Khóa luận Phát hiện loài fusarium spp. gây bệnh thối xương rồng (cactaceae) bằng phương pháp polymerase chain reaction (pcr)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN LOÀI Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG PHƢƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : PHẠM THỊ HẰNG Thành phố Hồ Chí Minh - Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction) Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện KS. DƢƠNG THÀNH LAM PHẠM THỊ HẰNG TS. LÊ ĐÌNH DÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi nhận đƣợc rất nhiều sự ủng hộ và giúp đỡ từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Nay tôi xin chân thành cảm ơn đến: Cha Mẹ và những ngƣời thân luôn tạo điều kiện, động viên con trong suốt quá trình con học tập tại trƣờng. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh học cùng tất cả Thầy Cô đã tận tình giúp đỡ, dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thầy Lê Đình Đôn và thầy Dƣơng Thành Lam đã hết lòng giúp đỡ, hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm, các Anh Chị làm việc tại phòng thí nghiệm 105 Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật khoa Nông Học cùng các Anh Chị làm việc tại Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Các Bạn sinh viên lớp công nghệ sinh học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài tốt nghiệp. Tp. Hồ Chí Minh tháng 9 năm 2007 Phạm Thị Hằng iii TÓM TẮT PHẠM THỊ HẰNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9-2007 “PHÁT HIỆN LOÀI NẤM Fusarium spp. GÂY BỆNH THỐI XƢƠNG RỒNG (Cactaceae) BẰNG KỸ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)” tại phòng Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Học trƣờng Đại học Nông Lâm và Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng – phòng Công nghệ Sinh học Thực vật Trƣờng Đại học Nông Lâm – TP.HCM. Thời gian thực hiện đề tài: 20/3/2007 đến 30/7/2007. Giáo viên hƣờng dẫn: KS. Dƣơng Thành Lam. TS. Lê Đình Đôn.  Nội dung nghiên cứu  Điều tra tình hình bệnh hại xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập xƣơng rồng bị bệnh từ các vƣờn điều tra. Từ đó phân lập, nhân và thu sinh khối các dòng nấm đã phân lập đƣợc.  Ly trích thu DNA. Thực hiện quy trình phản ứng PCR khuếch đại trình tự nằm trong vùng tef bằng primer ef1 và ef2 của các dòng nấm phân lập đƣợc.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh lên xƣơng rồng khỏe mạnh.  Kết quả đạt đƣợc  Tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn điều tra: Bệnh do vi khuẩn: 7,43%. Bệnh do nấm: 18,2%. Bệnh do virus: 0,16%.  Phân lập đƣợc 12 dòng nấm từ các mẫu xƣơng rồng bị bệnh với 2 hình thái có màu khuẩn lạc đặc trƣng: Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. iv  Ly trích đƣợc DNA tổng số của 12 dòng nấm phân lập đƣợc. Khuếch đại đƣợc đoạn DNA có kích thƣớc 700 bp nằm trong vùng tef của các dòng nấm (dựa vào thang ladder).  Giải trình tự vùng tef của 3 dòng nấm thuộc Fusarium spp. gồm: FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10. Xác định dòng FC07 – 3 và FC07 – 10 là nấm Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu.  Chủng bệnh nấm trên xƣơng rồng khỏe: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng sau 4 ngày chủng bênh (ở nhiệt độ phòng). v MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................. ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC ................................................................................................................... v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................... viii DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ ................................................................... x DANH SÁCH ĐỒ THỊ ............................................................................................... x Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 1.3 Giới hạn của đề tài ........................................................................................ 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Một số đặc tính để phát triển kiểng xƣơng rồng .......................................... 3 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) ................ 4 2.2.1. Phân loại thực vật .................................................................................. 4 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ ................................ 4 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới .......................................................................................................... 5 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh ..................................................................... 5 2.2.3.2. Trên thế giới .................................................................................. 6 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) ................................................................................................... 6 2.2.4.1. Đặc tính thực vật............................................................................ 6 2.4.2.2. Điều kiện sinh thái .................................................................... 10 vi 2.2.5. Bệnh hại trên cây xƣơng rồng ............................................................. 11 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng ........................................................... 11 2.2.5.2. Bệnh đốm than ............................................................................. 11 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng ........................................................ 12 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng ............................................................... 12 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium .................................................................. 12 2.3.1. Sự phân loại ........................................................................................ 12 2.3.2. Sự phân bố .......................................................................................... 14 2.3.3. Phạm vi kí chủ .................................................................................... 14 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium .............................. 14 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. gây ra và biện pháp phòng trừ 14 2.4.1. Khả năng gây hại ................................................................................ 14 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp. ............... 16 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh ................................................... 16 2.4.2.2. Biện pháp canh tác ....................................................................... 16 2.4.2.3. Biện pháp hóa học ....................................................................... 17 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium ............................ 17 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm ............................................ 18 2.6.1. Khái niệm ............................................................................................ 18 2.6.2. Nguyên tắc .......................................................................................... 19 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR ............................. 20 2.6.4. Ứng dụng của PCR ............................................................................. 22 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing ....................................... 22 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. .. 22 2.8.1. Trên thế giới ........................................................................................ 22 2.8.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 25 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam ...................... 26 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 27 vii 3.1. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 27 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu ........................................................ 27 3.1.2. Vật liệu ................................................................................................ 27 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 29 3.2.1 Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại TP. Hồ Chí Minh...... ... 29 3.2.2. Phân lập mẫu nấm ............................................................................... 29 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối .......................... 31 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm ........................................................... 32 Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. ............... 32 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số .................................................................. 32 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. .................................................................................................... 33 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR ................................................................ 35 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng .......................................................... 36 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng....................................... 36 3.2.8.2. Đánh giá kết quả .......................................................................... 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 37 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh ................................ 37 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng ....................................................... 37 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007). ........................................................... 39 4.3. Phân lập mẫu nấm ...................................................................................... 40 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các loài nấm Fusarium spp. ............. 41 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef .............................................. 43 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef ..................................................................... 43 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng ...................................................................... 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 52 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 53 viii TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 54 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 58 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR :Polymerase chain reaction. DNA :Deoxyrybonucleotide acid. TE :Tris EDTA. TAE :Tris Acetate EDTA. dNTP :Deoxynucleotide triphosphate. Taq :Thermus aquaticus. UV :Ulta violet. PGA :Potato glucose agar. WA :Water agar. EtBr :Ethidium bromide. l :micro lít. g :micro gam. M :micro gam/ lít. mM :mili gam/ lít. ctv :cộng tác viên. ng :nano gam. bp :base pair. rDNA : ribosomal DNA RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism. Tm : Melting Tempereture. TEF : Translation elongation factor. ITS : Internal Transcribed Spacer. ix NCBI : National Center for Biotechnology Informatic. DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. ................................. 13 Hình 2.2. Vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM-ID ........................................ 17 Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc ................................ 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc ......... 39 Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân ............................... 39 Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài .................................... 39 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA ......................................................... 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm .......................... 43 Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2. ................................................ 44 Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh .................. 51 Hình 4.9. Xƣơng rồng với triệu chứng thối sau khi chủng ................ 51 Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA. .......... 52 x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ BẢNG TRANG Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996). .................................. 26 Bảng3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR .................................... 33 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng ........................................ 34 Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10. ................... 46 Bảng 4.3. So sánh phần trăm độ tƣơng đồng (%) giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank........ 49 DANH SÁCH ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra ................................. 40 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, do nhu cầu đời sống của con ngƣời đƣợc nâng cao nên vấn đề thƣ giãn tinh thần ngày càng đƣợc coi trọng. Hiện nay vấn đề chơi cây cảnh trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh (Tp: thành phố) ngày càng phát triển trong đó có xƣơng rồng. Xƣơng rồng đang dần đƣợc khẳng định trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh vì chúng tƣơng đối dễ trồng, giá cả phải chăng, ai cũng có thể chơi và chăm sóc. Xƣơng rồng dù sống trên sa mạc khô cằn vẫn nở hoa sặc sở, thể hiện một sức sống mãnh liệt. Do nhu cầu của ngƣời sử dụng thích những loại xƣơng rồng lạ nên nhà vƣờn thƣờng lai tạo ra các loại cây ghép với sự đa dạng về chủng loại từ đó làm cho bệnh hại xƣơng rồng cũng phát triển theo. Xƣơng rồng cũng bị rất nhiều mầm bệnh tấn công và hậu quả của nó là làm cho nhiều loại quí hiếm của ngƣời sƣu tầm giống bị hƣ hại dẫn đến giảm phẩm chất, bệnh nặng và có thể chết hàng loạt gây thiệt hại cho nhà vƣờn và ngƣời sử dụng. Các bệnh thƣờng gặp trên xƣơng rồng: bệnh thối gốc, bệnh đốm than… và một trong những bệnh phổ biến nhất là bệnh thối do nấm Fusarium spp., bệnh này gây nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Vì vậy, vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác tác nhân gây bệnh để từ đó có những định hƣớng đúng đắn trong việc phòng trừ bệnh, nhằm làm giảm thiệt hại và mang lại hiệu quả cho ngƣời sản xuất. Đƣợc sự chấp thuận của bộ Môn Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dƣới sự hƣớng dẫn của KS. Dƣơng Thành Lam và TS. Lê Đình Đôn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phát hiện nấm Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng (Cactaceae) bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction)”. 2 1.2. Mục đích - yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định tên loài Fusarium spp. gây bệnh thối xƣơng rồng nhằm tìm ra quy trình phòng trừ hữu hiệu cho xƣơng rồng. 1.2.2. Yêu cầu  Điều tra tình hình bệnh hại tại các vƣờn trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh.  Thu thập và phân lập mẫu nấm trên xƣơng rồng bệnh. Nhân sinh khối các dòng nấm Fusarium spp.  Ly trích DNA các dòng nấm phân lập đƣợc. Thiết lập quy trình phản ứng PCR để khảo sát các yếu tố nhƣ chu kì nhiệt, nồng độ primer, nồng độ DNA, số chu kì thích hợp.  Giải trình tự sản phẩm PCR.  Chủng bệnh trên xƣơng rồng khỏe. 1.3 Giới hạn của đề tài  Đề tài đƣợc thực hiện từ 20/03/2007 đến 30/07/2007.  Chỉ thực hiện đƣợc trên một số mẫu. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Một số đặc tính để phát triển xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) Trƣớc đây không chỉ ở nƣớc ta mà nhiều nƣớc trên thế giới cũng vậy, số ngƣời thích chơi kiểng xƣơng rồng rất ít. Ngƣời nào thích “sƣu tập” thì số lƣợng cũng không nhiều. Nhƣng, càng về sau, số nghệ nhân đến với kiểng xƣơng rồng càng ngày càng nhiều, khi họ nhận ra một điều loại kiểng trụi lá này đƣợc các nhà thực vật học không ngừng lai tạo thêm nhiều cây có hình dáng lạ, và màu sắc cũng khác lạ. Xƣơng rồng có đủ loại: cây cao có mà cây thấp cũng có, cây to cây nhỏ cũng nhiều. Theo thói quen, hễ nói đến cây kiểng, ai cũng nghĩ là trồng ở trong vƣờn, ngoài sân, trƣớc hàng ba, lan can… nơi có nhiều nắng gió thông thoáng, chứ không ai nghĩ kiểng lại đem chƣng bày trong nhà, nơi thiếu ánh nắng và không khí lúc nào cũng hầm hập. Với xƣơng rồng là loại cây kì diệu, có thể sống tƣơi tốt trong nhà một vài tuần, thậm chí cả tháng, trong điều kiện thiếu hẳn ánh nắng, thiếu bón tƣơi… chính sự kì diệu này đã đƣa kiểng xƣơng rồng đến với mọi ngƣời, mọi nhà, trong đó có đông đủ cƣ dân thành thị. Đƣợc biết, tại nhiều nƣớc Âu Mỹ, mãi đến những năm đầu thế kỷ XX, ngƣời ta mới khám phá ra đƣợc điều này. Bởi vì trong giai đoạn này các thành phố của họ mật độ thị dân tăng cao đột ngột. Từ đó, đƣờng sá đƣợc mở rộng thêm, nhà cửa đƣợc cao tầng hơn, đất thổ cƣ trong thành phố còn lại bao nhiêu điều đƣợc trƣng dụng vào việc cất thêm nhà cửa…. Nhƣ vậy, không ai còn một khoảng đất thừa nào để trồng cây cảnh nhƣ trƣớc đây nữa! 4 Vì vậy, muốn trực tiếp đƣợc sống gần gũi với thiên nhiên, muốn có cây cảnh để giải trí, giảm stress, các thị dân mới nghĩ đến… kiểng xƣơng rồng, và đổ xô tìm mua về trồng. Ai cũng biết, chỉ có xƣơng rồng mới có khả năng sống lâu đƣợc trong nhà, lúc nào khí hậu cũng nóng và khô. Mặt khác, kiểng xƣơng rồng dùng chƣng trong nhà, thấp, choáng mặt bằng không nhiều nên dùng làm vật trang trí rất thích hợp và đẹp. Xƣơng rồng thƣờng đƣợc trồng trong loại chậu kiểng bằng gốm sứ với nhiều kiểu dáng khác nhau. So với nhiều giống cây kiểng khác, kiểng xƣơng rồng có giá cả thƣờng thấp hơn. Vị trí đặt chậu xƣơng rồng trong nhà cũng không cần phải cân nhắc quá kỹ. Nó có thể dùng móc kẽm cột vào chậu rồi treo lên nhƣ cách treo lan… Còn ở nƣớc ta trong thời gian gần đây dân từ các vùng quê cũng rủ nhau lên thành phố để tìm kế sinh nhai. Từ đó đẩy mật độ dân ở các thành thị tăng cao, có nơi tăng gấp hai ba lần! Việc đó dẫn đến phố phƣờng chật hẹp ngƣời đông đúc, nhà nào còn thửa đất nhỏ để trồng cây? Trƣớc tình trạng đó, chắc chắn dân thành thị cũng chỉ còn cách trồng kiểng… trên bao lơn, trên sân thƣợng và chƣng… kiểng xƣơng rồng trong nhà mà thôi! Nhƣ vậy, ngành nghề trồng kiểng xƣơng rồng tại nƣớc ta sẽ có cơ hội tốt để phát triển mạnh, do đó thị trƣờng rộng hơn. 2.2. Phân loại thực vật và giới thiệu về cây xƣơng rồng (Cactaceae) 2.2.1. Phân loại thực vật Giới (Kingdom) Thực vật Ngành (Division) Thực vật có hoa Lớp (Class) Thực vật hai lá mầm Bộ (Ordo) Caryophyllales Họ (Familia) Cactaceae (Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae). 2.2.2. Giới thiệu về cây xƣơng rồng và các cây cùng họ Trích theo (nguồn: http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae). 5 Cây xƣơng rồng thƣờng là loại cây mọng nƣớc thuộc họ Cactaceae (có cây ra hoa hai lá mầm). Họ Cactaceae có từ 24 đến 220 chi, tùy theo nguồn (90 chi phổ biến nhất), trong đó có từ 1.500 đến 1.800 loài. Những cây xƣơng rồng đƣợc biết đến nhƣ là có nguồn gốc từ Châu Mỹ, nhất là ở những vùng sa mạc. Cũng có một số loại biểu sinh trong rừng nhiệt đới, những loại đó mọc trên những cành cây, vì ở đó mƣa rơi xuống đất nhanh, cho nên ở đó thƣờng xuyên bị khô.  Loài cây quen thuộc có chung họ xƣơng rồng Quỳnh (Epiphyllum oxypetallum): Đây là loại hoa kiểng rất đƣợc nhiều ngƣời yêu chuộng vì đặc tính hoa đẹp. Hiện nay, ngƣời ta đã lai tạo đƣợc loại hoa Nhật quỳnh, loại hoa quỳnh nở cả ngày. Thanh long (Hylocereus undatus): Đây là một loại cây ăn trái. Trái có mùi vị đặc trƣng, hơi chua, ngọt. Vỏ trái màu từ đỏ hồng đến đỏ tía. 2.2.3. Tình hình sản xuất và phát triển xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh và trên thế giới 2.2.3.1. Tại Tp. Hồ Chí Minh Theo Trƣơng Duy Lam (2006), từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc, các loại cây xƣơng rồng đã đƣợc du nhập vào Việt Nam nhƣ Bolivia, Eriocacfus warasii… Và cho đến ngày nay, chúng là loại cây không thể thiếu trong bộ sƣu tập của những ngƣời chơi xƣơng rồng. Đất Tp. Hồ Chí Minh vẫn còn nổi tiếng với một bậc lão thành chuyên về các giống xƣơng rồng đó là Bác Năm Trƣờng ở Thủ Đức. Ông đã lai tạo, nhân giống liên tục để đến hôm nay trên thị trƣờng Việt Nam nói chung và thị trƣờng Tp. Hồ Chí Minh nói riêng có rất nhiều giống xƣơng rồng có màu sắc hoa rất lạ và đẹp. Trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh hiện nay phần lớn xƣơng rồng nhập từ Trung Quốc trong đó đặc biệt là các cây dùng để ghép. Thực tế cho thấy càng ngày trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh càng có nhiều hộ dân kinh doanh về xƣơng rồng. Cụ thể là theo điều tra thì cách đây hơn 10 năm số hộ trồng xƣơng rồng để kinh doanh chỉ đếm trên đầu ngón tay nhƣng ngày nay con số đó đã lên đến hàng chục hộ. Phần lớn các hộ trồng xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí Minh không xuất khẩu vì không đủ tiêu thụ trong nƣớc. Hiện nay các hộ trồng xƣơng rồng ở Tp. Hồ Chí 6 Minh đa số phân phối cho các tỉnh trong nƣớc đặc biệt là các tỉnh miền trung và nhiều nhất là vào các dịp lễ tết. Trung tâm Sinh học thực nghiệm (Viện ứng dụng công nghệ) đã nhân giống thành công cây xƣơng rồng Nopal có nguồn gốc từ Châu Mỹ, sinh trƣởng nhanh và rất thích hợp với điều kiện của vùng đất khô hạn. 2.2.3.2. Trên thế giới Theo Minh Sơn (2004), hiện nay Mỹ là một trong những nƣớc sản xuất và có thị trƣờng xƣơng rồng lớn nhất thế giới. Phần lớn ngƣời trồng cũng nhƣ thu hoạch tập trung ở vùng Tây Nam của quốc gia này. Ba thị trƣờng chính tiêu thụ xƣơng rồng đƣợc sản xuất tại Mỹ là vƣờn ƣơm, siêu thị và các nhà sƣu tập tƣ nhân. Các quốc gia tiêu thụ nhiều xƣơng rồng nhất từ sa mạc Chihuahua là Mỹ, Anh, Đức, Thụy Điển, Tây Ban Nha, Mexico, Italia và Canada. Christopher Robbins cho biết: ''Ở một số vùng của sa mạc Chihuahua, thu hoạch thực vật hoang dã là hoạt động mang lại hàng triệu USD mỗi năm. Một trong những động lực thúc đẩy hoạt động thu hoạch xƣơng rồng hoang dã này, cả hợp pháp và bất hợp pháp, bắt nguồn từ nhu cầu tạo cảnh quan tại các thành phố sa mạc". Trong những năm gần đây, Châu Âu và Nhật Bản là những điểm đến phổ biến của cây, hạt và quả xƣơng rồng hiếm, có giá trị cao. Các loại xƣơng rồng hiếm, đặc biệt là loại đƣợc tìm thấy ở vùng sa mạc thuộc chủ quyền của Mexico, có thể mang lại hàng nghìn USD. Hạt xƣơng rồng hiếm đƣợc bán với giá 7,5 USD/hạt tại Châu Âu. Hiện nay số lƣợng xƣơng rồng quý hiếm ở các sa mạc đã cạn kiệt do sự thiếu kiến thức của ngƣời dân và bọn buôn lậu đã nhổ cây từ các sa mạc lớn. 2.2.4. Đặc tính thực vật và điều kiện sinh thái của xƣơng rồng (theo Huỳnh Văn Thới, 2004) 2.2.4.1. Đặc tính thực vật Xƣơng rồng không đẹp mã bằng nhiều giống cây kiểng khác, vì chúng chỉ có một đoạn thân cây mập mạp, trơ trụi và giản dị tƣởng chừng nhƣ đời sống của nó 7 không có gì đáng để cho mọi ngƣời quan tâm chú ý đến. Thật ra, xƣơng rồng vẫn hội đủ những đặt tính thực vật đáng để đƣợc tìm hiểu cặn kẽ.  Thân cây Xƣơng rồng có thân mập, căng bong mọng nƣớc, vì bên trong chứa rất nhiều nƣớc gọi là mủ. Thân xƣơng rồng rất đa dạng: hình trụ (thƣờng gọi là mộc trụ hoặc độc trụ), hình cầu và dẹp. Đa số giống là hình trụ và hình cầu, số ít giống hình dẹp, nhƣ cây lƣỡi long (gốc dẹp, thân dẹp và cành nhƣ những chiếc lá dày). Hoặc loại xƣơng rồng “tai thở”… Thân cây xƣơng rồng, tùy giống mà có loại cao loại thấp, loại to, loại nhỏ. Thân có khía hoặc có múi. Có giống ít khía nhƣ giống ta dùng làm hàng rào (chỉ có ba khía), nhƣng cũng có giống 25 khía nhƣ giống Ferocactus wedzenii. Có giống khía rất cạn, nhƣng cũng có giống khía sâu. Giống không khía thì có múi. Múi là những nốt sần lớn từa tựa nhƣ vỏ trái thơm (dứa) mà đa số các giống xƣơng rồng hình cầu đều có dạng này.  Lông Đa số giống xƣơng rồng có thân trơn láng, nhƣng cũng có một số giống thân có lớp lông mịn phủ đầy, nhƣ Cephalocerus. Có giống trên ngọn đƣợc phủ chụp lớp lông dài trắng xóa, gọi là giống Borzicactus.  Gai Đa số xƣơng rồng đều có gai nhọn và là gai chùm, cái nào cũng nhọn hoắt. Nhiều giống xƣơng rồng có nhiều gai cứng mọc tua tủa, nhƣng cũng có giống gai nhỏ và mềm dịu. Đƣợc biết, mới đây một chuyên viên ngành hoa kiểng ở California là ông Luther Burbank đã lai tạo ra đƣợc giống xƣơng rồng mới không gai. Gai xƣơng rồng thƣờng màu đen, nhƣng cũng có giống gai màu vàng. Gai xƣơng rồng là biến thể của lá kèm mà thành, đây là đặc tính của đa số giống cây mọc ở vùng sa mạc quanh năm nóng cháy. Và nhờ vào tiết diện gai quá nhỏ đó nên xƣơng rồng không bị thoát nƣớc nhanh nhƣ các giống cây kiểng có nhiều lá khác. Tiêu biểu dạng gai, ví dụ: - Xƣơng rồng Ephorbia có nhiều gai, vừa dài vừa to, lại nhọn và cứng. 8 - Xƣơng rồng Echinocactus Grusonii thân có nhiều gai chằng chịt cơ hồ bao kín mít khắp thân cây. - Xƣơng rồng Cephalocerus có lông rất cứng nhƣng ít và nhỏ, lông giấu mình trong những nùi lông tơ trắng  Lá xƣơng rồng Khi nói đến xƣơng rồng ai cũng nghĩ đến thân nó trơ trụi, không lá. Thế nhƣng thực tế cũng có một ít giống xƣơng rồng có lá. Có giống lá nhỏ có giống lá to, nhƣng đa số lá đều có giống cuống ngắn và bản dày vì bên trong mọng nƣớc. - Xƣơng rồng Aeonium Holochrysum xuất xứ ở vùng Bắc Phi có nhiều lớp lá xếp khít nhau thành vòng tròn đồng tâm. - Một số giống xƣơng rồng khác, trong đó có giống Euphorbia có lá nhỏ xuất hiện ở phần ngọn và từ cạnh mép của cành.  Rễ xƣơng rồng Do xƣơng rồng (đa số) chỉ có thân đơn độc, trơ trụi, nhƣng trong thân lúc nào cũng chứa nhiều nƣớc (mủ), lại không bị thoát nƣớc nhanh nhƣ những giống cây có lá khác, nên nó không cần có bộ rễ hoàn chỉnh để hút đƣợc nhiều nƣớc nuôi cây, xƣơng rồng không có rễ cái (rễ trụ) mà chỉ có chùm rễ con lƣa thƣa. Chùm rễ con này có nhiệm vụ giữ cho thân cây mọc đứng thăng bằng không bị ngã đổ, và hút chất bổ dƣỡng trong đất để nuôi cây. Mặc dầu có bộ rễ yếu, nhƣng xƣơng rồng lại có sức sống khỏe, dẻo dai. Dù có bị nhổ lên trồng lại vẫn sống mạnh , khó chết.  Hoa xƣơng rồng Xƣơng rồng trổ hoa quanh năm. Số lƣợng hoa mỗi lần trổ có thể từ một đến năm bảy hoa, thậm chí nhiều đến chín mƣời hoa. Tùy từng giống mà hoa đậu trên cây ít hay nhiều ngày: có giống chỉ nở một ngày rồi tàn, nhƣng cũng có giống hoa khoe sắc trên cây đến vài ba ngày mới héo. Màu sắc của hoa xƣơng rồng cũng rất đa dạng, gồm có màu trứng, đỏ son, tím lợt, vàng chanh, vàng cam… Xin đơn cử một số giống xƣơng rồng với sắc hoa đặc trƣng của nó: 9 - Hoa màu trắng với nhiều chấm đỏ tía điểm xuyết, có giống Turbicarpus, xuất xứ tại Mexico. - Hoa màu bang và đỏ sậm có các giống Thelocactus (xuất xứ tại Mexico), và giống xƣơng rồng ở vùng Texas là Homalocephala. Về vị trí hoa trổ ra trên cây. Tùy giống mà có sự khác nhau. Thông thƣờng hoa mọc ra từ kẽ múi, nếu thân có dạng múi. Ngƣợc lại, nếu thân dạng khía thìhoa mọc ra ở cạnh gai (gai mọc ở mép khía). Ngay chồi con cũng vậy, thân dạng múi chồi con nẩy ra từ kẻ múi, còn thân dạng khía thì chồi con nẩy ra ở dạng gai. Cũng có giống xƣơng rồng hoa mọc thành từng cụm ở nách lá, nhƣ các giống EuphorbiaMilii, Euphorbia ligularia… Có giống hoa mọc trên sẹo của lá nhƣ xƣơng rồng Euphorbia Antiquorum  Trái xƣơng rồng Xƣơng rồng có trái hình cầu bên trong không chia thành ngăn hoặc múi và chứa nhiều hột. Từ lúc xƣơng rồng trổ hoa cho đến ngày trái chín. Tùy giống, ngắn là một tháng, dài là vài ba tháng.  Hột xƣơng rồng Trái xƣơng rồng chứa rất nhiều hột. Cây còn nhỏ thƣờng cho trái nhỏ, những cây trƣởng thành ra trái to hơn. Trong trái nhỏ chứa chừng vài chục hột, còn trái lớn chứa từ 500 hột trở lên. Kích thƣớc hột rất nhỏ, nhƣ hột é, nhỏ hơn hột mè (vừng). Tùy giống, khi chín trái già tự động tách vỏ ra để hột bên trong bắn hết ra ngoài. Nhƣng cũng có giống khi chín, trái cứ đeo dính trên cây, nếu không đƣợc hái thì chờ đến lúc vỏ trái bị mục hột mới phân tán ra ngoài. Hột vừa chín có thể đem gieo ngay, và tỷ lệ nảy mầm rất cao. 2.2.4.2. Điều kiện sinh thái Xƣơng rồng có nguồn gốc nguyên thủy ở vùng sa mạc, nơi có thời tiết vô cùng khắt nghiệt, ngày rất nóng và đêm rất lạnh, đất đai lại cằn cỗi. Vì vậy, xƣơng rồng không kén đất trồng, thích nghi đƣợc với các nƣớc vùng nhiệt đới, quanh năm có khí hậu nóng ẩm. Tại nƣớc ta, vùng nào cũng có thể trồng 10 đƣợc kiểng xƣơng rồng nhƣng, thích hợp nhất là các tỉnh Nam Bộ trong đó có Tp. Hồ Chí Minh, nơi có khí hậu khô, nóng và lƣợng mƣa trong năm không nhiều. Xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc với vùng có khí hậu lạnh khoảng 100C, nhƣng chúng sinh trƣởng yếu và phát triển chậm. Còn ở những vùng có khí hậu nóng ẩm thì sự sinh trƣởng và phát triển của chúng bình thƣờng. Trong điều kiện khô hạn, xƣơng rồng có thể chịu đựng đƣợc vài ba tháng liền mà sức khỏe của cây không bị suy giảm. Đó là ƣu điểm của nó khi đem trồng trong nhà.  Lƣợng mƣa Những vùng nào có lƣợng mƣa ít trong năm đều thích hợp cho việc trồng xƣơng rồng, nghĩa là nó chỉ cần lƣợng mƣa từ 1.000 mm trở xuống mới tốt. Vùng nào mƣa nhiều, nhất là mùa mƣa thƣờng kéo dài thì nên trồng xƣơng rồng trong nhà kính hoặc dƣới giàn che. Có thể nói trồng xƣơng rồng trong vùng ít mƣa vẫn tốt, miễn là thỉnh thoảng đƣợc tƣới để đất trồng đủ độ ẩm cần thiết là đƣợc. Xƣơng rồng không thích hợp với mƣa to gió lớn. Do bộ rễ quá yếu nên cây dễ ngã đổ hoặc nghiêng ngã khi gặp ngọn gió to. Vì vậy, với giống xƣơng rồng có thân cao to nhƣ các giống Euphorbia, Ercobaria, hoặc các giống Opuntia Dillenii Opuntia ficus Undia, khi cây trƣởng thành nên làm trụ chống đỡ cho khỏi đổ ngã. Ngay các giống xƣơng rồng có thân dài leo cao nhƣ Rhodcactus Scuelata và Rhodcactus grandifolius cũng có cây chống đỡ mới mọc thẳng lên đƣợc. Xƣơng rồng chịu đƣợc ánh sáng trực xạ. Trồng vào nơi có nắng nhiều cây càng sinh trƣởng tốt, kích thích sự ra hoa nhiều hơn và màu sắc hoa đƣợc tƣơi tắn hơn. Do xƣơng rồng là giống cây có nguồn gốc vùng sa mạc, quanh năm có thời tiết khắc nghiệt nhất, nên dù có gặp mùa nắng hạn vùng nhiệt đới kéo dài, cây vẫn đủ sức chống chọi. Nên tƣới nƣớc để giữ đƣợc độ ẩm cần thiết giúp cây sinh trƣởng tốt hơn.  Nhiệt độ Xƣơng rồng chịu đựng đƣợc nhiệt độ cao, vì vậy trồng xƣơng rồng trong nhà nhiều ngày liền, lúc nào nhiệt độ cũng khô, nóng nhƣng chúng vẫn sống tƣơi tốt. Với vùng nhiệt độ thấp, xƣơng rồng vẫn chịu đựng đƣợc, mặc dầu sự sinh trƣởng có phần chậm lại. 11  Độ ẩm Độ ẩm không khí cũng rất cần thiết cho sự sinh trƣởng của xƣơng rồng, tuy nhiên độ ẩm quá thấp lại không tốt. 2.2.5. Bệnh hại trên xƣơng rồng 2.2.5.1. Bệnh thối gốc xƣơng rồng Là bệnh khá phổ biến và nguy hiểm cho tất cả các loại xƣơng rồng. Bệnh gây hại chủ yếu là thối gốc hoặc một số vết thƣơng của cây ghép. Ban đầu là các đốm thối chứa nhiều nƣớc màu xám hoặc nâu đen, các chấm mốc màu đỏ tím hoặc màu trắng ở nơi tiếp giáp phần bệnh và phần khỏe. Đó là thể quả nấm và chất tiết của nấm. Khi bệnh lan rộng đến xung quanh thân, cây có thể bị khô mà chết. Nguyên nhân gây bệnh thối gốc xƣơng rồng là do nấm lƣỡi liềm (Fusarium oxysporum Schlecht) thuộc lớp nấm bào tử sợi gây ra. Bào tử không màu hình lƣỡi liềm có 3 – 4 vách ngăn, kích thƣớc 19 – 50 x 2,5 – 5 µm. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sinh trƣởng là 25 – 30°C. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). Theo Ik Hwa Hyun, Sang Dok Lee và ctv (1998), một loài Fusarium đƣợc phân lập từ xƣơng rồng có triệu chứng thối rửa ở tỉnh Koyang, Kyonggi năm 1997. Mầm bệnh này đƣợc xác định là Fusarium oxysporum dựa trên đặc điểm nấm học. Triệu chứng thối xuất hiện dƣới đất và vòng thƣơng tổn chiếm khoảng 1 – 3 cm đƣờng kính, xuất hiện trên gốc xƣơng rồng. Hình dạng nấm bệnh có cả dạng tiểu bào tử và đại bào tử. Dạng tiểu bào tử chiếm nhiều hơn cả, từ dạng oval đến dạng bầu dục. Đại bào tử có hình lƣỡi liềm, có 3 – 5 vách ngăn. Màu sắc khuẩn lạc trên môi trƣờng PGA là màu trắng, màu đào hoặc màu tía. Mầm bệnh có thể là nguyên nhân gây nên triệu chứng thối trên gốc xƣơng rồng ghép cũng nhƣ xƣơng rồng không ghép. 2.2.5.2. Bệnh đốm than Bệnh đốm than (bệnh thán thƣ) trên xƣơng rồng phát sinh khá phổ biến, bệnh nặng có thể làm cây chết khô. Cây bị bệnh thƣờng có đốm nhiều nƣớc màu nâu nhạt. Đốm bệnh dần dần lõm xuống lúc ẩm ƣớt trên đốm bệnh xuất hiện các chấm 12 đen nhỏ lồi lên đó là thể quả nấm. Bệnh do nấm đĩa gai (Colletotrichum sp) thuộc lớp bào tử xoang, bộ bào tử đĩa đen gây ra. Đĩa bào tử nhỏ, có lông cứng mọc rãi rác, bào tử đơn bào không màu hình bầu dục dài, kích thƣớc 10,8 – 14,4 x 3,5 – 4,3 µm. Bệnh này thƣờng gặp vào đầu mùa hạ và đầu mùa đông. Những loại xƣơng rồng cầu màu vàng rất nhạy cảm với bệnh này. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). 2.2.5.3. Tuyến trùng hại xƣơng rồng Theo Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã (2002), bệnh tuyến trùng hại xƣơng rồng chủ yếu trên xƣơng rồng 6 cạnh. Ngoài ra còn phát sinh trên hải đƣờng, mào gà, hƣớng dƣơng, hoa hồng. Trên rễ chính và rễ bên hình thành nhiều u bƣớu nhỏ, lúc đầu nhỏ về sau thô dần, cắt u thấy có nhiều hạt nhỏ màu trắng đó là tuyến trùng cái. Bệnh có thể làm cho cây chết khô. Bệnh tuyến trùng hại xƣơng rồng do Meloidogyne incognita chitwood. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng phát triển là 20 – 250C. Đất ẩm có lợi cho sự di chuyển của tuyến trùng đi tìm thức ăn và xâm nhập vào rễ cây. Nƣớc mƣa, nƣớc mƣơng dẫn, hoạt động con ngƣời có thể mang tuyến trùng lây lan. 2.2.5.4. Rệp sáp hại xƣơng rồng Rệp sáp hại xƣơng rồng (Diaspis echinocacti Bouche) thuộc bộ cánh đều họ rệp sáp hình thuẫn. Chúng dùng miệng chích hút để hút nhựa cây xƣơng rồng ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của cây. Mỗi năm phát sinh 2 – 3 lứa, tháng 5 – 7 và tháng 10 năm sau đều có rệp gây hại. (Trần Văn Mão, Nguyễn Thế Nhã, 2002). 2.3. Sự phân loại, phân bố, phạm vi kí chủ, đặc điểm phát sinh phát triển và khả năng gây bệnh của nấm Fusarium 2.3.1. Sự phân loại Giới (Kingdom) Fungi Ngành (Phylum) Ascomycota Lớp (Class) Sordariomycetes 13 Bộ (Order) Hypocreales Họ (genus) Fusarium (Nguồn:http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium). Hình 2.1. Hình thái bào tử nấm Fusarium spp. a. Nấm có dạng hình lƣỡi liềm. b. Vách ngăn. (Nguồn: Moulds/Illustrations/Fusarium_drawing.jpg) Nấm Fusarium thuộc lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu tính là gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Có tế bào sinh bào tử trần. Fusarium đặc trƣng bởi hệ sợi nấm ngăn vách màu trắng hoặc có một số màu khác nhƣng thƣờng có màu trắng. Nấm Fusarium có cành bào tử phân sinh, giá trần bào tử đơn độc hoặc tụ họp trong các đệm giá (Sporodochia) hoặc thành đệm cho giá nhầy (Pionnetes) đơn hoặc phân nhánh, các tế bào sinh bào tử trần là các thể bình đơn độc hoặc thành cụm trên đỉnh giá bào tử trần, đỉnh các nhánh của giá hoặc trực tiếp trên thân giá, trên các sợi nấm không phân hóa hình thái. Bào tử trần thƣờng ẩm ƣớt tụ họp thành khối cầu ở đỉnh thể bình hoặc hình chuối. Nấm có 2 dạng bào tử: bào tử trần lớn (Macroconidia) và bào tử trần nhỏ (Microconidia). Bào tử trần lớn có một đến nhiều vách ngăn, hình lƣỡi liềm có hoặc không có gót ở ngăn gốc. Bào tử trần nhỏ không có hoặc có 1 – 2 vách ngăn, hình elip, hình trứng, hình trụ, hình gần cầu, thƣờng không màu hoặc màu trắng nhạt. a b 14 2.3.2. Sự phân bố Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm bệnh phân bố rất rộng trên khắp thế giới, nấm Fusarium gây thiệt hại trên các loại cây trồng và gây ảnh hƣởng rất lớn đến kinh tế, đặc biệt ở vùng Châu Phi, Châu Mỹ và các nƣớc nhƣ: Australia, Panama, Hawaii, Philippines, Taiwan và các nƣớc Đông Nam Á. Bệnh do nấm Fusarium đƣợc phát hiện vào năm 1809 do nhà bác học Link, H.F. Sau đó vào năm 1821 đƣợc nhà bác học Fries, E. bổ sung thêm. 2.3.3. Phạm vi kí chủ Theo Bùi Xuân Đồng (1986), nấm Fusarium có rất nhiều dòng khác nhau nên khả năng ký chủ rất rộng trên nhiều loại cây trồng nhƣ: cây ăn trái, cây rau màu và một số cây hoa cảnh, có thể sống trong các điều kiện khác nhau và có thể tồn tại trong đất một thời gian dài, trong các xác bã thực vật dƣới nhiều dạng khác nhau, bào tử nấm có thể tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt một thời gian dài sau đó gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển và lây lan. Nấm gây hại nặng trên một số cây trồng đặc biệt là trên cây ăn trái nhƣ: chuối, xoài, nhãn, nho, ổi, cam quýt, đu đủ, bơ…. Ngoài ra, có một số dòng nấm Fusarium gây bệnh cho ngƣời và động vật nhƣ: gây ung thƣ họng ở ngƣời và ung thƣ bán cầu đại não trên ngựa và chuột (Thiel, P.G và ctv, 1991). 2.3.4. Đặc điểm phát sinh phát triển của nấm Fusarium Theo Bugnicourt F. (1939), nấm Fusarium có phổ kí chủ rất rộng trong các điều kiện khác nhau và có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 5ºC– 400C. 2.4. Khả năng gây hại của nấm Fusarium spp. và biện pháp phòng trừ 2.4.1. Khả năng gây hại Lester W. Burgess và ctv, (1988), đại học Sydney (Australila) xác định 13 nhóm, 20 loài gây hại trên một số cây trồng sau: 15 Loài F. latertium: đƣợc phân lập trên cây dâu bị bệnh khô đen nhánh, trên cây Celosia bị bệnh thối thân. Một vài phân lập đƣợc ghi nhận chúng hiện diện trên cây cà phê ở Papua, New Guinea. Loài F. decemcellulare: loài này thƣờng hiện diện ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng đƣợc phân lập từ những cây bị bệnh loét, khô cành. Từ các cây ca cao bị bƣớu ở Nam Mỹ. Loài F. moniliforme: loài này thƣờng xuất hiện ở vùng khí hậu ấm. Chúng thƣờng đƣợc phân lập từ những cây có triệu chứng bệnh thối thân, thối bắp, thối rễ cây Sorghum (Burgess, 1986), thối ngọn ở cây mía, gây hƣ hỏng hạt lúa. Loài này có khả năng nhiễm vào hạt giống của một vài cây kí chủ nhƣ: ngô, lúa…. Chúng có khả năng tạo ra độc tố moniliformin (Vesonder và Hesseltine, 1981). Loài F. solani: là loài có khả năng sống trong đất, phân bố trên phạm vi toàn thế giới, xuất hiện ở các vùng mƣa nhiều và đất thoát nƣớc kém. Là loài phổ biến nhất ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Chúng gây thối rễ, cổ rễ của nhiều loại cây trồng: đậu, cà chua. Gây thối củ, gây bệnh loét, chết khô của nhiều loại cây trồng ( Nelson, 1981). Loài F. oxysporum: loài này phổ biến trong đất canh tác ở vùng ôn đới và nhiệt đới. Loài này gồm nhiều dòng khác nhau và gây bệnh nghiêm trọng: gây héo mạch dẫn (Beckman, 1987), gây thối rạp cây con ( Nelson, 1981), gây thối rễ và cổ rễ (Jarvis và Shoemmaker, 1978). Loài này có hơn 100 dòng khác nhau và bệnh héo là một vấn đề quan trọng. Loài F. sambucinum: loài này thƣờng đƣợc phân lập từ rễ cây thông và nhiều cây khác bị bệnh rễ. Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến trong đất nông nghiệp, ở các vùng nhiệt đới và ôn đới. Chúng đƣợc phân lập từ các bộ phận dƣới đất: thân, rễ, củ và các bộ phận trên mặt đất. Theo Booth (1973), phân lập và nghiên cứu loài Fusarium. Một số loài đƣợc trích dẫn dƣới đây: 16 Loài F. solani: loài này đƣợc phân lập từ các cây bị vết thƣơng hoặc từ các cây bị nhiễm các loài nấm Phythium, Phytophthora, Rhizoctolani và các loài Fusarium khác. Loài này cũng gây hƣ hại nhiều loại thực phẩm. Loài F. solani f. sp. batatas: gây hại trên cây khoai lang. Loài F. solani f. sp. cucuritae: gây hại trên cây mía. Loài F. solani f. sp. phaceoli: gây hại trên cây đậu hà lan. Loài F. decemcecllulare: loài này đƣợc phân lập trên nhiều loại cây trồng ở nhiều nƣớc khác nhau: Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, Indonesia… Loài F. semitectum: loài này rất phổ biến ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. Đƣợc phân lập trên cây cà chua, ngô, chuối, đậu phộng… Loài F. moniliforme: loài này gây thối cây con, gây mốc hạt gạo, gây thối rễ cây bông vải, gây thối các cơ quan cây ngô, thối ngọn mía, xâm nhập vào hoa, quả cây chuối. Loài này có hơn 110 dòng khác nhau và có tính độc khác nhau. Một số dòng có tính độc đƣợc phân lập từ cây ngô ở Mỹ, khả năng gây bệnh phụ thuộc vào chu kỳ sống của nấm và điều kiện ngoại cảnh. Chúng có khả năng tạo ra gibberellia kích thích sự phát triển cây trồng. 2.4.2. Một số biện pháp chủ yếu để phòng trị nấm Fusarium spp 2.4.2.1. Sử dụng cây giống kháng bệnh Theo Bùi Xuân Đồng (1986), khi trồng phải xem xét điều kiện sinh thái đất đai mà chọn các giống thích hợp cho từng điều kiện của vùng và cần xem xét thƣờng xuyên về những thay đổi tính chống chịu của giống. 2.4.2.2. Biện pháp canh tác Theo Bùi Xuân Đồng (1986), biện pháp này rất quan trọng để phòng trừ nấm Fusarium. Trƣớc khi trồng phải làm đất kỹ, xử lý đất, bón phân hợp lý, luôn vệ sinh vƣờn sạch, thoáng mát. Nếu phát hiện bệnh phải thu gom các bộ phận bị bệnh đi tiêu hủy tránh sự lây lan trong vƣờn, chăm sóc kỹ cho từng giai đoạn sinh trƣởng của cây. Cần ngăn chặn di chuyển những cây bị bệnh từ vùng này sang vùng khác 17 tránh đƣợc mầm bệnh ban đầu. Khi cây bị bệnh có thể đào bỏ, xử lý đất bằng vôi hay một số loại thuốc trừ nấm khác. 2.4.2.3. Biện pháp hóa học Theo Bùi Xuân Đồng (1986), trên một số cây trồng có thể sử dụng một số thuốc hóa học trừ nấm khi cây bị nhiễm bệnh nhƣ: Metazeb, Benomyl, Rovral, Ridomil, Copper và một số thuốc khác, liều dùng nhƣ khuyến cáo. Sử dụng thuốc trên bằng cách phun hoặc tƣới vào gốc cây bị bệnh một vài lần cách nhau 7 – 10 ngày. 2.5. Tổng quan về vùng tef trên genome của nấm Fusarium Hình 2.2. Bản đồ vùng gen tef trên nấm Fusarium sử dụng trong FUSARIUM- ID Theo David M. Geiser và cộng sự (2004), gen tef giải mã một số protein thiết yếu cho bộ máy dịch mã, có tính hữu ích cao trong nghiên cứu sự phát sinh loài vì nó mang thông tin cao ở mức độ loài của Fusarium. Gen này lần đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ một marker trong nghiên cứu phát sinh loài để suy ra mối tƣơng quan và mức độ di truyền giữa các loài (Cho và ctv, 1995; Mitchell và ctv, 1997). Primer lần đầu tiên đƣợc phát triển trên nấm để khám phá và kiểm tra chuỗi thế hệ của các dòng Fusarium oxysporum (O` Donnell và ctv., 1998). Primer ef1 và ef2 đƣợc thiết kế dựa trên một phần vị trí exons giữa Trichoderma reesei và Histoplasma capsulatum. Các primer này có thể khuếch đại vùng 700 bp của gen tef flanking với 3 intron mà tổng số hơn nữa chiều dài của đơn vị siêu sao chép trong tất cả các loài đã biết (hình 2.2). Gen này xuất hiện phù hợp với số lƣợng copy đơn trên nấm Fusariium, và nó thể hiện mức độ cao của các trình tự đa hình giữa các loài có quan hệ mật thiết, ngay cả trong so sánh các phần của gen giải mã protein nhƣ là 18 calmodulin, beta-tubulin và histon H3. Vì các lý do đó, tef đã trở thành marker chọn lọc nhƣ là công cụ xác định single - locus trên nấm Fusarium. Ngoài nấm Fusarium thì trên các loại nấm khác chẳng hạn nhƣ nấm Trichoderma cũng có vùng tef. Trên nấm này vùng tef cho kết quả chính xác hơn là dựa vào vùng rDNA-ITS vì các loài vẫn có sự tƣơng đồng về trình tự trong vùng rDNA-ITS. Tef hữu ích trong việc xác định vùng gen chuyên biệt nhƣ vùng gen mã hoá actin, calmodulin, endochitinase, nó còn cho phép phân biệt đƣợc giữa các nhóm với nhau hay giữa loài cùng nhóm. Trong phòng thí nghiệm, vùng tef đƣợc quan tâm và khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc khoảng 600 bp (Gary J. Semuels). (trích dẫn bởi Lại Hà Tố Hoa, 2006). Một nhóm nghiên cứu gồm Bogale, Mesfin và ctv (2007), đã sử dụng trình tự gen tef để thiết kế primer chuyên biệt cho các loài Fusarium redolens và trong kỹ thuật PCR- RFLP để phân biệt giữa 3 loài Fusarium oxysporum cùng một tổ tiên chung. Gần đây hình thái học và các kỹ thuật chẩn đoán phân tử về nấm Fusarium redolens và 3 dòng Fusarium oxysporum phát sinh loài từ một tổ tiên chung còn mơ hồ. Do đó trình tự gen tef từ những loài này và các loài có mối quan hệ mật thiết với chúng đƣợc sử dụng để thiết kế primer chuyên biệt cho loài F. redolens, và để xác định vị trí giới hạn phân biệt giữa 3 loài F. oxysporum có chung một tổ tiên. 2.6. Ứng dụng kỹ thuật PCR trong phát hiện nấm Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đƣợc mô tả bởi Kary Mullis và các cộng sự (1985). 2.6.1. Khái niệm Đây là phƣơng pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA cần đƣợc khuếch đại. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những primer chuyên biệt. 19 Mạch khuôn thƣờng là một trình tự DNA của bộ gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho từng loại vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật. Primer là những đoạn oligonucleotide có khả năng bắt cặp bổ sung vào đầu 3’ của khuôn, DNA polymerase sẽ nối dài primer để hình thành mạch mới (Bùi Trang Việt, 2002). 2.6.2. Nguyên tắc Sự khuếch đại đƣợc thực hiện nhờ chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: (giai đoạn biến tính: tách sợi đơn DNA, denaturation) Ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn và nhiệt độ cần thiết để biến tính hoàn toàn DNA thƣờng là 94 – 950C trong 30 – 60 giây. Giai đoạn 2: (giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn, anealation) Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung với primer. Nhiệt độ cho giai đoạn này là 50 – 640C. Giai đoạn 3: (giai đoạn tổng hợp, kéo dài, elongation) Nhiệt độ tăng lên 720C, ở nhiệt độ này Taq DNA polymerase hoạt động tối ƣu. Trong khoảng 30 giây cho đến vài phút tùy theo kích thƣớc cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình tự của mạch khuôn, độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn đã bắt cặp với 2 DNA khuôn mạch đơn, các nucleotid lần lƣợt đƣợc gắn vào mỗi đầu DNA khuôn sợi đơn, gắn kế tiếp các nucleotid của primer và chiều bổ sung là 5’ ở trên cả 2 DNA sợi đơn. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ trên sẽ đƣợc lặp đi lặp lại nhiều chu kỳ và làm gia tăng số lƣợng DNA theo cấp số nhân. Sự khuếch đại này đƣợc tính nhƣ sau: Tổng số DNA khuếch đại= m x 2n . 20 Trong đó: n là số chu kỳ thực hiện. m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra. Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm. Trong số 3 giai đoạn trên, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai đoạn này sự lai DNA – DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì không lai đƣợc DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR ngƣời ta xác định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng nhóm primer nhƣ sau: Tm= 4 x (G+X) + 2(A+T) 0 C. 2.6.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR  DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch nhƣng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại DNA thu đƣợc trực tiếp từ dịch trích tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thƣờng phƣơng pháp này đƣợc áp dụng trong chẩn đoán. Lƣợng DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật nhỏ khoảng 1 g. Nếu lƣợng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn hay còn gọi là dƣơng tính giả.  Enzyme DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao: Taq polymerase đƣợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus (vi khuẩn suối nƣớc nóng). Taq polymerase quá cao sẽ thấy hiện tƣợng tổng hợp DNA do phản ứng giả của primer trên dây đơn, đây là những kết quả không chuyên tính sẽ làm sai lệch kết quả, còn nếu nồng độ Taq polymerase quá thấp sẽ không có đủ số lƣợng enzyme để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn.  Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: 21  Trình tự primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi” và primer “ngƣợc”, không có những cấu trúc “primer dimer” do sự bắt cặp bổ sung giữa các thành phần khác nhau của một primer.  Nhiệt độ nóng chảy Tm của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng tránh lặp đi lặp lại nhiều lần.  Các primer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen.  Các thành phần khác trong phản ứng PCR Bốn loại nucleotide (dNTP) thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ là 200 nM/mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sản phẩm khuếch đại dƣơng tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. Nồng độ Mg2+ cao hay thấp đều tạo ra các ảnh hƣởng rất khác nhau trong phản ứng PCR.  Số lƣợng chu kỳ phản ứng Số chu kỳ trong phản ứng thông thƣờng không đƣợc vƣợt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn. Giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau: sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không bắt cặp với mồi mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lƣợng mẫu ban đầu.  Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR Máy PCR cần đáp ứng đƣợc yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh, thật chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nƣớc trong quá trình thực hiện phản ứng PCR. Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 22 2.6.4. Ứng dụng của PCR Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nƣớc, phát hiện pháp y, điều tra tội phạm. Ứng dụng PCR để sản xuất những mẫu dò dùng trong phƣơng pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các đột biến điểm định hƣớng. Hơn thế nữa PCR còn đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhƣ:  Trong nghiên cứu genome học Nhân bản vô tính với PCR. Recombinant PCR. Kỹ thuật footprinting DnaseI. Multiplex PCR. HLA DNA (các kháng nguyên bạch cầu ngƣời) 2.7. Giới thiệu sơ lƣợc về kỹ thuật DNA sequencing Kỹ thuật DNA sequencing là công trình đƣợc công bố bởi Maxam và Gilbert (1977). Tuy nhiên hơn 20 năm qua kỹ thuật này đƣợc cải tiến rất nhiều. Đặc biệt với sự trợ giúp của computer, kỹ thuật huỳnh quang, tiến bộ của phƣơng pháp PCR và kỹ thuật điện di, kỹ thuật DNA sequencing trở thành công cụ rất có giá trị, làm nền tảng cho phân tích genome. Khái niệm: Kỹ thuật DNA sequencing là kỹ thuật xác định tất cả những hợp phần do nucleotid hình thành nên phân tử DNA (Alphey, 1997). 2.8. Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do nấm Fusarium spp. 2.8.1. Trên thế giới Tuy hiện nay các kỹ thuật công nghệ sinh học rất phát triển nhƣng dƣờng nhƣ việc ứng dụng các kỹ thuật này để định danh hay chẩn đoán bệnh do nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng rất ít. Và theo chúng tôi tìm hiểu thì chƣa thấy có tài liệu nào nói về kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện 23 nấm Fusarium spp. gây bệnh trên xƣơng rồng. Chỉ có chẩn đoán và phát hiện nấm Fusarium spp. bằng biện pháp sinh học phân tử trong một số lĩnh vực nhƣ là: Ralph A. Wang, Yi-Hong và cộng sự, (2002) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện genotype kháng Fusarium gây bệnh héo trên cây trồng. Nghiên cứu này nhằm mục đích phát hiện genotype của cây họ bầu bí kháng hay mẫn cảm với sự nhiễm Fusarium. Các nhà nghiên cứu này đã sử dụng phƣơng pháp PCR để khuếch đại DNA mẫu, sử dụng cặp mồi AM hoặc FM. Sản phẩm PCR từ các cặp mồi khác nhau về kích cở, phụ thuộc vào DNA mẫu thu đƣợc từ cây mẫn cảm hay kháng nấm Fusarium, nghiên cứu đã xác định nhanh và chính xác kiểu gen của cây trồng. Hirano, Yasushi và ctv (2006), đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phân biệt Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và radicis-lycopersici và loài F. oxysporum f. sp. lycopersici gây bệnh trên cây cà chua. Bằng cách so sánh một phần trình tự của gen mã hóa enzyme endopolygalacturonase (pg1) và enzyme exopolygalacturonase (pgx4) phân lập từ F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) và radicis-lycopersici (FORL) ở Nhật Bản và thiết kế các primer chuyên biệt (uni, sp13, sp23, and sprl) trên các nucleotide khác nhau của các loài gây bệnh. PCR với primer uni khuếch đại đoạn gen dài 670 - 672 bp từ FOL và FORL. Với primer sp13, chỉ thu đƣợc từ loài FOL 1 và 3. Với primer sp23, đoạn gen 518 bp thu đƣợc từ loài FOL 2 và 3 đƣợc khuếch đại. Primer sprl cho sản phẩm khuếch đại dài 947 bp, từ loài FORL , nhƣng không cho sản phẩm ở loài FOL. Yli - Mattila T., Paavenen S. và ctv (1996), đã sử dụng phƣơng pháp Isozyme và RAPD-PCR trong phân tích sự đa hình các dòng Fusarium avenceum ở Phần Lan. Kỹ thuật izozyme và RAPD - PCR đƣợc so sánh trong nghiên cứu đa hình giữa 33 dòng Fusarium avenaceum sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide và điện di trên gel agarose. Kỹ thuật isozyme đã phát hiện đƣợc 5 sự đa hình và độ tƣơng đồng là 70%, còn phƣơng pháp RAPD - PCR cho phép phân tích tất cả các dòng của F. avenaceum. Kết quả phenotype từ phân tích 24 RAPD - PCR đƣợc chia thành 5 nhóm chính bằng phân tích trung bình cộng và độ tƣơng đồng là 55%. Chiocchetti Annalisa và ctv, (1999) đã sử dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. basilici trên cây húng. Bằng cách sử dụng 69 trình tự DNA đƣợc khuếch đại, tạo ra từ sự phân lập các dòng Fusarium oxysporum f. sp. basilici khác nhau, F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp dot blot. Một trình tự dài 1038 bp đƣợc lai DNA từ tất cả các dòng F. oxysporum f. sp. basilici nhƣng không thu đƣợc đoạn DNA từ các dòng F. oxysporum phân lập từ các cây húng không mang bệnh hoặc các dạng đặc biệt khác điển hình của F. oxysporum, hoặc từ sự phân lập các loài F. redolens, F. tabacinum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, S. minor, và Pythium ultimum thu đƣợc từ các cây húng bị bệnh. Trình tự này đƣợc tạo dòng và đọc trình tự, 3 cặp mồi chuyên biệt của F. oxysporum f. sp. basilici đƣợc thiết kế, lần lƣợt cho sản phẩm khuếch đại là 943, 382, và 330 bp. Kỹ thuật nested PCR cho phép phát hiện F. oxysporum f. sp. basilici từ hạt bị bệnh và hạt bị nhiễm bẩn do tự nhiên hoặc nhân tạo. R N Crowhurst và cộng sự (1991), đã phân biệt sự khác nhau giữa nấm Fusarium solani f. sp. cucurbitae loài 1 và 2 bằng kỹ thuật RAPD. Phƣơng pháp này sử dụng để đánh giá sự đa dạng về genome giữa 21 dòng F. solani f. sp. cucurbitae loài 1 và loài 2. 7 sản phẩm đa hình nhờ RAPD đã sử dụng probe trong lai Southern genomic DNA trong đó 6 của 7 probe trong lai phân tử đƣợc sao chép trong giải trình tự đơn và 5 của 7 probe biểu hiện một sự lai chuyên biệt. Một nhóm nghiên cứu ngƣời Pháp (2000), đã sử dụng probe rDNA oligonucleotide và phƣơng pháp PCR để phát hiện nấm Fusarium oxysporum. Kỹ thuật PCR và lai phân tử đƣợc phát triển để phát hiện Fusarium oxysporum. Các dữ liệu trên trình tự từ rRNA 28S, 2 primer (PFO2 và PFO3) và probe 20 – mer đƣợc thiết kế. Những oligonucleotide này đƣợc kiểm tra trên 16 dòng F. oxysporum và 80 dòng của 23 loài Fusarium khác hoặc của 8 loài từ giống nấm khác. Phƣơng pháp PCR để khuếch đại đoạn DNA chuyên biệt từ các dòng F. oxysporum sử dụng các primer PFO2 và PFO3. Khi ở dƣới điều kiện cho phép, không thu đƣợc sản phẩm 25 PCR từ các primer này trên 80 dòng nấm khác. Probe oligonucleotide HFO1 đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp phóng xạ tự ghi và đánh giá sự khác biệt trong các thử nghiệm lai dot blot với rRNA khuếch đại bởi PCR. Dƣới điều kiện khách quan, lai probe với DNA từ các dòng F. oxysporum cho kết quả tốt. John Paul Jone và Pat Crill (1974), nghiên cứu tính kháng bệnh héo do Fusarium gây ra trên cây cà chua nhận thấy rằng giống M.A.160 và một số dòng khác mang gen I có khả năng kháng loài F. oxysporum f. sp. lycopersici. Một số dòng khác không mang gen này sẽ bị nhiễm bệnh. Nhóm nghiên cứu của Matias Pasquali, Alberto Acquadro và ctv (2004), đã nghiên cứu đề tài: Sự phát triển primer để tiến hành PCR phát hiện một loài Fusarium oxysporum mới gây bệnh trên cây cúc Pari. Cặp primer Mg5/Mg6 có thể xác định một cách chuyên biệt 9 dòng Fusarium oxysporum đƣợc kiểm tra từ A.frutescens, khi DNA genome của nấm đƣợc sử dụng nhƣ mẫu để kiểm tra. Ngoài ra, cặp primer Mg5/Mg6 cho phép phát hiện thành công các mô gốc và rễ mang bệnh từ cây không mang triệu chứng bệnh bên ngoài. Một nhóm nghiên cứu gồm Zhenggang Zhang và cộng sự (2005), đã sử dụng phƣơng pháp phân tử để phát hiện Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis nhiễm trong mẫu thực vật và đất. Với việc phát triển 2 loại PCR chuyên biệt để phát hiện nhanh và chính xác nấm gây bệnh Fusarium oxysporum f. sp. niveum và Mycosphaerella melonis trên mẫu thực vật và mẫu đất. 2 cặp primer chuyên biệt, Fn-1/Fn-2 và Mn-1/Mn-2 đƣợc tổng hợp. Primer Fn-1/Fn- 2 single PCR khuếch đại chỉ cho band khoảng 320 bp từ F. oxysporum f. sp.niveum, và primer Mn-1/Mn-2 cho sản phẩm PCR khoảng 420 bp từ M. melonis. 2.8.2. Tại Việt Nam Theo chúng tôi tìm hiểu thì tại Việt Nam hiện nay chƣa thấy có tài liệu nào nói về việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc chẩn đoán, phát hiện nấm Fusarium spp. gây hại trên xƣơng rồng. 26 2.9. Danh mục một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt nam Bảng 2.1. Một số loài Fusarium đƣợc tìm thấy ở Việt Nam (Đỗ Tấn Dũng, 1996) STT Tên bệnh Phân loại 1 Héo vàng cây khoai lang Fusarium batatas 2 Mốc hồng ngô F.moniliform f.sp. maydis 3 Lở gốc đậu tƣơng F.oxysporum f.sp. glysines 4 Héo vàng cây dƣa chuột F.solani f.sp.cucumerium 5 Héo vàng cây gừng F.oxysporum f.sp.zinggeberi 6 Vết xám trên cỏ lồng vực Fusarium sp. 7 Héo vàng cây hoa loa kèn F.oxysporum f.sp.lini 8 Vết xám trên cành chanh F.semitectum Berk 9 Thối củ chuối F.oxysporum f.sp.cubense 10 Héo vàng cây đinh lăng F.oxysporum f.sp.medicagins 11 Thối nhũn cây xƣơng rồng Fusarium oxysporum 27 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu thí nghiệm 3.1.1. Thời gian – địa điểm nghiên cứu  Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 20/03/2007 đến 30/07/2007  Địa điểm nghiên cứu Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nông học trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và công nghệ môi trƣờng trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.1.2. Vật liệu  Chủng vi sinh vật Các dòng nấm Fusarium spp. gây hại xƣơng rồng.  Môi trƣờng Môi trƣờng WA Agar 15 g H2O 1.000 ml Môi trƣờng PGA Khoai tây 200 g Glucose 20 g Agar 15 g H2O 1.000 ml Môi trƣờng nhân sinh khối Glucose 20 g Yeast extract 5 g MgSO4.7H2O 0,5 g KH2PO4 0,5 g K2HPO4 0,5 g CaCl2 1ít H2O 1.000 ml 28  Các thiết bị, dụng cụ thƣờng sử dụng  Các thiết bị Máy điện di (Bio-Rad) Bộ chày cối để nghiền mẫu Máy Vortex Máy PCR Máy chụp gel (Gel Doc 2000) Tủ cấy vi sinh Máy phơi mẫu 37ºC Máy ủ mẫu Tủ giữ mẫu: tủ lạnh (– 70ºC, – 20ºC), tủ mát (– 4ºC). Lò Viba Máy li tâm (Sigma)  Dụng cụ Ống nghiệm Micropipette các loại Đầu típ các loại Eppendorf các loại  Các hóa chất sử dụng  Các hóa chất để li trích DNA sợi nấm TE 1X Nitơ lỏng (nghiền mẫu nấm) Phenol/ Chlorform/ Isoamyl alcohol (25: 24: 1) Lysis Buffer Chloroform/ Isoamyl alcohol (24: 1) Isopropanol lạnh Ethanol 70% 29  Hóa chất sử dụng trong điện di Gel agarose dùng để phân tích DNA qua điện di thƣờng dùng có nồng độ 1% agarose. Dung dịch đệm TAE 0,5X dùng để pha gel và chạy điện di với các thành phần sau: + Tris HCl 4,48 g + Na 2 EDTA 0,5M (pH 8,0) 2 ml + Glacial acetic acid 1,14 ml + Nƣớc cất vừa đủ 1l ít Dung dịch nhuộm trên gel: 1% ethidium bromide  Hóa chất để thực hiện phản ứng PCR – Buffer 5X – MgCl2 25mM – dNTP 25mM – Primer ef1 10pmol/ l và primer ef2 1mpmol/ l – Taq DNA Polymerase 5U/ l – H2O cất khử ion 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Điều tra tình hình bệnh chết trên cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh Tiến hành điều tra tình hình bệnh hại trên cây xƣơng rồng tại một số hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh từ đó xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, virus, nấm gây ra. Hình thức điều tra: phỏng vấn, trao đổi trực tiếp với từng hộ sản xuất. 3.2.2. Phân lập mẫu nấm Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vƣờn xƣơng rồng bệnh ở Tp.Hồ Chí Minh. Tiến hành phân lập mẫu trên môi trƣờng WA và PGA. 30  Có 2 cách phân lập nấm từ xƣơng rồng bệnh  Cách 1: Mẫu bệnh đƣợc phân lập từ vết bệnh điển hình. Rửa mẫu bệnh bằng nƣớc sạch vì xƣơng rồng đƣợc trồng dƣới đất nên lúc thu thập mẫu dính rất nhiều đất. Để khô mẫu, sau đó cắt bỏ phần gai bên ngoài lấy phần thịt bên trong gồm phần mô bệnh và phần mô khỏe, cắt lấy mảnh nhỏ có kích thƣớc 5 7 mm x 5 7 mm. Tiến hành rửa khử trùng mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 1 2 lần rồi khử trùng mẫu bệnh bằng cồn 70º trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 2 3 lần, cắt nhỏ mẫu và để khô tự nhiên trong tủ cấy. Chú ý tất cả dụng cụ để cắt mẫu và khử trùng mẫu nhƣ cốc, dao, giấy thấm… đều phải vô trùng và không nên để mẫu quá khô. Sau đó đặt mẫu lên đĩa petri chứa sẵn môi trƣờng WA và đặt ở 5 7 điểm khác nhau trên đĩa, để ở nhiệt độ phòng. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng WA một lần nữa bằng cách cắt lấy mẫu nấm mọc từ các mẫu bệnh ở các điểm khác nhau trên đĩa WA trƣớc cấy sang các điểm khác nhau trên đĩa. Lần này khi nấm mọc cấy chuyền sang đĩa có sẵn môi trƣờng PGA, sau đó nấm mọc lại cấy chuyền qua môi trƣờng PGA để tạo dòng thuần.  Cách 2: Mẫu bệnh sau khi đem về tiến hành rửa bằng nƣớc sạch, để khô. Tiến hành ủ mẫu: Chuẩn bị các hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm đã đƣợc khử trùng bằng cồn 70º, lót giấy thấm vô trùng dƣới đáy hộp, xếp ống hút nhựa thành hình tam giác rồi đặt trên miếng giấy thấm trong hộp, cho một ít nƣớc cất vô trùng vô hộp sao cho chỉ vừa ƣớt giấy là đƣợc để tạo độ ẩm. Cho mẫu bệnh vào hộp và tiến hành ủ mẫu cho đến khi nấm mọc. Vì không biết nấm mọc là nấm mong muốn hay không nên phải xem chúng trên kính hiển vi. Xem nấm trên kính hiển vi: Dùng que cấy điểm khều lấy nấm trên mẫu bệnh sau khi ủ cho lên miếng lame đã có sẵn một giọt nƣớc xem kính, rồi cho miếng lamelle đậy lên giọt nƣớc trên lame. Sau đó đƣa lên kính hiển vi để xem. Nếu nấm thuộc Fusarium spp. thì tiến hành phân lập. 31 Cách phân lập: Chuẩn bị lame, que trang, ống hút thủy tinh đã đƣợc hấp khử trùng. Môi trƣờng WA sau khi hấp khử trùng, dùng ống hút thủy tinh đã chuẩn bị hút môi trƣờng WA cho lên lame sau đó trang đều bằng que trang. Chú ý môi trƣờng trên lame không quá dày và cũng không quá mỏng (vì nếu quá dày sẽ khó cắt bào tử và quá mỏng sẽ dễ bị khô môi trƣờng không cắt đƣợc bào tử). Chờ cho môi trƣờng trên lame khô tiến hành cho nấm lên lame bằng cách nhỏ một giọt nƣớc vô trùng trên lame có môi trƣờng, dùng que cấy khều nấm cho vào giọt nƣớc rồi dùng que trang vô trùng trải đều nấm trên lame. Chú ý miếng lame đƣợc đặt trong đĩa petri vô trùng có sẵn giấy thấm và ống hút xếp hình tam giác để tạo độ ẩm. Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 6 giờ, sau đó lấy miếng lame đƣa lên kính hiển vi để tiến hành cắt đơn bào tử (thƣờng cắt ở vật kính 4X). Dụng cụ để cắt đơn bào tử là dao cắt thạch trong phòng thí nghiệm. Bào tử sau khi đƣợc cắt xong đƣa qua môi truờng WA, mỗi đĩa chứa một đơn bào tử. Khi nấm mọc cấy sang môi trƣờng PGA vài lần để tạo dòng thuần.  Cách đặt tên mẫu: FC07 1 là mẫu nấm đƣợc phân lập từ mẫu bệnh trên cây xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh năm 2007, mẫu 1 (F: Fusarium spp., C: Cactaceae). Sau đó chúng tôi tiến hành kiểm tra nấm thuộc các dòng Fusarium spp. bằng cách coi hình thái nấm mọc và màu sắc nấm trên môi trƣờng PGA. Nấm Fusarium spp. mọc không gợn sóng và có màu trắng trên môi trƣờng. 3.2.3. Tăng sinh khối nấm trên môi trƣờng nhân sinh khối Dùng que cấy tam giác cắt khoảng 3 miếng thạch mỗi miếng có kích thƣớc từ 2 3 mm có chứa nấm cho vào bình tam giác có sẵn 100 ml môi trƣờng nhân sinh khối đã hấp tiệt trùng. Nấm trong các bình tam giác đƣợc nuôi lắc trên máy lắc. Chú ý mỗi dòng nấm đƣợc nuôi trong một bình tam giác khác nhau. Sau 72 giờ tăng sinh, sinh khối nấm đƣợc thu hoạch bằng miếng vải đã đƣợc hấp khử trùng. Nấm 32 sau khi thu hoạch trên miếng vải chuyển qua miếng giấy bạc và đem tồn trữ mẫu ở tủ 70ºC cho đến khi tiến hành ly trích. 3.2.4. Ly trích DNA tổng số của nấm Quy trình này đƣợc thực hiện dựa trên quy trình của Lee và Taylor. Bƣớc 1: Nghiền mẫu nấm trong dung dịch nitơ lỏng. Mẫu nấm đƣợc nghiền mịn cho vào các ống nghiệm có thể tích 15 ml. Trong quá trình nghiền cho nitơ lỏng vào liên tục để mẫu nấm không bị tan. Bứơc 2: Thêm 4 ml lysis buffer vào trong ống nghiệm. Trộn đều, ủ ấm ở 65ºC trong vòng 1 giờ. Bƣớc 3: Thêm vào 3 ml phenol/chloroform/isoamylalcohol lần lƣợt theo tỷ lệ (25: 24: 1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 4: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 5: Thêm vào ống nghiệm mới 3 ml chloroform/isoamylalcohol (24: 1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 6: Hút lấy phần dịch nổi ở trên (3 – 5 ml) cho vào ống nghiệm có dung tích 15 ml khác. Bƣớc 7: Thêm vào isopropanol lƣợng chất : 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm. Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 – 10 phút, ly tâm. Bƣớc 8: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Bƣớc 9: Dùng ethanol 70% để rửa tủa DNA. Rửa lại nhiều lần thƣờng là 3 – 4 lần. Bƣớc 10: Phơi khô mẫu. Mẫu DNA khô, thêm vào 200 l TE 1X. 3.2.5. Điện di xem DNA tổng số Điện di ở bƣớc này nhằm mục đích xem sản phẩm li trích DNA có bị gãy hay không và sản phảm có tinh sạch không. Nếu sản phẩm không tinh sạch phải tiến hành tinh sạch lại một lần nữa. 33  Các bƣớc của quá trình điện di Bƣớc 1: Chuẩn bị gel cho quá trình điện di. Cách chuẩn bị gel nhƣ sau: cân 0,125 g agarose, thêm 12,5 ml TAE 0,5X, đun trong lò viba ở bƣớc sóng 650W cho đến khi agarose tan hoàn toàn (thông thƣờng đun trong 2 phút). Để nguội đến khoảng 600C (đến khi nào cầm đƣợc mà không quá nóng) đổ gel vào giá nằm ngang có sẵn lƣợc đã cân bằng. Chờ gel đông đặc (khoảng 30 phút), rút lƣợc ra khỏi gel và cho vào bồn điện di có chứa TAE 0,5X sẵn sàng cho việc đặt mẫu. Bƣớc 2: Tiến hành điện di. Trộn dung dịch gồm 4 l DNA sau ly trích và 2 l loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng trên gel. Điện di 20 phút với cƣờng độ dòng điện là 400 mA và hiệu điện thế là 100V. Bƣớc 3: Nhuộm mẫu. Sau khi điện di xong, gel đƣợc lấy ra khỏi bồn điện di và ngâm vào dung dịch EtBr trong khoảng 15 20 phút. Bƣớc 4: Quan sát kết quả điện di. Kết quả điện di đƣợc quan sát dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh Gel Doc, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one (Biorad) Sau khi quan sát kết quả điện di thấy sản phẩm ly trích chƣa sạch còn có nhiều tạp chất. Để sản phẩm sau khi thực hiện phản ứng PCR thật tinh sạch, có thể tiến hành tinh sạch lại sản phẩm ly trích DNA. 3.2.6. Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng tef các dòng nấm Fusarium spp. Phản ứng PCR với cặp primer ef1và ef2. (David M. Geiser, 2004).  Thành phần phản ứng  Primer: Bảng 3.1. Primer dùng trong phản ứng PCR Primer Trình tự Primer theo chiều 5`- 3` Ef1 ATTGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC Ef2 GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT 34 Thành phần phản ứng PCR và lƣợng cần dùng đủ cho một phản ứng: Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR và lƣợng dùng đủ cho một phản ứng Thành phần Liều lƣợng ( l) Nồng độ cuối PCR buffer 10X 10 5X MgCl2 3 1,5 mM dNTP 0,4 0,2 mM Primer 1 1 10 pmol/ l Primer 2 1 10 pmol/ l Khuôn DNA 1 20 ng/ l Taq polymerase 0,2 5U/ l Nƣớc cất 33,4 Tổng cộng 50  Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Phản ứng với cặp primer ef1 và ef2. Các giai đoạn trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện theo David M. Geiser và cộng sự, (2004). Giai đoạn 1: 95ºC trong 3 phút Giai đoạn 2: Bƣớc 1: 95ºC trong 30 giây Bƣớc 2: 53ºC trong 45 giây 30 chu kỳ Bƣớc 3: 72ºC trong 45 giây Giai đoạn 3: 72ºC trong 7 phút Sản phẩm PCR đƣợc giữ ở 4ºC.  Các bƣớc đọc kết quả sản phẩm PCR  Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên agarose gel 1 %, dịch đệm TAE 0,5X.  Chạy điện di: 100 V, 250 mA, 20 phút.  Nhuộm gel bằng dung dịch EtBr trong vòng 15 phút.  Kết quả đƣợc ghi lại nhờ đọc tia UV và chụp ảnh bằng phần mềm Quality One của máy Gel Doc 2000 (Biorad). 35 Bảng tóm tắt quy trình khuếch đại vùng tef của các dòng Fusarium spp. bằng cách sử dụng primer ef1 và ef2. 3.2.7. Đọc trình tự sản phẩm PCR Sản phẩm PCR đƣợc đọc trình tự. Nấm Fusarium spp. đƣợc phân lập từ xƣơng rồng bệnh Cấy chuyền sang môi trƣờng PGA Nhân sinh khối nấm trong môi trƣờng nhân sinh khối Phân lập trên môi trƣờng WA Hoá chất: PCR Buffer 10X MgCl2 Primer ef2 Primer ef2 dNTP Taq polymerase DNA khuôn Nƣớc cất Thu sợi nấm Ly trích DNA Thực hiện phản ứng PCR Chu kỳ nhiệt: 95ºC/3 phút 95ºC/30 giây 53ºC/45 giây 72ºC/45 giây 72ºC/7 phút Nghiền sợi nấm 36 Các mẫu đƣợc đọc trình tự: FC07 3, FC07 7, FC07 10. 3.2.8. Chủng nấm lên cây xƣơng rồng Xƣơng rồng sau khi mua từ nhà vƣờn về để một tháng theo dõi có bệnh xuất hiện hay không. Những cây không bệnh đƣợc cho là cây khỏe mạnh và dùng để chủng bệnh. Thí nghiệm tiến hành chủng bệnh nầm lên xƣơng rồng với 12 dòng nấm phân lập đƣợc: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Các mẫu xƣơng rồng không chủng nấm bệnh dùng làm đối chứng. 3.2.8.1. Tiến hành chủng bệnh trên xƣơng rồng  Vật liệu Nấm đƣợc nuôi trên môi trƣờng nhân sinh khối. Cây xƣơng rồng khỏe mạnh. Hộp nhựa có kích thƣớc 20 x 8 cm. Kim tiêm + xi lanh 3 ml/cc.  Phƣơng pháp Nấm sau khi đƣợc nuôi trên môi trƣờng, dùng xilanh hút lấy phần dịch lỏng tiêm trực tiếp lên cây xƣơng rồng, mỗi cây tiêm khoảng 3 ml. Sau khi tiêm, dùng bao nilông vô trùng bao cây xƣơng rồng vừa chủng bệnh xong để tránh sự lây lan ra ngoài môi trƣờng. Xƣơng rồng sau khi chủng đƣợc để trong điều kiện nhiệt độ phòng. 3.2.8.2. Đánh giá kết quả Theo dõi xem sau khi chủng bệnh nấm bao nhiêu ngày thì xƣơng rồng bị bệnh và mô tả triệu chứng. Sau đó, lấy mẫu xƣơng rồng bị bệnh phân lập lại và xác định tác nhân gây bệnh. Cách phân lập giống nhƣ cách phân lập ban đầu từ các mẫu bị bệnh ở vƣờn xƣơng rồng mang về. Khi nấm mọc quan sát và mô tả. 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tình hình bệnh hại xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh Xƣơng rồng cũng giống nhƣ các loại cây cảnh khác thƣờng xuyên bị sâu bệnh gây hại làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng bình thƣờng, năng suất, phẩm chất trong đó có màu sắc, độ tƣơi lâu bền làm giảm giá trị kinh tế, giá trị thẩm mỹ, giá trị hàng hóa và xuất khẩu trên thị trƣờng, thậm chí còn làm chết cây. Hiện nay, tình hình bệnh hại nhất là bệnh chết khô trên cây xƣơng rồng đã gây thiệt hại rất lớn cho những hộ trồng xƣơng rồng tại Tp. Hồ Chí Minh. Do đó, việc tiến hành điều tra tình hình bệnh hại và xác định tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác bảo vệ thực vật. 4.2. Các triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng Qua điều tra cho thấy một số bệnh thƣờng xuất hiện trên xƣơng rồng với các triệu chứng nhƣ sau: Hình 4.1. Xƣơng rồng với triệu chứng thối gốc 38 Hình 4.2. Xƣơng rồng với triệu chứng thối vàng và đen ở gốc Hình 4.3. Xƣơng rồng với triệu chứng thối thân Hình 4.4. Xƣơng rồng cắt dọc với triệu chứng thối từ lõi ra ngoài Qua một số triệu chứng bệnh trên xƣơng rồng chúng tôi thấy bệnh phân bố trên tất cả trên các phần của cây kể cả cây ghép và cây không ghép. 39 4.2.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra (số liệu điều tra tháng 04 năm 2007) Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra Vƣờnđiều tra Tổng số chậu Số chậu bệnh do vi khuẩn Số chậu bệnh do nấm Số chậu bệnh do virus 1 5.000 450 1.500 0 2 15.000 1.500 2.500 0 3 12.500 700 2.500 100 4 11.200 900 2.500 0 5 9.300 800 700 0 6 7.900 550 1.200 0 7 11.500 500 2.000 0 8 17.500 1.500 4.000 50 9 3.000 0 10 0 Tổng cộng 92.900 6.900 16.910 150 Qua bảng 4.1 cho thấy chúng tôi tiến hành điều tra 9 hộ trồng xƣơng rồng trên địa bàn Tp. Hồ Chí Minh với tổng số là 92.900 chậu trong đó số bệnh do vi khuẩn là 6900 chậu, do nấm là 16.910 chậu và do virus là 150 chậu. Điều này còn đƣợc thể hiện qua tỷ lệ phần trăm (%) nhƣ sau: Qua đánh giá kết quả từ bảng 4.1, tỷ lệ nhiễm bệnh tại các vƣờn: bệnh do vi khuẩn: 7,43%, bệnh do nấm: 18,2%, bệnh do virus: 0,16%. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 2 Tỷ lệ n hi ễm b ện h( % ) Vi khuẩn Nấm Virus Tác nhân gây bệnh Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn, nấm, virus gây ra qua các vƣờn điều tra 40 Bệnh chết khô trên xƣơng rồng đang ảnh hƣởng rất nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn cho ngƣời trồng xƣơng rồng. Chúng tôi tiến hành điều tra 9 vƣờn xƣơng rồng và phần lớn các vƣờn này tập trung ở các quận Thủ Đức, quận 12, quận Gò Vấp và huyện Hóc Môn. Qua điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn và virus (bảng 4.1 và đồ thị 4.1), hầu nhƣ vƣờn nào cũng bị nhiễm bệnh và tỷ lệ nhiễm bệnh trong mỗi vƣờn khá cao, cụ thể là hộ ở quận 12 vƣờn chỉ có 5.000 chậu nhƣng có đến 30% bị bệnh. Điều này có thể do thời tiết thay đổi bất thƣờng, mƣa nhiều làm cho bệnh phát sinh và phát tán nhanh. Tuy nhiên cũng có nhiều nguyên nhân góp phần làm cho bệnh lây lan là các yếu tố tự nhiên và một phần do chính cách chăm sóc và kỹ thuật của ngƣời trồng xƣơng rồng. Họ chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chƣa có quy trình kỹ thuật hợp lý. Do đó, việc tìm cách phát hiện sớm bệnh trên xƣơng rồng để điều trị cũng nhƣ phòng chống là rất cần thiết. 4.3. Phân lập mẫu nấm Kết quả điều tra cho thấy, bệnh do nấm gây ra có tỷ lệ cao hơn vi khuẩn và virus. Trƣớc tình hình đó chúng tôi tiến hành thu thập các mẫu xƣơng rồng có triệu chứng bệnh do nấm gây ra và tiến hành phân lập trên 2 môi trƣờng là WA và PGA trong đó môi trƣờng WA dùng để loại tạp nhiễm vi khuẩn trong mẫu bệnh và là môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng nên thích hợp cho việc cắt đơn bào tử. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng trên môi trƣờng PGA (hình 4.5). Hình thái nấm khác nhau có thể do chúng gây bệnh chuyên biệt cho từng loại xƣơng rồng. 41 Hình 4.5. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bệnh trên môi trƣờng PGA A1. Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn B1. Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn 4.4. Kết quả ly trích thu DNA tổng số từ các dòng nấm Fusarium spp. DNA là vật chất cơ bản trong nghiên cứu di truyền phân tử. Do đó chúng ta phải ly trích đƣợc DNA tách khỏi tế bào và các chất nhƣ RNA, protein,… Có nhiều phƣơng pháp ly trích DNA nhƣng mục đích cuối cùng là làm sao thu đƣợc lƣợng DNA đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mặc dù giai đoạn tách chiết DNA là một giai đoạn khá đơn giản nhƣng nó lại đóng vai trò vô cùng quan trọng. Chúng tôi đã tiến hành ly trích tất cả các dòng nấm phân lập đƣợc bao gồm: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Sau khi ly trích xong, chúng tôi tiến hành điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/15 phút trong dung dịch TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng để kiểm tra DNA tổng số. Kết quả ly trích đƣợc thể hiện ở (hình 4.6). A1 B1 Hì nh 4.9 . Xƣ ơn g rồ ng với tri ệu ch ứ g th ối sa u kh i ch ủn g 42 Hình 4.6. Sản phẩm ly trích DNA tổng số của nấm Qua (hình 4.6) cho thấy 1. FC07 1, 2. FC07 2, 3. FC07 3,4. FC07 4, 5. FC07 5, 6. FC07 6, 7. FC07 7, 8. FC07 8, 9. FC07 9,10. FC07 10, 11. FC07 11, 12. FC07 12. Kết quả ly trích DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng số còn có thêm phần tạp nhiễm và những đoạn DNA bị đứt gãy mà quá trình ly trích không thể loại bỏ đƣợc.  Nguyên nhân tạo ra những đoạn DNA đứt gãy  Quá trình nghiền chƣa tốt hoặc do hoá chất nhƣ phenol, chloroform.  Thời gian cho phenol để phá huỷ lớp vỏ, lớp màng nhân, loại bỏ protein. Nếu nhƣ thời gian quá dài sẽ gây nên sự đứt gãy DNA một lƣợng rất đáng kể.  Ly tâm (tốc độ, thời gian, thao tác): - Ly tâm với thời gian ngắn, tốc độ thấp thì sự phân lớp chƣa tốt giữa phần dịch chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp phenol. - Ly tâm với thời gian quá dài thì phenol phá huỷ nhiều DNA hơn gây ra nhiều đoạn đứt gãy. - Ly tâm với tốc độ quá cao và thời gian dài thì DNA sẽ bị gãy rất nhiều.  Nguyên nhân thu lƣợng DNA tổng số ít là do: - Mẫu nghiền chƣa mịn. - Thời gian và nhiệt độ ủ chƣa đủ để phá vỡ vách tế bào. phần tạp DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 8 6 6 7 8 9 10 11 12 43 - Sự phân lớp chƣa tốt ở các bƣớc ly tâm.  Thực hiện càng nhiều bƣớc ly tâm thì lƣợng DNA đứt gãy càng nhiều cho nên bƣớc tủa DNA không cần phải ly tâm để tập trung lƣợng DNA mà để lắng khoảng 30 phút sẽ thu đƣợc DNA tinh hơn.  Nhƣ vậy mức độ DNA tinh sạch có hoặc không có bị đứt gãy, lƣợng DNA tổng số thu đƣợc nhiều hay ít là do quá trình nghiền nấm và ly trích.  Có 9 dòng Fusarium spp. đƣợc sử dụng để chạy PCR. 4.5. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng tef Hình 4.7. Sản phẩm PCR khi khuếch đại bằng cặp primer ef1 và ef2 Chúng tôi đã tiến hành khuếch đại 9 trong 12 dòng phân lập đƣợc gồm: FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 7, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12. Điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100V/20 phút trong dung dịch đệm TAE 0,5X, 4 l mẫu/giếng. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, dựa vào thang ladder, cho thấy các dòng nấm Fusarium spp. chạy với primer ef1 và ef2 có kích thƣớc khoảng 700 bp. 4.6. Kết quả giải trình tự vùng tef Các dòng nấm sau khi giải trình tự cho kết quả : FC07 3, FC07 7, FC07 10. Trình tự vùng tef của các dòng nấm đọc trình tự đƣợc đối chiếu với dữ liệu của chúng trên NCBI. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 700 pb 44 So sánh vùng trình tự tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với nhau và giữa 3 dòng với các dòng trên genbank kết quả thể hiện nhƣ sau: So sánh trình tự nucleotide vùng tef của 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10 sử dụng phần mềm CLUSTAL. 45 Bảng 4.2. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa dòng FC07 – 3, FC07 – 7 và FC07-10 Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83) 1: FC07-3 100 100 72 2: FC07-10 100 100 72 3: FC07-7 72 72 100 Qua bảng so sánh 3 dòng nấm trên chúng tôi thấy độ tƣơng đồng giữa FC07 – 3 và FC07 – 10 là 100%, FC07 – 3 và FC07 – 7 là 72%. Nhƣ vậy, dòng FC07 – 3 và dòng FC07 – 10 cùng 1 loài nấm và sự sai khác về nucleotide giữa 2 dòng trên với dòng FC07 – 7 là 28%. Nhƣ vậy, sự sai khác này là khá lớn, có thể dòng FC07 – 7 khác với 2 dòng FC07 – 3 và FC07 – 10. Để biết mức độ tƣơng đồng giữa 3 dòng nấm trên với các dòng trên genbank chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng tef của 3dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank sử dụng phần mềm CLUSTAL. 46 47 48 Bảng 4.3. So sánh phần trăm (%) độ tƣơng đồng giữa 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7, FC07 – 10 với các dòng trên genbank Xác định phần trăm độ tƣơng đồng sử dụng phần mềm ClustalX (1.83) 1: FC07-3 100 100 99 77 77 75 79 77 68 2: FC07-10 100 100 99 77 77 75 79 77 68 3: DQ465954-F.solani.south-Africa 99 99 100 78 78 75 80 78 67 4: AJ543556-F.culmorum.Nauy 77 77 78 100 98 90 83 83 73 5: AJ543580-F.graminearum.Nauy 77 77 78 98 100 89 83 82 72 6: EF512027-F.langsethiae.Canada 75 75 75 90 89 100 80 81 71 7: DQ295139-F.lateritium.China 79 79 80 83 83 80 100 80 68 8: DQ837692-F.oxysporum.China 77 77 78 83 82 81 80 100 71 9: FC07-7 68 68 67 73 72 71 68 71 100 Qua bảng so sánh độ tƣơng đồng vùng trình tự tef giữa 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10 với các dòng trên genbank khi sử dụng phần mềm CLUSTAL. Chúng tôi thấy dòng FC07 3, FC07 10 có độ tƣơng đồng với loài Fusarium solani là cao nhất 99%. Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng dòng FC07 3, FC07 10 là Fusarium solani. Còn dòng FC07 – 7 có độ tƣơng đồng cao nhất so với các dòng trên genbank cũng chỉ 73%, quá thấp để khẳng định nó là loài nào. Chúng tôi nghi ngờ nên đã Blast trình tự của dòng FC07-7 sau khi xử lý lên genbank nhƣng vẫn thu đƣợc độ tƣơng đồng rất thấp.  Nguyên nhân không thể khẳng định dòng FC07-7 là do:  Qua so sánh độ tƣơng đồng giữa dòng FC07-7 với một số dòng trên genbank chúng tôi nhận thấy đã khuếch đại đúng vùng chức năng, nhƣng không thể khẳng định tên dòng của FC07-7 do tác động của điều kiện sinh thái, địa lý sống khác 49 nhau hoặc do đột biến trong quá trình phân chia tế bào nên có sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen của dòng trong cùng 1 loài.  Có thể dòng FC07 – 7 chƣa đƣợc nghiên cứu vùng chức năng tef trên genbank nên chúng tôi không thể so sánh đƣợc. Vậy, nấm gây bệnh thối trên xƣơng rồng ngoài Fusarium solani còn có loài nấm khác còn đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Qua đó chúng tôi thấy định danh bằng hình thái không chính xác vì môi trƣờng sống của các giống loài ở những điều kiện khác nhau thì hình thái cũng có sự thay đổi dần để thích nghi, tồn tại và phát triển. Cho nên, định danh phân tử hiệu quả hơn, chính xác hơn. Công cụ trong sinh học phân tử nhƣ: kỹ thuật khuếch đại các vùng bảo tồn giống loài và những vùng chức năng khác, các probe đánh dấu và giải trình tự khuếch đại cung cấp những thông tin chính xác hơn về giống loài. Kết quả giải trình tự vùng tef của 3 dòng FC07 3, FC07 7, FC07 10  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-3 TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATC GACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCCC TCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCATT TACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCAT CACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTG GGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGCT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-7 TCGACTCCGGAAAGTCCACCACTGTAAGTTCTCACTCCATGACTGTTTACAATCAGTCTTACCCCGCCATTTTATCTGGTG GGAGTCCCTGCAACAGTATACTGACATTTACAACTAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTATCGACAAGCGAA CCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTAGGTCACTTTTCCCTCGATTCCTGAGCCTTTCCCTACGCGATCGATTCGCTTCACGTCC ATCACCCCGCCCAACATCGATGATATTTTTTTTGCGTGGCTTTTTTATATTGGTGGGGGGTTTTACCCCGCCGAATATGAG AAGCTGGCATTTCGCCCCACCACAAAAATTTTCATCCTTTCTCATGGCTCGTCACAAGCAATCAAGACATGATGCTGACA ACCCACCAATAGGAAGCCGCCGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCG TGAGCGTGGTATCACCATCGATATCGCTCTCTGGAAGTTCGAGACTCCTCGCTACTATGTCACCGTCATTGGTAAGTTTTG ATTGACTCATGCATGTCATCATCTATCAGTCACTAACATACATGATAGACGCC  Kết quả giải trình tự của dòng FC07-10 TCGACTCTGGCAAGTCGACCACCGTAAGTCAAACCCTCATCGCGATCTGCTTATCTCGGGTCGTGGAACCCCGCCTGGCA TCTCGGGCGGGGTATTCATCAGTCACTTCATGCTGACAATCATCTACAGACCGGTCACTTGATCTACCAGTGCGGTGGTAT CGACAAGCGAACCATCGAGAAGTTCGAGAAGGTTGGTGACATCTCCCCCGATCGCGCCTTGCTATTCCACAACGAATTCC CTCCCTCGCGATACGCTCTGCGCCCGCTTCTCCCGAGTCCCAAAATTTTTGCGGTCCGACCGTAATTTTTTTGGTGGGGCA TTTACCCCGCCACTCGGGCGACGTTGGACAAAGCCCTGATCCCTGCACACAAAAACACCAAACCCTCTTGGCGCGCATCA 50 TCACGTGGTTCACAACAGACGCTAACCGGTCCAACAATAGGAAGCCGCTGAGCTCGGTAAGGGTTCCTTCAAGTACGCCT GGGTCCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCCGT ACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTGCTGTCACCTCTGTCACACACGTCTCACCACTAACAATCAACAGACGCC 4.7. Chủng bệnh trên xƣơng rồng Chúng tôi tiến hành chủng lên cây xƣơng rồng khỏe. Hình 4.8. Xƣơng rồng khỏe mạnh trƣớc khi chủng bệnh Hì nh 4.9 . Xƣ ơn g 51 Sau 4 ngày chủng, quan sát thấy 7 dòng nấm có khả năng gây hại mạnh: FC07 1, FC07 3, FC07 4, FC07 6, FC07 7, FC07 – 8, FC07 10 với các triệu chứng nhƣ (hình 4.9). Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Điều này có thể do phân lập, cấy chuyền nhiều lần nên độc tính của nấm bị giảm hoặc do đặc tính giống xƣơng rồng có tính chống chịu với mầm bệnh. Sau đó chúng tôi tiến hành phân lập lại từ các cây xƣơng rồng chủng bệnh có biểu hiện bệnh. Kết quả thu đƣợc nấm có hình thái, màu sắc khuẩn lạc giống với ban đầu (hình 4.10) Hình 4.10. Nấm phân lập từ xƣơng rồng bị bệnh sau khi chủng nấm 4 ngày trên môi trƣờng PGA Nhƣ vậy, sau khi chủng các dòng FC07 1, FC07 2, FC07 3, FC07 4, FC07 5, FC07 6, FC07 7, FC07 8, FC07 9, FC07 10, FC07 11, FC07 12, chúng tôi đã phân lập lại đƣợc tất cả các dòng. Qua (hình 4.10) là các dòng FC07 –3 và FC07– 8 là 2 trong 12 dòng chúng tôi phân lập lại đƣợc sau khi chủng. 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua kết quả điều tra cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh do nấm gây ra cao hơn hẳn (18,2%) so với tỷ lệ nhiễm bệnh do vi khuẩn (7,43%) và virus (0,16%). Phân lập các dòng nấm thuộc Fusarium spp. trên xƣơng rồng bệnh qua 2 môi trƣờng WA và PGA. Kết quả phân lập đƣợc 12 dòng nấm với 2 hình thái đặc trƣng:  Khuẩn lạc nấm màu trắng, tròn, tơ mịn.  Khuẩn lạc nấm màu tím, tròn, tơ mịn. Tiến hành nhân và thu sinh khối các dòng nấm cần cho mục đích ly trích các dòng nấm để khuếch đại vùng gen tef với cặp primer ef1 và ef2 và thu đƣợc sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc 700 bp (căn cứ trên thang ladder), phản ứng thực hiện trên 9 trong 12 dòng ly trích đƣợc. Tiến hành giải trình tự vùng tef trên 3 dòng nấm FC07 3, FC07 7, FC07 10. Kết quả giải trình tự định danh dòng FC07 3 và FC07 10 là Fusarium solani, còn dòng FC07 – 7 vẫn đang tiếp tục nghiên cứu. Sau khi chủng bệnh nấm lên xƣơng rồng khỏe mạnh thu đƣợc kết quả: 7 dòng nấm có khả năng gây bệnh nặng. Các dòng còn lại có khả năng gây bệnh yếu. Mẫu nấm sau khi phân lập lại có hình thái giống với lần phân lập trên xƣơng rồng bệnh từ các vƣờn. 53 5.2. Đề nghị Từ những khó khăn, trở ngại trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi có thể đƣa ra một số đề nghị sau: Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trƣởng và phát triển, hình thái cụ thể của từng dòng nấm để góp phần cho kết quả định danh chính xác hơn. Tiếp tục nghiên cứu các loài nấm gây hại trên xƣơng rồng để từ đó có những biện pháp phòng trừ hữu hiệu. Tiếp tục nghiên cứu các vùng chức năng trên dòng FC07 – 7 và kết hợp định danh bằng hình thái để khẳng định chính xác tên của dòng FC07 – 7. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Nguyễn Thị Thanh Hà, 2006. Phát hiện vi khuẩn Erwinia carotovora subsp. carotovora trên cây địa lan (Cymbidium) bằng phương pháp PCR. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công Nghệ Sinh Học 2006. 2. Nguyễn Hồng Minh, 1993. Phản ứng các dạng cà chua tới toxin (Fumaric) và dịch nuôi cấy của nấm Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ở in vivo và in vitro. Tạp chí Bảo vệ Thực vật số 1/ 1993. 3. Huỳnh Văn Phục, 2006. Khảo sát tính đối kháng của nấm Trichoderma ssp. đối với Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây lúa và bắp. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công nghệ Sinh học 2006. 4. Trần Văn Mão – Nguyễn Thế Nhã. Phòng trừ sâu bệnh hại cây xương rồng cảnh. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội 2002. 5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng TEF. Luận văn tốt nghiệp Ngành Công Nghệ Sinh Học 2006. 6. Trƣơng Duy Lam, 2006. Như những đóa hồng. Tạp chí hoa cảnh số 10/ 2006. 7. Huỳnh Văn Thới, 2004. Cẩm nang trồng và lai tạo xương rồng. Nhà xuất bản Trẻ,2004. 8. Huỳnh Văn Thới, 1997. Cây cảnh nhiệt đới, kỹ thuật trồng xương rồng – sứ Thái. Đặc biệt cách trồng và chăm sóc cây trong nhà. Nhà xuất bản Trẻ 1997. 9. Minh sơn, 2004. Đánh cắp xương rồng sa mạc: lợi trước hại sau. (Theo Science). Báo điện tử Việt Nam Net 2004. 10. Đỗ Tấn Dũng, 1996. Kết quả nghiên cứu phạm vi ký chủ của nấm Fusarium sp hại trên một số giống cây trồng, cây cảnh và cỏ dại vùng Hà Nội năm 1996. Kết quả nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt, đại học nông nghiệp I. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.1996, trang 183-188. Nƣớc ngoài 11. Nassar Jafet M.; Hamrick J. L.; Fleming Theodore H. Genetic variation and population structure of the mixed-mating cactus, Melocactus curvispinus (Cactaceae). Heredity, 2001. 55 12. Horvath David P.; Chao Wun S. Molecular analysis of signals controlling dormancy and growth in underground adventitious buds of leafy spurge. Plant Physiology, 2002. 13. Batista Angela M.; Mustafa Arif F. Effects of variety on chemical composition, in situ nutrient disappearance and in vitro gas production of spineless cacti. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2003. 14. Chiocchetti, A., Bernardo, I., Daboussi, M.-J., Garibaldi, A., Gullino, M. L., Langin, T., and Migheli, Q. 1999. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. dianthi in carnation tissue by PCR amplification of transposon insertions. Phytopathology 89:1169-1175. 15. Chiocchetti Annalisa; Sciaudone Lucia; Durando Fiorenza; Garibaldi Angelo; Migheli Quirico. PCR detection of Fusarium oxysporum f. sp. basilici on basil. Plant disease ISSN 0191-2917. 16. V. Edel, C. Steinber, N. Gautheron, C. Alabouvette, Inra-Cmse, 1999. Ribosomal DNA-targeted oligonucleotide probe and PCR assay specific for Fusarium oxysporum. Laboratoire de Recherches sur la Flore Pathogène dans le Sol, 17 rue Sully, 21034 Dijon Cedex, France. 17. X. Y. Zheng, D. W. Wolff, S. Baudracco-Arnas, M. Pitrat. Development and utility of cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) and restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) linked to the Fom-2 Fusarium wilt resistance gene in melon (Cucumis melo L.). Department of Horticulture Science, Texas Agricultural Experiment Station, The Texas A&M University System, 2415 East Highway 83, Weslaco, TX 78596 18. Matias Pasquali, Alberto Acquadro, Virgilio Balmas, Quirico Migheli, Maria Lodovica Gullino và Angelo Garibald, 2004. Development of PCR Primers for a New Fusarium oxysporum Pathogenic on Paris Daisy (Argyranthemum frutescens L.). European Jounal of Plant pathology. 19. Diana Fernandez, Mohamed Ouinten, Abdelaziz Tantaoui, Jean-Paul Geiger, Marie-Josée Daboussi, và Thierry Langin, 1998. Fot 1 Insertions in the Fusarium oxysporum f. sp. albedinis Genome Provide Diagnostic PCR Targets for Detection of the Date Palm Pathogen. American Society for Microbiology. 56 20. Hirano, Yasushi; Arie, Tsutomu, 2006. PCR-based differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici and radicis-lycopersici and races of F. oxysporum f. sp. lycopersici. Jounal of General Plant Pathology. Volume 72, Number 5, October 2006 , pp. 273-283. 21. Zhenggang Zhang, Jingyu Zhang, Yuchao Wang, Xiaobo Zheng, 2005. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. Volume 249 Issue 1 Page 39-47, August 2005. < et=1&journalCode=fml> 22. Barry Pryor, Assistant Professor, Department of Plant Pathology,University of Arizona, Tucson, 2005. Detection of Fusarium oxysporum f. sp. lactucae in lettuce seed and soil. Arizona Iceberg Lettuce Research Council 23. Biehn, W. L and Dimond, A. E., 1973. Chemically induced root injury correlated with a redution of Fusarium wilt of Tomato. Phytopathology, pp. 655- 656 24. Kuniyasu, K. , 1984. Fusarium wit diseases of vegetable crop. Vegetable and Ornamental crops reasearch station, Japan. 25. H. Cai, H.R. Chen, F. Li, B.H. Kong. First Report of a Phytoplasma Associated with Cactus Witches’-Broom in Yunnan (China). New Disease Reports. 26. IK Hwa Hyun, Sang Dok Lee, Young Hee Lee, Noh Youl Heo, 1998. Mycological Characteristics and Pathogenicity of Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. and Hans. Causing Stem Rot of Cactus. The Plant Pathology Jounal, pp. 463-466. < pMenu=&topMenu1=> 27. Young Ho Kim, Kwang-Hyung Kim. Abscission Layer Formation as a Resistance Response of Peruvian Apple Cactus Against Glomerella cingulata. Phytopathology 92:964-969 28. Jones, J. P và Crill.P, 1974. Susceptibility og resistant tomato cultivars to Fusarium wilt. Phytopathology, pp 1507-1510. 29. David M. Geiser, Mariaa del Mar Jimenez, Seogehan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Ning Zhang và Gretchen, 2004. A. Kuldau, todd J. Ward and Kerry O` Donnell. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA 57 sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00: 1-7, 2004. 30. Gary J. Samuels, 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705. Acepted for publication. < alCode=phyto> 31. Bogale, Mesfin; Wingfield, Brenda D.; Wingfield, Michael J.; Steenkamp, Emma T. Species-specific primers for Fusarium redolens and a PCR-RFLP technique to distinguish among three clades of Fusarium oxysporum. FEMS Microbiology Letters, Volume 271, Number 1, June 2007 , pp. 27-32. < 05> 32. Abawi, G.R and Lorbeer, J.W, 1972. Several aspects of ecology and pathology of Fusarium oxysporum. Phytopathology, pp 870- 876. Trang WEB http:// en.wikipedia.org/wiki/Fusarium http:// en.wikipedia.org/wiki/cactaceae ions/Fusarium_drawing.jpg (Gary. J. Semuels). PHỤ LỤC Kết quả đọc trình tự vùng tef của 3 dòng FC07 – 3, FC07 – 7 , FC07 – 10.  Kết quả đọc trình tự vùng tef của dòng FC07-3. Ghi chú: M1 là tên đặt cho dòng FC07-3, M2 là tên đặc cho dòng FC07 – 7, M3 là tên đặt cho dòng FC07-10. Kết quả đọc trình tự vùng tef của dòng FC07 – 3. Kết quả đọc trình tự vùng tef của mẫu FC07 – 7 (M2) Kết quả đọc trình tự vùng tef của mẫu FC07 – 10 (M3)