Khóa luận Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm corynespora cassiicola (berk. và curt.) wei gây bệnh trên cây cao su (hevea brasiliensis muell. arg.) bằng phương pháp rflp – pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI Thành phố Hồ Chí Minh -2005- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN VŨ THỊ QUỲNH CHI ThS. PHAN THÀNH DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh -2005- iii LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường. Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp . PGS.TS Bùi Cách Tuyến cùng ThS. Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam – đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. TS. Bùi Minh Trí và TS. Đinh Duy Kháng đã có những chỉ dẫn, động viên giúp tôi thực hiện tốt khóa luận này. KS. Nguyễn Ngọc Mai cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Chị Huỳnh Kim Hưng cùng các anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã hướng dẫn và chia sẻ cùng tôi những khó khăn trong thời gian thực hiện khóa luận. Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã giúp đỡ và chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt nghiệp. Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ đã sinh thành, dưỡng dục con nên người, để Con được như ngày hôm nay. iv TÓM TẮT VŨ THỊ QUỲNH CHI. Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Tháng 09/2005. PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR. Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN. ThS. PHAN THÀNH DŨNG. Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước sản xuất cao su thiên nhiên. Triệu chứng biểu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ nhầm lẫn với các bệnh về lá khác. Do đó tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan. Những nghiên cứu trên thế giới cho thấy, nấm C. cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, C. cassiicola trên các dòng vô tính cao su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhờ đó có thể nhận biết C. cassiicola qua khả năng gây bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa sự đa dạng di truyền của C. cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được trồng ở Việt Nam. Kết quả đạt được: Nhận diện được triệu chứng đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Thu thập mẫu bệnh trên 32 dòng vô tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đoán và phân tích đa hình vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng phương pháp RFLP – PCR trên 7 dòng vô tính. Qua phân tích chúng tôi đi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR đối với nấm C. cassiicola của Silva và cộng sự (1998) có thể sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Chẩn đoán bệnh Corynespora bằng cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, sản phẩm thu nhận được không đặc trưng cho nấm C. cassiicola. v Không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào trong vùng ITS của các mẫu nấm nghiên cứu khi sử dụng phương pháp RFLP – PCR với các enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Các mẫu nấm được dùng trong phân tích có thể thuộc cùng một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay vi MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ...................................................................................................................... iii Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... vi Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... vii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích – Yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ............................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................. 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg. .................................... 2.2. Sơ lược về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei ....................................... 4 2.2.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 4 2.2.2. Phạm vi phân bố .................................................................................. 4 2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh ................................................. 5 2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola ..................................................... 5 2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis Muell. Arg ....................................................................................................... 6 2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su Hevea brasiliensis .................................................................................... 6 2.3.2. Tình hình bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại một số nước trồng cao su .............................................................................................. 6 2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su ..................... 9 2.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh do C. cassiicola ............... 9 vii 2.5. Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) .............................................. 10 2.5.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................... 10 2.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR .......................................... 12 2.6. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) ................................. 14 2.6.1. Giới thiệu ............................................................................................ 16 2.6.2. Định danh các enzyme ....................................................................... 15 2.6.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn ................................. 16 2.6.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA .................... 16 2.6.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE ............................... 18 2.6.6. Bản đồ giới hạn ................................................................................... 19 2.7. Vùng ITS và vai trò của nó trong phân tích đa dạng di truyền .................... 19 2.8. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nước ............................ 21 2.8.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nước ................................. 21 2.8.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nước ................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................................. 24 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ................................................................... 24 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 24 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 24 3.1.3. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 24 3.2. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 24 3.2.1. Phân lập nấm nguồn nấm C. cassiicola ............................................. 24 3.2.1.1. Hóa chất và dụng cụ .................................................................... 24 3.2.1.2. Phương pháp lấy mẫu .................................................................. 25 3.2.1.3. Phương pháp phân lập ................................................................. 25 3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR ........................................... 26 3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR........................... 26 3.2.2.2. Thực hiện phản ứng PCR ............................................................ 28 3.2.2.3. Đọc kết quả của phản ứng PCR ................................................... 30 3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) ........... 30 viii 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ ................................................................... 31 3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP .................................. 31 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 32 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora ................................................ 32 4.2. Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola .................................................... 37 4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola ............................................ 37 4.4. Kết quả phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS ..................................... 40 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 46 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 46 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 48 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 52 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction. RE: Restriction endonuclease. PDA: Potato Dextrose Agar. PSA: Potato Saccharose Agar. EtBr: Ethidium Bromide. TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism. ITS: Internal Transcribed Spacer. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. Bp: base pairs rRNA: ribosomal RNA. dvt: dòng vô tính. BVTV: bảo vệ thực vật VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó ........................................................ 15 Bảng 2.2: Liệt kê các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó ......................... 17 Bảng 2.3: Trình tự một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS của nấm ..................................................................................................................... 21 Bảng 3 .1: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ................................................ 29 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP ............................................... 31 Bảng 4.1: Các dòng vô tính cao su được lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trưng/ không đặc trưng)..................................................................................... 33 Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập được nấm C. cassiicola ................ 36 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam .... 8 Hình 2.2: Hình minh họa phản ứng PCR .................................................................. 11 Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm .............................................................................. 20 Hình 2.4: Lược đồ các primer trên vùng ITS ............................................................ 20 Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm ............................................................................................ 29 Hình 4.1: Triệu chứng bệnh đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora ................... 34 Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora ............................ 34 Hình 4.3:Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioidies ........................................................................................................ 35 Hình 4.4: Bào tử nấm C. cassiicola dạng đơn dưới kính hiển vi và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioidies ............................................................................... 35 Hình 4. 5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trường PDA ................................ 36 Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau ........... 37 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola ............... 38 Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi giảm lượng primer dùng trong phản ứng PCR ........................................................................................................... 39 Hình 4.9: Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae ................. 40 Hình 4.10: Các sản phẩm tạo thành khi phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI .......................................................................................... 41 Hình 4.11: Phân cắt các sản phẩm PCR bằng enzyme MspI .................................... 42 Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme CfoI .................................................... 42 Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm bằng enzyme RsaI .................................................... 43 Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII ........................................ 43 Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI ...................................... 44 1 PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm bệnh trên cây trồng, đặc biệt là nấm ký sinh là dịch hại nguy hiểm đối với nền nông nghiệp của nhiều quốc gia trên thế giới. Trong đó, nấm Corynespora cassiicola (Berk. and Curt.) Wei có khả năng phân bố và phổ ký chủ rộng đã gây thiệt hại đáng kể cho nền kinh tế của nhiều nước. Trong phổ ký chủ, Corynespora cassiicola gây hại đặc biệt nghiêm trọng cho cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.), đây là loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á, châu Phi và Nam Mỹ. Trên cây cao su, C. cassiicola gây ra bệnh rụng lá – còn được gọi là bệnh rụng lá Corynespora, bệnh này có thể xảy ra trên cây cao su thuộc mọi lứa tuổi và xảy ra quanh năm, gây thiệt hại rất lớn về năng suất mủ cao su. Bệnh này đã bùng phát thành những đợt dịch bệnh và được ghi nhận lần đầu tiên vào những năm 1980 ở Sri Lanka, Indonesia, Malaysia và Thái Lan trên các dvt mẫn cảm như RRIC 103, RRIM 725, KRS 21, PPN 2447. Trong khoảng thời gian từ 1980 - 1988, ở Indonesia, khoảng 1200 ha cao su đã bị ảnh hưởng nghiêm trọng, thiệt hại khoảng 400 ha, ước tính giá trị thiệt hại lên đến 50 triệu USD (theo CFC/INRO Project Proposal, 1999). Trong những năm gần đây, khả năng gây hại của nấm C. cassiicola ngày càng lớn và ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh. Biện pháp phòng trừ bệnh rụng lá Corynespora bằng hóa chất khá tốn kém và được nhận định là không kinh tế bằng cách thay thế các dvt mẫn cảm bằng các dvt có tính kháng (Chee, 1988). Dịch bệnh do nấm C. cassiicola gây ra thường làm kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản và thời gian phục hồi của những dvt bị nhiễm bệnh. Trước tình hình đó, người trồng cao su thường được khuyến cáo trồng các dvt có tính kháng bệnh. Tuy nhiên, khả năng gây bệnh của các dòng C. cassiicola là rất khác nhau tùy thuộc vào dvt cao su khác nhau và các điều kiện môi trường như nhiệt độ, độ ẩm, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất. Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa về di truyền (CFC/INRO Project Proposal, 1999; Safia và Noor Hisham, 2003). Do vậy, việc xác định sự đa dạng sinh học, đặc biệt là đa dạng ở mức độ phân tử của C. cassiicola là việc rất cần thiết. Đây 2 chính là tiền đề cho việc xác định các marker phân tử có liên quan đến tính độc của C. cassiicola và phục vụ cho việc nghiên cứu tính kháng trên các dvt cao su. Ở Việt Nam, bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su đã được ghi nhận vào tháng 09/1999, gây hại nặng cho các dvt RRIC 103, RRIC 104 và LH 88/372. Hiện nay, số lượng dvt cao su bị nhiễm bệnh đã tăng lên nhiều, bệnh đã xuất hiện tại một số công ty cao su ở miền Đông Nam Bộ (Phan Thành Dũng, 2004) và một số tỉnh phía Bắc như Hà Tây và Nghệ An (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật, 2000). Những nghiên cứu về bệnh này ở Việt Nam hiện chưa nhiều và mới chỉ dừng lại ở phân tích, đánh giá tình hình bệnh cũng như tính kháng của một số dvt cao su đối với nấm C. cassiicola. Việc ứng dụng các kỹ thuật phân tử trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu về nấm C. cassiicola chưa nhiều trong khi bệnh rụng lá Corynespora ngày càng lan rộng, triệu chứng bệnh ngày càng biến thiên, càng ngày càng có nhiều dvt cao su bị nhiễm bệnh, đã trở thành mối lo ngại của nhiều nước trồng cao su. Xuất phát từ các vấn đề trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phƣơng pháp RFLP – PCR”. 1.2.Mục đích yêu cầu 1.2.1.Mục đích Thu thập và phân lập nấm C. cassiicola trên lá cao su bị bệnh có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng, không đặc trưng trên các dvt cao su khác nhau, tại một số địa điểm khác nhau. Xác định sự khác biệt di truyền giữa các mẫu nấm C. cassiicola phân lập từ các dvt cao su khác nhau bằng phương pháp RFLP – PCR (Restriction Fragments Length Polymorphism – Polymerase Chain Reaction). 1.2.2. Yêu cầu Nhận dạng được các triệu chứng biểu hiện của bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su. Nắm vững kỹ thuật nuôi cấy và phân lập nấm C. cassiicola. Nắm vững kỹ thuật PCR và sử dụng các enzyme cắt giới hạn. 3 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới, lưu vực sông Amazone (Nam Mỹ), được H. Wickham du nhập vào châu Á và châu Phi năm 1876. Hai cây cao su được du nhập vào Việt Nam năm 1877 do Pierre trồng tại Thảo Cầm Viên (Sài Gòn), nhưng hai cây này sau đó bị chết. Ông Seeligmann gởi về Sài Gòn 50 cây cao su và chỉ còn sống 5 cây vào tháng 12 năm 1881, tiếp theo đợt 2 vào tháng 6 năm 1883, nhưng tất cả cây cao su nói trên đều không tồn tại và phát triển được do nhiều nguyên nhân. Đến năm 1897, sau một số lần thất bại tiếp theo của ông Raul trong việc du nhập và trồng cao su vào nước ta, bác sĩ Yersin đã thành công và vườn cao su đầu tiên được ông trồng tại Suối Dầu – Nha Trang (Đặng Văn Vinh, 2000). Đầu thế kỷ 20, các vườn cao su được trồng tại Đông Nam Bộ và đến đầu thập kỷ 50, cây cao su được trồng tại một số vùng Tây Nguyên, miền Trung và một số vùng ở phía Bắc (Đặng Văn Vinh, 2000). Hiện nay, diện tích cao su của cả nước đạt trên 450.000 ha với sản lượng trên 400.000 tấn /ha (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam, 2004). Cây cao su là loại cây công nghiệp dài ngày, cung cấp mủ và gỗ cho rất nhiều ngành công nghiệp. Đây cũng là loại cây có giá trị kinh tế cao trong các lĩnh vực nông – lâm – công nghiệp. Trong những năm gần đây, sản lượng mủ không ngừng được nâng cao nhờ những cải tiến về giống, kỹ thuật nông nghiệp, quy trình khai thác,… Tuy nhiên, những thiệt hại do bệnh gây ra cũng gia tăng đáng kể, một phần do việc chọn lọc chủ yếu dựa theo hướng sản lượng cao, sinh trưởng nhanh đã làm thất thoát gen kháng bệnh. Mặt khác, do tình hình thời tiết – khí hậu có nhiều thay đổi và diễn biến phức tạp, cùng với sự phát triển và chuyên canh cây trồng trên diện rộng trong vùng khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều đã dẫn đến sự phát sinh – phát triển mạnh về cả chủng loại cũng như mức độ bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến vấn đề canh tác và hiệu quả kinh tế của nó, thiệt hại sản lượng và gia tăng chi phí sản xuất. Hiện nay, cao su được phát triển mạnh dưới dạng tiểu điền, nên thiệt hại do bệnh gây ra đã ảnh hưởng trực tiêp đến đời sống của những người trồng cao su. 4 Theo Chee (1976), cây cao su bị trên 550 loài sinh vật tấn công, trong đó có 24 loài có tầm quan trọng về kinh tế. Theo Nguyễn Hải Đường (1997), có 24 loại bệnh gây hại trên cây cao su tại Việt Nam. 2.2. Sơ lƣợc về nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei 2.2.1. Lịch sử phát hiện Cooke (1896) ghi nhận Cercospora melonis là tác nhân gây đốm lá dưa hấu và dưa leo tại Mỹ. Năm 1906, Gusgow ghi nhận loại nấm tương tự trên dưa leo tại Đức và đặt tên nó là Corynespora maizei. Năm 1980, Lindau khẳng định các tác nhân nêu trên là cùng loài và đặt tên là Corynespora melonis (Cooke) Lindau. Tại Trung Quốc nhiều tác giả đã ghi nhận loại nấm này trên cây đậu nành, đậu đũa và đặt tên là Corynespora vignicola Kawamura. Liu (1948) cho rằng loại nấm gây bệnh tại Trung Quốc tương tự như loại nấm gây bệnh trên cùng ký chủ tại Mỹ đã được Olive và cộng sự đặt tên là Helminthosporum vignae Olive Bain và Lefebrve (Olive et al, 1945; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Sau đó trong báo cáo của IMI (International Mycological Institute) tại Anh cho biết Helminthosporum cassiicola (Berk and Curt) là ký chủ của 11 loài cây vùng nhiệt đới, trong đó có cao su và đu đủ. Năm 1950, Wei thu thập tất cả các tài liệu liên quan đến nấm này và phân tích để đi đến kết luận rằng chúng là tác nhân gây bệnh duy nhất thuộc loài Corynespora cassiicola và đặt tên là Corynespora cassiicola (Berk and Curt) Wei, tên này được các nhà bệnh cây chấp nhận cho đến nay. 2.2.2. Phạm vi phân bố C. cassiicola (Berk and Curt) Wei được ghi nhận tại hơn 80 nước trên thế giới thuộc nhiều vùng khí hậu khác nhau từ vùng ôn đới đới đến nhiệt đới như Trung Quốc, Nhật, Malaysia, Indonesia, Australia, Austria, Nigeria, Sri Lanka, Cambodia, Thái Lan, Cameroon, Congo, Cuba, Argentinia…vv (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995). 5 2.2.3. Phạm vi ký chủ và khả năng gây bệnh C. cassiicola có khoảng 160 loài ký chủ thuộc các nhóm cây ăn quả, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây ngũ cốc, cây rau màu và nhiều loại cây cảnh khác. Một số cây ký chủ của C. cassiicola bao gồm cao su (Hevea brasiliensis), đu đủ (Carica papaya), cà chua (Lycopersicum esculentum)…. Tuy nhiên, C. cassiicola trên cây cao su là ký sinh chuyên biệt (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995) C. cassiicola có thể gây hại cho tất cả các bộ phận của cây và gây ra các bệnh: leaf fire, leaf spot, target spot, frog eye, late blight, ring spot, brown leaf sprot…(Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995) 2.2.4. Đặc tính sinh học của C. cassiicola C. cassiicola (Berk and Curt) Wei có khả năng sống ký sinh trên thực vật cũng như có khả năng sống hoại sinh trên xác bã thực vật (Ellis và Holiday, 1971). Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu và biến thiên rất nhiều về hình thái, hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trong môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt, dạng hình lưỡi liềm, có chứa nhiều vết ngăn với chiều dài đôi khi lên đến 700 m. Ellis và Holiday (1971) mô tả khuẩn lạc của nấm có màu xám đến nâu. Bào tử dạng đơn hay kết thành chuỗi, biến thiên về kích thước và hình dạng. Nấm dễ dàng phát triển trên môi trường nhân tạo nhưng rất khó hình thành bào tử. Sử dụng môi trường PDA cải thiện đáng kể khả năng hình thành bào tử của C. cassiicola phân lập được từ đậu nành. C. cassiicola có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ 8 – 36oC trên môi trường PDA, thích hợp nhất ở 28oC, ngưng phát triển ở nhiệt độ trên 40oC. C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau có nhiệt độ phát triển tối ưu khác nhau. Khuẩn ty của C. cassiicola phát triển tốt trong điều kiện tối. Khuẩn lạc hình thành thay đổi theo mức độ chiếu sáng, phát triển rộng và mỏng dưới ánh sáng huỳnh quang, dày và tụ lại trong điều kiện tối. Đối với C. cassiicola trên cây cao su, khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên môi trường PDA ở nhiệt độ 28oC (Phan Thành Dũng dẫn nhập,1995). 6 2.3. Nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su (Hevea brasiliensis) 2.3.1. Sự xuất hiện của nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su (Hevea brasiliensis) Đây là bệnh mới và có tác hại lớn chƣa từng có từ trƣớc tới nay tại các nƣớc trồng cao su ở Châu Á. Bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên trên cây cao su thực sinh tại Sierra Leone (châu Phi) năm 1949. Tiếp theo, bệnh lần lƣợt đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ (1958), Malaysia (1961), Nigeria (1968), Thái Lan, Sri Lanka, Indonesia (1985), Bangladesh, Brazil năm 1988 và ở Việt Nam năm 1999 (Phan Thành Dũng dẫn nhập, 1995). Trên cây cao su, nấm C. cassiicola gây hại trên lá, cuống lá và chồi. 2.3.2. Tình hình bệnh do nấm C. cassiicola gây ra trên cây cao su tại các nƣớc trồng cao su Sự phát dịch và lây lan của C. cassiicola có liên quan đến các yếu tố môi trường như độ ẩm, nhiệt độ, lượng mưa, độ cao và độ màu mỡ của đất đai (CFC/INRO Project Proposal, 1999). Do vậy, tình hình bệnh và diễn biến bệnh ở các quốc gia khác nhau là khác nhau. Dịch hại do C. cassiicola gây ra được ghi nhận lần đầu tiên vào năm 1980, chủ yếu tại các nước sản xuất cao su như Indonesia, Malaysia, Sri Lanka, Thái Lan. Đến nay C. cassiicola đã gây hại ở nhiều nước. 2.3.2.1. Indonesia Bệnh bùng nổ lần đầu vào năm 1980 tại trại thực nghiệm Sembawa, Nam Sumatra. Hiện nay, bệnh gây hại trên tất cả vùng trồng cao su tại Indonesia. Do cao su tiểu điền chiếm trên 90 % tổng diện tích trồng trong nước nên thiệt hại do bệnh chưa thống kê đầy đủ. Tuy nhiên, 1.125 ha cao su trong giai đoạn 1980 – 1988 và 400 ha phải nhổ để trồng lại với ước tính thiệt hại khoảng 200 triệu Rp. Một số dvt kéo dài thời kỳ kiến thiết cơ bản 8 – 10 năm và làm giảm sản lượng 30 – 50 % đối với vườn khai thác (Sinulinga, 1996; Sujanto và Irwan Suhendry, 2000). Diễn biến của bệnh trên các dvt theo từng năm được ghi nhận như sau: - 1980: RRIC 103. - 1982: PNN 2058, 2444, 2447. - 1984: GT 1, KRS 21, FX 25, BPM 6, RRIM 725. 7 - 1991: RRIM 600. - 1995: IAN 873. - 1999: AV 2037. 2.3.2.2. Malaysia Ghi nhận tại vườn ương trên dvt RRIC 52 và FX 25. Năm 1985, dịch bệnh bùng phát gây hại nặng cho RRIC 103, KRS 21 và RRIM 725. Hiện nay bệnh ghi nhận tại tất cả các vùng trồng cao su trong cả nước, nặng nhất tại Johor Baru và Trengganu. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, 701, 702, 703, 712, 725, 901, 2009, 2020, PR 261, IAN 873, PB 217 (Shukhor S.K. and Hidir S.M., 1996). 2.3.2.3. Sri Lanka Là nước thiệt hại nặng nề nhất, bệnh lần đầu tiên xuất hiện tại 9 địa phương trong vườn nhân sau đó gây hại nặng trên toàn quốc. 4.300 ha dvt RRIC 103, là dvt cao sản được khuyến cáo trồng đại trà (2.400 ha của đại điền và 1.900 ha của tiểu điền chiếm 3% diện tích trồng cao su cả nước lúc bấy giờ), phải nhổ bỏ và trồng lại bằng dvt kháng bệnh. Chính phủ phải bồi thường 64 triệu Rp cho người trồng cao su bị thiệt hại. Các tiến bộ về giống bị khựng lại (thay thế PB 86 bằng các dvt cao sản thuộc RRIC 100’ s series), buộc phải duy trì dvt có sản lượng thấp nhưng có tính kháng bệnh. Các dvt mẫn cảm bị bệnh nặng trước đây bao gồm RRIC 103, RRIC 104, KRS 21, PNN 2444 đã bị loại bỏ từ đầu, một số dvt được đánh giá là kháng bệnh nay cũng đã bị nhiễm bệnh như là RRIM 600, GT 1, RRIC 110, IAN 873, PB 260, PB 28/59, PB 235, RRII 105 (Jayashinge,1996 và 2000). 2.3.2.4. Thái Lan Bệnh ghi nhận tại thí nghiệm trao đổi giống cao su quốc tế 7 năm tuổi ở trạm Surat Thani. Bệnh gây chết dvt RRIC 103 và rụng lá nặng trên KRS 21. Hiện nay, bệnh đã xuất hiện tên toàn bộ diện tích cao su tại Thái Lan, nhưng tác hại không nghiêm trọng (Narisa Chanruang, 2000). 2.3.2.5. Cameroon Bệnh được ghi nhận trên toàn bộ diện tích trồng cao su trong nước. Các dvt mẫn cảm bao gồm GT1, RRIM 600, RRIC 110, PB 260. RRIC 110 được trồng ở quy mô vừa và phải loại bỏ từ 1995 do nhiễm nặng, trong khi PB 260 là dvt có nhiều triển vọng về sản lượng và kháng bệnh tại Indonesia và Malaysia 8 nhưng bị hại rất nặng tại Cameroon và các nước châu Phi (Gobina, 2000; Phan Thành Dũng dẫn nhập, 2001). 2.3.2.6. Ấn Độ Xuất hiện lần đầu tại vườn ương từ 1969 – 1976 và bệnh chỉ xảy ra ở vài nơi. Cho đến năm 1996 – 1997 dịch bệnh đã bùng phát tại South Canara, Karnataka làm rụng lá, chết chồi và đôi khi chết cả cây. Bệnh cũng gây rụng lá và chết chồi tại vùng Trichur và Thodupuzha, miền trung bang Kerala vào năm 1999 – 2000. Các dvt bị nhiễm bệnh bao gồm GT 1, RRIM 600, Tijir 1 và RRII 105, 118. Tại vườn nhân RRII 105, 118, 300,305, PR 107, 255, 261, RRIM 600, PB 235, 255,260, 311, và GT 1. Dvt RRII 105 mẫn cảm nặng với bệnh gây nhiều chú ý do trên 80 % cao su tại đây trồng dvt này (Sabu,2000). 2.3.2.7. Việt Nam Bệnh xuất hiện lần đầu vào tháng 8 năm 1999 tại trại thực nghiệm cao su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Dvt LH 88/372, RRIC 103 và RRIC 104 bị hại nặng và phải cưa bỏ và xử lý bằng 0,5 % Benlate C 50 WP. Theo một số ghi nhận ban đầu, bệnh gây thiệt hại về sinh trưởng và sản lượng do tán lá không đủ để cây sinh trưởng và duy trì sản lượng. Một số vườn khai thác bị hại nặng có sản lượng chỉ bằng 1/3 -1/2 so với vườn cây có cùng điều kiện không bị nhiễm bệnh. Sinh trưởng cũng chậm, tỷ lệ khô miệng cạo và cỏ trong vườn cũng gia tăng hơn so với vườn cây không bị hại. Ngoài ra, cùng dvt và tuổi cây, bệnh phân bố khác nhau, trong đó gây hại nặng tại những vùng thấp ẩm ướt hơn so với vùng cao có điều kiện thông thoáng hơn (Phan Thành Dũng và Nguyễn Thái Hoan, 1999 và 2000). 9 Hình 2.1: Một đợt dịch bệnh do C. cassiicola gây ra trên cây cao su ở Việt Nam. Nguồn: Bộ Môn BVTV/VNCCSVN. 2.3.3. Đặc tính sinh học của nấm C. cassiicola trên cây cao su Khuẩn ty của nấm có màu xám đến nâu, rất biến thiên về hình thái, hình dạng bào tử trên vết bệnh cũng như trên môi trường nhân tạo. Bào tử trên lá có màu nâu nhạt với dạng hình lưỡi liềm chứa nhiều vết ngăn với chiều dài biến thiên, đôi khi đạt 700 m. Bào tử dạng đơn đôi khi dạng chuỗi dính với nhau ở hai đầu gọi là hilum, phát tán nhờ gió. Bào tử phóng thích vào ban ngày và cao điểm từ 8 – 11 giờ sáng. Sau thời gian mưa nhiều và tiếp theo nắng ráo, số lượng bào tử phóng thích nhiều nhất do nấm cần ẩm độ cao để hình thành bào tử. Bào tử có khả năng tồn tại trên các vết bệnh cũng như trong đất với thời gian kéo dài, trên lá cao su khô nấm vẫn tồn tại và giữ nguyên khả năng gây bệnh đến 3 năm (Chee, 1988). Nấm xâm nhập chủ yếu ở mặt dưới lá qua lớp biểu bì và khí khổng, ngoài ra còn tiết ra enzyme cellulase giúp phân huỷ màng tế bào. Trong suốt quá trình sinh trưởng, nấm còn tiết ra độc tố CC toxin (là cassiicoline chứa các amino acid) gây độc cho cây cao su, cho nên chỉ với một lượng nhỏ ở gân chính của lá cũng đủ gây rụng lá (Chee, 1988). Nấm có khả năng tồn tại và phát triển trong phạm vi nhiệt độ lớn, thích hợp nhất ở 28 2 oC và ẩm độ bão hoà (Chee, 1987 &1988; Jayashinghe, 2000). 10 Nấm có khả năng gây rụng lá non lẫn lá già, cuống lá và chồi. Hơn nữa, nấm gây bệnh quanh năm và suốt chu kỳ sống của cao su nên có tác hại rất lớn, nhất là trên các dvt mẫn cảm. 2.3.4. Triệu chứng bệnh của cây cao su bị nhiễm bệnh Bệnh xuất hiện trên lá, cuống lá và chồi với các triệu chứng biểu hiện rất khác nhau. - Trên lá: Vết bệnh màu đen với hình dạng xương cá dọc theo gân lá, vết bệnh lan rộng nếu điều kiện thuận lợi, gây chết từng phần, sau đó lá đổi màu vàng cam và rụng từng lá một. Trên lá non vết bệnh hình tròn màu xám đến nâu với vòng màu vàng xung quanh, có khi hình thành lỗ. Lá quăn và biến dạng, sau đó rụng toàn bộ. - Trên chồi và cuống lá: Các chồi xanh dễ nhiễm bệnh, đôi khi nấm bệnh cũng gây hại chồi đã hóa nâu. Dấu hiệu đầu tiên với vết nứt dọc theo cuống và chồi có dạng hình thoi, có mủ rỉ ra sau đó hóa đen, vết bệnh có thể phát triển dài đến 20 cm gây chết chồi, đôi khi chết cả cây. Nếu dùng dao cắt bở lớp vỏ ngoài sẽ xuất hiện những sọc đen ăn sâu trên gỗ, chạy dọc theo vết bệnh. Trên cuống lá với vết nứt màu đen có chiều dài 0,5 – 3,0 mm. Nếu cuống lá bị hại, toàn bộ lá chét bị rụng khi còn xanh mặc dù không có một triệu chứng nào xuất hiện trên phiến lá (Chee, 1988). 2.4. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR) Kỹ thuật PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1990 được sử dụng rộng rãi nhất trong số các ứng dụng của sinh học phân tử. Về thực chất đây là phương pháp tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của các tế bào (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) 2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán phát 11 hiện mầm bệnh trên người, động vật, thực vật, thực phẩm…(Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài sinh vật mục tiêu hoặc là gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000) Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2000). Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như hình 2.2. Bƣớc 1 (tách sợi đôi DNA, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, ở điều kiện này phân tử DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn, thường là ở nhiệt độ 94 - 95 C trong vòng 30 giây đến 1 phút. 12 Hình 2.2: Mô tả phản ứng PCR Bƣớc 2 (bắt cặp, annealation): trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây. Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo thành từ mạch được kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bước như trên được lặp đi lặp lại nhiều lần, làm số lượng DNA được gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính toán, sau 30 – 40 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm được nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc 13 gel polyacrylamide, sau đó tiến hành quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). 2.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR 2.4.2.1. DNA khuôn DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch, nhưng đôi khi kỹ thuật này cũng cho phép khuếch đại từ dịch DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào mà vẫn cho kết quả tốt, thông thường phương pháp này được áp dụng trong chẩn đoán. Lượng DNA được dùng trong phản ứng PCR là một lượng cực nhỏ, khoảng 1 g, ngoài ra, nếu sử dụng các enzyme polymerase cho hiệu quả cao còn có thể giảm lượng DNA khuôn xuống còn 100 ng. Nếu lượng DNA khuôn quá cao có thể tạo ra những sản phẩm không như mong muốn hay còn gọi là dương tính giả hay sản phẩm tạp nhiễm. Khuôn DNA có thể được thu nhận từ các mẫu không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần 2.4.2.2. Enzyme Thông thường, DNA polymerase dùng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu nhiệt cao. Enzyme thường được sử dụng hiện nay là Taq polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus. Ngày nay, nhiều loại enzyme chịu nhiệt khác nhau đã được phát hiện và đưa ra thị trường với chức năng hoàn thiện hơn và chuyên biệt hơn. Như enzyme Tth polymerase từ Thermus thermophilus, enzyme này hoạt động như một enzyme phiên mã ngược thông qua sự hình thành cDNA trong điều kiện RNA làm khuôn và ion Mn++, nhưng trong điều kiện DNA khuôn và ion Mg++, Tth polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. 2.4.2.3. Primer và nhiệt độ lai Primer có vai trò rất quan trọng trong tiến trình khuếch đại của phản ứng PCR. Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau: - Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc dimer primer do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer. 14 - Nhiệt độ nóng chảy của primer xuôi và primer ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các primer phải cân bằng, tránh các cặp GC lặp lại nhiều lần. - Các primer phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen. - Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và primer ngược không được quá lớn, phản ứng PCR tối ưu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1 kb. 2.4.2.4. Các thành phần khác trong phản ứng PCR - Bốn loại nucleotide thường được sử dụng với nồng độ 200 M/ mỗi loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn sẽ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. - Nồng độ Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng độ tối ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này phải được xác định riêng cho từng phản ứng. 2.4.2.5. Số lượng chu kỳ phản ứng Số lượng chu kỳ trong một phản ứng PCR thông thường không vượt quá 40 chu kỳ. Do phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm vì những nguyên nhân như sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sao vừa được tổng hợp không bắt cặp với primer mà chúng tự bắt cặp với nhau. Số chu kỳ còn tùy thuộc vào số lượng mẫu ban đầu. 15 2.4.2.6. Thiết bị và dụng cụ dùng trong phản ứng PCR Thiết bị cho phản ứng PCR như máy luân nhiệt (thermocycler) cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa sự bốc thoát hơi nước trong quá trình phản ứng. Eppendorf sử dụng trong phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng truyền nhiệt tốt. 2.5. Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease - RE) 2.5.1. Giới thiệu Trong phân tích genome, enzyme làm nhiệm vụ rất quan trọng là nhóm enzyme với thuật ngữ chung là enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE), ghi nhận các trình tự đặc biệt của nucleotide, và cắt DNA tại vị trí rất đặc biệt (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1999). Các RE được nghiên cứu lần đầu tiên vào những năm 1950. Các RE bao gồm một phần của tính chất cải biến (modification) viết tắt là M. Hệ thống R-M trong vi khuẩn giúp nó bảo vệ chống lại sự xâm nhập của thực khuẩn thể và những nhân tố lạ về di truyền. Từ kiểu hình được phân lập đầu tiên, hệ thống R- M bây giờ có thể sẵn sàng cho những phân tích di truyền rất có hiệu quả. Hệ thống R-M của vi khuẩn phá hủy những phân tử DNA lạ xâm nhập vào tế bào bằng con đường lây nhiễm, tiếp hợp, chuyển nạp. Hệ thống R-M của vi khuẩn có xu hướng tạo ra một thế cân bằng ở sinh vật nhân giả (prokaryotic) như là một hệ thống miễn dịch. Hệ thống R-M được tìm thấy trong vi sinh vật, chủ yếu là ở vi khuẩn. Nó rất đa dạng ngay cả trong cùng một tế bào. Số RE được tư liệu hóa cho đến nay trên 1200, trong đó có 17 thuốc type I, 179 type II, 4 type III rất chuyên tính, bên cạnh đó hơn 190 nhóm DNA modification methyltranferase đã và đang được định tính. Type I: Khi một enzyme nhận biết được một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài chục nucleotide. Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó. Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. 16 Type I và Type III có vai trò rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt có vai trò rất quan trọng trong trong kỹ thuật biến đổi di truyền. Hệ thống R-M thường có hai hoạt động chính: (a) một RE viết tắt là R- Enase rất chuyên tính tại một vị trí nào đó, nó có nhiệm vụ tiêu hóa DNA ngoại sinh, (b) một methyltranferase là M-Mtase có nhiệm vụ cải tiến và bảo vệ DNA nội sinh không bị tiêu hóa bởi R-Enase. 2.5.2. Định danh các enzyme Smith và Nathan (1973) đã đề nghị một hệ thống định danh thống nhất như sau: - Tên loài của sinh vật là ký chủ được xác định xong lấy chữ cái đầu tiên của genus cộng thêm 2 chữ cái của tên loài bằng 3 chữ, viết theo kiểu in nghiêng, thí dụ: Escheria coli = Eco và Haemophilus influenzae = Hin. Bảng 2.1. Một vài RE và vị trí phân cắt của nó Nguồn vi khuẩn Ký hiệu enzyme Trình tự 5’ – 3’ 3’ – 5’ Haemophilus aegyptius Staphylococcus aureus 3A Bacillus amyloliquefaciens H Escherichia coli RY13 Haemophilus influenzae Rd Providencia stuartii Seratia marcesens Xanthomonas malvacearum HaeIII Sau3AI BamHI EcoRI HindIII PstI SmaI XmaI GG/CC CC/GG GATC CTAG G/GATCC CCTAG/G G/AATTC CTTAA/G A/AGCTT TTCGA/A CTGCA/G G/ACGTC CCC/GGG GGG/CCC C/CCGGG GGGCC/C Ghi chú: Dấu “/” chỉ vị trí cắt. - Nòi của vi khuẩn được viết bằng chữ in hoa xụt xuống hàng dưới. Thí dụ, Ecok. Trong trường hợp hệ thống R-M được chuyên tính bởi virus hay plasmid 17 người ta dùng chữ viết tắt của tên là ký chủ và nguyên tố ngoại nhiễm được xác định theo sau chữ ấy, viết xuống hàng dưới ví dụ, EcoPI, EcoRI. - Khi một dòng ký chủ nào đó có nhiều hệ thống R-M khác nhau, người ta dùng số la mã đánh dấu ở phía sau. Thí dụ, HindI, HindII, HindIII… Số la mã này không phải là biểu thị loại hình enzyme. - Tất cả mọi RE đều có tên chung là “endonuclease R”, nhưng bên cạnh đó, nó còn mang thêm tên hệ thống, như R.HindIII. Tương tự, modification enzyme có tên chung là methylase M, theo sau đó là tên hệ thống. Modification enzyme của H. influenzae Rd tương hợp với endonuclease R.HindIII sẽ được ghi là M.HindIII. Trong thực tế người ta muốn việc sử dụng khi viết sao cho đơn giản, chữ nhảy xuống dưới không cần thiết, toàn bộ chữ viết tắt được ghi cùng một hàng, thí dụ, HindIII, và khi biết rõ là chỉ có RE, ký hiệu tượng trưng cho endonuclease R bị xóa bỏ (Bùi Chí Bửu Và Nguyễn Thị Lang, 1999). 2.5.3. Trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn Các RE có tính chuyên biệt với một trình tự nào đó và nó sẽ cắt nucleotide đúng vị trí xác định mà nó tìm thấy, vị trí này được gọi là trình tự mục tiêu, với số nucleotide trong chuỗi được xác định, thường là 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gen sẽ được cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc dài có kích thước khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể được thay thế bởi nucleotide khác (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Một đặc điểm của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự là hoàn toàn giống nhau nếu chúng được đọc theo chiều 5’ –3’. Như vậy vị trí cắt là giống nhau trên 2 mạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000; Desmond và Nicholl, 1994) 2.5.4. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lượng enzyme thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme được biểu hiện bằng đơn vị (unit), là lượng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA thời gian giờ ở 37 C. Phần lớn các thí nghiệm đòi hỏi phải phân cắt hoàn toàn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số 18 trường hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính toán nồng độ và thời gian ủ để đạt được sự phân cắt không hoàn toàn (Desmond và Nicholl, 1994). Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi cắt, 2 đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc biệt đặc tính cắt tạo đầu dính được ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in vitro, hai phân tử có nguồn gốc khác nhau được cắt bằng cùng một loại RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính (Desmond và Nicholl, 1994; Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000). Bảng 2.2. Các RE xếp thứ tự theo bản chất vị trí cắt của nó Đầu 5’ Đầu 3’ Đầu bằng Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự Enzyme Trình tự TaqI ClaI MboI BglII BamHI BclI HindIII NcoI XmaI XhoI EcoRI SalI XbaI T/CGA AT/CGAT /GATC A/GATCT G/GATCC T/GATCA A/AGCTT C/CATG C/CCGG C/TCGAG G/AATTC G/TCGAC T/CTAGA PstI SacI SphI BdeI ApaI KpnI CTGCA/G GAGCT/C GCATG/C GGCGC/C GGGCC/C GGTAC/C AluI FnudII DpnI HaeIII PvuII SmaI NaeI HpaI NruI BalI MstI AhaIII EcoRV AG/CT CG/CG GA/TC GG/CC CAG/CT CCC/GGG GCC/GGC GTT/AAC TCG/CGA TGG/CCA TCG/GCA TTT/AAA GAT/ATC 19 Trong quá trình thực hiện phản ứng thủy giải của enzyme cũng cần lưu ý là mỗi RE hoạt động tối ưu trong những điều kiện phản ứng nhất định, nhất là về mặt dung dịch đệm, tốt nhất là nên tuân thủ những khuyến cáo của nhà sản xuất RE sẽ giữ được hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn được bảo quản ở -20 C . Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra sau khi đã chuẩn bị đủ tất cả các thành phần khác và giữ trong đá trong khoảng thời gian càng ngắn càng tốt trước khi cất trở lại vào -20 C. Phản ứng cắt được tiến hành trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo điều kiện thuận lợi cho sự tiếp xúc của enzyme với cơ chất. Tuy nhiên cũng cần đảm bảo là thể tích của RE không vượt quá 1/10 t hể tích của phản ứng vì glycerol sẽ ức chế hoạt động của enzyme (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000) 2.5.5. Phân tích kết quả của các phản ứng cắt bằng RE Phản ứng cắt giới hạn sẽ tạo thành nhiều đoạn DNA, kích thước của chúng khác nhau tùy thuộc vào vị trí nhận biết của enzyme có trong phân tử phân tích. Do vậy cần có phương pháp xác định kích thước và số đoạn của các đoạn tạo thành. Dù phân tử có được phân cắt hay không, chúng ta cũng có thể kiểm tra thông qua độ nhớt của dung dịch. Phân tử DNA lớn hơn tạo nên dung dịch có độ nhớt cao hơn những phân tử nhỏ hơn, có nghĩa là sự phân cắt làm giảm độ nhớt của dung dịch. Tuy nhiên, những thao tác đối với số lượng và kích thước của sản phẩm tạo thành khó khăn hơn nhiều. Điều này được giải quyết vào đầu những năm 1970 khi kỹ thuật điện di được phát triển (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.5.1. Tách các phân tử bằng điện di trên gel Do phân tử DNA tích điện âm nên khi đặt phân tử DNA trong một điện trường phân tử DNA sẽ di chuyển về phía điện cực dương. Tốc độ di chuyển của phân tử DNA tùy thuộc vào hình dạng và tỉ lệ điện tích/ khối lượng của chúng. Tuy nhiên, hầu hết các phân tử DNA đều có hình dạng giống nhau và tỉ lệ điện tích/khối lượng gần như nhau nên không thể tách các phân tử DNA bằng kỹ thuật điện di chuẩn. Tuy nhiên, phân tử DNA có kích thước khác nhau có thể được phân biệt khi điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide. Gel là một mạng lưới lỗ mà phân tử DNA cần phải vượt qua để đi đến cực dương. Do vậy, phân tử nào có kích thước 20 nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn và ngược lại. Tùy theo thành phần của gel mà các phân tử DNA có kích thước khác nhau có thể được phân tách khi điện di trên gel đó (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.5.2. Quan sát các phân tử DNA trên gel Nhuộm bằng hóa chất Cách đơn giản nhất để xem kết quả điện di là nhuộm gel bằng hóa chất có thể làm cho phân tử DNA thấy được. Hóa chất thường được sử dụng để nhuộm gel là ethidium bromide. Các băng DNA có kích thước khác nhau phân tách trên gel sẽ được quan sát dễ dàng dưới ánh sáng của tia tử ngoại (Desmond và Nicholl, 1994). Ảnh phóng xạ tự ghi của những phân tử DNA đƣợc đánh dấu phóng xạ Một hạn chế của phương pháp nhuộm ethidium bromide là độ nhạy bị hạn chế. Lượng DNA của một băng nếu ít hơn 25 ng sẽ không thể hiển thị khi nhuộm gel với ethidium bromide. Một phương pháp khác là sử dụng các dấu hiệu có hoạt tính phóng xạ để đánh dấu các phân tử DNA. Khi đó, DNA có thể được quan sát khi đặt lên bản gel một tấm phim nhạy cảm với tia X. Phân tử DNA cũng có thể được đánh dấu bằng cách gắn các nucleotide có mang đồng vị Phospho phóng xạ P32. Ngoài ra, một số phương pháp khác cũng cho phép đánh dấu các phân tử DNA (Desmond và Nicholl, 1994). 2.5.6. Bản đồ giới hạn Hầu hết các đoạn DNA đều có trình tự nhận biết đối với những enzyme khác nhau. Điều này có lợi vì nó cho biết vị trí tương đối của những vị trí cắt này. Kỹ thuật thu nhận những thông tin như vậy được gọi là lập bản đồ giới hạn (restriction mapping). Việc này liên quan đến việc sử dụng enzyme cắt riêng lẻ và sau đó cắt kết hợp bằng nhiều enzyme, các đoạn được tạo thành được chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra kích thước. Từ những dữ liệu thu được ta có thể lập được bản đồ giới hạn (Desmond và Nicholl, 1994). 2.6. Vùng ITS (internal transcribed spacer) và vai trò của nó trong nghiên cứu đa dạng di truyền Hiện nay, vùng ITS có lẽ là vùng DNA được giải trình tự rộng rãi nhất ở loài nấm. Nó là một công cụ hữu dụng nhất cho hệ thống phân tử ở cấp độ loài (species) và trong cùng loài (within species), ví dụ như xác định các nòi địa lý. Do mức độ biến dị của nó 21 cao hơn các vùng khác của rDNA, sự biến dị giữa các đoạn lặp rDNA riêng biệt có thể được quan sát ở cả trong vùng ITS và vùng IGS (intergenic spacer region) ( Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS ở nấm. Ghi chú: LSU: large subunit SSU: small subunit IGS: intergenic spacer Nguồn: Hình 2.4: Lƣợc đồ các primer trên vùng ITS. Nguồn: 22 Hiện nay, có nhiều primer được thiết kế để khuếch đại vùng ITS và một số primer đã được phát triển nhằm khuếch đại chọn lọc hơn trình tự vùng ITS ở nấm. Bảng 2.3: Một số primer và trình tự của nó dùng trong nghiên cứu vùng ITS của nấm Tên primer Trình tự 5’ – 3’ Tác giả ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al, 1990 ITS 2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC White et al, 1990 ITS 3 GCATCGATGAAGAAAACGCAGC White et al, 1990 ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al, 1990 ITS 5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG White et al, 1990 ITS1-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes & Bruns, 1993 ITS4-B CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 1993 5,8S CGCTGCGTTCTTATCG Vilgalys lab. 5,8SR TCGATGAAGAACGCAGCG Vilgalys lab. Nguồn: 2.7. Tình hình nghiên cứu về C. cassiicola trong và ngoài nƣớc 2.7.1. Những nghiên cứu về C. cassiicola ngoài nƣớc C. cassiicola đã được nghiên cứu khá nhiều ở nhiều nước trên thế giới, do C. cassiicola có phổ ký chủ rộng (gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau). Ngoài những nghiên cứu về tình hình và khả năng gây hại của C. cassiicola ở các khu vực khác nhau, C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau cũng đã được nghiên cứu và so sánh mức độ khác biệt về di truyền và tìm hiểu khả năng nhận biết các dòng C. cassiicola, cũng như mức độ và khả năng gây độc của C. cassiicola. Kết quả của những nghiên cứu này cho thấy, tính độc của C. cassiicola ngày càng phát triển đa dạng và rất biến thiên, khả năng gây độc của C. cassiicola trên các dvt cao su khác nhau, tùy theo giai đoạn sinh trưởng. C. cassiicola có khả năng tổng hợp các enzyme phân giải pectin và enzyme phân giải cellulose ngoài cơ chế biến dưỡng độc tố (C.K. Jayashinge, 2000). 23 Nghiên cứu biến dị di truyền của 42 isolates nấm C. cassiicola trên các ký chủ khác nhau bằng phương pháp RAPD – PCR của Silva và các cộng sự (1995) cho thấy, có 5 nhóm di truyền đã được xác định, điều này có nghĩa là có sự khác biệt di truyền đáng kể giữa các isolates nấm C. cassiicola thu thập từ các ký chủ khác nhau. Những kết quả nghiên cứu này làm cho việc nghiên cứu tạo các dvt cao su kháng bệnh trở nên dễ dàng hơn (Silva và cộng sự, 2003). Những khác biệt về di truyền của nấm bệnh C. cassiicola trên ký chủ khác nhau đã được nghiên cứu bằng phân tích đa hình RFLP trên vùng ITS (internal transcribed spacer) của ribosome DNA và đa hình các đoạn DNA được khuếch đại từ DNA tổng số. Các chủng C. cassiicola có thể được phân biệt với các loài lân cận thuộc giống Helminthosporum dựa trên kích thước của vùng ITS được khuếch đại, nhưng không thể phân biệt rõ ràng vì vùng ITS của các isolates có kích thước giống nhau và phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn cũng cho những kết quả giống nhau. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD đã phát hiện được khác biệt đáng kể giữa một số isolates C. cassiicola. Phân tích theo nhóm các đoạn DNA được khuếch đại cho thấy 5 isolates được xếp vào 3 nhóm di truyền khác nhau tương ứng với nguồn gốc ký chủ và đặc điểm hình thái. Các kỹ thuật này có thể được mở rộng để nghiên cứu biến dị trong cùng isolates C. cassiicola trên cây cao su ở Sri Lanka, nơi mà các chủng C. cassiicola độc tính cao đã xuất hiện đe dọa nghiêm trọng cho ngành công nghiệp cao su thiên nhiên của nước này (Silva và cộng sự, 2002). Safiah Atan và Noor Hisham Hamid (2003) đã sử dụng kỹ thuật RAPD và khuếch đại vùng ITS để phân tích 9 isolates nấm C. cassiicola từ Hevea brasiliensis. Kỹ thuật RAPD với các primer ngắn đã cho phép phân biệt được 2 nhóm isolates, là isolates gây nhiễm cho các dvt RRIM 2020 và nhóm isolates gây nhiễm cho các dvt RRIM 600 và các dvt cao su khác. Kỹ thuật khuếch đại vùng ITS cho thấy 8/9 isolates là đơn hình khi phân tích sản phẩm khuếch đại bằng các enzyme cắt giới hạn. Silva và cộng sự (1998) kết hợp nghiên cứu đặc điểm hình thái, độc tính và đặc điểm phân tử của nấm C. cassiicola thu nhận từ các đồn điền cao su ở Sri Lanka. 32 isolates C. cassiicola được thu nhận từ phổ ký chủ rộng và địa điểm khác nhau đã được phân tích RFLP trên vùng ITS được khuếch đại và kỹ thuật RAPD khuếch đại hệ gen C. cassiicola bằng các primer ngẫu nhiên. Vùng ITS cho kết quả giống nhau 24 ở tất cả các isolates khi phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn. Tuy nhiên, kỹ thuật RAPD đã phát hiện sự đa hình rất lớn giữa các isolates, phân tích các dữ liêu thu thập được từ việc sử dụng 15 oligonuceotide primer đã xác định được có 7 nhóm RAPD khác nhau, các isolates có sự tương quan rất lớn giữa nhóm RAPD và vị trí phân lập cũng như kiểu gen của cây trồng ký chủ mà từ đó các isolates được phân lập. Ngoài ra, cũng có mối tương quan giữa nhóm RAPD với tỷ lệ tăng trưởng của isolate và tính độc trên các cây trồng ký chủ khác nhau. 2.7.2. Những nghiên cứu về C. cassiicola trong nƣớc Bệnh rụng lá Corynespora được phát hiện lần đầu tiên ở nước ta vào tháng 09/1999 tại Trạm Thực Nghiệm Cao Su Lai Khê, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam. Do bệnh là đối tượng kiểm dịch loại 2, nên khi vừa phát hiện, Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam, cùng với Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Vùng II và Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam đã thống nhất loại bỏ tất cả những dvt mẫn cảm nhằm dập tắt nguồn bệnh ngay từ ban đầu (Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam, 2004). Những nghiên cứu về bệnh rụng lá Corynespora ở Việt Nam hiện nay mới chỉ dừng lại ở việc quan sát đánh giá tình hình bệnh, kiểm tra tính kháng của một số dvt cao su. Việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để nghiên cứu về C. cassiicola chưa nhiều. 25 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 03/2005 đến tháng 08/2005. 3.1.2. Địa điểm - Thu thập một số mẫu trên đồng ruộng, tiến hành tại Bến Cát, Bình Dương và An Lộc, Đồng Nai. - Tiến hành phân lập C. cassiicola tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật,Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam - Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương. - Tiến hành phân tích RFLP - PCR tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật – Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hoá Sinh Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu Một số mẫu lá cao su thuộc các dvt cao su khác nhau có biểu hiện các triệu chứng đặc trưng và không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora. 3.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Phân lập nguồn nấm C. cassiicola 3.2.2.1. Hóa chất và dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pence, lame, lamelle, giá đỡ ống nghiệm, becher, kính hiển vi quang học, nồi hấp Tommy, tủ sấy, hộp đựng mẫu, giấy thấm nước, bút lông… Môi trường PSA hoặc PDA (tự pha chế theo công thức do Chee đề xuất năm 1988). Thuốc nhuộm Methylene blue. Thành phần môi trƣờng PSA: Khoai tây 100 g 26 Đường sucrose 10 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Thành phần môi trƣờng PDA: Khoai tây 200 g Đường glucose 2 0 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml Cách nấu môi trƣờng PSA: Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 100g, thái nhỏ hạt lựu, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong. Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc. Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 10g đường sucrose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu. Phân vào các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút. Môi trường PDA được thực hiện tương tự như môi trường PSA. 3.2.2.2.Phƣơng pháp lấy mẫu Mẫu được lấy vào buổi sáng sớm khi độ ẩm không khí còn cao, bào tử còn nằm trên lá và chưa phát tán vào không khí. Thông thường, mẫu được lấy trước 8h sáng. Mẫu được ghi rõ tên dvt lấy mẫu, địa điểm lấy mẫu, lá non hay lá già, vết bệnh đặc trưng hay không đặc trưng. Mẫu lá bệnh được đặt vào hộp có đặt giấy thấm nước để giữ ẩm. 3.2.2.3.Phƣơng pháp phân lập Mẫu nấm được phân lập từ vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynespora. Cách thực hiện như sau: Lấy lá bệnh đưa về phòng thí nghiệm, rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần, dùng que cấy nấm đã khử trùng ướt và khô, sau đó đốt trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội lấy trực tiếp bào tử ngay trên vết bệnh cấy vào đĩa môi trường (5 điểm/đĩa). Phương pháp phân lập từ một bào tử, sau hai ngày những khuẩn lạc nghi ngờ là nấm C. cassiicola được cấy sang đĩa môi trường 27 mới (môi trường PDA) và đặt dưới ánh sáng đèn huỳnh quang 12h/ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng (26 - 30ºC). Khi nấm phát triển, tiến hành cấy chuyền sang môi trường mới cho đến khi thu được nguồn nấm thuần chủng. Trong phân lập nấm C. cassiicola thường lấy bào tử ở mặt dưới của phiến lá. Bề mặt dưới của phiến lá là nơi thuận lợi cho sự phát triển của nấm hơn bề mặt trên của lá. Tầng cutin mỏng giúp nấm xâm nhập vào mô lá dễ dàng hơn, nấm ít chịu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường, đặc biệt là tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời. Sử dụng phương pháp phân lập như trên có thể thu nhận được nguồn nấm C. cassiicola đơn bào tử. Tuy nhiên, cần lưu ý là phương pháp này chỉ thực hiện được đối với nấm C. cassiicola do kích thước của bào tử nấm C. cassiicola tương đối lớn. Với phương pháp phân lập như trên, sau khi phân lập các mẫu nấm cần phải được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình thái sợi nấm và bào tử của nấm C. cassiicola dưới kính hiển vi. Nấm C. cassiicola rất khó tạo bào tử trên môi trường nhân tạo, để tạo được bào tử C. cassiicola trên môi trường nhân tạo có thể tiến hành theo phương pháp sau. Phƣơng pháp tạo bào tử nấm C. cassiicola nấm trên môi trƣờng PSA Các mẫu nấm sau khi thuần được cấy vào đĩa Petri có chứa 10 ml môi trường PSA. Nuôi cấy trong điều kiện tối liên tục 24/24h ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 5 ngày. Sau 5 ngày nuôi cấy sử dụng một tấm lame vô trùng cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc để kích thích sợi nấm tạo bào tử. Tiếp tục nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn 24/24h ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau thời gian trên tiến hành kiểm tra lại nguồn nấm bằng cách soi bào tử dưới kính hiển vi (đặt bào tử trong giọt nước cất hoặc giọt dung dịch methylene blue). Hình dạng bào tử được so sánh với những mô tả của Ellis và Holiday (1971). Các nguồn nấm được xác định chính xác là nấm C. cassiicola sẽ được sử dụng vào những phân tích tiếp theo. 3.2.2. Khuếch đại vùng ITS bằng kỹ thuật PCR 3.2.2.1. Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR 28 Các dòng nấm C. cassiicola sau khi đã phân lập thuần đƣợc chuyển sang môi trƣờng lỏng, tiến hành nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút), điều kiện nhiệt độ 26 - 30 C. Sau 4 ngày tiến hành thu sinh khối sợi nấm. Cần lƣu ý là sợi nấm phải khô và nên giữ nguồn sợi nấm ở -70 C. Hóa chất và dụng cụ ly trích - Becher, phễu lọc, giấy thấm, nitơ lỏng, phenol, chloroform, isoamyl alcohol, lysis buffer, isopropanol, TE 1X, ethanol 100%, ethanol 70%. - Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex. Phương pháp ly trích Khuôn mẫu cho phản ứng PCR là DNA của sợi nấm của các mẫu phân lập được. Phương pháp ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của Lee & Taylor (1990). Quy trình ly trích DNA tổng số nấm C. cassiicola 1) Nuôi trong môi trường lỏng. 2) Giữ sợi nấm ở - 70 C. 3) Lấy 1g sợi nấm khô kiệt vào cối và nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. 4) Chuyển phần bột nấm vào ống eppendorf. Ở bước này, cố gắng giữ cho bột nấm được nghiền không tan. 5) Thêm 400 l lysis buffer, trộn đều hỗn hợp. 6) Ủ ở 65 C trong 1 giờ. 7) Di chuyển ống nghiệm ra khỏi dung dịch nước ấm (ra khỏi bồn ủ nhiệt). 8) Thêm vào 300 l phenol: chlorophorm và isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ (lúc này dung dịch có màu trắng đục). Ly tâm 14 000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 9) Chuyển phần trên ống eppendorf sang một eppendorf khác với thể tích 300 l và kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ và cẩn thận. DNA sẽ kết tủa dạng sợi màu trắng đục. 29 10) Ly tâm 14 000 vòng trong 1 phút ở 28 C. 11) Cẩn thận đổ bỏ phần dịch lỏng. Dùng ethanol 70 % rửa sạch nhiều lần DNA. 12) Làm khô DNA, hoà tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4 C hay – 20 C cho đến khi sử dụng 3.2.2.2 Thực hiện phản ứng PCR Hóa chất và dụng cụ Các primer: 2 primer được sử dụng trong nghiên cứu là ITS A và ITS B được mô tả bởi Silva và cộng sự (1998), hai primer này được thiết kế để khuếch đại một đoạn DNA có kích thước 540 nằm trong vùng ITS 1 và ITS 2 của nấm C. cassiicola. Trình tự của các primer ITS A và ITS B như sau: Primer Trình tự 5’- 3’ ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Hoá chất, các enzyme và dung dịch dùng trong phản ứng PCR và điện di: Taq DNA polymerase (Biorad). PCR buffer(Biorad). dNTP’s (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) (Biorad). MgCl2 (Biorad). DNA ladder. (Biorad). Ethidium bromide. Dịch đệm TAE 0,5X. Loading buffer 6X, gel agarose. Dụng cụ thí nghiệm: Eppendorf các loại: 0.2ml, 0.5 ml, 1.5ml. Micropippette và các đầu típ. Lò vi sóng. Cân kỹ thuật 4 số. Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad). UV transilluminator (Biorad). 30 Máy chụp ảnh (DNA photography equipment) (Biorad). Máy thermal cycle (thực hiện phản ứng PCR). Thành phần hoá chất và chu kỳ phản ứng PCR Thành phần hóa chất của phản ứng PCR: Thành phần hóa chất (bảng 2.2): dNTP, 10X PCR buffer, MgCl2, primers, Taq polymerase. Nước cất: thêm vào cho đủ một phản ứng PCR (25 l). Khuôn mẫu DNA: sử dụng 1 l DNA cho phản ứng PCR 25 l. Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR. Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM 10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X MgCl2 1 25mM 1 mM ITS A 1 25pM/ l 25pM ITS B 1 25 M 0,5 M Taq polymerase 0,1 5U Khuôn mẫu 1 Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của Silva và cộng sự năm 1998. Chu kỳ của phản ứng PCR: tổng cộng có 41 chu kỳ (Siva và cộng sự, 1998) - Chu kỳ 1: Biến tính: 94 C 3phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 39 chu kỳ tiếp theo. Biến tính: 94 C 3 phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. 31 Kéo dài: 72 C 1 phút - 1 chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 9 phút. Tùy theo sản phẩm PCR thu đƣợc, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh để thu đƣợc sản phẩm PCR tối ƣu nhất dùng trong các phân tích tiếp theo. 94 C 94 C 94 C 72 C 72 C 72 C 54 C 54 C 54 C (1X) (39X) (1X) Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm. 3.2.2.4. Đọc kết quả phản ứng PCR Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose. - Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 1%). - Đun sôi khoảng 1- 2 phút trong lò vi sóng. - Để nguội đến 40 – 50 C ở nhiệt độ phòng. - Đổ gel vào bể điện di (đặt lược vào giếng trước khi đổ gel), chú ý không để bọt khí trên gel. - Để nguội khoảng 30 phút, cho gel đông cứng, rút lược khỏi gel, đặt bản gel vào bể điện di sao cho gel ngập trong dung dịch TAE từ 1 – 1,5 cm. 32 - Trộn 3 l sản phẩm PCR với 1,5 l loading dye 6X trên mặt giấy parafin. Cho hỗn hợp vào giếng của gel, bao gồm giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và giếng chứa mẫu. - Vận hành máy điện di ở hiệu điện thế 50V. Sau khi hoàn tất quá trình điện di, bản gel được lấy ra khỏi bồn điện di và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong khoảng 15 – 20 phút và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel (Biorad). 3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) Sản phẩm PCR thu được sẽ được phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn để xem xét có sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu phân tích hay không. 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ dùng trong phân tích RFLP sản phẩm PCR - Các enzyme cắt giới hạn EcoRI, MspI, CfoI, HaeIII, Sau3A, RsaI (Roche, Germany). - Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola. - Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad). - Dung dịch ethidium bromide . - Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml. 3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP Sản phẩm PCR sẽ được phân cắt riêng rẽ bằng các enzyme EcoRI, MspI, CfoI, HaeIII, RsaI, Sau3AI (Roche, Germany). Thành phần của một phản ứng RFLP như sau (xem thêm bảng 3.3). - Enzyme : 1 đơn vị enzyme. - Enzyme buffer: 2,5 l. - Sản phẩm PCR: 8 l. - Nước: thêm vào cho đủ một phản ứng (25 l). Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP. Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme Buffer enzyme Sản phẩm PCR Nước 0,1 2,5 8 10 U/ l 10 X 1U 1X 33 vừa đủ phản ứng 25 l Phản ứng cắt của enzyme được thực hiện bằng cách ủ mẫu với các thành phần như trên trong bồn ủ nhiệt, điều kiện nhiệt độ 37 C trong thời gian 3-14 giờ, sau đó tiến hành bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 65 C trong thời gian 15 phút (tùy theo mỗi enzyme mà có hay không có bước này). Sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu nghiên cứu được thể hiện khi kích thước của sản phẩm sau phản ứng khác nhau ở các mẫu. Kiểm tra sự khác biệt về kích thước của sản phẩm cắt bằng cách điện di trên gel agarose 2% - 3%(w/v) và quan sát kích thước của các đoạn DNA tạo thành bằng cách nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp ảnh DNA bằng máy chụp gel (Biorad). 34 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm C. cassiicola gây ra là một bệnh mới ở Việt Nam. Đây là một bệnh rất nguy hiểm, một khi xảy ra dịch bệnh sẽ gây ảnh hưởng rất lớn đến năng suất mủ cao su. Bệnh này gây rụng lá toàn bộ đối với cây cao su bị nhiễm bệnh nặng. Bệnh rụng lá Corynespora đã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và gây thiệt hại kinh tế rất đáng kể, nhất là các nước sản xuất cao su thiên nhiên (Jayashinghe, 1997). Những nghiên cứu trước đây trên thế giới cho thấy khả năng gây hại của nấm rất lớn, đã có 6 chủng nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei được ghi nhận là gây hại cho cao su tại Malaysia và 7 chủng tại Ấn Độ (Sabu và cộng sự, 2000). C. cassiicola rất dễ hình thành nòi mới khi có điều kiện thích hợp và độ ẩm lớn hơn 90%, phát tán và lây lan mạnh chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm của dvt, điều kiện môi trường và tính độc hại của tác nhân gây bệnh. Đây là ba yếu tố chính dẫn đến sự phát sinh, phát triển bệnh cũng như quyết định mức độ bệnh (Jayashinghe và Silva, 1996; Jayashinghe, 2000). Nói chung, tính đặc thù của nấm là khả năng biến đổi nhanh chóng với ký chủ mới. Về mức độ ảnh hưởng không giống các bệnh về lá khác hiện có tại Việt Nam bởi tác hại của bệnh rất lớn và ảnh hưởng nghiêm trọng đến cây cao su, phạm vi gây hại rộng từ lá non, lá già, cuống lá, chồi và từ vườn ương, vườn kiến thiết cơ bản đến vườn cây khai thác. Ở Việt Nam, bệnh này chưa bùng phát mạnh nhờ hiệu quả của công tác quản lý dịch bệnh. Những dvt mẫn cảm với bệnh này đều bị loại bỏ và được khuyến cáo không trồng. Khi phát hiện vườn cây có bệnh, tiến hành cưa bỏ toàn bộ, đốt cháy để hạn chế sự phát tán mầm bệnh. Những khu vực phát hiện bệnh này là Miền Đông Nam Bộ (Bình Dương, Đồng Nai), miền Bắc (Hà Tây, Nghệ An). Những đợt điều tra bệnh lá trên cây cao su gần đây ở tỉnh Tây Ninh và khu vực Tây Nguyên chưa phát hiện thấy có bệnh này. Về địa điểm lấy mẫu: mẫu bệnh rụng lá Corynespora được thu thập ở hai địa điểm là Vườn Dự Án Giống và Vườn Lưu Trữ Giống thuộc Bộ Môn Giống – VNCCSVN (Bình Dương), và vườn kiểm định bệnh An Lộc (Đồng Nai). Chúng tôi tiến hành thu 35 thập mẫu bệnh trên nhiều dvt khác nhau (bảng 4.1), sau đó tiến hành phân lập nấm C. cassiicola từ các mẫu bệnh. Bảng 4.1: Các dvt cao su đƣợc lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trƣng/ không đặc trƣng). Số thứ tự Dvt cao su được lấy mẫu bệnh Đặc điểm triệu chứng bệnh Nơi lấy mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 RRIV 2 RRIV4 MT/C/5 MT/C/4 AC/B/18 AC/B/17 LH 97/164 LH 96/347 RRIC 121 MTIT 14 MTIT 16 RO/CM/10 FX 2840 AC 88 PB 255 PB 260 MTI2 ROT5 LH 97/167 LH 82/008 LH 83/152 VM 515 VE2 LH 82/104 LH 82/183 RRIC 100 RRIC 102 GU 969 IAN 6323 LH 82/156 LH 83/161 Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai Trong quá trình thu thập mẫu trên đồng ruộng, chúng tôi nhận thấy bệnh Corynespora có biểu hiện triệu chứng rất khác nhau, thay đổi tùy theo tính mẫn cảm 36 của dvt đối với nấm bệnh. Ngoài triệu chứng điển hình (hình 4.1), bệnh còn biểu hiện ở những vết bệnh tròn, tâm đen có quầng màu vàng bao quanh (hình 4.2), triệu chứng này có thể gây nhầm lẫn giữa bệnh rụng lá Corynespora với bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioidies gây ra trên lá trưởng thành nhưng không u lồi mà trơn láng khi dùng tay vuốt nhẹ (hình 4.3). Hình 4.1: Triệu chứng đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora – vết bệnh hình xƣơng cá (fish bone). Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora. Dấu mũi tên chỉ vị trí vết bệnh. Vết bệnh phóng lớn (góc trái). 37 Hình 4.3: Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do Colletotrichum gloeosporioidies gây ra trên cây cao su. Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN a) b) Hình 4.4: Bào tử của nấm C. cassiicola dạng đơn dƣới kính hiển vi quang học (a, b) và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioidies (c). Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN 38 Sau khi phân lập, các mẫu nấm được kiểm tra lại bằng cách làm tiêu bản và quan sát bào tử dưới kính hiển vi, kết quả cho thấy, có 7 mẫu lá phân lập được nấm C. cassiicola, phần lớn các mẫu nấm là nấm Colletotrichum gloeosporioidies, phân biệt rất dễ dàng bằng bào tử (hình 4.4) Qua tiến trình phân lập chúng tôi thu nhận được 7 mẫu nấm C. cassiicola từ 7 dòng vô tính cao su khác nhau, đại diện cho các biểu hiện triệu chứng và địa điểm khác nhau (bảng 4.2). Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập đƣợc nấm C. cassiicola Số thứ tự Dòng vô tính phân lập được C. cassiicola Đặc điểm triệu chứng Địa điểm lấy mẫu 1 2 3 4 5 6 7 RRIV 2 RRIV4 AC 88 RO/CM/10 MT/C/5 LH 82/008 LH 83/152 Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai Để dễ dàng trong việc phân tích, mẫu nấm được phân lập từ dòng vô tính cao su nào sẽ được gọi tên theo dòng vô tính cao su đó. Đặc điểm chung của các mẫu nấm phân lập từ các dvt cao su khác nhau là khuẩn lạc có màu xám, sợi nấm mọc thành những đường tròn đồng tâm. Khuẩn lạc mọc dầy và tụ lại. Khi quan sát bằng cách lật ngược đĩa petri có thể nhận thấy những đường tròn đồng tâm, nấm nuôi cấy lâu ngày sẽ tạo sắc tố màu đen. Ở điều kiện nuôi cấy bình thường, nấm C. cassiicola rất khó hình thành bào tử. Hình 4.5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng PDA. 39 4.2. Kết quả ly trích DNA từ các mẫu nấm Các mẫu nấm được xác định là nấm C. cassiicola được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường potato dextrose broth (môi trường PDA không có agar), thu sinh khối sợi nấm và tiến hành ly trích DNA. Từ hình 4.5 cho thấy, các nguồn nấm đều cho kết quả ly trích DNA rất tốt. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (là RNA) có thể loại bỏ phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNase. Tuy nhiên, nguồn DNA này sau đó có thể sử dụng làm DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR mà không cần phải tiến hành tinh sạch. Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau. 4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola Những trình tự DNA mã hóa cho rRNA đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu mối quan hệ về mặt phân loại và biến dị di truyền của các loài nấm. Những nhóm gen mã hóa cho rRNA được tìm thấy ở cả nhân và ti thể, bao gồm những vùng bảo tồn và có khả năng biến dị, vùng này gồm những gen mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ rRNA 5,8S và tiểu đơn vị lớn của rRNA (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Vùng nằm giữa các tiểu đơn vị gọi là vùng internal transcribed spacers (ITS) và vùng nằm giữa các nhóm gen gọi là intergenic spacers (IGS), hai vùng này có khả năng biến dị nhiều hơn là những trình tự mã hóa cho các tiểu đơn vị rRNA và được sử dụng rộng rãi hơn trong những nghiên cứu về mối quan hệ giữa các loài trong cùng một giống (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Vùng ITS bao gồm hai vùng có khả năng biến dị nhưng không có chức năng mã hóa, là những vùng trong các rDNA lặp lại, giữa tiểu đơn vị có tính bảo tồn cao (tiểu DNA tổng số Phần tạp 40 540 bp sản phẩm PCR 1000 bp 500 bp 100 bp Sản phẩm phụ của phản ứng PCR đơn vị 5,8S) và các gen mã hóa cho tiểu đơn vị lớn rRNA. Vùng ITS rất hữu ích cho những nghiên cứu về đặc điểm phân tử của nấm (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Cặp primer ITS A và ITS B được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của sinh vật eukaryote có khả năng khuếch đại vùng DNA có khả năng biến đổi nằm giữa đầu 3’ của rDNA 18S và đầu 5’ của rDNA 28S, vùng này bao gồm cả gen rDNA 5,8S được nằm chồng qua bởi hai vùng ITS (ITS 1 và ITS 2) (Silva và cộng sự, 1998). Những primer này khuếch đại hữu hiệu một đoạn DNA duy nhất từ DNA hệ gen của nấm. Kích thước của đoạn DNA khuếch đại được là 540 bp (hình 4.7). Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR một số mẫu nấm C. cassiicola. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5. L3: RRIV 2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: LH 83/152 Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của Silva và các cộng sự (1998). Hình 4.7 cho thấy, sử dụng quy trình trên đã cho phép khuếch đại được vùng ITS mong muốn. Tuy nhiên, kết quả điện di trên gel agarose cũng cho thấy ngoài sản phẩm chính còn có các sản phẩm phụ không mong muốn. Sản phẩm PCR có sản phẩm phụ có thể là do một số nguyên nhân như primer quá nhiều, thời gian của bước kéo dài kéo dài hơn mức cần thiết, lượng DNA khuôn mẫu sử dụng nhiều cũng làm xuất hiện sản 41 phẩm phụ, và phản ứng có quá nhiều chu kỳ. Trong điều kiện cho phép chúng tôi đã thay đổi lượng primer sử dụng và đã thu nhận được sản phẩm PCR đặc hiệu hơn như hình 4.8. Tuy nhiên, ngoài yếu tố primer chúng tôi cũng đã kiểm tra các yếu tố khác có ảnh hưởng như thế nào đến sự khuếch đại một đoạn DNA trong vùng ITS của nấm C. cassiicola. Kết quả cho thấy các yếu tố khác không tạo ra sự ảnh hưởng đáng kể nào lên sản phẩm PCR tạo thành và chúng tôi không đưa ra thảo luận ở đây. Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận đƣợc sau khi giảm lƣợng primer dùng trong phản ứng PCR. L1: MT/C/5. L2: RRIV 2 L3: RRIV4 L4: AC 88 L5: LH 83/152 L6: LH 82/008 L7: LH 83/152. Sản phẩm PCR của 7 mẫu phân lập được kiểm tra kích thước và so sánh với các đối chứng dương khác (sử dụng quy trình tương tự để khuếch đại vùng ITS của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae) (hình 4.9). Qua hình 4.9, chúng tôi nhận thấy, phản ứng PCR với cặp primer ITS A và ITS B cũng có khả năng khuếch đại được vùng ITS của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae. Điều này là hợp lý vì cặp primer này được thiết kế cho vùng bảo tồn ITS, và hầu hết các nấm đều có vùng này. Theo chúng tôi, nếu sử dụng kỹ thuật này để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora do nấm C. cassiicola gây ra dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS 1, ITS 2 bằng cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả, vì sản phẩm PCR thu được có kích 42 thước giống nhau (540 bp) ở các loài nấm khác, điều này không cho phép nhận dạng nấm C. cassiicola dựa trên sản phẩm khuếch đại của vùng ITS1, ITS2. Hình 4.9: Kiểm tra kích thƣớc sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola và so sánh với sản phẩm PCR của nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae . L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: Beauveria bassiana L10: Metarhizum anisopliae L11: Đối chứng âm Ghi chú: Hai nguồn nấm Beauveria bassiana và Metarhizum anisopliae do Bộ môn BVTV – Khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm TP.HCM cung cấp. Kết quả này cũng cho thấy cần phải tìm ra một vị trí khác trên DNA hệ gen đặc trưng hơn cho C. cassiicola, để việc chẩn đoán bệnh do C. cassiicola gây ra nhanh chóng và chính xác hơn. Việc nghiên cứu về gen mã hóa cho protein độc tố cassiicoline có thể giúp giải quyết được vấn đề này. Đây có thể là hướng đi sẽ được nhiều phòng thí nghiệm lựa chọn trong tương lai. 4.4 Phân tích đa dạng vùng ITS của nấm C. cassiicola RFLP là một kỹ thuật mới được ứng dụng rộng rãi trong phân tích đa dạng di truyền. Trong kỹ thuật này chủ yếu ứng dụng các enzyme cắt giới hạn nhằm phân cắt một đoạn DNA hoặc cả hệ gen của một sinh vật nào đó. Nếu hai sinh vật có sự giống nhau về mặt di truyền khi phân cắt bằng RE sẽ tạo thành những đoạn DNA có kích thước giống nhau, số đoạn DNA tạo thành cũng giống nhau. Phương pháp RFLP 500 bp 540 bp 43 nguyên bản đòi hỏi phải trải qua giai đoạn Southern blot. Do vậy, trong phân tích đa dạng di truyền của các loài nấm, đặc biệt là phân tích đa dạng di truyền trong cùng loài, phương pháp RFLP – PCR được ứng dụng phổ biến hơn. Kỹ thuật này có nghĩa là sử dụng các RE để phân cắt sản phẩm PCR một đoạn gen hay một đoạn DNA nào đó, không trải qua giai đoạn southern blot. Sau khi phân cắt bằng các RE, sản phẩm sẽ được phân tích bằng cách điện di trên gel để xem xét có hay không có sự đa hình kích thước của các đoạn DNA tạo thành. Kỹ thuật này đơn giản hơn kỹ thuật RFLP thông thường. Hiện nay, RFLP – PCR được ứng dụng nhiều trong phân loại, nhất là phân loại ở mức độ dưới loài (đã ứng dụng thành công đối với nấm Verticilium, Rhizoctonia và Fusarium) (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Do sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu nên được sử dụng trực tiếp vào phân tích RFLP mà không cần phải tinh sạch. Sản phẩm PCR của nấm C. cassiicola được phân cắt riêng rẽ bằng các enzyme cắt giới hạn CfoI, EcoRI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI. Sản phẩm tạo thành được phân tích bằng cách điện di trên gel agarose. Chúng tôi nhận thấy mỗi enzyme đều tạo ra các sản phẩm giống nhau ở tất cả các mẫu khảo sát (hình 4.10, hình 4.11, hình 4.12, hình 4.13, hình 4.14, hình 4.15). Hình 4.10: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoRI. L1: DNA ladder L5: AC 88 L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10 L3: RRIV2 L7: LH 82/152 L4: RRIV4 L8: LH 82/008 300 bp 200 bp 44 Hình 4.11: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme MspI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm PCR bởi enzyme CfoI. Ghi chú L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 300 bp 100 bp Sản phẩm PCR cắt không hoàn toàn 400 bp 100 bp 45 Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme RsaI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: sản phẩm PCR trƣớc khi cắt. Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HaeIII. L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 400 bp 100 bp 400 bp 100 bp Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme Sau3AI. Ghi chú: L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: Sản phẩm PCR khi chƣa cắt 300 bp 100 bp Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cắt bằng enzyme EcoRI, chúng tôi thu được hai đoạn DNA có kích thước khoảng 240 bp và 300 bp. Sự phân cắt bằng enzyme HaeIII tạo thành hai đoạn DNA có kích thước khoảng 390 bp và 160 bp. Những kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước đây của Silva và cộng sự (1998), Safiah và cộng sự (2003). Sự phân cắt bằng RE khi điện di trên gel agarose cho phép ước lượng kích thước của những đoạn DNA tạo thành dựa vào thang DNA chuẩn. Tuy nhiên, chúng tôi không thể so sánh những kết quả mà chúng tôi thu nhận được khi cắt sản phẩm PCR bằng những enzyme khác với những kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới do không có số liệu và những nghiên cứu ở mức độ phân tử của nấm C. cassiicola hiện nay chưa nhiều. Trong thí nghiệm của chúng tôi, hầu hết các RE được sử dụng chỉ tìm thấy một vị trí cắt ngoại trừ enzyme CfoI có thể có đến 3 vị trí cắt khác nhau. Kết quả điện di cho thấy, khi cắt bằng CfoI chỉ thu nhận được 2 đoạn DNA, một đoạn có kích thước khoảng 300 bp, một đoạn có kích thước khoảng 100 bp. Điều đó có nghĩa là ngoài 2 đoạn DNA đó còn có những đoạn DNA khác không thể quan sát được, có thể do nguyên nhân sau: lượng DNA quá ít, nhuộm bằng ethidium bromide không cho phép nhận biết sự có mặt của đoạn DNA này. Ngoài enzyme CfoI, khi phân cắt bằng enzyme Sau3AI, các đoạn DNA vừa tạo thành có tổng kích thước không bằng kích thước của sản phẩm PCR, điều này được giải thích tương tự như trường hợp xảy ra với enzyme CfoI. Mặc dù các mẫu phân tích có biểu hiện triệu chứng khác nhau trên lá cao su, nhưng khi phân tích đa hình vùng ITS bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận thấy bất cứ sự khác biệt nào ở vị trí cắt của các enzyme đã sử dụng. Các mẫu thu nhận ở 2 khu vực khác nhau cũng cho kết quả giống nhau khi phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. Tuy nhiên, số lượng mẫu phân tích còn ít nên chưa thể đánh giá có hay không có sự đa dạng di truyền trong quần thể nấm C. cassiicola trên các dvt cao su ở Việt Nam. Mặt khác, có thể những mẫu trên có thể có sự khác biệt trong trình tự nucleotide, nhưng những khác biệt này không xảy ra ngay vị trí cắt của các enzyme cắt, phân tích bằng các enzyme cắt không phát hiện được sự sai khác. Kết quả phân tích vùng ITS bằng 6 RE đều không phát hiện bất cứ sự khác biệt nào. Các mẫu nấm mà chúng tôi phân tích có thể cùng thuộc một chủng nấm C. cassiicola và đây có thể là chủng nấm C. cassiicola duy nhất gây bệnh trên cây cao su ở Việt Nam hiện nay. Tuy nhiên, để có thể đi đến những kết luận chính xác hơn cần phải nghiên cứu trên số lượng lớn các mẫu nấm C. cassiicola. PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su hiện nay có biểu hiện triệu chứng bệnh rất khác nhau, mức độ bệnh tùy theo tính mẫn cảm của từng dvt cao su khác nhau. Việc này làm cho việc kiểm soát tình hình bệnh trở nên khó khăn. Việc nghiên cứu về tác nhân gây bệnh C. cassiicola phần nào giúp cho chiến lược quản lý tình hình bệnh trở nên dễ dàng hơn. Qua nghiên cứu về một số mẫu bệnh do tác nhân C. cassiicola gây ra chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau. Quy trình thực hiện phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS của nấm C. cassiicola đã được ứng dụng ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới có thể được sử dụng để nghiên cứu nấm C. cassiicola ở Việt Nam. Việc ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su với cặp primer ITS A và ITS B là không hiệu quả do kích thước của đoạn DNA khuếch đại được không đặc hiệu so với các nấm khác. Phân tích sản phẩm khuếch đại vùng ITS của các mẫu nấm trên các dvt cao su khác nhau, có triệu chứng bệnh khác nhau bằng các enzyme cắt giới hạn không nhận thấy bất cứ sự khác biệt nào ở kích thước của đoạn DNA tạo thành. Các mẫu nấm là giống nhau khi phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS. Các mẫu nấm nghiên cứu có thể cùng thuộc một chủng và đây có thể là chủng C. cassiicola duy nhất gây bệnh cho cây cao su ở Việt Nam hiện nay. 5.2. Đề nghị Những dvt cao su mới lai tạo ở Việt Nam biểu hiện mức độ bệnh rất khác nhau (Nguyễn Ngọc Mai, 2005). Những nghiên cứu khác trên thế giới cho thấy giữa các dòng nấm C. cassiicola trên cây cao su có sự phân hóa di truyền (Safia và cộng sự, 2003 ). Do vậy, chúng tôi đưa ra một số đề xuất sau. Tăng số lượng mẫu kiểm tra để kết quả phân tích mang tính khái quát hơn. Cần có những nghiên cứu cụ thể hơn về đặc điểm sinh trưởng, phát triển cũng như tính độc của nấm C. cassiicola trên cây cao su kết hợp với ứng dụng kỹ thuật RAPD – PCR để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola trên cây cao su ở Việt Nam, đồng thời xác định mối quan hệ giữa tính kháng của các dvt cao su lai tạo trong nước với những khác biệt về di truyền của nấm C. cassiicola. Điều này sẽ có lợi cho công tác tạo giống kháng và công tác quản lý bệnh. Tiến tới giải trình tự vùng ITS để xác định mức độ biến dị trong vùng ITS của nấm C. cassiicola Việt Nam so với các dòng nấm C. cassiicola khác đã giải trình tự trên thế giới, xác định vị trí phân loại C. cassiicola Việt Nam trong cây phân loại nấm C. cassiicola. Để hướng tới tạo giống cao su kháng bệnh rụng lá Corynespora cần nghiên cứu đa hình gen kháng C. cassiicola trên cây cao su, việc này giúp chọn nhanh dvt có khả năng kháng C. cassiicola và cũng là cơ sở để thực hiện lai tạo những dvt mới có khả năng kháng bệnh. PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Quyển II, Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông nghiệp. 45-60. 2. Cục Bảo Vệ Thực Vật. 2000. Báo cáo đề tài: Điều tra phân bố và mức độ phổ biến của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trên cây cao su và một số cây trồng khác ở một số vùng trọng điểm miền Bắc Việt Nam. 3. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.124 trang. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2000. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia. 5. Trần Văn Lợt. Giáo trình cây công nghiệp. Học phần Cây Cao Su. Tài liệu học tập, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005. 70 trang. 6. Nguyễn Ngọc Mai. Điều tra và đánh giá tính kháng bệnh rụng lá Corynespora trên một số dvt cao su lai tạo trong nước. LVTN Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 2005. 7. Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam. 2004. Báo cáo tổng kết hoạt động kinh doanh năm 2003. 8. Đặng Văn Vinh. 2000. Một trăm năm cao su ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. HCM. 11-38. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 9. Begho, E.R.,2000. The status of Corynespora leaf spot disease of Para Rubber in Nigeria: Preliminary investigations. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 10. Bridge, P. D., Arora D.K., Reddy C.A. and Elander R.P., 1998. Application of PCR in mycology. CABI publishing. UK. 1 - 21. 11. Brown, T.A.,1997. Chapter 4: Manipulation of purified DNA. Gene cloning - an introduction. Third edition. Published by Chapman and Hall. London, UK. 12. Chee, K.H., 1987. Corynespora leaf spot. Rubber Research Institute of Malaysia. Planters’ Bulletin, No 194: 3 – 7. 13. Desmond S.T, Nicholl, 1994. An introduction to genetic engineering. Cambridge University Press. 166p. 14. Dũng, P.T and Hoan, N.T., 2000. Current status of corynespora leaf fall in Vietnam. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 15. Dũng, P.T., 1995. Studies on C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei on rubber. Masters’ thesis. University Pertanian Malaysia. 16. Ellis, M.B and Holiday, 1971. Corynespora cassiicola. C.M.I Description of Pathogenic Fungi and Bacteria. No. 303. 1-2. 17. Ismail, H., N.Z. Radzia and K. Silvadadyan, 1996. Management stragies of Corynespora leaf fall with fungicides and cultural practices. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 18. Jayashinge, C.K. and W.P.K, Silva and Wettasinghe D. S., 2000. Corynespora cassiicola: a fungal pathogen with diverse symptoms on Hevea rubber. Bulletin of the Rubber Research Institute of Sri Lanka. 39, 1-5. 19. Jayashinge, C.K. and W.P.K, Silva.1996. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 20. Jayashinge, C.K..2000. Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 21. Jayasinghe, C.K., 1997. Leaf fall disease: a threat to world NR industry. Rubber Asia. 55 - 56. 22. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press. 322p. 23. Liyanage, AdeS, Jayasinghe, C.K., Liyanage, N.S.I and Jayaratne, R., 1986. Corynespora leaf spot disease of (Hevea brasiliensis): a new record. Journal of rubber research institute of Sri Lanka. 65. 47 - 50. 24. McPherson M.J., Moller S.G., 2001. PCR. BIOS Scientific Publisher Limited, UK. 276p. 25. Narisa Chanruang, 2000. Current status of Corynespora leaf fall in Thailand. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 26. Sabu, P.I., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in India. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 27. Safiah A. and Noor H.H., 2003. Differentiating races of C. cassiicola using RAPD and ITS markers. Journal of Rubber Research. 6(1). 59 – 64. 28. Shukhor S.K. and Hidir S.M., 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Malaysia. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 29. Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1995. RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus C. cassiicola. Aust. J. Bot., 43, 609 – 618. 30. Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1998. Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka. Plant pathology, 47 (3), 267-277. 31. Silva, W.P.K, Eric H. Karunanayake, Ravi L.C. Wijesundera and Uhanowita M.S. Priyanka., 2003. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence. Mycol Res. 2003 May;107(Pt 5):567-71. 32. Sinulinga W., Suwanto and Soepena H., 1996. Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996. 33. Sujanto and Irwan Suhendry., 2000. Corynespora leaf fall disease on Hevea rubber in Indonesia.Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000. 34. Tan A.M, Loo T.P, Gangadara Vadivel, Mohd Rosli Bachik and K.F. Yoon, 1992. Survey of Corynespora leaf disease of rubber in Peninsular Malaysia. Planters' Bulletin Rubber Research of Malaysia. No 211. 51- 62. 35. Tan A.M. 1990. Survey on Corynespora leaf fall disease. Planters’ Bulletin Rubber Research of Malaysia. No.194. 55 – 60. 36. The International Natural Rubber Organization, 1999. Improvement of management strategy in combating Corynespora leaf fall disease (CLFD) in Hevea brasiliensis. 50 Tài liệu internet 37. 38. Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA 39. Database: Corynespora cassiicola. 40. st_uids=12884953&dopt=Abstract Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence 41. Annual report 42. 5,8S Primer Map. 43. Primer Map. PHỤ LỤC CÁCH THỨC PHA MỘT SỐ HÓA CHẤT CẦN THIẾT 1. Pha lysis buffer Lysis buffer có các thành phần cụ thể như sau: Tris HCl 50mM, EDTA 50mM, SDS 3%, - mercaptoethanol 1%. - Cho vào becher một thể tích nước siêu sạch gần bằng với thể tích dung dich buffer mong muốn. - Lần lượt cho các thành phần khác: Tris HCl, EDTA và SDS vào dung dịch với một lượng sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng như mong muốn. - Khuấy đều cho hỗn hợp hòa tan, sau đó cho - mercaptoethanol vào. - Khuấy đều và chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH 8. Nếu sau khi chuẩn độ thể tích cuối cùng chưa đạt như mong muốn cần thêm nước siêu sạch vào cho đạt thể tích mong muốn. 2. Pha Phenol - Hòa tan 100g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol khi hòa tan). - Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100ml dung dịch Tris bazơ 0.5 M, pH8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lưu ý các thao tác này nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy hiểm đến sức khỏe. - Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch Tris HCl 0.5 M, pH 8. - Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên. - Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu được một lớp TE 1X (50ml). -Lưu ý là phải bảo quản dung dịch phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc). 3. Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH8 Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8. Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nước tinh sạch. Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.