Khóa luận Sử dụng chỉ thị phân tử microsatellite đánh giá đa dạng di truyền các dõng keo lá tràm (acacia auriculiformis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Niên khĩa: 2003-2007 Sinh viên:Trần Thị Thanh Hƣơng BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******  ****** SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. VƢƠNG ĐÌNH TUẤN TRẦN THỊ THANH HƢƠNG Niên khĩa: 2003-2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 1 LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn Ba Má cùng các anh chị trong gia đình đã nuơi dạy con đến ngày khơn lớn và cho con ăn học thành tài.  Chân thành cảm ơn! Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam bộ Trung Tâm Cơng nghệ sinh học TP. Hồ Chí Minh. Đã tạo mọi điều kiện cho tơi học tập và hồn thành luận án tốt nghiệp đúng tiến độ.  Chân thành cảm ơn! Tất cả các Thầy Cơ đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức cho lớp chúng tơi trong thời gian học tập tại trƣờng Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh.  Chân thành cảm ơn! TS.Vƣơng Đình Tuấn TS. Nguyễn Quốc Bình Đã luơn tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt quá trình làm đề tài.  Chân thành cảm ơn! Chị Ngơ Huỳnh Phƣơng Thảo và tất cả các anh, chị và các bạn lớp Cơng nghệ sinh học 29, đã khơng ngừng động viên giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiên đề tài. Xin chân thành tri ân! Sv: TRẦN THỊ THANH HƢƠNG 2 TĨM TẮT TRẦN THỊ THANH HƢƠNG, Đại Học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ MICROSATELLITE ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC DÕNG KEO LÁ TRÀM (Acacia auriculiformis)”. Hƣớng dẫn khoa học: TS.Vƣơng Đình Tuấn  Thời gian nghiên cứu Từ tháng 3/2007 đến 8/2007.  Địa điểm nghiên cứu Phân viện nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ . Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh.  Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Từ đĩ xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, cĩ liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, gĩp phần phục vụ cơng tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao.  Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dịng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dịng cây Keo lá tràm ở Việt Nam.  Phƣơng pháp nghiên cứu - Sử dụng kĩ thuật PCR để khuếch đại DNA ly trích từ mẫu lá của 100dịng Keo lá tràm thu đƣợc với 9cặp mồi.  Kết quả - Bƣớc đầu thanh lọc đƣợc một số cặp mồi SSR đƣợc sử dụng cho phân tích đa dạng di truyền. Và cĩ sự khác nhau về trọng lƣợng các bands của các cá thể phân tích và cĩ sự biến động di truyền giữa các cá thể.  Kết luận 3 - Thí nghiệm đã thanh lọc đƣợc một số cặp mồi (Am 341, Am 326 và Am 770) cĩ thể cho hiệu quả phân tích đa dạng di truyền Keo lá tràm khá tốt. 4 MỤC LỤC ĐỀ MỤC ...................................................................................................... TRANG TRANG TỰA ........................................................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii TĨM TẮT ............................................................................................................... iv MỤC LỤC ................................................................................................................ v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................. x Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Yêu cầu và mục đích nghiên cứu của đề tài ....................................................... 2 1.4 Giới hạn của đề tài ............................................................................................. 2 Phần 2. TỔNG QUAN ............................................................................................. 4 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học ........................................................................... 4 2.1.1 Định nghĩa ....................................................................................................... 4 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học ......................................................................... 4 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................. 4 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái ............................................................................ 4 2.1.3.2 Đa dạng lồi ................................................................................................. 5 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền .................................................................................... 6 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................ 7 2.2.1 Phân loại .......................................................................................................... 7 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ..................................... 8 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) ..................................... 9 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) ........................ 10 2.2.5 SSR (Microsatellite) ...................................................................................... 10 5 2.3 Kỹ thuật Microsatellite ..................................................................................... 11 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite .......................................................................... 11 2.3.2 Tính chất ........................................................................................................ 12 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite ......................................................... 13 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite ........................................................................... 14 2.3.5 Các loại Microsatellite .................................................................................. 15 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trị của Microsatellite ........................................... 15 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite .............................................................. 15 2.3.6.2 Vai trị của Microsatellite ........................................................................... 17 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite ................................................. 18 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai ......................................................................................... 18 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR ...................................................................................... 19 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................. 19 2.4.1 Khái niệm ...................................................................................................... 19 2.4.2 Thành phần và vai trị của các chất trong phản ứng PCR ............................. 20 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR.......................................................................... 23 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................ 23 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật ...................................................................... 23 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .......................................... 25 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di ...................................... 26 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) .................................. 28 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) .......................................................................... 28 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các lồi Keo .......................................................... 28 2.6.1.2 Cơng dụng của các lồi Keo (Acacia) ........................................................ 30 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) ........ 32 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái ............................................................ 33 2.6.2.2 Cơng dụng và tiềm năng gây trồng ............................................................ 35 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................................... 36 6 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 36 3.1.1 Thời gian thực hiện ....................................................................................... 36 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 36 3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................... 36 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm .................................................................................. 36 3.4 Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................... 37 3.5 Ly trích DNA ................................................................................................... 37 3.5.1 Hĩa chất ....................................................................................................... 37 3.5.2 Quy trình ly trích DNA ................................................................................. 38 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích ................................................................. 40 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR ................................................................................ 40 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR .................................................................................. 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 44 4.1 Quá trình ly trích ............................................................................................. 44 4.2 Phản ứng PCR .................................................................................................. 44 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 48 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 50 PHỤ LỤC 7 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µg: microgram  µM: micromol/lite  Al: Allele  bp: base pair  M:mét  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxynucleotide triphosphate  EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid  EtBt: Ethidium bromide  Kb: kilobases  mM: milimolar (milimol/lite).  PCR: Polymerase chain reaction  RNA: Ribonucleic acid  RNase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nĩng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của Taq  UV: Ultra Violet 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ..................................................... 16 Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ................................................. 16 Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR ................................................... 20 Hình 2.4: Hình thái lá các lồi Keo(Acacia) .......................................................... 29 Hình2.5:Hình thái một số lồi Keo ........................................................................ 30 Hình 2.6. Keo lá tràm ............................................................................................. 33 9 DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) ......... 8 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose ..................................... 27 Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide ........................ 27 Bảng 2.4:Các ancaloit trong các lồi Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) ............ 32 Bảng 3.1: Các hĩa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA .............................. 38 Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 41 Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng .......................................................... 41 Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA ................................................................. 39 10 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay cùng với sự phát triển của đời sống, kinh tế, xã hội, nhiều sản phẩm làm từ các chất liệu nhƣ nhựa, nhơm, hợp kim,…,đã ra đời với nhiều cơng dụng tiện lợi phục vụ cho đời sống tất bật của xã hội lồi ngƣời trong giai đoạn phát triển vũ bão. Tuy nhiên các sản phẩm này vẫn khơng thể nào thay thế đƣợc hồn tồn sự hiện diện của các sản phẩm đƣợc làm từ gỗ nhƣ: bàn ghế, cửa, kệ, tủ, hàng thủ cơng mỹ nghệ, tập sách vở…trong các gia đình, cơng sở, nhà hàng, khách sạn, phịng triển lãm, khu trƣng bày, trƣờng học,…Do các sản phẩm làm từ gỗ mang lại sang trọng, ấm cúng, gần gũi với thiên nhiên cho khơng gian sử dụng, và chúng cịn cĩ thể tái chế. Vậy mà thực tế cho thấy nguồn nguyên liệu gỗ ngày càng suy kiệt, giảm chất lƣợng do sự khai thác bừa bãi, nạn phá rừng của con ngƣời, thiên tai lũ lụt, hạn hán, cháy rừng, sự ơ nhiễm mơi trƣờng... Keo lá tràm hay cịn gọi Keo bơng vàng, là loại cây mọc nhanh cĩ xuất xứ từ Australia, Papua, New Guinea và Indonesia,…(Turnbull,1986). Đƣợc du nhập vào Việt Nam từ thập niên 60 của thế kỉ XX, với mục đích chủ yếu là cung cấp nguồn nguyên liệu cho sản xuất giấy, làm đồ trang trí nội thất, làm than củi,... ( Tại Việt Nam hiện nay, Keo lá tràm đƣợc trồng phổ biến ở nhiều địa phƣơng, tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền Trung và vùng Đơng Nam Bộ. Keo lá tràm đĩng gĩp một cách cĩ ý nghĩa trong ngành cơng nghiệp sản xuất giấy, nghề chế tác hàng thủ cơng mỹ nghệ và cũng nhƣ đời sống của nơng dân trồng rừng (Bùi Việt Hải,1998). Vì vậy việc chọn và tạo giống Keo lá tràm chất lƣợng cao với năng suất cao, chống chịu sâu bệnh là một nhu cầu hết sức cấp thiết đặt ra cho ngành lâm nghiệp. Việc nghiên cứu chọn giống Keo cũng đã đƣợc triển khai từ hàng chục năm nay ở Viện Khoa học lâm nghiệp nhƣng biện pháp chủ yếu là nhập hạt giống chất lƣợng cao, khảo nghiệm và chọn giống theo phƣơng pháp cổ điển của các dịng cây trội. Việc nghiên cứu chọn giống Keo sử dụng chỉ thị phân tử 11 hoặc trên các cơ sở kỹ thuật cao hầu nhƣ chƣa cĩ nhiều. Các phƣơng pháp chọn giống cổ điển tuy đã gĩp phần hình thành nên những giống vật nuơi đa dạng, nhƣng do chỉ tiêu chọn thuộc về hình thái, chủ yếu về kiểu hình và chỉ tiêu sinh hĩa thƣờng khơng ổn định và chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi mơi trƣờng. Sử dụng chỉ thị phân tử (DNA marker) để chọn giống sẽ bỏ qua các biến động khơng di truyền đồng thời theo dõi đƣợc các biến động di truyền khơng thể hiện ra kiểu hình. Hiểu biết về cấu trúc di truyền phân tử sẽ giúp chúng ta cĩ cơ sở vững chắc trong việc sử dụng nguồn tài nguyên thực vật một cách cĩ hiệu quả hơn để cải thiện giống cây trồng, phục vụ tốt hơn cơng tác quản lí và bảo tồn đa dạng sinh học, rút ngắn thời gian của quá trình chọn, tạo giống phục vụ cho cơng tác trồng rừng. Nhằm gĩp phần đánh giá tính đa dạng di truyền của các dịng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) ở Việt Nam, đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền của các dịng Keo lá tràm (Acacia auriculiformis)” đƣợc thực hiện do sự phân cơng của bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học và sự hƣớng dẫn chính của TS. Vƣơng Đình Tuấn. 1.2 Mục đích nghiên cứu -Xác định đƣợc chỉ thị ADN phù hợp cho nghiên cứu đa đạng di truyền Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Tƣd đĩ xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các cá thể thu thập từ những xuất xứ khác nhau, cĩ liên hệ đến tính trạng sinh trƣởng nhanh của các cá thể, gĩp phần phục vụ cơng tác chọn giống theo hƣớng chất lƣợng cao. 1.3 Yêu cầu - Xác định các cặp mồi để đánh giá đa dạng di truyền các dịng Keo lá tràm. - Tìm hiểu mối quan hệ di truyền của các dịng cây Keo lá tràm ở Việt Nam. 1.4 Giới hạn của đề tài Do quỹ thời gian và kinh phí cịn hạn chế nên chúng tơi mới chỉ dừng lại ở việc thanh lọc các cặp mồi SSR để tìm ra những cặp mồi thích hợp cho những nghiên cứu tiếp theo trong việc hồn thiện đánh giá đa dạng di truyền Keo lá tràm. Và đề tài chỉ thực hiện trên một số mẫu nghiên cứu thu thập đƣợc ở Trạm thực 12 nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Bình Dƣơng) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. 13 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu về đa dạng sinh học 2.1.1 Định nghĩa Thuật ngữ "đa dạng sinh học" lần đầu tiên đƣợc Norse và McManus (1980) định nghĩa, bao hàm hai khái niệm cĩ liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một lồi) và đa dạng sinh thái (số lƣợng các lồi trong một quần xã sinh vật). Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu cĩ, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về lồi và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất định nghĩa: “ Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu lồi thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các lồi và là những hệ sinh thái vơ cùng phức tạp cùng tồn tại trong mơi trƣờng”. 2.1.2 Ý nghĩa của đa dạng sinh học Sự đa dạng của sinh vật trong thiên nhiên chứa dựng vẻ đẹp vơ tận, đĩ chính là nguồn cảm hứng sáng tạo và cũng là nguồn kiến thức phong phú của nhân loại. Sự đa dạng sinh học cung cấp cho con ngƣời nguồn thức ăn phong phú và đa dạng chủng loại; cung cấp nguồn hàng hố và nguyên vật liệu phong phú và cần thiết cho nơng nghiệp, cho dƣợc học, cho khoa học cơng nghệ. Đa dạng sinh học là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nơng nghiệp. Ngồi ra đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng từ đĩ tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. 2.1.3 Các phân mức về đa dạng sinh học 2.1.3.1 Sự đa dạng về hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm và cao nhất của đa dạng sinh học. 14 Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các lồi sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đĩ với các nhân tố mơi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vơ sinh và hữu sinh. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau giữa các quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình) (OTA, 1987; FAO, 1990). Vậy hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện mơi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đĩ càng đa dạng. 2.1.3.2 Đa dạng lồi Sự đa dạng lồi đƣợc thể hiện bằng số lƣợng lồi khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Lồi đƣợc xác định theo cấu tạo hình thái của lồi hoặc theo phân loại sinh học( Theo cấu tạo hình thái của lồi: sự đa dạng lồi xác định theo nhĩm cá thể cĩ những hình thái, sinh lý hoặc hố sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhĩm khác. Thƣờng đƣợc vận dụng để định danh lồi, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới. Phân loại sinh học lồi: sự đa dạng lồi xác định theo nhĩm cá thể cĩ khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, khơng giao phối sinh sản với các nhĩm khác. Cách này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hố khảo sát mối quan hệ về gene. Theo Rojas và Stanley (1992), những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các lồi trên thực tế thƣờng phức tạp hơn nhiều so với lý thuyết. Một lồi cĩ thể cĩ rất nhiều phân lồi mà ta cĩ thể dễ dàng phân biệt dựa theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Nhƣng, đơi khi các phân lồi giống nhau đến mức tƣởng nhƣ là chúng cùng một lồi. 15 Vì vậy nghiên cứu về phân loại học để xác định lồi của một nhĩm lồi và định lồi của những mẫu vật mới chƣa đƣợc biết đến, nhằm tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng lồi là rất cần thiết. 2.1.3.3 Đa dạng về di truyền Đa dạng di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học. Đa dạng di truyền thể hiện qua sự khác nhau của tất cả các gen di truyền của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật. Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể tồn tại trong cùng một lồi và giữa các lồi khác nhau ( Đa dạng di truyền tạo nên sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể.Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền. Nghiên cứu về đa dạng di truyền là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về lồi. Sự đa dạng về mặt di truyền trong lồi chịu ảnh hƣởng bởi tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng cĩ bộ gene khác nhau. Sự đa dạng về bộ gene này là do các cá thể cĩ các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít (Lâm Vỹ Nguyên, 2006). Những hình thái khác nhau của gene đƣợc thể hiện bằng những alleles và những khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene cĩ thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gene trong di truyền học tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thơng qua sự tái tổ hợp của các gene trong quá trình sinh sản. Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gene và alleles trong một quần thể là vốn gene của quần thể và những tổ hợp của các alleles mà mỗi cá thể cĩ đƣợc gọi là kiểu gen – kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện bởi các đặc điểm 16 về hình thái, sinh lý, hố sinh và đƣợc đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng mơi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gene trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gene trong vốn gene đĩ, thƣờng mỗi gene cĩ nhiều hơn một allele (các gene đa hình) và số các alleles cho mỗi một gene đa hình. Sự tồn tại của các gene đa hình cho phép các cá thể trong quần thể cĩ thể cĩ kiểu gene dị hợp tử, cĩ nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gene cho phép các lồi thích ứng đƣợc với sự thay đổi của mơi trƣờng. 2.2 Một số DNA marker sử dụng nghiên cứu sự đa dạng di truyền 2.2.1 Phân loại Về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào đƣợc dùng để phân biệt hai cá thể, hai dịng hoặc hai giống khác nhau đều cĩ thể xem nhƣ một DNA marker. Những marker cĩ tính chất nhƣ vậy rất cần thiết vì số lƣợng của chúng lớn hơn rất nhiều so với các marker hình thái, marker ở dạng protein (isoenzyme) (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005). Dựa vào kỹ thuật thực hiện các DNA marker cĩ thể chia làm hai nhĩm (Bài giảng CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP. - Marker dựa trên sự khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR: ALP, AFLP, SSR, SSCP, RAPD. Dựa trên kiểu hình cĩ thể chia DNA marker thành hai nhĩm (CNSH cây trồng, Phạm Thành Hổ): - Marker đồng trội: Những marker cĩ thể phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử. Bao gồm marker allozyme, Microsatellite, RFLP. - Marker trội: Những marker khơng thể phân biệt những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử. Bao gồm RAPD, AFLP. 17 Bảng 2.1 : Các loại marker DNA (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2005) Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random Amplified Polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary Primer-PCR DAF DNA Amplification Fingerprinting AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence-Tagged Sites 2.2.2 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) Ngay từ klhi ra đời, RFLP một chỉ thị phân tử rất hữu dụng trong việc đánh giá đa dạng di truyền. RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) khi cĩ sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác (Wayne Powell và ctv,1996). Ngày nay, RFLP là kỹ thuật phân tích đa dạng di truyền đƣợc sử dụng phổ biến nhất. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gene. DNA bộ gene sẽ đƣợc cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dị DNA (đƣợc đánh dấu phĩng xạ) liên kết với một 18 locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau (Wayne Powell và ctv,1996). RFLP cĩ ƣu điểm là marker đồng trội cho phép phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp và dị hợp. Do kích thƣớc DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lƣợng marker tạo ra nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đối với sức khoẻ ngƣời nghiên cứu (do phải sử dụng phĩng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu cĩ chất lƣợng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này. Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một cặp mồi oligonucleotide cĩ thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đĩ đoạn DNA đƣợc khuếch đại đƣợc cắt bằng các restriction enzyme, điện di và phân tích trên gel nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bƣớc lai phĩng xạ nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phƣơng pháp RFLP. 2.2.3 Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuơn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP cĩ thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dịng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại cĩ thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt ( Powell et al, 1996; Winfield et al, 1998) Thơng thƣờng, trong AFLP sử dụng một cặp restriction enzyme gồm một enzyme cắt thƣờng xuyên và một enzyme cắt khơng thƣờng xuyên. Enzyme cắt thƣờng xuyên tạo ra những trình tự nhỏ và enzyme cắt khơng thƣờng xuyên sẽ nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt. Cặp enzyme thƣờng đƣợc dùng nhất là EcoRI - MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đơi (adaptor) sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản 19 ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.( Matthes et al., 1998; Karp et al., 1997) AFLP nhanh, khơng phức tạp nhƣ RFLP nhƣng vẫn khảo sát đƣợc tồn bộ gene. Kỹ thuật này địi hỏi ít lƣợng DNA ban đầu. Tuy nhiên, thơng tin di truyền phải đƣợc biết rõ để chuẩn bị primer tƣơng ứng, và AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 2.2.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà khơng cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn cĩ kích thƣớc khác nhau, cĩ khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer cĩ thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này cĩ thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hĩa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần cĩ máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao (Harris,1999) 2.2.5 SSR (Microsatellite) Rải rác ở những vị trí khác nhau trên bộ gene eukaryote là những vùng cĩ tính biến dị cao. Những vùng này cĩ chứa các trình tự DNA gọi là VNTR (variable number tandem repeat) cịn gọi là các tiểu vệ tinh. Các VNTR này đặc trƣng bởi số 20 lần lặp lại của trình tự lõi (đơn vị trình tự) DNA nhƣ: (AC)n, (AG)n, (AT)n, (TAT)n, (TCT)n, (CAG)n … Do số lần lặp lại của mỗi microsatellite là khác nhau ở mỗi cá thể nên tính đa hình tạo ra khi sử dụng phƣơng pháp này là rất cao. Dựa trên trình tự DNA, microsatellite đƣợc bảo tồn ở các cá thể cùng lồi cho phép chúng ta thiết kế mồi để khuếch đại trình tự lặp lại trong tồn bộ kiểu gene, trình tự mồi sử dụng trình tự đặc hiệu ở hai đầu locus microsatellite. Kích thƣớc các đoạn DNA đƣợc khuếch đại thƣờng từ 100 - 200 bp. Kết quả tạo ra các đoạn DNA cĩ chiều dài khác nhau phân tách trên gel polyacrylamide. Xác định trình tự đặc hiệu hai đầu locus microsatellite là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong việc phân tích kỹ thuật này. Do đĩ, việc sử dụng microsatellite gặp phải nhƣợc điểm lớn là phải xác định trình tự đặc hiệu cho mỗi locus đa hình. Ƣu điểm lớn nhất của microsatellite là cĩ tính đa hình cao và là một marker đồng trội. 2.3 Kỹ thuật Microsatellite 2.3.1 Khái niệm về Microsatellite Microsatellite (SSR marker): Một dạng của VNTR (variable number of tandem repeats) là chuỗi mã di truyền lặp lại rất đơn giản thƣờng xảy ra ngẫu nhiên trên hầu hết genome thực vật (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,2005), là một đoạn DNA đƣợc mơ tả đặc điểm bởi sự xảy ra của số lƣợng bản copy biến thiên (từ một vài bản lên đến 30 hay nhiều hơn) của dãy trong vịng 5 hoặc số bases ít hơn (gọi là đơn vị lặp lại). Một microsatellite điển hình cĩ đơn vị lặp lại AC, xảy ra ở khoảng 100.000 vị trí khác nhau trong bộ genome động vật điển hình. Ở bất kì một vị trí nào (locus), thƣờng xuyên cĩ khoảng 5 – 7 “alleles” khác nhau, mà mỗi alleles cĩ thể nhận biết tuỳ thuộc vào số đơn vị lặp lại. Những alleles này cĩ thể phát hiện bởi PCR , sử dụng primers đƣợc thiết kế từ một dãy đơn và cũng cĩ trên cả mặt kia của microsatellite. Khi sản phẩm PCR đƣợc chạy trên gel điện di, alleles đƣợc ghi nhận khác biệt về độ dài trong giá trị đến kích cỡ của đơn vị lặp lại,... 21 Microsatellite là một marker DNA chuẩn, chúng dễ dàng đƣợc phát hiện bằng PCR và chúng cĩ khuynh hƣớng xác định vị trí bằng nhau từ đầu đến cuối của genome. Hàng ngàn SSR đã đƣợc lập bản đồ trong nhiều lồi khác nhau. Tĩm lại, microsatellite ngày nay trở thành một thuật ngữ chung nhất để miêu tả các trình tự lặp lại ngắn và ngẫu nhiên, thay vì sử dụng các thuật ngữ STR (short tandem repeats) hay VNTR (variable number of tandem repeats) (Edward; 1991). Microsatellite bao gồm các đoạn lặp lại ngắn từ 2 - 6 bp và kích thƣớc tại mỗi locus là 20 - 100 bp. Microsatellite đƣợc tìm thấy trong tất cả cơ thể sống, đặc biệt là ở những cơ thể sống cĩ bộ gen lớn và phân bố đều trên genome. Microsatellite cĩ tính đa hình rất cao, là những codominant-al hay al đồng trội (bao gồm 2 loại: al đồng hợp và al dị hợp), nĩ cĩ các tính chất cần thiết cho một marker. Tần số đột biến từ 104 - 5.10-6, tuân theo định luật Mendel. Vị trí của microsatellite trên nhiễm sắc thể cĩ thể đƣợc xác định bằng PCR từ một lƣợng DNA rất nhỏ. Xác định microsatellite PCR trên một lồi nào đĩ thì cĩ thể áp dụng trên những lồi khác cĩ quan hệ họ hàng. 2.3.2 Tính chất Những markers này thƣờng hiện diện với mức độ cao của hiện tƣợng đa hình, đặc biệt khi số lần lặp lại lớn hơn hoặc bằng 10. Trình tự đƣợc lặp lại thƣờng đơn giản, bao gồm 2, 3 hoặc 4 nucleotides (tƣơng ứng với việc lặp lại di-, tri-, và tetranucleotide), và cĩ thể đƣợc lặp lại từ 10 đến 100 lần. Sự lặp lại của nucleotide CA xảy ra rất thƣờng xuyên trong bộ gene ngƣời và các lồi khác, và đƣợc hiện diện trong khoảng vài ngàn bases pair. Nhƣ vậy cĩ sự xuất hiện thƣờng xuyên của nhiều alleles tại vị trí microsatellite, kiểu gene trong phả hệ thƣờng cung cấp đầy đủ thơng tin về di truyền, trong đĩ alleles đặc thù của tổ tiên cĩ thể đƣợc nhận biết dễ dàng. Bằng cách này, microsatellite là marker lý tƣởng để xác định nguồn gốc, nghiên cứu di truyền quần thể và bản đồ tái tổ hợp. Nĩ cịn là marker phân tử dùng để cung cấp đầu mối về những alleles cĩ mối quan hệ gần nhau hơn. 22 Microsatellite thƣờng thay đổi với tỉ lệ đột biến tăng dần so với vùng trung tính khác của DNA. Tỉ lệ đột biến cao này cĩ thể đƣợc giải thích bởi sự bắt cặp sai trong bộ phận trƣợt (slipped strand mispairing - sự giữ khơng đúng mục tiêu) trong suốt quá trình sao chép DNA trên một chuỗi đơn xoắn kép. Sự đột biến cũng xảy ra suốt quá trình tái tổ hợp trong quá trình giảm phân. Một vài lỗi sai mục tiêu đƣợc sửa bởi cơ chế đọc và sửa trong nhân, thế nhƣng một vài đột biến cĩ thể khơng đƣợc sửa chữa. Kích thƣớc của đơn vị lặp lại, số lần lặp lại và sự hiện diện của sự lặp lại khác nhau là tất cả các yếu tố, cũng nhƣ là tính thƣờng xuyên của sự dịch mã trong khu vực của DNA lặp lại. Sự gián đoạn của microsatellites, cĩ thể do đột biến, cĩ thể là nguyên nhân trong việc giảm sự đa hình. Tuy nhiên, cơ chế tƣơng tự này thỉnh thoảng cĩ thể dẫn đến sự khuếch đại khơng chính xác của microsatellites; nếu sự sai mục tiêu xảy ra sớm trong suốt quá trình PCR, thì chiều dài khơng chính xác của microsatellites cĩ thể đƣợc khuếch đại. 2.3.3 Sự phát triển của primer Microsatellite Primer của microsatellite đƣợc phát triển bởi việc tạo dịng ngẫu nhiên một đoạn DNA từ những giống lồi trọng tâm. Những đoạn này đƣợc chèn vào plasmid hoặc phage vector, và đƣợc chuyển tiếp vào vi khuẩn Escheria coli. Khuẩn lạc sau đĩ phát triển và đƣợc chụp lên phim với những trình tự nucleotide đƣợc đánh dấu huỳnh quang đƣợc lai với trình tự lặp lại của microsatellite, nếu nĩ cĩ hiện diện trên đoạn DNA. Nếu dịng dƣơng tính cĩ thể thu đƣợc từ quy trình này, đoạn DNA đƣợc đọc trình tự và primers PCR sẽ đƣợc chọn từ vùng trình tự liên kết nhƣ vùng để xác định vị trí đặc trƣng. Quy trình này liên quan đến những thử nghiệm thành cơng, khi trình tự lặp lại của microsatellites phải đƣợc dự đốn trƣớc và primers đƣợc thu nhận ngẩu nhiên cĩ thể khơng biểu hiện tính đa hình cĩ ý nghĩa. Vị trí microsatellite đƣợc trải xuyên suốt genome và cĩ thể đƣợc thu nhận từ sự thối hố DNA chung của những mẫu cũ hơn, khi đĩ là tất cả những chất nền cần thiết và hợp lí để khuếch đại thơng qua PCR. Primer microsatellite đặc trƣng cho một lồi sẽ giúp phát hiện sự đa hình ở những vị trí tƣơng đồng (cùng locus trên mỗi al) đối với từng cá thể trong lồi. Điều 23 này cĩ thể thực hiện đƣợc là nhờ trình tự microsatellite và trình tự của vùng flanking- vùng nằm ở 2 bên trình tự microsatellite để thiết kế primer- đƣợc bảo tồn trong quá trình di truyền của lồi. Vùng flanking rất quan trọng vì nĩ giúp phát hiện trình tự microsatellite đặc trƣng ở mỗi locus trên nhiễm sắc thể. 2.3.4 Giới hạn của Microsatellite Microsatellite đƣợc chứng tỏ là marker phân tử hữu hiệu, đặc biệt trong nghiên cứu quần thể, thế nhƣng chúng khơng phải khơng cĩ hạn chế. Microsatellite đƣợc phát triển cho những chủng đặc trƣng cĩ thể đƣợc ứng dụng thƣờng xuyên với những chủng cĩ mối quan hệ họ hàng gần nhau, tuy nhiên tỉ tệ phần trăm vị trí di truyền đƣợc khuếch đại thành cơng cĩ thể bị giảm bởi sự gia tăng khoảng cách di truyền. Điểm đột biến trong vị trí bắt cặp của primer trong một lồi nào đĩ cĩ thể dẩn đến sự cố alleles khơng giá trị(null alleles), nơi mà primer microsatellite khơng thể đáp ứng để khuếch đại trong thí nghiệm PCR. Sự phân kì trong trình tự ở vùng liên kết cĩ thể dẫn đến sự bắt cặp kém của primer, đặc biệt ở vùng 3’ nơi mà sự kéo dài bắt đầu; sự khuếch đại ƣu tiên của vị trí alleles đặc thù do sự cạnh tranh tự nhiên của PCR cĩ thể dẫn đến việc cá thể dị hợp tử đƣợc ghi nhận từ đồng hợp tử (bộ phận khơng cĩ giá trị) ( M. J. Hayden and P. J. Sharp, 2001) Sự thất bại của phản ứng PCR cĩ thể thu nhận kết quả khi sự sai khác ở vị trí đặc thù đƣợc khuếch đại. Tuy nhiên, ảnh hƣởng sai khác của quần thể nhỏ và khả năng của sự liên kết giới tính cũng cần đƣợc xem xét để khơng đƣa ra giá trị sai của alleles khơng giá trị do sự tăng tính đồng hình trong phân tích quần thể. Sự khác nhau trong kích thƣớc allele cũng khơng phản ánh sự khác nhau thật sự. Đột biến cĩ thể cĩ từ sự thêm vào hay mất đi của bases và tồn bộ microsatellite cĩ thể chịu sự nén chặt về chiều dài. Tỉ lệ đột biến thì khơng cĩ tiêu chuẩn để đánh giá. Vùng trung tính của một số vùng microsatellite cịn đang nghi vấn, cĩ lẽ do sự biến thiên tính trạng số lƣợng hoặc sự cố trong vùng exon của genes dƣới sự chọn lọc. Khi sử dụng microsatellite để so sánh lồi, vị trí đồng hình cĩ thể dễ dàng khuếch đại trong những lồi cĩ quan hệ, thế nhƣng số vị trí khuếch đại thành cơng 24 trong suốt phản ứng PCR cĩ thể giảm do sự tăng khoảng cách di truyền giữa các lồi nghi vấn. Đột biến trong alleles microsatellite cĩ thể bị ảnh hƣởng xấu trong trƣờng hợp cĩ một đoạn alleles lớn hơn chứa nhiều bases hơn, và do đĩ cĩ thể đƣợc dịch sai trong quá trình phiên mã DNA. Một alleles nhỏ hơn tham gia vào việc làm tăng kích thƣớc, trong khi một alleles lớn hơn tham gia để làm giảm kích thƣớc, khi mà chúng cĩ thể là nguyên nhân cho sự giới hạn trên về kích thƣớc; sự ép buộc này đã đƣợc xác định nhƣng giá trị khẳng định là chƣa chuyên biệt. Nếu cĩ một sự khác biệt lớn về kích cỡ giữa alleles của cá thể, điều đĩ cĩ thể làm tăng sự khơng bền vững trong sự tái tổ hợp ở quá trình giảm phân. Trong tế bào khối u, nơi mà sự kiểm sốt trên phiên mã bị phá hủy, microsatellite cĩ thể tăng thêm hay mất đi thƣờng xuyên ở tỉ lệ đặc biệt cao trong mỗi chu kỳ nguyên phân. Do đĩ một dịng tế bào khối u cĩ thể chỉ ra những đặc điểm khác biệt di truyền từ những mơ kí chủ đĩ. 2.3.5 Các loại Microsatellite Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta cĩ : Mononucleotide SSR (A) AAAAAAAAAAA Dinucleotide SSR (GT)6 GTGTGTGTGTGT Trinucleotide SSR (CTG)4 CTGCTGCTGCTG Tetranucleotide SSR (ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC Trinucleotide SSR xuất hiện ít hơn dinucleotide SSR khoảng 10 lần, và tetranucleotide SSR cịn hiếm hơn nữa (Ma và ctv., 1996). 2.3.6 Cơ chế hình thành và vai trị của Microsatellite 2.3.6.1 Cơ chế hình thành Microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do hai quá trình: quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm 25 phân (unequal crossing- over during meiosis) hoặc quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage). Và quá trình trƣợt lỗi trong sao mã đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu trong việc hình thành các microsatellite, nĩ xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp từ đĩ tạo ra một chỗ phình nhất thời cĩ thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc cĩ thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.1: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân Hình 2.2: Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 26 2.3.6.2 Vai trị của Microsatellite Rất nhiều microsatellite đã đƣợc tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã. Chức năng rõ rệt của những vùng nhƣ vậy vẫn cịn chƣa rõ ràng, mặc dù ngƣời ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và cĩ liên quan tới các bệnh di truyền. Microsatellite đƣợc dùng nhƣ một marker di truyền để nghiên cứu về di truyền quần thể, quan hệ tiến hĩa, lập bản đồ gen. Tuy nhiên cĩ rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đĩng vai trị là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hịa. Microsatellite đƣợc tìm thấy khắp nơi ở phần trƣớc vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã đƣợc tìm thấy cĩ quan hệ với vùng mã hố. Số lƣợng khác nhau của các đoạn lặp lại của microsatellite ở vùng mã hố cĩ quan hệ với sự biểu hiện của gene và chức năng của gene. Ở một số trƣờng hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của microsatellite cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor. Vị trí của microsatellite gần hay xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi. Vùng điều khiển cĩ chứa microsatellite hoạt động nhƣ một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen. Microsatellite cũng liên kết với các protein bám mà các protein này cĩ chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gene, khi trình tự này đƣợc giải phĩng thì gen đƣợc khởi động và sao mã. Điều này chỉ ra rằng microsatellite hoạt động nhƣ một yếu tố điều hịa trong quá trình sao mã, ảnh hƣởng đến quá trình sao mã thơng qua ảnh hƣởng đến protein bám. Rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng ảnh hƣởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nĩ là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đĩ. Nhƣ một trình tự mang mã, microsatellite đã đƣợc tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau về số lần lặp lại của các trình tự trong microsatellite cĩ thể dẫn đến sự khác 27 nhau về chức năng của protein và hoạt động của gen, do đĩ cĩ thể ảnh hƣởng đến chức năng sinh lý cũng nhƣ sự phát triển của cơ thể. Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng cĩ sự ảnh hƣởng của chiều dài khác nhau của microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan đƣợc tổng kết lại nhƣ một yếu tố chức năng của hệ gen. Những tính chất đặc biệt của microsatellite nhƣ sự đột biến điểm dẫn đến những giả thiết cho rằng microsatellite cĩ thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lƣợng và quá trình tiến hĩa thích nghi (Kashi và ctv., 1997). Nĩ cho phép một quần thể cĩ thể khơi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc, nĩ hoạt động nhƣ một “núm điều chỉnh” mà qua đĩ những gen đặc biệt cĩ thể điều chỉnh nhanh chĩng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình địi hỏi của tiến hĩa (King và ctv., 1997). Do vậy microsatellite là một nguồn rất quan trọng trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền và làm cơ sở cho sự thay đổi của tiến hĩa. 2.3.7 Các phƣơng pháp phát hiện Microsatellite Cĩ 2 phƣơng pháp để phát hiện microsatellite: phƣơng pháp lai và phƣơng pháp PCR. 2.3.7.1 Phƣơng pháp lai Phƣơng pháp lai phân tử cho phép xác định chính xác kiểu microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai, cùng một lúc cĩ thể phát hiện nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dị khác nhau. Tuy nhiên xác định chiều dài của chúng cịn bị hạn chế. Trong phƣơng pháp lai cĩ hai cách: phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phĩng xạ và phƣơng pháp nhuộm bạc.  Phƣơng pháp phát hiện nhờ đồng vị phĩng xạ Phƣơng pháp hiệu quả và đƣợc dùng đầu tiên là đồng vị phĩng xạ. Ngƣời ta cĩ thể đánh dấu vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc đánh dấu và trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A, T, G, C (incorporation-labelling). Nhƣng 28 ngày nay phƣơng pháp dùng đồng vị phĩng xạ rất ít đƣợc sử dụng vì nguy hiểm đến sức khỏe con ngƣời và địi hỏi việc xử lí chất thải tốn kém.  Phƣơng pháp nhuộm bạc (phát hiện khơng dùng phĩng xạ) Phƣơng pháp này rẻ, khơng hại, nhƣng độ nhạy cao, địi hỏi một số kỹ thuật rắc rối khi nhuộm. 2.3.7.2 Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR sử dụng màu huỳnh quang để đánh dấu primer forward và sử dụng máy giải trình tự tự động. Phƣơng pháp này đƣợc phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự nucleotide để phát hiện sản phẩm PCR đƣợc đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incorporation). Khi kích thích bởi tia laser, các chất nhuộm màu này giải phĩng ra một tín hiệu mà máy tính cĩ thể phát hiện đƣợc bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với DNA chuẩn, chúng ta cĩ thể cĩ kích thƣớc chính xác của đoạn DNA quan tâm. Chất huỳnh quang này đƣợc gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR. Phƣơng pháp này cĩ hiệu quả rất cao và đang đƣợc sử dụng phổ biến trên các phịng thí nghiệm trên thế giới. Ngƣời ta cĩ thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và chạy cùng một giếng điện di, kể cả kích thƣớc các đoạn bằng nhau nhƣng chúng ta vẫn cĩ thể xác định đƣợc nhờ màu huỳnh quang khác nhau. Kết quả đƣợc thể hiện trên máy tính, nhờ đĩ chúng ta cĩ thể xác định đƣợc chính xác kích thƣớc của al, loại trừ những băng lặp lại (stuter DNA) hoặc thêm một nucleotide A… 2.4 Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.4.1 Khái niệm 29 Kỹ thuật PCR đƣợc phát minh vào năm 1985 bởi nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự. Phát minh này đã đem đến cho Mullis giải Nobel Hĩa học năm 1993. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đĩ một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dịng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu. Hình 2.3:Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 2.4.2 Thành phần và vai trị của các chất trong phản ứng PCR  Mẫu DNA: Mẫu DNA đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. Đối với DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mơ lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lơng, mơ … 30 Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu khơng cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 5-10 ng DNA thuần khiết. Nồng độ DNA cĩ thể xác định đƣợc nhờ sự đo OD (mật độ quang) ở độ dài sĩng 260nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo cơng thức : - 1 OD260nm = 50 ng/ l (đối với DNA sợi kép). - 1 OD260nm = 40 ng/ l (đối với DNA sợi đơn).  Primer (mồi): Là một đoạn acid nucleid cĩ trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F-primer (mồi xuơi) và R-primer (mồi ngƣợc). Cặp primer quyết định sự thành cơng của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác.  dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Nồng độ dNTPs thƣờng đƣợc sử dụng là 20 - 200 μM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đĩ, sự cân bằng trong thành phần các dNTPs cũng ảnh hƣởng đến phản ứng PCR. dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTPs sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTPs thích hợp nhất cho một phản ứng PCR cịn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lƣợng chu kỳ của phản ứng và chiều dài của sản phẩm đƣợc khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTPs tối ƣu cho từng phản ứng phải đƣợc xác định qua thực nghiệm  Dung dịch buffer: Tạo mơi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động.  Taq polymerase: 31 Ban đầu, khi chƣa sử dụng loại enzyme Taq - polymerase ngƣời ta phải thêm DNA polymerase trong từng chu kỳ nhân bản, vì DNA polymerase cần cho quá trình tổng hợp DNA nhƣng khơng chịu đƣợc nhiệt độ lớn hơn 900 C ở giai đoạn tách hai sợi của phân tử DNA. Năm 1988, Taq polymerase đƣợc phát hiện. Đây là một DNA polymerase bền với nhiệt, đƣợc cơ lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nĩng, với enzyme này chỉ cần cho một lần Taq polymerase là đủ. Nồng độ Taq polymerase đƣợc sử dụng thơng thƣờng là 0.5 - 5 đơn vị/100μl dung dịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm khơng chuyên tính cĩ thể xuất hiện làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ khơng cĩ đủ số lƣợng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong phản ứng PCR thì Taq polymerase cĩ khuynh hƣớng thêm một nucleotide loại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dịng (TA - cloning) và nĩ sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngồi ra cĩ thể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase bằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli hoặc Pfu. Sử dụng Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác.  Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.4.3 Nguyên tắc của phản ứng PCR Phản ứng PCR thƣờng đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: denature (biến tính DNA), annealing (gắn mồi), extension (kéo dài). Giai đoạn denature: tiến hành ở nhiệt độ từ 94 - 96 oC, trong 60 giây (thời gian cĩ thể dài hoặc ngắn hơn tùy theo độ dài DNA mẫu). Đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn dƣới tác dụng của nhiệt độ. Giai đoạn annealing: 50 – 60 oC, 30 giây. Đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích ( ở dạng sợi đơn). Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer. 32 Giai đoạn Extension: 72 o C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Nhiệt độ 72oC hoạt động của Taq polymerase đạt hiệu quả tối ƣu. Sau 25 -35 chu kỳ, phản ứng tiếp tục giai đoạn ủ ở 72oC trong 5 - 15 phút để hồn thiện các sản phẩm PCR. 2.4.4 Ứng dụng của kỹ thuật PCR Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nơng nghiệp, trong lâm nghiệp và thủy sản … Trong nghiên cứu genomic: Nhân bản vơ tính với PCR, recombinant PCR, multiplex PCR … Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đốn đƣợc nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng … gây ra. Trong nơng nghiệp và lâm nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ DNA marker (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gene … Trong thủy sản: Phát hiện, chuẩn đốn bệnh trên các lồi thủy sản. 2.4.5 Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR  Ƣu điểm: Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là cĩ thể thực hiện đƣợc.  Nhƣợc điểm: Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR cĩ thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính. 2.5 Quy trình ly trích DNA thực vật 33 DNA, vật liệu mang thơng tin di truyền đƣợc cấu tạo bởi nucleotide, là yếu tố mở đầu cho mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử, trong đĩ bao gồm các nghiên cứu tính đa dạng di truyền trong quần thể. Để cĩ thể tiến hành các thí nghiệm phân tích sâu hơn thì việc thu nhận một lƣợng DNA lớn và sạch là điều kiện đầu tiên. Đối với tách chiết DNA thì mối quan tâm hàng đầu là thu nhận đƣợc các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, ít bị phân hủy do các tác nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hố học (phân tử bị thủy giải do các enzym (enzym nội bào giải phĩng ra mơi trƣờng khi tế bào bị phá vỡ hay sự tạp nhiễm trong khi thao tác). Quá trình tách chiết DNA cần thực hiện ở nhiệt độ thấp để ức chế enzym nội bào. Cĩ nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phƣơng pháp đều cĩ ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta cĩ thể dựa vào đối tƣợng đƣợc đem thí nghiệm cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngồi ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Các phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền). Thơng thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phĩng DNA ra mơi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để đảm bảo sự tồn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thuỷ phân nội bào, ngƣời ta cĩ thể phá vỡ cơ học mơ và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-198oC). Sau đĩ sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hĩa học). Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần khơng mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hịa tan khác nhau của các loại phân 34 tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha khơng hịa tan (phenol, Chloroform/ nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1). Dung dịch này cĩ tác dụng làm biến tính protein đồng thời khơng hịa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ khơng cịn hịa tan trong pha nƣớc cĩ chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc cĩ chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại làm thí nghiệm. Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Cĩ thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thơng thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đĩ, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol cịn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cơ đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời cĩ thể hịa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Một số vấn đề cĩ thể gặp phải khi tách chiết DNA: - DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. - Cĩ lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. - Cĩ lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. - Cĩ lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.5.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử cĩ một đỉnh hấp thụ (tại nơi đĩ chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sĩng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vịng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta cĩ thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA cĩ trong mẫu ly trích. 35 Sự hấp thụ ánh sáng ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với: - 50 g/ml DNA sợi đơi. - 40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA. - 20 g/ml oligonucleotide sợi đơn. Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta cĩ thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích cĩ lẫn tạp protein thì kết quả tính tốn sẽ khơng chính xác. Do ngồi đỉnh hấp thụ là 280nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sĩng 260nm nhƣ các acid nucleotide và vì thế sẽ làm sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide trong dịch ly trích. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260nm/OD280nm. Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7-2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại khơng cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp định tính DNA bằng cách điện di trên gel. 2.5.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong cùng một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử cĩ cùng khối lƣợng thì phân tử nào cĩ điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là mơi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Cĩ hai loại gel 36 đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose Lỗ cĩ đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơi, kích thƣớc 300-10.000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhĩm phân tử cĩ kích thƣớc khác nhau. Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (kb) 0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5 1 20 0,5  7 0,5  5  Gel polyacrylamide Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA cĩ kích thƣớc dƣới 500bp, hiệu quả phân tách cĩ thể đạt 1 nucleotide. (Lƣu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng) Bảng 2.3: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (bp) 4 5 8 200  800 80  200 40  100 37 11 10  50 Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau: Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thƣờng đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ và vị trí của nĩ sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phĩng xạ tự ghi. Ngồi ra, các phân tử DNA cịn cĩ thể đƣợc đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta cĩ thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gẫy, lẫn tạp, …qua các band màu thể hiện. 2.6 Tổng quan về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) 2.6.1 Vài nét về chi Keo (Acacia) 2.6.1.1 Đặc điểm sinh học của các lồi Keo Chi Keo (Acacia) là một chi của một số lồi cây thân bụi và thân gỗ cĩ nguồn gốc tại đại lục cổ Gondwana, thuộc phân họ Trinh nữ (Mimosoideae) thuộc họ Đậu (Fabaceae), lần đầu tiên đƣợc nhà nghiên cứu Linnaeus miêu tả năm 1773 tại châu Phi. Hiện nay, ngƣời ta biết cĩ khoảng 1300 lồi cây Keo trên tồn thế giới, trong đĩ khoảng 950 lồi cĩ nguồn gốc ở Australia, và phần cịn lại phổ biến trong các khu vực khơ của vùng nhiệt đới và ơn đới ấm ở cả hai bán cầu nhƣ: châu Phi, miền nam châu Á, châu Mỹ. Tuy nhiên, chi Acacia khơng phải là chi đơn ngành mà đƣợc chia tách Acacia thành 5 chi mới ( 38 Lồi sinh trƣởng xa nhất về phía bắc của chi này là Acacia greggii (Keo vuốt mèo), đạt tới 37°10' vĩ bắc ở miền nam Utah, Hoa Kỳ. Lồi sinh trƣởng xa nhất về phía nam là Acacia dealbata (Keo bạc), Acacia longifolia (Keo bờ biển hay Keo vàng Sydney), Acacia mearnsii (Keo đen) và Acacia melanoxylon (Keo gỗ đen), đạt tới 43°30' vĩ nam ở Tasmania, Australia, trong khi Acacia caven đạt tới vĩ độ tƣơng tự nhƣ thế về phía nam, tại khu vực đơng bắc tỉnh Chubut, Argentina. Trong tiếng Anh, các lồi ở Australia gọi chung là wattle (cây Keo Ưc), cịn các lồi châu Phi và châu Mỹ gọi chung là acacia (cây Keo) (Bùi Việt Hải,1998). Lá của các lồi Keo nĩi chung là loại lá hình lơng chim phức. Tuy nhiên, ở một số lồi đặc biệt ở Australia và các đảo trên Thái Bình Dƣơng thì các lá chét bị triệt tiêu và các cuống lá cĩ dạng phẳng và bẹt, hƣớng lên trên, cĩ tác dụng giống nhƣ lá; chúng đƣợc gọi là cuống dạng lá. Hƣớng thẳng đứng của các cuống dạng lá bảo vệ cho các lồi cây này khơng bị quá nĩng do ánh sáng dữ dội của Mặt Trời, do chúng chắn ít ánh sáng hơn so với các lá cây nằm ngang. Một số lồi (chẳng hạn Acacia glaucoptera) thiếu cả lá lẫn cuống dạng lá, nhƣng cĩ cành dạng lá, là một phần của thân cây đã biến đổi thành dạng tƣơng tự nhƣ lá để cĩ chức năng quang hợp. Hình 2.4: Hình thái lá các lồi Keo(Acacia) Các hoa nhỏ cĩ 5 cánh hoa rất nhỏ, gần nhƣ ẩn kín trong các nhị hoa dài và đƣợc phân bổ trong các cụm hoa dày dặc dạng hình cầu hay hình trụ; chúng cĩ màu 39 vàng hay màu kem ở một số lồi, một số lồi khác thì màu hơi trắng hay thậm chí là tía (chẳng hạn Acacia purpureapetala) hoặc đỏ (trong lồi đƣợc trồng gần đây Acacia leprosa). Các lồi thƣờng cĩ gai, đặc biệt ở các lồi sinh trƣởng trong khu vực khơ cằn. Chúng thƣờng là các cành bị ngắn đi, cứng và sắc, hoặc đơi khi là lá kèm dạng lá biến hĩa thành. Ví dụ nhƣ: Acacia armata là cây gai Kangaroo ở Australia, Acacia giraffa ( Hình2.5:Hình thái một số lồi Keo A) Keo tuyến sĩng, sĩng rắn B) Keo tai tƣợng C) Keo bình linh,Keo dậu D) Keo lá trịn, Mimosa Đà Lạt 2.6.1.2 Cơng dụng của các lồi Keo (Acacia) 40 Thần thoại Ai Cập đã gắn lồi Keo (Acacia) với các đặc trƣng của cây của sự sống do nhiều lồi trong chi Acacia chứa một số loại ancaloit cĩ các tác động tới thần kinh, trong đĩ DMT và NMT là nổi bật và cĩ ích nhất. Lá, thân và/hoặc rễ cĩ thể ủ với một số thực vật chứa MAOI để thu đƣợc chất cĩ tác dụng ảnh hƣởng đến tuổi thọ khi uống. Vỏ cây Acacia arabica đƣợc coi là phƣơng thuốc cĩ ích trong điều trị việc xuất tinh sớm.( Trong cơng nghiệp, cây Keo đƣợc ứng dụng trong cơng nghệ thuộc da, làm chất cao su (catechu), làm chất làm se.Cung cấp các loại gỗ cĩ giá trị để làm đồ gỗ nội thất và cĩ độ bĩng cao (Acacia melanoxylon-Keo gỗ đen, hay Acacia homalophylla..).Ngồi ra một số loại Keo đƣợc dùng để sản xuất nƣớc hoa nhƣ Acacia farnesiana bởi nĩ cĩ mùi thơm rất mạnh. Vỏ các lồi Keo khác nhau rất giàu tanin và là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng; các lồi cĩ giá trị lớn nhất trong ứng dụng này là Acacia pycnantha (Keo vàng), Acacia decurrens (Keo vỏ dà), Acacia dealbata (Keo bạc) và Acacia mearnsii (Keo đen). Gỗ Keo đƣợc sử dụng trong sản xuất hộp đựng pháp điển của ngƣời Do Thái- một biểu tƣợng tinh thần, và cịn là một trong những biểu tƣợng cĩ quyền lực nhất trong Hội Tam Điểm, thể hiện linh hồn của Thƣợng Đế và sự tinh khiết của tâm hồn. Một số lồi đƣợc sử dụng nhƣ là các loại cây cảnh; phổ biến nhất là Acacia dealbata (Keo bạc) cĩ các lá từ màu lục xám tới màu bạc và các hoa màu vàng sáng; nĩ đơi khi cịn bị gọi sai thành "trinh nữ" (mimosa) tại một số khu vực cĩ trồng, bởi sự nhầm lẫn với cây trinh nữ thực thụ thuộc chi Mimosa Trong văn hĩa ẩm thực, hạt của một số lồi Keo đƣợc dùng làm thực phẩm và các một loạt các sản phẩm khác trong ẩm thực. Ví dụ, hạt của Acacia niopo đƣợc nƣớng và dùng nhƣ là thuốc hít tại Nam Mỹ. Tại Lào và Thái Lan, các loại rễ của Acacia pennata (gọi là cha-om) đƣợc sử dụng trong súp, cà ri, trứng ốp lết hay các mĩn xào. 41 Tại Việt Nam, các lồi cây Keo tai tƣợng (Acacia mangium) và Keo lá tràm (Acacia auriculiformis) đƣợc trồng để làm nguyên liệu sản xuất giấy, cải tạo vƣờn rừng. Bảng 2.4:Các ancaloit trong các lồi Keo (Alexander Shulgin. TiHKAL) Lồi Hoạt chất ancaloit Bộ phận chứa hoạt chất của cây A. baileyana 0,02%tryptamin và β-cacbolin Lá A. maidenii DMT và NMT Cuống lá A. albida DMT Lá A. confusa DMT và NMT Lá, cuống lá và vỏ cây A. cultriformis Tryptamin Lá và cuống lá A. laeta DMT Lá A. mellifera DMT Lá A. nilotica DMT Lá A. phlebophylla DMT Lá A. podalyriaefolia tryptamin Lá A. senegal DMT Lá A. seyal DMT Lá A. sieberiana DMT Lá A. simplicifolia DMT và NMT Lá, cuống lá, vỏ thân cây A. vestita Tryptamin Lá và cuống lá 2.6.2 Vài nét về cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth) 42 Tên Việt Nam hay tên địa phƣơng thƣờng gọi là Keo lá tràm hoặc Tràm bơng vàng. Tên khoa học: Acacia auriculiformis A. Cunn ex Benth, thuộc họ phụ Mimosoideae, họ Leguminosae. Theo báo cáo của Tổ chức nghiên cứu Lâm nghiệp của Liên hiệp quốc (IUFRO) tại hội thảo triển khai cho châu Á (Sri Lanka, 1984) thì cây Keo lá tràm là một trong số những lồi rất chủ yếu cạnh các lồi khác nhƣ Eucalyptus carnaldulensis,Leucaena leucocephala, Acacia mangium và Bamboos đƣợc giới thiệu để trồng rừng thâm canh ở các vùng đất thấp của khu vực nhiệt đới ẩm. Keo lá tràm đƣợc biết đến ở ngồi nơi phân bố tự nhiên của nĩ nhƣ là một lồi cĩ khả năng thích ứng nhất trong số những cây trồng rừng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ẩm. Hình 2.6. Keo lá tràm 2.6.2.1 Các đặc điểm sinh học và sinh thái Hình thái Keo lá tràm là loại cây gỗ nhỏ đến trung bình, thƣờng chỉ cao 8-20m, ở địa phận thuận lợi cĩ thể cao 25 đến 30m, đƣờng kính 80cm với đoạn thẳng dài,cành 43 nhỏ, dễ trồng bằng hạt, sống lâu, cĩ khả năng cố định đạm và tự tỉa cành tốt (Hƣớng dẫn kỹ thuật trồng rừng Keo lá tràm-Sở nơng nghiệp và phát triển nơng thơn Thanh Hĩa). Cĩ thể sinh trƣởng trên nhiều loại đất, kể cả đất nghèo kiệt, thốt nƣớc kém. Cây mọc nhanh, tốc độ sinh trƣởng cao trong vài năm đầu. Song, trên một nơi nếu trồng nhiều chu kì liên tục cĩ thể dẫn tới nghèo Kali và Mg trong đất. Gỗ giác màu vàng, gỗ lõi màu nâu sẫm, tỷ tỵong cơ bản (độ ẩm 12%) là từ 0.5 đến 0.65, hiệu suất bột giấy 49%, sợi dài 0.85mm, nhiệt trị 4700-4900kcal/kg, dùng làm trụ mỏ, nguyên liệu bột giấy (giấy gĩi), ván dăm, thân cành làm củi tốt do nhiệt lƣợng của than cao. Trong lâm sinh dùng làm cây trồng phù trợ cải tạo đất, che bĩng. Ở miền Nam gỗ Keo lá tràm đƣợc gọi là gỗ cẩm lai giả, thích hợp cho chế tác đồ mộc (Bùi Việt Hải, 1998) Lá của lồi Keo lá tràm là loại lá chét hình lơng chim phức, lá giả dài 10- 16cm, rộng 1.5-2.5 cm và cĩ 3 gân chính. Khi hạt nảy mầm, hai lá đầu tiên đại diện cho bộ trinh nữ, các lá về sau thì giống lá tràm nên đƣợc gọi là Keo lá tràm. Cây cĩ nhiều cành nhánh và thân thƣờng cong. Vỏ cây màu xám hoặc nâu, khi nhỏ tuổi cây cĩ vỏ nhẵn song khi càng nhiều tuổi vỏ cây càng thơ.quả. Quả khơ hình xoắn , khi chín tự nứt để phát tán hạt. Hạt nhỏ, màu nâu đen. Phân bố Cây Keo lá tràm phân bố tự nhiên ở ven biển Indonesia, vùng sa mạc nửa khơ hạn Papua New Guinea, ở trung tâm và đơng bắc Australia. Phạm vi phan bố nằm ở các vĩ độ 5-170 độ Nam, độ cao phân bố cĩ thể lên đến 400m nhƣng thƣờng phổ biến ở độ cao dƣới 100m. Keo lá tràm thƣờng gặp ở vùng khí hậu nĩng ẩm tới cận ẩm, nhiệt độ bình quân 22-240oC, lƣợng mƣa thay đổi từ 760mm-2000mm, nơi khơng cĩ băng giá và sƣơng muối. Tại những nơi đất bazan, lƣợng mƣa 2000mm, sau 11năm chiều cao của cây cĩ thể đạt 13.7m và chu vi thân cây đạt từ 1.3m đến 70cm ( Kushalapa,1992). Đặc điểm sinh thái 44 Keo lá tràm cĩ biên độ sinh thái rát rộng, cĩ khả năng thích nghi với điều kiện sinh thái tƣơng đối khắc nghiệt (nĩng và khơ hạn), chịu đƣợc đất nghèo dinh dƣỡng, tầng đất mỏng. Cĩ khả năng sinh trƣởng trên nhiều loại đất khác nhau nhƣ: đất sét, đất podson, đất laterit và ngay cả trên những vùng đất khơ hay đụn cát cố định, pH từ 3-9, lƣợng mƣa từ 200-1700mm. Keo lá tràm cĩ thể đƣợc xếp vào cây ƣa sáng hồn tồn. Các đặc trưng lâm học Keo lá tràm là một trong số những lồi cây cĩ khả năng thích nghi cao, sinh trƣởng nhanh, ổn định. Keo lá tràm cĩ khả năng cố định đạm và thích ứng rộng với các điều kiện khác nhau. Nĩ khơng những cĩ thể tồn tại và sinh trƣởng tốt ở những vùng cĩ mùa khơ kéo dài mà cả ở những vùng cĩ lƣơng mƣa hàng năm lên đến 6000mm (Bùi Việt Hải). Và mặc dù phân bố tự nhiên ở độ cao dƣới 400m nhƣng trồng đƣợc ở những độ cao lớn hơn. Ví dụ: ở Zimbabue (1.100-1.200 m) và Uganda (1.200-1.500 m). Keo lá tràm là lồi cây cĩ khả năng sinh trƣởng nhanh, tăng trƣởng chiều cao trong những năm đầu cĩ thể đạt 2-3m mỗi năm. Tại Việt Nam trên các thực địa thích hợp, chiều cao cây đạt ở 10-12 năm tuổi cĩ thể lên đến 25-30m, đƣờng kính 15-20m (xếp sau A.mangium và A.crassicarpa). 2.6.2.2 Cơng dụng và tiềm năng gây trồng Cơng dụng chính của Keo lá tràm là cung cấp gỗ chất lƣợng tốt cho nhiều mục đích khác nhau nhƣ dùng làm nguyên liệu sản xuất giấy, dùng để chế tác hàng thủ cơng mỹ nghệ, làm củi than đốt rất tốt. Gỗ cĩ tỷ trọng cao, chứa 59% cellulose, 24% lignin, 19% pentosan và giá trị nhiệt lƣợng đạt 4.800-4.900 kcal/kg. Keo lá tràm cĩ khả năng cải tạo đất trồng nên thƣờng đƣợc gây trồng rộng rãi. Ngồi ra cịn dùng lấy chất nhuộm màu và lấy tanin từ vỏ cây. 45 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 03/2007 đến 08/2007 3.1.2 Địa điểm thực hiện Mẫu lá các dịng Keo lá tràm đƣợc thu thập tại Trạm thực nghiệm lâm nghiệp Bàu Bàng(Tỉnh Bình Dƣơng ) của Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. Mẫu lá đƣợc phân tích tại Phân viện Nghiên cứu khoa học kĩ thuật lâm nghiệp Nam Bộ và Trung tâm Cơng nghệ sinh học TP.Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm Thu thập các dịng Keo lá tràm khác nhau (xem phụ lục). Cách lấy mẫu: Mẫu lá tƣơi đƣợc lấy tại rừng trên những cây cĩ đánh dấu số dịng khác nhau, cho vào túi nylon, đánh dấu mẫu và đƣa về trữ trong tủ lạnh để tiến hành ly trích DNA. Nguyên tắc thu thập mẫu: Thu thập lá non của các dịng Keo lá tràm cĩ kí số khác nhau. 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Trên cơ sở của các thơng tin thu thập trong và ngồi nƣớc, chỉ thị phân tử SSR(Microsatellite) đƣợc chọn để sử dụng trong nghiên cứu này do bởi : Chỉ thị này xuất hiện rải rác trên genome của sinh vật và cho độ đa hình lớn. Chỉ thị đồng trội nên dễ phát hiện. 46 Đơn giản nhƣng cho hiệu quả phân tích cao Ngồi ra, theo một số nghiên cứu kết quả do SSRs mang lại khi phân tích các lồi Keo cho kết quả phân tích cao hơn và cĩ tính chính xác cao hơn so với những chỉ thị phân tử khác. Ví dụ : hiệu quả cao hơn RAPD khoảng 7lần (Kraic và cộng tác viên, 1998) và cao hơn 3lần so với RFLP (Butcher và cộng tác viên, 2000). 3.4 Thiết bị và dụng cụ Chày và cối (Đức). Bình và khay đựng Nitơ lỏng. Cân điện tử (Ohaus - Mỹ). Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh). Tủ lạnh 4oC và -20oC. Máy Vortex (IKA - Đức). Máy hút và tủ cấy vơ trùng (Việt Nam /Anh). Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức). Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản). Lị Viba (Electrolux). Tủ sấy (Jencons-Anh). Máy điện di (Biorad). Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển). Đầu típ các loại (Đức). Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản). Máy PCR (BioRad – Thụy Điển). Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản). Eppendorf các loại(Pháp). 47 3.5 Ly trích DNA 3.5.1 Hĩa chất Các hĩa chất sử dụng trong thí nghiệm đƣợc liệt kê trong Bảng 3.1 Bảng 3.1: Các hĩa chất sử dụng trong quá trình ly trích DNA HĨA CHẤT CƠNG DỤNG CÁCH PHA CTAB(C19H42NBr) (M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hịa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC Ethanol 80% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Nitơ lỏng Giúp nghiền mẫu nhanh Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố cĩ trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc TE 10X Ổn định DNA Hịa tan DNA Pha 100ml: 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. Mercapto Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc EB(Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: 900µl CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65oC cho tan, hạn chế tạo bọt). Bổ sung 6 µl Mercaptro Ethanol. Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Isopropanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, khơng cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc 48 3.5.2 Quy trình ly trích DNA DNA trong mẫu lá Keo đƣợc ly trích theo quy trình mơ tả bởi Butcher và cộng sự (sơ đồ 3.1). Sơ đồ 3.1: Quá trình ly trích mẫu DNA 0.2g lá Keo non Bổ sung 500 μl Chloroform đảo đều o Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng(-196o) o Bổ sung 900 μl CTAB(65 o ) o Ủ trong 45-60 phút (65 o ) o Bổ sung 6 μl mercaptoethanol Ly tâm 13000vịng trong 8 phút.Thu dịch nổi Bổ sung 500 μl Phenol+ Chloroform (v/v=1:1).Đảo đều Ly tâm 13000vịng trong 8 phút.Thu dịch nổi Bổ sung 200 μl CTAB tủa, đảo đều trong 5 phút +500 μl Phenol+ Chloroform(v/v=1:1).Đảo đều Tủa DNA trong 600 μl Isopropanol lạnh, ly tâm lạnh ở 4 oC(13000 vịng trong 15 phút).Thu tủa. Rửa bằng 500 μl ethalnol (80%), ly tâm lạnh ở 4o (13000 vịng trong 15 phút), thu tủa, phơi khơ ở nhiệt độ phịng Hịa tan tủa DNA trong TE 49 3.5.3 Kiểm tra sản phẩm DNA ly trích Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel Agarose1.5%, trong dung dịch đệm 1X TBE ở hiệu điện thế 60 V, cƣờng độ dịng điện 400 mA trong 60phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ với TAE 0,5X và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide đã liên kết với sợi đơi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.6 Thực hiện kỹ thuật SSR  Hĩa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer MgCl2 . dNTP’s. Taq DNA polymerase. Primer. DNA mẫu (ly trích từ lá Keo). H2O cất chạy PCR. 3.6.1 Qui trình phản ứng PCR Phản ứng PCR với cặp primer đã lựa chọn Thành phần Thể tích sử dụng Nồng độ đầu Nồng độ cuối HN buffer 2,5 μl 10X 1X MgCl2 0,75μl 50mM 1.5mM dNTPs 0,2μl 25mM 0,2mM Primer forward 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl Primer reverse 0.5μl 10 μmol/ μl 0,2 μmol/ μl DNA mẫu 0.5μl Taq polymerase 0,2μl 5u/ μl 1u/ μl 50 H2O cất 19,85μl Tổng thể tích: 25µ Bảng 3.2: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian 1 94 2 phút 2 - 29 94 30 giây 55-60 30 giây 72 1 phút 30 72 5 phút 31 4 Forever Lƣu ý: Sau khi phản ứng PCR hồn chỉnh, chờ cho nhiệt độ trong máy về 4 oC trong 5 phút. Đem sản phẩm trữ ở 4oC hay -20oC để cĩ thể sử dụng với trong thí nghiệm sau này. Các thao tác tiến hành pha mix phải thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo điều kiện vơ trùng và các thành phần phải luơn đƣợc giữ trong điều kiện lạnh . Trình tự của các primer sử dụng trong đề tài theo chiều 5’ – 3’ Bảng 3.3: Trình tự các SSR’Primer sử dụng Primer Trình tự (5’-3’) Nucleotide lặp lại Am008 F: CCACCCGTTACCCATTTATG R: CCGTGATTGACTCTCAGCG (TG)14 Am012 F: TGAGTCGATCGCTTAGCTTG R: TCCCGTTATTATGCCAAAGTG (TC)15(AC)7-(AC)10AG Am014 F: TACTAACGTTGCTATATGAGAAAGG R: CTGGTTGTTCGCTTATATGG (ATAC)3(AC)26(AT)3,(GTAT)2(AT)3AC 51 Am018 F: CACGGCTGTTATTTCCTTCG R: GGAAAGAGGTGTGACAGAGGAC (AC)14 Am326 F: GGACCAAACTTATGCAACACC R: GCATCAATGTACTAAACCATTTCC (CA)20 Am341 F: CCATTCGAGCATCCTAAGAG R: CGTATGGCTGAGCTACTTAATCA (CA)12(TA)2 Am502 F: CAAATGGCCAAGTTACGACTG R: TTCTGGTAATCCAAACTTATGTGG (TTC)3-(GGA)8, AGA(GGA)2 Am522 F: ATGAGTTTGACCCGACTTGA R: TGCGTAACACGATTATCCT (AAT)3-(AGT)2(GGT)7 Am770 F: CAGAGGTGGCAGATGATGTC R: AAGCCTTTAGTTGGGCGTTC CTC(CAC)5CGC,(CAC)3 3.6.2 Điện di sản phẩm PCR Lƣu ý: Khi tiến hành nạp gel và gắn lƣợc cần tránh tạo bọt khí trong bản gel và tại các giếng. Bƣớc1: Rửa các tấm kính(0.75mm) với nƣớc. Lau khơ bằng giấy mềm. Rửa lại 2lần bằng cồn 70 oC. Dùng giấy khơng bụi lau lại thật sạch Lắp các tấm kính vào bộ phận đổ gel điện di đứng vào. Bƣớc2: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide(7.5%): H2O 4.89ml Tris HCl 1.5M,pH 8.8 2.5ml Monomer 2.5ml TEMED 10 μl 10% APS 100 μl Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Thêm iso propanol vào để làm đều mặt gel. Đợi gel đơng hồn tồn (khoảng 20phút), thấm hút dịch isopropanol. Bƣớc3: Chuẩn bị gel gom polyacrylamide(7.5%): H2O 2.133ml Tris HCl 1.5M,pH 8.8 0.33ml 52 Monomer 0.83ml TEMED 3μl 10% APS 30μl Bơm dịch gel vào bộ phận đổ gel. Gắn lƣợc tạo giếng. Đợi gel đơng hồn tồn. Tháo lƣợc. Gắn bản gel vào buồng điện di đứng. Chuẩn bị load mẫu điện di. Bƣớc4: Trộn 10µl mẫu với 10µl loading dye5x (BioRad) rồi nạp vào giếng. Vận hành máy điện di ở 60V, 400A trong 60 phút. Bƣớc5: Di chuyển gel ra khỏi tấm kính và đem nhuộm ethium bromide trong 15 phút. Rửa lại với TAE 0.5X. Tiến hành chụp gel. 53 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Quá trình ly trích Li trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nĩ quyết định sự thành cơng cho phản ứng PCR sau này. Qui trình li trích DNA theo sơ đồ 3.1 đạt hiệu quả tốt vì DNA li trích cĩ độ tinh khiết cao, khơng bị lẫn tạp DNA lạ. Dịch trích DNA chứa chất mercaptoethalnol cĩ khả năng phá vỡ thành tế bào rất mạnh. Bƣớc sử dụng Chloroform đƣợc lặp lại 2 lần liên tiếp kết hợp với li tâm đã loại bỏ hết protein và polysaccharide cĩ trong mẫu. Do đĩ, DNA thu đƣợc tƣơng đối tốt, đảm bảo cho phản ứng PCR xảy ra. Bƣớc pha tủa và pha lỗng mẫu sẽ giúp giảm nồng độ tạp chất cịn lẫn trong sản phẩm li trích sau cùng, bƣớc li tâm tiếp theo sẽ giúp thu đƣợc DNA tinh sạch với nồng độ thấp ở khoảng giữa ống và khơng bị lẫn tạp chất đã lắng xuống đáy ống. Hình điện di sản phẩm ly trích DNA 4.2 Phản ứng PCR 54 Phản ứng PCR qua nhiều thí nghiệm với nhiều quy trình nhiệt độ và thành phần thay đổi đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp nhất. Quy trình PCR ở trên là phù hợp và cho kết quả tin cậy. Do các đoạn DNA thu đƣợc từ sản phẩm PCR cĩ kích thƣớc khơng quá khác biệt nhau nên sự đa hình rất khĩ nhận thấy trong sản phẩm khi điện di trên gel thơng thƣờng. Vì vậy cần phải tiếp tục phân tích trên máy giải trình tự ABI 3100 để thu đƣợc những kết quả chính xác hơn. Sau khi tách chiết, mẫu ADN tách chiết từ các mẫu lá thí nghiệm này đƣợc sử dụng để thanh lọc các mồi SSR để tìm đa hình và xem mồi nào cĩ thể đƣợc sử dụng để đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể Keo lá tràm nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các cặp mồi thu đƣợc : Thanh lọc với cặp mồi Am341: Cá thể số 91 khơng xuất hiện band. Cĩ sự khác nhau về trọng lƣợng các band giữa các cá thể. Đồng thời cĩ sự biến động về di truyền giữa các cá thể. Thanh lọc với cặp mồi Am 522: Cĩ thu đƣợc đa hình giữa một số dịng. Cá thể số 142 và 178 cĩ trọng lƣợng phân tử nhỏ hơn các dịng khác. . 55 Thanh lọc với cặp mồi Am 502. Thanh lọc với cặp mồi Am 770: Cặp mồi Am 770 cũng cĩ thể sử dụng để nhận biết sự khác biệt giữa các cá thể: cá thể số 8 và 36 khơng cĩ band. Thanh lọc với cặp mồi Am 326. 56 Tƣơng tự nhƣ mồi Am 770, cặp mồi Am 326 cũng đƣợc dùng để nhận biết cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các cá thể khác. Nhƣ vậy 3 cặp mồi Am 326, Am 341 và Am 770 cĩ thể đƣợc sử dụng để phân biệt với các cá thể khác trong thí nghiệm này. Cần thử nghiệm tiếp để tìm đƣợc căp mồi chung cho tồn bộ cá thể nghiên cứu. Kết quả thanh lọc các mồi SSR trong thí nghiệm này, bƣớc đầu đã cho thấy các mồi đều cho dạng đa hình giữa các cá thể, trong đĩ mồi Am 341 cĩ thể phân biệt dùng để phân biệt cá thể số 91 (thuộc nhĩm sinh trƣởng trung bình) với các cá thể khác. Cặp mồi Am 770 cĩ thể đƣợc dùng để nhận biết cá thể số 8 (thuộc nhĩm cá thể cĩ sinh trƣởng nhanh), trong khi mồi Am 326 cĩ thể dùng để nhận biết các cá thể 116, 10, 30, 169 và 134 với các thể khác. Tuy nhiên, cặp mồi Am 326 chỉ cĩ thể sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ di truyền giữa các cá thể chứ khơng sử dụng đƣợc để tìm hiểu mối liên kết của chỉ thị phân tử và tính trạng tăng trƣởng nhanh trong quần thể Keo lá tràm này đƣợc. Những thí nghiệm thanh lọc với các cặp mồi khác cịn đang đƣợc tiếp tục tiến hành để phát hiện thêm các cặp mồi cĩ thể dùng để phân biệt giữa các cá thể , đặc biệt là cĩ liên quan đến tính trạng sinh trƣởng nhanh , và cĩ thể đƣợc sử dụng trong cơng tác chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng chất lƣợng với độ chính xác cao. 57 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tơi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Sử dụng lá keo non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất. Kết quả thanh lọc cho thấy cặp mồi Am 341, Am 326 và Am 770 cĩ thể đƣợc sử dụng để tìm hiểu mối quan hệ của các cá thể. Tuy nhiên để sử dụng những chỉ thị này tìm hiểu sự liên hệ với tính trạng tăng trƣởng nhanh thi cĩ thể sử dụng mồi Am 341 và Am 770. Luận văn thực hiện là một phần trong đề tài lớn với việc ứng dụng chỉ thị phân tử ADN trong chọn giống Keo lá tràm theo hƣớng tăng trƣởng nhanh. Tổng số mồi SSR dự kiến sử dụng là 50 cặp. Tuy nhiên do số kinh phí cấp hàng năm hạn chế nên mỗi năm chỉ đủ kinh phí mua 5-6 cặp mồi và hố chất thí nghiệm. Vì thế, luận văn chỉ mới thực hiện bƣớc thanh lọc đƣợc trên 9 cặp mồi. Do số cặp mồi thanh lọc cịn ít nên việc sử dụng phần mềm NTSYS để phân tích mối quan hệ di truyền sẽ chƣa đƣợc chính xác, vì thế luận văn chƣa thể cĩ kết luận về mối quan hệ di truyền giữa các cá thể nghiên cứu. 58 5.2 Đề nghị Trong các cơng trình nghiên cứu tiếp theo về Microsatellite để mang lại các kết quả khả quan hơn trong việc thu nhận các đoạn DNA mã hố cho các tính trạng chiều cao cây, thể tích thân, phẩm chất gỗ, khả năng chống chịu sâu bệnh.. cần lƣu ý một số vấn đề sau: - Tiếp tục áp dụng và hồn thiện kỹ thuật Microsatellite để lập hồ sơ kiểu gene cho các giống và keo phục vụ cho việc trao đổi dữ liệu, thơng tin về đa dạng di truyền giữa các giống, đồng thời phục vụ cho cơng tác lai tạo và chọn lọc giống. - Từ kết quả nghiên cứu lần này tiếp tục phát triển thêm, nhiều cặp mồi SSR cần phải đƣợc thử nghiệm, thanh lọc để chọn lựa primer phù hợp hơn cho việc đánh giá mối quan hệ di truyền gữa các cá thể Keo lá tràm một cách chính xác, để xây dựng cơ sở di truyền hồn chỉnh và tin cậy cho các giống cĩ phẩm chất cao tại Việt Nam nhằm tạo thuận lợi cho những nhận định, kiểm tra, phân tích sau này. -Cần chú ý thu thập thơng tin về các QTL (Quantitive trait loci) cĩ liên quan đến tính trạng tăng trƣởng nhanh để tìm đƣợc những cặp mồi thích hợp cho quá trình phân tích. Trên cơ sở đĩ, cặp mồi tìm đƣợc sẽ đƣợc dùng để xác định sự liên hệ với các tính trạng tăng trƣởng nhanh ở quần thể Keo lá tràm nghiên cứu. 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang – 1999: Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn bản trong chọn giống cây trồng- Nhà xuất bản Nơng nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Trọng Cúc – 2002: Đa dạng sinh học và bảo tồn thiên nhiên – Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Đỗ Thị Hồng Diễm :Luận văn khĩa luận tốt nghiệp 2002-2006. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng – 1997: Sinh học phân tử - Nhà xuất bản giáo dục. 5. Bùi Việt Hải – 1998:Nghiên cứu một số cơ sở khoa học cho kỹ thuật tỉa thƣa rừng trồng Keo lá tràm cung cấp gỗ nguyên liệu giấy sợi vùng miền Đơng Nam Bộ. 60 6. Phạm Thành Hổ : Bài giảng CNSH cây trồng. 7. Nguyễn Thị Lang – 2002: Các phƣơng pháp cơ bản trong nghiên cứu cơng nghệ sinh học – Nhà xuất bản Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. 8. Lâm Vỹ Nguyên: Luận văn khĩa luận tốt nghiệp 2002-2006. 9. Phạm Bình Quyền - Nguyễn Nghĩa Thìn – 2002. Đa dạng sinh học - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 10. Nguyễn Nghĩa Thìn – 2005: Đa dạng sinh học và tài nguyên di truyền thực vật - Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. 11. Trần Ngọc Việt : Luận văn khĩa luận tốt nghiệp 2002-2006. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGỒI 13. Butcher PA.; Decroocq S.;Gray Y. và Moran GF.,2000: Development, inheritance and cross- species amplification of Microsatellite markers from Acacia mangium. 14. Wickneswari R and Norwati M 199: Genetic diversity of natural population of Acacia auriculifofmis. Aust.J.Bot. 41:65-77. 15. Kenneth Berendzen, Iain Searle, Dean Ravenscroft, .v.v..,2005: A rapid and versatile combined DNA/RNA extraction protocol and its application to the analysis of a novel DNA marker set polymorphic between Arabidopsis thalian ecotypes Col-0 and Landsberg erecta 61 16. T. A. Holton, 1999. Plant Genotyping by Analysis of Microsatellites – Centre for Plant Conservation Genetics. Southern Cross University, Lisomore, Australia 17. Powell W; Morgante M; Andre C; Hanafey M; Vogel J; Tingey S; Rafalski A: The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (Microsatellite) markers for germplasm analysis 18. Antonio A.F. Garcia, Luciana L. Benchimo, Antơnia M.M. Barbosa, Isaias O. Geraldi: Comparison of RAPD, RFLP, AFLP and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines TRANG WEB PHỤ LỤC Phụ lục 1: Danh sách các dịng Keo trong thí nghiệm. STT Các dịng PT tốt Dịng PT TB Dịng PT chậm Dịng số V(cm3) Dịng số V (cm3) Dịng số V(cm3) 1 12 19.42 70 15.07 177 6.61 2 33 19.6 140 15.1 51 7.58 3 41 19.64 167 15.18 132 7.67 4 30 19.73 99 15.2 176 7.88 5 1b 19.85 94 15.23 104 7.9 6 1c 20.18 138 15.41 151 8.04 7 29 20.8 76 15.42 88 8.08 8 38 20.92 91 15.52 131 8.87 9 159 21.06 67 15.59 178 9.03 10 84 21.11 2 15.6 5 9.09 11 7 21.3 61 16.06 170 10 12 145 21.42 50 16.15 150 10.75 13 25 21.52 72 16.37 144 10.84 14 19 21.54 162 16.42 166 11.21 15 1f 21.59 11 16.48 148 11.32 16 158 21.73 4 16.95 92 11.43 17 9 21.86 10 16.99 47 11.79 18 8 22.51 23 17.22 175 11.82 19 36 23.21 71 17.22 135 12.26 20 3 23.4 65 17.23 103 12.36 21 34 23.76 16 17.25 142 12.48 22 18 24.02 71b 17.49 163 12.6 23 1k 24.27 89 17.66 168 12.75 24 44 24.45 31 17.75 169 12.86 25 57 24.5 137 17.84 136 12.88 26 85 25.16 97 18.02 86 13.26 27 13 25.45 152 18.1 56 13.33 28 1 25.57 78 18.15 73 13.49 29 58 25.82 172 18.22 83 13.56 30 147 26.65 81 18.23 87 13.72 31 64 27.87 60 18.41 82 13.85 32 1e 27.94 133 18.62 100 13.97 33 26 28.08 32 18.64 14 14,16 34 43 29.83