Khóa luận Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN VĂN NAM ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Khóa : 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr. NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms. NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại viện. Cô Nguyễn Lệ Hà, người đã tận tình hướng dẫn giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị cán bộ nghiên cứu của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi thực tập nghiên cứu đề tài tại trung tâm. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài. Các bạn thực tập cùng phòng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu đề tài. Con cảm ơn cha me, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành trang cho con bước vào đời. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:  PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.  Ths. Nguyễn Lệ Hà. Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease. Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris- HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... IV TÓM TẮT KHÓA LUẬN ....................................................................................... V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ IX DANH SÁCH CÁC BẢNG ...................................................................................... X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ........................................................................ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI ........................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME ............................................................. 3 2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme .............................................. 3 2.1.2. Định nghĩa về enzyme ............................................................................... 4 2.1.3. Cấu tạo phân tử ......................................................................................... 4 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại ............................................................... 6 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme .......................................... 6 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM ............................... 8 2.2.1. Giới thiệu về tôm ....................................................................................... 8 2.2.2. Khái quát protease .................................................................................. 10 2.2.2.1. Định nghĩa protease ......................................................................... 10 2.2.2.2. Protease của tôm .............................................................................. 11 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc .............. 12 a). Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................ 12 b). Nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................................ 13 2.2.3. Ứng dụng của protease ........................................................................... 14 2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU ...................................................................................................................... 15 2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. ................................................................. 15 2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme ............................................................... 16 2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel ................................................... 18 2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp ............................................................... 18 2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel .................................................................. 20 a). Chọn lựa gel ......................................................................................... 20 b). Chuẩn bị gel và bảo quản ..................................................................... 20 2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu ............................................................... 20 a). Dựng cột lọc gel ................................................................................... 20 b). Chuẩn bị mẫu ....................................................................................... 21 2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel ...................................... 21 vii 2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel .............................................. 22 a). Ƣu điểm ................................................................................................ 22 b). Nhƣợc điểm ......................................................................................... 22 2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE ..... 22 2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME ..... 24 2.5.1. Phương pháp Biuret ................................................................................ 24 2.5.2. Phương pháp Lowry ................................................................................ 25 2.5.3. Phương pháp Bradford ........................................................................... 25 2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) .................................... 26 2.5.5. Phương pháp đo phổ ............................................................................... 26 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 27 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM .......................................................................... 27 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU ............................. 27 3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 27 3.2.2. Hóa chất .................................................................................................. 28 3.2.3. Thiết bị .................................................................................................... 28 3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG .................................... 29 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 29 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú ....................... 29 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease .................................................................. 29 3.4.3. Bố trí thí nghiệm...................................................................................... 30 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp ............................................................................................ 31 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC .......... 32 3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT ..... 33 a). Nhiệt độ ................................................................................................ 33 b). pH ......................................................................................................... 33 c). Nồng độ muối ăn .................................................................................. 34 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel..................................................... 35 3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .. 35 3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................... 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 36 4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME ................... 36 4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau ......... 36 4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 38 4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 39 4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau ................................................................................................................... 41 4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp ....................... 42 4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC ................... 44 viii 4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau ........................... 44 4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau............... 46 4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau ................................................................................................................... 47 4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân ................................... 49 4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT ......................................................................................... 51 4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 51 4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................................... 52 4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú ........................................................................................................ 53 4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL ........................ 55 4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE .............. 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 64 5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 64 5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 66 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 1 Phụ lục chƣơng 3 .................................................................................................... 69 1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford .......................... 1 2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano ............................ 3 3. Phương pháp sắc ký lọc gel ............................................................................ 7 4. Điện di SDS-PAGE ......................................................................................... 9 a). Chuẩn bị hộp điện di .............................................................................. 9 b). Chuẩn bị mẫu protein ........................................................................... 10 c). Đƣa mẫu vào các giếng ........................................................................ 10 Phụ lục chƣơng 4 .................................................................................................... 80 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT NT: nội tạng. DC: dịch chiết. CPT: chế phẩm thô. TN: thí nghiệm. ĐC: đối chứng. dd: dung dịch. HT: hoạt tính. HTR: hoạt tính riêng. HL: hàm lƣợng. MW: molecular weight OD: optical density SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine UV: ultra viole x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme .. ................................................................................................................................... 24 Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu .................................................................................................. 42 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protease của CPT ....................................................................................................... 49 Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme protease sau sắc ký lọc gel ........................................................................................ 58 Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE .... 62 Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE ........... 62 xi DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình Trang Hình 2.1. Tôm sú ......................................................................................................... 9 Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease ....................................................................... 10 Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký .............................................................. 17 Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel ................................................................... 18 Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối ............................................................................ 21 Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. .................................................. 26 Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú ...................................................................... 27 Hình 4.1. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu nội tạng ............................................................................................ 55 Hình 4.2. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa cồn từ DC mẫu đầu tôm ............................................................................................ 55 Hình 4.3. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu nội tạng ...................................................................................... 56 Hình 4.4. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P100 của CPT tủa acetone từ DC mẫu đầu tôm ..................................................................................... 56 Hình 4.5. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu nội tạng................................................................................. 57 Hình 4.6. Sắc ký đồ kết quả tinh sạch với Bio-Gel P 100 của CPT tủa muối (NH4)2SO4 từ DC mẫu đầu............................................................................... 57 Hình 4.7. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu nội tạng .......................... 60 Hình 4.8. Kết quả điện di enzyme sau tinh sạch của mẫu đầu .................................. 60 Đồ Thị Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ............................................................................................ 36 Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu /nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu tôm sú ........................................................................................ 37 Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng ..................................................................... 38 Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 38 Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .................................................................... 39 Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ............................................................................ 40 xii Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .......................................................................... 41 Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ................................................................................. 41 Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng .................................................................................. 43 Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu ......................................................................................... 43 Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT ...................................................................................... 45 Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT ...................................................................................... 45 Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng .............................................................................. 46 Đồ thị 4.14. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu ...................................................................................... 47 Đồ thị 4.15. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng .......................... 48 Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu ................................. 48 Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu nội tạng ........................................................................ 49 Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu đầu ............................................................................... 50 Đồ thị 4.19. Yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT ................ 51 Đồ thị 4.20. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT ................................... 53 Đồ thị 4.21. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT ............. 54 Đồ thị 4.22. Ảnh hƣởng của quá trình tinh sạch sắc ký lọc gel đến HTR của enzyme ................................................................................................................ 58 Đồ thị 4.23. Sự tƣơng quan giữa giá trị Rf và Lg (trọng lƣợng phân tử) .................. 61 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme đƣợc phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nƣớc, sản lƣợng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trƣờng thế gới tăng 20-30% mỗi năm. Việt Nam là nƣớc có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thƣơng mại rất lớn. Nó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại. Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât. Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lƣợng và do đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật luôn đƣợc coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng nhƣ các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thƣơng mại. Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ sản. Với mức đóng góp 70 - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein – nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng quốc tế. Tôm dùng cho chế biến đƣợc cung cấp từ hai nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ƣu thế và nuôi tôm ở Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng. Các sản phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi, tôm 2 thịt xẻ lƣng … Trong quá trình gia công chế biến tôm thƣờng loại ra các phế phụ phẩm nhƣ nội tạng, đầu và vỏ tôm. Phế phụ phẩm này của tôm là nguồn thu nhận protease cao, mang lại lợi nhuận lớn cho công nghiệp sản xuất enzyme. Để hiểu về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có biện pháp hữu hiệu trong bảo quản, chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm cho việc thu nhận protease chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tách chiết, tinh sạch và tính chất của protease từ nội tạng và đầu tôm sú”. 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục đích chung của đề tài là tách chiết và tinh sạch protease từ nội tạng và đầu của tôm sú cũng nhƣ tính chất của nó. Để đạt điều này, đề tài tập trung vào các nội dung cụ thể sau:  Xác định quy trình tách chiết protease từ nội tạng và đầu của tôm sú Xác định tỷ lệ dung môi tách chiết protease thích hợp. Xác định loại dung môi tách chiết protease thích hợp. Xác định nồng độ tác nhân tủa thu hồi protein. Xác định tác nhân tủa thu hồi protein.  Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động protease của chế phẩm enzyme. Khảo sát hoạt tính theo pH. Khảo sát hoạt tính theo nhiệt độ. Xác định độ bền của protease.  Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.  Xác định trọng lƣợng phân tử của protease bằng điện di protein. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 2.1.1. Lƣợc sử các công trình nghiên cứu enzyme Khi con ngƣời chƣa có khái niệm về enzyme là gì nhƣng con ngƣời đã biết sử dụng nó trong chế biến bảo quản thực phẩm lên men cổ truyền. Khoảng 5.000 năm trƣớc công nguyên ở Jerico, ngƣời ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì, nấu rƣợu vang, sản xuất dấm, tƣơng chao,… ở các mức độ khác nhau, là những quá trình sinh học xƣa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại. Những mốc thời gian quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học Năm 1833, Payen và Persoz tách đƣợc diatase từ malt. Năm 1874, Hansen là ngƣời đầu tiên tách đƣợc renet từ bao tử cừu. Năm 1876, Kihne là ngƣời đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme. Năm 1897, hai anh em Buchner chứng minh dịch từ nấm men có thể chuyển hóa đƣờng glucose thành cồn và CO2. Năm 1913, Rohm là ngƣời đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa. Năm 1917, Boidin và Effront nghiên cứu α.amylase của B.Subtilis và ứng dụng trong ngành dệt. Năm 1920-1928, Will Slitter tinh sạch đƣợc enzyme. Năm 1926, Samner kết tinh đƣợc urease; Northrop kết tinh đƣợc protease. Năm 1928, Fleming phát hiện ra penicilline. Từ thế chiến thứ hai, bắt đầu sản xuất kháng sinh theo quy mô công nghiệp, sử dụng amyloglusosidase đƣờng hóa tinh bột. Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline. 4 Năm 1972, Boyer và các cộng sự đƣa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực cho công nghệ enzyme. Năm 1984, Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry-lamide và một loạt các quá trình sản xuất có sự tham gia của enzyme. 2.1.2. Định nghĩa về enzyme Enzyme là nhóm protein chuyên biệt hoá cao có vai trò và chức năng sinh học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc tác với tốc độ đặc hiệu cơ chất vô cùng hoàn hảo, xúc tác đặc hiệu các phản ứng hoá học ở điều kiện bình thƣờng mà các chất xúc tác hoá học khác không thể thực hiện nổi. Enzyme tham gia xúc tác tất cả các phản ứng biến đổi trong tế bào và cơ thể sống. Trong đó nhiều enzyme đóng vai trò điều hoà chủ đạo trong việc điều khiển sự phối hợp nhịp nhàng các phản ứng của quá trình trao đổi chất. Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hoá học rất khó xảy ra trong các điều kiện bình thƣờng ở ngoài cơ thể (để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, môi trƣờng acid mạnh hay kiềm mạnh...) nhƣng trong cơ thể, nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức “êm dịu nhẹ nhàng” nhiệt độ 37oC, áp suất thƣờng, môi trƣờng trung tính, ở nồng độ cao… Cơ thể thiếu enzyme thì mọi quá trình chuyển hoá sẽ đình trệ, các hoạt động sống, sinh sản, phát triển của của cơ thể sống không đƣợc bình thƣờng. Tóm lại: enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hoá sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác. 2.1.3. Cấu tạo phân tử Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thƣờng và có tính đặc hiệu rất cao cho nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp. Enzyme có bản chất protein, phân tử lƣợng lớn thƣờng là 10.000 đến 1.000.000 Datol. 5 Ví dụ phân tử lƣợng của ribonuclease là 12.000 Da, glutamt dehydrogenase là 1.000.000 Da, urease là 483.000 Da; đa số enzyem có hình dạng phân tử thuộc loại protein hình cầu. Có loại enzyme đơn nguyên nhƣng cũng có loại enzyme đa nguyên do nhiều đơn vị nhỏ tạo nên, mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi poplypeptit. Dung dịch enzyme có tính chất dung dịch keo. Enzyme không bền với nhiệt, ở nhiệt độ cao enzyme mất hoạt tính xúc tác. Các yếu tố gây biến tính protein nhƣ acid hay kiềm, muối kim loại nặng làm cho enzyme mất hoạt tính.  Thành phần cấu tạo của enzyme Enzyme có thể chia hai loại theo cấu tạo hoá học: Enzyme đơn giản và enzyme phức tạp. Loại đơn giản chỉ là những phân tử protein đơn thuần, sản phẩm thuỷ phân chỉ gồm các acid amin. Enzyme phức tạp ngoài phần protein còn có phần khác không phải protein apoenzyme thể hiện tính chất cơ bản của enzyme và tính đặc hiệu của nó. Phần không phải protein đƣợc gọi là coenzyme, còn gọi là nhóm ngoại thƣờng có chứa vitamin, phần này chung cho nhiều enzyme, trong quá trình xúc tác thì biến đổi. Trong thành phần cấu tạo của nhiều enzyme có chứa kim loại.  Trung tâm hoạt động của enzyme Mỗi hoạt động xúc tác của enzyme đều thông qua bộ phận đặc biệt của phân tử enzyme gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Trung tâm này gồm những nhóm hoá học, những liên kết peptit tiếp xúc trực tiếp với cơ chất. Một phần hoặc toàn bộ phân tử enzyme đƣợc coi là có khung cấu trúc thích hợp để duy trì hình dạng cần thiết đối với tính chất đặc hiệu và hiệu lực xúc tác. Do vậy khi làm thay đổi hình dạng của chúng dẫn đến khả năng xúc tác bị thay đổi. Trung tâm hoạt động của enzyme thƣờng bao gồm những acid amin có nhóm hoá học có hoạt tính cao nhƣ serin (-OH), histidin (vòng inmidozol), cytein (-SH), lysin (-NH3), tryptophan (indol), glutamic (-COOH). Các gốc acid amin tạo nên trung tâm hoạt động không nhất thiết sắp xếp ở cạnh nhau trong cấu trúc bậc 1 nhƣng gần nhau trong cấu trúc bậc 2, 3 và 4. 6 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại  Danh pháp: theo quy ƣớc quốc tế, tên gọi của enzyme thƣờng đƣợc gọi theo cơ chất đặc hiệu của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó, tên một enzyme thƣờng có hai phần. Phần đầu là tên cơ chất. Trong trƣờng hợp phản ứng đó là phản ứng lƣỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của hai cơ chất viết cách nhau hai chấm. Phần sau chỉ khái quát bản thân của phản ứng. Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn đƣợc gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân loại. Ví dụ nhƣ trypsin, chimotrypsin, pepsin…  Phân loại Hội nghị sinh hoá quốc tế lần thứ V (1962) chia enzyme làm 6 loại ký hiệu E.C. 1. Oxydoreductase là men ......... Oxy hoá khử. 2. Transferase ............................ Vận chuyển nhóm. 3. Hydrolase .............................. Thuỷ phân. 4. Lyase ..................................... Phân cắt. 5. Isomerase .............................. Đồng phân. 6. Ligase .................................... Tổng hợp. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động enzyme  Nồng độ cơ chất Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc nồng độ cơ chất. Nồng độ cơ chất tăng độ phản ứng xúc tác của enzyme tăng, nhƣng khi nồng độ cơ chất tăng đến mức cao thì tốc độ phản ứng đạt đến cực đại không tăng nữa. Thời điểm này enzyme bão hoà cơ chất.  Nồng độ enzyme Tốc độ phản ứng xúc tác bởi enzyme tỷ lệ thuận với hàm lƣợng enzyme nhƣng khi tăng cao nồng độ enzyme thì tốc độ cũng không tăng nữa do các sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều sẽ tác dụng vào vị trí dị lập thể của enzyme làm cho phản ứng đạt ở mức độ bão hoà. 7  Tác dụng của nhiệt độ Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme lên đến tốc độ cực đại đến chừng nào enzyme chƣa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên 10oC tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần. Khi nhiệt độ tăng đến khoảng 60 – 70oC thì phần lớn các enzyme mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó gọi là nhiệt độ tới hạn. Mỗi enzyme yêu cầu một nhiệt độ xúc tác tối ƣu riêng ở nhiệt độ này enzyme đạt tốc độ cao nhất. Nhìn chung nhiệt độ thích hợp của enzyme gần với nhiệt độ của cơ thể vào khoảng 40oC. Ở các vi sinh vật chịu nhiệt độ cao, enzyme của chúng có nhiệt độ thích hợp, ví dụ amylase động vật có nhiệt độ cao, enzyme ứng dụng khoảng 45 – 50oC nhƣng - amylase của vi sinh vật chịu nhiệt có nhiệt độ thích hợp là 70oC, đối với các enzyme của các vi sinh vật cảm ứng sống trong các suối nƣớc nóng thì nhiệt độ thích hợp vào khoảng gần nhiệt độ sôi của nƣớc. Nhiều enzyme thực vật có nhiệt độ thích hợp khá cao nhƣ papain ở 800C vẫn còn khả năng hoạt động.  Tác dụng của pH Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng; nó ảnh hƣởng rất lớn đối với tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một giá trị pH cho hoạt động của mình. Rất nhiều enzyme có pH thích hợp ở vùng trung tính nhƣng có enzyme hoạt động tốt ở vùng acid hay ở vùng kiềm. pH ảnh hƣởng đối với các phản ứng của enzyme do nhiều tác dụng rất khác nhau do pH tác dụng vào trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nhất là do các nhóm hoạt động của enzyme, vào trạng thái ion hoá của cơ chất, vào độ bền vững của phân tử enzyme và ảnh hƣởng đến sự kết hợp giữa phần protein và phần phụ không phải protein. Đối với enzyme có những nhóm hoạt động đặc biệt có thể tồn tại dƣới nhiều dạng ion khác nhau và thƣờng chỉ ở một trạng thái có tác dụng xúc tác. pH có tác dụng quyết định đối với trạng thái ion hoá của phân tử enzyme nói chung và các nhóm hoạt động của enzyme nói riêng, nên ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. 8  Tác dụng của ion kim loại Sự có mặt hay vắng mặt ion kim loại không thể hiện rõ đối với một số enzyme nhƣng nhiều enzyme chịu ảnh hƣởng sâu sắc đến nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có một số ion kim loại hầu nhƣ tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động một số enzyme; nhƣng cũng có những ion kim loại nhƣ Ag+, Hg+, Pb+ có độc tính cao với hầu hết các enzyme. Một số ion kim loại ức chế enzyme này nhƣng hoạt hóa enzyme kia. Có những ion kim loại ức chế một enzyme ở nồng độ này nhƣng lại hoạt hoá chính enzyme đó ở nồng độ khác. Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn tác dụng với cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzyme.  Tác dụng của chất hoạt hoá Chất hoạt hoá có khả năng làm tăng tác dụng xúc tác của enzyme. Chất hoạt hóa thƣờng có bản chất rất khác nhau. Ví dụ các amino nhóm halogen nhƣ Cl-, Br-, I - có tác dụng hoạt hoá - amylase. Glutathion có tác dụng hoạt hoá nhiều protease thực vật, một số enzyme oxy hoá khử có nhóm hoạt động – SH. Cystein là acid amin hoạt hoá nhiều men có nhóm – SH hoạt động. Tác dụng hoạt hoá của glutathion, cystein là do khả năng khử liên kết disulfur của phân tử enzyme. Các enzyme nhóm – SH hoạt động thƣờng chỉ hoạt động đƣợc khi các nhóm này ở dạng khử. Nhiều ion kim loại cũng có tác dụng hoạt hoá enzyme.  Chất ức chế Là những chất làm giảm tốc độ xúc tác của enzyme. Chất ức chế có thể gây ra quá trình ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế trên phức hợp enzyme cơ chất. 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM 2.2.1. Giới thiệu về tôm Tôm sú còn gọi là tôm cỏ, tôm nƣơng, tôm sú rằn, thuộc lớp giáp xác, bộ mƣời chân, họ tôm he, giống tôm he, loài tôm sú, có tên khoa học là Penaeus monodon, tên thƣơng mại là Black Tiger Shrimp. Tôm sú đƣợc đánh bắt và nuôi trồng hàng đầu thế giới. Theo thống kê của tổ chức Lƣơng thực Nông nghiệp thế giới (Food Agriculture Organization - FAO), sản lƣợng tôm sú năm 1997 chiếm 9 52% sản lƣợng tôm nuôi trồng toàn thế giới, với tốc độ tăng trƣởng trung bình 2%/năm. Trong các vùng nuôi tôm chủ yếu trên thế giới, Ðông Nam Á là vùng dẫn đầu chiếm 53,7% tổng sản lƣợng tôm toàn thế giới trong tổng số 54 quốc gia có ngành công nghiệp nuôi tôm phát triển (thống kê của FAO năm 1997). Hình 2.1. Tôm sú Hiện nay, ở Việt Nam tôm sú là một trong 5 loại tôm đƣợc nuôi trồng phổ biến và quan trọng nhất đối với nền kinh tế Việt Nam Tôm sú (Black tiger shrimp) - Penaeus monodon. Tôm thẻ (Banana shrimp) - Penaeus merguiensis. Tôm chân trắng (White leg shrimp) - Penaeus vannamei. Tôm Nhật Bản (Kuruma shrimp) - Penaeus japonicus. Tôm càng xanh (Giant fresh water prawn). Nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây, trở thành ngành kinh tế quan trọng. Năm 2002, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%. Năm 2004, xuất khẩu thủy sản đạt giá trị 2,4 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nƣớc trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Hiện nay, tôm sú vẫn là đối tƣợng chủ lực, thu hút sự chú ý lớn của ngƣời dân và chính quyền và cung cấp trong chuyển dịch cơ cấu kinh tế ven biển. 10 2.2.2. Khái quát protease 2.2.2.1. Định nghĩa protease Protease là những esterase thủy phân protein, chúng xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và cắt liên kết peptid giữa các L-acid amin thành các acid amin tự do, một ít peptid ngắn, pepton. Và chúng thƣờng tác động lên các liên kết ester đơn giản. Hình 2.2. Công thức cấu tạo protease  Dựa vào sự phân bố có thể chia protease làm hai nhóm Protease nội bào. Protease ngoại bào.  Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất Endopeptidase: enzyme thủy phân peptid ở giữa mạch. Exopeptidase: enzyme phân cắt các liên kết peptid ở đầu mạch.  Dựa vào pH hoạt động Protease acid tính. Protease kiềm tính. Protease trung tính.  Dựa vào nguồn thu nhận enzyme Protease động vật. Protease thực vật. Protease vi sinh vật.  Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme 11 Serine protease (OH): trypsine, chymotrypsine, substilopeptidase, milk alkaline protease (MAP), Thrombin… Thiol protease (SH): papain, bromeline… Aspartic protease (COOH): pepsin, renin… Metallo protease: carboxylpeptidase A, collagenase (cần trung tâm hoạt động là Zn2+ hoặc Mg2+). 2.2.2.2. Protease của tôm Sự tiêu hoá và trao đổi chất protein và các hợp chất nitơ khác giữa các loài giáp xác khác nhau rất nhiều. Hầu hết, các cơ chế tiêu hoá và hấp thụ khác với động vật có xƣơng sống. Các enzyme tiêu hoá, đặc biệt các enzyme tiêu hoá protein ở giáp xác nói chung và của tôm nói riêng khá giống với enzyme có trong dạ dày của cá. Protease ở tôm không có dạng pepsin, chủ yếu ở dạng trypsin hoặc protease serin dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao. Ngoài ra, còn có enzyme chymotrypsin, astacine, collagenase… Protease của tôm cũng nhƣ của các loài động vật thuỷ sinh khác là các protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá, sau đó đến nội tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan khác. Có nhiều cách phân loại protease, tuỳ vào khả năng thuỷ phân khác nhau mà các protease có đặc tính khác nhau. Nhóm enzyme này có tác dụng thuỷ phân protien, có tính đặc hiệu rộng rãi, chúng không chỉ thuỷ phân liên kết peptid mà còn có thể thuỷ phân các liên kết ester và cũng có thể xúc tác cho chuyển về gốc acid amin. Tuy nhiên, mức độ tác dụng khác nhau. Phần lớn các nhóm enzyme thuộc protease của tôm thƣờng có tính chất chung của một enzyme: Hòa tan đƣợc trong nƣớc, dung dịch nƣớc muối sinh lý đệm phosphate trung tính, đệm Tris-HCl và một số dung môi hữu cơ nên dựa vào những đặc tính này để tách chiết chúng. 12 Bị kết tủa thuận nghịch bởi một số muối trung hòa (sulfate amonium), ethanol, acetone…để thu nhận chế phẩm enzyme. Hoạt tính của enzyme có thể tăng hoặc giảm dƣới tác dụng của các chất hoạt hóa hay ức chế. Độ hoạt động của enzyme chịu ảnh hƣởng rất lớn bởi các yếu tố: nhiệt độ, pH môi trƣờng. Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Trân Châu cùng cộng tác viên về protease đầu tôm biển và Th.s Nguyễn Thị Mỹ Trang về protease đầu tôm bạc nghệ cho thấy các enzyme tiêu hoá protein là các enzyme hoạt động mạnh trong môi trƣờng kiềm. Theo Nguyễn Việt Dũng thì protease của tôm sú lại thể hiện hoạt tính cao ở môi trƣờng gần trung tính. Khả năng hoạt động của các enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài. Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô đƣợc xác định nhƣ khả năng hoạt động phân giải casein ở tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) và tôm đất (Metapenaecus ensis) thấp hơn ở Penaeus pencillatus, Penaeus monodon và Penaeus japonnicus. 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc a). Nghiên cứu trong nước Ở nƣớc ta hiện nay, công bố nhiều công trình nghiên cứu protease. Chủ yếu là nghiên cứu tách chiết tinh sạch và ứng dụng của enzyme các lĩnh vực công nghê ̣ thực phẩm và mỹ phẩm, dƣợc phẩm. Nguyễn Liêu Ba và Lê Văn Nhƣơng (2001), nghiên cứu thu nhận và tinh sạch protease kiềm từ dịch nuôi cấy B.brevis B1. Lê Đức Mạnh và các cộng sự (1996) nghiên cứu thu nhận và bảo quản protease từ chế phẩm lên men bề mặt của vi khuẩn Bacillus subtilis. Phan Thị Hồng Hải và các cộng sự (2001), nghiên cứu tinh chế protease từ sáng lá gan (Fasciolagigatica). 13 Đỗ Văn Ninh (2004), tối ƣu hóa quá trình phân giải protein của protease trong thị cá và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ protein đƣợc thủy phân. Vũ Văn Bội (2004), nghiên cứu quá trình thủy phân protein cá bằng protease từ Bacillus subtilis S5. b). Nghiên cứu ngoài nước Corvisat (1857) chiết tách trypsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên đƣợc thu nhận nhƣng chƣa tinh sạch. Danivevski (1862) chiết tách trypsin, amylase tụy tạng bằng phƣơng pháp hấp phụ. Nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong chiết tách và nghiên cứu các tính chất của enzyme cũng nhƣ protein. Tiếp theo đó là Hommarsten (1872) chiết tách đƣợc Chymosin. Wurtz (1879) chiết tách đƣợc papain, Crassman và Ambros (1926) chiết tách đƣợc bromelain… Theo Salem và các cộng sự (1995) đã sử dụng tỷ lệ là 0.3% enzyme so với cá gồm papain, trypsin, ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nƣớc mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark). Kết quả cho thấy với 0.3% papain cho hàm lƣợng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%. Liang và các cộng sự (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trà trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain đƣợc tăng lên. Nielsen (2001) nghiên cứu cải tiến phƣơng pháp xác định mức độ thủy phân protein cho kết quả nhanh chóng và chính xác. Stein (2004) sử dụng protease nội sinh thủy phân nội tạng cá tuyết Đại Tây Dƣơng cho hiệu suất thủy phân khá cao. 14 2.2.3. Ứng dụng của protease Các protease nói chung đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.  Trong công nghiệp: Trong sản xuất nƣớc chấm : Nƣớc mắm, tƣơng, chao,… Trong công nghệ thực phẩm : Làm mềm thịt, tăng hƣơng vị thịt sau khi chế biến,… Trong công nghệ thuộc da : Làm mềm lông, sạch lông, bóng da,… Trong công nghệ tơ tằm : Làm bóng và tách rời các sợi tơ. Xà bông, kem giặt có enzyme sẽ tẩy dễ dàng các vết bẩn. Đặc biệt ứng dụng giặt sạch vết máu, sữa trên vải. Trong công nghiệp sữa, các protease nhƣ renine, pepsine đƣợc dùng trong sản xuất formate, sữa đông tụ.  Trong nông nghiệp : Protease đƣợc dùng để sản xuất dịch thủy phân làm giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm.  Trong mỹ phẩm : Ngƣời ta trộn một lƣợng nhỏ protease vào kem xoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem mặt,… để làm da mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già.  Trong y học : Protease đƣợc dùng để sản xuất môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết thanh miễn dịch. Sử dụng enzyme collagenase trong điều trị cơ gân, mạch máu… bị sơ cứng Dùng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch… Sử dụng các chất hoạt hóa và kìm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trƣng. 15 Sản xuất thuốc làm tăng khả năng tiêu hóa protein của những ngƣời bị tiêu hóa kém…  Trong kỹ nghệ phim ảnh : Protease từ vi khuẩn đƣợc dùng để tái sinh các nguyên liệu nhƣ phim điện ảnh, phim Rơnghen…Protease phân giải và hòa tan lớp nhũ tƣơng gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý. 2.3. PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phƣơng pháp trích ly enzyme. Emzyme là loại protein đƣợc tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này thƣờng không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Để thu nhận enzyme nội bào, ngƣời ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phƣơng pháp. Các phƣơng pháp phá vỡ tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ tế bào nhƣ: Phương pháp cơ học. Nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền nhƣ bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa… Phương pháp vật lý nhƣ dùng sóng siêu âm. Phương pháp hóa học nhƣ dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate. Quá trình trích ly enzyme từ nội tạng và đầu tôm sú chịu tác động của các yếu tố: tỷ lệ dung môi trích, nhiệt độ, thời gian, pH. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly protease Tỷ lệ dung môi với mẫu: mẫu mô động vật có nhiều thành phần khác nhau, ngoài protein của enzyme và các thành phần enzyme khác đặc biệt là hàm lƣợng lipit nhiều, ảnh hƣởng đến quá trình trích ly, ở tỷ lệ thích hợp sẽ trích ly đƣợc những protein - protease ra ngoài mô nhiều hơn. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến quá trình trích ly, hầu hết protease động vật rất dễ biết tính hay giảm hoạt tính khi tăng nhiệt độ, hay ở nhiệt độ thích 16 hợp enzyme hoạt động mạnh thủy phân protein lẫn nhau. Thƣờng nhiệt độ ly trích protease từ mô động vật ở nhiềt độ không quá 5oC. Thời gian trích ly: đối với protease từ nguồn động vật dễ bị phân hủy vì hoạt tính protease mạnh và có sự hỗ trợ của các enzyme thủy phân khác có trong mô mẫu khi để ở thời gian lâu, hay thời gian ngắn thì quá trình hòa tan của enzyme từ mô tế bào mẫu. Chính vì vậy thời gian trích ly enzyme từ mô mẫu cần phụ thuộc loại mô mẫu và dung môi trích. pH là yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme trong quá trình ly trích, có những enzyme acid thì cần phải trích ly ở pH acid thì thu protein của enzyme đó cao hơn, còn enzyme kiềm thì ngƣợc lại. 2.3.2. Phƣơng pháp làm sạch enzyme Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, ngƣời ta thực hiện những phƣơng pháp sau  Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phƣơng pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phƣơng pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Ngƣời ta đƣa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50-70oC và pH ≤ 5. Ở điều kiện này những enzyme không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó, bằng phƣơng pháp ly tâm hoặc phƣơng pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn.  Phương pháp kết tủa phân đoạn Dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối khác nhau, thƣờng sử dụng muối (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, ngƣời ta đƣợc một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra, còn có thể sử dụng một số dung môi hữu cơ nhƣ ethanol, acetone để kết tủa protein. 17  Phương pháp hấp thu chọn lọc Có thể cho chất hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme hoặc cho dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ hydrocyapatite . Phƣơng pháp này có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, thƣờng thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0oC. Sau khi hấp thụ ta lại tiến hành chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp.  Phương pháp sắc ký Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nƣớc và tác nhân trao đổi ion , có thể áp dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion (Ion Exchange Chromatography) để làm sạch enzyme. Thƣờng sử dụng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion sau: o Nhựa trao đổi ion. o Dẫn suất ester của cellulose nhƣ carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-cellulose), triethylamino-ethyl- cellulose. Dựa vào đặc tính phân cực của protein : o Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography). o Sắc ký giấy. o Sắc ký đảo pha (Reverse Phase Chromatography). o Sắc ký tƣơng tác kỵ nƣớc (Hydrophobic Interaction Chromatography – HIC) Dựa vào kính thƣớc protein: sắc ký lọc gel (Gel Filtration Chromatography) Nhận biết sinh học (tính đặc hiệu của ligand): ắc ký ái lực (Affinity Chromatography) 18 Hình 2.3. Nguyên tắc hoạt động của sắc ký 2.3.3. Giới thiệu phƣơng pháp sắc ký lọc gel 2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lƣợng phân tử và phân tích định lƣợng tƣơng tác phân tử. Hình 2.4. Tách các phân tử bằng lọc gel  Một số thông số vật lý của phƣơng pháp Giới hạn tách (exclution limit): là kích thƣớc của phân tử nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel, nhƣ vậy tất cả chúng sẽ tách cùng một lƣợt ra khỏi cột. Thí dụ giới hạn tách của G-50 có phạm vi tách từ 1.500-30.000 Da, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel. Phạm vi tách (Fructionation range): Thí dụ sephadex G-50 có phạm vi tách từ 1.500-30.000 Da. Độ ngậm nước (water regain): Là trọng lƣợng nƣớc mà 1 gam bột gel khô hút nƣớc. Thí dụ G-50 có độ ngậm nƣớc là 5,0 0,3 g. Giá trị này chƣa tính đến lƣợng nƣớc bao quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột. 19 Thể tích nền (bed volume): là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu khi trƣơng nở trong nƣớc. G-50 có thể tích nền 9-11 ml/g gel khô. Hạt gel (Gel particle): Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thƣớc hạt xác định bằng mesh hoặc đƣờng kính hạt (bead diameter) tính theo m. Hạt có kích thƣớc lớn (50-100 mesh, 100-300 m cho tố độ dòng chảy qua cột cao, nhƣng kết quả tách thấp. Ngƣợc lại những hạt mịn (400 mesh, 10-40 m) lại cho tốc độ dòng chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thƣờng ngƣời ta chọn hạt gel có kích thƣớc 100- 200 mesh (50-150 m). Thể tích trống (void volume): Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có trọng lƣợng phân tử 2.000.000 Da. Thể tích thổi (elution volume): là thể tích đệm cần thiết để rửa thổi chất cần tách ra khỏi cột.  Đặc tính hóa học của gel Có 4 loại gel thƣờng đƣợc sử dụng. Dextran: Có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia (Thụy Điển) cung cấp với tên thƣơng mại là Sephadex. Giới hạn tách của gel dextran 600.000 Da. Tuy nhiên nếu dextran đƣợc bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’- methylene bisacrylamide thì dextran có giới hạn tách gia tăng. Gel polyacrylamide: Tạo bởi quá trình đồng polymer hoá của acrylamide và N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thƣơng mại) Gel agarose: Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ galactose và anhydrogalactose. Mạng gel đƣợc ổn định nhờ liên kết hydro nhiều hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio-Rad cung cấp agarose với tên thƣơng mại là Bio-gel A.. Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thƣơng mại là ultragel, nó cho phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp suất để tách. 20 2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel a). Chọn lựa gel Chủ yếu ngƣời ta sử dụng gel trong 2 trƣờng hợp: Loại bỏ phân tử có trọng lƣợng phân tử nhỏ ra khỏi hỗn hợp chứa các đại phân tử (thí dụ là quá trình loại muối (desalting) ra khỏi dịch chứa protein và nucleic acid. Cỡ hạt hay sử dụng 100- 200 mesh (10-40 m) hay 200-400 mesh (20-80 m). Hạt nhỏ hơn cho kết quả tách tốt hơn, nhƣng thời gian thực hiện lại rất dài. b). Chuẩn bị gel và bảo quản Gel dextran và acrylamide thƣơng mại ở dạng bột không ngậm nƣớc do vậy phải cho chúng ngậm nƣớc (cho nở) trƣớc khi sử dụng. Quá trình này thƣờng khoảng 3-4 giờ ở 20 o C đối với loại gel có liên kết nhiều, riêng P-300 và G-200 nên kéo dài thời gian trên tới khoảng 72 giờ (3 ngày đêm). Có thể rút ngắn thời gian nở trong nƣớc ở nhiệt độ cao (có thể đun). Gel agarose và gel polyacrylamide agarose thƣơng mại ở dạng ngậm nƣớc, do vậy không cần cho nở. Trƣớc khi nhồi gel mới vào cột phải loại bỏ những hạt siêu mịn bằng cách lắng – nghiêng (2-3 lần là đủ) và loại bọt khí bằng cách vừa khuấy vừa hút khí (bơm nƣớc) trong khoảng 1-2 giờ. Sau đó bổ sung chất bảo quản sodium aride (0,02%). 2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu a). Dựng cột lọc gel Để tách phân đoạn, tốt nhất nên sử dụng cột dài hơn 100 cm có tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng nằm trong khoảng từ 25-100. Để tách nhóm chất chỉ cần sử dụng cột dài khoảng 50 cm với tỷ lệ chiều dài nền gel/rộng trong khoảng 5-10. Đối với gel dextran và polyacrylamide sử dụng đệm có pH từ 1,0-10,0, trong khi gel agarose chỉ ổn định trong khoảng pH -10,0 và pH chọn lựa phải đảm bảo không làm mất hoạt tính của chất cần tách 21 b). Chuẩn bị mẫu Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột, tới 10-25% tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ đƣợc phép đƣa một lƣợng mẫu đƣa một lƣợng mẫu nhỏ vào cột 1-5% tổng thể tích cột ( là thể tích nƣớc tƣơng đƣơng chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dòng chảy nền điều chỉnh ở mức thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thƣờng đối với gel có kích thƣớc lỗ nhỏ , nên sử dụng tốc độ 8-12 ml/cm 2 mặt cắt ngang (15-25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2-5 ml/ cm2 (5-10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phƣơng pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thông thƣờng là nén theo chiều trong lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngƣợc từ dƣới lên. 2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel Loại muối. Tinh sạch phân tử sinh học. Xác định trọng lƣợng phân tử. Nhƣ đã trình bày ở trên, gel chỉ thích hợp để tách các chất sinh học có tính ƣa nƣớc trong dung dịch nƣớc. Tuy nhiên đôi khi cũng nẩy sinh sử dụng phƣơng pháp này để tách các chất kỵ nƣớc trong dung môi hữu cơ (ethanol, acetone, dimethyl sulfoxide, dimethyl forenemide, acetonitrile,v.v…). Trong các trƣờng hợp này cần phải có chỉ dẫn cho từng trƣờng hợp cụ thể. Hình 2.5. Sắc ký lọc gel loại muối. 22 2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel a). Ưu điểm Sắc ký lọc gel là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện trên các phân tử sinh học mẫn cảm với sự thay đổi về pH, nồng độ của ion kim loại hoặc các chất đồng tác động (cofactor) và các điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt. Sự phân tách có thể đƣợc thực hiện khi có sự hiện diện của các ion hoặc các cofactor thiết yếu, các chất tẩy (detergents), urea, guanidinehydrocloride, ở cƣờng độ ion cao hoặc thấp, ở 370C hay trong phòng lạnh tùy theo những yêu cầu của thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép thu lại lƣợng mẫu lớn, tách các phân tử có cùng pI và dễ dàng khử muối. b). Nhược điểm Chậm (tốc độ thấp - thời gian dài) Yêu cầu các cột có kích thƣớc lớn tƣơng đối so với lƣợng mẫu. Sự phân tách dựa trên sự khác nhau về kích thƣớc phân tử, thƣờng khó đạt đƣợc sản phẩm tinh khiết hoàn toàn. Vì lý do này, sắc ký lọc gel thƣờng đƣợc sử dụng với những kỹ thuật khác nhau nhƣ sắc ký trao đổi ion hay sắc ký hấp phụ. 2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE Sau khi thực hiện các bƣớc ly trích và tinh sạch enzyme bƣớc kế tiếp kiểm tra lại độ tinh sạch protein dựa vào kỹ thuật điện di. Kỹ thuật điện di có thể cho ta xác định đƣợc trọng lƣợng phân tử protein mong muốn. Kỹ thuật điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein đƣợc xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 đƣợc biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các 23 protein đều đƣợc tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thƣớc, những phân tử có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thƣớc nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thƣớc nhất định. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng và các phân tử tích điện dƣơng sẽ di chuyển về cực âm của điện trƣờng. Để xác định phân tử lƣợng của một protein, ngƣời ta thƣờng so sánh với một thang phân tử lƣợng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lƣợng phân tử khác nhau đã biết. Để đƣa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, ngƣời ta thƣờng sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phƣơng pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên): duỗi thẳng các phân tƣ̉ protein trong mẫu có cấu trúc bâc̣ cao về daṇg cấu trúc bâc̣ 1 và các protein này đƣợc dồn lại và tạo một lớp băng mỏng. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dƣới): tạo ra các băng protein có trọng lƣợng phân tử, kích thƣớc khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Hai lớp gel này đƣợc phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí. Kỹ thuật SDS-PAGE có thể xác định đƣợc những phân tử protein có trọng lƣợng phân tử từ 10.000 - 200.000 Da Những phân tử protein có trọng lƣợng lớn hơn 200.000 Da thƣờng đƣợc xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%. Ngoài kỹ thuật SDS-PAGE là phƣơng pháp điện di trong điều kiện làm biến tính protein (Denaturing condition), ngƣời ta còn dùng một số kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính (Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hƣởng đến đặc tính của protein nhƣ tạo liên kết (cross- linked) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lƣợng với những protein khác ngƣời ta sử dụng kỹ thuật điện di tập trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis). 24 2.5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME Ngƣời ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt tính hoạt động của enzyme. Ngƣời ta cũng không thể định lƣợng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt tính hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng. Bảng 2. 1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch với độ nhạy của chúng khác nhau, hoặc do dựa vào sự có mặt của một số amino acid, do thành phần amino acid của protein khác nhau là khác nhau, nên kết quả phân tích sẽ bị ảnh hƣởng. Có 5 phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch, trong đó 3 phƣơng pháp cổ điển, 2 phƣơng pháp hiện đại. Trong 5 phƣơng pháp thì 4 phƣơng pháp dựa vào phản ứng hoá học, 1 phƣơng pháp đo quang phổ. 2.5.1. Phƣơng pháp Biuret Peptide và đặc biệt protein chứa từ 2 liên kết peptide trở lên đều có khả năng tạo phức cho màu mận chín với dịch kiềm chứa CuSO4 (nhờ liên kết coordinate – Nhóm phƣơng pháp Các thông số cố định Các thông số thay đổi 1 Thời gian Nồng độ enzyme Biến đổi của cơ chất và của sản phẩm 2 Lƣợng cơ chất mất đi ( hay lƣợng sản phẩm tạo thành) Nồng độ enzyme Thời gian 3 Thời gian, lƣợng cơ chất mất đi hay lƣợng sản phẩm tạo thành Nồng độ enzyme 25 càng cua của N tham gia liên kết peptide với Cu+2). Hàm lƣợng của chúng (peptide & protein) tỷ lệ với độ đậm của màu. Ngƣời ta thƣờng sử dụng albumine bò (bovine serum albumin) để dựng đƣờng chuẩn và đo ở bƣớc sóng 540 nm, đối chứng là dịch biuret và đệm hoặc nƣớc. Có một số tác nhân gây cản trở: đệm chuẩn bị từ amino acid, đệm Good’s, đệm Tris. Phƣơng pháp biuret có ƣu điểm là cho cùng kết quả ổn định đối với các loại protein khác nhau, dễ dàng thực hiện. Nhƣợc điểm chủ yếu là độ nhạy kém (1 mg). 2.5.2. Phƣơng pháp Lowry Là phƣơng pháp khá nhạy (5 g). Đây là phƣơng pháp tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp biuret bổ sung thêm chất Folin-ciocalten làm tăng độ màu của dung dịch, nhƣ vậy dịch màu xanh dƣơng xuất hiện là do: - Liên kết càng cua giữa N tạo liên kết peptide với Cu+2 - Sự khử chất Folin-ciocalten do tysosine và tryptophan trong phân tử protein tạo ra. Các bƣớc thực hiện giống nhƣ phƣơng pháp biuret, độ nhạy cao hơn 100 lần. Tuy nhiên nó bị ảnh hƣởng rất mạnh bởi đệm Good’s, NH4)2SO4 (nồng độ >15%), glycine (nồng độ >0,5%) và mercaptan. Ngoài ra protein có hàm lƣợng tysosine và tryptophan khác nhau do vậy kết quả không mấy ổn định. 2.5.3. Phƣơng pháp Bradford Do hạn chế trên ngƣời ta đã có cải tiến khắc phục bằng cách sử dụng chất màu liên kết với protein (Bradford, 1976, Biorad, 1984). Chất màu Coomassie gắn với protein trong dung dịch có tính acid sẽ làm thay đổi đỉnh hấp phụ từ bƣớc sóng 465 nm (của Coomassie) lên bƣớc sóng 595 nm liên kết với protein.Thƣờng sử dụng globulin hoặc albumin máu bò làm protein chuẩn. Phép đo rất tiện vì chỉ sử dụng một loại chất. Màu xuất hiện trong gần 2 phút và ổn định trong gần 1 giờ. Độ nhạy của phƣơng pháp cao ( 1-20 g), đôi khi nhạy hơn cả phƣơng pháp Lowry, 26 phƣơng pháp Bradford cũng cho kết quả khác biệt với các loại protein khác nhau. Nó chỉ bị ảnh hƣởng bởi triton X-100, sodium dodecyl sulfate. Hình 2.6. Công thức cấu tạo chất màu Coomassie. 2.5.4. Phƣơng pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) Phƣơng pháp này tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Biuret và Lowry. Phân tử protein tƣơng tác với ion Cu+2 tạo ra Cu+1, ion này sẽ tạo phức với bicinchoninic acid làm thay đổi màu táo xanh của BCA thành màu mận chín đỏ ở bƣớc sóng 562 nm. Phƣơng pháp này nhạy tƣơng đƣơng phƣơng pháp Lowry và Bradford. Ƣu điểm chính của nó là đơn giản và không bị triton và sodium dodecyl sulphate cản trở. 2.5.5. Phƣơng pháp đo phổ Chủ yếu là nhờ sự có mặt của tyrosine và tryptophan nên dịch protein hấp thu ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 280 nm. Tất nhiên là đối với protein có hàm lƣợng….khác nhau, kết quả hấp thu sẽ không giống nhau. Tuy nhiên đây là phƣơng pháp rất nhanh, đơn giản. Dịch tế bào chứa nhiều chất cũng hấp thu ở bƣớc sóng này do vậy chúng cũng là tác nhân cản trở phép đo, chủ yếu là nucleic acid. Để khắc phục ngƣời ta sử dụng tỷ lệ hấp thu A 280/A 260 để xác định hàm lƣợng protein, công thức thực nghiệm cho phép xác định hàm lƣợng protein trong dung dịch chứa tới 20% nucleic acid. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là xác định nhanh, chỉ yêu cầu một lƣợng mẫu nhỏ, so với phƣơng pháp so màu nó không bị ảnh hƣởng bởi phần lớn đệm và (NH4)2SO4. Đặc biệt nó thƣờng đƣợc sử dụng để phát hiện các peak chứa protein trong phƣơng pháp sắc ký cột. 27 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM Thời gian tiến hành đề tài ngày 12/03/2007 đến ngày 20/07/2007 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới. 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 3.2.1. Vật liệu Mẫu đầu và nội tạng tôm sú đƣợc phân tách từ tôm sú sống, loại 40 - 50 con/kg đƣợc nuôi ở Cần Giờ. Tôm đƣợc chở trong thùng sục khí về phòng thí nghiệm, rửa sạch và giết chết bằng cách trộn với nƣớc đá vụn, tỷ lệ tôm /đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc nội tạng. Đầu và nội tạng đƣợc tách riêng 20 cái/bao nylong đƣợc bảo quản trong tủ đông sâu -20oC để sử dụng dần trong thí nghiệm, thời gian bảo quản không quá 4 tuần. Hình 3.1. Mẫu nội tạng và đầu tôm sú 28 3.2.2. Hóa chất Hóa chất pha đệm Tris-HCl 0,05 M pH 7,5. Hóa chất pha đệm phosphate: muối NaH2PO4.2H2O và muối Na2HPO4.12H2O. Muối sinh lý. Cát thạch anh. Hóa chất tủa protein: Cồn 96o, acetone, muối (NH4)2SO4. Hóa chất để xác định hàm lƣợng protein: Dung dịch albumin chuẩn 1mg/ml, thuốc thử Bradford (Coomasie Brilliant Blue, Ethanol tuyệt đối, Acid Phosphoric) Hóa chất để xác định hoạt tính enzyme: Dung dịch Tyrosine 1mg/ml; HCl 0,1M; Na2CO3 0,4M; dung dịch Trichloacetic acid 0,4M (TCA); thuốc thử Folin; dung dịch đệm phosphate 0,1M; casein dạng bột. Hóa chất dùng trong sắc ký lọc gel. Hóa chất dùng trong điện di SDS-PAGE. 3.2.3. Thiết bị Máy đo quang phổ UV – Vis. Máy khuấy từ. Thiết bị lọc hút chân không. Máy ly tâm. Máy đo pH. Cân phân tích. Bể ổn nhiệt, tủ sấy. Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad gồm phễu đổ gel, flow adaptor, vòi hút chân không để khử khí cho dung dịch. Cối inox nghiền mẫu. Ống nghiệm. 29 Bình định mức, ống đong. Phễu lọc, giấy lọc, đũa khuấy. Pipette thủy tinh, pipetman 100 – 200 l, 100 – 1000 l Các dụng cụ để chạy điện di: Bộ điện di dứng, bộ nguồn chạy điện di, đầu típ, eppendorf, phao để eppendorf. 3.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG Xác định hoạt tính của protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú theo phƣơng pháp Amano (Phụ lục 1_chƣơng 3). Xác định hàm lƣợng protein hòa tan theo phƣơng pháp Bradford (Phụ lục 2_chƣơng 3). Tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp (Phụ lục 3_chƣơng 3). Xác định trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp điện di SDS-PAGE (Phụ lục 4_chƣơng 3). 3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú Xay đầu tôm trên cối xay thịt, nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát thạch anh đã xử lý và làm sạch. Nội tạng chỉ nghiền. Dùng dung môi (nƣớc cất, dung dịch muối sinh lý, đệm phosphate, đệm Tris-HCl) với các tỷ lệ khác nhau, khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0 - 4oC trong 40 phút để chiết rút enzyme, ly tâm lạnh ở 4 oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ phần cặn, thu dịch chiết (DC). Khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi và loại dung môi chiết với mẫu. Từ đó chọn dung môi và tỷ lệ thích hợp chiết enzyme. 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease Sử dụng các tác nhân gây kết tủa thuận nghịch protein trong dịch chiết nội tạng và đầu tôm là: cồn 96o, acetone và muối sulfate amon. 30 Tiến hành tủa DC bằng các tác nhân trên với tỷ lệ DC/dung môi khác nhau ở điều kiện 0 – 4oC, thời gian tủa 60 phút, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút – thu cặn là chế phẩm enzyme thô (CPT). Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ tủa và tác nhân tủa từ đó chọn ra tác nhân và nồng độ thích hợp để tủa DC thu protease. 3.4.3. Bố trí thí nghiệm Quy trình tách chiết, tinh sạch và khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng hoạt động của protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm sú đƣợc tiến hành theo sơ đồ bố trí nhƣ sau Tôm sú (đầu hoặc nội tạng) Nghiền mịn Chiết dịch enzyme thô Ly tâm dịch chiết enzyme thô Dịch chiết enzyme thô (DC) Tủa dịch chiết Ly tâm thu chế phẩm thô Chế phẩm thô (CPT) Xác định trọng lƣợng phân tử bằng điện di SDS-PAGE Tinh sạch bằng sắc ký lọc gel  Xác định hoạt tính protease  Xác định hàm lƣợng protein  Xác định hoạt tính protease  Xác định hàm lƣợng protein  Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme CPT: nhiệt độ, pH, % muối ăn.  Xác định hoạt tính protease  Xác định hàm lƣợng protein 31 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp Dung môi chiết có ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành chiết tách protease từ mẫu nội tạng và đầu tôm sú bằng các dung môi: nƣớc cất, muối sinh lý, đệm phosphate 0,1M pH 7,0 và đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 cùng với các tỷ lệ khối lƣợng mẫu/dung môi (w/v) khác nhau, đƣợc giữ ở ≤ 4oC bằng đá vụn, khuấy liên tục trên mấy khuấy từ trong 40 phút. Ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Nƣớc cất: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Nƣớc muối sinh lý: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Đệm phosphate 0,1M pH 7,0: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10. Đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5: tỷ lệ mẫu/dung môi (w/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10. Xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng DC, so sánh, chọn ra tỷ lệ chiết thích hợp và loại dung môi chiết thích hợp. Sơ đồ bố trí TN nhƣ sau: Nội tạng tôm sú (đã nghiền) Hòa với các dung môi Nƣớc cất Tỷ lệ 1/1-5 (w/v) Muối sinh lý Tỷ lệ 1/1-5 (w/v) Đệm phosphate Tỷ lệ 1/1-10 (w/v) Tris-HCl Tỷ lệ 1/1-10 (w/v) (w/v) Xác định hoạt tính proetease của DC Xác định hàm lƣợng protein của DC Chọn ra dung môi và tỷ lệ chiết thích hợp Đầu tôm sú (đã nghiền) 32 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC Mỗi loại tác nhân tủa thƣờng có khả năng làm kết tủa protein-enzyme ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme sau khi kết tủa. Tiến hành tủa protein-enzyme từ DC bằng các tác nhân với các nồng độ trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ ≤ 4oC. Ly tâm lạnh 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút thu cặn tủa (DCT). Hòa CPT với dung dịch đệm phosphate 0,1 M pH 7,0 đƣợc đƣa về cùng thể tích nhất định (một lƣợng ít nhất có thể). Tủa bằng ethanol (cồn 96o) đƣợc làm lạnh, nồng độ tủa theo tỷ lệ DC/cồn (v/v): 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8. Tủa bằng acetone đƣợc làm lạnh, nồng độ tủa theo nồng độ phần trăm (%):50; 55; 60; 65; 70; 75. Tủa bằng muối (NH4)2SO4, nồng độ tủa theo nồng độ muối bão hòa (%): 50; 55; 60; 65; 70; 75. Xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của từng CPT, so sánh, chọn ra nồng độ tủa thích hợp và loại tác nhân tủa thích hợp. Sơ đồ bố trí TN nhƣ sau: DC enzyme từ nội tạng tôm Kết tủa bằng các tác nhân với nồng độ tủa khác nhau Cồn 96o Tỷ lệ 1/1-8 (v/v) Acetone Nồng độ 50-75% (NH4)2SO4 Nồng độ 50-75% Xác định hoạt tính protease của CPT Xác định hàm lƣợng protein của CPT Chọn ra tác nhân và nồng độ tủa thích hợp DC enzyme từ đầu tôm 33 3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT a). Nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme. Tiến hành xác định hoạt tính protease CPT của mẫu nội tạng tôm sú ở khi ủ với casein 1% pH 7,0 trong 60 phút với dãy nhiệt độ ủ: 30; 37; 47; 57; 67; 77oC theo phƣơng pháp Amano. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nhƣ sau: b). pH pH cũng là một trong những yếu tố quan trọng có ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính enzyme, mỗi enzyme có một khoảng pH hoạt động thích hợp và một giá trị pH tối ƣu nhất. Tiến hành thí nghiệm, ủ protease CPT của mẫu nội tạng tôm sú với casein 1% thay đổi theo dãy pH: 5; 6; 7; 8; 9 trong thời gian 60’ và nhiệt độ thích hợp (kết quả khảo sát nhiệt độ và thời gian). Xác định hoạt tính theo phƣơng pháp Amano. Sơ đồ bố trí TN nhƣ sau: Kết luận về nhiệt độ hoạt động tối ƣu CPT của mẫu nội tạng tôm Ủ với casein 1% pH 7.0 trong 60 phút với nhiệt độ (oC) 30 o C 37 o C 57 o C 67 o C Xác định hoạt tính protease 47 o C 77 o C 34 c). Nồng độ muối ăn Khảo sát ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT mẫu nội tạng tôm sú. CPT đƣợc hòa với dung dịch muối ăn với các nồng độ: 1%, 3%, 5%,…, 21%. Tiến hành xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano. Bố trí TN theo sơ đồ sau: ĐC 1% 3% 5% 7%....... 19% 21% Kết luận nồng độ muối ăn hoạt động tối ƣu CPT của mẫu nội tạng tôm Nồng độ muối ăn Xác định hoạt tính protease Kết luận pH hoạt động tối ƣu CPT của mẫu nội tạng tôm Ủ với casein 1% trong 60 phút, ở nhiệt độ thích hợp, với pH 5 6 8 Xác định hoạt tính protease 7 9 35 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel Tách các protein của protease trong CPT mẫu đầu và mẫu nội tạng của tác nhân tủa cồn, acetone và tủa muối (NH4)2SO4 với nồng độ thích hợp bằng phƣơng pháp sắc ký lọc gel áp suất thấp (Phụ lục 3 chƣơng 3). Các thông số tinh sạch bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp sau: Gel : Bio-Gel P-100 (Giới hạn phân tách 5.000 – 100.000 Da). Cột : 30 x 1,5 cm Flow adaptor : 1,5 cm. Tốc độ dòng : 0,14 ml/phút. Vmẫu : 1ml. Phân đoạn : 2 ml/phân đoạn. A280 : Độ hấp thụ protein ở bƣớc sóng 280 nm 3.4.5. Xác định trọng lƣợng phân tử bằng phƣơng pháp điện di SDS- PAGE Để xác định trọng lƣợng phân tử protein của protease sau khi tinh sạch bằng sắc ký lọc gel chúng tôi sử dụng kỹ thuật điện di SDS – PAGE (Phụ lục 4 chƣơng 3). Bộ điện di đứng của hãng Bio-Rad. Gel tập trung polyarylamide 4%. Gel phân tích polyarylamide 10%. Nhuộm gel bằng bromophenol Blue 3.4.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm đƣợc lập lại 3 lần, kết quả là trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm. Số liệu đƣợc xử lý để vẽ đồ thị bằng phần mền Excel. 36 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME 4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nƣớc cất ở các tỷ lệ khác nhau Chuẩn bị mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm nghiền nhuyễn, tiến hành chiết rút với nƣớc cất theo các tỷ lệ khối lƣợng mẫu/thể tích nƣớc cất (w/v) lần lƣợt: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ 0 – 4oC trong 40 phút, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC. Kết quả thể hiện trong bảng 4.1 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.1 và đồ thị 4.2. 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Tỷ lệ nội tạng/nước cất (w/v) Hà m lư ợn g p ro tei n ( mg /g) 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g) HL HT Đồ thị 4.1. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng Nhận xét: Lƣợng nƣớc cất dùng để tách chiết có ảnh hƣởng đến hiệu suất tách chiết protein-enzyme và hoạt tính protease của mẫu nội tạng và đầu tôm. Trong khoảng tỷ lệ mẫu/nƣớc cất từ 1/1 đến 1/4, khi tăng lƣợng nƣớc cất hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC cũng tăng. Mối quan hệ tỷ lệ thuận này có thể lý giải: khi lƣợng dung môi tăng, hiệu suất chiết rút protein-enzyme tăng, quá trình khuếch tán của protein vào dung môi sẽ tăng khi tăng thể tích dung môi. 37 Sự khuếch tán này tuân theo định luật Fick: “Lƣợng chất khuếch tán tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan, với gradien nồng độ và thời gian khuếch tán”. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Tỷ lệ mẫu đầu/nước cất (w/v) Hà m lư ợn g p ro tei n ( mg /g) 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g) HL HT Đồ thị 4.2. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/nƣớc cất) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu Khi tăng thể tích dung môi và không thay đổi khối lƣợng mẫu dẫn đến diện tích tiếp xúc giữa dung môi và mẫu nghiền tăng. Lƣợng dung môi tăng làm chênh lệch nồng độ chất tan giữa bề mặt tiếp xúc và các lớp dung môi bên ngoài (gradien nồng độ) tăng. Lƣợng dung môi tăng làm thay đổi pH của môi trƣờng tách chiết. Với các ảnh hƣởng trên đã làm cho lƣợng chất tan chiết tách đƣợc tăng khi tỷ lệ mẫu/dung môi tăng. Cả mẫu đầu và mẫu nội tạng đều cho kết quả tốt nhất về hàm lƣợng protein và hoạt tính protease ở tỷ lệ mẫu/nƣớc cất 1/4. Nếu tiếp tục tăng lƣợng dung môi dẫn đến hiệu suất thu hồi protein enzyme mong muốn sẽ giảm, do lƣợng protein không mong muốn tách chiết tăng ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme, có thể xảy ra khả năng thủy phân lẫn nhau cao. Nhƣ vậy khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của nƣớc cất cho kết quả tốt nhất với tỷ lệ mẫu/nƣớc cất là 1/4 (w/v). 38 4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nƣớc muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau Chuẩn bị mẫu nội tạng và mẫu đầu nghiền nhuyễn tiến hành chiết với dung dịch nƣớc muối sinh lý theo các tỷ lệ mẫu/nƣớc muối sinh lý lần lƣợt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5. Khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ, trong 40 phút, giữ ở nhiệt độ 0- 4 o C, ly tâm thu DC. Kết quả xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein thể hiện trong bảng 4.2 (Phụ lục chƣơng 4) đồ thị 4.3 và đồ thị 4.4 0 2 4 6 8 10 12 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Tỷ lệ mẫu NT/ nước muối sinh lý (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.3. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 0 5 10 15 20 25 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Tỷ lệ mẫu đầu/ nước muối sinh lý (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.4. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/dd muối sinh lý) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu 39 Nhận xét: Khả năng tách chiết protein-enzyme của dung môi nƣớc muối sinh lý cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của DC mẫu nội tạng và mẫu đầu tốt nhất ở tỷ lệ mẫu/dd muối sinh lý là 1/3 (w/v). Sau đó, tăng lƣợng nƣớc muối sinh lý thì khả năng tách chiết protein enzyme giảm dần. Sự thay đổi này tƣơng tự nhƣ dung môi nƣớc cất, có thể lý giải nhƣ phần nhận xét ở mục 4.1.1 4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau Chuẩn bị mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm nghiền tiến hành tách chiết với dung môi đệm phosphate 0,1M pH 7,0 với các tỷ lệ mẫu/đệm phosphate lần lƣợt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10, khuấy đảo liên tục bằng máy khuấy từ trong 40 phút ở 0- 4oC, ly tâm thu DC. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của từng DC. Kết quả trình bày trong bảng 4.3 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.5 và đồ thị 4.6. 0 5 10 15 20 25 30 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 Tỷ lệ mẫu NT/ đệm phosphate (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 100 200 300 400 500 600 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.5. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/dd đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 40 0 5 10 15 20 25 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 Tỷ lệ mẫu đầu/ đệm phosphate (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 20 40 60 80 100 120 140 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.6. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu Nhận xét: Dung môi đệm phosphate cũng ảnh hƣởng rất nhiều đến khả năng tách chiết protein-enzyme. Khi tiến hành khảo sát khả năng tách chiết enzyme của đệm phosphate ở tỷ lệ mẫu/dung dịch đệm phosphate từ 1/1 đến 1/5 (w/v) vẫn chƣa cho kết quả cực đại, đề tài tiếp tục khảo sát tiếp tỷ lệ 1/6 đến 1/10 (w/v). Kết quả đồ thị 4.5 và đồ thị 4.6 cho thấy, tỷ lệ 1/7 (w/v) có ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng tách chiết protease, cho kết quả hoạt tính protease của DC mẫu đầu và mẫu nội tạng cực đại.Tuy nhiên hàm lƣợng protein thì kết quả không giống nhau: Mẫu nội tạng thì cho kết quả khảo sát hàm lƣợng protein tốt nhất ở tỷ lệ NT/đệm phosphate là 1/7 (w/v): 20,04 mg/g. Mẫu đầu thì cho kết quả khảo sát hàm lƣợng protein tốt nhất ở tỷ lệ đầu/đệm phosphate là 1/6 (w/v): 21,23 mg/g. Hai kết quả này có sự chênh lệch không nhiều, hoạt tính protease là yếu tố mà chúng tôi quan tâm hơn. Nhƣ vậy, khả năng tách chiết protein enzyme của đệm phosphate 0,1M pH 7,0 thích hợp với tỷ lệ 1/7 (w/v). 41 4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau Chuẩn bị mẫu nội tạng và đầu tôm nghiền tiến hành tách chiết với dung dịch đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với các tỷ lệ mẫu/dd Tris-HCl lần lƣợt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8; 1/9; 1/10. Khuấy đảo hỗn hợp liên tục bằng máy khuấy từ trong 40 phút ở 0 - 4oC, ly tâm thu DC. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease. Kết quả trình bày trong bảng 4.4 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.7; 4.8. 0 5 10 15 20 25 30 35 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 Tỷ lệ mẫu NT/ đệm Tris-HCl (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 100 200 300 400 500 600 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.7. Ảnh hƣởng tỷ lệ (NT/đệmTris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 0 5 10 15 2 2 3 3 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 Tỷ lệ mẫu đầu/ đệm Tris-HCl (w/v) Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 0 20 40 60 80 100 120 140 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.8. Ảnh hƣởng tỷ lệ (đầu/đệmTris-HCl) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu 42 Nhận xét: Tƣơng tự nhƣ dung môi đệm phosphate, Tris-HCl cũng ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng tách chiết protein enzyme. Kết quả xác định hoạt tính protease và hàm lƣợng protein điều tốt với tỷ lệ mẫu/Tris-HCl 1/7 (w/v). Khả năng tách chiết của đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 đều tốt ở mẫu đầu và mẫu nội tạng tôm sú. Khi tăng lƣợng đệm Tris-HCl lên thì khả năng tách enzyme cũng tăng, lƣợng protein thu đƣợc và hoạt tính protease của nó cũng tăng, nhƣng giá trị này đạt cực đại ơ tỷ lệ 1/7 (w/v), sau đó giảm nhanh nếu tiếp tục tăng lƣợng đệm Tris-HCl. Điều này cũng đƣợc giải thích tƣơng tự khi khảo sát với các dung môi trên (xem phần nhận xét ở mục 4.1.1). Nhƣ vậy kết quả khảo sát khả năng tách chiết ở các tỷ lệ của dung môi Tris- HCl 0,1M pH 7,5 đã chọn đƣợc tỷ lệ chiết thích hợp nhất là 1/7 (w/v). 4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp Sau khi khảo sát khả năng tách chiết của các dung môi (nƣớc cất; muối sinh lý; đệm phosphate; đệm Tris-HCl) ở các tỷ lệ khác nhau, tiến hành so sánh khả năng tách chiết của từng loại dung môi ở tỷ thích hợp để chọn ra dung môi chiết protein- enzyme thích hợp. Kết quả so sánh trình bày trong bảng 4.5, đồ thị 4.9 và đồ thị 4.10. Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu tôm sú Dung môi chiết Nội tạng Đầu HL protein (mg/g) HT protease (U/g) HL protein (mg/g) HT protease (U/g) Nƣớc (1/4) 11,32 312,00 36,77 56,02 Muối (1/3) 10,62 394,32 19,61 79,10 Đệm P (1/7) 27,37 511,12 19,61 79,10 Tris-HCl (1/7) 28,75 543,52 20,04 121,53 43 0 5 10 15 20 25 30 35 Nước (1/4) Muối (1/3) Đệm P (1/7) Tris-HCl (1/7) Dung môi chiết Hà m lượ ng pr ote in (m g/g ) 0 100 200 300 400 500 600 Ho ạt tín h p ro tea se (U /g) HL HT Đồ thị 4.9. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC nội tạng 0 5 10 15 20 2 3 35 40 Nước (1/4) Muối (1/3) Đệm P (1/7) Tris-HCl (1/7) Dung môi chiết Hà m lượ ng pr ote in (m g/g ) 0 20 40 60 80 100 120 14 Ho ạt tín h p ro tea se (U /g) HL HT Đồ thị 4.10. Ảnh hƣởng loại dung môi chiết đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC đầu Nhận xét: Từ đồ thị 4.9 và đồ thị 4.10 cho thấy khả năng chiết của dung môi khác nhau và ảnh hƣởng rất nhiều đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của DC. Mẫu nội tạng: với dung môi Tris-HCl cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính protease DC tốt nhất. Mẫu đầu: thì dung môi Tris-HCl cho kết quả hoạt tính protease DC tốt nhất, nhƣng hàm lƣợng protein của DC cho kết quả tốt với dung môi nƣớc cất. 44 Dung môi đệm phosphate và Tris-HCl có khả năng tách chiết protein- enzyme của mẫu nội tạng cho kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme tốt hơn dung môi nƣớc cất và muối sinh lý. Điều này có thể do dung môi đệm Tris-HCl đảm bảo đƣợc điều kiện pH của môi trƣờng phù hợp khả năng khuếch tán protein của protease hệ tiêu hóa tôm vào DC, hiệu suất thu hồi protein-enzyme mong muốn tốt hơn. Để rõ hơn các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tách chiết protease nhƣ: pH, nhiệt độ ủ, thời gian ủ cần phải nghiên cứu sâu hơn. Lƣợng protein của DC mẫu đầu bằng dung môi nƣớc cất cao nhất, nhƣng hiệu suất thu hồi protease không cao, protein thu hồi không thể hiện hoạt tính protease. Nhƣ vậy, chọn dung môi chiết đệm Tris-HCl 0,05M pH 7,5 với tỷ lệ mẫu/dung dịch đệm Tris-HCl = 1/7 (w/v) để thu DC sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo. 4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC Dung môi hữu cơ thƣờng để kết tủa thuận nghịch protase trong DC mà không làm giảm hoạt tính của chúng là ethanol (cồn 96o) và acetone. Hóa chất thƣờng dùng để kết tủa thuận nghịch protease trong DC mà không giảm hoạt tính protease của chúng là muối (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa protase muốn đạt đƣợc hiệu suất cao mà không làm giảm nhiều hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein của CPT cần phải tiến hành trong điều kiện lạnh 0 - 4oC, tỷ lệ hay nồng độ của tác nhân tủa và điều kiện tủa thích hợp nhất. 4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau Chuẩn bị DC nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7), tiến hành tủa bằng cồn 96o với các tỷ lệ DC/cồn (v/v) lần lƣợt là: 1/1; 1/2; 1/3; 1/4; 1/5; 1/6; 1/7; 1/8 ở 4oC thời gian tủa là 60 phút. Ly tâm lạnh ở 4oC, tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút thu tủa là chế phẩm enzyme thô (CPT). Chế phẩm enzyme thô này đƣợc hòa với dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 7,0 (lƣợng ít nhất), đƣa về 45 cùng thể tích. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của CPT. Kết quả trình bày trong bảng 4.6 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.11 và đồ thị 4.12. 0 2 4 6 8 10 12 14 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 Tỷ lệ DC mẫu NT/cồn (v/v) H àm lư ợn g pr ot ei n (m g/ g) 0 100 200 300 400 500 600 H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.11. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC NT/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 Tỷ lệ DC mẫu đầu/cồn (v/v) H àm lư ợn g pr ot ei n (m g/ g) 0.00 20.00 40.00 60. 0 80.0 100.00 120.00 140.00 H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.12. Ảnh hƣởng của tỷ lệ (DC đầu/cồn) đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT Nhận xét: Qua kết quả thực nghiệm cho thấy, khi tăng thể tích cồn lên thì khả năng tủa protein cũng tăng. Điều này có thể giải thích: khi tăng thể tích cồn làm tăng diện tích tiếp xúc của các phân tử protein trong DC với dung môi cồn, sẽ tách triệt để hơn các phân tử nƣớc bao xung quanh phân tử protein, làm giảm tính tan của protein, tăng khả năng tủa của chúng. Khi tỷ lệ DC/cồn ở 1/6 (v/v) thì có hiệu 46 suất thu hồi protein có hoạt tính protease tốt nhất. Hiệu suất này không duy trì khi tiếp tục tăng lƣợng cồn lên tỷ lệ 1/7 và 1/8, khi đó khả năng tủa protease sẽ giảm, protein không mong muốn và các tạp chất kết tủa sẽ tăng ảnh hƣởng đến hoạt tính. Vì vậy chọn tác nhân tủa cồn với tỷ lệ 1/6 (v/v) để kết tủa thu CPT trong các nghiên cứu tiếp theo. 4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau Chuẩn bị DC nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7), tiến hành tủa bằng acetone với các nồng độ (%) lần lƣợt là: 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ở 4oC trong 60 phút. Ly tâm thu CPT. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease của CPT. Kết quả trình bày trong bảng 4.7 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.13 và đồ thị 4.14. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 50% 55% 60% 65% 70% 75% Nồng độ % acetone với DC mẫu nội tạng H àm lư ợn g pr ot ei n (m g/ g) 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.13. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng 47 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 50% 55% 60% 65% 70% 75% Nồng độ % acetone với DC mẫu đầu H àm lư ợn g pr ot ei n (m g/ g) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) HL HT 4.14. Ảnh hƣởng nồng độ acetone đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu Nhận xét: Từ đồ thị 4.13và đồ thị 4.14 cho thấy tác nhân acetone kết tủa protein của DC từ mẫu nội tạng ở nồng độ 65% cao nhất, của DC từ mẫu đầu ở nồng độ 55%. Nội tạng tôm là nơi chứa hệ protease nhiều nhất, giúp cho quá trình tiêu hóa thức ăn cung cấp năng lƣợng cho tôm. Điều mong muốn của chúng tôi là thu protease từ nội tạng tôm, chính vì thế chúng tôi chọn nồng độ acetone 65% để tủa thu hồi CPT cho các thí nghiệm tiếp theo. 4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau Chuẩn bị DC mẫu nội tạng và đầu của dung môi chiết Tris-HCl (tỷ lệ 1/7), tiến hành tủa bằng muối sulfate amon với các nồng độ phần trăm bão hòa lần lƣợt là 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ở 4oC trong 60 phút, ly tâm thu CPT. Xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính protease. Kết quả trình bày trong bảng 4.8 (Phụ lục chƣơng 4), đồ thị 4.15 và đồ thị 4.16. 48 0 5 10 15 20 25 50% 55% 60% 65% 70% 75% Nồng độ % muối bão hòa với DC mẫu nội tạng Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 360 380 400 420 440 460 480 500 520 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.15. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu nội tạng 0 5 10 15 20 25 50% 55% 60% 65% 70% 75% Nồng độ % muối bão hòa với DC mẫu đầu H àm lư ợn g pr ot ei n (m g/ g) 0 20 40 60 80 100 1 0 1 0 H oạ t t ín h pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.16. Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối (NH4)2SO4 bão hòa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ mẫu đầu Nhận xét: Từ đồ thị 4.15 và đồ thị 4.16 cho thấy nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 70% thì CPT của mẫu nội tạng và mẫu đầu có hoạt tính protease và hàm lƣợng protein cao nhất so với các nồng độ muối bão hòa khác. Vì vậy, chọn nồng độ muối (NH4)2SO4 bão hòa 70% để tủa thu hồi CPT sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 49 4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân Khả năng tủa của mỗi tác nhân ảnh hƣởng rất nhiều đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT. Tiến hành so sánh khả năng tủa của các tác nhân: cồn (tỷ lệ 1/6 v/v), acetone (65%) và muối sulfate amon 70%. Kết quả so sánh đƣợc trình bày trong bảng 4.9, đồ thị 4.17 và đồ thị 4.18 sau: Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protease của CPT Tác nhân tủa Nội tạng Đầu HL protein (mg/g) HT protease (U/g) HTR (U/mg) HL protein (mg/g) HT protease (U/g) HTR (U/mg) CỒN 1:6 11,83 490,19 41,45 18,40 121,98 6,63 ACETON 65% 14,80 471,98 31,70 17,00 106,00 6,24 (NH4)2S04 70% 22,70 496,49 21,74 23,00 122,73 5,34 0 5 10 15 20 25 CỒN 1:6 ACETON 65% Sulfateamon 70% Tác nhân tủa Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 455 460 465 470 475 480 485 490 495 500 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.17. Ảnh hƣởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu nội tạng Từ đồ thị 4.17 ta thấy, khả năng tủa các tác nhân cũng ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT. Tác nhân tủa (NH4)2SO4 70% cho kết quả tủa tốt nhất. Tuy nhiên hoạt tính riêng khi tủa bằng cồn cao hơn tủa bằng acetone 1.769 lần và cao hơn tủa bằng (NH4)2SO4 1,213 lần. 50 0 5 10 15 20 25 CỒN 1:6 ACETON 65% Sulfateamon 70% Tác nhân tủa Hà m lư ợn g p ro te in (m g/ g) 95 100 105 110 115 120 125 Ho ạt tí nh pr ot ea se (U /g ) HL HT Đồ thị 4.18. Ảnh hƣởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT từ DC mẫu đầu Kết quả khảo sát CPT từ DC mẫu đầu không có sự khác biệt so với CPT từ mẫu nội tạng. Tủa bằng (NH4)2SO4 70% cũng cho kết quả hoạt tính protease và hàm lƣợng protein của CPT tốt hơn tủa bằng cồn và acetone, nhƣng hoạt tính riêng của CPT tủa bằng cồn vẫn cho kết quả tốt nhất. Chúng ta thấy: sử dụng cồn làm tác nhân tủa thì giá thành rẻ, quá trình thu CPT đơn giản, nhanh (chỉ cần đƣa bột nhão thu đƣợc sau khi ly tâm vào tủ chân không), sau khi làm khô, hoạt tính enzyme không giảm. Tiến hành thu hồi lƣợng cồn trong khối dịch sau khi thu kết tủa để sử dụng lại nhiều lần, sẽ giảm đáng kể chi phí sản xuất, vệ sinh và an toàn môi trƣờng cũng hoàn toàn đảm bảo; Với tác nhân sulfate amon, ƣu điểm không làm giảm hoạt độ enzyme, không gây mùi khó chịu nhƣ cồn và acetone nhƣng có nhƣợc điểm là: trong CPT có muối sulfate amon, phải tinh sạch loại muối tiếp. Phƣơng pháp tinh sạch loại muối thƣờng áp dụng là dùng màng thẩm tích hay sắc ký lọc gel. Hai quá trình này rất tốn thời gian: đối với phƣơng pháp thẩm tính phải kéo dài 14 đến 20 giờ và phải tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp; sắc ký loại muối bằng Bio-Gel G 25 chi phí tốm kém, quá trình thực hiện phức tạp, thời gian sắc ký lâu. Mặt khác, sulfate amon có tính ăn mòn cao, làm rỉ sắt thép, xâm thực bê tông mạnh, các thiết bị, dụng cụ tiếp xúc với nó phải làm từ hợp kim đặc biệt. 51 Căn cứ vào hoạt tính riêng, sự phân tích trên và hiệu quả kinh tế của quá trình tủa chúng tôi chọn cồn 96o với tỷ lệ 1/6 (v/v) để làm tác nhân tủa protease trong DC nội tạng và đầu tôm để thu CPT là thích hợp nhất. 4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT Do điều kiện thời gian của đề tài, nên chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT trong DC của mẫu nội tạng tôm sú, để giúp chúng tôi tìm hiểu thêm một số tính chất hoạt động của protease trong nội tạng tôm nói chung và đầu tôm nói riêng để có biện pháp bảo quản tôm tốt hơn trong quá trình chế biến. 4.3.1. Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú Xác định hoạt tính protease trong CPT tủa cồn của DC mẫu nội tạng theo phƣơng pháp Amano. Ủ emzyme của CPT với casein 1% pH 7,0 trong 60 phút và nhiệt độ ủ thay đổi lần lƣợt là: 30oC, 37 oC, 47 oC, 57 oC, 67 oC, 77oC. Kết quả xác định hoạt tính đƣợc trình bày trong bảng 4.10 (Phụ lục chƣơng 4) và đồ thị 4.19. 0 200 400 600 800 27 37 47 57 67 77 Nhiệt độ Ho ạt tín h p ro tea se (U /g) Đồ thị 4.19. Yếu tố nhiệt độ ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT Từ đồ thị 4.19 cho thấy đƣờng biểu diễn hoạt tính protease của CPT đạt nhiệt độ hoạt động cực đại ở 47oC. Khi nhiệt độ tăng cao hơn nhiệt độ tối ƣu, hoạt tính 52 protease giảm rất nhanh và hầu nhƣ mất hoạt tính hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn 77 oC. Nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính protease nội tạng của tôm tuy thấp hơn so với bromelin của dứa và papain của đu đủ nhƣng cao hơn nhiệt độ tối ƣu thích hợp của động vật trên cạn. Trái với suy nghĩ lâu nay của nhiều ngƣời cho rằng protease động vật hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 37oC và khoảng nhiệt độ tối ƣu từ 35 - 45oC, thực nghiệm cho thấy enzyme nội tạng của tôm có nhiệt độ thích hợp ở 47oC. Tuy nhiên, kết quả này có sự khác biệt với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Lệ công bố năm 1996, protease trong đầu tôm Bộp và tôm Rảo có nhiệt độ thích hợp nhất ở 55o và 60 o C, theo Reece P. (1988) thì enzyme nội tạng cá Thu Đại Tây Dƣơng, cá Hồi nƣớc ngọt vùng bắc cực đã tinh sạch gồm 2 nhóm: nhóm protease-acid có hoạt tính cao nhất ở 37oC và nhóm protease-kiềm có hoạt tính cao nhất ở 45oC. Kết quả này chứng tỏ nhiệt độ của môi trƣờng sống có ảnh hƣởng đến nhiệt độ hoạt động của enzyme. Mặt khác CPT mà chúng tôi nghiên cứu, ngoài protease còn nhiều protein và các tạp chất khác, chính các tạp chất này có thể làm ảnh hƣởng đến nhiệt độ hoạt động của protease trong CPT. Để làm rõ vấn đề này cần phải nghiên cứu sâu thêm. Điều này rất có ý nghĩa trong chế biến tôm và nghiên cứu ứng dụng protease của nội tạng tôm trong công nghệ thực phẩm, cũng nhƣ các ứng dụng khác của protease. 4.3.2. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú Xác định hoạt tính protease trong CPT tủa cồn của DC mẫu nội tạng theo phƣơng pháp Amano. Ủ emzyme của CPT với casein 1% thay đổi theo pH lần lƣợt: 5; 6; 7; 8; 9 trong 60 phút ở 47oC. Kết quả trình bày trong bảng 4.11 (Phụ lục chƣơng 4) và đồ thị 4.20. 53 0 100 200 300 400 500 600 5 6 7 8 9 Độ pH Ho ạt tín h p rot eas e Đồ thị 4.20. Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính protease của CPT nội tạng tôm sú Nhận xét: Từ đồ thị 4.20 cho thấy protease CPT mẫu nội tạng của tôm sú hoạt động mạnh nhất tƣơng ứng tại pH 7. Kết quả này giống với kết quả nghiên cứu của tác giả Tạ Thị Yến (2005), pH tối ƣu CPT từ nội tạng-thịt-chỉ tôm sú là pH 7,5. có sự khác biệt khi so sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Trân Châu cùng cộng sự: pH tối ƣu CPT từ đầu tôm biển là pH 8,5, so sánh với protease từ nội tạng, gan mực ống của tác giả Đỗ Văn Ninh (2004) hoạt động tốt ở pH kiềm (pH 8,5 - 9,5). Kết quả nghiên cứu trên, có thể sơ bộ kết luận: hệ protease trong nội tạng của tôm sú hoạt động tối ƣu ở khoảng pH trung tính. Điều này phù hớp với đặc điểm cấu tạo của hệ tiêu hóa trong nội tạng tôm sú. 4.3.3. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú Kết quả xác định hoạt tính CPT protease của nội tạng ở nồng độ muối ăn khác nhau đƣợc trình bày trong bảng 4.12 (Phụ lục chƣơng 4) và đồ thị 4.21. Nhận xét: Qua kết quả thực nghiệm cho thấy, nồng độ muối ăn ảnh hƣởng rất lớn đến hoạt tính protease của CPT. Nồng độ muối ăn 3% cho kết quả hoạt tính protease đạt cực đại. 54 0 100 200 300 400 500 600 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Nồng độ muối ăn (%) HT p ro tea se (U /g) HT Đồ thị 4.21. Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease CPT mẫu nội tạng tôm sú Điều này có thể lý giải là do muối ăn phân ly thành Na+ và Cl - , nồng độ muối thấp lớp vỏ hydrate của phân tử protein cũng chƣa bị biến đổi, chƣa gây biến tính protein. Mặc khác, các ion này cũng liên kết với các phần mang điện trong phân tử enzyme, làm tăng điện tích của các trung tâm hoạt động này. Kết quả những biến đổi trên làm