Khóa luận Phân lập virus prrs trên môi trường tế bào marc-145 và xác định virus bằng kỹ thuật Rt-pcr

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iv BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY. HOÀNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Thầy Hải, Cô Hà và các Thầy Cô Bộ Môn Vi Sinh-Truyền Nhiễm đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Anh Lê Hồng Phong ở Cục Thú Y vùng 6 đã rất tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khoá luận. Anh Uyên đã động viên và chia sẻ vấn đề của tôi. Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất là các bạn trong phòng 14A, cƣ xá B) đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập.  Đặc biệt tôi xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cô Trần Thị Bích Liên và Anh Hoàng Thanh Hải đã rất tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.  Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt nhất đến với cha mẹ, những ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ và luôn cho con một tinh thần thoải mái để luôn chú tâm vào chuyện học.  Và lời cám ơn đặc biệt nhất tôi xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, đã luôn luôn bên tôi, an ủi và động viên để tôi làm tốt nhất. Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng tôi. Thủ Đức, tháng 8 năm 2007 iv Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 tại phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh. Mục tiêu của đề tài là phân lập virus từ các loại mẫu khác nhau và xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Nội dung nghiên cứu gồm:  Hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên bình nuôi cấy 25cm2 với những lƣợng tế bào là 7.105 và 106.  Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau khi nuôi cấy phân lập từ các loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Sau thời gian thực hiện, chúng tôi có các kết quả sau: o Thời gian một lần cấy chuyển ở lọ 25cm2 với những lƣợng tế bào: 7.105, 106 lần lƣợt là 72,56 giờ và 46 giờ. o Tế bào MARC-145 sau khi đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng vẫn phát triển bình thƣờng. o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết thanh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận đƣợc 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11). o Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% trên mẫu xét nghiệm. v SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology". The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept. of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city. Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology. The contain is concerned about:  Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.10 5 and 10 6 .  Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes.  Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.105 cells is 72,565 hours, 10 6 cells is 46 hours. o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally. o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment. 3 specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: 2 lymphonotes, 1 lung (3/11 specimens). o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... iii TÓM TẮT ............................................................................................................ iv SUMMARY ........................................................................................................... v MỤC LỤC ............................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ................................................................................ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................. xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................ xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục đích - Yêu cầu ...................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN .................................................................................... 3 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào ...................................................................... 3 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật .................................................... 3 2.1.2. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy ........................................ 4 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................ 6 2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế ............................................................... 6 2.2. Phƣơng pháp PCR ........................................................................................ 6 2.2.1. Nguyên tắc ............................................................................................ 7 2.2.2. Thực nghiệm ......................................................................................... 7 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR ............................................ 8 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR .......................................................................... 9 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus ........................................................... 10 2.3.1. Lịch sử bệnh ........................................................................................ 10 2.3.2. Căn bệnh học ....................................................................................... 11 2.3.2.1. Phân loại ..................................................................................... 11 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc .................................. 12 vii 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy ...................................................................... 14 2.3.2.4. Sức đề kháng .............................................................................. 16 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS ....................................................................... 16 2.3.3.1. Loài mắc bệnh ............................................................................ 16 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan ................................................................... 16 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập ........................................................................ 17 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh ........................................................................ 17 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng .......................................................................... 20 2.3.5. Chẩn đoán ............................................................................................ 20 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng ................................................................... 20 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng ............................................................. 21 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể .................................. 21 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên .................... 22 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS........................................ 23 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào ............................ 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ......................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm................................................................................. 25 3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu ........................................................................ 25 3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 25 3.4. Vật liệu và dụng cụ .................................................................................... 26 3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus ........ 26 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 ................................... 26 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR ..................................... 27 3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA ............................................ 27 3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR ......................................... 27 3.4.6. vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR ........................... 28 3.5. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 28 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu .......................................................................... 28 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 .......................................... 28 viii 3.5.2.1. Hồi phục tế bào .......................................................................... 28 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào ...................................................................... 29 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus ................................................................ 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 34 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 ..................................... 34 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ............... 35 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ................ 37 4.4. Kết quả RT-PCR ........................................................................................ 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 44 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 44 5.2. Tồn tại ........................................................................................................ 44 5.3. Đề nghị ....................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 45 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS ............................................ 19 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS ............................................ 31 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR ................................................... 33 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1. Virus PRRS ......................................................................................... 12 Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng .................................................................... 15 Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS ..................................................... 15 Hình 2.4. Triệu chứng bệnh tai xanh................................................................... 20 Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS ....................................................................... 20 Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer .......................................................................... 30 Hình 4.1. Đối chứng âm ..................................................................................... 40 Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào ........................................................... 40 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng ................................................................................ 40 Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP ................ 41 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2 ................. 41 Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào ....................... 42 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 .............................. 34 Bảng 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ........ 36 Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 ......... 38 Bảng 4.4. Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm .......................... 46 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMV: Avian Myeloblastosis Virus cDNA: Complement Deoxynucleotide Acid DEPC: Diethyl Pyrocarbonate DNA: Deoxynucleotide Acid dNTP: Deoxynucleotide Triphosphate EDTA: Ethylene Diamine Tetra Acetate ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay EMEM: Eagle Minimum Essential Medium FA: Florescent Antibody Staining HRPO: Horseradish Peroxidase IFA: Immuno Peroxidase Monolayer Assay IHC: Immunohistochemistry Staining IPMA: Immuno peroxidase Monolayer Assay LAH: Lactalbumin Hydrolysate MSD: Mystery Swine Disease Nu: Nucleotide ORF: Open Reading Frame PAM: Porcine Alveolar Macrophage PBS: Phosphate Buffer Saline PBSA: Phosphate Buffer Saline Solution A PCR: Polymerase Chain Reaction PRRS: Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome RNA: Ribonucleotide Acid RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SN: Serum Neutralization TBE: tris Borate EDTA µl: Microlit 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Từ nhiều năm nay, ngành chăn nuôi chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế ở nƣớc ta vì nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp. Nó đã cung cấp một phần nhu cầu thực phẩm thiết yếu của cuộc sống con ngƣời. Trong đó ngành chăn nuôi heo không ngừng phát triển để cung cấp đủ số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng cho ngƣời tiêu dùng. Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lƣợng heo nuôi ngày càng tăng cao. Song song với quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hƣởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trƣởng của heo nhƣ: bệnh FMD, bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh giả dại…và gần đây nhất là một vấn đề đang làm đau đầu giới chăn nuôi, nó ảnh hƣởng không nhỏ đến hiệu quả kinh tế của ngành chăn nuôi là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and respiratory syndrome). Bệnh do virus PRRS tiến triển phức tạp, khó khống chế lại ít biểu hiện triệu chứng, tỷ lệ mắc bệnh cao, bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi. Bệnh gây sảy thai ở thời kỳ cuối, chậm động dục, gia tăng số thai chết và heo con sơ sinh yếu, heo con chết trƣớc khi sinh, còi cọc, chậm lớn. Những nghiên cứu về PRRS trƣớc đây chỉ dừng lại ở việc điều tra tỷ lệ nhiễm bằng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS. Mặc dù việc nuôi cấy phân lập virus trên môi trƣờng tế bào khó, tuy nhiên xác định sự hiện diện của virus từ mẫu huyết thanh dƣơng tính và các mẫu lâm sàng là rất cần thiết để làm cơ sở cho công tác phòng bệnh và các nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ thực tế trên, đƣợc sự phân công của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của ThS. Trần Thị Bích Liên và BSTY Hoàng Thanh Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT- PCR”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định sự hiện diện của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC- 145 bằng kỹ thuật RT- PCR góp phần hoàn thiện dần quá trình chẩn đoán bệnh PRRS trên heo và lấy đó làm cơ sở cho những nghiên cứu sau này. 1.2.2. Yêu cầu Khảo sát đặc tính của tế bào MARC-145 bằng cách hồi phục tế bào và xác định thời gian một lần cấy chuyển. Phân lập virus PRRS từ huyết thanh, phổi, hạch phổi của heo nghi ngờ bệnh trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Ghi nhận bệnh tích tế bào sau 7 ngày nuôi cấy. Dùng kỹ thuật RT- PCR (Reverse Trascriptase - Polymerase Chain Reaction) để xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào nuôi cấy. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Tổng quan về nuôi cấy tế bào Nuôi cấy tế bào là kỹ thuật duy trì và phát triển các tế bào ở ngoài cơ thể sống nhƣng vẫn thực hiện đầy đủ các chức năng biến dƣỡng và chức năng chuyên biệt của tế bào. Quá trình nuôi cấy tế bào cho phép mỗi tế bào đóng vai trò nhƣ những tế bào độc lập, nó có thể phân chia nhờ quá trình nguyên phân và quần thể tế bào tiếp tục phát triển cho đến khi bị giới hạn bởi bề mặt nuôi cấy hay sự cạn kiệt dinh dƣỡng. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào năm 1907 bởi Harrison. Ngày nay kỹ thuật này đã đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học và thú y học để nghiên cứu tác động của các chất lên tế bào hay nghiên cứu virus để phân lập, giám định, chuẩn độ virus, xác định tính chất huyết thanh học, quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và đặc biệt là sản xuất vaccine. Quá trình nuôi cấy thƣờng gồm những tế bào thuộc cùng một loại. 2.1.1. Một số đặc điểm của tế bào động vật Tính cơ học yếu: tế bào động vật không vách và kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 µm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi thao tác trên tế bào nhƣ khuấy trộn để tách tế bào, di chuyển mẫu tế bào. Tăng trƣởng và phân chia chậm: thời gian tăng trƣởng gấp đôi của tế bào trung bình là 30 giờ. Trong khi đó thời gian này của vi khuẩn chỉ khoảng 30 phút. Tính cần giá đỡ: hầu hết tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thƣờng, tế bào phát triển tốt khi gắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt dụng cụ nuôi. Tuy vậy một số tế bào nhƣ tế bào ung thƣ có thể sinh trƣởng và phân chia ở trạng thái lơ lửng không cần giá đỡ. 4 Tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng ở nhiệt độ -1960C, ở nhiệt độ này tế bào có thể giữ đƣợc khả năng sống không hạn định và sẽ phát triển trở lại trên môi trƣờng nuôi cấy khi hồi phục. Ngoài ra tế bào còn có các đặc tính khác nhƣ: kém thích nghi với môi trƣờng, nhạy cảm với các ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormone tăng trƣởng để phân chia (Phan Kim Ngọc, 2002). 2.1.2. Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy tế bào Môi trƣờng nuôi cấy tế bào phức tạp và giàu chất dinh dƣỡng để tạo điều kiện tốt nhất cho sự phát triển của tế bào. Môi trƣờng có thể đƣợc cung cấp dƣới dạng dung dịch để sử dụng ngay hay dƣới dạng dung dịch đậm đặc hoặc dạng bột. Dạng dung dịch đậm đặc có thể sử dụng sau khi pha loãng với nƣớc cất tiệt trùng, trong khi dạng bột phải đƣợc hoà tan trong nƣớc và tiệt trùng bằng cách lọc qua lƣới lọc 0,22µm. Thành phần cơ bản của môi trƣờng nuôi cấy: Carbonhydrate: glucose (5-10mM) đƣợc dùng trong hầu hết các công thức để cung cấp nguồn năng lƣợng cũng nhƣ tiền chất cho tổng hợp sinh học, nhƣ ribose cần cho tổng hợp acid nucleic. Có thể dùng fructose thay thế cho glucose. Glucose có trong hầu hết môi trƣờng là nguồn ly giải tạo pyruvate vào chu trình acid citric và sinh ra CO2. Amino acid (0,1-0,2mM) cũng đƣợc dùng nhƣ là nguồn tiền chất cho tổng hợp protein. Ngƣời ta thƣờng sử dụng glutamine, tuy nhiên, ammoniac đƣợc thành lập từ chuyển hoá glutamine có thể ức chế sự sinh trƣởng trong một số quá trình nuôi cấy. Muối cũng đƣợc dùng để làm cho môi trƣờng có tính đẳng trƣơng, duy trì sự cân bằng với phần bên trong tế bào. Bicarbonate (NaHCO3) cũng đƣợc dùng để đóng vai trò nhƣ hệ thống đệm trong sự kết hợp với 5-10% CO2 đƣợc cung cấp bởi tủ ủ. Điều này cho phép môi trƣờng duy trì có pH từ 7,2-7,4. 5 Vitamin và hormone hiện diện ở nồng độ tƣơng đối thấp và đƣợc dùng để kích thích sinh trƣởng. Lƣợng vitamin và hormone thay đổi nhiều giữa các công thức môi trƣờng khác nhau. Điều này cho thấy nhu cầu vitamin của các dòng tế bào là khác nhau. Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cải thiện sự sinh trƣởng của tế bào, giúp tế bào dễ bám vào bề mặt thủy tinh và phát triển mạnh hơn. Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum- FBS) thƣờng đƣợc sử dụng bổ sung vào cho môi trƣờng nuôi cấy, nhƣng lại đắt tiền và hiếm. Nồng độ huyết thanh thƣờng đƣợc dùng từ 5- 20%. Những dòng tế bào liên tục có xu hƣớng thích nghi với môi trƣờng có nồng độ huyết thanh thấp. Xu hƣớng hiện nay là sử dụng môi trƣờng không huyết thanh nhƣng chỉ mới thành công trong nuôi cấy tế bào Hela và L292. Các protein trong huyết thanh nhƣ albumin, fibronectin, globulin giúp tế bào bám dính và phát triển. + Những bất lợi của môi trƣờng có huyết thanh - Thay đổi huyết thanh cần làm nhiều xét nghiệm nên tốn kém. - Khi cấy nhiều loại tế bào cần nhiều loại huyết thanh. - Nguy cơ lan truyền mầm bệnh. - Huyết thanh thƣờng nhiễm virus và Mycoplasma, do đó ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy. - Giá thành đắt. + Bất lợi của môi trƣờng không có huyết thanh - Tế bào phát triển và sinh sản chậm. - Môi trƣờng đƣợc pha chế sẵn, khó kiểm tra chất lƣợng và đắt tiền. Kháng sinh thƣờng đƣợc cho vào môi trƣờng nuôi cấy trong thời gian ngắn nhằm làm giảm nguy cơ tạp nhiễm. Nồng độ tối ƣu của kháng sinh đƣợc xác định theo kinh nghiệm của ngƣời tiến hành nuôi cấy. Kháng sinh thƣờng đƣợc dùng dƣới dạng kết hợp. Có thể sử dụng Penicilin G, Streptomycin và Amphotericin B để ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dƣơng, Gram âm và chống nấm (Butler, 2004). 2.1.3. Điều kiện nuôi cấy 6 Hầu hết tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy sinh trƣởng tốt ở nhiệt độ 370C và pH 7,4. Nếu ở nhiệt độ thấp hơn một chút so với 370C thì tốc độ sinh trƣởng sẽ giảm xuống nhƣng tế bào không bị phá hủy. Tuy nhiên nhiệt độ cao hơn, từ 39- 40 0C sẽ phá huỷ tế bào. Do vậy, việc đảm bảo rằng nhiệt độ không tăng trong tủ cấy là rất quan trọng (Butler, 2004). 2.1.4. Sự tạp nhiễm và cách hạn chế Nguyên nhân chính của sự thất bại trong nuôi cấy tế bào là sự tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm thƣờng do tiệt trùng dụng cụ không đạt yêu cầu và thƣờng bắt nguồn từ sự tiếp xúc của con ngƣời nhƣ là từ bàn tay, hơi thở, tóc. Môi trƣờng và thiết bị ngày nay đƣợc cung cấp sẵn nhằm hạn chế tới mức tối đa những nguy cơ tạp nhiễm này. Nguy cơ này cũng có thể đƣợc giảm bớt hơn nữa bởi sự quan tâm cẩn thận tới từng chi tiết khi tiến hành nuôi cấy. Nhằm giảm bớt các nguồn tạp nhiễm, cần chú ý các điểm sau: Rửa tay với xà phòng diệt khuẩn trƣớc và sau quá trình có liên quan đến cấy tế bào. Có thể dùng găng tay nhựa. Hạn chế những con đƣờng tới phòng thí nghiệm khi thí nghiệm đang tiến hành. Làm sạch bề mặt làm việc trƣớc và sau mỗi quá trình nuôi cấy. Dùng không gian tiệt trùng (ví dụ tủ cấy tiệt trùng) cho tất cả các thao tác. Dùng ống nghiệm nuôi cấy bằng plastic đƣợc tiệt trùng và chỉ dùng một lần. Mua môi trƣờng và huyết thanh từ nhà cung cấp đáng tin cậy để đảm bảo rằng sự tạp nhiễm không phát sinh từ nguồn này (Butler, 2004). 2.2. Phƣơng pháp PCR Phƣơng pháp PCR (polymerase chain reaction) là phƣơng pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phƣơng pháp này đƣợc K.Mullis đƣa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Sự khác biệt giữa tạo dòng và phƣơng pháp PCR là ở chỗ phƣơng pháp PCR đƣợc thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất nhiều bản sao DNA. Trong khi đó phƣơng pháp tạo dòng phải đƣợc thực hiện trong tế bào 7 sinh vật. Kỹ thuật PCR có thể đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hƣớng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…. 2.2.1. Nguyên tắc Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện in vitro với sự hiện diện của enzyme DNA polymerase để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài để hình thành mạch mới. Nếu ta cung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đƣợc đoạn DNA nằm giữa 2 đoạn mồi. Điều đó nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer). 2.2.2. Thực nghiệm Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1: Đây là giai đoạn biến tính (denaturation). Ở giai đoạn này thƣờng sử dụng điều kiện nhiệt độ biến tính, thƣờng ở 940C- 950C trong 30- 60 giây, làm đứt các cặp base và tách DNA sợi đôi tạo thành các sợi đơn để đóng vai trò nhƣ khuôn mẫu quá trình tổng hợp DNA.  Giai đoạn 2: Đây là giai đoạn bắt cặp (annealation). Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ 400C- 700C trong 30-60 giây tuỳ thuộc vào primer sử dụng cho phản ứng. Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA mẫu. Việc xác định nhiệt độ lai này là rất quan trọng, nó quyết định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn đến sự bắt cặp không đặc hiệu, dẫn đến kết quả khuếch đại bị sai. Nếu nhiệt độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp đƣợc. 8 Nhiệt độ này có thể đƣợc tính thông qua Tm. Tm là nhiệt độ mà ở đó việc lai bắt cặp đúng phân ly. Thông thƣờng nhiệt độ lai đƣợc sử dụng thấp hơn.  Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn kéo dài (elongation). Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 720C- 740C trong 30 giây đến vài phút tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn DNA cần tổng hợp. Điều kiện nhiệt độ này sẽ giúp cho Taq polymerase (là emzyme chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một loại vi khuẩn suối nƣớc nóng, Thermus aquaticus) hoạt động và tiến hành tổng hợp sợi DNA mới (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998). 2.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 2.2.3.1. DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận đƣợc trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lƣợng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hƣớng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao. 2.2.3.2. Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nƣớc nóng Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác đƣợc đƣa ra thị trƣờng với nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase là một enzyme tách chiết từ Thermus themophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzyme phiên mã ngƣợc khi có mạch RNA khuôn và ion Mg++, nhƣng với sự hiện diện của DNA khuôn và Mg ++ , Tth polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. 2.2.3.3. Primer và nhiệt độ lai Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn. Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau: Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu. Các đoạn mồi không nên chứa hơn 3 Nu giống nhau xếp liên tiếp. 9 Tỷ lệ GC lý tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp. Hai đoạn mồi không đƣợc có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau. Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp DNA vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi. Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa. Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tƣởng là nhỏ hơn 1kb. 2.2.3.4. Các thành phần khác của phản ứng Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20- 200µM/mỗi nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase. Nồng độ ion Mg++ cũng là nhân tố ảnh hƣởng mạnh đến phản ứng PCR. Nồng độ tối ƣu phải đƣợc xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. 2.2.4. Phƣơng pháp RT-PCR RT- PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phƣơng pháp dùng để khuyếch đại cDNA đƣợc tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngƣợc. RT- PCR thƣờng đƣợc sử dụng để tạo ra thƣ viện cDNA (complementary DNA) lớn từ một lƣợng rất nhỏ mRNA, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngƣợc và sử dụng trong việc định lƣợng mức độ phân tử của gene. Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng đƣợc sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus RNA.  Nguyên tắc Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗi oligonucleotide: enzyme phiên mã ngƣợc ( reverse transcriptase) và DNA polymerase. Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cDNA từ RNA và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi DNA từ cDNA. Do enzyme reverse transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mã ngƣợc để tạo ra cDNA phải 10 đƣợc thực hiện ở nhiệt độ thấp (thƣờng khoảng từ 42-450C). Điều này gây ra những trở ngại: Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp không đặc hiệu của các primers. Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành RNA cấu trúc bậc hai. Tuy nhiên những trở ngại này có thể đƣợc giải quyết nhờ vào việc sử dụng enzyme DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus. Enzyme này trong những điều kiện nhất định, có đặc tính sinh học đặc biệt là có thể thực hiện cùng lúc 2 chức năng: chức năng của reverse transcriptase và chức năng của DNA polymerase. 2.3. Sơ lƣợc về căn bệnh, bệnh do virus PRRS Trong chăn nuôi heo, một trong những bệnh mới xuất hiện trong thời gian gần đây và đƣợc nhắc đến nhiều đó là hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp trên heo (porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS). Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Bắc Mỹ vào đầu những năm 1980, sau đó bệnh xuất hiện ở Châu Âu và Châu Á và đƣợc xác định là do một loại virus thuộc họ Arteriviridae, có khả năng xâm nhiễm vào đại thực bào và mô. Virus PRRS là một virus RNA có vỏ bọc, gây cả thiệt hại về sinh sản trong đàn lợn giống và về các triệu chứng hô hấp trong đàn heo thịt. Heo nái biểu hiện kém ăn, thở khó và có thể kèm theo sốt ngắn. Sảy thai, đặc biệt là cuối thời kỳ chửa, tăng số lƣợng con chết khi đẻ, heo vẹo chân, heo yếu và xảy ra tử vong ở heo con. Ở heo nuôi thịt, mức độ bệnh hô hấp tăng lên, thƣờng kết hợp với các bệnh khác (Thanh Thuận, 2001). Ở ổ dịch cấp tính, ƣớc tính giảm sản lƣợng 5-20%, giảm từ 1-3.8 heo con/nái/năm, thiệt hại từ 100-155$/nái/năm (dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Thể mãn tính làm cho heo thịt chậm lớn, tăng chi phí thuốc để điều trị các bệnh kế phát. 2.3.1. Lịch sử bệnh Năm 1987, bệnh đƣợc phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ với tên gọi “bệnh thần bí trên heo” (Mystery Swine Disease - MSD). 11 Tháng 11 năm 1990, ổ dịch PRRS đầu tiên xảy ra ở Đức và lan tràn nhanh chóng sang các quốc gia khác ở Châu Âu. Mùa đông năm 1990- 1991, lần lƣợt các quốc gia Châu Âu nhƣ Hà Lan, Bỉ, Pháp và Tây Ban Nha đã báo cáo về hội chứng này với nhiều tên gọi khác nhau: “Bệnh tai xanh” (Blue-eared Pig Disease), “Hội chứng hô hấp và sảy thai trên heo” ( Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome -PEARS), hay “Hội chứng hô hấp và vô sinh” (Swine Infertility and Respiratory Disease - SIRD). Năm 1991, lần đầu tiên Wenvoort và cộng sự đã phân lập đƣợc căn bệnh ở Viện thú y trung ƣơng Lelytad – Hà Lan đã phân lập đƣợc căn bệnh và đặt tên cho loại virus này là “Lelystad”. Năm 1992, Collins và cộng sự ở Mỹ cũng báo cáo về việc phân lập đƣợc virus gây bệnh và sử dụng tên gọi VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ. Cũng trong năm 1992, hội nghị quốc tế và tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã nhất trí đặt tên cho bệnh này là “Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo” (porcine reproductive and respiratory syndrome- PRRS) (Võ Thị Đan Thanh, 2006) Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dƣơng tính). Các nghiên cứu về bệnh trên những trại giống lớn tại các tỉnh phía Nam cho thấy tỷ lệ lợn có huyết thanh dƣơng tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới 68,29%. Ở các nƣớc khác, tỷ lệ đàn trong vùng bệnh có huyết thanh dƣơng tính rất cao, nhƣ ở Anh là 6-75%, Mỹ là 36%,… (Phòng Dịch tễ-Cục Thú y) 2.3.2. Căn bệnh học 2.3.2.1. Phân loại Virus PRRS thuộc: Bộ Nidovirales. Họ Arteriviridae. Giống Arterivirus. 12 Hình 2.1. Virus PRRS (Nguồn: http//www. agraroldal.hu) 2.3.2.2. Một số đặc điểm về hình thái và cấu trúc Virus PRRS có cấu trúc RNA mạch đơn dƣơng, có đƣờng kính 40-70 nm, có vỏ bọc, kích thƣớc genome dài 14,5 kb mã hoá cho việc tái tạo virus (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Bộ gene của virus PRRS gồm có 8 khung độc mở (ORFs) mã hoá cho các thành phần khác nhau của virus. Tuy nhiên chỉ có 3 khung ORFs có ý nghĩa quan trọng trong định danh virus, đó là ORFs 7,6 và 5 quy định tổng hợp các protein tƣơng ứng: nucleocapsid (N) 15-kDa, matrix (M) 19-kDa và glycoproteins envelope (protein GP5) 25-kDa. Đây là những protein cấu trúc quan trọng nhất, chúng chiếm 90-95% lƣợng protein cấu trúc của virus. Protein N là một protein nhỏ (15 kDa) và có tính kiềm cao, điều này có thể giúp nó tƣơng tác dễ dàng hơn với bộ gen RNA. Protein N hiện diện ở mức độ cao trong những tế bào bị nhiễm virus PRRS và chiếm từ 20- 40% lƣợng protein của phân tử virus. Hiện nay protein N đƣợc dùng nhƣ là một kháng nguyên để phát hiện kháng thể trong huyết thanh của heo. Protein M có trọng lƣợng phân tử khoảng 18 kDa. Mặc dù chức năng của nó đƣợc biết rất ít nhƣng nó đƣợc xem nhƣ có vai trò trong sự kết hợp với thụ thể trên tế bào đích, vì protein M kết hợp GP5 tạo phức hợp M-GP5 để kết hợp với thụ thể trên tế bào đích (Delputte và cs, 2001). 13 Protein GP5 có trọng lƣợng phân tử khoảng 25 kDA, là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng apoptosis và đóng vai trò quan trọng trong việc nhận diện thụ thể trên tế bào đích (Nathalie và cs, 2003). Về mặt di truyền, khi phân tích gene của các dòng virus PRRS gây bệnh khác nhau, ngƣời ta xác định đƣợc 2 dòng virus riêng biệt: dòng Châu Âu (Lelystad) và dòng Châu Mỹ (VR-2332). Hai dòng virus này không những khác biệt về đặc tính gây bệnh mà khác nhau về mức độ nhất định về kiểu gene. Qua phân tích gene và theo dõi sự thay đổi trình tự Nu của các dòng PRRS, ngƣời ta đã xác định rằng ở dòng Châu Mỹ, các ORFs 7 và 6 có tính ổn định rất cao, chúng gần nhƣ không thay đổi trong suốt quá trình tiến hoá của dòng virus này, tuy nhiên, sự khác biệt giữa dòng virus Châu Âu và Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ, chẳng hạn sự tƣơng đồng về trình tự axit amin của ORFs 7 giữa 2 dòng virus này chỉ vào khoảng 57-59% và của ORFs 6 là 70-81%. Trong khi đó, khung đọc mở ORFs 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng 1 dòng Châu Mỹ và chỉ tƣơng đồng với dòng Châu Âu khoảng 51-59%. Sự tƣơng đồng về trình tự axit amin quy định do các khung đọc mở ORFs 2, 3 và 4 giữa các dòng Châu Mỹ và Châu Âu tƣơng ứng chỉ ở từ 63,58% và 68% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gen (Trần Đức Minh). Sự khác biệt về kiểu gene đƣơng nhiên sẽ liên quan đến sự khác biệt về kiểu hình và nhƣ vậy có thể dựa vào đặc điểm gene để chẩn đoán dòng virus và ngƣợc lại. Nhƣ vậy, trên cơ sở về kiểu gene, dịch tễ học phân tử cho phép xác định chính xác bản đồ dịch tễ của một căn bệnh, quá trình xuất hiện, phát triển của virus PRRS (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nghiên cứu virus ở mức độ phân tử còn cho phép xác định đƣợc khả năng sản xuất và sử dụng virus nhƣợc độc để làm văcxin. Ngƣời ta đã ghi nhận nhiều trƣờng hợp hội chứng PRRS trở nên trầm trọng hơn sau khi đàn heo đƣợc tiêm vắcxin virus PRRS nhƣợc độc vì cấu trúc gene của virus nhƣợc độc thay thế glycine bằng arginine ở vị trí 151 của ORFs 5 sẽ hoàn nguyên rất nhanh bộ gene của chúng so 14 với bộ gene của virus nguyên thuỷ ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, và nhƣ thế độc lực của chúng cũng đƣợc phục hồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.2.3. Đặc điểm nuôi cấy Virus rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi. Bình thƣờng đại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, virus xâm nhập vào cơ thể, riêng đối với virus PRRS, virus có thể nhân lên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) (phòng Dịch tễ-Cục Thú y). Virus xâm nhập vào tế bào bằng con đƣờng nhập nội bào (endocytosis) qua trung gian receptor. Ngƣời ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế nang đối với virus(Delputte và cs, 2001; Nathalie và cs, 2003) và trên MARC-145 là vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Jeong-Ki Kim và cs, 2005). Theo Jeong-Ki Kim và cs, 2005 thì kháng thể kháng vimentin ngăn cản sự gây nhiễm của virus trên tế bào MARC-145. Khi chuyển vimentin tái tổ hợp vào 2 dòng tế bào BHK-21 và CRFK (Crandall Rees feline kidney), không nhạy cảm với virus PRRS, thì 2 dòng tế bào này trở nên nhạy cảm với PRRSV, điều đó chứng tỏ sự tấn công và gây nhiễm của virus liên quan tới vimentin, 1 loại intermediate-filament protein (Jeong- Ki Kim và cs, 2005). Bằng kính hiển vi điện tử, ngƣời ta phát hiện những tiểu phần của virus hiện diện trong những khoang nhỏ. Kháng nguyên virus có thể phát hiện ngay 6 giờ sau gây nhiễm (Dea, 2000; Pol, 1997). Virus PRRS đƣợc lắp ráp khi nucleocapsid xuất hiện trong khoang của lƣới nội chất không hạt hay vùng Golgi hoặc cả hai. Robison và cs (1997) đã tìm thấy trong tế bào gây nhiễm MARC-145 protein M định vị tại bộ Golgi và protein N thì định vị quanh nhân và hạch nhân. Lớp vỏ bọc ngoài (envelope) chủ yếu đƣợc hình thành trong khoang của lƣới nội chất và cũng là nguyên nhân làm cho bào quan này phình to ra (Dea và cs, 1995; Mardassi và cs, 1994; Pol, 1997). Sau khi hình thành, virion đƣợc tập hợp lại và di chuyển ra màng bào tƣơng để giải phóng virus (Meulenberg, 2000). Theo Pol và Wagenaar, 1992; 15 Pol, 1997, sau khi nuôi cấy 9-12 giờ, các tế bào bị xâm nhiễm sẽ vỡ ra và giải phóng các hạt virus hoàn chỉnh (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Hình 2.2. Đại thực bào bình thƣờng Hình 2.3. Đại thực bào bị nhiễm PRRSV (Nguồn: ) Virus PRRS mã hoá các sản phẩm gen mà chúng có thể gây ra apoptosis, một kiểu chết phổ biến, đóng vai trò quan trọng trong sự cân bằng nội tại và loại bỏ những tế bào tổn thƣơng và già cỗi. Tuy nhiên cơ chế của hiện tƣợng này chƣa đƣợc biết rõ. Ngƣời ta xác định đƣợc protein GP5 của virus là tác nhân gây ra apoptosis (Meulenberg, 2000). Những thay đổi có tính thoái hoá do apoptosis gây ra trong tế bào bao gồm nhân tế bào cô đặc lại, vỡ ra, không bào bị thoái hoá, tế bào chất cô đặc, nhiễm sắc thể bị đứt ra từng mảnh (Suarez, 2000). Virus đạt đỉnh cao lúc 24- 48 giờ và có thể duy trì tới 60- 70 giờ sau nuôi cấy (Meng và cs, 1996). Theo Kim và cs (1993), trong quá trình nhân lên của virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MA- 104 (MARC-145), hiệu giá virus có thể đạt tối đa 108,5 TCID50/0,1ml sau 48- 72 giờ nuôi cấy. Khi gây nhiễm tế bào, hầu hết các chủng virus PRRS đều gây bệnh tích tế bào nhƣng vẫn có một số chủng virus PRRS thì không (Christianson và Joo, 1994; Yoon và cs, 1992). Bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra là: tế bào co tròn, tập trung lại, sau đó dày lên, nhân co lại và cuối cùng là tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Benfield và cs (1992) cũng mô tả bệnh tích tế bào do virus PRRS gây ra nhƣ: các tế bào co tròn, trở nên thoái hoá (nhân kết đặc lại) và tách khỏi tế bào một lớp sau 2- 4 ngày nuôi cấy. Toàn bộ lớp tế bào bong ra sau 6 ngày. Kết quả cũng tƣơng tự trên dòng tế bào PAM khi gây nhiễm virus PRRS (Pol và 16 Wagenaar, 1992; Wensvoort, 1992; Pol, 1997) (dẫn liệu Võ Thị Đan Thanh, 2006). Các dòng PRRSV của Bắc Mỹ phát triển khá tốt trên MARC-145 trong khi các dòng PRRSV của Châu Âu phát triển nhanh hơn trên PAM. Nhiều phòng thí nghiệm ở Hàn Quốc và Bắc Mỹ chỉ sử dụng MARC-145 vì khó khăn khi phải nuôi cấy PAM (Han-Kook Chung và cs, 2002). Một nghiên cứu khác của Bloemraad (1994) cho thấy sau 40 giờ nuôi cấy, gần 40% tế bào PAM có bệnh tích tế bào. Tuy nhiên, kết quả này có thể thay đổi giữa các phòng thí nghiệm (Yoon, 2003). 2.3.2.4. Sức đề kháng Virus PRRS tồn tại đƣợc trong thời gian dài hơn 4 tháng ở -700C đến -200C nhƣng khoảng 90% khả năng gây nhiễm của virus bị mất trong vòng 1 tuần ở 40C. khả năng hồi phục của virus đã đƣợc báo cáo kéo dài đến 20 phút ở 560C, 24 giờ ở 37 0C và 6 ngày ở 210C. Virus bền vững ở pH từ 6,5 -7,5 nhƣng chết nhanh khi pH 7,65 (Benfield và cs, 1999). Nhƣ vậy, virus PRRS không bền với nhiệt độ và pH. Ngoài ra, virus dễ bị diệt bởi chất sát trùng và tia cực tím (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Các chất tẩy uế có tác dụng làm giảm khả năng lây nhiễm của virus và các chất tan dầu mỡ nhƣ chloroform và eter đặc biệt hữu hiệu trong việc phá vỡ cấu trúc vỏ ngoài của virus và làm ngừng sự tái sản (Trần Đức Minh). 2.3.3. Dịch tễ học bệnh PRRS 2.3.3.1. Loài mắc bệnh Loài heo, cả heo nhà lẫn heo rừng đƣợc cho là loài mắc bệnh duy nhất. Tuy nhiên, vịt trời bài thải virus qua phân khi gây nhiễm thực nghiệm với virus PRRS bằng nƣớc uống, chứng tỏ vịt trời cũng mẫn cảm với virus PRRS (Ausvetplan, 2004). 2.3.3.2. Phƣơng thức lây lan - Trực tiếp: do tiếp xúc trực tiếp giữa thú bệnh và thú khỏe từ mũi- mũi, qua giao phối, thú mẹ truyền virus cho thú con qua tử cung. Ở lợn mẹ mang trùng, virus có thể lây nhiễm cho bào thai ở giai đoạn giữa thai kỳ trở đi. Lợn trƣởng thành có thể bài thải virus trong vòng 14 ngày trong khi đó lợn con và lợn choai có thể bài thải virus trong1-2 tháng. 17 - Gián tiếp: qua chất bài tiết nhƣ dịch mũi, phân hoặc qua những giọt khí dung. Theo Hoàng Văn Năm (2001), ngoài việc vận chuyển heo bệnh vào đàn cảm nhiễm và lây lan qua không khí thì ít có bằng chứng nói về cách truyền lây khác. Tuy nhiên, ngƣời ta còn thấy việc lây lan trong đàn giống còn theo con đƣờng truyền tinh dịch. Ở những nọc nhiễm bệnh, tinh dịch trong thời kỳ virus huyết có thể gây bệnh cho đàn chƣa có miễn dịch với mức độ biểu hiện tuỳ thuộc vào kích cỡ đàn, mật độ nuôi và tình trạng vệ sinh. Nhƣ vậy, heo nọc là đối tƣợng truyền lây virus quan trọng trong đàn. 2.3.3.3. Đƣờng xâm nhập Virus xâm nhập qua đƣờng hô hấp, gieo tinh, tiêu hoá (Ausvetplan, 2004), chất chứa mầm bệnh. Virus có nhiều ở chất tiết dịch mũi, tinh dịch và phân của heo bệnh. Sau cảm nhiễm, heo bệnh có thể chứa virus trong huyết thanh đến 210 ngày, trong tinh dịch 92 ngày, trong dịch mũi 21 ngày và trong dịch hầu họng đến 157 ngày. Trong đó, tinh dịch và dịch mũi là hai nguồn lây nhiễm đáng quan tâm (dẫn liệu Trần Thị Bích Huyền, 2005). 2.3.3.4. Cơ chế sinh bệnh Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus nhân lên trong đại thực bào ở tiểu phế nang và trong tế bào nội mô của hệ thống lƣới võng nội. Tế bào biểu mô đƣờng hô hấp trên cũng là nơi thích hợp cho sự nhân lên của virus PRRS. Quá trình virus nhân lên và phá hủy đại thực bào gây ra bệnh tích ở thành mạch, làm thủy thũng tế bào nội mô của tĩnh mạch, giảm hàm lƣợng protein huyết tƣơng đến các mô và tạo các cục huyết khối gây nhiều hậu quả bệnh lý khác nhau. Những biểu hiện khác nhau của bệnh tuỳ thuộc vào khả năng nhân lên hay phá hủy tiểu phế nang, tế bào nội mô và tế bào lympho (dẫn liệu Trần Thanh Phong, 1996). Tác động phá huỷ đại thực bào phế nang, đặc biệt trên heo con, làm giảm khả năng đề kháng của vật chủ chống lại vi khuẩn kế phát hoặc xâm nhập của các virus khác. Hầu hết sự nhiễm kế phát đƣợc quan sát sau ổ dịch PRRS là bệnh đƣờng hô 18 hấp. Rõ ràng là nếu những tế bào bảo vệ đầu tiên nhƣ PAM bị phá huỷ thì nó sẽ ảnh hƣởng rất lớn đến khả năng của vật chủ chống lại vi khuẩn và virus gây bệnh (dẫn liệu Hoàng Văn Năm, 2001). Theo Trần Thanh Phong (1996), do gây suy giảm miễn dịch, bệnh PRRS mở đƣờng cho những vi sinh vật cơ hội nhƣ: Pasteurella multosida, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, A. pleuropneumoniae, Chlamydia psittaci, Leptospira interrogans, virus giả dại, virus cúm, Enterovirus, Parvovirus… Trên nái mang thai, virus ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào bạch cầu, tế bào đơn nhân trong dòng máu để đến cơ quan sinh sản. Cảm nhiễm có thể xảy ra ở bất cứ giai đoạn nào của quá trình mang thai nhƣng biểu hiện lâm sàng phụ thuộc vào lớn vào giai đoạn nhiễm trùng của bào thai và độc lực của chủng virus gây bệnh. Nhiễm trùng ở giai đoạn đầu và giai đoạn giữa của kỳ mang thai không có hay chỉ có tác động nhẹ so với cảm nhiễm ở giai đoạn sau. Cảm nhiễm xảy ra trong thời kỳ phôi thƣờng có mức độ biểu hiện bệnh rất thấp vì tế bào phôi chƣa biệt hoá, không thích hợp cho sự nhân lên của virus. Mặt khác, lúc này trứng thụ tinh chƣa gắn chặt chẽ với nội mạc tử cung nên sự truyền virus từ mẹ sang phôi bị hạn chế. Trong khi ở giai đoạn sau của kỳ có mang, nhau thai và mạch máu nuôi thai rất phát triển, nhau thai trở thành bộ phận trao đổi chất cần thiết, đồng thời là cầu nối truyền virus và kháng thể chống virus từ mẹ sang thai. Virus có thể qua nhau ở dạng tự do hay kết hợp với các tế bào khác của thú mẹ. Nhiễm trùng giai đoạn này tạo ra nhiều vết bong tróc nhỏ trên tế bào biểu mô nhau thai và bệnh tích hoại tử động mạch cuống rốn, từ đó làm cho bào thai bị thiếu dƣỡng chất, thiếu O2, gây sảy thai kỳ cuối, heo con sinh ra yếu ớt, dị tật và tăng tỷ lệ thai chết tƣơi khi sanh (Prieto và cs, 2000; dẫn liệu của Hoàng Văn Năm, 2001). Nhiễm bệnh dai dẳng cũng là một đặc trƣng của Arterivirus, sự tồn tại dai dẳng gây ra nhiễm bệnh âm ỉ, virus hiện diện ở mức độ thấp trong cơ thể thú và giảm dần theo thời gian (Trần Đức Minh). Theo R.Allende và cs (2000) vào ngày 150 sau gây nhiễm thực nghiệm không phân lập đƣợc virus bằng nuôi cấy tế bào và không phát hiện đƣợc RNA của virus bằng phƣơng pháp RT-PCR. 19 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ cơ chế sinh bệnh của virus PRRS (Nguồn:Rosssow, 1998) Virus PRRS Lây lan trực tiếp qua đƣờng tiêu hoá, gieo tinh và hô hấp Nhân lên trong màng nhày phổi hoặc đại thực bào Virus tấn công vào hạch lâm ba Vào máu gây virus huyết Phân bố đến các hệ thống của cơ thể và tới các tế bào đơn nhân hoặc đại thực bào Biểu hiện lâm sàng Nái : Sảy thai Phối không đậu Heo sơ sinh Khó thở, dấu hiệu thần kinh và tỷ lệ chết cao Heo sau cai sữa Gia tăng tỷ lệ chết, có biểu hiện hô hấp Heo thịt Sốt, ăn ít Nọc Ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh 20 2.3.4. Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng bệnh thể hiện rất khác nhau, theo ƣớc tính, cứ 3 đàn đầu tiên tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện bệnh, một đàn có biểu hiện ở mức độ vừa và một đàn ở mức độ nặng. Lý do cho việc này vẫn chƣa có lời giải, tuy nhiên với những đàn khoẻ mạnh thì mức độ bệnh cũng giảm nhẹ hơn, và cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau. Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dƣơng tính nhƣng không có biểu hiện lâm sàng (phòng Dịch tễ, Cục Thú y). Theo Trần Đức Minh thì mức độ lâm sàng thay đổi tuỳ chủng virus, sự biến động khả năng gây bệnh của virus, hàm lƣợng virus tăng trong máu và các mô, khả năng của các chủng có độc lực cao để tái sản hữu hiệu hơn trong cơ thể ký chủ. Bệnh tích  Bệnh tích đại thể: - Da có thể xuất huyết, thâm tím do chảy máu trong mô. - Phổi tụ huyết, viêm phổi thuỳ trƣớc với những ổ viêm đốm màu xám, có nhiều dịch ở phổi và màng bao tim. - Có những ổ hoại tử trên nhau thai của nái bệnh.  Bệnh tích vi thể: - Viêm phổi hoại tử. - Có sự thoái hoá các đại thực bào ở tiểu phế nang. Hình 2.4. Triệu chứng tai xanh Hình 2.5. Sảy thai do virus PRRS (Nguồn: và 2.3.5. Chẩn đoán 2.3.5.1. Chẩn đoán lâm sàng 21 Theo Benfiled (1999), khi trong đàn heo có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên các hạng heo, sinh sản bất ổn và năng suất đàn giảm hơn bình thƣờng thì có thể nghi ngờ bệnh do virus PRRS. Mặt khác, theo Taylor (1995) và dẫn liệu của Hoàng Văn Năm (2001) có cơ sở nghi ngờ bệnh khi: Tỷ lệ chết lúc sinh >20% Tỷ lệ sảy thai >8% Tỷ lệ heo con chết trƣớc khi cai sữa >26% Tỷ lệ heo con chết trong tuần đầu tiên vƣợt quá 25%. Tuy nhiên, để xác định đúng căn bệnh cần thực hiện các phƣơng pháp chẩn đoán phi lâm sàng khác (dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2. Chẩn đoán phi lâm sàng 2.3.5.2.1. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể 2.3.5.2.1.1. Phản ứng IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay) Đây là phản ứng đầu tiên đƣợc sử dụng để phát hiện kháng thể kháng virus PRRS đƣợc gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp. Kỹ thuật này có thể thực hiện trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC-145. Tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ sẽ đƣợc gây nhiễm với PRRSV và đƣợc ủ ở 370C trong 24 giờ. Sau đó tế bào đƣợc gây nhiễm sẽ đƣợc cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ khoảng 1 giờ ở 370C và đƣợc cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng virus thì 30-50% tế bào sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch chromogen trong 30 phút. Không có sự thay đổi màu của tế bào khi kết quả là âm tính. IPMA đƣợc sử dụng nhiều ở châu âu. Trong chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, ngƣời ta thƣờng sử dụng IPMA vì xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7-15 ngày và có thể phát hiện kháng thể đến 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là không thể xác định trực tiếp hàm lƣợng kháng thể bảo vệ. 2.3.5.2.1.2. Phản ứng IFA (Indirect Immunhofloresence Assay) 22 Giống nhƣ trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào. Quá trình thực hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein isothiocynate). Việc đọc kết quả cần phải có kính hiển vi huỳnh quang. sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ mẫu có kháng thể kháng virus. Phản ứng có độ đặc hiệu cao 99,5% và cho phép phát hiện kháng thể kháng virus đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Nhƣợc điểm của IFA và IPMA là không thể làm tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn. 2.3.5.2.1.3. Phản ứng SN (Serum Neutralizing) Đây là phản ứng trung hòa virus, phản ứng này có độ đặc hiệu cao nhất, đƣợc sử dụng để phát hiện và định hiệu giá kháng thể kháng virus. Nhƣợc điểm của phản ứng này là đắc tiền, khó thực hiện và tốn thời gian vì kháng thể trung hoà xuất hiện chậm (1-2 tháng sau khi nhiễm). Tuy nhiên đây là phản ứng rất tốt để xác định miễn dịch bảo hộ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007 và dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). 2.3.5.2.1.4. Phản ứng ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Xét nghiệm ELISA (xét nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn kết enzyme) có độ nhạy và độ đặc hiệu cao và thực hiện đơn giản hơn so với IFA và IPMA, có thể phát hiện kháng thể trong vòng 3 tuần sau khi nhiễm bệnh. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất của phƣơng pháp này là dễ cho kết quả dƣơng tính giả. Tỷ số S/P (sample/position)≥0,4 thì kết quả đƣợc ghi nhận là dƣơng tính. Các phản ứng IFA, SN, ELISA đƣợc sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm ở miền Nam nƣớc Mỹ (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.2. Các phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên Phƣơng pháp FA (florescent antibody staining-kháng thể huỳnh quang) và IHC (immunohistochemistry staining-hoá mô miễn dịch) có thể đƣợc sử dụng để phát hiện kháng nguyên virus trong mẫu mô. 23  Phƣơng pháp FA có thể thực hiện trực tiếp trên các mẫu đông lạnh. Phƣơng pháp này cho kết quả nhanh và chi phí thấp, tuy nhiên lại có độ nhạy và độ đặc hiệu không cao. để đảm bảo kết quả chẩn đoán, mẫu cần đƣợc lấy và làm lạnh nhanh.  Phƣơng pháp IHC cũng đƣợc thực hiện trên mẫu mô cắt lát, tuy nhiên phƣơng pháp này có thể thực hiện với các mẫu mô đã đƣợc cố định bằng formol. Điều này là khá quan trọng vì rất thuận lợi trong việc bảo quản mẫu bệnh phẩm. IHC có độ nhạy cao hơn so với FA nhƣng mất nhiều thời gian và tốn chi phí hơn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). 2.3.5.2.3. Phát hiện gen của virus PRRS Kỹ thuật PCR đƣợc phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu bệnh phẩm. Kỹ thuật này không những có độ đặc hiệu và độ nhạy cao mà thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm cũng ngắn hơn so với phƣơng pháp nuôi cấy tế bào vì thế nó đƣợc sử dụng khá rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện virus. Nhiều dạng khác nhau của PCR đƣợc sử dụng, hầu hết chúng đƣợc sử dụng để phát hiện các vùng ORFs 7, ORFs 6 hay ORFs 1b của virus. Để gia tăng độ nhạy trong chẩn đoán PRRSV, nhất là để phân biệt 2 dòng virus thì Han-Kook Chung và cs (2002) đã sử dụng phƣơng pháp multiplex reverse transcription-nested PCR (RT-nPCR) . Fun in wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn tại của virus PRRS trong xác heo thƣơng phẩm và trong tinh dịch con đực. Tuy nhiên kết quả chẩn đoán chƣa đủ làm cơ sở để kết luận bệnh mà chỉ cho phép xác định tình trạng nhiễm của đàn và kỹ thuật này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ kỹ thuật cao. Các quy trình thu nhận và trữ mẫu, quy trình chiết tách và tinh sạch RNA phải đƣợc thực hiện một cách nghiêm ngặt. Do đó kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác nhau. 2.3.5.2.4. Phân lập virus trên môi trƣờng tế bào Trong phân lập virus, cũng nhƣ các phƣơng pháp chẩn đoán khác, khâu đầu tiên và quan trọng nhất đó là cách lấy mẫu và bảo quản mẫu. Mẫu xét nghiệm có thể là huyết thanh, dịch tràn ổ bụng, dịch phế nang, dịch mẫu mô (hạch, phổi, lách). 24 Trong số đó thì dịch phế nang và huyết thanh đƣợc đánh giá là mẫu tốt nhất cho việc phân lập virus khi dịch bùng phát. PRRSV tồn tại trong huyết thanh lâu hơn trong mô, nhƣng đối với thú già thì lại có nhiều PRRSV trong mô hơn trong máu. Đối với các trƣờng hợp sảy thai ở thời kỳ cuối hay sinh sớm thì nên lấy mẫu ở những heo con sinh ra yếu, trƣớc khi cho bú hơn là thai khô, thai chết lƣu. Việc phân lập virus đối với những thú nhiễm bệnh mãn tính thì hạch amiđan, dịch rữa khí quản là những mẫu có khả năng nuôi cấy tốt hơn so với mẫu huyết thanh và phổi. Một điểm quan trọng khác cần chú ý là nhiệt độ bảo quản mẫu trong quá trình vận chuyển và phân lập virus. Các mẫu bệnh phẩm cần phải đƣợc bảo quản ở 40C hay thấp hơn trong quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm và thời gian giữ mẫu ở nhiệt độ này tốt nhất là không quá 48 giờ. Những mẫu bệnh phẩm lƣu giữ trong một thời gian dài bắt buộc phải đƣợc bảo quản ở -700C, không đƣợc đông và rã đông mẫu nhiều lần. Việc phân lập virus gặp nhiều khó khăn vì virus chỉ có thể nhân lên trên hai loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (Porcine Alveolar Macrophage-PAM) và tế bào thận khỉ (MARC-145, CL2621). Tuy nhiên theo Yoon và Stevenson (1999) thì không phải tất cả virus PRRS đều phát triển ở cả hai loại tế bào này mà PAM nhạy cảm với virus hơn so với CL2621, đặc biệt khi mẫu đƣợc dùng là huyết thanh. Còn Han-Kook Chung và cs (2002) cho rằng PRRSV chủng Châu Mỹ phát triển tốt hơn trên MARC-145, ngƣợc lại PRRSV chủng Châu Âu lại phát triển nhanh hơn trên PAM. 25 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ 3/2007 đến 8/2007 3.1.2. Địa điểm  Địa điểm lấy mẫu: một số trại heo tại TP HCM và các vùng lân cận.  Địa điểm xét nghiệm: - Phòng nuôi cấy tế bào, Bộ Môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi- Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM. - Trung Tâm Phân Tích Hoá Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM. 3.2. Đối tƣợng và số lƣợng mẫu 3.2.1. Đối tƣợng Heo nái rối loạn sinh sản, thai chết sau khi sinh và heo sau cai sữa có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ bệnh. 3.2.2. Số lƣợng mẫu 11 mẫu gồm: - 6 mẫu huyết thanh. - 3 mẫu phổi. - 2 mẫu hạch phổi. 3.3. Nội dung nghiên cứu  Xác định thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) trên loại lọ nuôi cấy 25cm2 với những lƣợng tế bào là 7.105 và 106. 26  Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng MARC-145 từ các loại mẫu: huyết thanh, phổi, hạch phổi của đối tƣợng lấy mẫu.  Xác định sự hiện diện của virus PRRS từ dịch tế bào MARC- 145 sau gây nhiễm bằng kỹ thuật RT- PCR. 3.4. Vật liệu và dụng cụ 3.4.1. Thiết bị và dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào và phân lập virus PRRS Các dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, bình đá… Tủ cấy; tủ ấm CO2. Kính hiển vi soi ngƣợc. Máy ly tâm.Ống ly tâm vô trùng. Lọ nuôi cấy tế bào 25cm2. Pipette. 3.4.2. Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC- 145  Dòng tế bào và gốc virus chuẩn do AAHL (Australian Animal Health Laboratory) cung cấp.  Môi trƣờng phát triển: trong 100ml môi trƣờng gồm: - EMEM (Egle Minimun Essential Medium): 86,25 ml - Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml. - Glutamine 2,92%: 1ml. - Na Pyruvate 100mM: 1ml. - LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml. - Sodium Bicarbonate 7%: 1ml. - Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 40000UI Penicillin, 40000µg Streptomycin): 0,25ml. - Kháng nấm (trong 1ml có 500µg Amphotericin B): 0,5ml  Môi trƣờng duy trì: giống môi trƣờng phát triển nhƣng chỉ dùng 2% huyết thanh thai bò.  PBSA (Phosphate buffer saline solution A).  Trypsin 1X. 27  Thuốc nhuộm Trypan Blue 0,22%. 3.4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phản ứng PCR - Tủ cấy vô trùng. - Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C). - Tủ -700C (Sanyo Ultra Low). - Tủ -200C (CFC Free Sanyo Brandt) - Tủ lạnh. - Máy vi sóng (Electrolux). - Máy chụp gel (Biorad). - Máy PCR (Biorad). - Máy Vortex. - Bộ nguồn và bồn điện di. - Micropipet, đầu tuýp và eppendorf. 3.4.4. Vật liệu và hoá chất cho chiết tách RNA Vật liệu và hoá chất trong phƣơng pháp không sử dụng TRIzol - Dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2-mercaptoethanol, pH 7.0). - Phenolchloroform. - Isopropanol. - Ethanol 75%. - RNAse - free water. 3.4.5. Vật liệu và hoá chất sử dụng cho RT-PCR - Nƣớc không có Rnase. - Tfl DNA Polymerase (Promega). - dNTPs (Promega). - Cặp mồi. - RNA mẫu chuẩn. - RNA thu đƣợc từ mẫu ly trích. - AMV reverse transcriptase (Promega). 28 - MgSO4 (Promega). - AMV/Tfl reaction buffer (Promega). 3.4.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR - Agarose (Biorad). - TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na2EDTA, nƣớc cất hai lần khử ion đã hấp khử trùng). - Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE). - Ladder 100bp. - Ethidium bromide. 3.5. Phƣơng pháp tiến hành 3.5.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Huyết thanh: cố định heo, lấy máu khoảng 4- 5ml tại tĩnh mạch cổ (heo cai sữa), tĩnh mạch tai (heo nái). Sau đó cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và chắt lấy huyết thanh vào eppendorf vô trùng. Hạch phổi, phổi (chỉ lấy ở heo chết sau khi sinh và heo sau cai sữa): lấy mẫu hạch phổi, phổi cho vào bao nylon sạch, buộc chặt và cho vào bình đá vận chuyển về phòng thí nghiệm. Mẫu sau khi lấy đƣợc chuyển về phòng thí nghiệm và đƣợc xử lý tiến hành phân lập virus ngay. Nếu mẫu chƣa đƣợc phân lập ngay sẽ đem bảo quản ở -700C tại Trung Tâm Phân Tích Hoá Sinh Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM. 3.5.2. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC- 145 3.5.2.1. Hồi phục tế bào Tế bào đƣợc trữ dƣới dạng đông lạnh ở trong nitơ lỏng, khi muốn sử dụng thì phải hồi phục lại tế bào. Các bƣớc hồi phục tế bào: Lấy lọ đựng tế bào từ bình nitơ lỏng ra, ngâm vào nƣớc ấm 370C, chờ đến khi nƣớc đá tan hết thì lấy ra. Dùng pipette chuyển lƣợng tế bào bên trong lọ sang ống ly tâm. Cho thêm 10ml môi trƣờng phát triển vào, chầm chậm từng giọt một. Dùng pipette trộn nhẹ để hỗn hợp hòa đều với nhau. 29 Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó bỏ phần nƣớc trên, búng đều vào đáy lọ ly tâm để các tế bào tách rời nhau. Cho 3ml môi trƣờng phát triển vào, dùng pipette trộn đều rồi hút khoảng 0,1ml ra để đếm. Cho tế bào vào lọ nuôi cấy đã có sẵn 8-10ml môi trƣờng phát triển. Đƣa lọ tế bào vào tủ ấm ở 370C có bổ sung 5% CO2. Sau 24 giờ thì thay đổi môi trƣờng. 3.5.2.2. Cấy chuyển tế bào Khi tế bào đã mọc đầy bề mặt nuôi cấy, tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành cấy chuyển.  Tách tế bào ra khỏi lọ Rút bỏ môi trƣờng trong lọ nuôi cấy, rửa lớp tế bào bằng 8-10ml PBSA, rồi rút bỏ. Cho vào 3ml trypsin, để trong tủ ấm 5 phút sau đó cho một tay cầm lọ tế bào đập nhẹ vào lòng tay kia để đảm bảo tách ra thành những tế bào riêng lẻ. Bất hoạt trypsin bằng 3ml môi trƣờng phát triển, rồi rút cho vào ống ly tâm (loại 15ml). Dùng thêm 7ml môi trƣờng phát triển để rửa lại lọ nuôi cấy rồi hút cho vào ống ly tâm. Ly tâm 1500 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó đổ phần nƣớc trên, búng vào đáy lọ ly tâm cho các tế bào rời nhau. Cho vào ống ly tâm 3ml môi trƣờng phát triển, trộn đều bằng pipette rồi lấy ra 0,1ml để đếm tế bào.  Đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ▫ Cách tiến hành Trộn 100µl huyễn dịch tế bào và 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10). Đƣa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella. 30 Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt, có điểm sáng ở giữa), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu L). Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer ▫ Cách tính kết quả Trong đó: C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng.  Cho lƣợng tế bào cần cấy chuyển vào trong lọ nuôi cấy mới đã có 8-10 ml môi trƣờng phát triển.  Đƣa lọ tế bào vào ủ ấm 370C có bổ sung 5%CO2.  Theo dõi cứ 3 giờ một lần sự phát triển của tế bào đầy bề mặt nuôi cấy lọ 25cm 2 với những lƣợng tế bào 7.105 và 106. Kết quả đƣợc xử lý bằng phần mềm staTGraphics Ver. 7,0. 3.5.3. Phƣơng pháp phân lập virus Virus PRRS đƣợc phân lập theo sơ đồ 3.1. Số tế bào trong 1ml: C = n*d*10 4 4 31 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ phân lập và xác định virus PRRS. (ĐC: đối chứng. US: chủng Châu Mỹ. EU: chủng Châu Âu) Mẫu (huyết thanh, phổi, hạch phổi) xử lý mẫu Gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. … ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hàng ngày trong 7 ngày. Gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. … ĐC(+)US ĐC(+)EU ĐC(-) Mẫu Thu hoạch dịch tế bào Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày trong 7 ngày RT-PCR RT-PCR Ghi nhận kết quả gây nhiễm lần một Có bệnh tích tế bào. Bệnh tích tế bào nghi ngờ hoặc không có bệnh tích Thu hoạch dịch tế bào. Nhận định kết quả. Ghi nhận kết quả gây nhiễm lần hai 32  Phƣơng pháp xử lý mẫu để phân lập virus Mẫu hạch phổi, phổi đƣợc nghiền trong dung dịch đệm phosphat PBS (cứ 1gam bệnh phẩm nghiền trong 5ml PBS). Sau đó, ly tâm huyễn dịch 5000vòng/phút trong 15 phút. Hút phần nƣớc trong cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản trong tủ -700C. Huyết thanh và mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ lọc qua lƣới lọc 0,2µm trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng tế bào.  Phƣơng pháp gây nhiễm tế bào lần thứ nhất với các mẫu đã xử lý Khi tế bào đã phát triển đầy bề mặt lọ nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp thì tiến hành gây nhiễm tế bào. - Lấy lọ tế bào ra, thay môi trƣờng phát triển bằng môi trƣờng duy trì. - Gây nhiễm tế bào bằng mẫu huyết thanh, phổi, hạch phổi đã đƣợc xử lý với thể tích là 1ml. Lƣu ý khi đƣa mẫu vào môi trƣờng tế bào cần đƣa vào bề mặt khác bề mặt tế bào tăng trƣởng trong lọ nuôi cấy. - Cho lọ tế bào đã đƣợc gây nhiễm vào tủ ấm 370C có 5%CO2. Sau 24 giờ thay môi trƣờng duy trì. - Theo dõi và ghi nhận bệnh tích tế bào hằng ngày. Sau 7 ngày thu hoạch dịch tế bào nuôi cấy.  Phƣơng pháp thu hoạch dịch tế bào - Để lọ tế bào sau khi gây nhiễm 7 ngày vào ngăn đá tủ lạnh cho đến khi tế bào và môi trƣờng đông thành đá, sau đó lấy ra đánh nhẹ vào lòng bàn tay để tế bào bong ra hết rồi để ở nhiệt độ phòng để rã đông tế bào và môi trƣờng. Lặp lại động tác trên thêm 2 lần nữa. - Hút toàn bộ môi trƣờng trong lọ tế bào vào một ống ly tâm. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút. Hút lấy phần nƣớc bên trên cho vào eppendorf vô trùng và bảo quản ở -700C.  Phƣơng pháp gây nhiễm lần hai bằng dịch tế bào đã thu hoạch Các bƣớc thực hiện giống nhƣ gây nhiễm lần thứ nhất nhƣng thay mẫu huyết thanh, phổi và hạch phổi bằng dịch tế bào đã thu hoạch. 33 Xử lý mẫu  Phƣơng pháp xác định sự hiện diện của virus bằng kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT- PCR đƣợc thực hiện theo sơ đồ 3.2 với các mẫu thu hoạch đƣợc sau hai lần gây nhiễm. Sơ đồ 3.2. Sơ đồ thực hiện phản ứng RT-PCR Để thực hiện phản ứng phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn cDNA sau phiên mã ngƣợc với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chúng tôi thực hiện kỹ thuật RT-PCR một bƣớc nhằm hạn chế sự lây nhiễm. Mẫu (Dịch tế bào) Ly trích RNA virus Kỹ thuật RT-PCR một bƣớc Điện di sản phẩm RT-PCR Nhuộm gel Quan sát kết quả điện di (dƣới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, đƣợc quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad) 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong suốt thời gian tiến hành đề tài, kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc nhƣ sau 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Để khảo sát đặc điểm phát triển của tế bào MARC-145 hiện có, chúng tôi ghi nhận thời gian một lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp) với hai mức tế bào ban đầu đƣa vào môi trƣờng là 7. 105 và 106, khảo sát đƣợc lặp lại 2 lần. Thời gian một lần cấy chuyển không những giúp xác định tính ổn định của tế bào mà còn có thể chủ động về thời gian phân lập virus. Trong quá trình thực hiện nuôi cấy tế bào MARC-145 ở bình flash 25 cm2, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Thời gian một lần cấy chuyển tế bào MARC-145 Lƣợng tế bào (tế bào/ml) Thời gian phát triển đầy bề mặt nuôi cấy (giờ) Lần 1 Lần 2 Trung bình 7.10 5 72.75 72 72.56 10 6 46.25 45.75 46 Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy, khi thực hiện cấy chuyển tế bào MARC- 145 trên bình 25cm2, với lƣợng tế bào 7.105 thì trung bình sau 72,56 giờ tế bào sẽ phát triển đầy bề mặt nuôi cấy. Khi lƣợng tế bào là 106 thì thời gian tế bào tạo thành một lớp ngắn hơn, trung bình là 46 giờ. Kết quả này tƣơng đối phù hợp với kết quả của Hoàng Thanh Hải (2005) (70,5 giờ và 43,5 giờ) và của Võ Thị Đan Thanh (2006) với lƣợng tế bào 7.105 và 106 thì thời gian một lần cấy chuyển trung bình là 71 giờ và 45.5 giờ. Nhƣ vậy, sự phát triển của dòng tế bào MARC-145 chúng tôi đang sử dụng tƣơng đối ổn định có thể dùng để phân lập virus PRRS. 35 4.2. Kết quả gây nhiễm lần một trên môi trƣờng tế bào MARC-145 Với 11 mẫu (gồm 6 mẫu huyết thanh, 3 mẫu phổi và 2 mẫu hạch phổi) đƣợc lấy từ thai chết tƣơi và heo con yếu có biểu hiện lâm sàng nghi ngờ nhiễm virus PRRS, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Sau khi gây nhiễm, chúng tôi so sánh biểu hiện bệnh tích trên môi trƣờng tế bào đã đƣợc gây nhiễm với các mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm bằng việc đánh giá tế bào chết sau khi gây nhiễm. Kết quả gây nhiễm lần một đƣợc ghi nhận ở bảng 4.2. Chúng tôi nhận thấy: Sau khi gây nhiễm 2 ngày, 1 mẫu hạch phổi trong số 5 mẫu phổi và hạch phổi đã có biểu hiện bệnh tích tế bào. Bệnh tích chủ yếu tế bào co tròn, chết và bong lên khỏi bề mặt nuôi cấy. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần đến ngày thứ 7 là 85%. Kết quả của chúng tôi tƣơng tự nhƣ nhận xét của Võ Thị Đan Thanh (2006) về kiểu bệnh tích trên môi trƣờng tế bào. Tuy nhiên về thời gian và tỷ lệ tế bào chết khác nhau, điều này có thể do nhiều yếu tố ảnh hƣởng nhƣ địa điểm, thời gian và đời của tế bào MARC-145 chúng tôi sử dụng. Hai mẫu khác (1 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi) đƣợc chúng tôi xếp vào nhóm mẫu có biểu hện bệnh tích nghi ngờ sau lần gây nhiễm đầu tiên do tỷ lệ tế bào chết thấp (5-20%) và thời gian xuất hiện bệnh tích lâu (sau 5 ngày nuôi cấy). Toàn bộ 6 mẫu huyết thanh đều có kết quả giống đối chứng âm. Nhƣ vậy, trong tổng số 11 mẫu gây nhiễm lần đầu tiên, có 1 mẫu hạch phổi có biểu hiện bệnh tích tế bào, 1 mẫu phổi và 1 mẫu hạch phổi khác có bệnh tích ở dạng nghi ngờ, các mẫu còn lại đều giống đối chứng âm. Khi phân lập virus trên môi trƣờng tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm hoặc không gây bệnh tích tế bào ở lần gây nhiễm đầu tiên, nhƣng ở lần gây nhiễm tiếp theo (passage) có thể xuất hiện bệnh tích (Murphy và cs, dẫn liệu của Võ Thị Đan Thanh, 2006). Do đó, chúng tôi thu hoạch dịch tế bào và gây nhiễm lần 2 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. 36 Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm lần 1 trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Loại mẫu Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả CPE 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày HT1 0 0 0 0 0 0 0 - HT2 0 0 0 0 0 0 0 - HT3 0 0 0 0 0 0 0 - HT4 0 0 0 0 0 0 0 - HT5 0 0 0 0 0 0 0 - HT6 0 0 0 0 0 0 0 - P1 0 0 0 0 0 0 0 P2 0 0 0 0 5 10 20 ± P3 0 0 0 0 0 0 0 - HP1 0 10 30 50 65 80 85 + HP2 0 0 0 0 5 10 15 ± HT: huyết thanh P: phổi HP: Hạch phổi CPE: Cytopathogenic effect: bệnh tích tế bào +: có bệnh tích tế bào -: không bệnh tích ±: bệnh tích nghi ngờ 37 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 10 mẫu dịch tế bào thu hoạch trong lần gây nhiễm đầu đƣợc chúng tôi thực hiện gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả gây nhiễm lần hai trên môi trƣờng tế bào MARC-145 Loại mẫu Tỷ lệ tế bào hƣ họai sau khi gây nhiễm (%) Kết quả C.P.E 1 ngày 2 ngày 3 ngày 4 ngày 5 ngày 6 ngày 7 ngày DTBHT1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT2 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT4 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT5 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHT6 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP1 0 0 0 0 0 0 0 - DTBP2 0 0 0 8 15 20 25 ± DTBP3 0 0 0 0 0 0 0 - DTBHP2 0 0 0 5 10 15 20 ± CPE: Cytopathic effect (bệnh tích tế bào) +: có bệnh tích tế bào HP: hạch phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HT: huyết thanh : không có bệnh tích tế bào P: phổi DTB: dịch tế bào Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy: các mẫu có kết quả nghi ngờ ở lần gây nhiễm thứ nhất, sau khi gây nhiễm lần hai có biểu hiện bệnh tích tế bào sớm hơn (lúc 4 ngày) nhƣng tỷ lệ tế bào chết không tăng nhiều. Tỷ lệ tế bào chết vào ngày thứ 7 là 20-25 %. Do đó, chúng tôi vẫn xếp 2 mẫu này vào nhóm mẫu có bệnh tích nghi ngờ. 38 Nhƣ vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trƣờng tế bào MARC-145, có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) là 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi. Một số hình ảnh về phân lập virus trên môi trƣờng tế bào MARC-145: Hình 4.1. Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.2. Mẫu không có bệnh tích tế bào (độ phóng đại 100 lần) 39 Hình 4.3. Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.4. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu HP. (độ phóng đại 100 lần) 40 Hình 4.5. Bệnh tích tế bào vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm ở mẫu P2. (độ phóng đại 100 lần) 4.4. Kết quả RT-PCR Sau hai lần gây nhiễm, chúng tôi tiến hành thu hoạch dịch tế bào và thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định sự hiện diện của virus PRRS trong môi trƣờng tế bào. Chúng tôi chỉ tiến hành chạy PCR trên những mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào vì điều kiện thiếu hoá chất. Tuy nhiên do một số hạn chế trong thời gian chúng tôi đang tiến hành kỹ thuật này nhƣ hoá chất, máy đọc gel bị trục trặc,... nên chúng tôi gởi mẫu đi xác định bằng kỹ thuật RT-PCR. 41 Bảng 4.4 Kết quả RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau khi gây nhiễm CPE: cytopathic effect (bệnh tích tế bào) HT: huyết thanh +: có bệnh tích tế bào P: phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HP: hạch phổi -: không bệnh tích tế bào DTB: dịch tế bào KTH: không thực hiện Loại mẫu Gây nhiễm lần một Gây nhiễm lần hai Kết quả CPE Kết quả RT-PCR Kết quả CPE Kết quả RT-PCR DTB HT 1 KTH KTH DTB HT 2 KTH KTH DTB HT 3 KTH KTH DTB HT 4 KTH KTH DTB HT 5 KTH KTH DTB HT 6 KTH KTH DTB P 1 KTH KTH DTB P 2 ± KTH ± DTB P 3 KTH KTH DTB HP1 + + KTH DTB HP2 ± KTH ± 42 Việc gây bệnh tích tế bào và kết quả RT-PCR dƣơng tính dã xác định sự hiện diện của virus trong mẫu xét nghiệm. Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thực hiện thành công việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ mẫu hạch phổi. Điều này cũng cho thấy môi trƣờng tế bào MARC-145 là môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển của virus PRRS và có thể sử dụng cho phân lập. Kết quả của chúng tôi phù hợp với sự nhận định của Jeong-Ki Kim và cs (2005): tế bào MARC-145 là dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus này. Hình 4.6. Kết quả RT-PCR mẫu ly trích từ dịch nuôi cấy tế bào USA: chủng Châu Mỹ EU: chủng Châu Âu Lad: thang chuẩn Giếng 1: mẫu DTB HP từ kết quả CPE lần một. Giếng 2: mẫu DTB P2 từ kết quả CPE lần hai. Giếng 3: mẫu DTB HP2 từ kết quả CPE lần hai. 1 2 3 Lad USA EU Band 200bp 43 Trong tổng số 11 mẫu phân lập, chúng tôi đã ghi nhận đƣợc có 3 mẫu có bệnh tích tế bào khi gây nhiễm trong đó có 2 mẫu cho kết quả nghi ngờ. Các mẫu cho bệnh tích trên tế bào MARC-145 là mẫu phổi và hạch phổi của heo sau cai sữa có biểu hiện bệnh lý hô hấp. Bằng kỹ thuật RT-PCR xác định đƣợc 1 mẫu dịch tế bào từ hạch phổi có sự hiện diện virus PRRS, chiếm tỷ lệ 50% (1/2 hạch phổi). Kết quả của chúng tôi khác với Hoàng Thanh Hải (2005), tác giả chƣa thành công trong việc phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 từ các loại mẫu đƣợc lấy từ lò mổ nhƣ: huyết thanh, máu, hạch phổi và dich rữa khí quản. Sự khác nhau này theo chúng tôi có thể tác giả chỉ dựa trên kết quả ELISA dƣơng tính. Mặt khác, không thể loại trừ các yếu tố có thể ảnh hƣởng đến kết quả phân lập nhƣ đối tƣợng lấy mẫu, cách bảo quản, xử lý mẫu và đời của tế bào MARC-145 khi sử dụng. So với kết quả của Võ Thị Đan thanh (2006), chúng tôi đã thành công trong việc phân lập virus từ hạch phổi. Vậy ngoài hai loại mẫu thƣờng đƣợc sử dụng để phân lập virus PRRS là huyết thanh và hạch amiđan thì mẫu hạch phổi cũng cho kết quả khả thi khi phân lập virus này. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Thời gian tế bào MARC-145 phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào một lớp với lƣợng tế bào 7.105 và 106 là 72,565 giờ và 46 giờ. Phân lập virus PRRS trên môi trƣờng tế bào MARC-145 với 4 loại mẫu chúng tôi có đƣợc: hạch amiđan, huyết thanh, phổi, hạch phổi. Có 3 mẫu có biểu hiện bệnh tích tế bào trong tổng số 11 mẫu chúng tôi có đƣợc chiếm tỷ lệ 27,27%. Biểu hiện bệnh tích tế bào xuất hiện từ ngày thứ hai sau gây nhiễm và tăng nhanh vào những ngày tiếp theo ở mẫu hạch phổi. Bằng kỹ thuật RT-PCR, trong 3 mẫu có bệnh tích tế bào có 1 mẫu cho kết quả dƣơng tính chiếm 33,33% trên mẫu xét nghiệm. 5.2. Tồn tại Chƣa xác định đƣợc liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50 - Tissue culture infected dose 50). Chƣa xác định đƣợc chủng Châu Âu hay chủng Châu Mỹ. Số lƣợng mẫu còn hạn chế nên không thể kết luận đƣợc mẫu nào là tốt nhất cho phân lập virus PRRS khả thi. Chƣa xác định sự hiện diện virus PRRS trên các mẫu không có bệnh tích tế bào. 5.3. Đề nghị Tiếp tục phân lập virus với số lƣợng mẫu nhiều hơn. Xác định chủng virus phân lập. Cần xác định bằng kỹ thuật RT-PCR đối với những mẫu không có bệnh tích. Xác định TCID50. 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt 1. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, Tp. HCM. 2. Hoàng Thanh Hải, 2005. Thử nghiệm nuôi cấy tế bào MARC-145, ứng dụng kỹ thuật ELISA và nuôi cấy tế bào để chẩn đoán bệnh do virus PRRS trên heo. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. 3. Hoàng Văn Năm, 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp). Tạp chí khoa học thú y. Số 1/2002. Tr. 74- 87. 4. Hoàng Văn Năm, 2001. Hội chứng sinh sản và hô hấp ở lợn (bài dịch tổng hợp). Tạp chí khoa học thú y. Số 2/2001. Tr. 65- 75. 5. Nguyễn Ngọc Hải, 2007. Công nghệ sinh học trong thú y. NXB Nông Nghiệp, Tp.HCM. 6. Phòng Dịch tễ-Cục Thú y. Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. 7. Thanh Thuận, 2002. Bệnh hô hấp của lợn - Tổng quan (bài dịch từ báo cáo tại International Pig Health Conference- Bangkok 3/2001). Tạp chí khoa học thú y số 1/2002. Tr76. 8. Trần Đức Minh. Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Bài dịch từ “Theriogenology 66 (2006): 655-662”). 9. Trần Thanh Phong, 1996. Giáo trình bệnh truyền nhiễm do virus trên heo. Tủ sách Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Tr. 99- 104. 10. Võ Thị Đan Thanh, 2006. Phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145 và xác định virus bằng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Tp. HCM.  Tài liệu nƣớc ngoài 11. Ausvetplan, 2004. Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome. 46 12. Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. In disease of swine, 8 th edition. Ed.Straw B.E., D ’ Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J..Iowa State University Press, Ames- Iowa, USA. p.201- 220. 13. Butler M, 2004. Animal cell culture and technology. The second edition- bios scientific publishers. P.1, P.55-58. 14. Delputte P. L, Vanderheijden N, Nauwynck H. J, 2001. Involvement of matrix protein in attachment of porcinereproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages. http//www. pubmedcentral.gov. 15. Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae, 2002. Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested PCR. p59. 16. Jeong-Ki Kim, Al-Majhdi Fahad, Kumar Shanmukhappa, and Sanjay Kapil, 2005. Defining The Cellular Target(s) Of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Blocking Monoclonal Antibody 7G10. 17. Kim H.S., Kwang J., Yoon I.J., Joo H.S., Frey M.L., 1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus a homogeneous subpopulation of MA- 104 cell line. Arch.Virol.133: 477- 483. 18. Meulenberg Janneke J.M., 2000. PRRS, the virus. http//www.csirus.com. 19. Nathalie Vanderheijden, Delputte Peter L., Favoreel Herman W., 2003. Involvememt of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages.http//www. pubmedcentral.gov. 47 20. Prieto C., and Castro J.M., 2000. Pathogennesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in gestating sows. Vet.Res.31:56- 57. 21. R.Allende, W.W.Laegreid, G.F.Kutish, J.A.Galeota, R.W.Wills and F.A.Osorio, 2000. Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus: Description Of Persistence In Individual Pigs Upon Experimental Infection. Journal of Virology. p. 10834 – 10837. 22. Rosso K.D.,1998. Review article: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome. Vet Pathol 35: 1-20. 23. Sinjder E.J., and Meulenberg J.J.M, 1998. Review article: the molecular biology of arteriviruses. Journal of General Virology 79: 961- 979. 24. Suarez Paloma, 2000. Ultrastructural pathogenesis of the PRRS virus. http//www.csirus.com. 25. Yoon K.J.,and Stevenson G., 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome. Trends in emerging viral infection of swine. Iowa State Press. P.347- 354.  Tài liệu Internet PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP PHA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO Tất cả các thao tác đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng.  Pha môi trƣờng EMEM (pha một lít). Cho 500 ml nƣớc cất khử ion vào bình thuỷ tinh. Cho một gói EMEM dạng bột (9,6g một gói) vào bình sao cho bột không dính vào thành, lắc kĩ để bột tan. Khuấy từ tối thiểu một giờ để bột tan hoàn toàn. Làm đầy thành một lít. Lọc tiệt trùng môi trƣờng với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không trong tủ cấy vô trùng. Chắt ra một lọ nhỏ để ở 370C trong 48 giờ để kiểm tra sự tiệt trùng. Phần còn lại trữ trong ngăn dƣới của tủ lạnh.  Phƣơng pháp pha LAH 25% (pha một lít). Cân 250g LAH cho vào trong một lọ thuỷ tinh một lít, cho 500ml nƣớc cất khử ion vào lọ rồi dùng khuấy từ làm cho tan bột. Khi bột tan hết thì làm đầy thành một lít. Chia vào các lọ nhỏ, hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, trữ ở 40C.  Phƣơng pháp pha glutamine (pha một lít). Cân 29,2g glutamine và cho vào một lít, không cho bột dính vào thành lọ. Đong một lít nƣớc khử ion và cho vào lọ sao cho tan hết bột ở thành lọ. Trộn tối thiểu 15 phút để hoà tan. Khi tan hết, lọc với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không. Khi lọc xong chiết ra lọ 5ml. Trữ lạnh đông.  Phƣơng pháp pha dung dịch P/S (Penicillin/Streptomycine) để pha 500ml (trong 1ml có 40000UI Penicillin và 40000 g Streptomycine). Lấy 20 lọ benzylpenicillin 1000000UI và 20 lọ Streptomycine Sulfate 1g. Bóc bỏ lớp vỏ để lộ phần cao su. Lấy xilanh hút 10ml nƣớc khử ion vào mỗi lọ Penicillin, 5ml vào mỗi lọ Streptomycine. Khi bột tan hút Penicillin và Streptomycine từ lọ cho vào lọ 500ml. Rửa lại các lọ nhƣ trên. Làm đầy thành 500ml với nƣớckhử ion. Chia nhỏ ra lọ 1ml và 4ml. Trữ -200C.  Pha dung dịch kháng nấm (Fungizone): pha 50ml dung dịch trong đó có 500 g Amphotericine B/ml. Lấy một lọ kháng nấm Amphotericine B (25mg/lọ), dùng xilanh bơm 10ml nƣớc cất khử ion vào lọ thuốc, lắc cho tan. Sau khi bột tan hút dung dịch từ lọ vào lọ 100ml. Bơm 10ml nƣớc cất để tráng sạch. Làm đầy thành 50ml Chia thành lọ nhỏ 2ml. trữ -200C.  Pha Na pyruvate100mM: Na pyruvate đã đƣợc nhà sản xuất pha sẳn ở dạng lọ 100ml. Do đó, chỉ cần tách ra các lọ 5ml để thuận tiện cho việc sử dụng.  Tổ hợp môi trƣờng phát triển: trong 100ml môi trƣờng gồm: Huyết thanh thai bò (FBS): 8ml. Glutamine: 1ml. Na pyruvate 100mM: 1ml. LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml. Sodium Bicarbonate 7%: 1ml. Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 400000UI penicillin, 400000 g streptomycine): 0,25ml. Kháng nấm (trong 1ml có 500 g amphotericine B): 0,5ml. EMEM (Eagle Minimum Essential Medium): làm đầy thành 100ml.  Môi trƣờng duy trì giống môi trƣờng phát triển nhƣng thay 8% FBS bằng 2% FBS.  Quy trình pha PBSA (phosphate bufferd saline solution A) pha 200ml. Cho 200ml nƣớc cất khử ion vào chai thuỷ tinh có nắp. Cho 2 viên PBSA vào. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Lƣu ý không đƣợc vặn nắp quá chặt. Sau khi hấp xong vặn chặt nắp, trữ lạnh 40C.  Pha trypsine 0,5% Cho 0,5ml EDTA-Tripsin vào ống falcon 15ml. Cho tiếp 9,5ml PBSA đã hấp khử trùng vào. Trộn đều và trữ ở 40C.  Pha hoá chất ly trích RNA Pha Sodium citrate.2H2O 0,75M - Cho 2,005g Sodium citrate.2H2O vào chai đã đựng 7ml H2O. - Dùng NaOH chuẩn độ đến pH 7,0. - Thêm nƣớc cho đủ 10ml. Pha Sarkosyl 10% - Cho 10ml nƣớc khử DEPC vào chai. - Cho 1g Sarkosyl vào khuấy tan. Pha -mercaptoethanol - Cho 0,36ml nƣớc khử DEPC vào eppendorf 1,5ml. - Cho 0,41g -mercaptoethanol vào., lắc đều cho tan hết. - Bảo quản trong 1 tháng ở nhiệt độ phòng. Pha dung dịch ly giải tế bào - Cho 40ml nƣớc đã khử DEPC vào chai. - Cho 37,092g guanidium thiocyanate vào. - Thêm 1,7ml Sodium citrate.2H2O 0,75M và 2,5ml Sarkosyl 10%. - Cho nƣớc khử DEPC vào đến khi đủ 50ml. - Khuấy trên máy khuấy có gia nhiệt ở 650C. - Bảo quản đƣợc ở nhiệt độ phòng trong 3 tháng, nếu ở nhiệt độ thấp hơn thì guanidium thiocyanate sẽ bị kết tủa. - Khi sử dụng thì cho thêm vào 0,36ml -mercaptoethanol/50ml dung dịch ly giải tế bào.  Quy trình ly trích RNA không sử dụng TRIzol o Bƣớc 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào  350 l dịch mẫu mô đƣợc nghiền nhuyễn trong PBS hay 350 l dịch tế bào.  500µl dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2-mercaptoethanol, pH 7.0). o Bƣớc 2: Phân tách và tinh sạch RNA  50µl sodium acetate 2M, pH 4.0; 600µl phenolchloroform.  Ủ ở 370C trong 5 phút.  Votex mạnh trong 15 giây và để yên ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.  Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. o Bƣớc 3: Kết tủa RNA  Thu dịch nổi.  Kết tủa RNA bằng 500µl isopropanol.  Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C.  Hút bỏ dịch nổi, thu cặn. o Bƣớc 4: Rửa RNA  Rửa cặn với 1ml ethanol 75%.  Ly tâm 9000 vòng/phút trong 2 phút.  Rửa lại lần nữa.  Làm khô tự nhiên trong chân không khoảng 5-10 phút. o Bƣớc 5: Hòa tan RNA  Hòa tan với 30µl nƣớc không chứa RNase (RNase – free water) trên đá, trộn đều và ủ ở 55-600C trong 10 phút.  Giữ RNA trong tủ -700C. Nên sử dụng RNA để thực hiện phản ứng PCR càng sớm càng tốt vì RNA để lâu dễ bị enzyme RNAse phân huỷ. Thời gian một lần cấy chuyển Analysis of Variance for TGIAN.ketqua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:TGIAN.ltb 705.69922 1 705.69922 7295.934 .0001 RESIDUAL .1934500 2 .0967250 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 705.89267 3 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for TGIAN.ketqua -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 4 59.282500 .1555032 58.613424 59.951576 A:TGIAN.ltb 700000 2 72.565000 .2199148 71.618783 73.511217 1E6 2 46.000000 .2199148 45.053783 46.946217 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TGIAN.ketqua by TGIAN.ltb -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1E 2 46.000000 X 700000 2 72.565000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 700000 - 1E6 26.5650 1.33815 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.