Khóa luận Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật ở vườn quốc gia Cát Tiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: PHAN TRUNG HẬU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT Ở VƢỜN QUỐC GIA CÁT TIÊN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ PHAN TRUNG HẬU ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , người đa ̃tâṇ tình hướng dâñ và taọ moị điền kiêṇ để em thưc̣ hiêṇ khóa luâṇ này. Thạc sĩ Kiều Phương Nam , là người thầy hết lòng tận tụy tuyền đạt những kinh nghiệm quí báo trong suốt quá trình làm đề tài. Em xin cảm ơn thầy rất nhiều! Quý thầy cô bộ môn công nghệ sinh học, cùng các thầy cô trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã chỉ dạy và truyền đạt cho chúng em những kiến thức quý báu suốt 4 năm học qua. Em cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tư trường ĐH Khoa hoc̣ Tư ̣nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đôṇg viên tôi những lúc găp̣ khó khăn trong đề tài. Cảm ơn tất cả các thành viên lớp CNSH 29 và các baṇ thân đa ̃cùng tôi chia sẻ những nỗi buồn vui những năm đaị hoc̣. Và trên hết , con cảm ơn ba má , và các anh chị đa ̃luôn chăm lo , ủng hộ, tin tưởng và khích lệ con những lúc khó khăn nhất để con có thể vững bước trên con đường đã chọn. Tháng 9/2007 Phan Trung Hậu iv TÓM TẮT Đề tài “Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trƣởng thực vật ở vƣờn quốc gia Cát Tiên” được thực hiện tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007. Kết quả: - Phân lập và làm thuần được 75 chủng vi sinh vật từ vườn Quốc Gia Cát Tiên. Trong đó có 45 chủng trên môi trường chọn lọc MMS (khoáng MS+1% methanol) và 30 chủng trên môi trường chọn lọc MSo (môi trường MS loại bỏ các thành phần chứa nitrogen). - Sàng lọc qua 2 hệ thống (khả năng tác động lên chồi thuốc lá trong điều kiện in vitro và khả năng kích thích hạt nảy mầm của hạt đậu xanh trong điều kiện in vivo), chúng tôi chọn lọc được 9 chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng trên thực vật bao gồm: 6012a, 6019a, 6019b, 6021a, 6027a, ON16a, ON20a, ON28a và ON29b. Kết quả định danh: Chủng 6012a và 6027a được định danh tới cấp độ giống là vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium. Riêng chủng 6012a có thể là một loài mới. Các chủng 6019a, 6019b, 6021a, ON16a, ON20a, ON28a, ON29b là nấm men và có đặc điểm tương đồng với các giống nấm men sau: - Các chủng 6019b, ON16a, ON20a, ON29b có điểm tương đồng với giống Pichia. - Chủng 6019a có điểm tương đồng với giống Cocidiascusc. - Chủng 6021a có điểm tương đồng với giống Rhodotorula. - Chủng ON28a có điểm tương đồng với giống Endomycopsis. v MỤC LỤC CHƢƠNG..................................................................................... ...............TRANG Trang tưạ ................................................................................................................... i Lời cảm ơn .............................................................................................................. iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................... v Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... viii Danh sách các hình ................................................................................................. ix Danh sách các sơ đồ và biểu đồ .............................................................................. xi Danh sách các bảng ................................................................................................ xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ............................................... Error! Bookmark not defined. 1.1. Đặt vấn đề .......................................................... Error! Bookmark not defined. 1.2. Mục tiêu ............................................................. Error! Bookmark not defined. 1.3. Yêu cầu ............................................................... Error! Bookmark not defined. Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................... Error! Bookmark not defined. 2.1. Vườn Quốc gia Cát Tiên ................................... Error! Bookmark not defined. 2.2. Sơ lược sự tương tác giữa vi sinh vật và thực vật ........... Error! Bookmark not defined. 2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tương tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tương tác.................................. .................................................................................... 7 2.2.1.1. Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật............ ...... Error! Bookmark not defined. 2.2.1.2. Vi sinh vật gia tăng dinh dưỡng cho cây ..... Error! Bookmark not defined. 2.2.2. Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trưởng ở thực vật. ..... Error! Bookmark not defined. 2.3. Các phương pháp định danh vi sinh vật ............. Error! Bookmark not defined. 2.3.1. Phương pháp truyền thống .............................. Error! Bookmark not defined. vi 2.3.1. Phương pháp hiện đại ...................................... Error! Bookmark not defined. vii Chƣơng 3: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP ........... Error! Bookmark not defined. 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.2. Vật liệu ............................................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.2. Thiết bị dụng cụ .............................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3. Hóa chất .......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.2.3.1. Môi trường phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dưỡng methyl (MMS)……………….. ............................................. Error! Bookmark not defined. 3.2.3.2. Môi trường chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) . Error! Bookmark not defined. 3.2.3.3. Môi trường nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Error! Bookmark not defined. 3.2.3.4. Các môi trường khác .................................... Error! Bookmark not defined. 3.3. Phương pháp thí nghiệm .................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1. Phân lập và làm thuần ..................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.1. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu: .......................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.2. Phân lập chọn lọc ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.1.3. Giữ giống ... ………………………………………………………………….Error! Bookmark not defined. 3.3.2. Định tính .......................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2.1. Khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng kiện in vitro và in vivo ........................................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.2.2. Xử lý thống kê .............................................. Error! Bookmark not defined. 3.3.2.3. Quan sát hình thái ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3. Định danh vi khuẩn ......................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa .... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.2. Đặc điểm sinh lý ........................................... Error! Bookmark not defined. 3.3.3.3. Đặc điểm sinh hóa ........................................ Error! Bookmark not defined. viii 3.3.3.4. So sánh tính tương đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard ................. Error! Bookmark not defined. 3.3.3.5. Phân tích trình tự rDNA 16S. ....................... Error! Bookmark not defined. 3.3.4. Định danh nấm men ........................................ Error! Bookmark not defined. 3.3.4.1. Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men ... Error! Bookmark not defined. 3.3.4.2. Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men ....... Error! Bookmark not defined. Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................. Error! Bookmark not defined. 4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ........................... Error! Bookmark not defined. 4.2. Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tương tác với thực vật. .............. Error! Bookmark not defined. 4.2.1. Khảo sát khả năng kích thích tăng trưởng thực vật của các chủng VSV trong điều kiện in vitro ....................................................... Error! Bookmark not defined. 4.2.2. Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống .... Error! Bookmark not defined. 4.3. Định danh vi sinh vật ......................................... Error! Bookmark not defined. 4.3.1. Kết quả quan sát hình thái ............................... Error! Bookmark not defined. 4.3.2. Định danh vi vi khuẩn.................................................................................... 59 4.3.2.1. Kết quả khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa......................... 59 4.3.2.2. Phân tích trình tự rDNA 16S .......................................................................70 4.3.3. Định danh nấm men .......................................................................................77 4.3.3.1. Quan sát các đặc điểm hình thái nấm men ..................................................77 4.3.3.2. Các đặc điểm sinh lí, sinh hóa .....................................................................80 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ....................... Error! Bookmark not defined.2 5.1 Kết luận .................................................... Error! Bookmark not defined.2 5.2 Đề nghị ....................................................... Error! Bookmark not defined. ix TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………….. ………….85 PHỤ LỤC viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair EDTA Ethylene-Diamine-Tetraacetic-Acid MS Murashige và Skoog, 1962 CMS Môi trường bổ sung 2% cao thịt và 2% casein MMS môi trường Methanol Minerol Salts Gram (-) Gram âm Gram (+) Gram dương PPFM Pink-Pigment Facultative Methylotrophic PCR Polymerase chain reaction MSo Môi trường khoáng MS không có nitrogen DNA Deoxyribonucleotide Acid Taq Tag polymerase LDC Lysine decarboxylase PHB Poly-beta-hydroxybutyrate ix DANH MỤC CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi khuẩn biến dưỡng methyl; (B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập .......................................................................... 6 Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật ................................................. 10 Hình 2.3: Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa ............................................... 11 Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR .................................................... 41 Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên chồi thuốc lá sau 2 tuần ............................................................................................. 49 Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung chủng 6027a .............................................................................................................. 49 Hình 4.3: Kết quả tương tác của 2 chủng vi sinh vật ON16a (A), ON29b (B) lên chồi thuốc lá ..................................................................................... 52 Hình 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của chúng 6012a so với đối chứng sau 2 ngày. .......................................................................... 55 Hình 4.5: Kết quả khảo sát khả năng kích hạt nảy mầm của chủng ON20a so với đối chứng. .......................................................................................... 57 Hình 4.6: Hình thái tế bào qua kính hiển vi vật kính 100X. ..................................... 60 Hình 4.7: Khảo sát ngưỡng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn 6012a và vi khuẩn 6027a ........................................................................................... 63 Hình 4.8: Kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR của hai chủng vi khuẩn. .................................................................................................................... 66 Hình 4.9: Kết khảo sát khả năng cố định nitơ của hai chủng 6012a và 6027a. ................................................................................................................... 67 Hình 4.10: Kết quả định tính PHB của chủng 6012a dưới kính hiển vi huỳnh quang bươc sóng 460nm. ............................................................................. 68 Hình 4.11: DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn. ..................................................... 71 x Hình 4.12: Sản phẩm PCR với cặp mồi (2F, 2R). ..................................................... 72 Hình 4.13: Sản phẩm PCR với cặp mồi (27F, 1525R).............................................. 73 Hình 4.14: Sản phẩm PCR với cặp mồi (520F, 920R).............................................. 74 Hình 4.15: Mối quan hệ phát sinh loài của chủng 6012a với tất cả các chủng chuẩn của các loài Methylobacterium đã và sẽ công bố trong năm 2007 dựa trên trình tự rDNA 16S nguyên vẹn ................................... 76 xi DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1: Quy trình thí nghiệm ............................................................................ 24 Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS ................................... 47 Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS .......................... 48 Biểu đồ 4.3: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MSo ..................................................... 51 Biểu đồ 4.4: So sánh ảnh hưởng của vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MSo .............................................. 51 Đồ thị 4.1: Đường tương quan tuyến tính giữa giá trị OD610nm và mật độ tế bào .......................................................................................................... 61 Đồ thị 4.2: Đường cong tăng trưởng của 2 chủng vi khuẩn phân lập được ........... 61 Biểu đồ 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy ..................... 62 Biểu đồ 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của hai chủng vi khuẩn trên môi trường dịch thể CMS sau 3 ngày nuôi cấy .................................... 62 xii DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR ............................................................................................... 37 Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) ............... 47 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưởng của các chủng vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo .................... 50 Bảng 4.3: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl ................................................................................... 53 Bảng 4.4: Kết quả khảo sát khả năng kích thích nảy mầm của các chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường MSo ...................................................... 55 Bảng 4.5: Bảng thống kê các đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật có khả năng tương tác với thực vật ......................................................... 58 Bảng 4.6: Các đặc điểm hình thái cơ bản của 2 chủng vi khuẩn ............................. 60 Bảng 4.7: Đặc điểm biến dưỡng carbon của hai chủng 6012a và 6027a .................. 64 Bảng 4.8: Bảng kết quả thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR và hoạt tính Catalase……………………………………………………………………66 Bảng 4.9: Bảng tổng kết các đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn ................................................................................................. 69 Bảng 4.10: Nồng độ và độ tinh sạch DNA bộ gen của chủng phân lập được ghi nhận qua máy đo Nanodrop ........................................................ 71 Bảng 4.11: Hệ số tương đồng di truyến của chủng 6012a với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố .................................................................... 75 Bảng 4.11: Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men .......................................... 78 Bảng 4.12: Khả năng lên men đường glucose .......................................................... 80 Bảng 4.13: Khả năng đồng hóa nguồn carbon và đồng hóa nitrat ............................ 80 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi nền nông nghiệp. Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Bên cạnh đó, gần đây nhiều công bố khoa học cho thấy tiềm năng sử dụng tương tác có lợi giữa vi sinh vật với cây trồng để kích thích sinh trưởng ở thực vật, trong đó các vi sinh vật có khả năng cố định nitrogen và biến dưỡng methyl đang thu hút được rất nhiều sự quan tâm. Khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng vi sinh vật này được biết đến thông qua cơ chế cố định đạm hoặc sự sản sinh các hợp chất sinh học như các phytohormone, vitamin và cả một số loại enzyme có khả năng ức chế sự phát triển của mầm bệnh qua đó kích thích sinh trưởng của cây chủ. Chính bởi những ưu điểm này mà việc tìm ra các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đang là một hướng đi đầy tiềm năng. Đặc biệt trong điều kiện nước ta là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học phong phú với các khu bảo tồn thiên nhiên còn hoang dã, thì tiềm năng tìm thấy các chủng vi sinh vật có ích trên là rất lớn. 2 Trên những cơ sở đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Phân lập và định danh một số vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trƣởng thực vật ở vƣờn Quốc gia Cát Tiên”. 1.2 Mục tiêu  Phân lập và tuyển chọn những vi sinh vật có đặc tính tương tác thực vật để ứng dụng trong nông nghiệp.  Định danh để tìm kiếm các loài mới. 1.3 Yêu cầu  Phân lập và làm thuần được một số chủng vi sinh vật có khả năng biến dưỡng methyl và cố định nitrogen ở vườn Quốc gia Cát Tiên.  Khảo sát để chọn lọc những vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật từ những chủng phân lập được.  Bước đầu định danh các chủng vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật dựa vào các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1 Vƣờn Quốc gia Cát Tiên [23] Vườn Quốc gia Cát Tiên (VQGCT) nằm trên vùng chuyển tiếp từ cao nguyên xuống đồng bằng qua địa phận ba tỉnh: huyện Cát Tiên, Bảo Lâm (tỉnh Lâm Đồng); Bù Đăng (tỉnh Bình Phước); Vĩnh Cửu, Tân Phú (tỉnh Đồng Nai). Chính vì thế vườn có nhiều dạng địa hình: từ núi cao, sườn dốc, đồi nhấp nhô cho đến thềm sông bằng phẳng, nhiều thác ghềnh, suối lớn và những vùng đầm lầy ngập nước. VQGCT cách thành phố Hồ Chí Minh 150km với tổng diện tích là 73878 ha, tài nguyên thiên nhiên phong phú, đa dạng và là một trong những Vườn Quốc gia lớn nhất Việt Nam.  Hệ thực vật Vườn Quốc gia Các Tiên có nhiều dạng sinh cảnh: rừng nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae); rừng nửa rụng lá nguyên sinh và thứ sinh trên đất thấp ưu thế bởi các loài Lagertroemia sp. đất ngập nước ngọt và trảng cỏ ngập nước theo mùa ưu thế bởi các loài Saccharum sp. rừng ngập lụt ưu thế bởi các loài Hydrocarpus sp. xen lẫn Ficus benjamina và các kiểu sinh cảnh thứ sinh như rừng tre nứa, trảng cỏ... Hệ thực vật đã ghi nhận 1362 loài thực vật bậc cao có mạch, trong số đó có 34 loài có tên trong "Sách Đỏ" Việt Nam và nhiều loài cây gỗ có giá trị như gõ đỏ, xoay, cẩm lai, giáng hương quả to  Hệ động vật 4 Theo thống ghi nhận 77 loài thú, 318 loài chim, 58 loài bò sát, 26 loài ếch nhái, 130 loài cá. Trong số đó có các loài thú lớn quý hiếm và một số loài có nguy cơ đe doạ tuyệt chủng toàn cầu như tê giác Java, bò tót, voi Châu Á, cá sấu nước ngọt (Crocodylus siamensis); một số loài chim đặc hữu như gà so cổ hung (Arborophila davidi), gà tiền mặt vàng (Polyplectron germani), một số loài chim nước quý hiếm như quắm cánh xanh (Pseudibis davisoni), ngan cánh trắng (Cairina scutulata), già đẫy nhỏ (Leptoptilos javanicus). Đối tượng bảo tồn là rừng cây họ Dầu, các hệ sinh thái đặc thù, các loài tê giác, cá sấu, bò tót, các loài chim đặc hữu. VQGCT thực sự là kho bách khoa toàn thư sống cho công tác nghiên cứu thế giới tự nhiên 2.2 Sơ lƣợc sự tƣơng tác giữa vi sinh vật và thực vật Các vi khuẩn tương tác với thực vật rất đa dạng về giống loài và cơ chế tương tác với thực vật. Những vi khuẩn này là một bộ phận quan trọng trong quá trình phát triển của thực vật. Mặc dù các nghiên cứu về vi khuẩn tương tác thực vật chủ yếu tập trung vào các vi sinh vật gây bệnh trên thực vật và các vi sinh vật cố định nitơ. Tuy nhiên, mối quan tâm về sự đa dạng của các vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật đã và đang gia tăng. Và thực tế trong tự nhiên có nhiều loại vi sinh vật có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật, nhưng chúng chỉ chiếm một tỷ lệ nhỏ trong quần thể vi sinh vật. Những vi sinh vật này có vai trò quan trọng trong nông nghiệp hay môi trường. Những tiến bộ kỹ thuật trong sinh thái và di truyền vi sinh vật đã và đang phát hiện ra nhiều loài vi sinh vật có ích, có tác động tích cực lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Đồng thời cũng làm sáng tỏ các cơ chế tương tác giữa thực vật và vi sinh vật, làm nền tảng cho việc ứng dụng các vi sinh này vào cuộc sống [18]. Các vi sinh vật tương tác với thực vật không chỉ bao gồm các vi sinh vật tiền nhân (Prokaryote) mà nó còn cả các vi sinh vật nhân thực (Eukaryote): + Prokaryote là thành phần chiếm đa số của hầu hết các quần thể vi sinh vật trong thực vật. Các prokaryote này, thường là vi khuẩn có thể hiện diện với mật độ 5 lên tới 109 tế bào trên 1 gram mô rễ. Nếu nuôi cấy chúng trên môi trường chọn lọc có thể đạt 1010 tế bào trên 1 gram sinh khối thực vật [18]. + Eukaryote bao gồm nấm sợi, nấm men, tảo, protozoa và các tuyến trùng thường tập trung với mật độ thấp hơn các prokaryote. Một thí dụ rõ ràng là các vi sinh vật cộng sinh trên rễ có thể đạt lượng tế bào trên 1 gram mô rễ là: 106-109 tế bào vi khuẩn, 107 xạ khuẩn, 105-106 tế bào nấm men, 103 đối với tảo, 102-103 đối với protozoa. Bacteriophage và các loại virus cũng là thành viên của quần thể này, chúng có thể tìm thấy trong đất với mật độ 108-109 tế bào trên một gram đất [6]. Vi sinh vật tương tác thực vật có thể phân nhóm dựa vào nơi cư trú, và bản chất tác động của chúng lên thực vật. Phân nhóm dựa vào nơi cư trú bao gồm Các vi sinh vật biểu sinh (epiphyte): bao gồm các vsv cộng sinh ở vùng rễ (Rhizosphere) và vsv cộng sinh trên bề mặt lá (Phyllosphere). Phần lớn các vi sinh vật biểu sinh tương tác thực vật sống bằng các chất dinh dưỡng thoát ra trên bề mặt cây. Ví dụ vùng rễ thường tiết ra nhựa keo (dịch nhày) chứa: Hydrat polysaccharide, acid hữu cơ, vitamin, và amino acid, đó là điều kiện tối ưu đối với một giá thể mà vi sinh vật cần cho sự sinh trưởng và phát triển. Nhựa keo được bao bọc bởi nước, và như thế giúp làm môi trường thủy giải tốt đối với rễ và vi sinh vật vùng rễ phát triển [16]. Ở vùng lá, nguồn thức ăn cho các vi sinh vật là dịch lá tiết ra. Trong nhóm vi sinh vật vùng lá thì vi khuẩn biến dưỡng methyl tùy ý (Pink-pigmented facultatively methylotrophic, PPFM) chiếm tỉ lệ lớn và nó được phân bố trên nhiều loại cây. [14]. Chúng sử dụng nguồn carbon là nguồn methanol do cây tiết ra từ quá trình phân hủy các pectin có methyl. Nhờ khả năng sử dụng nguồn thức ăn khác thường này, PPFM có thể loại bỏ các chất độc này khỏi mô thực vật, và có chỗ cư ngụ trên lá. Các PPFM sử dụng nguồn carbon, và các khoáng chất từ cây chủ, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hóa chuyển hóa quan trọng của cây chủ [19] (Hình 2.1). 6 Đa số các vi sinh vật này không làm thay đối sự sinh trưởng và sinh lý của cây. Do đó, phần lớn vi sinh vật tương tác thực vật có một tương tác hội sinh (commensalisti) với cây chủ. Hình 2.1: (A) Quá trình chuyển hóa hợp chất 1 carbon ở vi sinh vật biến dưỡng methyl (B) Khuẩn lạc Methylobacterium từ cỏ ba lá trên môi trường phân lập [20] Các vi sinh vật nội sinh (endophytic) Các vi sinh vật nội sinh (endophytic) là các vi sinh vật sống bên trong mô thực vật sống và không gây hại tới cây chủ. Chúng được phân lập từ bề mặt mô hay chiết xuất từ mô thực vật. Mặc dù, các loại nấm endophytic đã được nghiên cứu rộng rãi trong khi các vi khuẩn endophytic thì chưa, các vi khuẩn này vẫn thu hút được sự quan tâm nhờ vào tiềm năng sử dụng của chúng trong nông nghiệp. Các vsv nội sinh được phân lập từ nhiều loại mô và cây khỏe mạnh. Kobayashi và Palumbo (2000) đã biên soạn một danh sách 55 giống và 144 loài endophytic phân lập từ rễ, thân, hoa, hạt, quả của nhiều loài thực vật [14]. 7 2.2.1 Phân nhóm vi sinh vật tƣơng tác với thực vật dựa vào bản chất của sự tƣơng tác [16] Theo bản chất của sự tương tác thì các vi sinh vật tương tác được chia làm 2 nhóm: nhóm vi sinh vật có lợi cho thực vật và nhóm vi sinh vật gây bất lợi cho thực vật. Các vi sinh có lợi chiếm ưu thế là các vi sinh vật kích thích sự sinh ở thực vật sinh trưởng. Việc tìm hiểu và xác định các cơ chế này rất khó khăn do sự đa dạng của các cơ chế. Đối với các vi sinh vật cố định đạm, sự kích thích sinh trưởng chỉ thấy rõ khi cây sống trên vùng đất nghèo đạm. Đến nay khả năng kích thích sinh trưởng thực vật đến nay được hiểu theo 4 con đường chính - Gia tăng lượng các chất dinh dưỡng ở dạng dễ sử dụng cho cây - Sản xuất các phytohormone kích thích sinh trưởng thực vật - Tăng cường ảnh hưởng có lợi của các tương tác cộng sinh - Giảm tác động có hại của các mầm bệnh. 2.2.1.1 Các vi sinh vật ức chế tác hại của mầm bệnh lên thực vật: thường được tìm thấy ở các vi sinh vật nội sinh. Các vi sinh vật nội sinh bảo vệ cây khỏi sự tấn công của các mầm bệnh bằng các cơ chế sau: Cạnh tranh về nơi ở và dinh dƣỡng Các endophyte thuộc nhóm này có khả năng sinh sản rất nhanh chóng, chúng vượt qua số lượng các mầm bệnh trong cây và ức chế sự sinh sản cũng như dinh dưỡng của mầm bệnh. Ví dụ điển hình trong trường hợp này là một số loại nấm men. Sự sinh sản bằng cách nảy chồi khiến nấm men nhân lên số lượng một cách nhanh chóng và khiến sự nảy mầm của các bào tử B. cinerea hoàn toàn bị ức chế. Sự tổng hợp các loại hợp chất thứ cấp Trong nhiều nghiên cứu người ta nhận thấy các vi sinh vật nội có sự sản sinh ra các loại hợp chất thứ cấp có hoạt tính của kháng sinh do đó chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt một số loại nấm bệnh. Như trường hợp của 2 loại kháng sinh tự nhiên do Sporothrix floccolosa sản xuất ra là: heptadeceonic và methyl-hepadecenoic acid có khả năng kháng khuẩn và 8 kháng một số loại nấm như: B. cinerea, Fusarium oxysporum sp. Urquhart và Punja (2002) cũng đã tinh chế một ester acid béo với hoạt tính kháng nấm từ Tilletiopsis pallescens. Enzyme phân hủy vách tế bào [16] Nhiều nghiên cứu cho thấy , các vi sinh vật tương tác thực vật có khả năng sản sinh ra các loaị enzyme phân hủy thành lysis của tế bào các loaị mầm bêṇh như : enzyme chitinase, β-1,3-glucanase... Môṭ số loaị nấm men như Pichia anomala, P. membranifaciens,R. glutinis, C. laurentii, A. pullulans, Tilletiopsis albescens, tạo β-1,3-glucanase chống laị các loaị nấm gây bêṇh trên lá và trên quả như : A. niger, Sphaerotheca fuliginea, P. xanthii (Urquhart, 1994; Castoria, 1997; Jijakli và Lepoivre 1998; Castoria và côṇg sư ̣ , 2001; Masih và Paul 2002). Trong công trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tương quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [16]. Kích thích phản ứng phòng vệ ở cây chủ Sư ̣cảm ứng này liên quan đến viêc̣ sản xuất môṭ số hơp̣ chất như phenylalanine ammonia lyase phytoalexin, peroxidase và ethylene trong mô tế vào thưc̣ vâṭ. 2.2.1.2 Vi sinh vật gia tăng dinh dƣỡng cho cây [16] Khả năng cố định nitơ (biến đổi nitơ thành amonia) chủ yếu giới hạn trong giới prokaryotes nhưng đa dạng giữa các giống vi khuẩn. Nằm trong số gần 100 loại cố định nitơ (diazotrophic), chỉ có một vài loại có tính chuyên biệt cao, các tương tác mật thiết có thể tạo một cơ quan mới hay một cơ quan có cấu trúc giống với cơ quan của cây chủ. Tương tác đạt cực đại khi chúng chuyển sang cố định nitơ cho cây chủ, theo đó cung cấp một lượng dinh dưỡng cho cây chủ. Ngược lại cây chủ cũng giúp bảo vệ vi khuẩn khỏi điều kiện môi trường và cung cấp các hợp chất giàu năng lượng cho hoạt động cố định nitơ. Các vi sinh vật cố định đạm bao gồm vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu, các vi sinh vật tự do cố định đạm, các vi khuẩn lam… 9  Vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu Nghiên cứu điển hình nhất về tương tác cộng sinh giữa vi khuẩn và thực vật là tương tác giữa vi khuẩn tạo nốt sần trên rễ và các cây họ đậu. Các cây thuộc họ này bao gồm: đậu hòa lan, đậu nành, đậu lăng và cỏ linh lăng cũng như các loại cỏ trinh nữ, cây keo… Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn cộng sinh được phân loại thành vài giống, và các loài chuyên biệt nhất thuộc giống Rhizobium, Sinorhizobiu, Mesorhizobium, Bradyrhizobium. Hầu hết các vi khuẩn cộng sinh trên cây họ đậu đều tạo ra nốt sần trên rễ (các nốt sần này là những tín hiệu cho thấy có sự tương tác giữa vi khuẩn và cây trồng). Và trong sự đáp ứng này, có sự sản xuất các phân tử tín hiệu lipochitooligosaccharide thường được gọi là các nhân tố Nod. Các nhân tố Nod khiến các sợi rễ xoắn lại, hạn chế sự thủy phân của thành tế bào bên trong các nốt xoắn, sự lõm vào của màng plasma, sự lắng đọng của vật liệu tạo vách tế bào mới tạo ra dòng xâm nhiễm. Chúng giữ vai trò như một đường ngõ đi vào mô cây. Vi khuẩn phân chia bên trong các dòng này khi chúng phát triển xuyên qua nhiều lớp vỏ tế bào trong rễ. Một số loài vi khuẩn cộng sinh cây họ đậu khác lại xâm nhập vào cây thông qua các lỗ hổng ở biểu bì và di chuyển xuống vùng gian bào của rễ, có hoặc không có sự hình thành các dòng xâm nhiễm. Ở một vài loài cây chủ như là cỏ linh lăng và đậu hà lan, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân bên trong vỏ tế bào và gây nên các nốt sần bất định (các nốt sần này tiếp tục kéo dài phụ thuộc vào sự liên tục của mô phân sinh ở đỉnh); ở các cây chủ khác như đậu nành, vi khuẩn gây ra sự phân chia trực phân của vùng bên ngoài lớp vỏ tế bào và dẫn đến sự hình thành nốt sần bất định. Ở hai trong số 3 phân họ cây họ đậu (Mimosoideae và Papilionoideae), vi khuẩn di chuyển từ dòng xâm nhiễm vào trong tế bào chất của tế bào cây chủ bằng cơ chế nhập bào (endocytosis). Nó cho phép vi khuẩn được bao bọc bởi màng tế bào thực vật. Các vi khuẩn ở trong vùng gian bào và nội bào này được gọi là các bacteroid, phân chia cho đến khi chúng chiếm đầy tế bào cây chủ và phân hóa thành dạng giàu nitrogenase, enzyme 10 Sự gia tăng độ mật thiết của các tƣơng tác 1. Vi sinh vật cộng sinh cƣ trú ở vùng gian bào (Endosymbionts) Ví dụ: vi khuẩn cộng sinh gây nốt sần trên rễ cây họ đậu 2. Vi sinh vật cƣ trú ở vùng ngoại bào (Ectosymbionts) Ví dụ: tương tác giữa vi khuẩn lam và một số loài thực vật bậc thấp 3. Vi sinh vật bên trong mô cây chủ (Endophytes) Ví dụ: Herbaspirillum sp. ở cây mía đường 4. Vi sinh vật chỉ sống trên bề mặt cây Ví dụ: Azospirillum và Klebsiella quan trọng để cố định nitơ. Trong phân họ Caesalpinoideae, các vi khuẩn không rời khỏi trong dòng xâm nhiễm thay vào đó, các dòng xâm nhiễm phân nhánh cho đến khi nó chiếm đầy tế bào chủ. Sự cố định nitơ chỉ xảy ra khi nồng độ oxi tự do trong nốt sần đủ thấp để cho phép kích hoạt enzyme nitrogenase. Protein liên kết oxy leghemoglobin ở thực vật (có chức năng liên quan tới hemoglobin, giữ vai trò làm giảm lượng oxy khi xử dụng oxy để hô hấp). Ngoài ra còn có các các sinh vật nội bào cố định đạm không hình thành nốt sần (diazotrophic endophyte) đã được phân lập từ một số loại cây thân thảo như: bắp, lúa, mía đường, lúa mì…ví dụ điển hình về vi khuẩn nội bào cố định đạm là Gluconacetobacter diazotrophicus (trước đây là Acetobacter diazotrophicus), Herbaspirillum spp ở cây mía, Alcaligenes, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter, , Klebsiella, Pseudomonas và Rhizobium trên lúa và bắp (James, 2000). Khi chủng các loại vi khuẩn nay lên rễ, chúng sẽ xâm nhiễm vào rễ và nhiều khi là vào hệ thống mô mạch tạo thành các quần thể vi sinh vật trong vùng gian bào và có thể đạt nồng độ 101- 107 tế bào trên 1 gram trọng lượng tươi [16].  Vi sinh vật tự do cố định nitơ Đây là các loại vi khuẩn tương tác thực vật cố định đạm nhưng không xâm nhập vào một loại cây chủ theo hướng cộng sinh chuyên biệt. Hình 2.2: Phổ tương tác cố định đạm trên thực vật [16]. 11 Hầu hết các prokaryote cố định nitrogene sống trạng thái tự do. Sự cố định nitrogen ở vùng rễ phổ biến hơn do việc cố định nitrogen cần năng lượng lớn, và vùng rễ cây là vùng giàu carbohydrate. Các loài Azospirillum là những loài cố định nitrogen đầu tiên được phân lập từ rễ cây và nó có các đặc tính tốt nhất của các loài sinh vật cố định đạm tương tác thực vật. Không giống các sinh vật nội sinh cố định đạm như Gluconacetobacter diazotrophicus và Herbaspirillum sp. (nội sinh bắt buộc), Azospirillum sp. là nhóm nội sinh không bắt buộc. Chúng vừa sống được cả nội sinh và trên vùng rễ. Bên cạnh nitrogen thì phosphate là loại dinh dưỡng khoáng thứ hai ảnh hưởng nhiều lên sinh trưởng của cây. Lượng phosphate trong đất rất dồi dào nhưng phần lớn đều ở dạng chưa hòa tan. Nhiều loài vi sinh vật rễ có thể hòa tan các phosphate vô cơ bằng cách tiết ra các acid hữu cơ, như gluconic acid và 2-ketogluconic acid, hay có thể khoáng hóa phosphate vô cơ bằng cách tiết enzyme ngoại bào phosphatases. Một số loài vi khuẩn khác sản xuất các hợp chất hữu cơ (gọi là siderophore) các chất này kết hợp với Fe3+, khiến nó dễ chuyển đổi thành dạng dễ sử dụng hơn (Fe2+) [16]. Hình 2.3. Azospirillum brasilense bề mặt của rễ lúa [20] 12 2.2.2 Vi khuẩn sản xuất các chất kích thích lên sự sinh trƣởng ở thực vật. 2.2.2.1 Enzymes: Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1- aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật ở vùng rễ (Li và ctv., 2000) như: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp. Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và Variovorax paradoxus [19]. Cơ chế này được lý giải là do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ (mà ethelen này ức chế sự sinh trưởng của rễ) do đó kích thích rễ phát triển. 2.2.2.2 Phytohormone: Tác động kích thích lên sinh trưởng thực vật thường là do sự sản xuất các phytohormone. Phytohormone phổ biến nhất là auxin indole-3-acetic acid (IAA). đã có nhiều nghiên cứu về sự sản xuất auxin này ở các loài vi khuẩn như: Azospirillum brasilense, Aeromonas veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium spp., Comamonas acidovorans, Enterobacter sp., và Rhizobium leguminosarum [19]. Tuy nhiên có rất ít các vi sinh vật có khả năng tổng hợp IAA để kích thích sự sinh trưởng ở thực vật. Chúng thường là các vi khuẩn gây bệnh như Argobacterium tumefaciens, A. rhizogenes và P. syringae pv. Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh trên thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ, ngược lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt. Holland và Polacco (1994) đã nghiên cứu về Methylobacterium, cytokinin và sự phát triển của thực vật bằng cách đun hạt đậu nành (500C trong 4 giờ) để giảm khả năng nảy mầm xuống khoảng 30%. Khi đó mật độ PPFM nhiễm ở hạt cũng đồng thời giảm xuống 90%. Việc bổ sung cytokinin (benzyl adenine + zeatin 0,5 mg/l) vào các hạt này có tác dụng phục hồi tỉ lệ nảy mầm. Bổ sung PPFM vào môi trường hạt nảy mầm cũng có tác dụng tương tự như tác dụng của cytokinin [10]. Kết quả này phù hợp với giả thuyết cho rằng PPFM ảnh hưởng đến lượng cytokinin có trong mô tế bào thực vật. 13 Koenig và cộng sự (2002), nghiên cứu về mối liên hệ giữa Methylobacterium sp. và thực vật ở mức phân tử. Họ chứng minh bốn loài Methylobacterium sp. phân lập từ lá và loài M. extorquens đều tạo ra cytokinin là trans-zeatin ở mức rất thấp và tiết vào môi trường nuôi cấy [15]. Tuy nhiên, kết quả của Koenig và cộng sự đã cung cấp bằng chứng về cơ chế tổng hợp cytokinin ở các chủng Methylobacterium, là tiền đề cho các nghiên cứu về mối quan hệ giữa Methylobacterium và thực vật. Hơn nữa, bằng chứng về một vi khuẩn hội sinh tạo phytohormone đã đưa đến cái nhìn thấu đáo hơn về vai trò của vi khuẩn Methylobacterium sp. với thực vật. Kết quả: Methylobacterium sp. có khả năng tổng hợp cytokinin phù hợp với những khám phá khác và một số dinh dưỡng methyl khác (như Methylomonas methanica, Methylovorus may) có khả năng tổng hợp cytokinin [7]. Hơn thế nữa, Joshi Jagmoha và Holland (2001) đã đưa ra giải pháp tăng năng suất bằng cách phun PPFM lên cây trồng [21]. Bên cạnh đó năm 2004, Omer và cộng sự đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi trường chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn biến dưỡng methyl. Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có phản ứng dương tính với với thuốc thử Salkowski. Điều này được chứng minh rõ hơn bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết hợp với phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt nhân). Ba chủng tạo ra IAA có hàm lượng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/l nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP). Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1 – 2,4 mg/l [17], [9]. Các kết quả này đã gây được sự chú ý lớn. Agricell Report nhấn mạnh: “Việc khảo sát về khả năng vi khuẩn dinh dưỡng methyl kích thích tăng trưởng và phát sinh hình thái thực vật trong điều kiện in vitro là rất lý thú và mang lại rất nhiều triển vọng”. Hy vọng rằng các nghiên cứu về mặt sinh lý, sinh hoá và cơ chế phân tử của vi khuẩn dinh dưỡng methyl tương tác với thực vật sẽ đem lại những hiểu biết hơn về 14 nguyên lý của mối quan hệ này đồng thời mở ra hướng ứng dụng mới của công nghệ sinh học trong nông nghiệp ở điều kiện in vitro và in vivo. 2.3 Các phƣơng pháp định danh vi sinh vật Từ lâu thì việc định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật. Đồng thời, phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành để cho kết quả nhanh chóng và chính xác. 2.3.1 Phƣơng pháp truyền thống Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào. Mặc dù phương pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt là trong việc định danh các chủng mới [1]. Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiệu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng. Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất [22].  Sữ dụng khóa phân loại Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) [3]. Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp. Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau. Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên. Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống. Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện [2]. 15 Đến năm 1952, J. Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J. Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952, the yeast, a taxonomic study, North Holland, Pub Co. Amsterdam), được xuất bản lần thứ hai năm 1957. Năm 1970, J. Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản lần thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971. Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới. Hệ thống phân loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định 349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau [2].  Sử dụng phƣơng pháp số học Ngoài ra, dựa vào những thông tin về đặc điểm của vi sinh vật, người ta còn có thể tính hệ số tương đồng để đánh giá mức độ tương đồng giữa các chủng vi sinh vật. Trong đó hệ số Jaccard được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng giữa hai chủng khi muốn bỏ qua các đặc điểm mà cả hai chủng đều thiếu [1]. 2.3.2 Phƣơng pháp hiện đại  Giới thiệu Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới. Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn. Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền [3]. Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước đo tiến hóa”. Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26S rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật. Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ 16 có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình tự [1]. Phương pháp hiện đại dùng để định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện nay:  Sử dụng mẫu dò kết hợp với phƣơng pháp lai in-situ phát huỳnh quang (Fluorescence in-situ Hybridazation - FISH) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic (DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng để nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Phân tích dữ liệu các trình tự SSU rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới. Một số trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài cũng đã được xác định. Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới. Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp, đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các giới này. Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode). Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào. Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH). Phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật. 17  Phƣơng pháp lai nucleic acid [4] Thành phần base của DNA chỉ có tác dụng chứng minh các vi khuẩn là không có liên hệ với nhau. Tỷ lệ các base trong DNA có thể thay đổi trong phạm vi rất rộng. Nếu hai vi sinh vật có thành phần base khác nhau thì chúng không có liên hệ với nhau. Tuy nhiên, hai vi khuẩn có cùng thành phần base chưa hẳn là có quan hệ với nhau do trình tự base có thể khác nhau. Việc lai giữa các DNA của hai vi khuẩn cho phép định danh một loài mới hoặc xác định mối quan hệ đến mức giống và loài giữa hai vi khuẩn. Để xác định mối quan hệ giữa các chủng, thông thường người ta so sánh phần trăm lai (DNA-DNA) giữa chủng cần khảo sát với một chủng đã biết (chủng chuẩn). DNA từ chủng chuẩn được ly trích, tinh chế, đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ, phân đoạn thành những đoạn ngắn có chiều dài ngẫu nhiên, đun nóng để tách mạch. DNA từ các chủng được khảo sát cũng được chuẩn bị tương tự nhưng không được đánh dấu. Tiến hành lai mẫu DNA chủng chuẩn với nhau (đối chứng). Sau đó tuần tự lai DNA chủng chuẩn với DNA chủng cần khảo sát. Thu lấy DNA mạch kép (có lai), loại bỏ DNA mạch đơn. Đo năng lượng phóng xạ của trường hợp đối chứng. Lượng này được xem là tương đương 100% lai. Tương tự tính năng lượng phóng xạ thu được từ các trường hợp lai giữa chủng chuẩn với chủng được khảo sát. Tính phần trăm lai. Từ số liệu về mức độ lai có thể xác định mối tương quan giữa các chủng như sau: - Trên 70% lai: 2 chủng cùng loài (khác chủng) - Trên 20% lai: 2 chủng cùng giống (khác loài) - Dưới 10% lai: 2 chủng khác giống Lai nucleic acid dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các base A-T và G-C. Các đoạn polynuclotide đơn có nguồn gốc khác nhau nhưng có cấu trúc bổ sung với nhau thì chúng có thể bắt cặp với nhau tạo ra phân tử lai. Một số phương pháp lai nucleic acid thường được sử dụng: - Phương pháp lai Southern Blot 18 - Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (Rectriction Fragment Length polymorphism – RFLP) hay phương pháp dấu vân tay (Finger Printing) - Phương pháp lai Northern Blot  Khuếch đại trình tự đặc hiệu nhờ phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [12], [17] Trước khi giải trình tự đoạn gen mong muốn, thì ta cần khuếch đại chúng bằng phương pháp PCR. PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA từ mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này. Kỹ thuật này do Karl Mullis và ctv (Mỹ) phát minh năm 1985. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát hiện các mầm bệnh vi sinh vật có trong thực phẩm. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là một trình tự DNA của gen (gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc gen quy định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật này. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase, đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA trong phản ứng PCR, ở điều kiện đảm bảo hoạt động của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành một số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethibium bromide. Kỹ thuật PCR được coi là nền tảng của nhiều kỹ thuật phân tích DNA.  Giải trình tự các gen mã hóa cho tiểu phần rRNA 16S Muốn nghhiên cứu trình tự các nucleotide của một gen, một đoạn DNA, hoặc cả phân đoạn DNA cần phải tiến hành giải trình tự. Một số phương pháp giải trình tự thường dùng hiện nay: 19 Phƣơng pháp hóa học (Phương pháp Maxam và Gilbert, 1977): Các đoạn DNA được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ở dầu 5’, và được xử lý bằng các chất hóa học nhằm bẻ gãy các đoạn DNA tại các vị trí các base khác nhau. Phƣơng pháp dideoxy (Phương pháp Sanger,1977): dựa trên hoạt động của enzyme DNA Polymerase xúc tác phản ứng kéo dài chuỗi polynucleotide, và dừng lại khi gặp các dideoxynucleotide (ddNTP). Giải trình tự DNA tự động: Dựa vào sự phát tín hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. Ngoài ra, gần đây hai kỹ thuật mới được thiết lập cũng được sử dụng để định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền là Ribotyping và FAME (Fatty Acid Methyl Ester):  Kỹ thuật Ribotyping Kỹ thuật này cũng phân tích SSU rRNA (nhưng không giải trình tự) giúp định danh vi sinh vật đến mức loài, dựa trên sự sai khác trong trình tự nhận diện của các enzyme cắt giới hạn. Gen mã hóa cho SSU rRNA được khuếch đại bằng PCR, cắt bằng một hoặc vài enzyme cắt giới hạn, tách bằng điện di và lai bằng các mẫu dò. Các vạch lai là chuyên biệt cho từng loài và chủng vi sinh vật, được đưa vào cơ sở dữ liệu và được sử dụng như là các mã vạch để định danh vi sinh vật [].  Kỹ thuật Fame (Fatty Acid Methyl Ester) Kỹ thuật này dựa trên tính chuyên biệt về chủng loại và thành phần các acid béo hiện diện trong màng tế bào vi khuẩn. Tính chuyên biệt này là do sự đa dạng về chiều dài mạch, nhóm thế, vòng, hydroxyl, độ không bão hòa,…của acid béo trong màng. Việc phân tích dẫn xuất methyl ester của các acid béo này ngày càng được dùng rộng rãi trong chuẩn đoán bệnh, dịch tễ học, xét nghiệm vi sinh vật trong nước, thực phẩm… [4] 20 Chƣơng 3 3 VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2007 đến ngày 08/2007 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Mẫu thí nghiệm Nguồn mẫu để phân lập vi sinh vật (VSV) kích thích tăng trưởng ở thực vật là mẫu lá, mẫu đất, mẫu nước tại Vườn quốc gia Cát Tiên thuộc địa phận huyện Tân Phú, Tỉnh Đồng Nai vào tháng 4 năm 2007. Chủng vi khuẩn chuẩn Methylobacterium extorquen JCM 2802T từ ngân hàng vi sinh vật Nhật Bản. E. coli DH5α từ Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Đại học Quốc Gia Tp. HCM. Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv Samsun) lấy từ Trại thực nghiệm Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM, cơ sở Linh Trung-Thủ Đức, sử dụng để khảo sát hoạt tính kích thích sự tăng trưởng thực vật của chủng VSV phân lập được trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Hạt đậu xanh (Vigna radiata L., công ty cổ phần giống cây trồng miền Nam – 282, Lê Văn Sĩ, Q.Tân Bình, Tp.HCM), được sử dụng để khảo sát khả năng nảy mầm của hạt. 21 3.2.2 Thiết bị dụng cụ  Bể ổn nhiệt (Fisfer Scientific)  Bộ điện di ngang Mupid-EX (advance)  Cân phân tích  Eppendorf, micropippette, microplate (Nikko)  Hộp soi đèn tử ngoại UV (Vilber Lourmat)  Kính hiển vi  Máy đo quang phổ (Gene Quantpro)  Máy lắc tròn  Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zantrifugen)  Lò Microwave  Nồi hấp vô trùng autoclave  Tủ ấm Prolabo  Tủ cấy vô trùng  Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus) Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm sinh phân tử, vi sinh, nuôi cấy mô thực vật. 3.2.3 Hóa chất 3.2.3.1 Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi sinh vật biến dƣỡng methyl MMS. Môi trường muối khoáng MS chưa có Methanol (Phụ lục 1) sau khi hấp vô trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm, để nguội và bổ sung thêm 1% Methanol. Đối với môi trường MMS rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Môi trường MMS không bổ sung vitamine hay các yếu tố tăng trưởng khác 3.2.3.2 Môi trƣờng chọn lọc vi sinh vật cố định nitơ (MSO) Môi trường khoáng MS trong đó loại bỏ một số thành phần khoáng chứa nitrogen. Khoáng MS đã được thay thế (Phụ lục 1) Đường 30g/l 22 Đối với môi trường rắn thì bổ sung thêm Agar 20g/l trước khi hấp vô trùng ở 121 0C, áp suất 1 atm. 3.2.3.3 Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn (CMS) Môi trường khoáng MS - Murashine & Skoog, 1962 (Phụ lục 3) bổ sung thêm: Đường sucrose .................................................................. 30g/l Glycine ............................................................................. 2mg/l Meo-inositol ..................................................................... 100mg/l Vitamine B1...................................................................... 100ml/l Cao thịt ............................................................................. 2g/l Casein hydrolyase ............................................................ 2g/l Nước cất ........................................................................... vừa đủ 1L 3.2.3.4 Các môi trƣờng khác  Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng nguồn carbon của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc Môi trường dịch thể MMS trong đó Methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp nguồn carbon và bổ sung thêm chất chỉ thị pH là bromothymol blue với nồng độ cuối là 0,04%. Các chất cung cấp nguồn carbon bao gồm: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, fructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar.  Môi trƣờng YM broth Quan sát hình thái nấm men Yeast Extract .............................................................. ..... 3,0g Malt Extract ................................................................ .... 3,0g Peptone ..................................................................... .... 5,0g Glucose ................................................................... ......... 10,0g Nước cất ........................................................................... vừa đủ 1L 23  Môi trƣờng acetate agar Quan sát bào tử nấm men CH3COONa ..................................................................... 200g Agar .................................................................................. 20g Nước cất ........................................................................... vừa đủ 1L  Môi trƣờng lên men đƣờng Glucose ............................................................................. 10g Pepton .............................................................................. 10g NaCl1 ................................................................................ 1g Meat extract ...................................................................... 1g Chất chỉ thị pH Bromothymol Blue ................................. 0,018g/l Nước Cất ........................................................................... vừa đủ 1L  Môi trƣờng đồng hóa nitrogen Khảo sát khả năng đồng hóa nitrate Bacto Yeast Cacbon base ................................................ 117g/l Bổ sung thêm KNO3 (0,78%) Nguồn Nitrogen được lọc vô trùng  Một số hóa chất khác - Bộ kit nhuộm gram của hãng MERK (Đức) - Bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa dùng để định danh trực khuẩn Gram âm của công ty Nam Khoa - KOH 3% dùng để thử nghiệm String - H2O2 30% dùng trong thử nghiệm Catalase - Glycerol để giữ giống vi sinh vật - Các hóa chất dùng trong nghiên cứu về sinh học phân tử như: dung dịch CTAB 2X, TE 0.1X, TAE 2X, Phenol:Chloroform (1:1), DEPC-H2O, Tag DNA Polymerase, dNTP, Buffer 10X,… 24 3.3 Phƣơng pháp thí nghiệm Phương pháp thực hiện được trình bài dưới bảng sau: Sơ đồ 3.1: Qui trình thí nghiệm. 3.3.1 Phân lập và làm thuần Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên ở các dạng quần xã gồm nhiều quần thể. Việc nghiên cứu một quần thể VSV nhất định (tập hợp các tế bào cùng loài) sẽ phụ Chủng thuần Nguồn mẫu Phân lập, làm thuần Kích thích sự nảy mầm hạt (in vivo) Kích thích sự tăng trưởng thuốc lá (in vitro) ki Khảo sát khả năng tương tác với thực vật Quan sát hình thái, phân loại các chủng có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật Vi khuẩn Nấm men Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Định danh theo khóa phân loại của Lodder Phân tích trình tự rDNA 16S Định danh loài 25 thuộc nhiều vào khả năng phân lập, làm thuần tế bào của quần thể, khả năng giữ giống dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện trên chủng thuần. Phần lớn các phương pháp phân lập và làm thuần các chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế cho chủng quan tâm. Theo Green P.N. (1992), Methylobacterium sp. là những vi khuẩn có khả năng sử dụng Methanol làm nguồn carbon và năng lượng, vì thế môi trường MMS (Methanol Minerol Salts) là môi trường thích hợp để phân lập và làm thuần các chủng VSV có khả năng sử dụng methanol. Tuy nhiên, môi trường MMS chưa bổ sung Methanol có thành phần gần giống với môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962), vì vậy có thể sử dụng luôn môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) bổ sung thêm 1% Methanol làm môi trường phân lập và làm thuần VSV. Mặc khác các chủng vi sinh vật có khả năng cố định nitơ chúng tôi sử dụng môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) nhưng loại bỏ các thành phần có chứa nitơ (MSO). 3.3.1.1 Lấy mẫu và tăng sinh mẫu: Các mẫu đất, nước, lá lấy từ khu vực rừng Bầu Sấu thuộc vườn Quốc gia Cát Tiên. Mẫu nước có thể trải trực tiếp trên môi trường MMS và MSO Còn đối với mẫu đất và mẫu lá, tiến hành tăng sinh trên môi trường MMS, và MSO lỏng lắc 100 vòng/phút từ 2 đến 3 ngày. 3.3.1.2 Phân lập chọn lọc Hút 100 µl mẫu (nước, đất, lá) từ từng môi trường chọn lọc và trải lên môi trường rắn MMS, MSO tương ứng, ủ ở nhiệt độ 25-30 o C. Sau 2-4 ngày quan sát và chọn tất cả các khuẩn lạc đơn đem đi làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần liên tiếp (3-4 lần) trên đĩa môi trường rắn tương ứng. 26 3.3.1.3 Giữ giống Sau khi thu được các chủng thuần đem tăng sinh trong môi trường CMS và giữ giống với Glycerol 35-50%, bảo quản trong điều kiện -20oC. 3.3.2 Định tính 3.3.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trƣởng thực vật của các chủng VSV trong điều kiện in vitro và in vivo  Khảo sát trên môi trƣờng MS (Murashine & Skoog, 1962) Mục đích: Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng vi sinh vật phân lập được. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), đơn yếu tố, và gồm 46 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Vật liệu: Các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường MMS + 1% methanol, tăng sinh trên môi trường CMS sau 4 ngày. Chồi ngủ thuốc lá Nicotiana tabacum 2 tuần tuổi được nuôi cấy in vitro. Phƣơng pháp: Chồi thuốc lá được cắt sao cho đồng nhất là 2 cm ngâm vào trong dịch vi sinh vật (trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút, sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MS. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 24 ± 20C Thời gian chiếu sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux Ẩm độ: 55% - 60% Chỉ tiêu ghi nhận: 27 Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ sung theo các chỉ tiêu sau : - Độ tăng chiều cao (mm) và độ tăng trọng lượng tươi (mg) của chồi: là hiệu của chiều cao, trọng lượng tươi chồi thuốc lá sau 14 ngày thí nghiệm (chồi được lấy ra khỏi ống nghiệm để đo) với chiều cao chồi ban đầu khi cấy vô ống nghiệm - Trọng lượng khô (mg): chồi cây sau khi đo trọng lượng tươi được sấy khô ở nhiệt độ từ 45 – 50oC sau 12h và cân. - Chiều dài rễ: chồi thuốc lá sau 14 ngày được lấy ra khỏi ống nghiệm tiến hành đo chiều dài rễ (mm)  Khảo sát trên môi trƣờng MS không nitơ (MSO) Mục đích: Xác định khả năng kích thích sự tăng trưởng của thực vật của các chủng VSV phân lập được trên môi trường không nitơ. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD (Completely Randomized Design), đơn yếu tố, và gồm 31 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 5 mẫu. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Vật liệu: Các chủng vi sinh vật phân lập được từ môi trường MSo tăng sinh trên môi trường CMS sau 4 ngày. Chồi thuốc lá Nicotiana tabacum được nuôi cấy trong 2 tuần Môi trường MSo được giảm lượng đường (5 g/l) nhằm hạn chế sự phát triễn vượt mức của các chủng vi khuẩn phân lập được. Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ: 24 ± 20C Thời gian chiếu sáng: 16h Cường độ ánh sáng: 2000-3000 lux Ẩm độ: 55% - 60% Phƣơng pháp: Dịch khuẩn được đem đi đo OD610nm để xác định mật độ tế bào. 28 Chồi cây thuốc lá được ngâm vào trong dịch VSV (trừ mẫu đối chứng) trong 5 phút, sau đó cấy vào các ống nghiệm chứa môi trường MSO. Chỉ tiêu ghi nhận: Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được ghi nhận ở nghiệm thức đối chứng và có bổ sung theo các chỉ tiêu sau (Phương pháp ghi nhận chỉ tiêu giống như thí nghiệm khảo sát trên môi trường MS): - Độ tăng chiều cao chồi (mm) - Độ tăng trọng lượng tươi (mg) - Trọng lượng khô (mg) - Chiều dài rễ (mm)  Khảo sát khả năng kích thích sự nảy mầm của hạt giống trong điều kiện in vivo Mục đích: Xác định khả năng tương tác kích thích sự sinh trưởng ở thực vật Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 76 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 100 hạt. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Vật liệu: Sinh khối VSV được thu nhận sau 4 ngày nuôi cấy Hạt giống đậu xanh Giá thể: cát được rửa sạch và hấp vô trùng cho vào các khay nhựa. Phƣơng pháp Dịch vi khuẩn đem đi đo OD610nm để xác định mật độ tế bào, sau đó ly tâm thu sinh khối. Ủ hạt (100hạt/50ml dịch khuẩn) với sinh khối vi khuẩn trong 1 giờ, sau đó đặt chuyển sang các khay nhựa chứa giá thể cát. Đối chứng được thực hiện tương tự với nước cất. Các khay nhựa được ủ ở nhiệt độ phòng. Sau 48-60 giờ ghi nhận tỷ lệ nảy mầm của hạt so với đối chứng. Chỉ tiêu ghi nhận 29 Tỉ lệ nảy mầm của hạt giống. 3.3.2.2 Xử lý thống kê Số liệu thu được từ các thí nghiệm trên được xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0 3.3.2.3 Quan sát hình thái Mục tiêu: xác định hình đạng tế bào, khuẩn lạc, trên cơ sở đó sơ bộ phân chia các nhóm vi sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình định danh Tiến hành: Quan sát sự phát triển và hình dạng của khuẩn lạc sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường MMS, CMS, nhằm ghi nhận hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc. Quan sát vi sinh vật dưới kính hiển vi ở vật kính 40x. Ghi nhận đặc điểm về hình thái của vi sinh vật như hình dạng kích thước, tế bào, hình thức sinh sản. 3.3.3 Định danh vi khuẩn Sau khi nuôi cấy trên các môi trường chọn lọc, chúng ta có thể thu được các khuẩn lạc đơn thuần khiết, còn gọi là “chủng thuần”. Chủng thuần là yêu cầu cần cho việc định danh các vi sinh vật. Việc định danh này được thực hiện dựa trên các đặc điểm về kiểu hình, cùng với các đặc tính sinh lý, sinh hóa cũng như khả năng biến dưỡng một số cơ chất của các chủng vi sinh vật phân lập được, trong đó quan trọng nhất là các thử nghiệm sinh hóa. 3.3.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa  Đặc điểm hình thái  Đo kích thƣớc tế bào Sau khi nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm Crytal Violet, quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X, sử dụng kính trắc vi thị kính, vật kính để đo kích thước tế bào.  Thử nghiệm gram Phƣơng pháp nhuộm Gram Thực hiện theo phương pháp nhuộm vi khuẩn của Christian Gram Nguyên tắc: Dựa vào khả năng lưu giữ phẩm màu Crystal Violet trên thành tế bào vi khuẩn sau khi rửa bằng cồn. Vi khuẩn Gram dương có lớp vỏ tế bào dày tạo 30 bởi peptidoglycan, nhờ đó mà màu tím của Crytal Violet được gắn chắc vào tế bào (nhờ iodine) nên không bị khử bởi cồn, do đó vẫn giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu. Còn vi khuẩn Gram âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan hơn), nhưng lại có nồng độ lipid cao, khi rửa bằng cồn lớp chất béo này sẽ bị hòa tan kéo theo màu của thuốc nhuộm ban đầu, tế bào không màu lại bắt với màu hồng đỏ của thuốc nhuộm Fuschin. Như vậy, sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ; còn vi khuẩn Gram dương có màu tím. Các bƣớc thực hiện: - Nhỏ sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lên lam kính sạch (nếu mật độ vi khuẩn quá dày đặc thì có thể pha loãng ra) cố đđịnh tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa đđèn cồn. - Ngoài ra, ta cũng có thể sử dụng que cấy thu khuẩn lạc đơn từ đĩa môi trường CMS, dàn đều lên giọt nước trên lam kính sạch. - Nhuộm mẫu bằng dung dịch tím tinh thể (Crystal Violet) trong 3 phút, rửa lại bằng nước. - Nhuộm tiếp bằng dung dịch Lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước. - Rửa mẫu bằng ethanol 95%: aceton (1:1) trong 30 giây, sau đó rửa lại bằng nước. - Nhuộm tiếp mẫu bằng dung dịch Fuschin Ziehl trong 30-60 giây, rửa lại bằng nước. Để khô, quan sát sự bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi. Phƣơng pháp String test: Nguyên tắc: Dựa vào khả năng tạo nhầy (kéo sợi) giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng, vách tế bào của vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy (kéo sợi) String dương (vi khuẩn Gram âm) khi có kéo sợi, còn String âm (vi khuẩn Gram dương) khi không có kéo sợi. Thực hiện: 31 Dùng que cấy thu sinh khối vi khuẩn nuôi cấy trên đĩa môi trường CMS trải lên giọt dung dịch KOH 3% trên lam kính sạch (sinh khối càng nhiều thì hiện tượng quan sát càng rõ). Ghi nhận khả năng kéo sợi của vi khuẩn. Khả năng di động Nguyên tắc: vi khuẩn có thể di động nhờ cấu trúc protein, gọi là tiên mao (flagella). Đây có thể là một trong những căn cứ có thể dùng để phân biệt các vi sinh vật Thực hiện: Có thể ghi nhận khả năng di động của vi khuẩn bằng 2 phương pháp: - Phƣơng pháp 1: Thử nghiệm trong môi trường thạch mềm LDC (bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR). Nếu vi khuẩn mọc theo đường cấy và lan ra cả bên ngoài đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Ngược lại, nếu vi khuẩn chỉ mọc theo đường cấy mà không lan ra ngoài thì không có khả năng di động. Tuy nhiên, hiện tượng quan sát được không rõ, vì vậy cần tiến hành thí nghiệm 2. - Phƣơng pháp 2: quan sát các tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên giọt nước trên lam kính sạch, và quan sát sự di động của tế bào vi khuẩn. 3.3.3.2 Đặc điểm sinh lý  Xác định đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào Mục đích: làm cơ sở để xác định mật độ tế bào cho các thí nghiệm sau này dựa trên nồng độ OD610nm (xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục). Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi sự hiện diện của các phần tử trong môi trường lỏng làm cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Do vậy tế bào khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục, độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập được quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục [3]. 32 Thực hiện: Vi khuẩn nuôi cấy trên môi trường CMS lỏng sau đó đem đi pha loãng và đo OD610nm để được các nồng độ từ 0,1 đến 1,0. Từ các nồng độ OD610nm tiến hành pha loãng bậc 10. Tùy nồng độ OD mà có thể pha loãng từ 10-3 đến 10-12, từ mỗi nồng độ OD610nm chọn ra 3 độ pha loãng trải 0,1 ml lên đĩa môi trường CMS. Ủ 25-30oC trong 2-3 ngày, và đếm số khuẩn lạc phát triển trên đĩa (trong khoảng từ 25-300 khuẩn lạc). Tính số lượng tế bào trong 1 ml môi trường: Ni=A x10 x di Trong đó: Ni : Số lượng tế bào ở độ pha loãng di A : Số khuẩn lạc đếm được trên đĩa di : Độ pha loãng Dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD610nm và logN/ml bằng phần mềm Excel.  Xác định đƣờng cong tăng trƣởng Mục đích: Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối vi khuẩn. Thực hiện: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 25-30oC và tiến hành đo OD610nm 4giờ/lần trong vòng 60 giờ.  Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ Mục đích: xác định nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn. Thực hiện: dựa vào 2 phương pháp Phƣơng pháp 1: Cấy vi khuẩn lên các đĩa môi trường rắn CMS, ủ ở các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 30, 35, 40oC, sau 3- 4 ngày ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc. Phƣơng pháp 2: Cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng, nuôi cấy ở các nhiệt độ khác nhau 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50oC trong 3 ngày và đo OD610nm Dựa vào đường tương quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào.  Khảo sát ảnh hƣởng của pH 33 Mục đích: xác định độ pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng vi khuẩn. Thực hiện: Cấy vi khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường CMS lỏng ở các độ pH từ 4,0-9,0 (cách nhau 0,5), nuôi cấy lắc 100 vòng/phút, sau 3 ngày ghi nhận nồng độ OD610nm. Dựa vào đường quan tuyến tính suy ra mật độ tế bào. 3.3.3.3 Đặc điểm sinh hóa  Khảo sát hoạt tính Catalase Nguyên tắc: Phần lớn các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Catalase thủy phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và giải phóng O2, gây hiện tượng sủi bọt khí. Thực hiện: Nhỏ vài giọt H2O2 lên khuẩn lạc của vi khuẩn phát triển trên bề mặt thạch. Quan sát và ghi nhận hiện tượng sủi bọt khí.  Khảo sát hoạt tính Oxydase Nguyên tắc: Cytochrome Oxydase là thành phần quan trọng trong chuỗi chuyển điện tử hô hấp, với O2 là chất nhận điện tử cuối cùng nên chỉ hiện diện trong các loài vi sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Hoạt tính này được phát hiện nhờ thuốc thử p-phenylenediamine bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương. Thực hiện: dàn đều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD). Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương sau vài phút.  Khảo sát khả năng sử dụng các nguồn Carbon Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng nguồn cung cấp carbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do khi sử dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn 34 carbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường trung tính có màu xanh lá cây, môi trường acid có màu vàng, còn môi trường kiềm có màu xanh dương. Thực hiện: Chất cung cấp nguồn Carbon: acetate, betain, citrate, D-glucose, dimethylamine, ethanol, fructose, lactose, L-Abrabinose, L-glutamate, maltose, methylamine, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, Nutrient agar. Chất chỉ thị: bromothymol blue 0,04%. Pha môi trường khoáng MS và 2ml/l chất chỉ thị pH trong nhiều erlen khác nhau rồi hấp vô trùng, trong mỗi erlen bổ sung thêm 1% chất cung cấp nguồn Carbon bằng cách lọc vô trùng, chỉnh pH môi trường về pH =7. Bơm vào từng giếng của Microplate 1ml môi trường, đối với mỗi chất cung cấp carbon có thể sử dụng nhiều giếng khác nhau trong đó có 1 giếng đối chứng. Cấy 20µl dịch vi khuẩn vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng. Ủ ở 25-30OC trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).  Các thử nghiệm trong bộ sinh hóa IDS 14GNR IDS 14GNR là bộ kit 14 thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn Gram âm, được công ty Nam Khoa sản xuất nhằm giúp cho việc định danh các trực khuẩn Gram âm được nhanh chóng và dễ dàng hơn. Các thử nghiệm trong bộ kit IDS 14GNR bao gồm: Thử nghiệm lên men Glucose: các vi sinh vật có khả năng lên men đường Glucose sẽ tạo ra các sản phẩm có tính acid, làm thay đổi màu của chất chỉ thị bramothymol blue. Thử nghiệm khử nitrate: dựa trên sự tạo thành nitrite và cạn kiệt nitrate. Nitrite được tạo thành từ nitrate sẽ phản ứng với thuốc thử sulphanilamide và N- napthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất có màu hồng đỏ. Ở 35 một số trường hợp phản ứng không rõ, cần kiểm chứng lại sự cạn kiệt nitrate bằng bụi kẽm kim loại. Thử nghiệm ONPG: Các vi khuẩn chỉ lên men lactose khi có sự hiện diện của gen mã hóa enzyme –galactosidase trong tế bào. Hoạt tính của enzyme này có thể được xác định dựa vào cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG). Sự thủy phân của cơ chất đường này bởi –galactosidase sẽ phóng thích o-nitrophenol có màu vàng. Thử nghiệm urease: dựa trên khả năng tổng hợp enzyme urease, xúc tác sự thủy phân urea, giải phóng NH3 và CO2, làm tăng pH của môi trường, làm đổi màu chất chỉ thị Phenol-Red. Phản ứng (+) khi có màu đỏ cánh sen. Thử nghiệm khả năng biến dƣỡng citrate: sự biến dưỡng citrate bởi vi sinh vật sẽ tạo ra CO2, đồng thời phân giải muối ammonium, sinh NH3 làm kiềm hóa môi trường, làm đổi màu của chất chỉ thị bromothymol blue. Thử nghiệm Bile Esculin: dựa trên khả năng thủy phân glucoside trong esculin thành esculetin và glucose khi có sự hiện diện của muối mật. Esculetin phản ứng muối sắt trong môi trường tạo thành phức chất có màu đen hay màu nâu đen. Thử nghiệm khả năng sinh H2S: dựa trên khả năng khử hợp chất Sodium thiosulphate có trong môi trường để giải phóng H2S. Khí H2S tạo ra được phát hiện dựa vào phản ứng kết tủa màu đen FeS giữa H2S với ion Fe 2+ của chất chỉ thị Ferric ammonium citrate. Thử nghiệm khả năng sinh Indole: Tryptophan là một acid amine có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên các sản phẩm chứa gốc indol. Việc phát hiện indol được thực hiện bằng phản ứng của phân tử này với các thuốc thử chứa p-Dimethylaminpobenzaldehyde (p-DMABA). Nhân pyrol của indol chứa nhóm CH2 sẽ kết hợp với nhân benzen của p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ. Thử nghiệm V-P (Voges-Proskauer): trong điều kiện có oxy và pH kiềm, 2,3-butanediol bị chuyển hóa thành acetonin, và acetonin tiếp tục bị oxy hóa thành 36 diacetyl dưới sự xúc tác của –naphthol. Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có trong pepton kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Thử nghiệm khả năng biến dƣỡng Malonate: Các vi sinh có khả năng biến dưỡng manolate đồng thời có khả năng sử dụng ammonium làm nguồn đạm duy nhất. Sự tăng trưởng của vi sinh vật trên môi trường chứa Manolate làm nguồn carbon duy nhất sẽ kéo theo việc sử dụng nguồn đạm này, làm phóng thích NH3 làm kiềm hóa môi trường. Do vậy khả năng biến dưỡng manolate có thể được nhận thấy bằng sự chuyển màu của chất chỉ thị bromothymol blue trong môi trường. Thử nghiệm LDC (Lysine decarboxylase): Phản ứng được xúc tác bởi LDC sẽ loại bỏ CO2 ra khỏi lysine, CO2 sinh ra sẽ làm tăng pH của môi trường và được ghi nhận qua sự đổi màu của chỉ thị pH (bromocresol purple). Thực hiện: Tạo dịch huyền phù sinh khối vi khuẩn trong 3-5ml nước cất, hoặc nước muối sinh lý vô trùng (pha càng đục càng tốt) Bơm 200 µl dịch vi khuẩn vào các giếng của khay nhựa. Đối với ống LDC, dùng que cấy vô trùng nhúng vào dịch vi khuẩn, sau đó cắm vào ống môi trường, dán miệng ống lại. Đem tất cả đi ủ ở nhiệt độ 25-30oC trong 2-3 ngày, bổ sung thêm thuốc thử (nếu cần) và đọc kết quả theo bảng 3.1 37 Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR Stt Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Dƣơng tính Âm tính 1 Lên men glucose Không Vàng Tím 2 Khử Nitrate 1 Đĩa giấy tìm nitrate Đỏ Vàng lợt 3 Galactosidase Không Vàng Không màu 4 Urease Không Đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng 5 PDA 1 giọt FeCl3 Xanh lá đậm Vàng lợt 6 Citrate Không Xanh biển Xanh lá/vàng 7 Esculin Không Đen Không đen 8 Sinh H2S Không Đen Không đen 9 Sinh Indole Kovac Đỏ Không đổi màu 10 Voges-Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt Napthanol Đỏ Vàng nhạt 11 Sử dụng Malonate Không Xanh biển Vàng/xanh lá 12 Oxydase Không Xanh dương Không đổi màu 13 LDC Không Tím Vàng 14 MOT (di động) Không Nhòe đường cấy Không nhòe đường cấy  Khảo sát khả năng cố định đạm Dreyfus (1988) và Abdoulaye Sy (2001) đã chứng minh rằng ở một số loài Methylobacterium sp. có khả năng cố định đạm nhờ sự hiện diện của một số gen (gen nifH và gen nod) có vai trò tương tự như gen cố định đạm ở Rhizobium. Năm 2006, Raja cũng đã chứng minh được 11 chủng Methylobacterium sp. có khả năng phát triển trên môi trường khoáng MS không nitrogen, trong đó có 1 chủng chỉ có sự hiện diện của gen nifH mà không có gen nod (gen tạo nốt sần ở rễ cây). Vì thế, chúng tôi xem xét khả năng cố định đạm của các chủng phân lập được. 38 Phƣơng pháp: Cấy vi khuẩn lên các erlen chứa môi trường dịch thể NMS có bổ sung chất chỉ thị màu bromothymol blue 0,04%, nuôi cấy lắc 100 vòng/phút ở nhiệt độ 25-30oC. Sau 4-5 ngày ghi nhận sự đổi màu của môi trường so với đối chứng.  Khảo sát khả năng sinh tổng hợp PHB PHB (poly-beta-hydroxybutyrate) là nguồn carbon dự trữ ở vi khuẩn Methylobacterium. PHB là một polymer chịu nhiệt có khẳ năng phân hủy sinh học. Vì thế, việc định tính sự tích lũy PHB không những cần thiết cho mục tiêu phân loại mà còn đánh giá tiềm năng sử dụng thu nhận PHB chủng vi khuẩn mới phân lập được [1] Mục đích: Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB của các chủng phân lập được. Nguyên tắc: Sử dụng phẩm nhuộm chuyên biệt Nile Blue A để ghi nhận sự hiện diện các hạt PHB trong tế bào vi khuẩn phân lập được. Với thuốc thử này, các hạt PHB trong tế bào sẽ bắt màu cam sáng trên nền tế bào màu đen khi quan sát dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm. Vật liệu: - Sinh khối của 2 chủng vi khuẩn phân lập được. - Phẩm nhuộm Nile Blue A - Dung dịch acid acetic 8% Thực hiện: Lấy 1-2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn, đặt lên tấm lam sạch, hơ qua ngọn lửa nhiều lần để cố định tế bào trên lam. Nhuộm tế bào đã cố định bằng 1 giọt phẩm nhuộm Nile Blue A trong 15 phút ở 55oC. Rửa sạch phẩm thừa bằng nước cất, sau đó rửa lại 1 lần nữa bằng acid acetic trong 1 phút. Dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho 1 giọt nước lên lam, đậy lamen lại. Quan sát sự bắt màu cam sáng của các hạt PHB trong tế bào vi khuẩn đã được xử lý màu dưới kính hiển vi phát huỳnh quang ở bước sóng 460nm. 39 3.3.3.4 So sánh tính tƣơng đồng di truyền dựa trên hệ số Jascard (Sj) Hệ số tương đồng Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ tương đồng của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của chủng vi khuẩn phân lập được với các loài được công bố thì việc tính toán giá trị hệ số Sj là cần thiết. Hệ số Sj được tính theo công thức: Sj= a/(a+b) a: tổng số các đặc điểm tương đồng ở hai loài b: tổng số đặc điểm khác biệt ở hai loài Giá trị của hệ số Sj nằm trong khoảng 0-1 (0-100%). Nếu 2 loài có hệ số Sj >0,8 (80%) thì có khả năng thuộc cùng một loài. 3.3.3.5 Phân tích trình tự rDNA 16S  Tách chiết DNA Mục đích: Thu nhận DNA bộ gen của các chủng phân lập được. Thực hiện: theo quy trình tách chiết DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. [1]. - Ly tâm thu sinh khối - Bổ sung 600µl CTAB nóng, đem vortex thật kỹ, ủ ở 65oC trong 60 phút, để cho CTAB phá màng tế bào hoàn toàn. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, biến tính lần 1 bằng 500µl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, biến tính lần 2 bằng 500µl phenol:chloroform (1:1), lắc nhẹ. - Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút. - Thu dịch nổi, tủa bằng 1ml ethanol tuyệt đối lạnh. - Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ 4oC trong 5 phút. - Rửa lại tủa bằng 500µl cồn 70oC. - Phơi mẫu cho khô cồn. - Hòa tan tủa trong 20µl dung dịch TE 0,1X. - Bổ sung 2µl dung dịch RNAse (1mg/ml), ủ 37oC trong 60 phút. 40 - Bảo quản ở nhiệt độ 4oC. - Sản phẩm DNA bộ gen được đánh giá thông qua điện di qua gel agarose 1%, đo nồng độ và xác định độ tinh sạch qua tỷ số OD260nm/OD280nm.  Khuếch đại trình tự rDNA 16S bằng phản ứng PCR Để có thể định danh một cách chính xác các chủng vi khuẩn phân lập được ở mức độ loài thì gần như toàn bộ thông tin về trình tự DNA mã hóa cho phân tử rDNA 16S phải được biết thật đầy đủ. Vì thế cần tiến hành các phản ứng PCR để khuếch đại toàn bộ trình tự rDNA 16S từ khuôn là DNA bộ gen của các chủng vi khuẩn thu nhận được ở trên. Các phản ứng PCR được thực hiện với các mồi khác nhau, bao gồm: Cặp mồi 2F (5’ GAT CGG CCC GCG TCT GAT TAG 3’) và 2R (5’ CCG TCA TTA TCG TCC CGG ACA 3’) đã được Nishio T, và cộng sự (1997) sử dụng trong định danh cho chi Methylobacterium. Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập được với các cặp mồi: 27F : 5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1525R: 5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’ 520F: 5’-CAGCAGCCGCGGTAATAC-3’ 920F: 5’-AAACTCAAATGAATTGACGG-3’ 520R: 5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’ 920R: 5’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’ Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại trình tự rDNA 16S bao gồm: Buffer (10X) ........................................................................... 2,5µl Mg2+ (25mM) ........................................................................ 1,5µl dNTP (2mM) .......................................................................... 2,5µl Mồi xuôi (10pmol/µl) ............................................................. 1µl Mồi ngược (10pmol/µl) .......................................................... 1µl DNA khuôn (100ng/µl) .......................................................... 1µl Tag DNA polymerase (2U/µl) ................................................ 1µl 41 DEPC-H2O ............................................................................. vừa đủ 25µl Thực hiện các phản ứng PCR: - Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp mồi (2F, 2R), với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234 bp. - Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của các chủng vi khuẩn phân lập được với cặp mồi (27F-1525R). - Tinh chế: sử dụng bộ kit tinh chế sản phẩm PCR của hãng Bio Basic, Canada. - PCR với các cặp mồi bên trong để kiểm chứng sự bắt cặp chuyên biệt của các cặp mồi trong. Vì kích thước sản phẩm PCR bằng cặp mồi (27F, 1525R) là 1500 Nu là rất lớn. Khó giải trình tự một cách chính xác theo phương pháp giải trình tự trực tiếp từ phản ứng PCR nên phải sử dụng các cặp mồi bên trong. Mục tiêu của các phản ứng PCR này là chứng minh cặp mồi (520F, 920R) có khả năng bắt cặp với trình tự rDNA 16S của vi khuẩn mục tiêu. - Các phản ứng PCR được thực hiện với cùng một chu trình nhiệt như sau: Hình 3.1: Chu trình nhiệt của các phản ứng PCR. - Các sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 2% ở điện thế 50V trong 40 phút. Sau đó nhuộm bằng ethidium bromide trong 45 phút, và xem kết quả dưới đèn UV. - Những sản phẩm tốt sẽ được gửi đi giải trình tự (Macrogen, Hàn Quốc) để có thể định danh chính xác đến mức độ loài.  Phân tích trình tự rDNA 16S. 4 o C 72 o C 72 o C 60 o C 90 giây 120 giây 5phút 94 o C 95 o C 90 giây 5phút 40 chu kỳ 42 Kết quả giải trình tự (phụ lục) sẽ được xử lý bằng phần mềm fast PCR để tạo ra các trình tự rDNA nguyên vẹn của mỗi chủng vi khuẩn. Trình tự rDNA 16S nguyên vẹn này sẽ được so sánh với các trình tự DNA của các chủng vi khuẩn khác trên ngân hàng dữ liệu NCBI bằng phầm mềm BLAST. Trình tự của chủng khảo sát và các chủng chuẩn được sắp gióng cột bằng chương trình CLUSTAL X phiên bản 1.81. Cây phát sinh loài được bằng phương pháp neighbor-joining trong chương trình MEGA phiên bản 2.1 với 1000 lần lặp lại. 3.3.4 Định danh nấm men 3.3.4.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái nấm men  Hình thái của tế bào sinh dƣỡng Sau khi phân lập và làm thuần chúng ta cần kiểm tra các đặc điểm hình thái của tế bào nấm men qua các đặc điểm về hình dạng, kích thước và kiểu sinh sản. Tế bào nấm men có nhiều hình dạng khác nhau như: hình tròn, hình trứng, hình bầu dục, hình que… Về kích thước, nấm men là tế bào có kích thước lớn, lớn hơn tế bào vi khuẩn 5-10 lần. Tế bào nấm men thường có chiều dài 9-10µm, chiều rộng 2-7µm Cách thực hiện: Nuôi cấy tế bào nấm men trong môi trường YM Broth ở nhiệt độ phòng, khoảng 24-48 giờ Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi, chú ý các đặc điểm về hình dạng kích thước kiểu sinh sản, tế bào thường ở dạng đôi hay tạo chùm.  Hình thái của khuẩn ty giả Ở một số loài nấm men, chồi trưỡng thành không tách ra khoải tế bào mẹ mà tạo thành một chuổi tế bào gọi là khuẩn ty giả. Rất khó để phân biệt giữa khuẩn ty giả và khuẩn ty thật, để phân biệt có thể dựa vào cách quan sát tế bào cuối cùng của chúng. Khuẩn ty thật có độ khúc xạ và tế bào cuối cùng thường dài hơn tế bào cạnh nó, còn khuẩn ty giả không có độ khúc xạ, không thấy rõ vách ngăn giữa các tế bào (giả đốt) và tế bào cuối cùng thường ngắn hơn tế bào cạnh nó. 43 Sự hình thành khuẩn ty giả ở nấm men là do tác động của điều kiện môi trường nghèo dinh dưỡng, thiếu oxy… Cách thực hiện: (Phương pháp Dalmau). - Trước tiên cần chuẩn bị lame, lamelle, đĩa Petri có giấy lọc ở dưới và một thanh chữ U ở dưới đem hấp vô trùng. - Hút nước đã hấp vô trùng bơm lên giấy lọc để giữ cho môi trường trong đĩa petri không bị khô. - Hút môi trường PDA đã hấp khử trùng và đã làm tan, trải trên miếng lame - Dùng que cấy thẳng ria một đường lên miếng lame và đặt miếng lamelle lên chỗ vừa cấy cho thật kín. - Đem ủ ở nhiệt độ phòng, bổ sung nước cất vô trùng 3 ngày/lần đề tránh môi trường thạch bị mất nước. Kết quả: quan sát khuẩn ty giả dưới kính hiển vi.  Hình thái bào tử nang Bào tử nang của các loại nấm men rất khác nhau về số lượng bào tử trong nang, hình dạng, màu sắc, kích thước. Sự hình thành bào tử nang thường được cảm ứng bởi môi trường ức chế sự phát triển dinh dưỡng . Cách thực hiện: Cấy giống đã hoạt hóa vào môi trường Acetate agar và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 tuần. Quan sát nang bào tử dưới kính hiển vi 3.3.4.2 Xác định một số đặc tính sinh hóa của nấm men  Khả năng lên men Glucose Lên men glucose là một trong những yếu tố quan trọng để bước đầu định danh nấm men đến giống. Quá trình lên men có thể sinh khí hay không sinh khí, có thể tạo acid hay tạo ethanol. Muốn xác định khả năng lên men cần xác định các yếu tố sau: Khả năng sử dụng Glucose (màu môi trường có thay đổi) 44 Khả năng tạo ethanol (hình thành phức chất màu vàng với tinh thể iode trong điều kiện kiềm) Khả năng sinh khí (sự xuất hiện bọt khí trong ống Durham) Cách thực hiện: - Hút 2ml môi trường cơ bản vào ống nghiệm loại nhỏ có chứa ống Durham đã lấy hết khí ra đem hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. - Hút 1ml dung dịch đường Glucose đã lọc vô trùng trong điều kiện vô trùng. - Cấy giống và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày kiểm tra 12 tiếng/lần Kết quả: Sinh khí : (+) có khí trong ống Duharm (-) không có khí trong ống Durham Sinh ethanol: (+) hình thành tinh thể màu vàng (-) không hình thành tinh thể vàng với I2  Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon Kiểm tra đặc tính đồng hóa các nguồn cacbon là kiểm tra khả năng phát triển của nấm men trên môi trường chỉ chứa một nguồn cacbon như là nguồn năng lượng duy nhất. Thử nghiệm này có thể được thực hiện trên môi trường rắn hay lỏng. Tuy nhiên môi trường lỏng thường được sử dụng nhiều hơn. Các nguồn carbon được khảo sát bao gồm: beatin, citrate, D-glucose, fructose, lactose, L-glutamate, maltose, nitrate, sebacate, sucrose, trimethylamine, tartrate. Thực hiện: các bước thí nghiệm được thực hiện như thí nghiệm khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn cacbon của vi khuẩn Kết quả: Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng (màu xanh lá cây).  Khả năng đồng hóa Nitrat Nấm men có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen. Khả năng sử dụng nguồn nitrate là một tiêu chuẩn quan trọng trong việc định danh một số giống. 45 Cách thực hiện: - Hút vào ống nghiệm nhỏ 1ml môi trường Bacto Yeast Cacbon base có bổ sung chất chỉ thị màu Bromothymol Blue 2ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Nguồn nitrogen KNO3 được bổ sung bằng cách lọc vô trùng. - Bơm vào từng giếng của Microplate 1ml môi trường. Cấy 20µl dịch nấm men vào các giếng của Microplate, trừ giếng đối chứng. - Ủ ở 25-30OC trong 4-5 ngày và đọc kết quả: đặt microplate lên tờ giấy trắng. Phản ứng dương tính khi môi trường đổi màu so với đối chứng  Tổng hợp các đặc điễm và định danh Căn cứ trên các đặc điểm hình thái, sinh lý của các chủng nấm men phân lập được và dựa trên khóa phân loại Lodder [2]. Định danh tới mức độ giống các loài khảo sát. 46 4 Chƣơng IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập và làm thuần: Từ 25 mẫu thu nhận từ Vườn Quốc gia Cát Tiên chúng tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên 2 môi trường MMS và MSo. Kết quả chúng tôi đã thu nhận được 45 chủng VSV trên môi trường MMS và 30 chủng trên môi trường MSo. 4.2 Kết quả sàng lọc các chủng có khả năng tƣơng tác với thực vật 4.2.1 Khảo sát khả năng kích thích tăng trƣỡng thực vật của các chủng VSV trong điều kiện in vitro  Khảo sát khả năng tƣơng tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dƣỡng methyl trên môi trƣờng MS (Murashine & Skoog, 1962)  Kết quả: Sau 14 ngày nuôi cấy, chúng tôi ghi nhận kết quả và chia các nghiệm thức làm 2 nhóm Âm tính (chồi ngủ chết) có tất cả 37 nghiệm thức. Dương tính (chối ngủ sống) nhóm dương tính gồm có 9 nghiệm thức chồi phát triển. Kết quả của 9 nghiệm thức này được ghi nhận và tiến hành thống kê so sánh với đối chứng (Bảng 4.1). Chủng vi sinh vật Độ tăng của chiều cao chồi (mm) Chiều dài rễ (mm) Độ tăng của trọng lƣợng tƣơi (mg) Trọng lƣợng khô (mg) Đc 13,73 ± 1,87 d 49,06 ± 7,49bc 486,00 ± 11,27d 78,33 ± 7,57c 6010a 8,86 ± 1,35 c 44,06 ± 6,96ab 477,66 ± 60,45c 73,33 ± 8,50bc 6012a 7,73 ± 0,96 b 53,06 ± 6,58cd 430,33 ± 22,90bc 59,33 ± 3,21a 47 Bảng 4.1: Khảo sát khả năng tương tác thực vật của các chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl trên môi trường MS (Murashine & Skoog, 1962) Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05) 0 5 10 15 20 25 Đc 6010a 6012a 6019a 6019b 6020a 6020c 6021a 6027a Chủng vi sinh vật (m m) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 (m m) Độ tăng chiều cao cây Chiều dài rễ Biểu đồ 4.1: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên chiều cao và chiều dài rễ cây thuốc lá trên môi trường MS. 6019a 18,73 ± 1,62 ef 55,85 ± 7,89d 600,66 ± 51,05d 108,00 ± 5,56e 6019b 19,26 ± 1,58 g 61,53 ± 7,83e 572,66 ± 59,41d 107,66 ± 10,10e 6020a 6,53 ± 1,12 a 51,13 ± 6,66cd 399,66 ± 15,43a 53,00 ± 4,00a 6020c 7,86 ± 1,06 bc 44,8 ± 7,32ab 377,33 ± 17,78ab 58,66 ± 2,52a 6021a 8,66 ± 1,45 bc 40,06 ± 6,64a 437,66 ± 37,07bc 63,33 ± 4,04ab 6027a 17,93 ± 1,57 f 73,60 ±6,26f 593,33 ± 10,69d 93,00 ± 5,13d 48 0 100 200 300 400 500 600 700 Đc 6010a 6012a 6019a 6019b 6020a 6020c 6021a 6027a Chủng vi sinh vật (m g) 0 20 40 60 80 100 120 (m g) Trọng lượng tươi Trọng lượng khô Biểu đồ 4.2: So sánh ảnh hưởng của các chủng vi sinh vật lên trọng lượng tươi và trọng lượng khô cây thuốc lá trên môi trường MS. Kết quả khảo sát (Bảng 4.1) chúng tôi ghi nhận có 9 chủng vi sinh vật biến dưỡng methyl không gây chết ở chồi thuốc lá.Trong đó các chủng 6019a, 6019b, 6027a đều có kết quả theo dõi tốt so với đối chứng và các mẫu khác theo các chỉ tiêu ghi nhận. Chủng 6019a: chồi thuốc lá cho kết quả dương tính tốt nhất ở trọng lượng tươi 600,66mg, trọng lượng khô 108 mg chỉ tiêu về chiều dài rễ cũng cho kết quả cao hơn so với đối chứng (Hình 4.1C). Chủng 6027a: chồi thuốc lá có kết quả tốt nhất về chiều dài rễ so với đối chứng 73,6mm. Đặc biệt ở vùng vết cắt chồi cấy có thấy sự hình thành của mô sẹo (Hình 4.2). Đây là dấu hiệu cho thấy khả năng tiết ra các phytohormone của chủng 6027a. Riêng chỉ tiêu về trọng lượng tươi, trọng lượng khô, chiều cao cây đều cho kết quả dương tính so với đối chứng (Bảng 4.1) Các chủng còn lại tuy không gây chết trên mô thực vật nhưng các chỉ tiêu tăng trưởng đều cho kết quả thấp hơn so với đối chứng. 49 Từ kết quả thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành chọn các chủng 6019a, 6019b, 6027a để tiến hành định danh.  Khảo sát khả năng tƣơng tác thực vật của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng MS không nitơ (MSO) Hình 4.1: Kết quả tương tác của các chủng vi sinh vật lên chồi thuốc lá sau 2 tuần A: Đối chứng C: Chủng 6019b B: Chủng 6019a D: Chủng 6027a Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo ở chồi thuốc lá khi bổ sung chủng 6027a 50 Kết quả: Sau 14 ngày nuôi cấy, chúng tôi ghi nhận và chia các nghiệm thức làm 2 nhóm: Âm tính: (chồi thuốc lá chết) có tất cả 24 nghiệm thức (tương ứng với 24 chủng vi sinh vật phân lập được). Dương tính: (chồi thuốc lá sống) gồm có 7 nghiệm thức có chồi thuốc lá phát triễn. Kết quả của thí nghiệm này được ghi nhận trong bảng 4.2 Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng kích thích sinh trưỡng của các chủng vi sinh vật trên chồi thuốc lá nuôi cấy in vitro trong môi trường MSo Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05) Chủng vi sinh vật Độ tăng chiều cao cây (mm) Chiều dài rễ (mm) Độ tăng của trọng lượng tươi (mg) Trọng lượng khô (mg) Đc 3,2 ± 0,77d 63,26 ± 8,97b 269,00 ±27,0