Khóa luận Sử dụng kỹ thuật das-Elisa và rt-pcr để phát hiện virus gây bệnh đốm võng trên cây đu đủ (papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÕNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii iii LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo điều kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin cảm ơn thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ bảo và hỗ trợ cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Con cảm ơn Ba, Mẹ đã luôn dành tình thƣơng cho con; dạy dỗ, động viên con; là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn các Anh, Chị ở Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh đã hết lòng giúp đỡ, đóng góp nhiều kinh nghiệm quý báu cho em hoàn thành tốt khóa luận. Em chân thành cảm ơn anh Cƣờng- Viện Cây Ăn Quả miền Nam, anh Dũng- Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tiền Giang, anh Vinh- Trạm BVTV Tân Phú- Định Quán đã cung cấp tài liệu và tạo điều kiện thuận lợi cho em thu thập mẫu thí nghiệm. Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình dạy bảo, dìu dắt em trong suốt quãng đƣờng sinh viên. Cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 đã luôn bên cạnh mình, đóng góp, động viên mình trong học tập cũng nhƣ trong cuộc sống. TP. HCM, Tháng 9 năm 2005 Nguyễn Thị Thùy Dƣơng iv TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THÙY DƢƠNG, Bộ môn Công nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “SỬ DỤNG KỸ THUẬT DAS-ELISA VÀ RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM VÒNG TRÊN CÂY ĐU ĐỦ (Papaya ringspot virus) TẠI HAI TỈNH ĐỒNG NAI VÀ ĐỒNG THÁP”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Bùi Cách Tuyến Đề tài đƣợc tiến hành tại hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Nội dung thực hiện: - Tiến hành lấy mẫu bệnh đốm vòng trên cây đu đủ tại hai tỉnh điều tra. - Sử dụng kĩ thuật DAS ELISA để chẩn đoán và đánh giá mức độ nhiễm bệnh đốm vòng ở hai tỉnh này. - Thiết lập quy trình RT-PCR để phát hiện PRSV với đối tƣợng thí nghiệm là các mẫu dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp DAS ELISA - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng ở các địa điểm - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo từng giống cây - Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo tuổi cây 4 - 5 tháng (chƣa trái) 70,00 % 6 - 8 tháng 85,71 % 8 - 11 tháng 12,50 % Trên 1năm 36,11 % Xã Mỹ Hiệp 92,68 % Xã Bình Thạnh 77,42 % Xã Phú Tân 47,37 % Xã Phú Lộc 47,37 % Xã Phú An 16,00 % Da bông (Db) 86,54 % Mã Lai (Ml) 80,00 % Địa phƣơng (Đp) 34,92 % v Kết quả đạt đƣợc theo phƣơng pháp RT-PCR - Cặp mồi 1 không đặc hiệu cho trình tự gen coat protein của PRSV-P song vẫn khuếch đại đƣợc sản phẩm mong muốn. - Cặp mồi P4-M30 và P14-M31 đặc hiệu cho trình tự coat protein của PRSV-P. Kết quả giải trình tự một số mẫu - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P14-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 619 bp. - Mẫu Mỹ Hiệp (giải trình tự với mồi P7-M31): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 410 bp. - Mẫu Định Quán (giải trình tự với mồi P7-M30): Thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp. So sánh các trình tự vừa giả đƣợc với trình tự coat protein và genome của PRSV-P trên Genebank, thấy có sự tƣơng đồng khá cao. Chứng tỏ, sản phẩm thu từ mồi P14- M31 và P7-M30 đúng là đợc khuếch đậi từ gen coat protein của PRSV-P. Nhƣ vậy, đã xây dựng đƣợc quy trình chẩn đoán PRSV trên cây đu đủ bằng phƣơng pháp RT-PCR với các cặp mồi P14-M31 hay P7-M30. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................. x DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................xi DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................... xii PHẦN I ............................................................................................................................ 1 GIỚI THIỆU .................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 2 PHẦN II ........................................................................................................................... 3 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 3 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) ........................................................... 3 2.1.1. Phân loại học .................................................................................................. 3 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố ....................................................................................... 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 4 2.1.4. Nhu cầu sinh thái ............................................................................................ 5 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ ............................................ 6 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng ................................................................................... 6 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn .................................................................................. 7 2.1.6. Tình hình sản xuất .......................................................................................... 8 2.1.7. Sâu bệnh ......................................................................................................... 9 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính ........................................................... 10 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ ................................................................ 10 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ.......................... 11 vii 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật ................................................ 11 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) ........................ 15 2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV ...................................... 20 2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng ........................................................ 20 2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị ........................................................................ 20 2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử ....................................... 21 2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học ............................................................... 21 2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ............................................. 22 2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác .......................................................................... 22 2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay . 22 2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) ................................................................................................................ 24 PHẦN III ....................................................................................................................... 27 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 27 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 27 3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu ......................................................................................... 27 3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) .................................................................................................................................... 28 3.3.1. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 28 3.3.2. Hóa chất ....................................................................................................... 29 3.3.3. Quy trình thực hiện ...................................................................................... 31 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ............................................................................. 31 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR ........................................................................... 35 PHẦN IV ....................................................................................................................... 39 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................................... 39 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu ..................................................... 39 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA ................................... 40 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra ........................................................ 40 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây ................................................................. 42 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR ..................................................................................... 44 4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu ........................................................................ 53 viii PHẦN V ........................................................................................................................ 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 56 5.1. Kết luận ............................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ................................................................................................................ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 58 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 61 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid CP gene: Coating protein gene DAS ELISA: Direct double antibody sandwich DMSO: Dimethylsulforxide DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease dNTP: Deoxynucleotide triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid EIA: Enzyme immunoassay ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay EtBt: Ethidium bromide FDA: Food and Drug Administration MMLV: Moloney murine leukemia virus mRNA: Messenger RNA OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction p-NPP: p- nitrophenyl phosphate PRSV: Papaya ringspot virus PSP-T: Phosphate buffer saline with TWEEN-20 RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RT-PCR: Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Cây đu đủ ........................................................................................................ 3 Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus ........................................................................ 12 Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây ............................................ 16 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá ................................................................................. 17 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) ................................. 18 Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả ................................................................... 18 Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) ............................................... 19 Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA .................................................................................. 24 Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn ........................................... 44 b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 ................................ 44 Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 .................................................................. 45 Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 .............................................................. 46 Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 ........................................................... 47 Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên ................................................. 50 Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 ...................................................... 51 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 ........................................................ 52 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ ...... 6 Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (Trần Thế Tục, 1998) ..................... 9 Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm ........................................ 28 Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra .......................................... 40 Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây .................................................. 42 Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ....................................................................... 43 xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra ................................................... 41 Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây .................................................................. 42 Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây ..................................................................... 43 1 PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Tính cấp thiết của đề tài Đu đủ (Carica papaya L.) là một loại trái cây giàu dinh dƣỡng và đang có giá trị kinh tế hiện nay. Trái chín có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao, theo phân tích thành phần hoá học, trong 100g thịt trái chín có chứa 86,6 % nƣớc, 12,1 % tinh bột, 0,6 % protein, 0,3 % lipit, năng lƣợng là 50 calo, 0,7 % xơ, 0,5 % tro và khá nhiều khoáng nhƣ: Kali (204 mg), Ca (34 mg), P (11 mg). Đặc biệt, đu đủ cung cấp lƣợng vitamin rất phong phú: vitamin A (450 mg), C (74 mg), B1 (0,03 mg), P (0,5 mg), B2 (0,04mg) (Trần Thế Tục, 1998). Hơn nữa, lá đu đủ có thể sử dụng làm mềm thịt hay làm giảm độ đục trong quy trình sản xuất bia. Ngoài ra, đu đủ còn đƣợc sử dụng cho nhiều mục đích khác nhƣ: ly trích papain, sử dụng làm rau (đối với trái chƣa chín), hoặc để diệt khuẩn. Trên thế giới, vùng trồng và xuất khẩu đu đủ nổi tiếng là Hawaii, đồng thời nó cũng là nơi sản xuất đu đủ lớn nhất ở Mỹ, cung cấp 60 % số quả tƣơi cho Mỹ và Nhật Bản. Tuy nhiên việc sản xuất đang bị hạn chế bởi bệnh do papaya ringspot virus (PRSV) (Gonsalves, 1998). Đây là virus gây thiệt hại hàng đầu đối với canh tác đu đủ. Không chỉ ở Hawaii, Philippine - một quốc gia nổi tiếng về sản xuất đu đủ - cũng bị thiệt hại rất lớn bởi loài virus này. Chẳng hạn, năm 1984, 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite đã bị tàn phá, làm thiệt hại 300.000 USD (Opina, 1986). Do tính chất gây bệnh đặc trƣng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kì phƣơng thức nào mà chỉ có thể khắc phục bằng cách phòng trừ và sử dụng giống kháng bệnh nên thiệt hại của bệnh rất nghiêm trọng. Thêm vào đó, bệnh lại rất khó nhận biết ở giai đoạn sớm, đến khi ta quan sát đƣợc triệu chứng một cách rõ ràng thì đã quá muộn và thƣờng không chính xác. Thiệt hại đáng kể do PRSV đối với việc canh tác đu đủ đã làm nảy sinh nhu cầu làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc có nền sản xuất đu đủ lớn nhƣ Mỹ, Brazil, Philippine, Cuba… mà còn 2 đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam - tiềm năng khí hậu, đất đai rất phù hợp cho việc phát triển sản xuất đu đủ. Cùng với sự phát triển vƣợt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh ngày nay đã giúp ta có thể chẩn đoán nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh virus. Xuất phát từ các vấn đề trên, trong phạm vi khoá luận tốt nghiệp, tôi xin thực hiện với nội dung “Sử dụng kỹ thuật DAS-ELISA và RT-PCR để phát hiện virus gây bệnh đốm vòng trên cây đu đủ (Papaya ringspot virus) tại hai tỉnh Đồng Nai và Đồng Tháp”. 1.2. Mục đích - Khảo sát và thu thập mẫu đu đủ ở một số vùng chuyên trồng đu đủ ở Đồng Nai và Đồng Tháp. - Chẩn đoán nhanh và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kit ELISA. - Xây dựng quy trình RT-PCR để nhận biết virus gây bệnh đốm vòng trên đu đủ. - Phân tích trình tự gene của một số mẫu bệnh nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa các chủng gây bệnh tại Việt Nam với các chủng khác trên thế giới. 1.3. Yêu cầu - Đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng kỹ thuật ELISA trên các mẫu thu thập đƣợc. - Xây dựng quy trình RT-PCR có tính đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng. 1.4. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu - Đối tƣợng nghiên cứu Các mẫu lá đu đủ (Carica papaya L.) đƣợc lấy từ hai tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp. - Phạm vi nghiên cứu Chẩn đoán và đánh giá tình hình nhiễm bệnh bằng phƣơng pháp DAS-ELISA. Nhận biết sự hiện diện của virus PRSV trên mẫu đu đủ thu thập đƣợc thông qua sử dụng kĩ thuật RT-PCR 3 Hình 2.1 Cây đu đủ (Semillas del Caribe, 2003) PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây đu đủ (Carica papaya L .) 2.1.1. Phân loại học - Tên khoa học: Carica papaya L. - Họ: Caricaceae (hay Papayaceae- họ đu đủ) Đu đủ do có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ cây thân thảo nên tiết kiệm đƣợc diện tích trồng trọt, tận dụng đƣợc những khoảng không gian trống trên đồng ruộng, vƣờn nhà… lại mau cho trái (khoảng từ 6 - 7 tháng) nên cây đƣợc trồng rất phổ biến ở khắp nơi trên thế giới dù đây là một loại cây khá nhạy cảm với các tác nhân gây hại trong tự nhiên. Sản phẩm thu hoạch đƣợc sử dụng để ăn hoặc làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc, thuộc da. Ở một số nơi trên thế giới, đặc biệt là ở Australia và một vài đảo ở phía đông Ấn Độ, cây đu đủ đƣợc biết đến với tên gọi là papaw hay pawpaw. Bên cạnh tên papaya rất phổ biến thì ở Nam Á và Đông Ấn Độ nó còn có các tên gọi bị sai lệch đi nhƣ kapaya, kepaya, lapaya hay tapaya. Ở Pháp, trái đu đủ đƣợc gọi là papaye, còn cây đu đủ là papayer, đôi khi đƣợc gọi theo tên nội địa là figuier des Iles. Theo tiếng Tây Ban Nha, trái đu đủ đƣợc gọi là mélon zapote, lechosa, papaya; còn cây đu đủ có tên là papayo hay papayero, fruta bomba, mamón hay mamona tùy thuộc vào từng nƣớc. Ở Brazil, tên thông dụng của nó là mamao. Ở Châu Âu, khi đƣợc phát hiện lần đầu tiên nó đƣợc đặt cho tên địa phƣơng là “tree melon” (James A. Duke, 1983). 4 2.1.2. Nguồn gốc, phân bố Mặc dù hiện nay vẫn chƣa xác định chính xác nguồn gốc, xuất xứ nhƣng cây đu đủ đƣợc đa số các nhà nghiên cứu khẳng định là bắt nguồn từ Châu Mỹ nhiệt đới, có thể là từ miền Nam Mexico và một số vùng lân cận của Trung Mỹ (Gonsalves, 1998). Hiện nay, ngƣời ta vẫn chƣa tìm thấy một dạng cây nào gần gũi với những giống hiện có mà ở trạng thái hoang dại do cây đu đủ là cây có khả năng giao phấn rất lớn và thƣờng nhân giống bằng hạt nên khả năng bị biến đổi di truyền là rất dễ dàng. Các tài liệu nghiên cứu đã ghi lại rằng, trƣớc năm 1525, hạt đu đủ lần đầu tiên thu thập đƣợc là từ Panama, sau đó là ở Dominican Republic. Từ đó việc trồng trọt đã lan rộng sang khắp các vùng có khí hậu ấm hơn ở miền Nam và Trung Mỹ, miền Nam Mexico, Đông Ấn Độ và Bahamas rồi lan dến Bermuda vào năm 1616. Vào khoảng 1550, ngƣời Tây Ban Nha đem các hạt đu đủ từ Philippine về trồng và từ đây đu đủ bắt đầu lan rộng đến Malacca và Ấn Độ. Sau đó hạt đu đủ lại đƣợc lan truyền từ Ấn Độ sang Naples vào năm 1626. Ở Mỹ, hạt đu đủ đƣợc đem đến Florida từ Bahamas. Đến 1959, đu đủ đƣợc trồng phổ biến ở khắp miền Nam và Trung Florida nhƣng chủ yếu là trong các vƣờn nhà và các trang trại với quy mô nhỏ. Ngày nay, đu đủ phổ biến ở khắp các khu vực nhiệt đới trên thế giới cũng nhƣ quần đảo thuộc Thái Bình Dƣơng và ngày càng trở nên thích hợp đƣợc với nhiều khu vực và nhiều vùng đất khác nhau. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Theo những nghiên cứu, khảo sát của James A. Duke trong Handbook of Enery Crop (1983) Thân, rễ Đu đủ là loại thực vật thân thảo, kích thƣớc lớn, sau khoảng một năm cây có thể cao từ 1,8 - 3 m, sau đó có thể đạt đến độ cao 6 m thậm chí là 9 m. Thân già có màu xám xanh, nâu xám hay nâu đỏ. Thân cây xù xì, lồi lõm do những vết sẹo của lá rụng, sẹo phát hoa để lại. Hầu hết rễ đu đủ là rễ chùm, đâm nhánh ngang mạnh khi gặp điều kiện thuận lợi, phân bố rất nông trên tầng đất 10 - 30 cm và rất rộng. Rễ nhỏ, giòn dễ bị tổn thƣơng do cơ giới cũng nhƣ do ngập úng hay khô hạn. Trong đất, rễ hoạt động rất mạnh do vậy 5 rất cần oxy, vì vậy chúng rất mẫn cảm khi đất chặt, bí hay ngập nƣớc, đất có độ ẩm cao cũng gây bất lợi cho sự phát triển của rễ. Lá Lá đơn, mọc thành chùm ở ngọn thân và xoắn theo hình trôn ốc với khoảng cách giữa các cuống lá là 30 - 105 cm. Lá lớn, cuống lá dài, phiến lá rộng, mỏng, mềm, xẻ thùy (khoảng 5 - 9 thùy). Gân lá màu hơi vàng, nổi rõ ở mặt dƣới phiến lá. Lá đu đủ rất dễ bị gãy, rách. Cần chú ý bảo vệ bộ lá vì số lá tỉ lệ thuận với số phát hoa mọc ra ở nách lá, khả năng đậu trái, độ lớn trái và năng suất thu hoạch. Hoa Hoa mọc ở nách lá, có năm cánh, cánh hoa dày, thƣờng nở vào ban đêm, có mùi hƣơng nhẹ. Thời gian từ khi nở đến khi tàn của một hoa kéo dài từ 3 - 5 ngày. Trái, hạt Đa số trái có hình dạng tƣơng tự trái dƣa (melon-like), ngoài ra còn có hình bầu dục hơi tròn, đôi khi có hình quả lê hoặc kéo dài ra thành hình dùi cui. Trọng lƣợng trái có thể lên đến 9 kg. Đối với những cây hoang dại trái có thể nhỏ hơn. Nằm sát thành phía trong của thịt quả là bó sợi màu trắng, mang các hạt hình trứng, màu đen nhƣ hạt tiêu. Chiều dài hạt khoảng 5 mm, đƣợc phủ bởi bao hạt bằng chất gelatin trong suốt. Trái đu đủ mang trung bình khoảng 300 - 500 hạt. Khi trái có đủ độ già thƣờng có khoảng 60 - 70 % hạt có thể mọc thành cây. 2.1.4. Nhu cầu sinh thái Khí hậu Đu đủ rất nhạy cảm với sự lạnh giá, giới hạn phân bố trong khoảng 32o Nam đến 32 o Bắc với nhiệt độ ấm áp khoảng 25oC và lƣợng mƣa 1200 mm/năm. Do đó cần lƣợng mƣa phải nhiều hoặc phải đƣợc tƣới nƣớc đầy đủ nhƣng cũng cần phải có sự thoát nƣớc tốt. Nếu ngập úng, cây sẽ chết trong vòng 48 giờ. Trong điều kiện nhiệt độ thấp khoảng 32oF (-0,56oC) sẽ gây hại cho cây, nếu cái lạnh cứ kéo dài cây sẽ chết. Đu đủ là một cây ƣa sáng, thiếu ánh sáng dẫn đến các đốt của thân vƣơn dài, cuống lá nhỏ, phiến lá mỏng và dễ bị sâu bệnh phá hoại nhƣ rệp, virus. 6 Đất đai Mặc dù ánh sáng là yếu tố cần nhất nhƣng bên cạnh đó đất trồng cũng cần giàu hữu cơ và tơi xốp. Tuy nhiên nhìn chung đu đủ có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau song đất đó phải giữ nƣớc cũng nhƣ thoát nƣớc tốt và có độ thoáng nhất định, có tầng canh tác dày 70 cm, hàm lƣợng khí trong đất là 4 %. pH tối ƣu cho cây phát triển là 5,5 - 6,5. 2.1.5. Ý nghĩa kinh tế và giá trị dinh dƣỡng của đu đủ 2.1.5.1. Giá trị dinh dƣỡng Hàm lƣợng dinh dƣỡng có trong các thành phần của cây đu đủ đƣợc công bố từ Trung Mỹ và Cuba (James A. Duke, 1983) Bảng 2.1 Giá trị dinh dƣỡng có trong 100 g bộ phận có thể ăn đƣợc của cây đu đủ Bộ phận Thành phần Trái Lá ( * ) Calories 23,11 - 25,8 Lƣợng nƣớc 85,9 - 92,6 g 83,3 % Protein 0,081 - 0,34 g 5,6 % Chất béo 0,05 - 0,96 g 0,4 % Carbohydrates 6,17 - 6,75 g 8,3 % Chất xơ 0,5 - 1,3 g 1,0 % Chất tro (Ash) 0,31 - 0,66 g 1,4 % Calcium 12,9 - 40,8 mg 0,406 % (CO) Phosphorus 5,3 - 22,0 mg Sắt 0,25 - 0,78 mg 0,00636 % Carotene ( ** ) 0,0045 - 0,676 mg 28,900 I.U. Thiamine 0,021 - 0,036 mg Riboflavin 0,024 - 0,058 mg Niacin 0,227 - 0,555 mg Ascorbic Acid 35,5 - 71,3 mg 38.6 % Tryptophan 4 - 5 mg Methionine 1 mg Lysine 15 - 16 mg Magnesium 0,035 % Phosphoric Acid 0,225 % ( * ): Phân tích đƣợc thực hiện tại Malaya ( ** ) : Lƣợng carotenoid trong đu đủ chủ yếu ở dạng cryptoxanthin. 7 2.1.5.2. Ứng dụng thực tiễn Giá trị thực phẩm Đu đủ phổ biến nhất là đƣợc sử dụng dƣới dạng tƣơi sống. Ngoài ra còn có thể sử dụng làm món trái cây trộn, nƣớc sốt trái cây, coctail, thêm vào kem, bánh… Đu đủ chƣa chín không bao giờ đƣợc ăn do nó chứa rất nhiều nhựa. Thậm chí khi đƣợc sử dụng làm salad nó cũng cần đƣợc bỏ vỏ, hạt, đun sôi đến khi mềm. Trái chín có thể loại bỏ vỏ, hạt, phần thịt cho vào các chai hoặc can chứa để lên men làm rƣợu trái cây. Ở miền Đông Ấn Độ, lá đu đủ non có thể sử dụng nấu và ăn tƣơng tự nhƣ rau bina (rau Spinach). Các chùm hoa đực đƣợc bán sang các nƣớc Indonesia, New Guinea để nấu (có thay nƣớc nấu để loại bỏ vị đắng) và ăn nhƣ rau sống. Ở Indonesia, hoa đôi khi đƣợc sử dụng để làm kẹo. Ở Châu Phi, thân cây còn non có thể đƣợc sử dụng để nấu ăn. Sự hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Italy và Somalia đã tìm thấy trong hạt đu đủ có chứa đến 18 acid amine gồm: glutamic acid, arginine, proline, aspatic acid, proline, tyrosine, lysine, aspatic acid, glutamic acid. Ngoài ra còn ly trích đƣợc tinh dầu có mùi hƣơng nhẹ từ hạt và tinh dầu này có thể đƣợc sử dụng trong công nghiệp thực phẩm hay trong kĩ nghệ công nghiệp. Giá trị thƣơng mại Nhựa thu đƣợc từ thân và trái đu đủ còn xanh chứa 2 loại enzyme phân giải protein là papain và chymopapain. Trong đó, chymopapain có số lƣợng nhiều nhất song papain lại có hoạt lực mạnh gấp đôi. Một công dụng đƣợc biết đến nhiều nhất của sản phẩm papain thƣơng mại là xử lý làm mềm thịt, đặc biệt là ở các hộ gia đình. Tại các lò mổ, ngƣời ta nhận thấy rằng nếu tiêm papain vào gia súc khoảng nửa giờ trƣớc khi mổ sẽ có tác dụng làm thịt mềm hơn bình thƣờng. Ngoài ra, papain còn đƣợc sử dụng để làm tinh khiết bia, xử lý len và sợi vải trƣớc khi nhuộm, xử lý da thú trong công nghiệp thuộc da, sử dụng nhƣ một chất bổ trợ trong sản xuất cao su, sử dụng xử lý gan cá ngừ trƣớc khi ly trích dầu để thu đƣợc lƣợng vitamin A và D nhiều hơn. Mặt khác, nó còn đƣợc bổ sung vào kem đánh răng, chất tẩy rửa, mỹ phẩm cũng nhƣ là các dƣợc phẩm trị về tiêu hóa. Papain 8 còn có khả năng điều trị những vết loét, hạn chế sự sƣng tấy, khả năng phát sốt và hàn dính vết thƣơng sau phẫu thuật. Gần đây, FDA (Cơ quan quản lý lƣơng thực và dƣợc phẩm Hoa Kỳ) đã khẳng định tác dụng của việc tiêm chemopapain vào đĩa sụn xƣơng sống của bệnh nhân để điều trị hoạt động thoái hoá các đĩa sống lƣng. (FDA Drug Bull. 12(3):17-18) Sử dụng trong dân gian Trong các bài thuốc dân gian ở miền nhiệt đới, nhựa tƣơi đƣợc bôi lên những vết sƣng tấy, trị mụn cóc, đốm tàn nhang và đƣợc sử dụng nhƣ một bài thuốc trị giun sán. Trái còn xanh, hạt khi tiêu hoá rất có hại, có khả năng gây sẩy thai. Tuy nhiên một vài nơi sử dụng chúng nhƣ một bài thuốc điều kinh và tẩy giun. Lá, rễ cũng có thể sử dụng làm thuốc tẩy giun. Lá khô đƣợc sử dụng dƣới dạng thuốc hút với công dụng làm dịu đi cơn hen suyễn hoặc sử dụng thay thế cho thuốc lá. Nhựa cây có thể sử dụng trị bệnh vảy nến, trị chứng khó tiêu, sát trùng tại chỗ, sử dụng đắp lên các vết bỏng, vết cháy… Hoa đƣợc dùng trị bệnh vàng da. Công dụng nhƣ một liều thuốc kháng sinh: những nghiên cứu tại trƣờng Đại học Nigeria đã phát hiện thấy dịch trích từ quả đu đủ chín, chƣa chín và từ hạt đều có hoạt tính chống lại vi khuẩn G+; sử dụng với liều mạnh có thể chống lại cả vi khuẩn G - . Dịch thu từ hạt đƣợc ly trích, sản xuất ra aglycone của glucotropaeolin benzyl isothiocyanate (BITC) có tác dụng kìm hãm và tiêu diệt vi khuẩn, nấm. Ở một bệnh viện tại London vào năm 1977, trong một ca bị nhiễm khuẩn sau phẫu thuật trên một bệnh nhân đƣợc thay thận, bệnh nhân này đã đƣợc cứu chữa chỉ bằng một mảnh đu đủ đắp lên vết thƣơng và để trong 48 giờ, trong khi đó tất cả các phƣơng thuốc hiện đại lúc bấy giờ đều không hiệu quả. 2.1.6. Tình hình sản xuất Trên thế giới Đối với một vƣờn cây đu đủ bình thƣờng, một cây có thể cho 2 - 4 trái chín/ tuần trong suốt mùa thu hoạch. 9 Cây khỏe mạnh, nếu đƣợc chăm sóc tốt, năng suất trung bình là 34 kg/cây/năm; một số cây cá biệt có thể cho đến 136 kg/cây/năm. Ở Nam Phi, năng suất trung bình vào năm thứ 4 là 100 kg/cây. Với mật độ 1000 cây/ha cho năng suất trung bình là 30 tấn. Ở khu vực Hilo của đảo Hawaii, năng suất trung bình là 37 tấn/ha. Với một diện tích là 100 ha, Princess Orchards ở Maui cho 68 kg/tuần trong suốt mùa thu hoạch. Ở khu vực Kapoho của Hawaii, năng suất trung bình là 38000 kg/ha trong năm đầu tiên, 25000 kg/ha vào năm thứ 2. Cây đu đủ cho khoảng 50 % sản lƣợng papain vào năm đầu tiên, 30 % và năm thứ hai và 20 % vào năm thứ ba. Năng suất thu hoạch trung bình 70 - 130 kg/ha. Theo thống kê, năng suất papain thô/ha vào năm đầu tiên là 20 - 25 kg; năm thứ hai là 90 - 100 kg; năm thứ ba là 60 - 90 kg/ha; 30 - 40 kg/ha vào năm thứ tƣ; 20 hoặc ít hơn vào năm thứ năm. Ngƣời ta cũng ƣớc lƣợng rằng 1 kg papain thô tƣơng ứng với khoảng 5 kg nhựa tƣơi (James A. Duke, 1983). Bảng 2.2 Sản lƣợng trung bình đu đủ trên thế giới (*) (Trần Thế Tục, 1998) Năm 1979 - 1981 1991 1992 1993 Sản lƣợng 3,016 5,024 5,421 5,563 (đơn vị tính là 1000 tấn) ( * ): Nguồn FAO Yearbook- Production. Vol. 47. 1993. Rome 1994. Ở Việt Nam Ở nƣớc ta hiện nay, do sâu bệnh, úng nƣớc và điều kiện thời tiết không thuận lợi cho việc ra hoa, kết trái nên năng suất đu đủ trung bình chỉ khoảng 20 tấn/ha (Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Tiền Giang, 2003). Đồng thời ở Việt Nam, đu đủ chỉ đƣợc trồng với mục đích thu hoạch trái phục vụ cho mục tiêu thực phẩm (ăn tƣơi, sản xuất nƣớc ép hoa quả, bánh kẹo,…) và cũng chỉ sản xuất với quy mô nhỏ và vừa, phục vụ cho nhu cầu trong nƣớc mà thôi. 2.1.7. Sâu bệnh Theo Nguyễn Thành Hối (1996), các loại sâu bệnh trên đu đủ bao gồm: 10 2.1.7.1. Các loài côn trùng gây hại chính a) Rệp sáp (gồm 5 họ Asterolecanniidae Coccidae Diaspididae Margarodiae Pseudococcidae) (Nguyễn Mạnh Chinh, 2002) Thƣờng là loại rệp có màu trắng xám, phát triển nhiều trong mùa nắng. Rệp có kích thƣớc 2 - 3 mm, bám sát vào ngọn thân, lá, trái, bông… chích hút nhựa cây, lá làm trái kém phát triển và dễ bị nấm bồ hóng tấn công gây bệnh. b) Rệp dính (rầy mềm- Aphididae) Đeo bám, chích hút ở trái, đọt non hoặc ở mặt dƣới lá. c) Nhện đỏ (rầy lửa- Tetranychus seximaculatus) Nhện có màu hồng nhạt đến đỏ đậm, rất nhỏ (dƣới 1 mm) nên phải quan sát kĩ mới phát hiện đƣợc, thƣờng bám ở phía mặt dƣới lá và trên trái. Nơi bị chích hút nặng lá bị vàng loang lổ từng đốm nhỏ, sau đó bị cháy đi. Khi bị nặng lá có thể bị cháy hoàn toàn. d) Ruồi đục trái (Toxotrypana curvicauda) Thƣờng chỉ gây hại nặng khi trái để chín cây. Ruồi đục vào trái để đẻ trứng, giòi nở ra sẽ gây thối trái. 2.1.7.2. Các bệnh phổ biến trên đu đủ (Nguyễn Thành Hối (1996), Nguyễn Văn Thành (1997)) a) Bệnh thối gốc ( do nấm Pythium spp) Bệnh chủ yếu do loài Pythium aphanidermatum gây ra. Nấm bệnh tồn lƣu trong xác bã cây bệnh có trong đất và sinh sản rất nhiều noãn bào tử để lây lan. Bệnh phát triển mạnh nhất khi trời nóng ẩm. Ẩm độ quanh gốc cây càng cao, bệnh phát triển càng mạnh. b) Bệnh đốm lá (do nấm Phyllosticta sulata) Trên lá, đốm bệnh có hình tròn, hình trứng, thon dài hay có hình dạng bất kì. Vùng giữa vết bệnh có màu bạc trắng, viền có màu vàng hay nâu. Vùng bệnh khô và mỏng dần rồi rách đi. 11 Mầm bệnh tồn lƣu rất lâu trong xác lá cây bệnh và phát tán theo gió để lây lan. Do đó nên tiêu hủy xác lá bệnh để tránh lây lan. c) Bệnh cháy lá (do nấm Helminthosporium rostratum) Phần chóp của các lá bên dƣới có các đốm úng nƣớc, lan dần vào bên trong lá làm lá bị nâu và khô đi. Nếu nhiễm nặng, cuống lá bị héo, mềm và lá bị rụng. d) Bệnh phấn trắng (do nấm Oidium caricae) Mặt dƣới lá bị đóng phấn màu trắng, nếu nhiễm nặng lá sẽ phát triển kém, có thể bị biến dạng chút ít. Trái cũng bị các đốm phấn trắng tròn hay bầu dục và phát triển kém. e) Bệnh khảm (do Papaya mosaic virus) Bệnh phổ biến và quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới. Ở Việt Nam, bệnh gây thiệt hại nặng ở Đồng bằng sông Cửu Long. Cây con mới trồng cũng có thể nhiễm bệnh song thƣờng thấy ở cây đã đƣợc 1 - 2 năm tuổi. e) Bệnh đốm vòng (do Papaya ringspot virus) Cùng với bệnh khảm, bệnh đốm vòng cũng khá phổ biến và nghiêm trọng cho đu đủ ở Đồng bằng sông Cửu Long. f) Bệnh do tuyến trùng (Meloidogyne incognita và Rotylenchulus reniformis) Cả hai loại tuyến trùng đều phá hoại rễ và gây thiệt hại cho đu đủ. Cây con nhiễm nặng có thể chết, còn cây trƣởng thành có thể giảm sức sinh trƣởng. 2.2. Sơ lƣợc về Papaya ringspot virus và tác hại của nó trên đu đủ 2.2.1. Khái niệm chung về bệnh virus hại thực vật Sự phát hiện ra virus hại thực vật Từ hàng ngàn năm về trƣớc, khi xã hội loài ngƣời phát triển còn rất thấp, thiên nhiên và môi trƣờng đang đƣợc bảo tồn hầu nhƣ giữ nguyên trạng thái hoang sơ ban đầu, con ngƣời đã nhận ra sự phá hoại của virus hại thực vật, điều này đƣợc thể hiện trong kinh thánh và những văn bia còn lƣu lại cho đến ngày nay. Tuy nhiên phải đến những năm 1600 - 1660, lịch sử mới ghi chép lại nhóm bệnh này qua những bức họa mô tả triệu chứng bệnh virus trên hoa tulip của các danh họa Tây Âu (mà nay hiện còn đƣợc lƣu giữ trong các bảo tàng). Sau đó mãi đến cuối thế kỉ XIX, virus hại thực vật mới chính thức đƣợc phát hiện với công lao của nhiều nhà khoa học nhƣ: Mayer A. (1886), Ivanopski D. (1892), Baijerinck M. (1898), Loeffler và Frosh (1898). Đến đầu 12 thế kỉ XX, các virus gây bệnh cho thực vật lần lƣợt đƣợc phát hiện nhƣ: virus khảm thuốc lá, virus thoái hóa khoai tây… Nhƣng mãi tới năm 1939 khi Kaushe Pflankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus TMV (virus khảm thuốc lá) thì việc nghiên cứu và phát hiện nhóm nguyên nhân gây bệnh này mới phát triển nhanh chóng và thu nhiều thành tựu to lớn. Ngày nay, virus học (Virology) là môn khoa học hiện đại, ứng dụng rất nhiều thành tựu của sinh học phân tử. Hình 2.2 Hoa tulip bị nhiễm bệnh virus (Potyvirus, Spring, 2001) Thiệt hại của bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) - Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần dần tàn lụi. Tuy nhiên, virus cũng có thể gây nên những thiệt hại nặng nề và nhanh chóng ngay trong các vụ trồng cây hằng năm nhƣ virus gây bệnh vàng lụi lúa, xoăn lá cà chua, thoái hóa khoai tây, khảm sọc lá hành tây,… - Thiệt hại quan trọng thứ hai của virus là ảnh hƣởng tới phẩm chất của các sản phẩm nông nghiệp. Chẳng hạn, hạt lúa bị bệnh vàng lụi thƣờng bị lép không thu hoạch đƣợc, hoặc sẽ rất nhỏ, hạt gạo bị đen, ăn có vị đắng. - Bệnh virus còn nguy hiểm ở chỗ: virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây chủ vì vậy virus chỉ bị chết hay mất hoạt tính khi nào tế bào cây bị chết, hủy hoại. Đối với những cây trồng nhân giống vô tính nhƣ cam, quýt, khoai tây, khoai lang… virus là nguy cơ hủy diệt rất lớn. Chúng rất khó phát hiện và loại trừ. 13 Đặc tính chung của virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Virus thực vật là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Virus có cấu tạo rất đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và acid nucleic. Lõi nucleic ở bên trong và đƣợc bao bọc bằng một lớp vỏ protein (vỏ capsid). Thƣờng acid nucleic của virus thực vật là RNA và chỉ khoảng hơn 25 loài virus có lõi là DNA. Virus gây bệnh cây thƣờng chỉ có một loại protein. Virus kí sinh ở mức độ tế bào. Một virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus khác nhau. Trong tế bào chủ, nó sẽ điều khiển tế bào chủ dùng vật chất từ chính tế bào chủ để tạo thành nhiều virus mới. Cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết. Triệu chứng bệnh virus hại thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Việc phân loại triệu chứng bệnh virus hại thực vật có ý nghĩa rất quan trọng trong chẩn đoán, phòng trừ và nghiên cứu bệnh hại. Tuy nhiên, sự phân loại triệu chứng bệnh chỉ có tính chất tƣơng đối vì diễn biến bệnh rất phức tạp. Virus sau khi xâm nhiễm vào cây trồng và gây ra nhiều triệu chứng khác nhau mà chúng ta có thể quan sát bằng mắt thƣờng, song cũng có nhiều trƣờng hợp không thấy biểu hiện gì khác thƣờng mà ngƣời ta gọi là “bệnh ẩn”. Qua nghiên cứu, nhiều nhóm tác giả đã chia triệu chứng bệnh thành các nhóm sau: Khảm lá Đây là triệu chứng phổ biến nhất với hầu hết các bệnh virus hại cây. Virus xâm nhiễm vào lá gây ra hiện tƣợng lá bị loang lổ, chỗ xanh đậm, chỗ xanh nhạt, chỗ biến vàng. Ví dụ nhƣ virus khảm thuốc lá, khảm lá ớt, khảm dƣa chuột. Khảm đốm có hình nhẫn Thƣờng gặp là khảm và tạo ra đốm chết hoại hình nhẫn (đốm vòng) nhƣ bệnh đốm hình nhẫn trên đu đủ, cây mận, thuốc lá, hoa cẩm chƣớng. Triệu chứng hại gân lá Là hiện tƣợng bệnh phá hoại ở gân lá dẫn đến gân lá sáng, gân chết, biến dạng,… nhƣ virus Y hại thuốc lá, khoai tây. Khảm lá, lùn cây Đây là hiện tƣợng khá phổ biến của bệnh virus nhƣ khảm lùn cây ngô, vàng lùn cây lúa. 14 Biến dạng Nhƣ xoăn lá cà chua, cuốn lá khoai tây, xoăn lá hồ tiêu, ớt. Biến vàng Nhƣ vàng ở lúa, vàng lá cam, lá đậu. Hiện tƣợng tàn lụi Cây còi cọc, lùn, mọc từng búi nhƣ bệnh lùn bụi ở lạc, bệnh triteza ở cam, chanh. Gây vết chết ở thân cây Bệnh vàng lá ở cam gây ra vết lõm ở thân các cây cam, chanh; virus sƣng cành táo. Biến dạng củ, quả Nhƣ bệnh đốm héo cà chua, bệnh vàng lùn khoai tây, bệnh virus ở táo, mận. Sự truyền bệnh ở virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Virus có cơ chế truyền bệnh rất thụ động do virus là vật kí sinh tuyệt đối ở mức độ tế bào. Vì vậy, sự lan truyền của bệnh có những đặc điểm riêng, khác các nhóm vi sinh vật khác. Sự truyền bệnh không nhờ môi giới - Truyền bệnh qua nhân giống vô tính thực vật: Chẳng hạn truyền qua nuôi cấy mô tế bào; qua hom giống chiết từ cây bị bệnh, qua mắt ghép, cành ghép, chồi ghép, gốc ghép bị nhiễm bệnh. Các cây trồng nhân giống vô tính bằng củ nhƣ khoai tây, cây cảnh, cũng có nguy cơ truyền nhiễm virus rất lớn. - Truyền bệnh qua hạt giống và phấn hoa: Virus thƣờng truyền qua hạt giống song cũng có khoảng 100 virus lan truyền đƣợc qua hạt giống. Phần lớn nhóm này là các virus ở những cây họ bầu bí, họ đậu. - Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Thƣờng xảy ra với các bệnh virus có tính chống chịu cao với điều kiện môi trƣờng. Lá cây trồng ở mật độ dày và giao tán có thể lây lan lẫn nhau khi lá cây bệnh cọ sát vào lá cây khỏe. Các vết thƣơng gây nên do côn trùng, các động vật khác, máy móc, dụng cụ canh tác, thu hái cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền cơ học, tiếp xúc nhờ giọt dịch. Một số virus có sức chống chịu kém hơn trong điều kiện môi trƣờng thiên nhiên thƣờng vừa lây bằng cơ học tiếp xúc lại vừa lây bằng côn trùng. Sự truyền bệnh nhờ môi giới 15 - Côn trùng là nhóm môi giới truyền bệnh virus quan trọng nhất. Có thể chia các kiểu truyền bệnh qua côn trùng và các động vật thành 3 nhóm virus + Nhóm truyền theo kiểu bền vững: Là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian dài từ một vài tiếng đến một tuần lễ mới có khả năng lây bệnh cho cây. Ví dụ gây bệnh xoăn lá cà chua (Tomato leafcurl virus), virus gây bệnh cuốn lá khoai tây (Potato leafrool virus) + Nhóm truyền bệnh theo kiểu không bền vững: Gồm những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ một vài phút đến một giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây đến 30 phút chích hút ở cây bệnh sau đó có thể lây lan ngay. Điển hình là các virus thuộc nhóm potyvirus nhƣ: virus đốm vòng đu đủ (Papaya ringspot virus), khảm lùn ngô (Maize dwarf mosaic virus). + Nhóm truyền bệnh nửa bền vững: Gồm các virus có đặc tính truyền trung gian giữa hai nhóm trên. Điển hình là virus Tungro hại lúa, virus Triteza hại cam chanh,… - Nhện thuộc họ tám chân, chúng có mật độ khá cao trên các cây kí chủ nhƣng phạm vi kí chủ của nhện hẹp hơn các loài côn trùng khác, có thể truyền đƣợc khoảng hơn 9 loài virus gây hại ở thực vật. - Tuyến trùng có thể truyền đƣợc khoảng 20 loài virus gây hại cây. Các loài tuyến trùng thƣờng truyền những virus không bền vững (non-persistant), một số tuyến trùng có thể giữ virus trong cơ thể chúng trong một thời gian khá dài, một vài tháng thậm chí cả năm (chẳng hạn tuyến trùng Xiphinema truyền bệnh virus hại nho). - Nấm trong quá trình gây bệnh và xâm nhập vào cây khỏe có khả năng mang theo virus gây hại cho cây. Đặc biệt là các loài nấm sống dƣới đất. - Cây tơ hồng (Cuscuta sp.)- là loài thực vật dại rất phổ biến ở nƣớc ta. Đây là một loài thực vật thƣợng đẳng kí sinh tạo rễ ăn sâu vào thân các cây sống để hút nhựa. Chính vì vậy có khá nhiều loài virus thực vật có thể di chuyển theo thân cây tơ hồng và lây lan từ cây này sang cây khác. 2.2.2. Virus gây bệnh đốm vòng- Papaya ringspot virus (PRSV) Tác nhân gây bệnh 16 Phân loại: Họ: Potyviridae Giống: Potyvirus Loài: Papaya ringspot virus Tên viết tắt: PRSV Dòng: type P Nguồn gốc: PRSV-p đƣợc phân lập và nghiên cứu lần đầu tiên vào năm 1949 trên cây đu đủ ở Hawaii (Jensen, 1949), sau đó bắt đầu xuất hiện nhiều báo cáo về loài virus này từ khắp các khu vực trồng đu đủ trên thế giới. Còn về vùng địa lý đầu tiên xuất hiện loài virus này vẫn chƣa đƣợc xác định chính xác. Đặc điểm: Papaya ringspot virus (PRSV)- thuộc nhóm potyvirus. Là một virus với acid nhân là RNA, sợi đơn (ssRNA, positive-strand viruses), xoắn ngoằn ngoèo, kích thƣớc sợi 760 - 800 nm, đƣờng kính 12 nm với bộ gen có kích thƣớc tổng cộng là 12 kb. Ở cây bị nhiễm, virus đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của cây, chúng tạo nên các thể vùi hình trụ (cylindrical incusions- CI) hoặc vô định hình (amorphous inclusion- AI) trong tế bào chất, không bào của mô cây bị nhiễm. Song những tế bào này không chứa các virion, trong khi đó nhựa cây thƣờng chứa rất nhiều virion. Mỗi một virion gồm khoảng 5,5 % nucleic acid và 94,5 % protein (Marc Fuchs, 1997). Hình 2.3 Các dạng thể vùi của virus tồn tại trong mô cây (Mark A. Ross, 2002) PRSV đƣợc chia làm hai dạng PRSV-w và PRSV-p. Trong đó, PRSV-p xâm nhiễm và gây hại trên hầu hết các loài đu đủ và cây thuộc họ bầu bí trên thế giới, còn 17 PRSV-w chỉ xâm nhiễm trên những cây thuộc họ bầu bí, không xâm nhiễm trên cây đu đủ (Gonsalves, 1998 và Tennant et al., 1994). Tuy nhiên, trên thực tế rất ít khi phát hiện thấy PRSV-p trên các cây họ bầu bí trên đồng ruộng mà chỉ có thể thấy trên các cây họ bầu bí trong điều kiện thí nghiệm mà thôi. Một vài nghiên cứu đƣa ra giả thuyết rằng PRSV-p là một dạng đột biến từ dạng PRSV-w; song những nghiên cứu cụ thể về sự tiến hoá này vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng. Do theo những khảo sát về trình tự DNA mã hoá protein vỏ (coat protein- CP) của virus ở Australia, trình tự này rất giống nhau giữa hai loài P và W; song loài PRSV-w đã đƣợc tìm thấy ít nhất là 20 năm trƣớc khi phát hiện thấy loài PRSV-p. PRSV-p bao gồm một số loài, loài tìm thấy ở Hawaii khác với loài tìm thấy ở Thái Lan hay Florida. Do đó, phƣơng pháp khống chế mầm bệnh ở mỗi vùng cũng không giống nhau (Marison F, 2002). Phân bố địa lý Phân bố rộng khắp vùng Trung Đông, Nam và Trung Mỹ; Trung Quốc, Pháp, Đức, Ấn Độ, Ý, Mexico, Đài Loan, và đặc biệt là ở Mỹ. Triệu trứng (Vũ Triệu Mân (1999) và Duke J. (1983)) Đặc điểm chính của bệnh là làm lùn cây, sản lƣợng trái bị giảm, lá bị khảm và biến dạng. Ở lá, bệnh thƣờng tạo ra các đốm sáng màu vàng nhạt lúc đầu, lá hơi co và khảm nhẹ. Sau dần, vết đốm phát triển thành những đốm hình nhẫn, xuất hiện rất nhiều trên bề mặt lá. Ở mặt trên của các lá đọt, vùng mô lá ở giữa gân phụ và gân nhánh bị nhăn phồng. Bìa lá non bị uốn cong vào theo mặt dƣới lá. Bìa lá già thì cuốn lên. Khi cây bị bệnh nặng, lá non thƣờng bị mất thùy, chỉ còn cuống, đôi khi cả cuống cũng bị biến dạng, co quắp. Hình 2.4 Triệu chứng bệnh trên lá 18 Hình 2.5 Đối chiếu giữa lá bệnh (bên trái) và lá khỏe (bên phải) (Mark A. Ross, 2002) Ở quả, lúc đầu vết bệnh là những đốm thâm xanh thẫm, sau đó lớn dần thành các đốm hình nhẫn màu xanh thẫm. Vết bệnh thƣờng tập trung ở nửa trên của quả, gần về phía cuống. Khi quả già, chính các vết thâm này sẽ thối sâu vào bên trong quả gây hỏng quả. Bệnh còn tạo các sọc dầu, màu xanh trên ngọn thân và cuống lá. Hình 2.6 Triệu chứng trên cuống lá và quả (Denis Persley, 2004) Trái bệnh bị nhạt do virus làm giảm lƣợng đƣờng trong trái. Cây đu đủ ở bất kì độ tuổi nào cũng đều rất nhạy cảm với virus này, song đối với các cây còn non, khi bị nhiễm sẽ không chết, vẫn sống nhƣng còi cọc và không có khả năng cho trái. Đƣờng lây nhiễm (Vũ Triệu Mân, 1999) PRSV là một loài vi sinh vật sống kí sinh. Chúng lây truyền từ cây chủ này sang cây chủ khác thông qua một vector. Đó là hai loài aphids (rầy mềm hay rệp muội), Aphis gossypii (rệp bông) và Myzus persicae (rệp đào), chúng mang theo virus trên cơ thể và truyền sang cây khi chúng chích hút cây, và truyền theo phƣơng thức không bền vững 19 (non-persistant). Trong sự lây truyền bệnh, virus cần sự hiện diện của một protein là AI (amorphous inclusion protein) đóng vai trò nhƣ một nhân tố hỗ trợ cho sự lây truyền thông qua côn trùng. Ngoài ra, bệnh còn có thể bị lây truyền từ cây bệnh sang cây lành nếu con ngƣời chạm vào cây bệnh rồi sau đó chạm vào cây lành hoặc lây truyền trực tiếp qua các vết thƣơng cơ học. Bệnh lây lan nhanh nhất là ở các cây từ 5 - 6 tháng tuổi. Virus không truyền qua hạt của trái bệnh. Đồng thời virus không có khả năng tồn tại trong môi trƣờng đất và trong các mô cây đã bị chết. Hình 2.7 Myzus persicae (trái) và Aphis gossypii (phải) (Introduction to plant virus, Featured creatures) Mức độ nguy hại Ở Hawaii, ngành thƣơng mại đu đủ bắt đầu vào những năm 1940 với diện tích trồng ban đầu là 500 mẫu Anh (acres) ở hòn đảo Oahu thuộc quần đảo Hawaii. Đến năm 1945, PRSV đƣợc phát hiện lần đầu tiên tại Hawaii, sau đó vào những năm 1950 nó đã trở thành nguyên nhân chính gây nên thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất đu đủ ở Oahu (Golsalves, 1998). Điều này đã khiến cho nền sản xuất đu đủ ở Oahu ngƣng trệ hẳn. Tuy nhiên để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ đu đủ, ngƣời dân ở đảo Hawaii bắt đầu chuyển sang chuyên canh đu đủ ở quận Puna, cũng thuộc đảo Hawaii. Nguyên nhân là do Puna là một vùng đất đƣợc xem nhƣ là miễn nhiễm với PRSV trong suốt hơn 30 năm, mặc dù các khu vực lân cận hầu nhƣ phá sản trƣớc thiệt hại từ PRSV. Tuy nhiên, vào 1992, PRSV đã bắt đầu lan truyền đến Puna và nhanh chóng lan rộng khắp nơi. Chỉ trong vòng 1 năm sau khi xuất hiện PRSV, ngƣời nông dân nơi đây đã chứng kiến sự hủy diệt khủng khiếp của nó: vào năm 1992 sản lƣợng đu đủ ở Puna là 53 triệu pounds, đến 1993, sản lƣợng suy giảm đến 15 triệu pounds, đến 1998, sản lƣợng chỉ còn 23 triệu pounds. 20 Ở Philippines, đu đủ là loại trái cây xếp thứ 6 trong tổng sản lƣợng trái cây (Philippines Recommends for Papaya, 1977). Vào 1984, khi PRSV bắt đầu xâm nhiễm vào 200 ha đu đủ ở Silang, Cavite, đã làm thiệt hại năng suất lên đến 300000 USD. Sau đó bệnh lan truyền rất nhanh sang những vùng trồng đu đủ khác ở Cavite và một số tỉnh thuộc phía Nam Tagalog, đặc biệt là ở Laguna và Batangas. Tƣơng tự, nền sản xuất đu đủ ở phía nam Luzon, Philippines đã từng là một nền sản xuất mang lại nhiều lợi nhuận cho đến khi có sự bùng nổ của dịch bệnh do PRSV. Nó đã làm thiệt hại đến 80 % sản lƣợng đu đủ nơi này, và hiện nay nó đã lan rộng khắp Luzon, Visayas và một số nơi thuộc Mindanao (Swain, 2001) Biện pháp phòng trừ tổng hợp - Cần tìm kiếm, khảo nghiệm cũng nhƣ nhập nội các giống đu đủ kháng bệnh. - Tạo nguồn cây con sạch bệnh trong vƣờn ƣơm, cách ly chống rệp. - Sử dụng các biện pháp hóa học để diệt côn trùng truyền bệnh nhất là đối với rệp bông (Aphis gossypii) và rệp đào (Myzus persicae). - Thực hiện chọn lọc, vệ sinh đồng ruộng thƣờng xuyên để loại bỏ cây bệnh, bảo vệ cây đu đủ tới 12 tháng tuổi, sau đó thu hoạch chậm nhất tới 18 tháng tuổi thì chặt bỏ để xây dựng vƣờn mới 2.2.3. Những phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus PRSV (Vũ Triệu Mân, 2003) 2.2.3.1. Phƣơng pháp quan sát triệu chứng Dựa trên những mô tả sẵn có về các dạng bệnh virus để phân biệt bệnh virus thực vật với các triệu chứng do viroid, mycoplasma, tuyến trùng, bệnh không truyền nhiễm (do môi trƣờng không thuận lợi) gây ra. Triệu chứng bệnh virus bao gồm hai nhóm chính là: Nhiễm hệ thống (còn gọi là nhiễm toàn cây) và nhiễm bộ phận (còn gọi là chết hoại cục bộ). Nhóm nhiễm hệ thống thƣờng tạo hiện tƣợng khảm lá (mosaic), còn nhóm nhiễm bộ phận thƣờng tạo vết chết cục bộ (nécrotic local lésion). Một điều cần chú ý là bệnh virus thƣờng có hiện tƣợng mất triệu chứng (latent periode). Hiện tƣợng này đôi lúc gây ra sự nhầm lẫn giữa cây bệnh và cây khỏe. 2.2.3.2. Phƣơng pháp cây chỉ thị 21 Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây kí chủ (có thể là cây trồng hay cây dại) nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh. Đây là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Cây chỉ thị cũng đƣợc chia làm hai nhóm: Cây nhiễm bệnh cục bộ (tạo ra các vết chết trên lá, thân…) và cây nhiễm bệnh hệ thống ( thƣờng tạo ra triệu chứng toàn thân nhƣ khảm lá, biến vàng, lùn cây…) 2.2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng hiển vi điện tử Trong tế bào kí chủ, virus thƣờng tạo thành các dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này không phải lúc nào cũng có thể quan sát thấy, song ta có thể nhuộm màu rồi quan sát dƣới kính hiển vi quang học thông thƣờng với độ phóng đại 80 lần. - Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất. - Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định hai virus là khác nhau trong một mẫu. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là IEM method. - Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng Ultramicrotom và nhuộm mẫu đƣợc cắt, quan sát sự hiện diện của virus trong mẫu đƣợc cắt. 2.2.3.4. Phƣơng pháp huyết thanh học Là phƣơng pháp sử dụng rộng rãi, đặc hiệu và nhanh chóng để chẩn đoán virus thực vật. Ba phƣơng pháp chính thử huyết thanh - Phƣơng pháp kết tủa: Dựa trên cơ sở hỗn hợp virus và kháng huyết thanh, tạo sự kết tủa trong dung dịch hay trong gel - Phƣơng pháp liên kết: Trong phƣơng pháp này virus tiểu thể hoặc kháng thể cho hấp thụ. Phản ứng dƣơng gây nên các tiểu thể lớn liên kết thành khối với nhau, tăng phản ứng virus-kháng thể. - Liên kết miễn dịch men 22 + ELISA: Thử nghiệm ELISA có nhiều dạng, tuy nhiên tất cả đều liên quan đến đĩa nhựa nhiều lỗ đã đƣợc xử lý đặc biệt, do đó bề mặt đĩa sẽ liên kết đƣợc với protein (virus hoặc kháng thể). Do tính đặc hiệu, kháng thể sẽ bắt các kháng nguyên đặc hiệu. Kế tiếp cho chất nền thích hợp vào thì màu sắc sẽ biến đổi nơi có kháng thể gắn với enzyme đƣợc giữ lại trên đĩa, nghĩa là có virus bệnh cần chẩn đoán. + DIBA hoặc FIPSA: Phân tích miễn dịch điểm giống nhƣ ELISA, nhƣng mẫu dịch cây đƣợc đƣa vào từng điểm trực tiếp trong màng nitrocellμlose hoặc nylon. Màng này liên kết tất cả protein bao gồm cả virus. Sau đó, sự có mặt của virus đƣợc xác định bằng kháng huyết thanh có gắn với enzyme. 2.2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, từ năm 1980 các phƣơng pháp sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ và mang lại nhiều thành tựu to lớn cho việc chẩn đoán, phát hiện và nghiên cứu bản chất virus gây bệnh nhƣ phƣơng pháp DNA probe, hybridation, PCR. Nhờ các phƣơng pháp này chỉ cần với một lƣợng nhỏ DNA hay RNA thu từ cây chủ, ta có thể khuếch đại chúng lên, qua bản gel điện di ta có thể xác định sự tồn tại của chúng. 2.2.3.6. Các phƣơng pháp khác (Vũ Khắc Nhƣợng, 1983) Đối với một số loại bệnh cây còn dùng phƣơng pháp hóa học để chẩn đoán dựa vào sự xuất hiện màu sắc nhƣ dùng dung dịch CuSO4 3% để chẩn đoán bệnh virus Cucumis virus 2. Phƣơng pháp huỳnh quang để chẩn đoán mô quả, hạt bị bệnh dựa vào đặc tính của mô bệnh và của kí sinh vật có khả năng phát sáng trong khi chiếu nguồn tia sáng có đủ độ dài sóng nhất định (nguồn sáng thƣờng dùng là đèn thạch anh). Phƣơng pháp đo độ nhớt của dịch cây cũng là phƣơng pháp có thể dùng để chẩn đoán bệnh lý của một số trƣờng hợp cây bị bệnh. 2.2.4. Sơ lƣợc về phƣơng pháp ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Phƣơng pháp này đƣợc thiết kế 23 cho việc phát hiện và định lƣợng vật chất nhƣ peptides, protein, antibodies, hormone,… Đôi khi nó còn đƣợc gọi bởi một tên gọi khác là EIA (Enzyme ImmunoAssay). Từ năm 1978, Clark và Adam đã ứng dụng phƣơng pháp ELISA trong chẩn đoán virus hại khoai tây, thí nghiệm này đã thành công và từ đó phƣơng pháp này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh thông thƣờng và đƣợc ứng dụng nhiều trong chẩn đoán nhanh bệnh virus thực vật, phát hiện cây bệnh ẩn (Phạm Văn Ty, 2001). Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là: Khi có một protein lạ xâm nhập vào máu của động vật (kháng nguyên) thì trong cơ thể động vật sẽ có một phản ứng mạnh mẽ trở lại và sinh ra ở máu động vật một loại protein đặc hiệu (kháng thể). Kháng thể khi kết hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành kết tủa, làm mất tác dụng của kháng nguyên, vô hiệu hóa kháng nguyên. Trên cơ sở đó ngƣời ta đã tách virus từ cây bệnh, lấy virus đã đƣợc làm tinh khiết tiêm vào máu động vật làm thí nghiệm (thƣờng là thỏ, chuột bạch hay ngựa) để gây miễn dịch, sau đó thu đƣợc kháng huyết thanh đa dòng (polyclonal antibody). Bằng một số phƣơng pháp khác, ngƣời ta phân ly virus thành các dòng riêng biệt, thực hiện nhân chúng trên tế bào ung thƣ lách chuột bạch trong môi trƣờng vô trùng và thu đƣợc kháng huyết thanh đơn dòng (monoclonal antibody). Đặc điểm quan trọng của phản ứng kháng huyết thanh là tính đặc hiệu của nó: mỗi kháng nguyên chỉ kết hợp với một loại kháng thể tƣơng ứng mà thôi, không kết tủa chéo, do đó phƣơng pháp này đƣợc ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu khoa học và sản xuất. Nhƣ vậy, kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bƣớc: - Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể - Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm. 24 Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là (John R., 2001): - Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). - Indirect ELISA: Phƣơng pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). - Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Đƣợc gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies). Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA Trong phạm vi đề tài khóa luận này, chúng tôi đã sử dụng kĩ thuật DAS ELISA (Double Antibody Sandwich) để thực hiện. Đây là một dạng của Direct sandwich ELISA với kháng thể sử dụng là kháng thể đa dòng thu nhận từ thỏ kể cả kháng thể bắt và kháng thể phát hiện. Hình 2.8 Bộ test kit DAS ELISA 2.2.5. Sơ lƣợc về kĩ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) Kĩ thuật PCR (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998) PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong 25 sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một một lƣợng lớn bản sao của một trình tự xác định. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999) DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). Từ “xuôi” và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen. PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: - Biến tính phân tử DNA (Denature) - Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) - Tổng hợp mạch mới (Extension) Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. Nested-PCR (Mc Pherson M.J., 2000) Đây là một dạng cải tiến từ phƣơng pháp PCR, trong đó thí nghiệm sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi. Cặp mồi thứ nhất sẽ khuếch đại trình tự có kích thƣớc lớn hơn, sau đó các mồi “nested” (nested primer) sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu. Phƣơng pháp nested-PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested-PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested- PCR (HN-PCR). 26 Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Song do sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR . RT-PCR (Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction) Do Taq polymerase không hoạt động đƣợc trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kĩ thuật phối hợp là RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR). Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc. Mồi sử dụng cho phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên. Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 27 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 8 năm 2005. Địa điểm lấy mẫu: - Xã Mỹ Hiệp, xã Bình Thạnh, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp - Xã Phú Lộc, xã Phú An, huyện Tân Phú, tỉnh Đồng Nai - Xã Phú Tân, huyện Định Quán, tỉnh Đồng Nai Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh- Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Do đu đủ ở các vƣờn đƣợc chọn chỉ là một loại cây trồng xen, bổ sung để tận dụng những khoảng đất trống khi cây trồng chính còn nhỏ, chƣa giao tán (nhƣ các vƣờn mãng cầu, cam quýt, bƣởi, xoài mới trồng) hoặc trồng thành đƣờng biên bao quanh các ruộng trồng cây ngắn ngày nhƣ đậu tƣơng, lạc nên chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu nhƣ sau: - Trong các vƣờn trồng xen, thƣờng đu đủ đƣợc trồng thành hàng xen kẽ với cây trồng chính và các hàng đu đủ này cách nhau khoảng 2 - 4 m. Đối với những vƣờn này, lấy mẫu theo hình ziczắc sao cho việc lấy mẫu đảm bảo đƣợc tính chất ngẫu nhiên. Đối với dạng trồng theo đƣờng biên của ruộng, nếu đƣờng biên này bao gồm nhiều hàng đu đủ hợp thành thì chúng tôi cũng tiến hành lấy mẫu theo đƣờng zic zắc; còn nếu đƣờng biên chỉ gồm một hàng đu đủ, lấy mẫu ngẫu nhiên theo khoảng cách (tức là cứ 5 - 10 cây thì lấy một mẫu). - Trên mỗi cây đƣợc chọn, cắt lấy lá ở phần ngọn (cách đỉnh khoảng 2 - 3 lá) cho vào một bao nilon riêng có ghi nhãn cẩn thận với đầy đủ thông tin về địa điểm, chủ vƣờn, giống cây, triệu chứng, điều kiện canh tác (xem Bảng điều tra ở phần Phụ lục). Mẫu sau đó đƣợc đem về phòng thí nghiệm và trữ trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC. 28 Bảng 3.1 Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Stt Địa điểm Số lƣợng mẫu Tỉnh Huyện Xã 1 Đồng Tháp Cao Lãnh Mỹ Hiệp 45 Bình Thạnh 35 2 Đồng Nai Định Quán Phú Tân 20 Tân Phú Phú Lộc 20 Phú An 25 Tổng số mẫu 145 3.3. Phƣơng pháp giám định bệnh đốm vòng trên đu đủ (Papaya Ringspot Desease) Trong phạm vi khóa luận tốt nghiệp này, tôi đã thực hiện giám định bệnh đốm vòng bằng phƣơng pháp DAS ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay) và sau đó tiến hành kiểm tra lại kết quả của thí nghiệm ELISA bằng kĩ thuật RT-PCR trên các mẫu dƣơng tính thu đƣợc. 3.3.1. Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ - Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu - Kéo - Cân phân tích - Eppendoff 1,5 ml để chứa mẫu sau khi nghiền - Eppendoff 0,2 ml - Hộp đựng eppendoff - Micropipette P1000 - Micropipette P100 - Đầu tip 1000 μl - Đầu tip 100 μl - Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng và keo dán đĩa ELISA (adhesive film) - Ống đong 29 - Khay đổ gel điện di - Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel) - Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA (nhƣ eppendoff, cột lọc, tube rửa…) Máy móc, thiết bị - Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh) - Máy li tâm (Sigma, Hettich) - Tủ mát ( nhiệt độ 2 - 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo) - Tủ định ôn (cài đặt ở 37oC) (Memmert) - Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert) - Máy vortex (IKA Works) - Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Ependof) - Lò viba (Electrolux) - Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad) - Máy đọc gel (Biorad) 3.3.2. Hóa chất 3.3.2.1. Dùng trong DAS ELISA Sử dụng kit PLANTEST ELISA® trên đối tƣợng PRSV do hãng Bio Rad cung cấp. Loại kit sử dụng là Kit 480- DAS ELISA. Hóa chất - Dịch trích (Extraction buffer X20), trữ ở 2 - 8oC (*) - Dịch rửa (Washing buffer X20), trữ ở 2 - 8oC (*) - Coating buffer X1 (blue), trữ ở 2 - 8oC - Antibodies (blue cap), trữ ở -20oC - Conjugate buffer X1 (red), trữ ở 2 - 8oC - Conjugate antibodies (red cap), trữ ở -20oC - Substrate buffer X1, trữ ở 2 - 8oC - Substrate tablets- pNPP (p- nitrophenyl phosphate), dạng viên (5 mg/1 viên), trữ ở 2 - 8oC ( * ): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit. 30 3.3.2.2. Dùng trong RT- PCR Hóa chất dùng trong tách chiết RNA Sử dụng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio Rad cung cấp. - Lysis solution - Low stringency wash solution (X5) - High stringency wash solution - Dnase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng) - Dnase dilution solution - Elution solution - β- mercaptoethanol, 14,2 M (catalog #161-0710) (*) - Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 % ( * ) - Ethanol 100 % và 70 % (*) - Tris-base (pH 7,5, 10 mM) ( * ) - Nitơ lỏng (*) - NaOH 0,1M ( * ) - EDTA 1mM ( * ) - DEPC (Diethyl pyrocarbonate) ( * ) ( * ): Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit. Hóa chất sử dụng tạo cDNA Sử dụng kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit do Bio-Rad cung cấp - iScript Reaction Mix (X5) - Nuclease-free water - iScript Reverse Transciptase Hóa chất sử dụng trong PCR - Nuclease-free water - iTaq buffer (X10) - iTaq DNA polymerase (Bio-Rad) - MgCl2 (50 mM) - dNTP mix (10 mM) (Bio-Rad) - DMSO - Primer: 31 Cặp primer 1 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 900 bp) (Roberto C.A. Lima, 2002) Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟ Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟ Cặp primer 2 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 429 bp) P7 5‟- CGG GAC CAG TGG AAC TTT CAC G- 3‟ M30 5‟- CCT CTC AGT GGC ATT TCT CTT TGC- 3‟ Cặp primer 3 (kích thƣớc sản phẩm khuếch đại là 658 bp) P14 5‟- CCA AGA ATG AAG CTG TGG ATG C- 3‟ M31 5‟- ATC GAA AGC GTA TCT AGC GAG GC- 3‟ Trong đó, P- plus: mồi dƣơng hay mồi xuôi (forward primer). M- minus: mồi âm hay mồi ngƣợc (reverse primer). Hóa chất sử dụng trong điện di - Agarose - TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8) - Blue/Orange Loading dye 6X (Promega) - Ethium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 % - Ladder 100 bp (kích thƣớc 1500 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 2 % 3.3.3. Quy trình thực hiện 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA Ly trích mẫu Mẫu sau khi lấy ra từ tủ -20oC đƣợc cắt thành mảnh nhỏ, cân khoảng 0,5 g cho vào cối nghiền trong 2,5 ml dung dịch đệm ly trích (extraction buffer X1); sao cho tỉ lệ giữa lƣợng mẫu và dịch trích là 1:5. Do virus tồn tại nhiều trong bó mạch libe nên khi chọn mẫu nghiền thƣờng ta nên chọn phần gân lá và nên chọn các lá non. Tiến hành nghiền cho đến khi mẫu mịn ra và hòa tan đều trong dịch trích, sau đó cho tất cả dịch thu đƣợc vào một eppendoff 1,5 ml sạch, có nắp và đem ly tâm ở 7000 vòng/3 phút ở 4oC. Ghi chú thông tin cần thiết lên eppendoff. Mẫu sau khi nghiền có thể bảo quản ở 2 - 8oC trong vòng 48 giờ. 32 Thực hiện thí nghiệm ELISA - Bƣớc 1: Phủ kháng thể vào các giếng: Trƣớc tiên phải pha loãng kháng thể với tỉ lệ kháng thể/ dịch đệm là 1/500. Nhƣ vậy, hóa chất pha cho mỗi dĩa gồm 10 ml buffer và 20 μl kháng thể. Phân phối dịch pha loãng vào các dĩa sao cho 100 μl/giếng. Sau đó dùng băng keo trong (adhesive film) dán dĩa lại và đem ủ ở 37oC trong 2 giờ. Ủ xong, đem rửa dĩa bằng dịch rửa PBS- TWEEN X1 ba lần với máy rửa dĩa ELISA. Sơ đồ phủ kháng thể 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B ( * ) C ( * ) D ( * ) E ( * ) F ( * ) G ( * ) H - Bƣớc 2: Phân phối dịch trích mẫu vào các giếng cũng với thể tích 100 μl/giếng. Đồng thời ở giai đoạn này ta cũng phân phối các đối chứng âm và dƣơng vào các giếng đối chứng. Sự phân phối tiến hành theo từng cặp nhƣ sơ đồ. : Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất : Giếng đƣợc phủ bởi kháng thể : Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào) (*) 33 Sơ đồ phân phối dịch trích mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B ( * ) BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C ( * ) BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D ( * ) PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E ( * ) PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F ( * ) NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G ( * ) NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H Sau khi phân phối ta dùng adhesive film đậy dĩa và ủ dĩa qua đêm ở nhiệt độ 2 - 8 oC. Ủ xong ta tiến hành rửa dĩa 3 lần với PBS- TWEEN X1. - Bƣớc 3: Phân phối các conjugate antibodies vào các giếng (100 μl/giếng). Conjugate antibodies cũng cần đƣợc pha loãng trƣớc sử dụng với tỉ lệ conjugate antibodies/ conjugate buffer là 1/500. Nhƣ vậy hóa chất cần pha cho mỗi dĩa gồm 10 ml buffer và 20 μl conjugate. Sau đó ta đậy dĩa và ủ ở 37oC trong 2 giờ và tiến hành rửa 3 lần bằng dung dịch PBS- TWEEN. : Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất : Giếng đƣợc phủ bởi dịch trích mẫu (Sample) : Giếng đƣợc phủ bởi dịch ly trích mẫu (extraction buffer X1) : Giếng đƣợc phủ bởi đối chứng dƣơng (positive control) : Giếng đƣợc phủ bởi đối chứng âm (negative control) B F (*) P C N C 34 Sơ đồ phân phối conjugate antibodies 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B ( * ) C ( * ) D ( * ) E ( * ) F ( * ) G ( * ) H - Bƣớc 4: Phân phối substrate (100 μl/giếng). Trƣớc khi phân phối, ta cần hòa tan substrate (ở dạng viên) trong buffer tƣơng ứng sao cho nồng độ cuối là 1 mg/ml. Nhƣ vậy mỗi dĩa, lƣợng hóa chất cần pha là 10 ml buffer cho 2 viên substrate (5 mg/viên). Đậy dĩa lại và đem đi ủ ở 37oC trong 30 phút và sau đó thì để ở nhiệt độ phòng. Sơ đồ phân phối substrate s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H : Giếng đƣợc phủ bởi nƣớc cất : Giếng đƣợc phủ bởi conjugate antibodies : Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào) (*) 35 - Bƣớc 5: Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA (ở bƣớc sóng 405 nm) sau 30 phút ủ với substrate, đọc lại lần 2 sau 1giờ và đọc lần 3 sau 2 giờ. Trong đó, giá trị và biện luận của test ELISA đƣợc tính thông qua các giá trị đo OD của buffer, các đối chứng dƣơng, âm và của mẫu sau khi đã trừ đi giá trị OD của các giếng substrate (các giai đoạn đầu đƣợc phủ bằng nƣớc cất). OD mẫu = OD đọc đƣợc – OD của giếng substrate Giá trị OD này của mẫu sẽ đƣợc so sánh với một giá trị gọi là ngƣỡng (với ngƣỡng = hai lần giá trị OD trung bình của đối chứng âm) Kết quả: POS- đƣợc đánh giá là nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt xa ngƣỡng NEG- đƣợc đánh giá là không nhiễm bệnh khi giá trị OD của mẫu dƣới ngƣỡng. Ngoài ra, còn có thể đọc kết quả bằng mắt thƣờng thông qua sự tạo màu có thể nhìn thấy đƣợc của substrate bị thủy phân bởi enzyme: + Màu vàng tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính + Không màu tƣơng ứng với kết quả âm tính. Tuy nhiên phƣơng pháp này độ tin cậy không cao so với việc đọc kết quả bằng máy. 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT-PCR Ly trích RNA (xem sơ đồ trang 36) Tạo cDNA Phản ứng tạo cDNA đƣợc thực hiện trong 20 μl bao gồm: - 5X iScript Reaction Mix 4 μl - iScript Reverse Transcriptase 1 μl - Nuclease-free water 10 μl - RNA mẫu 5 μl : Giếng đƣợc phủ bởi substrate : Giếng không sử dụng (không đƣợc phủ bởi bất kì chất nào) 36 Sơ đồ ly trích RNA Mẫu tƣơi 60 mg/eppendoff, có nắp, 2ml Nghiền trong N2 lỏng - Trộn đều bằng pipette - Ly tâm/ 3 phút Thu dịch nổi cho vào một eppendoff, 2ml, có nắp mới 14 μl PVP 2 % 700 μl Lysis solution 700 μl EtOH 70 % Trộn đến khi không còn phân lớp Ly tâm/ 1 phút Hút 700 μl cho vào RNA binding column Thực hiện tƣơng tự cho đến khi hết dung dịch trong tube hòa tan với EtOH 70 % Thu RNA binding column Thu RNA binding column Ly tâm/ 30 s 700 μl Low wash stringency 80 μl dung dịch Dnase I - Ủ 15 phút/ to phòng - Ly tâm/ 30 s Thu RNA binding column 700 μl High wash stringency Ly tâm/ 30 s Thu RNA binding column 700 μl Low wash stringency - Ly tâm/ 30 s - Ly tâm/ 1 phút Thu RNA binding column 80 μl Elution solution - Ủ/ 1 phút - Ly tâm 2 phút Thu dịch lỏng (trữ ở 4oC) 37 Phản ứng khuếch đại cDNA - Phản ứng PCR chuẩn đƣợc thực hiện trong 25 μl bao gồm: (Roberto C.A. Lima, 2002) Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng iTaq buffer MgCl2 dNTP mix iTaq DNA polymerase Nuclease-free water Primer Sense Antisense cDNA 10 X 50 mM 10 mM 5 u/μl 2,2 μg/μl 2,4 μg/μl 1 X 3,5 mM 0,4 mM 2 u 100 ng/μl 100 ng/μl 2,50 μl 1,75 μl 1,00 μl 0,40 μl 14,85 μl 0,50 μl 0,50 μl 3,00 μl - Phản ứng PCR cải tiến (có bổ sung chất tăng cƣờng (enhancer) là DMSO) Hóa chất Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích sử dụng iTaq buffer MgCl2 dNTP mix iTaq DNA polymerase Nuclease-free water DMSO Primer Sense Antisense cDNA 10 X 50 mM 10 mM 5 u/μl 100 % 2,2 μg/μl 2,4 μg/μl 1 X 3,5 mM 0,4 mM 2 u 2 % 100 ng/μl 100 ng/μl 2,50 μl 1,75 μl 1,00 μl 0,40 μl 14,85 μl 0,50 μl 0,50 μl 0,50 μl 3,00 μl 38 Chu kì nhiệt (Roberto C.A. Lima, 2002) Chu kì nhiệt chuẩn của phản ứng PCR Chu kì nhiệt 1 Chu kì nhiệt 2 - 94 oC/7 phút - 94 oC/3 phút 50 oC/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 52 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 o C /1 h - 94 oC/7 phút - 94 oC/3 phút 58 oC/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 60 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 o C /1 h - 94 oC/7 phút - 94 oC/3 phút 60 o C/1 phút 72 oC /3 phút 1 chu kì - 94 oC /1 phút 65 oC /1 phút 72 oC /3 phút 30 chu kì - 72 oC /10 phút - 4 o C /1 h Điện di trên gel agarose - Sử dụng gel ở nồng độ 1,5 % (đối với ladder có kích thƣớc 1000 bp). - Sử dụng gel ở nồng độ 2 % (đối với ladder kích thƣớc 1500 bp). Bơm mẫu vào giếng với tỉ lệ mẫu/ loading dye là 4:2. Trƣớc khi bơm vào giếng, mẫu phải đƣợc trộn đều với loading dye bằng pipette. Tiến hành điện di ở 50 V, 250 A trong 60 phút. Điện di xong, lấy gel ra và cho vào bồn Ethium bromide ngâm trong 15 - 20 phút. Sau đó lấy ra rửa sạch Ethium bromide và đem quan sát kết quả điện di bằng máy đọc gel (do Ethium bromide là một hóa chất rất độc hại, nên khi tiếp xúc với nó cần phải luôn mang găng tay). 39 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Hiện trạng canh tác cây đu đủ ở nơi lấy mẫu Huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp Cao Lãnh là một vùng đất khá trù phú, màu mỡ dù đất đai có nhiều nơi bị nhiễm phèn song có thể khắc phục đƣợc. Nơi đây lại có nguồn nƣớc tƣới dồi dào với hệ thống kênh rạch chằng chịt, khí hậu nóng ẩm nên rất thích hợp cho việc trồng đu đủ. Đu đủ ở đây thƣờng đƣợc trồng xen với các cây lâu năm nhƣ xoài, bƣởi, cam, chanh. Do đƣợc trồng xen với cây ăn trái do đó việc bón phân cho cây trồng chính cũng phần nào cung cấp đƣợc dinh dƣỡng cần thiết cho cây đu đủ vì thế đu đủ ở đây có sức sống mạnh mẽ, xanh tốt, cho trái sai, kích thƣớc lớn. Đồng thời nhờ đó mà cây còn tăng sức chống chịu cũng nhƣ tính đề kháng với các loại bệnh, đặc biệt là bệnh về virus. Song cũng có những vƣờn do cây nhiễm virus từ khi còn nhỏ nên cây suy tàn sớm, buộc phải chặt bỏ. Huyện Tân Phú và Định Quán, tỉnh Đồng Nai Đây là vùng đất cũng khá màu mỡ song khí hậu có sự thay đổi lớn trong năm. Do sự khác biệt rõ rệt về khí hậu cũng nhƣ nguồn nƣớc tƣới giữa hai mùa mƣa và nắng nên ngƣời dân nơi đây chỉ trồng đu đủ vào mùa mƣa khi trời nóng ẩm và nguồn nƣớc tƣới dồi dào. Cũng tƣơng tự, cây đu đủ nơi đây cũng chỉ đƣợc trồng xen với cây khác nhƣ cây điều, mãng cầu,… nhƣng so với Đồng Tháp thì đất đai nơi đây nhìn chung nghèo dinh dƣỡng và khô cằn hơn với cấu hình đá tổ ong, chính vì vậy việc trồng đu đủ có nhiều khó khăn nhƣ: phải thƣờng xuyên bón phân, tƣới nƣớc, cây có sức chống chịu kém nên khi nhiễm bệnh cây nhanh chóng suy tàn,… Nhìn chung, do hiện nay ở nƣớc ta chƣa có sự đầu tƣ thích đáng cho việc sản xuất cũng nhƣ chế biến sản phẩm nên đu đủ ở nƣớc ta có giá trị kinh tế khá thấp (thƣờng chỉ khoảng 600 - 1200 đồng/ kg trái tƣơi). Chính nguyên nhân này kèm theo dịch bệnh virus càng làm cho nền sản xuất đu đủ chỉ ở mức nhỏ, tự phát, không tập trung, trồng xen tạm thời để lấy ngắn nuôi dài. 40 Về giống, chủ yếu ngƣời dân chọn cây cho trái tốt, thu quả, giữ hạt lại rồi tự ƣơm giống cho vụ sau chứ không mua từ trung tâm hay trại giống. Về phân bón, do cây đu đủ sử dụng rất nhiều dinh dƣỡng do đó cần bón nhiều. Các loại phân thƣờng sử dụng là N-P-K, Super lân, kali, urê … Thuốc bảo vệ thực vật thƣờng là các thuốc diệt côn trùng gây bệnh nhƣ thuốc diệt rệp, nhện, rầy… bao gồm Supracide, Admire 50EC, Danitol, Sherzol… Phƣơng pháp trồng nhìn chung là trồng xen thành từng hàng hoặc thành từng líp bao quanh các cây trồng chính. Qua đánh giá sơ bộ khi lấy mẫu, các vƣờn có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng là khá cao, hầu nhƣ tất cả các cây trong vƣờn đều nhiễm bệnh với các dấu hiệu nhƣ có sọc dầu trên thân, cuống; lá biến dạng ở nhiều mức độ; trái có các đốm hình vòng nhẫn. Mức độ thiệt hại còn tùy thuộc vào thời điểm cây bị nhiễm bệnh (nếu cây nhiễm bệnh ở giai đoạn 3 – 4 tháng thì cây suy tàn, còi cọc, không cho trái; cây nhiễm ở giai đoạn 8 - 9 tháng thì vẫn cho trái nhƣng trái nhỏ, đôi khi bị biến dạng) và tình trạng dinh dƣỡng của cây (cây đƣợc chăm sóc tốt có sức chống chịu và đề kháng bệnh tốt hơn). 4.2. Kết quả thu đƣợc từ thí nghiệm với bộ kit DAS- ELISA 4.2.1. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo địa bàn điều tra Bảng 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng theo địa bàn điều tra Địa điểm Số mẫu điều tra Số mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Tỉnh Đồng Tháp Huyện Cao Lãnh Xã Mỹ Hiệp 41 38 92,68 Xã Bình Thạnh 31 24 77,42 Tỉnh Đồng Nai Huyện Định Quán Xã Phú Tân 19 9 47,37 Huyện Tân Phú Xã Phú Lộc 19 9 47,37 Xã Phú An 25 4 16,00 Tổng 135 84 62,22 41 92.68 77.42 47.37 47.37 16.00 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 Xã Mỹ Hiệp Xã Bình Thạnh Xã Phú Tân Xã Phú Lộc Xã Phú An ĐỊA ĐIỂM LẤY MẪU TỈ L Ệ NH IỄ M B ỆN H Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Đồ thị 4.1 Tỉ lệ nhiễm bệnh trên các địa bàn điều tra Qua đánh giá kết quả từ Bảng 4.1 và Đồ thị 4.1, nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo các vùng nhƣ sau: - Xã Mỹ Hiệp: 92,68 % - Xã Bình Thạnh: 77,42 % - Xã Phú Tân: 47,37 % - Xã Phú Lộc: 47,37 % - Xã Phú An: 16 % Nhận xét thấy tỉ lệ nhiễm bệnh ở vùng Đồng Tháp cao hơn hẳn Đồng Nai mặc dù điều kiện dinh dƣỡng và khí hậu ở Đồng Tháp tốt và thuận lợi hơn Đồng Nai. Nguyên nhân có thể do ở Đồng Tháp dù cây đã bị nhiễm virus song do đƣợc chăm sóc tốt nên cây có khả năng chống chịu cao vì thế vẫn sinh trƣởng đến khi ra hoa, kết trái; còn ở Đồng Nai, điều kiện tự nhiên khắc nghiệt hơn cộng với sự chăm sóc không tốt bằng ở Đồng Tháp nên một khi cây nhiễm bệnh sẽ nhanh chóng suy tàn, còi cọc và sớm bị loại bỏ, do đó cây còn tồn tại đƣợc thƣờng là cây có tính kháng bệnh hoặc chỉ nhiễm virus dòng nhẹ. 42 4.2.2. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây Bảng 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh Đốm vòng theo giống cây Địa điểm Giống cây Da bông (Db) Mã Lai (Ml) Địa phƣơng (Đp) (+)/Σ % (+) (+)/Σ % (+) (+)/Σ % (+) Tỉnh Đồng Tháp Huyện Cao Lãnh Xã Mỹ Hiệp 28/31 90,32 10/10 100 - - Xã Bình Thạnh 17/21 80,95 6/10 60 - - Tỉnh Đồng Nai Huyện Định Quán Xã Phú Tân - - - - 9/19 4,74 Huyện Tân Phú Xã Phú Lộc - - - - 9/19 47,37 Xã Phú An - - - - 4/25 16,00 Tổng 45/52 86,54 16/20 80 22/63 34,92 (+)/Σ: Số cây nhiễm bệnh trong tổng số cây % (+): Tỉ lệ cây nhiễm bệnh “-“ : không có lấy mẫu 86.54 80 34.92 0.00 25.00 50.00 75. 0 100.00 Da bông (Db) Mã Lai (Ml) Địa phương (Đp) GIỐNG CÂY TỈ L Ệ NH IỄ M BỆ NH Tỉ lệ nhiễm bệnh (%) Đồ thị 4.2 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo giống cây Nhận xét Từ Bảng 4.2 và Đồ thị 4.2 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh trên các giống cây nhƣ sau: - Giống Da Bông: 86,54 % - Giống Mã Lai: 80 % - Giống Địa phƣơng: 34,92 % 43 Giống Địa phƣơng chủ yếu thu mẫu từ tỉnh Đồng Nai do đó ở chỉ tiêu này ta chỉ có thể so sánh tình hình nhiễm bệnh trên hai giống Da bông và Mã Lai thu thập tại tỉnh Đồng Tháp. Theo đồ thị trên, nhận thấy giống Da bông có tỉ lệ nhiễm bệnh đốm vòng cao hơn giống Mã Lai. 4.2.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Bảng 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Tuổi cây Số mẫu Số mẫu nhiễm bệnh Tỉ lệ nhiễm (%) 4 - 5 tháng (chƣa trái) 20 14 70,00 6 - 8 tháng 63 54 85,71 8 - 11 tháng 16 2 12,50 Trên 1 năm 36 13 36,11 Tổng 135 83 61,48 70.00 85.71 12.50 36.11 0.00 25.00 50.00 75.00 100.00 TỈ L Ệ N H IỄ M B ỆN H 4-5 tháng (chưa trái) 6-8 tháng 8-11 tháng Trên 1năm TUỔI CÂY Tỉ lệ nhiễm (%) Đồ thị 4.3 Tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây Nhận xét Từ Bảng 4.3 và Đồ thị 4.3 nhận thấy tỉ lệ nhiễm bệnh theo tuổi cây nhƣ sau: - Từ 4 - 5 tháng: 70 % - Từ 6 - 8 tháng: 85,71 % - Từ 8 - 11 tháng: 12,5 % - Trên 1 năm: 36,11 % 44 Nhƣ đã biết, virus PRSV này thƣờng phát triển và lây lan mạnh vào thời kì cây bắt đầu trƣởng thành (6 – 8 tháng), tuy nhiên cũng xuất hiện khi cây còn nhỏ (4 - 5 tháng). Còn tỉ lệ nhiễm bệnh trên độ tuổi 8 – 11 tháng và hơn 1 năm chiếm tỉ lệ thấp là do số lƣợng mẫu lấy ở độ tuổi này quá ít (16 mẫu 8 - 11 tháng tuổi, 36 mẫu hơn một năm tuổi). Do đó, đánh giá sự nhiễm bệnh theo độ tuổi trong thí nghiệm này do lƣợng mẫu lấy ở mỗi độ tuổi là quá ít nên không phản ánh chính xác mức độ nhiễm bệnh theo độ tuổi mà chỉ có thể cho ta biết rằng cây có thể nhiễm bệnh ở mọi độ tuổi, mọi giai đoạn của quá trình phát triển. 4.3. Kết quả thí nghiệm PCR Thiết kế thí nghiệm Chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số từ lá đu đủ bằng kit ly trích AurumTM Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) của công ty Bio- Rad. Từ dung dịch RNA thu đƣợc, tiến hành phản ứng sao chép ngƣợc thành DNA với bộ kit iScriptTM cDNA Synthesis Kit cũng do Bio- Rad cung cấp. Sau đó, từ nguồn cDNA thu đƣợc, thực hiện phản ứng khuếch đại PCR với cặp mồi 1 (nêu ở phần vật liệu và phƣơng pháp). Sản phẩm nhân bản đƣợc phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1,5 % cùng với thang 100 bp, nhuộm bằng ethium bromide, đọc kết quả bằng máy đọc gel. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: a) b) Hình 4.1 a) Chạy PCR với hóa chất và chu kì nhiệt chuẩn b) Chạy PCR với hóa chất chuẩn và chu kì nhiệt 1 và 2 LD: Ladder ĐQ: Mẫu lấy ở huyện Định Quán MH: Mẫu lấy ở xã Mỹ Hiệp TP: Mẫu lấy ở huyện Tân Phú BT: Mẫu lấy ở xã Bình Thạnh 300 bp 100 bp 650 bp 400 bp 300 bp 100 bp 45 Nhận xét: Khi thực hiện phản ứng PCR trên quy trình nhiệt chuẩn, chúng tôi thấy chỉ xuất hiện 1 band duy nhất có kích thƣớc 300 bp, không thấy band 900 bp. Để hoạt động của mồi đặc hiệu hơn, chúng tôi tiến hành thay đổi thông số về nhiệt độ (chu kì nhiệt 1 và 2) song sản phẩm thu đƣợc lại có nhiều band, và cũng không thấy xuất hiện band mong muốn. Do nhiệt độ thay đổi khá nhiều và gần đến nhiệt độ biến tính của mồi mà không thu đƣợc kết quả nên chúng tôi tiến hành giữ nguyên chu kì nhiệt chuẩn và chuyển sang thay đổi các thông số hóa chất trong phản ứng PCR. Qua nghiên cứu tài liệu về các chất có tác dụng hỗ trợ cho phản ứng PCR (enhancers of PCR), nhận thấy chất DMSO (Dimethylsulfoxide) là một chất có tác dụng duy trì sự tách mạch của DNA trong giai đoạn biến tính, qua đó hỗ trợ cho phản ứng khuếch đại hoàn toàn trình tự DNA, nhất là đối với những trình tự khá dài (Sambrook; Newton C.R., 1997). Nồng độ DMSO trong hỗn hợp phản ứng là 2 %. Kết quả thu đƣợc từ nghiệm thức với chu kì nhiệt chuẩn và thành phần hóa chất có bổ sung DMSO: Hình 4.2 Kết quả chạy PCR với cặp mồi 1 Nhận thấy, sản phẩm PCR xuất hiện nhiều band bao gồm band 900 bp (band có kích thƣớc mong muốn), 350 bp và 100 bp. Nhƣ vậy, DMSO đã phát huy tác dụng trong nghiệm thức này. Tuy nhiên, sản phẩm thu đƣợc đa kích thƣớc và band mong muốn khá mờ, nhƣ vậy chứng tỏ cặp mồi đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này là không đặc hiệu. Thật vậy, qua 900 bp 350 bp 100 bp 46 tra cứu các thông tin về độ đặc hiệu của cặp mồi 1 trên trang web NCBI- BLAST thấy chỉ mồi antisense là bắt cặp với đoạn gene CP của PRSV, còn mồi sense thì không thấy sự bắt cặp nào với gene CP. Độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 Query = Sense 5‟- ATC ATT CCA TGG GCG TGT TCC ATG AAT CAA- 3‟ (30 letters) Taxonomy reports Distribution of 5 Blast Hits on the Query Sequence Hình 4.3 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi xuôi 1 Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi xuôi 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)  gi|21627138|gb|AE003811.3| Drosophila melanogaster chromosome 2R, section 39 of 74 of the complete sequence  gi|49609491|emb|BX950851.1| Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043, complete genome  gi|24653840|ref|NM_166092.1| Drosophila melanogaster CG16801-PA, isoform A (CG16801) mRNA, complete cds  gi|24653838|ref|NM_137188.1| Drosophila melanogaster CG16801-PB, isoform B (CG16801) mRNA, complete cds  gi|13430987|gb|AC008342.12|AC008342 Drosophila melanogaster, chromosome 2R, region 51F-51F, BAC clone BACR33K06, complete sequence Độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 Query = Antisense 5‟- AGC TAA CCA TGG GCG AGT ATT CAG TTG CGC- 3‟ (30 letters) 47 Taxonomy reports Distribution of 40 Blast Hits on the Query Sequence Hình 4.4 Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ngƣợc 1 Các trình tự đích có khả năng bắt cặp với mồi ngƣợc 1 (đƣợc xắp xếp theo thứ tự giảm dần về độ đặc hiệu của mồi)  gi|29469899|gb|AY231130.1| Papaya ringspot virus Mex-VrPO, complete genome  gi|3882013|emb|AJ012649.1|PRI012649 Papaya ringspot virus CP gene, isolate Veracruz (VTB-6), partial cds  gi|247640|gb|S89893.1| 3' region: coat protein [papaya ringspot virus PRSV, type W Australian isolate, Cucurbita pepo cv. Green Ruffles (Northrup King), Genomic RNA, 1070 nt]  gi|6694283|gb|AF196839.1|AF196839 Papaya ringspot virus isolate H1K coat protein gene, partial cds  gi|6694281|gb|AF196838.1|AF196838 Papaya ringspot virus isolate Puerto Rico coat protein gene, partial cds 48  gi|3511154|gb|AF063220.1| Papaya ringspot virus isolate P polyprotein gene, partial cds  gi|12744709|gb|AF319507.1|AF319507 Papaya ringspot virus isolate VrCo-7 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744707|gb|AF319506.1|AF319506 Papaya ringspot virus isolate VrCa-15 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744705|gb|AF319505.1|AF319505 Papaya ringspot virus isolate VrAc-27 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744703|gb|AF319504.1|AF319504 Papaya ringspot virus isolate TbC-43 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744701|gb|AF319503.1|AF319503 Papaya ringspot virus isolate TbC-42 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744699|gb|AF319502.1|AF319502 Papaya ringspot virus isolate SpT-27 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744697|gb|AF319501.1|AF319501 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 40 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744695|gb|AF319500.1|AF319500 Papaya ringspot virus isolate CpPM- 39 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744693|gb|AF319499.1|AF319499 Papaya ringspot virus isolate YcY-15 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744689|gb|AF319497.1|AF319497 Papaya ringspot virus isolate VrCo-1 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744687|gb|AF319496.1|AF319496 Papaya ringspot virus isolate VrAl-18 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744685|gb|AF319495.1|AF319495 Papaya ringspot virus isolate TmLC- 70 coat protein (CP) gene,partial cds  gi|12744683|gb|AF319494.1|AF319494 Papaya ringspot virus isolate TmCM- 25 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744681|gb|AF319493.1|AF319493 Papaya ringspot virus isolate QrFC-3 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744679|gb|AF319492.1|AF319492 Papaya ringspot virus isolate QrFC-2 coat protein (CP) gene, partial cds 49  gi|12744677|gb|AF319491.1|AF319491 Papaya ringspot virus isolate QrFC-1 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744675|gb|AF319490.1|AF319490 Papaya ringspot virus isolate OxT-80 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744673|gb|AF319489.1|AF319489 Papaya ringspot virus isolate OxT-66 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744671|gb|AF319488.1|AF319488 Papaya ringspot virus isolate OxT-27 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744667|gb|AF319486.1|AF319486 Papaya ringspot virus isolate McFJ-57 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744665|gb|AF319485.1|AF319485 Papaya ringspot virus isolate McFJ-18 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12744659|gb|AF319482.1|AF319482 Papaya ringspot virus isolate JlPV-13 coat protein (CP) gene, partial cds  gi|12584306|gb|AY017190.1| Papaya ringspot virus clone CpT-30 polyprotein gene, partial cds  gi|12584304|gb|AY017189.1| Papaya ringspot virus clone GrCy-9 polyprotein gene, partial cds  gi|11141739|gb|AF309968.1|AF309968 Papaya ringspot virus isolate Colima coat protein (CP) mRNA, partial cds  gi|63034424|gb|DQ008449.1| Papaya ringspot virus P isolate VER75-pr.8-5 coat protein gene, partial cds  gi|63034422|gb|DQ008448.1| Papaya ringspot virus P isolate VER74-pr.8-12 coat protein gene, partial cds  gi|63034420|gb|DQ008447.1| Papaya ringspot virus P isolate VER73-pr.8-8 coat protein gene, partial cds  gi|63034418|gb|DQ008446.1| Papaya ringspot virus P isolate VER72-pr.8-25 coat protein gene, partial cds  gi|58531193|dbj|AP008212.1| Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 6, complete sequence  gi|58197799|gb|AC154401.2| Mus musculus BAC clone RP23-166O7 from 13, complete sequence 50 429 bp  gi|4582483|gb|AC006312.8|AC006312 Homo sapiens chromosome 9, clone hRPK.401_G_18, complete sequence  gi|21202838|dbj|AP003489.2| Oryza sativa (japonica cultivar-group) genomic DNA, chromosome 6, PAC clone:P0568D10  gi|40539136|gb|AC126426.3| Mus musculus BAC clone RP24-291G13 from chromosome 13, complete sequence Sau khi tra cứu độ đặc hiệu của cặp mồi 1, nhận thấy có một nghi vấn đặt ra đó là sản phẩm kích thƣớc 900 bp thu đƣợc này có phải đã đƣợc khuếch đại từ trình tự của gene CP trên PRSV hay không? Hay đó chỉ là sự bắt cặp không đặc hiệu của mồi với một đoạn gene lạ, tạp nhiễm cũng có kích thƣớc 900 bp. Để khẳng định độ đặc hiệu của cặp mồi 1 cũng nhƣ khẳng định sản phẩm kích thƣớc 900 bp trên là đƣợc khuếch đại từ gene CP của PRSV, với sự giúp đỡ của thầy Đinh Duy Kháng- Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội, chúng tôi đã thiết kế hai cặp mồi đặc hiệu hơn cho đoạn gene CP của PRSV, gồm P7-M30 và P14-M31 (với trình tự đƣợc nêu ở phần Vật liệu và phƣơng pháp). Với hai cặp mồi này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nested- PCR, kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Từ sản phẩm khuếch đại của cặp mồi 1, sử dụng 1μl sản phẩm này làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo với cặp mồi P7-M30 (mọi thông số để thực hiện phản ứng đƣợc giữ nguyên nhƣ cũ). Hình 4.5 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 trên sản phẩm thu đƣợc từ cặp mồi 1 51 Nhận xét: Kết quả phản ứng PCR trên cặp mồi P7-M30 chỉ cho 1 band duy nhất với kích thƣớc 429 bp, điều này đã giải tỏa đƣợc nghi ngờ về sản phẩm 900 bp thu đƣợc từ cặp mồi 1. Chứng tỏ sản phẩm 900 bp này đúng là đã đƣợc khếch đại từ trình tự gene CP của PRSV. - Để kiểm chứng lại độ tin cậy của thí nghiệm Nested-PCR trên hai cặp mồi 1 và P7-M30, chúng tôi tiến hành thí nghiệm Nested-PCR một lần nữa trên hai cặp mồi P7- M30 và P14-M31 (trình bày ở phần Vật liệu và phƣơng pháp). Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi P14-M31 trên khuôn mẫu là sản phẩm cDNA thu đƣợc từ phản ứng sao chép ngƣợc RNA tổng số từ kit ly trích (với quy trình và hóa chất PCR đƣợc giữ nguyên nhƣ chuẩn ban đầu). Hình 4.6 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P14-M31 Nhận xét: Sản phẩm khuếch đại chỉ gồm một band duy nhất với kích thƣớc 658 bp, chứng tỏ cặp mồi P14-M31 là đặc hiệu. Từ sản phẩm 658 bp này, ta lấy 1μl sản phẩm để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo với cặp mồi trong là P7-M30 (với quy trình chuẩn ban đầu). 658 bp 52 Hình 4.7 Kết quả chạy PCR với cặp mồi P7-M30 Nhận xét: Từ hai thí nghiệm Nested-PCR trên đã khẳng định chắc chắn về độ đặc hiệu của các cặp mồi 1, P7-M30, P14-M31 và sự hiện diện của trình tự CP gene của PRSV trong mẫu bệnh thu đƣợc. Nhƣ đã nêu ở phần Vật liệu và Phƣơng pháp, các mẫu sử dụng trong thí nghiệm RT-PCR là các mẫu dƣơng tính chọn lọc từ kết quả của test kit ELISA. Với kết quả dƣơng tính thu đƣợc từ phƣơng pháp RT-PCR đã củng cố và bổ sung cho kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp ELISA. Nhận thấy, dù chẩn đoán bệnh bằng phƣơng pháp nào đi nữa thì độ tin cậy đều nhƣ nhau. Tuy nhiên, mỗi phƣơng pháp có những ƣu nhƣợc điểm riêng và do đó tùy thuộc điều kiện, yêu cầu cụ thể mà ta chọn phƣơng pháp ứng dụng cho phù hợp. Những ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp ELISA và RT-PCR Ƣu điểm - Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện đồng thời một lƣợng mẫu lớn hơn rất nhiều so với phƣơng pháp RT-PCR (thƣờng một kit PLANTEST ELISA® chuẩn có thể chẩn đoán cùng một lúc 135 mẫu). - Phƣơng pháp RT-PCR lại có độ nhạy cao hơn. 429 bp 53 Nhƣợc điểm - Phƣơng pháp RT-PCR do cần phải có giai đoạn tách chiết RNA nên tốn nhiều thời gian hơn; mẫu RNA sau đó phải đƣợc bảo quản ở điều kiện lạnh, sạch, an toàn. Nếu không, mẫu để lâu sẽ không đảm bảo, dễ nhiễm RNase từ môi trƣờng làm phân hủy RNA mẫu, gây hiện tƣợng âm tính giả; hoặc dễ nhiễm RNA lạ từ môi trƣờng làm nhiễu kết quả thí nghiệm, đôi khi còn gây hiện tƣợng dƣơng tính giả. - So với ELISA, RT-PCR đòi hỏi điều kiện thực hiện thí nghiệm nghiêm ngặt hơn, phải có hóa chất và dụng cụ chuyên dùng khi thao tác với RNA. Điều kiện thí ngiệm phải luôn đảm bảo ở nhiệt độ lạnh hoặc mát; luôn đeo găng tay để tránh Rnase trên đầu ngón tay dính vào mẫu, eppendoff… - Hóa chất sử dụng cho tách chiết và thực hiện RT-PCR phải có độ tinh khiết cao, do đó giá thành cũng cao hơn so với ELISA. Vì vậy, việc chẩn đoán bệnh bằng kĩ thuật RT-PCR khó thực hiện và phổ biến rộng rãi đối với các nƣớc có nền kinh tế còn khó khăn, đang phát triển. Từ đó nó cản trở khả năng phổ biến, ứng dụng vào thực tiễn của phƣơng pháp RT-PCR. Nhìn chung ELISA có độ nhạy thấp hơn song xét về mặt kinh tế và tính dễ thực hiện nó có nhiều ƣu điểm hơn so với kĩ thuật RT-PCR. 4.4. Kết quả giải trình tự một số mẫu Các mẫu đƣợc chọn giải trình tự bao gồm: - Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P14-M31, có kích thƣớc sản phẩm là 658 bp) - Mẫu thu tại xã Mỹ Hiệp (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản phẩm là 429 bp) - Mẫu thu tại huyện Định Quán (khuếch đại với cặp mồi P7-M30, có kích thƣớc sản phẩm là 429 bp) Kết quả giải trình tự cho thấy Mỹ Hiệp (658 bp) Chỉ giải trình tự đƣợc với mồi P14, mồi M31 bị nhiễu nhiều. Song kết quả đọc của mồi P14 khá tốt, đoạn thu nhận có kích thƣớc 619 bp (xem phần Phụ lục 8). 54 Định Quán (429 bp) Giải trình tự đƣợc với cả hai mồi P7 và M30. Sau khi sử dụng phần mềm CLUSTALX để thu nhận trình tự bắt cặp của hai mồi (sản phẩm PCR mong muốn), thu đƣợc đoạn có kích thƣớc 412 bp (xem phần Phụ lục 9). Mỹ Hiệp (429 bp) Giải trình tự đƣợc với cả hai mồi P7 và M30. Sau khi xử lý với phần mềm CLUSTALX, thu đƣợc đoạn sản phẩm PCR có kích thƣớc 410 bp (xem phần Phụ lục 10). Cuối cùng, lấy cả 3 trình tự đã đƣợc chọn lọc ở trên đem so sánh sự tƣơng đồng một lần nữa với phần mềm CLUSTALX. Thu đƣợc đoạn tƣơng đồng chung cho cả 3 mẫu, đoạn này có kích thƣớc 393 bp (xem phần Phụ lục 11). Từ trình tự trên, sử dụng phần mềm CLUSTALX để so sánh nó với trình tự của CP- PRSV và genome của PRSV trên Genebank. Kết quả so với trình tự của CP-PRSV trên Genebank CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment 3 ------------------------------------------------------------ AJ012649 TCCAAGAATGAAGCTGTGGATGCTGGTTTGGATGAAAAACTCAAAGAAAAAGAAAAACAG 60 3 ------------------------------------------------------------ AJ012649 AAAGAAAAAGAAAAACAAAAAGAAAAAGAAAAAGACAATGCTAGTGACGGAAATGATGTG 120 3 ------------------------------------------------------------ AJ012649 TCGACTAGCACAAGAACTGGAGAGAAAGATAGAGATGTCAATGTCGGGACCAGTGGAACT 180 3 1 ---------CCGAGAATAAAATCATTTACTGACAAGATGATTTTACCGAAAATTAAAGGA 51 AJ012649 181 TTCACGGTTCCGAGAATTAAATCATTCACTGATAAGATGATTCTACCAAGAATTAAGGGA 240 190******** ******** ***** ********* **** * ****** *** 3 AAAACTGTCCTTAATTTTAAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGATATCTC 111 AJ012649 AAGACTGTCCTTAATTT-AAATCATCTTCTTCAGTATAATCCGCAACAAATTGACATTTC 299 ** ************** ************************************ ** ** 3 AAACACTCGTGCCACTCAAACTCAATTCGAAAAGTGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 171 AJ012649 TAACACTCGTGCCACTCAGTCACAATTTGAGAAATGGTATGAGGGAGTGAGGAATGATTA 359 ***************** * ***** ** ** ************************** 3 CGGTCTCAACGATAACGAAATGCAAGTG-ATGTTAAACGGTTTGATGGTTTGGTGTATTG 230 AJ012649 TGGTCTGAATGATAATGAAATGCAAGTG-ATGCTGAATGGCTTGATGGTTTGGTGTATCG 418 ***** ** ***** ************ *** * ** ** ***************** * 3 AAAATGGTACATCTCCAGACTTATCTGGTGTTTGGGTAATGATGGATGGGGAAACACAAG 290 AJ012649 AGAATGGTACATCTCCAGACATATCTGGTGTTTGGGTTATGATGGATGGGGAAATTCAAG 478 * ****************** **************** **************** **** 3 TTGATTATCCCATTAAGCCTTTAATTGAACATGCAACTCCTTCGTTTAGGCAAATCATGG 350 AJ012649 TTGACTATCCAATCAAGCCTTTAATTGAGCATGCTACCCCGTCATTTAGGCAGATTATGG 538 **** ***** ** ************** ***** ** ** ** ******** ** **** 3 351 CTCACTTCAGTAACGCGGCAGAGGCATACATCGCAAAGAGGAATG--------------- 396 AJ012649 CTCACTTTAGTAACGCGGCAGAAGCATATATTGCAAAGAGAAATGCCACTGA