Tài liệu Khóa luận Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao: TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
______***______
KIỀU NGỌC BÍCH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ
CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH
CELLULASE CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG
HÀ NỘI, 2012
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phương Phú Công
đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn
để em hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Khắc Thanh - trưởng phòng
Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và
tập thể cán bộ phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình
hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận
văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em học tập và rèn luyện trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Si...
58 trang |
Chia sẻ: haohao | Lượt xem: 1993 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Khóa luận Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
______***______
KIỀU NGỌC BÍCH
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ
CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH
CELLULASE CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. PHƢƠNG PHÚ CÔNG
HÀ NỘI, 2012
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phương Phú Công
đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn
để em hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Ths. Nguyễn Khắc Thanh - trưởng phòng
Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2, PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung và
tập thể cán bộ phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình
hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ bảo kiến thức chuyên môn, sửa luận
văn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp em học tập và rèn luyện trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp đại học.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Sinh trường
ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy và tạo điều kiện chu đáo cho em trong suốt
quá trình học tập và hoàn thành khóa luận.
Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người
thân đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết
quả như ngày hôm nay.
Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất cả những sự
giúp đỡ quí báu đó !
Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Sinh Viên
Kiều Ngọc Bích
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình. Các số
liệu, các kết quả thu được trong khóa luận là trung thực, chưa từng được
công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu
trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 05 năm 2012
Sinh Viên
Kiều Ngọc Bích
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes
Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes
Hình 1.3. Cấu tạo một Coelomycetes
Hình 1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần
Hình 1.5. Các kiểu phát triển của bào tử trần
Hình 1.6. Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần
Hình 1.7. Cuống sinh bào tử trần
Hình 1.8. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt
Hình 1.9. Một số hình dạng bào tử trần
Hình 1.10. Các hình dạng khác nhau của bào tử
Hình 1.11 Chi Penicillium Link ex Fries. Các thành phần của chổi
(bộ máy mang bào tử trần).
Hình 1.12. Cấu tạo cơ quan sinh bào tử trần ở Aspergillus
Hình 1.13. Cấu tạo khuẩn ti và cơ quan sinh bào tử trần của Penicillium
Hình 1. 14. Cấu trúc không gian của cellulose
Hình 1.15. Cấu trúc không gian của CMC
Hình3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất
Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M 4V
Hình 3.3 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 151
Hình 3.4 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 251
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả và đặc điểm các chủng nấm mốc phân lập được
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập được
CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT
CBH : Cellobiohydrolase
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
CMC –ase : cacboxylmethylcellulase
CS : Cộng sự
E1 : Exoglucanase
E2 : Endoglucanase
UV : Tia cực tím
A.glaucus : Aspergillus glaucus
A.restricus : Aspergillus restricus
A.cervinus : Aspergillus cervinus
A.ornatus : Aspergillus ornatus
A.nidulans : Aspergillus nidulans
A.versicolor : Aspergillus versicolor
Austus : Aspergillus ustus
A.flavipes : Aspergillus flavipes
A.wentii : Aspergillus wentii
A.flavus : Aspergillus flavus
A.niger : Aspergillus niger
A.ocharaceus : Aspergillus ocharaceus
A. sparsus : Aspergillus sparsus
A. cremeus : Aspergillus cremeus
A. candidus : Aspergillus candidus
H1 : Hình 1
VSV : Vi sinh vật
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU...............................................................................................................1
1. Lý do chọn đề tài..............................................................................................1
2. Mục đích của đề tài..........................................................................................2
3. Nội dung của đề tài..........................................................................................3
4. Ý nghĩa khoa học của đề tài.............................................................................3
5. Điểm mới của đề tài.........................................................................................3
NỘI DUNG
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về nấm mốc................................................................................4
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes).......................................................4
1.1.1.1. Hyphomycetes....................................................................................5
1.1.1.2. Coelomycetes.....................................................................................5
1.1.1.3. Agonomycetes....................................................................................7
1.1.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử
dạng nảy chồi.........................................................................................................8
1.1.3. Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần............................................8
1.1.4. Cuống sinh bào tử trần.............................................................................9
1.1.5. Bào tử trần..............................................................................................10
1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries...........................................................11
1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới......................11
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus........................................................15
1.3. Sơ lược về Penicillium...........................................................................17
1.4. Cellulose va cellulase.............................................................................19
1.4.1. Celulose..................................................................................................19
1.4.2. Cellulase.................................................................................................21
1.4.3. Ứng dụng của cellulase
1.4.3.1. Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm...................22
1.4.3.2. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh..........23
1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose...................................................24
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu.....................................................................................26
2.1.1. Mẫu phân lập..........................................................................................26
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu...............................26
2.2. Môi trường....................................................................................................27
2.3. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................27
2.3.1. Phương pháp phân lập............................................................................27
2.3.1.1. Thu thập mẫu..................................................................................27
2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản....................................27
2.3.1.3. Tiến hành phân lập..........................................................................28
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính.....................................................................30
2.3.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy
chấm điểm....................................................................................................30
2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch ( William, 1983)......................................................................30
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002)..................31
2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường
Crapek- Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô................................31
2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô
(Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg,
1996)............................................................................................................31
2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại...........................................32
2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới
kính hiển vi soi nổi.......................................................................................32
2.3.4.2. Quan sát các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp
ảnh qua kính hiển vi ( Axioskop).................................................................33
CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.1. Kết quả phân lập........................................................................................34
1.2. Kết quả thử hoạt tính..................................................................................35
1.3. Kết quả định loại sơ bộ..............................................................................37
1.3.1. Bản mô tả chủng M4V...........................................................................37
1.3.2. Bản mô tả chủng M151..........................................................................40
1.3.3. Bản mô tả chủng M251..........................................................................43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................47
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Từ trước đến nay, chăn nuôi luôn có vai trò quan trọng đối với nền
nông nghiệp nước ta, giá trị chăn nuôi chiếm tỷ trọng khá, trên 27% cơ cấu của
toàn ngành và tăng trưởng mỗi năm (giai đoạn 2001 - 2009) đạt 7-8%. Trong
chăn nuôi việc tìm giải pháp nào để tăng năng suất vật nuôi, nâng cao hiệu suất
sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn ở mức cao nhất và đặc biệt là không
có hại đến sức khỏe con người là vấn đề đang cần được quan tâm. Một trong
những giải pháp được đưa ra là có thể sử dụng các chế phẩm enzyme ( gồm
nhiều loại enzyme, trong đó có cellulase) [2].
Nguồn thức ăn cung cấp năng lượng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là
ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc. Ngoài protein, lipit, chất dinh dưỡng cung cấp
năng lượng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate. Trong đó, các
polysaccharide gồm cellulose, β-glucan là các chất chứa cầu nối β-1,4 glucoside.
Các chất này làm tăng độ nhớt trong ruột, cản trở tế bào vách ruột hấp thụ các
chất dinh dưỡng. Các chất này có trong vách tế bào thực vật, ngăn trở các
enzyme nội sinh tiếp cận với các chất dinh dưỡng như protein, tinh bột và lipit
có trong bào chất, từ đó cản trở sự tiêu hóa, hấp thụ các chất dinh dưỡng này.
Bổ sung cellulase, β-glucanase trực tiếp vào thức ăn sẽ cho phép tăng khả năng
hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.[3], [7].
Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn thức ăn giàu
cellulose như rơm, rạ, bã mía, bã khoai, bã sắn đã và đang được triển khai ở
nhiều nước, trong mọi lĩnh vực như sản xuất protein đơn bào làm thức ăn cho
gia súc. Trong lĩnh vực này, nấm sợi thường được sử dụng lên men các nguồn
2
phế thải giàu cellulose tạo ra sinh khối protein chứa hàm lượng các amino axit
cân đối, các vitamin và tạo hương thơm có lợi cho tiêu hóa của vật nuôi [7].
Hàng năm, hoạt động trong ngành chăn nuôi đã thải ra môi trường hàng
trăm ngàn tấn phế phẩm có thành phần chủ yếu là cellulose, hiện đã và đang là
một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường. Nếu không có biện pháp
xử lý thì đây sẽ là nguồn gây ô nhiễm môi trường.
Một số vi sinh vật có khả năng sinh cellulase như vi khuẩn, nấm mốc.
Cellulase từ vi khuẩn trong nhiều trường hợp được nghiên cứu có hoạt tính cao
hơn cellulase từ nấm mốc. Tuy nhiên, nhìn chung vi khuẩn sản xuất enzym ngoại
bào số lượng thấp hơn nấm mốc. Nấm mốc là vi sinh vật hiếu khí, nhân chuẩn
dị dưỡng, chúng thường có mặt trong đất, xác động thực vật và không khí. Một
số loài nấm mốc có khả năng tổng hợp ra các enzyme, axit hữu cơ, vitamin, các
kích thích tố tăng trưởng động thực vật như: Aspergillus niger, Aspergillus
hennebergii [4], [6], với khả năng chống chịu pH và khả năng sử dụng nguồn
cacbon, nguồn nitơ tốt.
Do đó tôi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các
đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase
cao” để nghiên cứu.
2. Mục đích của đề tài
2.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase.
2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc phân lập
được.
2.3. Bước đầu phân loại sơ bộ một số chủng có hoạt tính cellulase cao nhất.
3
3. Nội dung của đề tài
Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase trên
các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam ( Mỹ Đức- Hà Nội,
Tam Dương – Vĩnh Phúc )
Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái của chủng nấm mốc có khả năng
sinh cellulase
Định loại chủng mốc có khả năng sinh cellulase cao, nhằm chọn những chủng
nấm mốc thuộc danh mục an toàn (thường dùng trong công nghệ sinh học).
4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Tìm hiểu sự đa dạng của các chủng nấm mốc có khả năng sinh
cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp ở miền Bắc Việt Nam.
4.2. Nâng cao khả năng nghiên cứu các đặc điểm phân loại của một số chủng
nấm mốc có khả năng sinh cellulase ở Việt Nam.
4.3. Tìm ra những chủng nấm mốc thuộc danh mục an toàn sinh học có
khả năng sinh cellulase cao nhằm ứng dụng có các nghiên cứu tiếp theo.
5. Điểm mới của đề tài
Trong các chủng nấm mốc phân lập được, dựa theo phương pháp phân
loại truyền thống, tôi xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergilus niger,
đây là loài thuộc danh mục an toàn sinh học, có tiềm năng ứng dụng cao trong
sản xuất enzyme bổ sung vào thức ăn vật nuôi.
4
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cƣơng về nấm mốc
Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng
sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm
(Basidiomycetes). Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có 1700
chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm Ceolomycetes. Theo
E.Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi Phialoconidiae
( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì
chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi
Aspergillus có khoảng 185 loài [16].
1.1.1. Nấm bất toàn (Deuteromycetes)
Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm. Theo hệ
thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes
(1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm:
Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá
(giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó
giá).
Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá
bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata.
Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. Ở đây
chúng tôi giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn.
5
Phân lớp của nấm bất toàn
1.1.1.1. Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài)
Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi
nấm (như các đệm nấm, các bó giá), nhưng không ở trong các conidiomata
(fruit body) riêng biệt.
Hình 1.1. Các dạng Hyphomycetes
1.1.1.2. Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ
Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc hoặc đệm
giá.
Hình 1.2. Giá sinh bào tử Coelomycetes
6
Hình 1.3. Cấu tạo một Coelomycetes
1. Bào tử trần, 2. Tế bào sinh bào tử trần, 3. Cuống sinh bào tử trần, 4. Sợi nấm
Những bộ phận sinh sản vô tính
Hypha (sợi nấm): Một trong các sợi trong hệ nấm là các tản của một sợi nấm.
Các tản khác biệt với các phần sợi sinh dưỡng hấp phụ chất dinh dưỡng
Bào tử trần: Một tế bào bất kỳ mà từ đó một bào tử được sinh ra trực tiếp.
Các kiểu phát sinh bào tử trần: Tản (a ), nảy mầm ( b).
Hình 1.4. Các kiểu phát sinh bào tử trần
7
1.1.1.3. Agonomycetes( mycelia sterilia - nấm bất thụ)
Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử. Một số tạo thành
cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (chlamydospore ) hoặc các tế bào dày ( tế
bào Hulle). Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trưng để phân
loại ( Erick H.C.Mckenzie, 2004; Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham,
1994) [18], [19].
Năm 1995, Hughes đã đưa ra khóa phân loại có tính liên kết và tổng quát
hơn về nhóm Hyphomycetes. Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc
điểm của giá bào tử trần ( conidiophores) và bào tử trần ( conidia). Năm 1968,
Baron lại đưa ra một khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà
nấm học vẫn sử dụng (H.L.Barneet & Barry B. Hunter, 1973), trong đó các đặc
điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa
của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó... là những đặc điểm quan trọng
để phân loại ( Erick H.C. Mckenzie, 2004; E. Kifer & N Morelet, Robert K.
Noyd, 2000) [18], [16], [21].
Gần đây, trong các khóa phân loại của mình E. Kifer & N. Morelet, Robert
K. Noyd ( 2000) [16], [21] đã kết hợp khóa phân loại của Saccardo ( 1880 –
1884) và Grove ( 1919) để phân chia Deuteromycota thành 2 lớp lớn là
Hyphomycetes và Coelomycetes dựa vào cách sắp xếp của các giá bào tử trần.
Lớp Hyphomycetes: đặc trưng bởi các giá bào tử trần ( condiophores) tạo
ra trên sợi nấm, không tạo thể quả vô tính.
Lớp Coelomycetes: các giá bào tử trần ( conidiophores) được sinh ra trong
các thể quả vô tính (axesual ascomata).
8
1.1.2. Các kiểu phát triển bào tử trần trong sự phát sinh bào tử dạng nảy chồi
(blastic) (Theo Katsuhiko Ando, 2002) [15].
Sự phát sinh bào tử phân cắt hoàn toàn: Kiểu bào tử đính (Aleurio - type),
một điểm trên tế bào sinh bào tử trần, bào tử đơn độc (H.1.5a ). Kiểu nảy chồi
(Blasto - type): Cấu trúc màng đỉnh ở vị trí trên tế bào sinh bào tử trần và chuỗi
bào tử với một vị trí để tạo thành mộ chuỗi liên tiếp không phân nhánh (chuỗi
gốc già) ( H.1.5b ).
Hình 1.5. Các kiểu phát triển của bào tử trần
Phát sinh bào tử nội sinh: Dạng bình (Phialo - type), Các chuỗi bào tử ra
khỏi tế bào sinh bào tử trần ở cùng một vị trí, đôi khi trong các chuỗi rời tế bào
có thay đổi ( H.1.5c). Dạng phân đốt (Annello - type), Các chuỗi bào tử ra khỏi
tế bào sinh bào tử trần ở các vị trí cao hơn, thỉnh thoảng trong các chuỗi rời, tế
bào có thay đổi (H.1.5d ).
1.1.3. Sự phát triển của các tế bào sinh bào tử trần
Tế bào sinh bào tử trần phát triển theo nhiều kiểu: Kiểu ổn định, kích
thước của tế bào sinh bào tử trần là ổn định (H1.6a) . Kiểu kéo dài, tế bào sinh
bào tử trần phát triển cùng với sự sản sinh các bào tử trần (H1.6b) . Kiểu giảm
9
dần, độ dài các tế bào sinh bào tử trần giảm đi khi mỗi bào tử trần được sinh ra
(H1.6c).
Hình 1.6. Các dạng phát triển của tế bào sinh bào tử trần
1.1.4. Cuống sinh bào tử trần
Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một sợi nấm sinh sản) mang hoặc
gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần được sinh ra. Đôi khi
được dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi đối với các tế bào sinh bào tử trần.
Hình 1.7. Cuống sinh bào tử trần
10
Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân
nhánh ( H1.8c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử
trần (H1.8d ), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh
(H1.8e).
Hình 1.8. Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt
1.1.5. Bào tử trần (conidia)
Có nhiều hình dạng khác nhau: Hình dạng đơn giản. Ví dụ: Cầu, gần cầu,
elip, hình quả thận (H.1.9a) .b. Bào tử sợi, tỷ lệ chiều dài và rộng của bào tử =
15:1 (H1.9b) . Bào tử vách lưới, bào tử được chia nhỏ ra bởi các vách ngăn
chéo nhau (H1.9c). Bào tử xoắn ốc trục bào tử uốn cong hơn 1800 (H1.9d ).
Bào tử dạng chữ thập, bào tử có nhiều trục, có mấu, có lông mềm chiếm 1/4
chiều dài của bào tử (H1.9e).
11
Hình 1.9. Một số hình dạng bào tử trần
1.2. Chi Aspergillus Micheli ex Fries
1.2.1. Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới
Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm
1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi
Eurotiumherbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô. Fries
( 1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli. De Bary ( 1850) phát hiện ra
rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus
glaucus. Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus
chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries.
Chuyên luận về chi Aspergillus xuất bản gần đây nhất và vẫn đang được
sử dụng rộng rãi để định loại các loài của chi nấm này là chuyên luận của
Raper và Fennell (1965). Hệ thống phân loại chi Aspergillus của Raper và
Fennell (1965) [24] gồm 132 loài (đã được chấp nhận) và được xếp vào 18 nhóm
loài (Robert A. Samsom, 1999) [25] , đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng
12
rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm
này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus (E. Kifer & N.
Morelet; Robert K. Noyd, 2002) [16], [21].
Để có thể xử lý phân loại một số lượng lớn các loài thuộc chi này, các nhà
nghiên cứu trước đây đã chia nó ra thành các nhóm loài (group) hoặc các thứ
(series) dựa trên màu sắc bào tử, hình dạng và kích thước của bọng đỉnh giá, sự
có mặt của trạng thái hữu tính... (Raper và Fennell ,1965) [24]. Năm 1985, Gams
và cộng sự đề nghị đổi các nhóm loài (group) thành các chi phụ (subgenera) và
các tổ chi (sections) để cho nó phù hợp với danh pháp thực vật hơn. Dưới đây là
phần tóm tắt hệ thống phân loại chi Aspergillus hiện đang được sử dụng rộng rãi
(Maren A. Klich, 2002) [17]. Ở đây chúng tôi bổ sung tên các nhóm loài
( group) tương đương trong chuyên luận của Raper và Fennell, 1965 [24].
Chi Aspergillus Micheli ex Fries.
Chi phụ Aspergillus: thể bình dạng đơn tầng ( uniseriate), ưa khô, bào tử
màu lục xám
Tổ chi ( Section) Aspergillus ( tương đương với A.glaucus Group): dạng
hữu tính eurotium, thể quả (cleistothecia) màu vàng với thành là một lớp tế bào
nhu mô giả hình đa giác, bào tử túi (ascospore) trong suốt.
Tổ chi ( Section) Restricti ( tương đương vói A.restricus Group): chỉ có
dạng vô tính, sinh trưởng chậm trên tất cả các môi trường.
Chi phụ Fumigati: dạng thể bình đơn tầng. Bọng đỉnh giá thương có hình
quả lê, bào tử màu lục xám, lục xanh đến màu cam.
13
Tổ chi (Section) Fumigati ( tương đương với A.fumigatus Group): bào tử
màu lạc xám đến lục xanh.
Tổ chi (Section ) Cervini ( tương đương với A.cervinus Group) : bào tử
cam nhạt đến cam xám.
Chi phụ Ornati : thể bình dạng đơn tầng, bào tử màu lục xám, lục vàng
hoặc nâu olive.
Tổ chi (Section) Ornati ( tương đương với A.ornatus Group): giống với
chi phụ.
Chi phụ Clavati: Thể bình dạng đơn tầng, bọng đỉnh giá chủ yếu hình
chùy, bào tử có màu lục xám
Tổ chi ( Section) Clavati (tương đương với A.nidulans Group): giá bào tử
trần ngắn, thường nâu, bào tử lục, thường có tế bào Hulle, đa số các loài có trạng
thái hữu tính Emericella. Thể quả có thành mềm, bao quanh bởi tế bào Hulle,
bào tử màu đỏ đến tía.
Tổ chi (Section ) Versicolores (tương đương với A.versicolor Group): giá
bào từ trong suốt đến nâu, bào tử lục, lục xám hoạc lục xanh.
Tổ chi (Section ) Usti (tương đương với A.ustus Group): giá bào tử trần
màu nâu, bào tử màu đỏ đục, nâu hoặc olive.
Tổ chi (Section ) Terrei (tương đương với A.terreus Group): giá bào tử
trần trong suốt, bào tử màu da bò, đến cam nâu.
14
Tổ chi (Section) Flavipedes ( tương đương với A. flavipes Group): giá
bào tử trần trong suốt đến nâu nhạt, bào tử màu trắng đến da bò.
Chi phụ Circumdati: thể bình dạng lưỡng tầng hoặc đơn tầng, bọng giá
hình cầu cho đến hình quả lê.
Tổ chi (Section) Wentii (tương đương với A.wentii Group): bào tử màu da
bò, nâu vàng cho đến nâu olve.
Tổ chi (Section) Flavi (tương đương với A .flavus Group): bào tử màu lục
vàng đến nâu olive.
Tổ chi (Section) Nigri (tương đương với A.niger Group): giá bào tử trần
có thành nhẵn, bào tử đen hoặc gần đen.
Tổ chi ( Section) Circumdati (tương đương với A.ocharaceus Group): thể
bình thường là dạng lưỡng tầng, bào tử vàng
Tổ chi ( Section) Candidi (tương đương với A.candidus Group): bào tử
trắng hoặc gần trắng.
Tổ chi ( Section) Cremel (tương đương với A.cremeus Group): bào tử
nâu, vàng hoặc xanh lục.
Tổ chi ( Section) Sparsi (tương đương với A.sparsus Group): bào tử xám
nhợt đến màu olive.
Chi phụ Stilbothamnium: đặc điểm nổi bật là các giá bào tử trần tập hợp
thành bó, dạng cụm lớn, thẳng. Chi phụ này được thiết lập bởi Samson và Seifert
năm 1985 (J.E.Smith, 1994). Tuy nhiên, sự sắp đặt của một số loài và sự tồn tại
15
của một số nhóm loài này vẫn đang có nhiều tranh cãi ( Ozakiewiez, 1989;
Samson & Frisvad, 1991; Peterson, 2000 [25].
1.2.2. Đặc điểm sinh học của Aspergillus
Các đặc điểm đặc trưng của chi Aspergillus Micheli ex Friex
Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách,, không màu, màu nhạt,
hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất định của
khuẩn lạc.
Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia). Cũng như các loại nấm bất
toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trưng
dùng trong phân loại chi nấm này.
Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần
Cơ quan sinh bào tử trần phát triển tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào
chân (foot- cell) có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các tế bào lân cận của sợi
nấm. Tử tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần ( condiophore hay stipe).
Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn, trong suốt
hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài. Phần ngọn của giá bào tử phình
rộng tạo thành bọng định giá ( versicle). Bọng định giá có thể có nhiều hình thái
khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng đế phân loại Aspergillus với các loại
nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi Penicillium.
Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình quả bầu,
hình bàn chang.
16
Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình
( phialide). Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng đơn
tầng (uniseriate). Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc xuất phát
từ bọng đỉnh giá ( lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng tầng
( biseriate). Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá cũng là đặc điểm đặc
trưng để phân biệt Aspegillus với các chi có quan hệ gần gũi với nó. Từ thể bình
sinh ra các bào tử trần (conidia). Bào tử trần không có vách ngăn, khác nhau về
hình dạng, kích thước, màu sắc... ở các loài khác nhau.
Hình 1.10. Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a. 1 lớp - b. 2 lớp - c.
phiến - d. tia, e. tể (theo Samson và ctv., 1995)
Ở một số loài Aspergillus người ta đã tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính
(telrmorph) của chúng, các loài này được xếp vào các chi của nấm túi như
17
Emercella, Eurtium, Neosartorya và một số chi khác (Raper & Fennell, 1965;
Samson, 1979) [17].
Đặc điểm đặc trưng của nhóm loài Aspergillus niger
Theo khóa phân loại chi Aspergillus (Raper & Fennell, 1965; Al-
Musallam, 1980; Domsch et al; 1980; Klich & Pitt; Kozakiewiez, 1989; Tzean et
al., 1990; Parenicova, 2000 và Maren A Krick, 2002) [17], [24] thì nhóm loài
Aspergillus niger có những đặc điểm nổi bật sau:
Bông nấm (conidial head): dạng màu đen tối, đen hơi lục, đen hơi nâu, đen
tía hoặc đen cacbon; có hình cầu hoặc phóng xạ hoặc chia ra thành các cột không
đều, đặc. Giá bào tử trần ( conidiophore, stipe): thường nhẵn hoặc hơi ráp ở một
số loài, thành thường dày. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình cầu hoặc gần cầu.Các
lớp thể bình (seriation): đơn tầng hoặc lưỡng tầng tùy ở từng loài. Bào tử trần
(conidia): hình cầu, gần cầu, elip, nhẵn hoặc gần nhẵn, hơi ráp hoặc ráp.Hạch
nấm: hình cầu đến cầu, màu kem khi non, khi già màu lông bò hoặc hồng hoặc
nâu.
1.3. Sơ lƣợc về Penicillium
Theo E. Kiffer, M. Morelet, 2000, trong số các chi nấm thuộc tổ chi
Phialoconidiae ( lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ
Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,
chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái.[16].
Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001: 186-187) [1] chi
Penicillium đặc trưng bởi các đặc điểm:
18
Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu
sẫm. Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng,
đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau,
môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa
tan tương ứng. Bộ máy mang bào tử trần (còn gọi là "chổi", penicillius) hoặc chỉ
gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần
với hai đến nhiều cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi
cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo hai vòng, biverticillate). Giá bào tử
trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch
nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau và khẩn lạc có dạng
mặt nhung (velutinate). Bào tử trần cũng như giá bào tử trần, các nhánh, các
cuống thể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc
sần sùi, gồ ghề.
Hình 1.11. Chi Penicillium Link ex Fries. Các thành phần của chổi
(bộ máy mang bào tử trần).
19
1.4. Cellulose va cellulase
1.4.1. Cellulose
Cellulose là polysaccarit chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó
chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có
nhiều ở tế bào một số loài VSV. Ở tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV,
chúng tồn tại ở dạng sợi. Khi đun sôi với axit sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển
thành glucose còn khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit
cellobiose [12].
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer
mạch thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này
liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các
glucose này và bằng liên kết β-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các
gốc glucose phân nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các
gốc glucose trong cellulose thường lệch một góc 1800 và có dạng như một chiếc
ghế bành. Cellulose thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như
sau: [12]
Hình 1. 12. Cấu trúc không gian của Cellulose
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton.
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Vandervan và liên kết
20
hydro.Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm.
Các sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi
sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:
Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn
nhờ liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl
ở mạch cacbon của mạch khác. Ở vùng này cellulose rất bền vững dưới tác động
của điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ sợi ở vùng
này.
Vùng vô định hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vandervan. Ở
vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên
ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bị trương phồng lên, enzym cellulase rất dễ tác
động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do,
hydrogen của chúng dễ bị thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc
acetyl tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn
xuất được ứng dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của
cellulose được thay thế bằng gốc –OCH2COOH
Hình 1.13. Cấu trúc không gian của CMC
21
Trong tự nhiên celulose khá bền vững, không tan và bị trương lên khi
hấp thụ nước. Cellulose bị thủy phân khi đun nóng với axit hay kiềm ở nồng độ
khác cao, hoặc bị phân giải dưới tác dụng của cellulase được tổng hợp bởi các vi
sinh vật [3].
1.4.2. Cellulase
Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp
chất cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4
giữa 2 đơn vị glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau
đây:
1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt đầu cuối
của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn có một loạt các tên
khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase. Ngày nay nó được coi
là enzyme chủ đạo phân giải cellulose, bởi nó có khả năng phân cắt cellulose ở
cả vùng kết tinh.
1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này tham
gia phân giải liên kết -1,4 glucoside trong cellulose và -D-glucanase. Sản phẩm
của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. Enzym này còn có
một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase.
β- 1,4 -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia
phân hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy
cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là cellobiase và
glucosidase [3].
22
1.4.3. Ứng dụng của cellulase
1.4.3.1. Ứng dụng enzyme cellulase trong chế biến thực phẩm
Trong quá trình sản xuất các loại nước quả và nước uống không cồn dựa
trên việc trích li dịch quả từ thịt nghiền. Các loại quả sau khi tách vỏ bỏ hạt được
nghiền, thu được thịt quả nghiền có dạng dịch nhuyễn. Từ thịt quả nghiền đã ép
bã thu được dịch quả. Dịch này thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và
các thành phần của polysaccharide làm cho dịch quả có độ nhớt cao. Để tăng
hiệu suất trích li dịch quả, giảm bớt độ nhớt, tăng mức cảm quan nước quả và
giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất quan trọng. Enzyme
này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa. Sự kết hợp của glucanase và
pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn màng tế bào. Trong quá trình sản xuất, ở giai
đoạn dịch hóa bổ sung hỗn hợp các enzyme cellulase, hemicellulase sẽ đem lại
hiệu quả của chế phẩm, làm cho độ đồng thể của nước quả có thịt sẽ tốt hơn [2],
[3]. Trong công nghệ sản xuất bia, các chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase đã được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diacetyl, do đó giảm
lượng diacetyl được tạo thành, rút ngắn thời gian cần thiết để ủ bia. Trong dịch
lên men có chứa một lượng β-glucan, chất này ảnh hưởng tới khả năng lọc và
gây đục cho bia (Đặng Thị Thu et al., 2004) [3]. Trong quá trình sản xuất cà phê
ở Việt Nam, cà phê chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp khô, phương pháp
này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến hành nâng cao chất lượng cà phê,
phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá trình sử dụng phức hệ enzyme
cellulase và pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và làm tăng khả năng ly trích dịch
quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulose gây hiện tượng thẫm mầu, làm giảm chất
lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử dụng chế phẩm
A. niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và cellulase cho
23
thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng chế phẩm
không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc vỏ
khá cao. Trong quá trình ly trích dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát
các chất hòa tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09
hiệu suất trích ly cao hơn mẫu không sử dụng là 46% (Nguyễn Đức Lượng,
2003) [5].
1.4.3.2. Trong công nghệ sử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh
Rác thải là nguồn chính gây nên ô nhiễm môi trường dẫn tới mất cân
bằng sinh thái và phá hủy môi trường sống, đe dọa tới sức khỏe và cuộc sống
con người. Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử
dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu
quả. Hiện nay, có rất nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các
chủng vi sinh vật tiết ra nhằm thủy phân cellulose trong rác thải. [2], [6]. Phức hệ
cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy thải ra.
Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này chứa
rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định
tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy, nước thải của các nhà máy
giấy, các cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung cácchế phẩm chứa phức
hệ cellulase đem lại hiệu quả cao [3].
1.5. Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose
Cellulase được thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như động vật
(các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc nảy mầm là đại
mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) và vi sinh vật (nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn
và vi khuẩn). Tuy nhiên, vi sinh vật là nguồn thu enzyme chủ yếu vì thời gian
24
sống ngắn nên thu được nhiều lần trong năm và chủ động sử dụng nguồn
nguyên liệu rẻ tiền để nuôi cũng như dễ dàng điều khiển có định hướng nguồn
enzyme hoặc gia tăng lượng enzyme. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh
mẽ của khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng các phương pháp sinh học phân
tử để tạo ra những chủng mới mang những đặc điểm nổi bật mà các đối tượng
động vật, thực vật ít áp dụng như gây đột biến nhân tạo.Trong vi sinh vật, rất
nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men có khả năng
sinh tổng hợp cellulase.
Các loài vi khuẩn cả hiếu khí lẫn kị khí đều có khả năng cellulase như
Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et al.,1973), Acidothermus
cellulobuticus (Bergquist et al., 1999,) [8]. Ngoài ra còn có các loài ưa kiềm như
Cephalosporium sp. RYM-202 ( Kang and Rhee, 1995) [13].
Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lượng
and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) và
Streptomyces reticuli cũng có khả năng tổng hợp mạnh enzyme. Các loại nấm
mốc thuộc chi Aspergillus như A.niger (Coral et al., 2002, Omojasola and Jilani,
2008) [10] ,[23], A. Candidus (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009) [20], A.
flavus (Ojumu et al., 2003) [22], A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996) [11] ,
A. oryzae và các chủng Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al.,
1992, Cao Cường và Nguyễn Đức Lượng, 2003) [5], [9] đều có khả năng sinh
enzyme. Các nhóm thuộc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al.,
1990, Trịnh Đình Khá, 2006, Chinedu et al., 2008) [6] cũng có khả năng tổng
hợp enzyme cao.
25
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Mẫu phân lập
Rác thải, lá cây mục, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy ở huyện Tam
Dương (Vĩnh Phúc) và huyện Mỹ Đức ( Hà Nội).
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất dùng cho nghiên cứu
Thiết bị: Buồng cấy, tủ ấm, nồi sấy, máy lắc, máy lắc li tâm, cân điện tử,
kính hiển vi quang học, máy ảnh kỹ thuật số, nồi hấp và các thiết bị khác trong
phòng thí nghiệm vi sinh vật khoa Sinh – KTNN trường ĐH Sư phạm Hà Nội 2.
Hóa chất: NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, FeSO4, Agar, Nước cất, NaCl,
saccarose, CMC (cacboxyl methyl cellulose), thuốc thử lugon 1%, cồn, dầu soi
kính... và các hóa chất thông dụng khác.
2.2. Môi trƣờng
Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống: môi trường Crapek- Dox cơ
sở, thành phần môi trường như sau:
Saccarose : 30 g/l FeSO4 : 0.001 g
NaNO3 : 10 g/l Thạch Agar : 20 g/l
MgSO4 : 0,5 g/l H2O : 1 lít
KCl : 0,5 g/l KH2PO4 : 2 g/l
NaCl : 1% pH : 5 – 6
26
Môi trường lỏng: để nuôi cấy thu enzyme, tôi sử dụng môi trường có
thành phần giống với môi trường Crapek – Dox cơ sở nhưng không có thạch
Agar và thay đường saccarose bằng bột giấy (có bản chất là cellulose).
Môi trường thử hoạt tính: sử dụng môi trường có thành phần giống vơi
môi trường Crapek – Dox cơ sở nhưng thay nguồn cacbon bằng CMC
(cacboxylmethylcellulose) để đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm
mốc, thành phần môi trường như sau:
CMC : 10 g/l FeSO4 : 0.001 g
NaNO3 : 10 g/l Thạch Agar : 20 g/l
MgSO4 : 0,5 g/l H2O : 1 lít
KCl : 0,5 g/l KH2PO4 : 2 g/l
NaCl : 1% pH : 5 – 6
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân lập
2.3.1.1. Thu thập mẫu
Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rac thải ở những nơi
khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20g mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác
nhau. Mẫu sau khi lấy sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ
thông tin, thời gian và địa điểm mẫu được lấy.
2.3.1.2. Chuẩn bị môi trường phân lập và bảo quản
Khử trùng : khử trùng thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và môi trường dinh
dưỡng
27
Mục đích : Tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật ngoại lai hiện diện trong môi
trường, tạo điều kiện vô trùng cho môi trường để kết quả phân lập, nuôi cấy
chính xác
Nguyên tắc khử trùng : Không làm biến tính môi trường, không làm biến
tính một số chất trong môi trường, Sau khi khử trùng, trong môi trường không
sản sinh ra các chất độc gây chết vi sinh vật nuôi cấy, phải đảm bảo điều kiện vô
trùng tuyệt đối sau khi khử trùng, bảo đảm an toàn đối với người sử dụng.
Phương pháp : đối với các dụng cụ (nút bông, ống nghiệm, que chang, hộp
petri..,) sẽ được bọc bằng giấy báo sau khi rửa sạch và làm khô, tiến hành khử
trùng bằng nồi hấp ở áp suất khoảng 1 atm trong khoảng 30- 45 phút rồi chuyển
sang tủ sấy (1700C, 2 giờ). Đối với buồng cấy thì được khử trùng bằng tia UV,
một số dụng cụ khác thì khử trùng bằng cồn.
Chuẩn bị môi trường
Sau khi vô trùng dụng cụ xong, tiến hành cân môi trường (Crapek – Dox
cơ sở) để làm môi trường phân lập. Môi trường được hấp thanh trùng ở 1210C
trong khoảng 20 phút, sau đó phân phối khoảng 25ml môi trường và mỗi hộp
lồng đã vô trùng, để có môi trường thạch nghiêng thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi
trường (chưa thành trùng) vào ống nghiệm rồi đậy nút bông, đem hấp thanh
trùng ở 1210C trong khoảng 20 phút sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi
trường khi còn đang nóng.
28
2.3.1.3. Tiến hành phân lập
Pha loãng mẫu
Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhưng rất quan trọng
trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích
hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lượng cũng như phân tích vi sinh
vật.
Đối với mẫu chất lỏng: dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa
9 ml dung dịch pha loãng, khi đó ta sẽ được nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục
từ ống nghiệm 10-1 hút tiếp 1ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha
loãng độ pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy đến nồng độ cần thiết.
Đối với mẫu rắn: cân chính xác 10 g mẫu, sau đó cho vào 90 ml dung dịch
pha loãng nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp tục pha loãng tương tự như mẫu chất
lỏng.
Phân lập
Dùng pipet hút lấy 1 ít dung dịch mẫu đó, nhỏ 1 giọt vào hộp lồng đầu
tiên, lấy que chang chang đều, rồi vẫn dùng que chang đó ta chang tiếp vào
khoảng 6-7 hộp lồng tiếp theo mà không cần nhỏ thêm dung dịch mẫu vào. Làm
lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi chang mẫu vào các hộp lồng xong
đánh giấu và gói cẩn thận lại rồi đem nuôi trong tủ ấm khoảng 300C.
Thường xuyên kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày. Nếu thấy có khuẩn lạc
mới mọc lên thì lập tức cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồi đánh
dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi sau 3 – 4 ngày. Chủng nào không lên thì loại
29
bỏ, chủng nào lên thì giữ lại , bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 400 C để giữ giống
dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo, cấy truyền định kỳ và liên tục.
Cứ theo dõi các hộp lồng liên tục như vậy khoảng 4 -5 ngày mà không
thấy có thêm khuẩn lạc mới nào xuất hiện thì đem hấp bẩn và vô trùng các hộp
lồng này để tiến hành làm thí nghiệm với các mẫu khác.
Phương pháp cấy truyền bảo quản giống trên môi trường thạch nghiêng
Dán nhãn ghi: tên giống vi sinh vật và ngày cấy. Một tay cầm 2 ống
nghiệm: một ống giống và 1 ống môi trường. Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ
dây cấy trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng. Dùng ngón út và ngón áp út rút nút
bông của ống giống ra. Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm. Đợi que cấy
nguội, đưa que cấy vào ống nghiệm lấy khuẩn lạc trong ống giống. Rút que cấy
ra và tiến hành cấy truyền trong ống môi trường. Khử trùng lại phần không khí
nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bông. Khử trùng lại que cấy sau khi sử dụng
xong.
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính
2.3.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm
điểm
Định tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy
một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một
điểm vào môi trường đĩa thạch chứa 1 % cơ chất CMC, nuôi trong tủ ấm 3 – 4
ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch thuốc thử liugon đỏ 1 %, hoạt
tính enzyme được xác định bằng hiệu số ( D - d, cm).
Với D : là đường kính vòng phân giải d : là đường kính khuẩn lạc.
30
2.3.2.2. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi
trường thạch ( William, 1983)
Dùng khoan nút chai khoan các lỗ trên môi trường thử hoạt tính, tương
ứng với từng loại enzyme. Nhỏ vào một lỗ khoan 100 µm dung dịch enzyme đã
chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6h- 8h cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch sau
đó cho vào tủ ấm ở 300C trong 24h. Hiện hình vòng phân giải bằng dung dịch
thuốc thử lugon đỏ 1 %. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số ( D - d,
cm).
Với D là đường kính vòng phân giải ; d là đường kính lỗ đục
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A. Klich, 2002)
2.3.3.1. Phương pháp cấy chấm điểm các chủng nấm mốc lên môi trường
Crapek- Dox cơ sở để nghiên cứu các đặc điểm vĩ mô
Để hạn chế hiện tượng bào tử nấm phát tán và mọc linh tinh trên bề mặt
đĩa thạch, úp ngược đĩa thạch xuống rồi tiến hành cấy chấm 3 điểm khi đĩa thạch
vẫn úp ngược, đánh dấu lại và không lật đĩa thạch lên, cứ thế đem nuôi ủ ở 320C
trong 7 ngày. Sau đó lấy ra quan sát và chụp hình và mô tả các đặc điểm của
nấm.
2.3.3.2. Phương pháp cấy trên khối thạch để quan sát các đặc điểm vi mô
(Robert A. Samson and Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad àn Filtenborg, 1996)
Chuẩn bị hộp lồng, lam kính, lamen, bông ướt, khoan nút chai vô trùng.
Đổ môi trường định loại nghiên cứu vào các hộp lồng sao cho độ dày đạt
gần 1mm, dùng khoan nút chai khoan lấy các khối thạch.
31
Đặt khối thạch ở 2 điểm cách đều nhau trên một lam kính.
Cấy một ít bào tử vào khối thạch đó.
Đậy lamen lên từng khối thạch đó.
Đặt bông ướt vô trùng vào để giữ ẩm cho mẫu.
Sau khi cấy xong dùng kính hiển vi theo dõi từng ngày sự phát triển của
hệ sợi, các hạch nấm.
2.3.4. Phương pháp quan sát các đặc điểm phân loại
2.3.4.1. Quan sát các đặc điểm vĩ mô sau đây bằng mắt thường hoặc dưới kính
hiển vi soi nổi.
Màu sắc bào tử (conidial color): Chính là màu sắc của bông nấm, đây là
đặc điểm qan trọng để phân loại đến mức chi phụ.
Đường kính khuẩn lạc (colony diameter): kích thước lớn nhất của một
trong 3 khuẩn lạc nuôi trên cùng một hộp lồng.
Màu sắc hệ sợi (mycelial color): Thường có màu trắng nhưng một số loại
có màu khác.
Dịch tiết trên bề mặt hệ sợi (exudate) : là các giọt lỏng nhỏ, được hình
thành trên bề mặt hệ sợi
Màu của mặt sau khuẩn lạc (reverse color): là màu sắc quan sát được phía
dưới khuẩn lạc bằng cách nhìn phía dưới đĩa thạch. Màu sắc này thường phụ
thuộc vào môi trường.
Sắc tố hòa tan (Soluble pigment): là sắc tố khuếch tán vào agar theo viền
khuẩn lạc.
32
Hạch nấm (Sclerotia): là khối cứng gồm các sợi nấm, thường hình cầu,
gần cầu hoặc elip, không chứa bào tử.
Thể quả (cleistothecia): đây là các thể quả không tự mở, nó chứa các túi
bào tử mà bên trong là các bào tử túi.
2.3.4.2. Quan sát các đặc điểm vi mô dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh
qua kính hiển vi ( Axioskop)
Giá bào tử trần (conidiophore, tipe) : xác định chiều dại màu sắc và cấu
trúc bề mặt của giá bào tử trần, đây là các đặc điểm quan trọng để phân loại.
Bọng đỉnh giá (versicle) : là đỉnh phồng lên của cuống bào tử nấm. Quan
sát hình dạng và đo kích thước.
Các lớp thể bình (Seriation): quan sát số tầng thể bình
Bào tử trần (conidia): hình thái, kích thước và cấu trúc bề mặt là đặc điểm
quan trọng.
Bông nấm (conidial head): Quan sát hình dạng bông nấm.
Tế bào Hule: thành dày, có tính khúc xạ cao.
Bào tử túi: màu sắc, kích thước, cách trang trí của bào tử túi, bao gồm các
gờ nổi, hoặc các đường rãnh bao xung quanh bào tử núi và cấu trúc bề mặt của
thành lồi.
33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả phân lập
Bảng 3.1. Kết quả và đăc điểm các chủng nấm mốc phân lập đƣợc
Mẫu
STT
Chủng mốc
Đặc điểm của chủng
Màu của khuẩn lạc Thời gian xuất hiện
Lá
cây
mục
1 M1-51 Đen 2 ngày
2 M1-52 Nâu trắng 3 ngày
3 M1-61 Đen 2 ngày
4 M1-62 Tím đen 3 ngày
5 M1-9 Xanh rêu 2 ngày
6 M1-10 Trắng 2 ngày
Gỗ
cây
mục
7 M2 -1 Xám 3 ngày
8 M2-3 Xám đậm 3 ngày
9 M2-4 Xanh 3 ngày
10 M2-51 Nâu đậm 1 ngày
11 M2 -52 Nâu 2 ngày
12 M2-6 Nâu 3 ngày
13 M2-7 Xám nhạt 2 ngày
14 M2-8 Nâu đậm 3 ngày
Đất
mùn
15 M3-4 Xanh Đen 1 ngày
16 M3-8 Trắng vàng 2 ngày
17 M3-10 Nâu 3 ngày
Rơm
dạ
mục
18 M4-1 Vàng 3 ngày
19 M4-2 Trắng xanh 2 ngày
20 M4-3 Xanh mốc 2 ngày
21 M4 D Đen 2 ngày
22 M4 XT Xanh trắng 1 ngày
23 M4-V Vàng xanh 2 ngày
24 M4 -7 Nâu nhạt 3 ngày
25 M4- 8 Xanh rêu 3 ngày
34
Từ lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được thu từ huyện Mỹ
Đức (Hà Nội), Tam Dương ( Vĩnh Phúc) chúng tôi đã chia làm 4 mẫu và tiến
hành phân lập trên 50 hộp petri, quan sát trong 5 ngày và thu được được 25
chủng nấm mốc. Đặc điểm của 25 chủng nấm mốc được nghi ở bảng 3.1.
Kết quả ở bảng 3.1 cho thấy: Trong các mẫu khác nhau thì sự phân bố nấm
cũng khác nhau, trong đó hai mẫu gỗ cây mục và rơm dạ mục thu được nhiều
chủng mốc hơn so với lá cây mục và đất mùn. Kết quả cũng cho thấy các chủng
nấm mốc ở Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức (Hà Nội) mà tôi nghiên cứu khá
là đa dạng, có tiềm năng cho nhiều ứng dụng thực tế như sản xuất enzym, xử lý
nước thải,...
3.2. Kết quả thử hoạt tính
Nhằm kiểm tra khả năng sinh cellulase của 25 chủng nấm mốc phân lập
được, chúng tôi sử dụng phương phấp cây chấm điểm trên môi trường Crapex-
dox được có 1% CMC, sau 3 ngày đo đường kính phân giải cellulase. Kết quả
thử hoạt tính được thể hiện ở bảng 3.2.
35
Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập đƣợc
Mẫu
STT
Chủng
mốc
Hoạt tính
cellulase
D-d (cm)
Mẫu
STT
Chủng
mốc
Hoạt tính
cellulase
D-d (cm)
Lá
cây
mục
1 M1-51 1.7 Đất
mùn
15 M3-4 0.5
2 M1-52 1.0 16 M3-8 0.8
3 M1-61 0.6 17 M3-10 0.5
4 M1-62 0.5 Rơm
dạ
mục
18 M4-1 1.4
5 M1-9 0.6 19 M4-2 0.5
6 M1-10 0.7 20 M4-3 0.4
Gỗ
cây
mục
7 M2 -1 1.2 21 M4 D 1.0
8 M2-3 0.5 22 M4 XT 0.4
9 M2-4 0.3 23 M4-V 2.0
10 M2-51 1.9 24 M4 -7 0.6
11 M2 -52 1.2 25 M4- 8 0.6
12 M2-6 1.2
13 M2-7 0.6
14 M2-8 0.7
Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy: khả năng sinh tổng hợp cellulase ở các chủng
nấm mốc ở các mẫu thu thập ở Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức ( Hà Nội ) là
rất đa dạng. Trong đó mẫu rơm dạ mục là thu được đa dạng nhất các chủng mốc.
Khả năng sinh tổng hợp cellulase ở các mẫu, chủng khác nhau là không như
nhau, trong số 25 chủng có tới 9 chủng đường kính phân giải cellulose lớn hơn
1 cm, 16 chủng còn lại có đường kính phân giải cellulose nhỏ hơn 1 cm. Trong
đó có ba chủng có hoạt tính cellulase cao là chủng M4-V có đường kính phân
giải là 2 cm, chủng M2-51 đường kính phân giải 1,9 cm và chủng M1-51 có
đường kính phân giải là 1,7 cm. So sánh với các nghiên cứu khác ở trong nước
như Lê Thị Hồng Nga (2005), Trịnh Đình Khá (2007) [6] thì ba chủng mà chúng
tôi thu được là có hoạt tính cellulase cao. Do đó chúng tôi chọn ba chủng này để
phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
36
M151 M251 M4V
Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của 3 chủng mạnh nhất
3.3. Kết quả định loại sơ bộ
3.3.1. Bản mô tả chủng M4V
Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002),
tôi đã bước đầu xác định được chủng M4V thuộc chi Penicillium do nó có các
đặc điểm hình thái rât giống với các đặc điểm hình thái của chi Penicillium trong
khóa phân loại Samson và cs (1995) [25]. Những đặc điểm hình thái của chủng
M4V được miêu tả cụ thể như sau:
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở: 35 mm sau 7
ngày nuôi cấy.
Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu xanh lục ở giữa, ở rìa màu
xám xanh. Khuẩn lạc hình trứng thon dài. Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc : có màu
nâu tối, không nhăn.
37
Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính
Giá bào tử trần (condiophore, tipe): phát triển hầu hết từ hệ sợi, không có
nhánh hoặc mang 1-2 nhánh. Nhánh nếu có nhẵn.
Bào tử: Khi riêng rẽ, các bào tử trần không màu hoặc màu nhạt. khi tụ họp
thành đám, thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám. Các bào tử trần
này tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình, xếp thành các chuỗi song song hay
dạng cột
Bông nấm (conidial head): hình cái chổi. Bọng đỉnh giá (vesicle): hình đế,
bàn chang. Bào tử trần (conidia): có hình ovan, cầu.
Các lớp thể bình (seriation): lưỡng tầng. Cuống thể bình thành vòng 3-6 cái
trên đỉnh giá bào tử trần hoặc trên đỉnh mỗi nhánh
Hình thái khuẩn lạc Bào tử trần (X400)
38
Bào tử trần ( X1000) Bọng đỉnh giá ( X1000)
Giá bào tử ( X100) Giá bào tử ( X1000)
Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X400)
Hình 3.2. Một số đặc điểm hình thái của chủng M 4V
39
3.3.2. Bản mô tả chủng M 151
Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002),
tôi đã bước đầu xác định được chủng M 151 thuộc chi Aspergillus do nó có các
đặc điểm hình thái rất giống với các đặc điểm hình thái của chi Aspergillus trong
khóa phân loại Samson và cs (1995). Những đặc điểm hình thái của chủng
M 151 được miêu tả cụ thể như sau:
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở là 40mm sau 7
ngày nuôi cấy.
Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu vàng hoa cau, vàng tươi, hệ sợi
khí sinh tử trắng đến vàng nhạt
Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu vàng tối, không nhăn.
Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính
Giá bào tử trần (condiophore, tipe): không phân nhánh, hơi ráp, thành dày,
dài 1,5 đến 3 cm.
Bông nấm (conidial head): hình bán cầu, gần cầu.
Bọng đỉnh giá (vesicle): hình bán cầu, hình cầu.
Bào tử trần (conidia): có hình cầu. Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau
hình tia tỏa tròn hoặc tách thành các cột, đôi khi có các khối bào tử trần nhỏ màu
nâu đen.
Các lớp thể bình (seriation ): đơn tầng bao phủ 70- 90%, Cuống thể bình lớn
40
Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc
Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X400 )
Bông nấm ( X1000) Bọng đỉnh giá (X400)
41
Bào tử trần (X1000) Bào tử trần ( X400)
Hình 3.3 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 151
3.3.3. Bản mô tả chủng M 251.
Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A. Klich, 2002),
tôi đã bước đầu xác định được chủng M 251 thuộc loài Aspergillus niger do
nó
có các đặc điểm hình thái rât giống với các đặc điểm hình thái của loài
Aspergillus niger trong khóa phân loại Samson và cs (1995). Những đặc
điểm hình thái của chủng M 251 được miêu tả cụ thể như sau:
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Đường kính khuẩn lạc trên môi trường Crapek – Dox cơ sở là 55 mm sau
7
ngày nuôi cấy.
Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu đen hơi nâu,có vòng trắng ngăn
cách phần giữa khuẩn lạc với rìa khuẩn lạc. hệ sợi khí sinh vàng nhạt
Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu đỏ cam, nhăn.
Cấu tạo cơ quan sinh sản vô tính
Giá bào tử trần (condiophore, tipe): không phân nhánh, thẳng, thành rất dày
42
Bông nấm (conidial head): hình cầu.
Bọng đỉnh giá (vesicle): hình bán cầu, hình cầu, hơi thon dài, mang cuống
thể bình và thể bình
Bào tử trần (conidia): đa số hình ovan, elip, một số hình cầu.
Các lớp thể bình (seriation ): đơn tầng, bao phủ 50- 80%.
Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc
Bào tử trần ( X400) Bào tử trần (X1000)
43
Giá bào tử (X400) Bọng dỉnh giá ( X1000)
Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X1000)
Hình 3.4 .Một số đặc điểm hình thái của chủng M 251
44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Từ các mẫu lá mục, gỗ mục, đất mùn và rơm dạ mục, được lấy ở Mỹ
Đức ( Hà Nội), Tam Dương (Vĩnh Phúc) chúng tôi đã phân lập được 25 chủng
nấm mốc, tất cả 25 chủng nấm mốc này đều có khả năng tổng hợp cellulase phân
giải cellulose.
2. Trong 25 chủng nấm mốc này có 3 chủng M4V, M251, M151 có hoạt
tính cellulase mạnh nhất, hoạt tính của 3 chủng này lần lượt là 2.0 cm, 1.9 cm,
1.7 cm.
3. Bước đầu định loại sơ bộ 3 chủng nấm mốc M4V, M251, M151. Trong
đó, M4V thuộc chi Penicillium, M51 thuộc chi Aspergillus, M251 thuộc loài
Aspergillus niger.
KIẾN NGHỊ
1. Các chủng M4V, M151, M251, chỉ được định loại sơ bộ trên phương
pháp quan sát các đặc điểm hình thái là chủ yếu. Kiến nghị kết hợp thêm phương
pháp phân loại bằng kĩ thuật sinh học phân tử
2. Tiếp tục nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh
cellulase của các chủng ( nhiệt độ, nguồn cacbon, nguồn nitơ, độ pH thích hợp,
độ ẩm....) bằng phương pháp lên men rắn.
3. Nghiên cứu đánh giá tiềm năng ứng dụng của 3 chủng M4V, M251,
M151.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
[1] Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, (2001). Vi nấm dùng trong công nghệ
sinh học, NXB KH & KT Hà Nội, trang: 13 – 16, 154 – 168.
[2] Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thùy Dương. “Phân lập,
tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose
nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả là thức ăn chăn nuôi”.
[3] Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân
Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
[4] Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả năng sinh
tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger RNNL- 363, Báo cáo khoa
học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà
Nội: 304-307.
[5] Nguyễn Đức Lượng (2003) Sản xuất cà phê theo phương pháp enzyme, Báo
cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ
thuật, Hà Nội: 318-320.
[6] Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp
cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase, Luận văn thạc sĩ khoa học,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
46
[7] Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu quả sử dụng năng lượng
và giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi-
Viện chăn nuôi quốc gia: 16.
TIẾNG ANH
[8] Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular
diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria, FEMS
Microbiol Ecol 28: 99-110.
[9] Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of
action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus
Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced and chromogenic
cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378.
[10] Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of
crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain, Turk J
Biol, 26: 209-213.
[11] Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by
Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic Acad Sci,
9: 119-124.
[12] Ekperigin MM, Preliminary studies of cellulase production by
Acinetobacter anitratus and Branhamella sp, African Journal of Biotechnology
Vol. 6, pp. 028-033, 4 January 2007.
[13] Kang M, Rhee Y (1995) Cacboxymethyl cellulases active and stable at
alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp. RYM-202, Biotechnol Lette,
17: 507-512.
47
[14] Katsuhiko Ando at al, 2004, Sampling and Isolation Methods of Fungi,
Department of Biotechnology, National Institute of Technology and Evaluation
(NITE), Japan.
[15] Katsuhiko Ando, 2002, Identification of Fungi Imperfecti, NITE Biological
Resource Center National Intitute of Technology and Evaluation.
[16] Kiffer E., M. Morelet, (2000), the Deuteromycetes (Mitosporic Fungi),
Science Publishers TNC, U.S.A., 115pp.
[17] Maren A. Klich, 2002. Identification of Common Aspergillus Speceies,
Pulished by the Central bureau voor Schimmelcutues, Utrecht, The Nethrlands,
107 pp.
[18] Mc Kenzie Erick H.C., (2004), Fungal Taxonomy Workshop, Landcare
Research Private Bag 92170 Auckland New Zealand, p. 3,6.
[19] Michael J.Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994, The Fungi.
[20] Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-
Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of Biotechnology,
1: 51-56.
[21] Noyd R.K., (2002), Mycology Reference Card, The American
Phytopathological Society 3340 Pilot Knob Road. St Paul, Minnesota 55121 –
2079, USA, 18pp.
[22] Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003)
Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 fermented in
sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152.
48
[23] Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma longi,
Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on waste from orange,
Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388
[24] Raper K B, Fennell D L (1965), the Gennus Aspergillus, Baltimore USA
William and Wilkins, Preston street baltimore, Md 21202 U S A, p 570.
[25] Robert A. Samson and Ellen S.Hoekstra, Jens C. Frisvad and Filtenborg
(1996). Introduction to Food- borne Fungi, Centraalbureau voor Schimmelcutues
Baarl Delft, Pg : 3,4, 52- 83.
[26] Robert A. Samson, John I. Pitt (2000). Integration of modern taxonomic
methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- ĐỀ TÀI PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO.pdf