc vào cấu trúc bậc 1, 2, 3 và 4 của phân tử và trạng thái tự nhiên của nó. Enzyme có MW thay đổi rất rộng từ 12.000 Da đến hàng vài trăm nghìn Da. Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên có đủ tính chất của protein. Giống với các protein hình hạt khác, Enzyme có thể hòa tan trong nƣớc, dung dịch đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý… Dung dịch Enzyme có tính chất của dung dịch keo ƣa nƣớc. Enzyme trong dung dịch dễ dàng bị kết tủa dƣới tác dụng của muối trung hòa nhƣ Sulphatamon hoặc các dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone,… ở nhiệt độ thấp nhƣng không bị mất hoạt tính xúc tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm Enzyme. 5 Ngƣợc lại, dƣới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) Enzyme thƣờng bị mất khả năng xúc tác. Và mức giảm hoạt độ tƣơng ứng với mức độ biến tính của phân tử protein – Enzyme. 2.1.1.4. Phân loại Rất nhiều Enzyme đƣợc đặt tên bằng cách thêm đuôi –ase vào tên gọi cơ chất hoặc tên gọi mô tả quá trình xúc tác của nó, ví dụ urease là Enzyme thủy giải ure. Một số Enzyme khác nhƣ pepsin, trypsin,… lại không gọi theo tên cơ chất mà vẫn gọi theo tên truyền thống. Để thống nhất tên gọi Enzyme, theo quy ƣớc quốc tế, tên Enzyme thƣờng có 2 phần: phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ tên kiểu phản ứng mà chúng xúc tác. Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất xây dựng hệ thống phân loại Enzyme quốc tế. Trong hệ thống phân loại này, tất cả các Enzyme đƣợc phân thành 6 lớp:  Oxydoreductase: Enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.  Transpherase: Enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.  Hydrolase: Enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân.  Liase: Enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 (Pyruvate decarboxylase) hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nƣớc (Fumarate hydrolase).  Isomerase: Enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tƣơng hổ phức tạp giữa galactose và glucose.  Ligase: Enzyme xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic acid, tạo thành oxaloacetid acid. 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hóa cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đi với tế bào và cơ thể sống – là chất xúc tác sinh học có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu tuyệt vời. Chúng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học ở điều kiện sống bình thƣờng mà các chất xúc tác hóa học khác không thể thực hiện nổi. Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống, trong đó khá nhiều Enzyme đóng vai trò điều hòa làm nhạc trƣởng điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng trong quá trình trao đổi chất. 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease 2.1.2.1. Định nghĩa Protease là Enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid amin tự do, một ít peptide ngắn, pepton. Phản ứng thủy phân bởi Enzyme có thể biểu diễn theo sơ đồ: Enzyme A – B + H2O AH + BOH Protease (Cơ chất + H2O Sản phẩm) Nhƣ vậy, phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng lƣỡng phân. Nhƣng do trong phản ứng thủy phân lƣợng nƣớc rất lớn và coi nhƣ không đổi trong suốt quá trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1. Trong quá trình phản ứng, các phân tử cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc vào sự có mặt của các phân tử khác. Cần lƣu ý: Trong quá trình thủy phân, phản ứng thủy phân cơ chất là phản ứng chính nhƣng không phải duy nhất mà còn có một số phản ứng phụ. Nhƣ: trong phản ứng thủy phân protein thành axit amin, các phản ứng phụ có thể là phản ứng phân huỷ axit amin thành các sản phẩm thứ cấp, phản ứng Melanoidin tạo thành các hợp chất màu… 2.1.2.2. Nguồn thu nhận Từ động vật Protease động vật thƣờng có ở tuỵ tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày,… Gồm: - Pancreatin gồm: trypsin, chymotrypsin và một số Enzyme khác có ở tuỵ tạng, chúng đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch tuỵ. - Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, đƣợc tiết ra ngoài tế bào cùng với dịch vị. - Renin chỉ có ở ngăn thứ tƣ trong dạ dày bê non dƣới 5 tháng tuổi, là Enzyme đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất fromage. 7 Từ thực vật Enzyme protease từ thực vật có ở các phần khác nhau của cây nhƣ: thân, lá và đặc biệt có nhiều ở quả. Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt đới nhƣ: đu đủ, dứa, cây sung, articho và đậu tƣơng. Ví dụ: - Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh. - Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh. - Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả. Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các Enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp và y dƣợc. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,…Harley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau: - Protease serine - Protease kim loại - Protease acid - Protease tiol. 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme [3] -Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ Enzyme. Nhƣng nếu tăng nồng độ Enzyme quá lớn, vận tốc phản ứng tăng chậm. 8 - Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Nhƣng khi tăng nồng độ cơ chất đến mức nào đó, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng. Với từng Enzyme, nồng độ tới hạn của cơ chất cũng nhƣ với từng cơ chất, nồng độ tới hạn của Enzyme phụ thuộc vào điều kiện của qúa trình phản ứng. Vì vậy, với từng Enzyme khi dùng để thủy phân một cơ chất cụ thể, trong những điều kiện cụ thể, cần nghiên cứu để xác định nồng độ tới hạn của Enzyme. - Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa Hoạt độ của Enzyme có thể bị thay đổi dƣới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng (chất hoạt hóa) hoặc làm giảm (chất kìm hãm) hoạt độ Enzyme. Tác dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất, tùy từng Enzyme. Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng Enzyme sẽ làm cho Enzyme bị giảm hoạt tính nhƣng không bị chuyển hóa bởi Enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ, kể cả các protein. Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của Enzyme hoặc làm cho Enzyme chuyển thành dạng hoạt động từ dạng không hoạt động. Các chất này thƣờng có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim lọai hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của Enzyme một cách trực tiếp hoặc gián tiếp. - Ảnh hƣởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hƣởng rất lớn đến phản ứng Enzyme và tốc độ phản ứng Enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vƣợt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm và dẫn đến mức triệt tiêu. Nếu đƣa nhiệt độ lên cao hơn mức nhiệt độ thích hợp, hoạt tính Enzyme sẽ bị giảm, khi đó Enzyme không có khả năng phục hồi lại hoạt tính. Ngƣợc lại, ở nhiệt độ 00C, Enzyme bị han chế rất mạnh, nhƣng khi đƣa nhiệt độ lên từ từ hoạt tính Enzyme sẽ tăng dần đến mức thích hợp. Ở nhiệt độ thấp (0-410C), vận tốc phản ứng tăng khi nhiệt độ tăng. Sự gia tăng vận tốc này đơn thuần là do cung cấp năng lƣợng cho phản ứng. 9 Ở nhiệt độ sau đó (tùy thuộc vào từng loại Enzyme, ở khoảng 450C), vận tốc phản ứng giảm do sự biến tính của protein. Đa số Enzyme bị mất hoạt tính ở 80- 100 0 C. Nhiệt độ thích hợp của một Enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, pH, lực ion của môi trƣờng. - Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân vì nó ảnh hƣởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa Enzyme và đến độ bền của protein- Enzyme. Đa số Enzyme bền trong khoảng pH = 5-9, độ bền của Enzyme có thể tăng lên khi có các yếu tố làm bền nhƣ: cơ chất, coEnzyme, Ca2+… Mỗi Enzyme có một giá trị pH thích hợp, không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ: cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ… Với nhiều Enzyme protease, pH thích hợp ở vùng trung tính, nhƣng cũng có một số Enzyme có pH thích hợp rất thấp (pepxin, protease axit của vi sinh vật,…) hoặc khá cao nhƣ subtilin, có pH thích hợp lớn hơn 10. - Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Trong quá trình thủy phân, thời gian tác dụng của Enzyme lên cơ chất dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: độ mịn của nguyên liệu, pH, nhiệt độ,… Thời gian thủy phân cần đủ dài để Enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. Khi cơ chất cần thủy phân đã thủy phân hết, quá trình thủy phân kết thúc. Thời gian thủy phân phải thích hợp để đảm bảo hiệu suất cao đồng thời đảm bảo chất lƣợng sản phẩm tốt. Trong thực tế, thời gian thủy phân phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể. - Ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc Với phản ứng thủy phân bởi Enzyme thì nƣớc vừa là môi trƣờng để phân tán Enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng. Nƣớc có ảnh hƣởng đến tốc độ và chiều hƣớng của phản ứng thủy phân bởi Enzyme. Vì thế, nƣớc là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi Enzyme, nó có thể tăng cƣờng hoặc ức chế các phản ứng do Enzyme xúc tác. 2.1.2.4. Ứng dụng Trong công nghiệp thực phẩm 10 - Enzyme protease đƣợc sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Ngƣời ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội tạng động vật để thuỷ phân làm mềm nguyên liệu hoặc thuỷ phân nguyên liệu tạo thành các dạng dịch thuỷ phân dễ hấp thu, dễ tiêu hoá. - Trong chế biến nƣớc giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease sử dụng để làm trong dịch quả, dịch bia tạo điều kiện cho quá trình lọc. - Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm phomat. - Sản xuất nƣớc chấm: nƣớc mắm, tƣơng, chao,… - Protease dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thƣơng mại của các sản phẩm có giá trị thấp, nhƣ: dùng protease để thủy phân protein trong phế liệu công nghiệp thực phẩm (xƣơng, collagen,…) thành các dạng hoà tan thu dịch đạm thủy phân cho ngƣời hoặc thức ăn chăn nuôi. - Dùng protease để thuỷ phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá hoặc để tinh chế guanin. Trong công nghiệp dệt Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng, không ảnh hƣởng đến độ bền của tơ. Trong công nghiệp phim ảnh Protease đƣợc dùng để sản xuất gellatin phủ trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X-quang. Trong công nghiệp da Protease đƣợc dùng để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lƣợng lông thu hồi và tỷ lệ thu hồi tăng 25-30% so với khi dùng phƣơng pháp hoá học, da có chất lƣợng cao. Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm Protease đƣợc thêm vào để sản xuất xà phòng, thuốc đánh răng, để tẩy sạch các vết máu mủ hoặc bổ sung protease vào kem bôi mặt, có tác dụng loại đƣợc các lớp biểu bì chết, làm mịn da. Trong công nghiệp dƣợc phẩm Protease đƣợc dùng để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu Enzyme tiêu hoá, thuốc tiêu mủ ở các vết thƣơng và giảm đau cho ngƣời bệnh. 11 2.2. Đại cƣơng về tôm và Enzyme protease từ tôm ([9], [10]) 2.2.1. Đại cƣơng về tôm Tôm trong bộ Decapoda, ngoại trừ cận bộ Brachyura bao gồm các loài cua, cáy và có thể là một phần của cận bộ Anomura bao gồm các loài tôm ở nhờ (ốc mƣợn hồn). Cụ thể nhƣ sau: Bộ Decapoda +Phân bộ Pleocyemata  Caridea: Tôm thực sự  Stenopodidea: Tôm sọc đỏ trắng  Polychelida: Các loài tôm chuyển tiếp giữa dạng tôm thực sự và tôm hùm, là các động vật giáp xác mù, sống ở đáy, giống tôm hùm.  Achelata: Nhóm tôm hùm không càng. Tôm hùm nuôi và đánh bắt ở Việt Nam thuộc nhóm này.  Glypheoidea: Tôm hùm glypheoid, đôi khi đƣợc gộp trong cận bộ Astacidea nhƣ là một siêu họ.  Astacidea: Hai nhóm (Astacoidea và Parastacoidea) tôm đồng, tôm sông, một nhóm tôm hùm thực sự (có càng) (Nephropoidea), và một nhóm tôm hùm đá ngầm (chi Enoplometopus).  Thalassinidea: "Tôm hùm bùn" và "tôm ma"  Anomura: Tôm ở nhờ +Phân bộ Dendrobranchiata: Tôm pan đan, tôm thẻ, tôm he. Hình 2.1: Tôm Tôm biển thuộc lớp giáp xác, bộ mƣời chân, trong đó quan trọng nhất là các loài trong họ tôm he (Penaeidae), ngoài ra còn có họ tôm moi, tôm hùm, tôm vỗ,... là loại hải sản có giá trị xuất khẩu hàng đầu của Việt Nam. 12 Bên cạnh sản lƣợng tôm khai thác tự nhiên, sản lƣợng tôm nuôi của Việt Nam cũng tăng lên nhanh chóng, trong đó sản phẩm tôm sú nuôi hiện nay đứng ở vị trí hàng đầu trên thế giới. Tôm biển của Việt Nam ngày nay không những là món ăn quen thuộc đối với ngƣời dân Việt Nam mà còn có giá trị trên thị trƣờng thực phẩm thế giới. Thịt tôm biển của Việt Nam có hƣơng vị thơm ngon, thành phần dinh dƣỡng cao, tuy nhiên sản lƣợng khai thác phần lớn là cỡ trung bình và nhỏ, cỡ lớn chủ yếu chỉ đạt tới size 26-30 hoặc lớn hơn nhƣng khối lƣợng không đáng kể. Nghề nuôi tôm của Việt Nam đã và đang đƣợc phát triển mạnh và mang lại hiệu quả kinh tế lớn đối với xuất khẩu thuỷ sản của Việt Nam. Ngoài tôm sú đƣợc nuôi phổ biến, tôm chân trắng cũng đã bắt đầu đƣợc thử nghiệm nuôi để tạo thêm sự đa dạng phục vụ nhu cầu xuất khẩu và tiêu thụ nội địa. Vùng phân bố Suốt dọc bờ biển Việt Nam nơi nào cũng bắt gặp các loài tôm thuộc các họ tôm có giá trị kinh tế và xuất khẩu cao, song tuỳ theo thời gian, địa hình biển, thời tiết và các đối tƣợng đánh bắt khác nhau, hình thành các khu vực đánh bắt chủ yếu: ven bờ phía Tây Vịnh Bắc Bộ, vùng biển Nam Thanh Hoá-Bắc Nghệ An là bãi tôm quan trọng thứ 2 của ven bờ phía Tây Vịnh Bắc Bộ, chạy từ lạch Ghép đến lạch Quèn và bãi tôm vịnh Diễn Châu, vùng biển Nam Hà Tĩnh, vùng biển miền Trung, vùng biển Nam Bộ, vùng biển gần bờ phía Tây (Vịnh Thái Lan),… Nuôi tôm Tôm sú là đối tƣợng nuôi xuất khẩu chính. Vùng nuôi thích hợp là khu vực nƣớc lợ có độ mặn từ 2‰ đến 25‰ . Tôm đƣợc nuôi trong các ao đầm nƣớc lợ ở cả vùng cao và vùng triều. Một số nơi nuôi xen kẽ vụ lúa, vụ tôm và nuôi chung với cá rô phi, cua và rong câu. Năng suất bình quân cả nƣớc là 400kg/ha/vụ. Năng suất có nơi đạt bình quân 4000kg/ha. Tùy theo vùng, miền có thể nuôi 1-2 vụ/năm. Mùa vụ thu hoạch : rải rác từ tháng 4 đến tháng 9. Chính vụ, sản lƣợng cao nhất vào tháng 5, 6, 7. Xuất khẩu Xuất khẩu tôm của Việt Nam tăng trƣởng liên tục hàng năm. Tính trung bình trong đầu những năm 2000, sản lƣợng tôm đông lạnh xuất khẩu hằng năm đạt khoảng 150.000 tấn, trị giá gần 1tỷ USD. 13 Tôm của Việt Nam đã có mặt trên 70 thị trƣờng ở khắp các châu lục trên thế giới. Có hơn 50 mặt hàng tôm đông lạnh xuất khẩu, đƣợc chế biến dƣới nhiều dạng sản phẩm khác nhau nhƣ tƣơi sống, đông lạnh, các sản phẩm chế biến sẵn, chế biến ăn liền, các sản phẩm phối chế, các sản phẩm khô, đóng hộp, làm lên men chua... Các nhà máy chế biến tôm ở Việt Nam hiện nay phần lớn đều có hệ thống trang thiết bị hiện đại và áp dụng các công nghệ tiên tiến nhất trên thế giới với các tiêu chuẩn chất lƣợng đƣợc ứng dụng theo quốc tế nhƣ Chƣơng trình chất lƣợng (QMS) theo HACCP, ISO 9001-2000, SSOP, GMP. Các hệ thống dây chuyền IQF tự động hiện đại có khả năng sản xuất các mặt hàng giá trị cao. Thành phần dinh dƣỡng của tôm biển: Các loài tôm biển đƣợc chế biến xuất khẩu chủ yếu : tôm sú, tôm bạc (tôm he chân trắng), tôm sắt, tôm thẻ, tôm chì. 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm  Theo Samuel keyers, 1985, đầu tôm chứa một lƣợng lớn những chất dinh dƣỡng, nhƣ các acid amin, Nucleotid rất hấp dẫn tính ăn của các loài động vật thuỷ sản nên đƣợc tận dụng để bổ sung vào khẩu phần ăn của chúng hoặc cho gia súc, gia cầm (Samuel P.M, 1986). Thành phần hoá học trong đầu tôm Thành phần Hàm lƣợng (%) Ẩm độ Đạm toàn phần Protein thô Lipid Canxi Phospho 73,22 1,86 11,64 2,01 2,19 0,37 (Kết quả phân tích tại Viện Pasteur) Protein thuộc loại hoàn thiện và chứa nhiều acid amin nhƣ: tyrozyn, tryptophan, xistin và ít lyzyn, histidin hơn so với các protein của thịt cá. Thịt tôm còn chứa một lƣợng lớn vitamin B2 cũng nhƣ các nguyên tố khoáng, Ca, P, Fe, Cu, Iot,… Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g sản phẩm ăn đƣợc Thành phần chính Muối khoáng Vitamin Kcal g Mg mg Calories Moisture Protein Lipid Glucid Ash Calci Phosphor Iron A B1 B2 PP 82 79,2 17,6 0,9 0,9 1,4 79 184 1,6 20 0,04 0,08 2,3 14  Cơ quan nội tạng của tôm [4] Khi giải phẫu tôm, ngƣời ta thấy cơ quan nội tạng của tôm tập trung chủ yếu ở phần đầu, bao gồm hệ tiêu hóa, tuần hoàn, hô hấp, bài tiết, sinh dục… Dạ dày là phần chính của hệ tiêu hóa. Ngoài dạ dày ra, hệ tiêu hóa còn có ruột giữa (ngắn), ruột sau (dài) chạy qua cả phần bụng. Hệ tiêu hóa là nơi tập trung các Enzyme khác nhau, đặc biệt là protease phân giải protein có hoạt tính khá mạnh, giúp cho việc tiêu hóa thức ăn của tôm. Ngoài ra, một số cơ quan khác nhƣ gan, tụy, ống dẫn tiêu hóa,…cũng chứa nhiều protease.  Vỏ tôm [2] Thành phần của vỏ tôm gồm có: khoáng, protein, H2O, Chitin, ngoài ra còn có một số thành phần khác nhƣ lipit, các sắc tố chủ yếu là Asthaxanthin,…Tỷ lệ giữa các thành phần này không ổn định, phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ giống loài, mùa vụ, đặc điểm sinh thái – sinh lý. Chitin là thành phần chủ yếu của vỏ tôm. Vì vậy, đây là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất Chitin – Chitosan. 2.2.3. Enzyme protease từ tôm [4] 2.2.3.1. Tính chất Protease của tôm cũng nhƣ của các loài động vật thuỷ sản khác là các protease nội bào, tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó là nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt là ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nôi tạng nằm ở phần đầu nên hệ Enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu, sau đó đến các cơ quan khác. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serine dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Một số protease tiêu biểu nhƣ: cathepsin, dipeptidase, carboxypeptidase, trypsin …. (Nguồn: Bộ nội thƣơng, 1982. Trƣờng đại học Thƣơng nghiệp thƣơng phẩm học hàng thực phẩm, tập II. HN) Khả năng hoạt động của các Enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài. Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô đƣợc xác định nhƣ khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh và tôm đất thấp hơn ở Penaeus pencillatus, P. monodon và P. japonnicus. 15 Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và thạc sĩ Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các Enzyme tiêu hoá protein là các Enzyme hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease từ tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trƣờng gần trung tính. Nhƣ vậy, qua một số nghiên cứu của một số tác giả cho thấy Enzyme từ tôm nói chung là các protease kiềm tính. Các Enzyme này đều có tính chất chung của Enzyme là: - Hoà tan đƣợc trong nƣớc, dung dịch nƣớc muối và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào tính chất này để tách chiết chúng. - Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hoà (sulphatamon), ethanol, acetone để thu chế phẩm Enzyme. - Hoạt tính của Enzyme có thể tăng hoặc giảm dƣới tác dụng của các chất hoạt hoá hoặc chất ức chế. - Độ hoạt động của Enzyme chịu ảnh hƣởng lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trƣờng… 2.2.3.2. Phân loại Có nhiều cách phân loại protease tuỳ theo khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có các đặc tính khác nhau. Nhóm Enzyme này có tác dụng thuỷ phân protide, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thủy phân liên kết peptide mà còn có thể thuỷ phân cả liên kết ester và có thể xúc tác cho chuyển vị gốc acid amine. Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau. - Trypsin Loại Enzyme này có trong dịch vị tuỵ tạng. Trypsin trong động vật thuỷ sản nói chung và trong tôm nói riêng, tồn tại ở dạng không hoạt động gọi là trypsinogene chúng đƣợc hoạt hoá bởi Enzyme enterokinase. Trypsin là loại protease kiềm tính, phân tử lƣợng khoảng 23.800 Da, điểm đẳng điện ở pH=10,5. Đa số trypsin hoạt động ở pH thích hợp là 8,0; khả năng tác dụng của trypsin khá mạnh với các loại protide với phân tử lƣợng thấp ở các mối liên kết peptide, ester. Trypsin từ ruột tôm có pH thích hợp là 7,8 ở 380C khi cho tác dụng với cơ chất là casein trong 24 giờ. 16 - Peptidase, ereptase (erepsin) và các loại khác Peptidase tham gia thuỷ phân liên kết peptide trong phân tử protide và các polipeptide. Khả năng tác dụng cũng nhƣ tính đặc hiệu của Enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm kề bên mối liên kết peptide. - Carbohydrase Enzyme này xúc tác thuỷ phân các glucid và glucozit. 2.3. Chitin 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin [2] Lịch sử phát hiện Cách đây hơn 180 năm, Chitin lần đầu tiên đƣợc tìm thấy bởi Braconnot vào năm 1811, khi ông thu đƣợc một chất có khả năng bền với kiềm và gọi là “Fungin” từ nấm bậc cao. Sau đó, tên Chitin đƣợc Odier đề nghị vào 1923 khi tách đƣợc một polisaccharide từ cánh cứng của bọ da. Ngày nay, Chitin đƣợc phát hiện ở cả động vật lẫn thực vật. Phân bố Chitin hiện diện ở thực vật bậc thấp. Trong thế giới thực vật, Chitin chỉ giới hạn ở loài nấm, tảo lục, địa y, noãn khuẩn. Ở tôm, Chitin hiện diện ở dạng kết hợp với các thành phần khác. Chitin hiện diện ở động vật bậc thấp. Chitin là thành phần cấu tạo nên xƣơng hữu cơ chính ở động vật không xƣơng sống (trùng đốt, tiết túc, nhuyễn thể, côn trùng). Đối với ngành tiết túc Chitin chỉ là một trong những thành phần cấu tạo của bộ xƣơng ngoài. Trong thiên nhiên, dạng Chitin nguyên chất chỉ tồn tại trong nang của loài mực ống Logigo. Ở thủy sản, Chitin tồn tại rất nhiều, đặc biệt là vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,… hàm lƣợng cao. Vì vậy, phần lớn Chitin đƣợc chiết xuất từ vỏ của các loài giáp xác nhất là vỏ tôm, kế đó là vỏ cua, ghẹ. Ở vỏ tôm cũng nhƣ vỏ cua, Chitin tạo phức hệ với protein và thƣờng chứa thêm một tỉ lệ lớn CaCO3. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Trong tự nhiên hiếm thấy Chitin tồn tại ở dạng tự do, nó liên kết dƣới dạng phức hợp Chitin – protein, Chitin với các hợp chất vô cơ,…Khi tồn tại nhƣ thế, Chitin có khả năng đề kháng đối với các chất 17 thủy phân hóa học và Enzyme, gây khó khăn cho việc tinh chế, tách chiết. Tùy thuộc vào đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, ngƣời ta có thể thấy có sự thay đổi về lƣợng và chất Chitin. Mặc dù gặp rất nhiều khó khăn trong việc chiết tách Chitin nhƣng ngƣời ta đã khẳng định về sự hiện diện của Chitin ở thực vật lẫn động vật dựa vào phép đo quang học, phân tích bằng tia X và phân cắt bởi Enzyme hay phản ứng hoá học. Thành phần Chitin của một số phế liệu thủy sản [8] Phế liệu Thành phần Chitin (%) Vỏ hến Vỏ ốc Vỏ cua đồng Vỏ tôm đồng Vỏ tôm biển 0,4 1,24 23,8 30,0 33,1 Cấu tạo Chitin là một trong những polisaccharide đƣợc tìm thấy nhiều trong tự nhiên, nhiều thứ hai chỉ sau cellulose. Chitin đƣợc cấu tạo bởi các đơn vị 2 acetamido-2 deoxy-D glucose nối với nhau bằng liên kết - 1, 4 glycoside. Chitin đƣợc xem là dẫn xuất từ cellulose, trong đó gốc – OH ở vị trí C2 đƣợc thay thế bởi gốc acetamide NHCOCH3. Điểm giống nhau của liên kết glucoside ở Chitin và cellulose đƣợc thể hiện qua nhiệt lƣợng toả ra tƣơng đƣơng nhau vào khoảng 29 Kcal/mol.  Công thức hoá học của Chitin (C8H13NO5)n, trong đó: C = 47.29 %. H = 6.45 %. N = 6.89 %. O = 39.37 %. 18  Công thức cấu tạo của Chitin Chitin đƣợc tách ra từ nấm, giáp xác, côn trùng có cấu tạo tƣơng tự nhau. Đặc tính lý hoá học - Chitin có cấu tạo tinh thể bền vững, hiếm thấy ở trạng thái tự do mà thƣờng liên kết với protein bởi nối cộng hoá trị dƣới dạng Chitin - protein phức hợp. - Chitin không tan trong alcol, trong dung dịch acide và kiềm loãng hay đậm đặc, và các dung môi thông thƣờng. - Chitin có thể tan trong H2SO4 đậm đặc, H3PO4 78–97% và acide formide khan. - Trong dung dịch HCl, Chitin có độ triền quang thay đổi từ -140 đến +560. Sự thay đổi này chứng tỏ có sự thủy giải Chitin. - Độ phân tán của dung dịch keo Chitin trong các dung dịch muối trung tính ngậm nƣớc tƣơng đối cao. - Chitin hấp thụ tia hồng ngoại ở bƣớc sóng = 884-990 cm-1. - Trong môi trƣờng kiềm đun nóng Chitin sẽ bị khử một số nhóm Acetyl ra khỏi mạch polymer tạo thành dẫn xuất Chitosan. Một vài tính chất quan trọng của Chitin thƣơng phẩm [8] Các chỉ tiêu kỹ thuật Chitin Kích thƣớc 2 – 5 mm Độ ẩm < 10% Tro < 2% Protein < 3% Mùi Không mùi Màu Trắng 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác Billard quan sát trên loài giáp xác Decapoda cho biết sự tổng hợp của Chitin theo sau giai đoạn lột xác. Glycogen đƣợc sử dụng hoàn toàn và tích tụ khi lớp vỏ 19 mới đƣợc hình thành. Sự tổng hợp Chitin ở giáp xác liên quan đến việc sử dụng glycogen và nó phải chuyển sang dạng đơn giản hơn là D-glucose. Sự tổng hợp và phân hủy Chitin ở giáp xác rất tích cực vì phần lớn lớp vỏ bị tiêu hủy chỉ đƣợc hình thành lại sau mỗi lần lột xác. Trong giai đoạn này sự thiếu thức ăn làm vỏ mỏng hơn cho thấy khả năng sử dụng Chitin nhƣ một chất biến dƣỡng và dự trữ. 2.3.4. Ứng dụng của Chitin Từ những năm 30 của thế kỷ này, việc nghiên cứu về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất hoá lý và ứng dụng của Chitin đã đƣợc công bố. Cho đến nay, Chitin đƣợc đƣa vào ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, cả lĩnh vực công nghệ sinh học và đạt hiệu quả cao. Trong công nghiệp nhẹ - Trong công nghệ làm giấy, Chitin là một thành phần phụ gia rất tốt, đặc biệt cho giấy cao cấp. - Chitin đƣợc dùng để sản xuất vải, bao, dây điện và dụng cụ bảo hộ lao động do có khả năng chống nƣớc, lửa và chịu nắng. Trong công nghệ làm sạch môi trƣờng Chitin dùng để xử lý nƣớc thải công nghiệp, có khả năng tạo phức chất với những kim loại nặng, độc hại; dùng để lọc nƣớc sạch cho tiêu dùng. Trong công nghiệp thực phẩm - Chitin dùng để bảo quản thực phẩm, rau quả, ngăn cản sự phá huỷ của nấm mốc và vi sinh vật. - Khi sử dụng Chitin chất lƣợng nƣớc quả tốt hơn so với khi sử dụng các chất khác nhƣ: silicasol, gelatin,… - Chitin đƣợc sử dụng trong thực phẩm chế biến để thu hồi lƣợng protein hao hụt. - Chitin đƣợc dùng làm phụ gia thực phẩm với tác dụng làm đặc và chuyển thành sữa. Trong y tế +Ngành dƣợc Chitin có tác dụng ngăn chặn khả năng sinh sản và sự tồn tại đặc trƣng của loài Anophelles stephensi. Hợp chất Chitin-protein có khả năng diệt đƣợc giun sán mà không độc đối với cơ thể. 20 +Ngành y - Từ Chitin sản xuất ra Chitosan có thể dùng sản xuất chỉ khâu phẩu thuật mà không cần phải cắt chỉ. - Vì đƣợc chiết xuất từ phế liệu tôm, từ Chitin tạo Chitosan là nguồn nguyên liệu thiên nhiên sơ cấp để tạo ra glucosamine. Glucosamine, thƣờng kết hợp với chondroitin sulfate để điều trị bệnh viêm khớp xƣơng mãn tính, một bệnh phổ biến trên thế giới. - Chitosan đƣợc phát hiện có tác dụng tăng cƣờng vận chuyển thuốc qua các bề mặt biểu mô và vì vậy có thể sử dụng Chitosan kết hợp với thuốc để giúp chúng thu hút về các vị trí nhƣ niêm mạc mũi. Chitosan có thể mở các liên kết tế bào biểu mô nhờ đó cho phép thuốc đi qua. Tác dụng này có thể đƣợc sử dụng để đƣa thuốc vào cơ thể bằng cách xông qua mũi thay vì phải tiêm. - Kết hợp với máu, Chitosan có tác dụng làm đông máu. Vì vậy, sử dụng Chitosan để băng bó vết thƣơng. Chitosan còn có đặc tính kháng khuẩn, ngƣời ta hi vọng dùng băng chứa Chitosan để băng vết thƣơng giảm tỷ lệ nhiễm trùng. - Chitosan có tác dụng vận chuyển gen không có virut. Các dẫn xuất của Chitosan không độc và có hiệu quả tạo ra gen, nhất là các tế bào ung thƣ vú. Những đặc tính này rất đáng quan tâm, vì một ngày nào đó các dẫn xuất Chitosan có thể đƣợc dùng để tạo ra gen trong điều trị chống ung thƣ, cũng nhƣ các dạng thuốc khác. Trong mỹ phẩm Chitin dùng làm các chất phụ gia, kem bôi mặt, thuốc mềm da, tăng khả năng hoà tan sinh học giữa kem thuốc và da, chế tạo thuốc định hình tóc, kem bôi da, lột mặt. Trong nông nghiệp +Trong trồng trọt - Làm phân bón cho cây trồng, là chất kiểm soát sự phân li hơi chất hoá học nông nghiệp. - Chitin là thành phần chính trong thuốc phòng trừ sâu bệnh, dùng làm thuốc kích thích tăng trƣởng cho cây trồng. - Làm tăng độ nảy mầm hạt và tạo diệp lục tố trên lá, tăng khả năng tăng rễ, thúc đẩy quá trình ra hoa kết quả. +Trong chăn nuôi 21 Chitin dùng làm thức ăn tăng trọng cho gia súc, gia cầm, kìm hãm bệnh tiêu chảy ở gà thịt. Trong công nghiệp chế biến gỗ: làm tăng độ bền của gỗ. Trong công nghệ điện tử và bán dẫn: làm màng bọc lót các linh kiện. Trong công nghệ sinh học: dùng để cố định Enzyme và các tế bào sinh vật. Một số ứng dụng khác: Chitin bị sulfate hoá hoàn toàn, đƣợc dùng làm chất kết dính trong kem đánh răng, keo… 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam [2] 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới Năm 1971, Allan và cộng sự đã dùng Chitosan để kết tủa agaropectin trong agar và chiết agarose. Somchai đã báo cáo kết quả dùng Chitosan để làm giảm phần tử điện tích âm trong agaropectin và có thể nhận đƣợc agar tinh khiết hoặc agarose. Năm 1972, hãng Kyowa Oid and Fat của Nhật lần đầu tiên đƣa vào sản xuất công nghiệp Chitin. Năm 1977, Viện kỹ thuật Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác định giá trị của Chitin và protein trong vỏ tôm, cua, đã cho thấy việc thu hồi các chất này rất có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp, phần Chitin thu đƣợc, đƣợc dùng sản xuất ra các dẫn xuất có nhiều ứng dụng khác nhau. Sản lƣợng Chitin 1990 trên thế giới là 1200 tấn. Nƣớc sử dụng hàng đầu là Nhật (600 tấn/năm) và Mỹ (400 tấn/năm). Ngoài ra nhƣ Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp cũng đang triển khai thêm các cơ sở sản xuất ở qui mô 50 kg Chitin/ngày với giá bán ra là 200-300 France/kg. Ở Mỹ, hàng năm tổng giá trị về các chế phẩm Chitin-Chitosan sử dụng là 355 triệu USD, trong đó 190 triệu thuộc ngành y tế, sau đó nông nghiệp (54 triệu) và mỹ phẩm (50 triệu). Theo FAO, nhu cầu Chitin-Chitosan có thể lên tới 36700 tấn/năm trong thập kỷ tới. (Nguyễn Văn Khoa, 1994) Các phòng thí nghiệm của Malaysia và công nghiệp làm ngọt nƣớc biển đã thành lập công ty liên doanh Seafresh Chitosan để khai thác khả năng cung cấp thƣơng phẩm các chất thƣơng phẩm các chất dẫn xuất của tôm. Công ty này đặc biệt quan tâm với Chitin và polisaccharide từ vỏ tôm thải bỏ và hƣớng hoạt động chính vào các thị trƣờng xuất khẩu. 22 Theo tiến sĩ Arisol Alimuniar - giám đốc kỹ thuật, ông hy vọng sản xuất khoảng 150-180 triệu sản phẩm Chitin-Chitosan /năm góp phần cùng các nƣớc sản xuất chính khác nhƣ Nhật Bản, Mỹ, Na Uy, Canada và Nga. Giá cả của các loại sản phẩm Chitin-Chitosan biến động từ 30 USD đến 400 USD/kg tuỳ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm, lƣợng bán Chitin và Chitosan đạt khoảng 2 tỷ USD. (Nguyễn Đổng, 1994) Nhiều nƣớc nhƣ Nhật, Mỹ, Anh, Hội Chitin thuộc cộng đồng Châu Âu “ECCHIS” đã và đang nghiên cứu một cách có hệ thống và đề cập nhiều nội dung khoa học trong đó có việc ứng dụng Chitin nhƣ một chất hấp phụ trao đổi ion để tinh chế nƣớc giải khát. Hiện nay, có khoảng 10 công ty lớn, hầu hết ở Nhật, sản xuất Chitin – chitosan trên thế giới. Công ty Protan biopolymer, một trong những công ty lớn trên thế giới sản xuất Chitin – Chitosan đã nghiên cứu ra nhiều sản phẩm có nguồn gốc Chitin sử dụng để xử lý nƣớc, khử các ion kim loại độc, bọc hạt và nhiều ứng dụng khác trong nông nghiệp. Ngày nay, ngƣời ta tập trung vào các dẫn xuất của Chitin và khả năng ứng dụng của những dẫn xuất này. Toàn bộ quá trình hoạt động khoa học của R.A.A. Muzzarelli (Đại Học Y Khoa Ancona – Ý) tập trung vào Chitin và dẫn xuất của nó. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều quy trình sản xuất Chitin – Chitosan, với nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau, nhƣng chủ yếu là vỏ tôm, cua, ghẹ. 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam Việc nghiên cứu, sản xuất Chitin – Chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất, phục vụ đời sống là một vấn đề tƣơng đối mới ở nƣớc ta. Năm 1978, trƣờng Đại Học Thủy Sản bắt đầu nghiên cứu chiết tách Chitin – Chitosan. Trƣớc yêu cầu xử lý phế liệu thủy sản ngày càng cấp bách, trƣớc những thông tin khoa học, kỹ thuật mới về Chitin – Chitosan, cũng nhƣ tiềm năng thị trƣờng của chúng, đã thúc đẩy các nhà khoa học nƣớc ta bắt tay vào nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất Chitin – Chitosan ở bƣớc cao hơn, đồng thời nghiên cứu các ứng dụng của chúng ở các lĩnh vức khác nhau. Gần đây, khi Chitin – Chitosan trở thành nhu cầu trong nhiều ngành công nghiệp và có gía trị thì rất nhiều cơ quan nghiên cứu nhƣ: trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. 23 HCM, Đại Học Tổng Hợp TP. HCM, Đại Học Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ,… đã tập trung vào nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng công nghệ này. Tuy nhiên, chất lƣợng sản xuất và những ứng dụng của nó chƣa đƣợc đánh giá đầy đủ. Ở phía Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với Xí Nghiệp Thủy Đặc Sản Hà Nội sản xuất Chitosan và ứng dụng trong lĩnh vực nông nghiệp và có hiệu quả bƣớc đầu. Ở phía Nam, Trung Tâm Công Nghệ và Sinh Học Thủy Sản phối hợp với một số cơ quan khác nhƣ: Đại Học Y Dƣợc TP. HCM, Phân Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Khoa Học Nông Nghiệp Miền Nam đã và đang nghiêu cứu, sản xuất và ứng dụng Chitin – Chitosan trong các lĩnh vực: nông nghiệp, y dƣợc và mỹ phẩm. 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin Sơ đồ chung cho quá trình sản xuất Chitin Nguyên liệu Khử khoáng Khử protein Tẩy màu Chitin Nguyên liệu dùng trong sản xuất Chitin có thể sử dụng vỏ tôm, cua, ghẹ, nang mực,… Nguyên liệu có thể sử dụng nguyên liệu khô hoặc tƣơi. Tuy nhiên, việc sử dụng nguyên liệu khác nhau sẽ xử lý ở chế độ khác nhau. Chitin đã đƣợc tách chiết từ vỏ tôm từ hơn một thế kỉ nay, nhƣng cho đến nay việc tách chiết này vẫn đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp hóa học là chính. 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học Quy tắc chung: loại bỏ tạp chất (protein, khoáng, lipid) từ vỏ tôm. Ưu điểm: nhanh, dễ thực hiện Nhược điểm: - Tốn nhiều hóa chất - Gây ô nhiễm môi trƣờng - Ảnh hƣởng đến sức khỏe ngƣời lao động 24 - Chất lƣợng sản phẩm lại không cao. Chế phẩm Chitin nhận đƣợc thƣờng có màu vàng do tác động của các hóa chất đƣợc sử dụng trong quy trình tách chiết (đều ở nồng độ cao). Bên cạnh đó, trong phƣơng pháp này, quá trình khử protein đƣợc thực hiện bằng NaOH: + NaOH ảnh hƣởng đến độ nhớt của Chitosan, cụ thể hơn là NaOH cắt mạch polysaccharide của Chitin, làm giảm độ nhớt của Chitosan xảy ra trong quá trình deacetyl hoá. + Dịch thủy phân protein sẽ loại bỏ do lẫn kiềm đồng thời acid amin của thủy phân không còn giá trị đích thực của chúng. Phƣơng pháp của Heckman Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Sấy khô ở 1000C Nghiền thành bột Ngâm trong HCl 2N trong 48 giờ (có lắc hoặc khuấy liên tục) Ly tâm Trung hòa bằng dung dịch NaOH ở 1000C trong 12 giờ Tách cặn Rửa, ly tâm theo thứ tự: nƣớc, ethanol, ether Làm khô Nghiền tinh Bột Chitin có màu kem 25 Phƣơng pháp của Samuer P. Meyers và Keuns. Lee Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch và làm khô Xay nhuyễn, sàng Tách protein: NaOH 3,5%, 2 giờ, 650C Lọc, rửa sạch Tách vô cơ: HCl 1N, 30 phút, nhiệt độ phòng Lọc, rửa sạch Tẩy màu bằng Aceton Rửa sạch, làm khô ở 600C, 6 giờ Chitin Phƣơng pháp của Trƣờng Đại học Thủy sản (Nha Trang) Vỏ tôm tƣơi Rửa sạch Phơi khô Ngâm vỏ tôm trong HCl 5% ở nhiệt độ phòng, 48 giờ Rửa sạch Thủy phân bằng NaOH 8% ở 1000C trong 48 giờ Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 1%, H2SO4 10% trong 1 giờ Rửa sạch 26 Khử màu lần 2 bằng Na2S2O3 trong 15 phút Rửa sạch Sấy khô Chitin Phƣơng pháp của Nguyễn Thị Anh Đào và Nguyễn Thị Thu Thủy (LVTN, 1993) Phế liệu tôm Rửa sạch, tách thịt Vỏ tôm Rửa sạch, làm khô Tách protein bằng NaOH 3.5%, W:V= 1:15, 80 – 1000C 75 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch Tách vô cơ bằng HCl 1N, W:V= 1:10 ( Tôm thẻ) = 1:15 (Tôm choáng) Ở nhiệt độ phòng, 60 phút (Tôm thẻ), 90 phút (Tôm choáng) Rửa sạch, làm khô Chitin thô Tẩy màu bằng Javel W:V=1:20-1:30, 10 phút hoặc H2O2 3% / NaOH 5%, W:V= 1:20-1:30, 3 giờ (Tôm thẻ), 4 giờ (Tôm choáng) Chitin 27 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học Trong thời gian gần đây, phƣơng pháp chế biến sinh học, sử dụng các Enzyme protease để khử protein trong nguyên liệu để thay thế cho NaOH, Enzyme này có thể có nguồn gốc từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật đã đƣợc nghiên cứu và bƣớc đầu áp dụng để thay thế phƣơng pháp hóa học nhằm hạn chế những khiếm khuyết do phƣơng pháp hóa học gây ra. Trong các loại protease thì chimotripsin papain và protease của vi sinh vật đƣợc sử dụng hiệu quả. * Trần Thị Luyến và cộng tác viên trƣờng Đại học Thủy Sản đã nghiên cứu thành công sử dụng Enzyme papain làm tác nhân thủy phân protein của vỏ tôm trong công nghệ sản xuất Chitin theo quy trình sau: Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/10V, Ngâm HCl 10%, tỉ lệ 1W/5V, nhiệt độ phòng trong 5 giờ nhiệt độ phòng trong 5 giờ Rửa sạch Khử protein bằng papain 13%, tỉ lệ 1W/5V, pH=5 ÷ 5.5, 70-800C, 4 giờ Rửa sạch Tẩy màu Làm khô ở 600C Chitin Quy trình papain cho sản phẩm có độ nhớt cao, đặc biệt độ deacetyl cao. Nhƣ vậy, để nâng cao chất lƣợng của Chitosan có thể sử dụng Enzyme papain thay thế cho NaOH khử vỏ tôm. 28 Ngoài ra, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam còn tách chiết Chitin nhờ sử dụng Enzyme bromelin từ dịch ép vỏ dứa – Enzyme với hoạt tính thủy phân protein mạnh theo quy trình sau [5]: Vỏ dứa Vỏ + đầu tôm tƣơi Nghiền nhỏ Phơi khô Chiết rút Enzyme protease Sấy lại cho khô giòn ở 400C bằng nƣớc máy từ 2-3 lần Nghiền nhỏ Xử lý bột đầu - vỏ tôm với dịch ép vỏ dứa đến khi toàn bộ lƣợng khoáng trong nguyên liệu bị loại bỏ hết (thử với dung dịch HCl) Rửa sạch Lƣợng protein còn lại đƣợc loại bỏ tiếp bằng dung dịch NaOH 1% hoặc 2% Rửa sạch Tẩy màu với KMnO4 0.1%, C2H2O4 1% Sấy khô Chitin Ưu điểm của phương pháp: - Sử dụng nguồn protease từ nƣớc ép vỏ dứa, hoàn toàn không cần đến HCl, một thành phần quan trọng hàng đầu không thể thiếu trong phƣơng pháp hóa học để loại bỏ chất khoáng. - Tốn ít NaOH - Hiệu suất thu hồi Chitin cao hơn - Chất lƣợng chế phẩm Chitin cũng tốt hơn phƣơng pháp hóa học thông thƣờng. Nhược điểm: Mất nhiều thời gian hơn phƣơng pháp hóa học. 29 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm của phòng Các chất có hoạt tính sinh học - Viện Sinh học nhiệt đới. 3.2. Nguyên liệu Nội tạng và vỏ tôm dùng trong thí nghiệm đƣợc thu về từ các công ty chế biến thủy sản trong thành phố. Nội tạng đƣợc thu trực tiếp tại bàn xử lý của phân xƣởng chế biến các công ty trên, sau đó cho vào các túi PE, cấp đông và bảo quản ở - 200C. Hình 3.1: Nội tạng tôm Vỏ tôm tƣơi rửa sạch. Một phần để ráo trên rổ thƣa trong 30 phút, đem xay nhỏ. Một phần đem phơi khô, sau đó sấy lại cho khô giòn ở 400C rồi xay nhỏ. Đây là 2 nguồn nguyên liệu vỏ tôm khô và tƣơi để thu nhận Chitin. 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng  Hoá chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong phòng thí nghiệm.  Các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng: - Cân điện tử 2200g độ chính xác 10-6(g) SATORIUS – CHLB Đức - Máy đo quang phổ UV - Vis - Máy ly tâm lạnh ROTINA - CHLB Đức - Máy đo pH – PHM 83 Autical pH meter – Đan Mạch - Bể ổn nhiệt 30 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu [4] 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford Ưu điểm - Dễ sử dụng, hoá chất đơn giản (chỉ cần một loại thuốc thử) - Độ nhạy cao (có thể phát hiện protein ở hàm lƣợng 1-20 g) - Ít tốn thời gian - Phức chất giữa thuốc nhuộm và protein tƣơng đối ổn định. - Phƣơng pháp này ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là Amoniumsulfate. Hoá chất và thiết bị Hoá chất Dung dịch Albumin chuẩn Thuốc thử Bradford Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh Hình 3.3: Bể ổn nhiệt Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis 31 Thiết bị Máy đo quang phổ UV-Vis Nguyên tắc Phƣơng pháp này dựa trên sự thay đổi bƣớc sóng hấp thu cực đại và sự thay đổi màu xảy ra khi Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong dung dịch Acid. Trong dung dịch mang tính Acid khi chƣa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bƣớc sóng hấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang màu xanh dƣơng và hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nnm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue có màu da cam đỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein, tƣơng tác với tất cả các nhóm kị nƣớc và các nhóm mang điện tích dƣơng trên phân tử protein. Trong môi trƣờng của các gốc mang điện tích dƣơng, sự proton hoá không xảy ra và màu xanh xuất hiện. Màu sẽ xuất hiện trong 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Các bước tiến hành Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đƣờng chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết đƣợc nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta đƣợc ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với lƣợng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl (ODo). Lấy giá trị OD = ODx-ODo. Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đƣờng chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tƣơng ứng trên trục hoành. Dựng đƣờng chuẩn Albumine Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0,10, 20, 30, 40, 50 g/ml. Lập các ống nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Nồng độ dung dịch Albumine ( g/ml) 0 10 20 30 40 50 Dung dịch Albumine (ml) 1 1 1 1 1 1 Dung dịch thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 Ống 0 tƣơng ứng với thời gian xuất phát ban đầu 0 phút, thực hiện phản ứng ở các ống còn lại 1,2,3,4,5, mỗi ống cách nhau 1 phút. 32 Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bƣớc sóng 595 nm. Đồ thị đƣờng chuẩn protein đƣợc lập ở hình 3.5 (Phụ lục trang 61) Định lƣợng protein trong mẫu thí nghiệm Lấy 1 ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bƣớc sóng 595 nm. Từ đó suy ra hàm lƣợng protein có trong mẫu thí nghiệm. Mẫu đƣợc pha loãng sao cho mật độ quang đo đƣợc trong khoảng đƣờng chuẩn. Mật độ quang của mẫu trừ đi mật độ quang của ống đối chứng, chiếu vào đƣờng chuẩn để suy ra lƣợng protein có trong dung dịch mẫu thí nghiệm ( g/ml). 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano) Hóa chất HCl 0,1 M Na2CO3 0,4M Dung dịch Trichloacetic (TCA 0,4 M) Tyrosin tinh khiết Thuốc thử Folin Đệm phosphat pH = 7; 0,1 M Dung dịch Casein 1% Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV - Vis Máy đo pH Nguyên tắc Dùng protein casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của Enzyme protease trên cơ sở định lƣợng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thủy phân dƣới tác dụng của Enzyme. Hoạt động của Enzyme đƣợc biểu diễn bằng đơn vị hoạt tính thủy phân protein của Enzyme. 33 Các bước tiến hành Xây dựng đƣờng chuẩn Tyrosin Pha dung dịch Tyrosin ở các nồng độ khác nhau: 10, 20, 30, 40, 50 g/ml dung dịch HCl. Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào 1 ml dung dịch Tyrosin đã pha trên. Thêm 1 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 5 lần vào dung dịch hỗn hợp. Trộn đều, để yên dung dịch ở 470C ±0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50. Đối với ống đối chứng: Dùng 1 ml HCl 0,1M thay cho Tyrosin. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bƣớc sóng 660nm, ghi nhận kết quả là As0. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 5 trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ đƣợc giá trị OD1 đến OD5. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protease. Đồ thị này gọi là đƣờng chuẩn Tyrosin ở hình 3.6 (Phụ lục trang 61) Xác định hoạt tính Enzyme protease Cho 1 ml dung dịch Casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 470C ±0,50C trong 10-15 phút. Cho 1 ml dịch chiết Enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 470C ±0,50C trong 1 giờ. Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng Enzyme. Để yên dung dịch trong 25 phút, lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Hút 1 ml dịch lọc . Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1 ml dịch lọc. Thêm vào 1 ml thuốc thử Folin. Trộn đều, để yên ở 470C ±0,50C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 660nm (ghi nhận kết quả này là Am). Mẫu đối chứng: Lấy 1 ml nƣớc cất thay cho 1 ml dung dịch Enzyme và tiến hành các bƣớc nhƣ mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả này là A0. Tính toán Nguyên tắc 34 Hàm lƣợng Tyrosin đƣợc giải phóng do protease thủy phân đƣợc tính bằng cách lấy (Am- A0) rồi lấy kết quả so với đƣờng chuẩn Tyrosin để xác định hoạt độ protease. Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) Enzyme protease đƣợc xác định là lƣợng Enzyme để tạo ra lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g Tyrosin trong 1 ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm. Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/ml)= (Am- A0)*F*n*1/100 Hoạt tính Enzyme protease (ĐVHT/g)= (Am- A0)*F*n*1/100*V/m F= [(10/As10-A0)+(20/As20-A0)+(30/As30-A0)+(40/As40-A0)+(50/As50-A0)]/5 Am: độ hấp thu của mẫu A0: độ hấp thu của ống đối chứng F : hệ số tƣơng quan giữa hàm lƣợng Tyrosin và độ hấp thu ở bƣớc sóng 660nm trên đƣờng chuẩn. n: hệ số pha loãng của Enzyme 1/100: hệ số chuyển đổi V: thể tích của dung dịch Enzyme m: khối lƣợng chế phẩm Enzyme thô. 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease từ nội tạng tôm [4] Quá trình tách chiết thu Enzyme đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0- 4 0C) để hạn chế sự biến tính của protein – Enzyme dƣới tác động của môi trƣờng. Quy trình Nội tạng tôm Nghiền mịn Chiết rút Enzyme protease Ly tâm thu dịch chiết Dịch chiết Enzyme thô Kết tủa Enzyme protease (cặn tủa) Ly tâm thu chế phẩm thô Chế phẩm Enzyme protease thô 35 Thu nhận chế phẩm Enzyme protease thô bằng máy đông khô. Chế phẩm thô này đƣợc bảo quản trong ngăn đá ở nhiệt độ -200C và sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm. Các bước tiến hành Nội tạng đƣợc nghiền mịn với cát thạch anh trong cối inox đặt trong đá vụn. + Chiết rút thu dịch chiết Dùng nƣớc muối sinh lý 0,9% đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh với tỷ lệ dung môi/mẫu = 3/1 trong 40 phút. Trong quá trình chiết khuấy đảo liên tục, ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch chiết. + Thu nhận chế phẩm protease Kết tủa thuận nghịch protein – Enzyme trong dịch chiết thu đƣợc bằng tác nhân thích hợp: Ethanol 960 (cồn) với tỷ lệ Ethanol: dịch chiết = 4:1 trong 60 phút. Cồn đã đƣợc làm lạnh trong tủ lạnh cho từ từ vào dịch chiết đến tỷ lệ gây tủa protease, giữ lạnh 0-40C trong 60 phút, sau đó ly tâm tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút thu chế phẩm thô. Xác định hoạt tính của Enzyme chế phẩm thô theo phƣơng pháp Amano. 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm Việc sản xuất Chitin bằng cách ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm để loại protein đƣợc thực hiện theo quy trình sau: Vỏ tôm (tƣơi, khô) Xử lý Xay nhỏ Thủy phân protein trƣớc Khử khoáng trƣớc Nồng độ 3÷8% Nhiệt độ bt÷70 0 C pH 3÷9 Xử lý với Enzyme protease thô Xử lý với HCl, trong 5 giờ, t 0 phòng Thời gian 1÷6 giờ tỷ lệ: tƣơi (1W/5V), khô (1W/10V) Xác định hàm lƣợng protein trong dịch thủy phân Rửa sạch Dịch lọc Lọc (còn hàm lƣợng protein) Xử lý với Nhiệt độ bt÷70 0 C Sử dụng làm Vỏ tôm Enzyme protease thô pH 3÷9 thức ăn gia súc Thời gian1÷6 giờ 36 Rửa sạch Xác định hàm lƣợng protein trong dịch thủy phân Xử lý với HCl, trong 5 giờ, t 0 phòng Lọc Dịch lọc tỷ lệ: tƣơi (1W/5V), khô (1W/10V) (còn hàm lƣợng protein) Rửa sạch Vỏ tôm Sử dụng làm thức ăn gia súc Chitin thô Rửa sạch Chitin thô Chitin thô Tẩy màu với KMnO4 1%; H2SO4 10%; trong 1,5 giờ Rửa sạch Tẩy màu lần 2 với Na2S2O3 2%, trong 15 phút Rửa sạch Làm khô Chitin Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Các bước tiến hành - Giai đoạn khử khoáng Trong vỏ tôm, thành phần khoáng chủ yếu là CaCO3, Ca3(PO4)2 nên chúng tôi chọn HCl để khử khoáng, vì sau khi khử khoáng các muối Clorua tạo thành hòa tan trong nƣớc đƣợc rửa trôi đi ở công đoạn rửa. - Giai đoạn rửa Công đoạn này có tác dụng rửa trôi hết lƣợng CaCl2 tạo thành và đồng thời loại bỏ lƣợng HCl dƣ. - Giai đoạn khử protein Việc dùng chế phẩm Enzyme protease từ nội tạng tôm có tác dụng: thủy phân protein trong liên kết Chitin – protein và một số protein khác để giải phóng các axit amin, các liên kết peptid thấp phân tử, NH3,… 37 - Giai đoạn rửa Chitin thô tạo thành đƣợc rửa sạch nhằm loại hết lƣợng Enzyme protease dƣ và protein hòa tan. - Giai đoạn khử màu Công đoạn khử màu thƣờng tùy thuộc vào nguyên liệu, trong vỏ tôm thƣờng tồn tại sắc tố chủ yếu là Asthaxanthin. KMnO4 là chất oxy hóa mạnh. Nhiều nghiên cứu cho thấy KMnO4 còn có tác dụng khử một số tạp chất do trong quá trình ngâm Axit và khử protein một số tạp chất chƣa bị khử. Vì vậy, để khử màu trong sản xuất Chitin, tôi sử dụng KMnO4 / H2SO4. Tuy nhiên, cần nghiên cứu hàm lƣợng Na2S2O3 thích hợp để tẩy màu của KMnO4 dƣ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian xử lý thích hợp. Trong quá trình khử phải luôn khuấy đều để màu bay hơi đƣợc đều đặn. Khử cho đến màu tím của KMnO4 mất hết. 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm [3] 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo các nồng độ khác nhau với nhiệt độ = 370C pH = 7 thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc nồng độ thích hợp (đo hàm lƣợng protein hòa tan giảm mạnh nhất) 3% 4% 5% 6% 7% 8% 38 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp ở các nhiệt độ khác nhau với pH = 7 thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc nhiệt độ thủy phân thích hợp 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp, nhiệt độ thủy phân thích hợp với pH khác nhau với thời gian = 4 giờ tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc pH thủy phân thích hợp 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp Vỏ tôm tƣơi Vỏ tôm khô Xử lý Xử lý 5 6 7 8 9 4 3 Nhiệt độ phòng 40 0 C 45 0 C 50 0 C 70 0 C 39 Xử lý với Enzyme protease thô theo nồng độ thích hợp, nhiệt độ thích hợp, pH thích hợp với thời gian khác nhau với tỷ lệ vỏ tôm/dịch thủy phân = 1W/10V Đo hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease Chọn đƣợc thời gian thủy phân tốt nhất Khảo sát xem dùng Enzyme protease thủy phân vỏ tôm với các thông số nào thì thu đƣợc Chitin tốt nhất. 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu - Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 mẫu, lấy kết quả trung bình cộng của 3 mẫu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm. - Số liệu đƣợc xử lý để vẽ đồ thị trên phần mềm Excel với hệ số tƣơng quan R≥0.95. 6 4 giờ 6 giờ 5 giờ 3 giờ 2 giờ1 giờ 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân Nồng độ Enzyme là một trong những yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình thủy phân. Vì vậy, muốn tìm điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân, việc xác định nồng độ Enzyme thích hợp là điều cần thiết đầu tiên. Nồng độ Enzyme quá thấp thì không đủ lƣợng để thủy phân, còn nồng độ Enzyme cao quá mức tới hạn thì tốc độ phản ứng tăng chậm, thậm chí không tăng, điều này là hao phí và không cần thiết. Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ sau: thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nhiệt độ = 37 0C, pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme thay đổi: 3, 4, …, 8%. Thu dịch thủy phân, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính Enzyme protease dịch thủy phân của từng mẫu thí nghiệm. Trên cơ sở kết quả đo hàm lƣợng protein, xác định đƣợc nồng độ chế phẩm thô protease thủy phân thích hợp (đo hàm lƣợng protein giảm mạnh nhất). Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.1a và 4.1b (Phụ lục trang 62) và biểu diễn trên hình 4.1a và 4.1b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô 41 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân từ 3% đến 6%, sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh và tƣơng đối đều. - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân ở cả vỏ tôm khô và tƣơi đạt 6%, hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân giảm đạt giá trị cực đại. - Khi nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân từ 7% trở đi (7;8%;…), lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm. Điều này đƣợc giải thích nhƣ sau: - Khi nồng độ Enzyme thấp 3-5%, lƣợng Enzyme thấp không đủ thủy phân vỏ tôm nên hàm lƣợng protein giảm không nhiều. - Khi nồng độ Enzyme tăng quá 6% (7;8%;…), lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân càng tăng (lƣợng protein tăng này là của Enzyme cao chênh lệch so với 6%) nhƣng hàm lƣợng protein vỏ tôm không đổi nên lƣợng Enzyme chênh lệch này trở nên dƣ thừa khi dùng thủy phân cùng một lƣợng vỏ tôm nên tăng nồng độ Enzyme quá 6% thì hàm lƣợng protein tiếp tục giảm. Vì vậy, ta chỉ cần sử dụng Enzyme ở nồng độ 6% là thích hợp thủy phân vỏ tôm để tránh hao phí và không cần thiết. - Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân thích hợp ở cả vỏ tôm khô và tƣơi là 6%, do khi xét trong cùng một lƣợng vỏ tôm, hàm lƣợng protein hòa tan ở cả vỏ tôm khô và tƣơi chênh lệch không đáng kể: 42 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 32 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Nguyên liệu Hàm lƣợng protein ( g/ml) Vỏ tƣơi 125,7 Vỏ khô 116,4 ( Nguồn từ thực nghiệm) 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân Sau khi xác định đƣợc nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, tiến hành xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.2a và 4.2b ( Phụ lục trang 63) và biểu diễn trên hình 4.2a và 4.2b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 32 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tínhEnzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 43 Nhận xét - Ở nhiệt độ phòng (320C) hoạt tính Enzyme hoạt động yếu nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan không cao. - Ở nhiệt độ 32-550C (đối với vỏ khô) và 32-600C (đối với vỏ tƣơi), do nhiệt độ càng tăng thì tốc độ phản ứng càng tăng nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng nhiệt độ này tăng đều và mạnh. - Ở nhiệt độ 55-650C (đối với vỏ khô) và 60-650C (đối với vỏ tƣơi), hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm và giảm mạnh nhất ở nhiệt độ 700C do tăng nhiệt độ từ 60 0C trở đi (đối với vỏ khô) và 650C (đối với vỏ tƣơi), protein bắt đầu bị biến tính và mất hoạt tính mạnh ở 700C. Như vậy: Nhiệt độ thủy phân thích hợp với vỏ tôm khô là ở 550C và với vỏ tôm tƣơi là ở 60 0C. Khoảng nhiệt độ này (55-600C) nằm trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho chế phẩm thô protease nội tạng tôm hoạt động tốt (ở 570C) [4]. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Ths. Nguyễn Văn Lệ về đầu tôm Bộp [6]. Nếu so sánh với kết quả thủy phân protein của thịt cá bằng Enzyme protease nội tạng cá Thu, cá Ngừ và gan mực ống [3] hay với protease B. subtilis S5 [7], thì kết quả này cũng tƣơng đồng. Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm vì để phát huy tối đa hoạt tính thủy phân protein của Enzyme nội tạng tôm cần duy trì nhiệt độ cao (55-600C). Khoảng nhiệt độ này không phải là khoảng nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật gây thối rửa nên tôm thủy phân bằng Enzyme nội tạng tôm ở khoảng nhiệt độ này sẽ không bị hƣ hỏng trong thời gian ngắn dù không sử dụng chất chống thối. 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân pH môi trƣờng có ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình thủy phân. Vì vậy, việc xác định giá trị pH thích hợp cho quá trình thủy phân là rất cần thiết. Sau khi xác định đƣợc nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm khô là 550C, vỏ tôm tƣơi là 600C, tiến hành xác định pH thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 550C, với vỏ tƣơi ở 600C. Kết quả đƣợc 44 trình bày ở bảng 4.3a và 4.3b (Phụ lục trang 64) và biểu diễn trên hình 4.3a và 4.3b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tínhEnzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Trong khoảng pH = 3-6, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng đều. - Trong khoảng pH = 8-9, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan giảm đều. - Tại giá trị pH = 7, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan đạt giá trị cực đại. Giá trị pH môi trƣờng này phù hợp với pH tối ƣu cho hoạt động thủy phân của chế phẩm protease thô. - Vì Enzyme protease tôm là các protease hoạt động mạnh trong môi trƣờng từ trung tính đến kiềm nên mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng pH = 7-9 45 nhiều hơn mức độ giảm của hàm lƣợng protein trong khoảng pH = 3–6 (do đây là môi trƣờng Axit, Enzyme protease không hoạt động mạnh). 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp là 6%, nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm khô là 550C, vỏ tôm tƣơi là 600C, pH= 7, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4a và 4.4b (Phụ lục trang 65) và biểu diễn trên hình 4.4a và 4.4b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi: - Trong khoảng thời gian 1-3 giờ, hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh nhƣng vẫn chƣa đủ để thủy phân hầu hết lƣợng protein của vỏ tôm. - Thời gian thủy phân thích hợp nhất khi đạt đƣợc 4 giờ. Lúc này, hiệu suất thủy phân cao đồng thời đảm bảo chất lƣợng sản phẩm tốt [3]. Thời gian thủy phân 4 giờ 0 10 20 30 40 50 6 7 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) 46 đủ dài để Enzyme phân cắt các liên kết trong cơ chất là vỏ tôm, tạo thành các sản phẩm cần thiết của quá trình thủy phân. - Từ 5 giờ trở đi (5; 6; 7 giờ), mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng không đáng kể so với tại thời điểm 4 giờ. Do vậy, để tránh lãng phí về thời gian và lợi ích về kinh tế chọn thời gian thủy phân lúc 4 giờ là thích hợp. 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: nồng độ Enzyme thủy phân là 6%, pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.5a và 4.5b (Phụ lục trang 66) và biểu diễn trên hình 4.5a và 4.5b dƣới đây: 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 27 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Nhận xét - Ở nhiệt độ bình thƣờng (270)-600C mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Ở nhiệt độ 600C hàm lƣợng protein giảm đạt giá trị cực đại. - Ở nhiệt độ 65-700C hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm do trong khoảng 65- 70 0C protein bắt đầu bị biến tính làm cho hoạt tính Enzyme giảm. 47 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 27 40 45 50 55 60 65 70 Nhiệt độ ( 0 C) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Nhận xét - Ở nhiệt độ bình thƣờng (270)-550C mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Ở nhiệt độ 550C hàm lƣợng protein giảm đạt giá trị cực đại. - Ở nhiệt độ 60-700C hàm lƣợng protein hòa tan bắt đầu giảm do trong khoảng 60- 70 0C protein bắt đầu bị biến tính nên hoạt lực Enzyme cũng giảm theo. Như vậy: Nhiệt độ thủy phân thích hợp nhất đối với vỏ tôm khô sau khử khoáng là ở 60 0C, đối với vỏ tôm tƣơi là ở 550C. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.2 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ thủy phân thích hợp đối với vỏ tôm sau khử khoáng, tiến hành xác định pH thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 600C, với vỏ tƣơi ở 550C. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6a và 4.6b (Phụ lục trang 67) và biểu diễn trên hình 4.6a và 4.6b dƣới đây 48 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 3 4 5 6 7 8 9 pH % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 3 4 5 6 7 8 9 pH % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi sau khử khoáng: - Trong khoảng pH 3-6, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan tăng đều. - Trong khoảng pH 8-9, mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan giảm đều. - Tại giá trị pH = 7 (pH trung tính), mức độ giảm của hàm lƣợng protein hòa tan đạt giá trị cực đại. Điều này hoàn toàn phù hợp với pH thích hợp cho hoạt động thủy phân của chế phẩm thô protease. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.3 49 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Sau khi xác định đƣợc nhiệt độ và pH thủy phân thích hợp, tiến hành xác định thời gian thủy phân thích hợp bằng cách bố trí thí nghiệm theo cách sau: Thí nghiệm đƣợc giữ ở điều kiện: pH = 7, trong thời gian 4 giờ, tỷ lệ vỏ tôm / thể tích dịch Enzyme = 1/10 với nồng độ Enzyme 6%, nhiệt độ với vỏ khô ở 600C, với vỏ tƣơi ở 550C. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.7a và 4.7b (Phụ lục trang 68) và biểu diễn trên hình 4.7a và 4.7b dƣới đây 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % gi ảm (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1 2 3 4 5 6 Thời gian thủy phân (giờ) % giả m (% ) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Hàm lượng protein giảm (%) 50 Nhận xét Ở cả vỏ tôm khô và tƣơi sau khử khoáng: - Trong khoảng thời gian 1- 4 giờ, hàm lƣợng protein hòa tan tăng mạnh. - Từ 5 giờ trở đi, hàm lƣợng protein hòa tan hầu nhƣ không tăng. - Thời gian thủy phân tốt nhất khi đạt đƣợc 4 giờ. Điều này đƣợc giải thích tƣơng tự nhƣ ở mục 4.1.4 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc Nguyên liệu Khối lƣợng nguyên liệu ban đầu (g) Lƣợng Chitin thu đƣợc (g) Hiệu suất tách chiết Chitin (%) Vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc 100 19 19 Vỏ khô khử khoáng trƣớc 100 24,2 24,2 Vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc 100 18,08 18,08 Vỏ khô thủy phân protein trƣớc 100 20,6 20,6 Nhận xét - Ở cả 2 nhóm khử khoáng trƣớc và thủy phân protein trƣớc: vỏ khô đều cho hiệu suất cao hơn và màu sắc tƣơi, trắng hơn vỏ tƣơi: + Ở nhóm khử khoáng trƣớc: hiệu suất của vỏ khô là 24,2% và vỏ tƣơi là 19%. + Ở nhóm thủy phân protein trƣớc: hiệu suất của vỏ khô là 20,6% và vỏ tƣơi là 18,08%. - Nhóm khử khoáng trƣớc cho hiệu suất cao hơn và và màu sắc tƣơi, trắng hơn nhóm thủy phân protein trƣớc: + Hiệu suất của vỏ khô khử khoáng trƣớc là 24,2% và vỏ khô thủy phân protein trƣớc là 20,6%. + Hiệu suất của vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc là 19% và vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc là 18,08%. 51 Nguyên liệu Sản phẩm Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm Vỏ tôm khô Vỏ tôm tƣơi Chitin vỏ khô khử khoáng trƣớc Chitin vỏ khô thủy phân protein trƣớc Chitin vỏ tƣơi thủy phân protein trƣớc Chitin vỏ tƣơi khử khoáng trƣớc 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua 3 tháng nghiên cứu thực nghiệm, đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với vỏ tôm thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân thích hợp: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân thích hợp ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với vỏ tôm khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân thích hợp: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân thích hợp ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân thích hợp ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. 5.2. Đề xuất ý kiến - Tiếp tục khảo sát nồng độ Enzym thích hợp cho quá trình thủy phân vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc. - Theo dõi pH trong quá trình thủy phân nhằm kiểm soát chặt chẽ quá trình tối ƣu hóa. - Trang bị thêm nhiều thiết bị phục vụ nghiên cứu về Enzyme và phục vụ sản xuất chế phẩm Enzyme từ nội tạng tôm cũng nhƣ các động vật thủy sinh khác. - Điều kiện thí nghiệm tốt hơn và thời gian giới hạn của đề tài đủ dài để có thể kiểm soát chất lƣợng Chitin tốt hơn. - Tiếp tục nghiên cứu phƣơng pháp tẩy màu tốt hơn. - Thực hiện tối ƣu hóa quá trình thu nhận chế phẩm Enzyme thô. - Thực hiện tối ƣu hóa quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng Enzyme protease từ đầu tôm để có thể áp dụng vào quy mô công nghiệp. 53 - Nghiên cứu phát triển công nghệ sản xuất các chế phẩm protease thƣơng mại từ nội tạng và đầu tôm cũng nhƣ các loài động vật thủy sinh, đáp ứng yêu cầu Enzyme protease của các cơ sở sản xuất, thay thế nguồn Enzym nhập khẩu. - Tiếp tục nghiên cứu, phát triển ứng dụng chế phẩm protease thủy sản trong các lĩnh vực chế biến thủy sản, công nghiệp thực phẩm và các lĩnh vực khác của sản xuất và đời sống, tạo đầu ra cho ngành sản xuất Enzyme. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1]. Phan Huỳnh Anh, 2007. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến việc tách chiết và tính chất của Enzyme protease từ nội tạng và đầu tôm sú (Penaeus Monodon). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân khoa học, Đại học Mở TP. HCM. [2]. Vũ Ngọc Bội, 2004. Nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng Enzyme protease từ B. subtilis S5. Luận án tiến sĩ sinh học, trƣờng Khoa học tự nhiên - Đại học quốc gia TP. HCM. [3]. Lê Công Chánh, 2000. Nghiên cứu chiết rút Chitin từ nang mực. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Thủy sản, Đại học Thủy sản, Nha Trang. [4]. Nguyễn Văn Lệ, 1996. Nghiên cứu và sử dụng proteinaza đầu tôm trong chế biến thủy sản. Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, trƣờng Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. [5]. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh tập I, Nhà xuất bản Đại học quốc gia TP. HCM. [6]. Đỗ Văn Ninh, 2003. Tối ưu hóa quá trình thủy phân protein của protease trong thịt cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein được thủy phân. Luận án tiến sĩ kỹ thuật, Đại học Thủy sản, Nha Trang. [7]. Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú, Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện KH và CN Việt Nam, số 2/2006. Phương pháp Enzyme tách chiết Chitin từ vỏ tôm. Tạp chí Dƣợc liệu, tập 11, trang 77 – 80. [8]. Khoa Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, 2004. Công nghệ Enzyme, 113 trang. INTERNET [9]. [10]. [11]. 55 PHỤ LỤC Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease * Công thức tính hiệu suất thu Chitin: bằng phƣơng pháp trọng lƣợng H = (mChitin / mvỏ tôm)*100 (%) Trong đó: H : hiệu suất thu Chitin (%) mChitin: khối lƣợng Chitin thu đƣợc (g) mvỏ tôm : khối lƣợng vỏ tôm nguyên liệu (g) 56 Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trìnhthủy phân vỏ tôm tƣơi Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 0 0 3 146,1 128,14 12,3 12512 6408,65 48,78 4 152,9 121,4 20,6 15876,67 5136,1 67,65 5 163,26 110,2 32,5 19283,67 4628,08 76 6 181,97 109,09 40,05 21568,33 3826,22 82,26 7 198,69 123,94 37,62 26804,33 7290,78 72,8 8 208,92 172,57 17,4 27004 8452,25 68,7 Nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân (%) Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thủy phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 0 0 0,00 3 190,8 147,35 22,77 22295 11985,8 46,24 4 197,35 134,24 31,98 24229 9102,84 62,43 5 206,64 123,36 40,3 30190 7517,31 75,10 6 213,94 111,89 47,7 34097 5871,5 82,78 7 216,55 125,36 42,11 37194 10808,6 70,94 8 226,21 160,36 29,11 37748,3 12925,02 65,76 57 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 60,06 0 15885 0,00 Sau 4 giờ 32 56,41 6,08 8747 44,5 40 48,53 19,19 7679 51,66 45 41,98 30,1 6941 56,30 50 35,45 40,98 6884,3 56,66 55 12,55 79,10 4591,3 71,10 60 13,8 77,02 4946,3 68,86 65 19,31 67,85 6183 61,08 70 55,09 8,28 8755 44,94 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi Thời gian thủy phân (giờ) Nhiệt độ ( 0 C) Tổng hoạt tính Enzyme protease (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) Lúc 0 giờ 51,23 0 16859 0 Sau 4 giờ 32 42,19 2,50 12140,7 27,99 40 36,3 17,65 11664 30,81 45 33,18 29,14 8089 52,02 50 38,3 35,24 7908,7 53,09 55 12,75 75,11 7257,7 56,95 60 7,43 85,50 5958,3 64,66 65 10,56 79,39 6135,7 63,6 70 48,92 4,51 9690,7 42,52 58 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô pH Tổng hoạt tính Enzyme protease lúc 0 giờ (UI) Tổng hoạt tính Enzyme protease sau 4 giờ thuỷ phân (UI) Hoạt tính Enzyme protease giảm (%) Tổng hàm lƣợng protein lúc 0 giờ (µg) Tổng hàm lƣợng protein sau 4 giờ thủy phân (µg) Hàm lƣợng protein giảm (%) 3 38,61 36,75 4,82 8350,39 5909,57 29,93 4 40,90 34,44 15,80 8404,24 4530,73 46,09 5 42,70 32,79 23,21 9552,33 4149 56,57 6 44,21 31,27 29,26 9189,33 3672,98 60,03 7 48,03 27,81 42,10 124