Khóa luận Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hương mắm đặc trưng từ chượp mắm và ứng dụng vào sản xuất nước mắm chay từ nấm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ ANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC GIỐNG VI SINH VẬT SINH PROTEASE VÀ GÂY HƢƠNG MẮM ĐẶC TRƢNG TỪ CHƢỢP MẮM VÀ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT NƢỚC MẮM CHAY TỪ NẤM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. VƢƠNG THỊ VIỆT HOA TRẦN THỊ ANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Chúng tôi xin chân thành cảm tạ: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bô Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. ThS Vƣơng Thi Việt Hoa đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Ks Nguyễn Minh Hiền đã tận tình giúp đỡ , tạo điều kiện cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học 29 và Bảo Quản 29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng mắm đặc trƣng và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi Sinh, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 3/2007 đến 7/2007 dƣới sự hƣớng dẫn của Th.S Vƣơng Thị Việt Hoa nhằm tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân và gây hƣơng tốt để ứng dụng thử vào sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm. Đề tài tiến hành gồm 5 thí nghiệm: Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện ƣu thế trong chƣợp mắm trên môi trƣờng NA, NB, cơ bản và nƣớc chiết nấm rơm. Thí nghiệm 2: khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ở thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm đƣợc bổ sung muối với nồng độ tăng dần từ 0% đến 20%.dựa hàm lƣợng đạm formol sinh ra sau mỗi lần bổ sung muối đƣợc đo bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol. Thí nghiệm 3: khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được từ thí nghiệm 1 và bố trí trên môi trường nước chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 24 giờ, khảo sát khả năng hàm lƣợng đạm formol đƣợc sinh ra bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ thí nghiệm 1 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm có 20% muối. Thời gian theo dõi sau 3 ngày, ghi nhận kết quả qua phép thử cho điểm bằng phƣơng pháp đánh giá cảm quan. Thí nghiệm 5:Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân là 400C-500C. Tỉ lệ phối trộn của dứa từ 15% đến 45%. v Sản phẩm nƣớc mắm chay có bổ sung vi khuẩn gây hƣơng Clostridium.sp và vi khuẩn thủy phân Bacillus.sp đƣợc phân lập và tuyển chọn từ các thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, thí nghiệm 3, thí nghiệm 4 để cho ra sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất. Kết quả thu đƣợc: Tất cả các chủng đều có khả năng chịu mặn. Chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 đƣợc chọn làm tác nhân thủy phân. Chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 đƣợc chọn làm tác nhân sinh hƣơng. Nghiệm thức 5 với công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu là 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu khí (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) + 10% vi khuẩn kị khí (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) đƣợc chọn làm công thức phối trộn để sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh. Tp.HCM, ngày 30 tháng 7 năm 2007 Bộ môn Công Nghệ Sinh Học vi ABSTRACT Subject “ Isolation, selection of microorganism that release protease and create specific smell of fish sauce and applied to produce vegetarian fish sauce from mushroom ” is excicuted in Microorganism Laboratory, Food Technology Faculty, Nong Lam University from 3/2007 to 7/2007, is guided by MSc Vuong Thi Viet Hoa to select bacteria can hydrolyze protein and create specific smell of fish sauce well in order to produce experimentally vegetarian fish sauce from mushroom. The subject has 5 experiments: The 1 st experiment: Isolation, selection of microorganism that is present mainly in fish sauce grounds in NA, NB, Czapek and Volvariella volvacea extract culture. The 2 nd experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with salt concentration from 0% to 20%. Survey hydrolysis of protein by title of formol method. The 3 rd experiment: Survey possibility of salt-resistant of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Survey hydrolys of protein by title of formol method after 24 hours. The fourth experiment: Survey possibility of hydrolysis of bacteria that isolated on Volvariella volvacea extract culture with 20% salt. Result is evaluated by sense organs method. The fifth experiment: Producing experimentally vegetarian fish sauce from mushroom. T 0 opt: 40 0 C – 500C. Ratio of pineapple: 15% - 45%. Vegetarian fish sauce is supplemented Clostridium sp and Bacillus sp that are isolated and selected from the 1 st experiment, the 2 nd experiment, the 3 rd experiment and the fourth experiment. vii Result: All of bacteria have possibility of salt-resistant. Hydrolytic agents are Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4. Smell agents are Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2. The fifth sample (include: 45% pineapple + 20% Volvariella volvacea + 20% Pleurotus ostreatus + 15% salt + 10% Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 (ratio of Bacillus sp.1 and Bacillus sp.4 is 1:1) + 10% Clotridium sp.1 and Clostrdium sp.2 (ratio of Clostridium sp.1 and Clostridium sp.2 is 1:1)) is chosen the formula of accomplished product. Ho Chi Minh City, July 30 th 2007 Biotechnology Faculty viii MỤC LỤC CHƢƠNG...................................................................................................... TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .................................................................................................................iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Abtract ...................................................................................................................... vi Mục lục ...................................................................................................................viii Danh sách các bảng .................................................................................................. xi Danh sách các sơ đồ, hình , đồ thị ..........................................................................xiii 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2. Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài ................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .......................................................................................................... 2 1.2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.2.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 4 2.1. Khái quát về nƣớc mắm ..................................................................................... 4 2.1.1 Giới thiệu .......................................................................................................... 4 2.1.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm ........................... 4 2.1.3 Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm ................................................................... 7 2.2. Cơ chế hình thành nƣớc mắm ............................................................................ 7 2.2.1. Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin ................................................. 7 2.2.2. Quá trình tạo hƣơng thơm ............................................................................... 8 2.3. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ............................................................................ 8 2.3.1. Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày .......................................................... 8 2.3.2. Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ..................................................... 10 2.4. Giá trị dinh dƣỡng của nấm ăn ......................................................................... 13 ix 2.5. Sự phân giải của enzyme .................................................................................. 18 2.5.1. Phân loại protease ......................................................................................... 18 2.5.2. Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng ............................................................ 19 2.5.2.1. Protease từ vi sinh vật ................................................................................ 19 2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin ..................................................... 20 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 21 3.1. Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 21 3.2. Nguyên vật liệu thí nghiệm .............................................................................. 21 3.2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 21 3.2.2. Vật liệu .......................................................................................................... 21 3.2.3. Môi trƣờng sử dụng ....................................................................................... 22 3.2.2. Hóa chất sử dụng ........................................................................................... 22 3.3. Nội dung và phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm .............................................. 23 3.4. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm .......................................................... 23 3.4.1. Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm .................................................................................................... 23 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 25 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm .............................................. 26 3.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................. 27 3.5. Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 29 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 32 4.1. Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các hủnh vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm ................................. 32 4.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật .......................................... 32 x 4.1.1.1 Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí ............................ 32 4.1.1.2. Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí ............................... 35 4.1.2. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 37 4.1.3. Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ............................................................. 40 4.1.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc ......................................................................................................................... 43 4.2. Kết quả sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc .......................................................................................................... 44 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 56 5.1. Kết luận ............................................................................................................ 56 5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 57 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 68 7. PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm ......................................................... 7 Bảng 2.2. So sánh thành phần nƣớc mắm ngắn ngày có dùng thêm chế phẩm enzyme vi sinh vật và nƣớc mắm dài này theo phƣơng pháp thông thƣờng .......... 12 Bảng 2.3. Thành phần phân tích của một số nấm trồng phổ biến ........................... 14 Bảng 2.4. Hàm lƣợng vitamine và chất khoáng ...................................................... 14 Bảng 2.5. Thành phần acid amin trong nấm ........................................................... 14 Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ......................................................... 28 Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan nƣớc mắm ........................................................ 31 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 0% ............................ 37 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 3% ............................ 38 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 10% .......................... 38 Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 20% .......................... 39 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức ............. 41 Bảng 4.6. Bảng điểm đánh giá cảm quan về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ chƣợp mắm ................................................................ 43 Bảng 4.7. Kết quả hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian .. 45 Bảng 4.8. Kết quả hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian .... 46 Bảng 4.9. Kết quả hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian ....... 47 Bảng 4.10. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 1 .................................... 48 Bảng 4.11. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 2 .................................... 48 xii Bảng 4.12. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 3 .................................... 49 Bảng 4.13. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 4 .................................... 49 Bảng 4.14. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 5 .................................... 49 xiii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ, HÌNH , ĐỒ THỊ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày ................. 9 Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ............ 11 Sơ đồ 3.1. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm .............................................................. 23 Sơ đồ 4.1. Quy trình đề nghị sản xuất nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm ........... 54 HÌNH TRANG Hình 4.1. Khuẩn lac Bacillus sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 32 Hình 4.2. Khuẩn lac Bacillus sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 33 Hình 4.3. Khuẩn lac Bacillus sp.3 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34 Hình 4.4. Khuẩn lac Bacillus sp.4 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 34 Hình 4.5. Khuẩn lac Bacillus sp.5 - Tế bào vi khuẩn (x100) .................................. 35 Hình 4.6. Khuẩn lac Clostridium sp.1 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36 Hình 4.7. Khuẩn lac Clostridium sp.2 - Tế bào vi khuẩn (x100) ............................ 36 Hình 4.8. Hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh khuẩn lạc của những chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease trên môi trƣờng cơ bản bổ sung 10% sữa ...... 40 Hình 4.9. Sản phẩm nƣớc mắm chay ...................................................................... 55 ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Biến thiên khả năng sinh đạm formol của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm theo nồng độ muối .............. 39 Đồ thị 4.2. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra do các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc từ chƣợp mắm trong các nghiệm thức... .......................................... 42 Đồ thị 4.3 Khảo sát hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian. ......................................................................................................................... 45 Đồ thị 4.4. Khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian .......................................................................................................................... 46 Đồ thị 4.5. Khảo sát hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian .... 47 Đồ thị 4.6. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan màu sắc giữa các nghiệm thức ...... 50 xiv Đồ thị 4.7. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan mùi giữa các nghiệm thức ............. 50 Đồ thị 4.8. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan vị giữa các nghiệm thức ................ 51 Đồ thị 4.9. Điểm có trọng lƣợng về cảm quan độ trong giữa các nghiệm thức ...... 51 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề. Trung Quốc có nƣớc tƣơng, Việt Nam có nƣớc mắm. Từ lâu nƣớc mắm đã trở thành một loại nƣớc chấm rất thông dụng và gần gũi với ngƣời dân Việt Nam, những ai đi xa khi nhớ đến quê hƣơng thì không thể quên hƣơng vị của nƣớc mắm quê nhà. Ngƣời nƣớc ngoài thì biết đến nƣớc mắm nhƣ món ăn truyền thống của ngƣời Việt Nam, đã có bài báo so sánh nƣớc mắm đối với Việt Nam giống nhƣ rƣợu cônhắc đối với nƣớc Pháp.Vừa đƣợc xem là loại gia vị vừa đƣợc xem là thực phẩm giàu dinh dƣỡng, nó chứa nhiều acid amin không thay thế nhƣ lysin, valin…các vitamine hoà tan trong nƣớc B1, B2, PP…và các nguyên tố Ca, P, S… Khi xã hội phát triển,chất lƣợng cuộc sống ngày càng đƣợc nâng cao thì con ngƣời luôn đòi hỏi đến các loại thực phẩm không chỉ về chất lƣợng và mùi vị, mà còn phải đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nhƣng vẫn giữ đƣợc giá cả hợp lý. Và những yêu cầu này không loại trừ nƣớc mắm. Ngoài ra vấn đề cạnh tranh giữa các hãng nƣớc mắm không chỉ trong nƣớc mà còn ngoài nƣớc nhƣ Thái Lan thì các yêu cầu trên càng đƣợc quan tâm hơn. Trong khi đó, công nghệ sản xuất nƣớc mắm ở Viêt Nam còn mang tính thủ công, hiệu suất lên men thấp, thời gian lên men kéo dài và đây cũng là nhƣợc điểm lớn nhất. Vì vậy nếu chúng ta có đƣợc chủng vi sinh vật thủy phân đạm và gây hƣơng thì ta có thể linh động hơn trong quá trình sản xuất đồng thời có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu giàu đạm khác nhau và rút ngắn đƣợc chu kì sản xuất, nâng cao chất lƣợng sản phẩm, nâng cao hiệu suất kinh tế. Bên cạnh đó việc tìm các nguồn nguyên liệu mới nhằm làm đa dạng sản phẩm nƣớc mắm cũng là một nhu cầu cấp thiết trên thị trƣờng. Làm sao để có một sản 2 phẩm nƣớc mắm mà những ngƣời an chay vẫn có thể dùng? Ta biết rằng từ lâu nấm đã đƣợc coi là một đặc sản thơm ngon có giá trị dinh dƣỡng cao. Hàm lƣợng đạm trong nấm cao hơn bất kì loại rau quả nào khác, hàm lƣợng muối khoáng trong nấm cao hơn thịt cá và đặc biệt nấm có chứa nhiều loại vitamine nhƣ B12, B2… Ngoài ra nấm còn có tác dụng chữa một số loại bệnh. Với những giá trị và tác dụng nhƣ trên nấm đƣợc xem là loại thức ăn an toàn dành cho ngƣời. Những năm gần đây, phong trào nuôi trồng nấm phát triển mạnh. Nhà nhà trồng nấm. Ngƣời ngƣời trồng nấm. Gặp lúc thời tiết thuận lợi, nấm ra hàng loạt tiêu thụ và không tránh khỏi cảnh “dội chợ”, hàng trăm ký nấm bị đổ đi vì không thể giữ lâu đƣợc. Chính vì vậy vẫn dựa trên phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm cổ truyền và nguyên tắc sử dụng nguồn hệ vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm, enzyme từ dứa và nguồn nguyên liệu nấm để sản xuất ra sản phẩm nƣớc mắm chay. Từ những ý tƣởng trên, đƣợc sự cho phép của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm, dƣới sự hƣớng dẫn của và giúp đỡ của Th.S Vƣơng Thị Việt Hoa chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn các giống vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng mắm đặc trƣng và ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm. 1.2.Mục đích, nội dung và giới hạn đề tài. 1.2.1.Mục đích. Tuyển chọn các vi khuẩn sinh protease và gây hƣơng từ các chủng vi khuẩn đã đƣợc phân lập qua khảo sát khả năng phân giải đạm và gây hƣơng trong dịch chiết nấm rơm. Ứng dụng các chủng vi sinh vật sinh protease và gây hƣơng để chế biến nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nguyên liệu nấm rơm và nấm bào ngƣ làm đa dạng sản phẩm nƣớc mắm, tạo sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, đáp ứng nhu cầu an toàn thực phẩm. 1.2.2.Nội dung nghiên cứu. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm. Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trong chƣợp mắm trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. 3 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh protease qua khảo sát khả năng thủy phân protein của các chủng vi sinh vật phân lập trong chƣợp mắm trên nguyên liệu nƣớc chiếtt nấm rơm. Khảo sát khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập trong chƣợp mắm trên nguyên liệu nƣớc chiết nấm rơm. Sản xuất thử nghiệm nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập và tuyển chọn đƣợc. 1.2.3. Giới hạn đề tài. Đề tài chỉ bƣớc đầu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh thủy phân tốt và gây hƣơng mắm đặc trƣng trên dịch chiết nấm rơm từ đó ứng dụng vào sản xuất nƣớc mắm chay ở quy mô phòng thí nghiệm. Do thiếu hóa chất để thực hiện một số phản ứng sinh hóa nên đề tài chỉ dừng lại ở mức định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Khái quát về nƣớc mắm. 2.1.1. Giới thiệu. Nƣớc mắm đƣợc sản xuất bằng cách cho phân giải protein của cá dƣới tác dụng của các enzyme có sẵn trong thịt và ruột cá. Cho cá vào hủ sành với lƣợng muối đầy đủ, phơi trộn và để 6 – 12 tháng. Mắm cá đang muối đƣợc gọi là chƣợp. Khi chƣợp chín đem lọc (hoặc đem nấu rồi lọc ta đƣợc nƣớc mắm). (Lê Xuân Phƣơng, 2001). Nƣớc mắm có truyền thống từ lâu đời và cho đến nay chƣa có tài liệu nào xác định đƣợc thời điểm chính xác cũng nhƣ ai là ngƣời đầu tiên đƣa ra quy trình sản xuất sản phẩm này, chỉ biết rằng nó đã gắn liền với đời sống hằng ngày, mang nét đặc trƣng rất riêng, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam (Nguyễn Trọng Cẩn, Đỗ Minh Phụng, 1990). Nghề nƣớc mắm đã có những chuyển biến rõ rệt từ màu sắc, mùi vị và thời gian tạo ra sản phẩm rút ngắn từ 9 – 12 tháng còn lại khoảng 2 – 3 tháng. Năm 1914, Rose đánh giá phẩm chất của nƣớc mắm theo các chỉ số hóa học: Đạm toàn phần tính theo g/l. Đạm hữu cơ = đạm toàn phần - đạm amoniac. Đạm amin = đạm formol - đạm amoniac. 2.1.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình hình thành nƣớc mắm: Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân phải phù hợp thì quá trình thủy phân nhanh hơn. Lƣợng nƣớc cho vào trong quá trình thủy phân, theo kinh nghiệm của các xí nghiệp sản xuất nƣớc chấm cho thấy lƣợng nƣớc cho vào thủy phân tốt nhất là 30 – 40% so với nguyên liệu, khi cho nƣớc vào nên cho 5 – 10% muối NaCl và duy trì nhiệt độ thủy phân 540C – 580C trong suốt thời gian lên men 5 là 64 – 72 giờ. ( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006) Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nƣớc chấm, thiếu muối nƣớc chấm sẽ không hình thành đƣợc. Yêu cầu của muối trong quá trình sản xuất nƣớc chấm phải là muối ăn (NaCl), muối càng tinh khiết càng tốt. Tốt nhất là muối kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn cao, màu trắng óng ánh không đóng cục, không có vị đắng chát. Nồng độ muối thấp có tác dụng thúc đẩy quá trình thủy phân protein nhanh hơn, tạo thành acid amin nhiều hơn. Nồng độ muối cao có tác dụng ức chế, làm mất hoạt tính của enzyme, quá trình thủy phân chậm lại, thời gian thủy phân kéo dài. Thƣờng lƣợng muối cho vào quá trình lên men khoảng 20 – 25% so với lƣợng nƣớc. Nên thực hiện phƣơng pháp cho muối nhiều lần và cần phải xác định số lần cho muối vào và khoảng cách giữa các lần cho muối để không ảnh hƣởng đến quá trình lên men. Nồng độ muối ảnh hƣởng mạnh mẽ đến vi sinh vật. Nồng độ muối cao sẽ ức chế vi sinh vật phát triển. Còn nồng độ muối thấp thì mốc dễ dàng phát triển cùng với một số vi khuẩn gây thối phát triển và làm hƣ sản phẩm. Nhiệt độ là yếu tố rất quan trọng để phát huy tác dụng tích cực của các loại enzyme. Trong quá trình chế biến, khi nhiệt độ tăng thì vận tốc phản ứng của các enzyme sẽ tăng, nhƣng nhiệt độ tăng cao quá sẽ ức chế enzyme và quá trình thuỷ phân sẽ giảm. Vì enzyme mang bản chất là protein nên chúng không chịu đƣợc nhiệt độ cao. Nhiệt độ thích hợp cho các enzyme hoạt động từ 45 0 C – 540C. Ngoài ra nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến sự phát triển của vi sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ nhất định, do đó ta cần tạo một nhiệt độ tối ƣu cho vi sinh vật phát triển và sinh trƣởng, từ đó vi sinh vật sẽ tiết ra nhiều enzyme và quá trình thuỷ phân protein thành acid amin nhanh hơn. Mỗi hệ enzyme có pH tối thiểu khác nhau vì vậy phải xem loại enzyme nào nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu nhất trong quá trình sản xuất nƣớc chấm. 6 Từ đó, ta tạo pH thích hợp cho enzyme đó hoạt động. Qua thực nghiệm cho thấy pH môi trƣờng tự nhiên có pH = 4 – 5 thích hợp cho quá trình lên men. Đồng thời, ở pH này còn có tác dụng ức chế vi khuẩn gây thối phát triển. Nƣớc bổi có vi khuẩn, men tiêu hóa đƣợc xem nhƣ dung môi hòa tan các chất do sự phân giải cá hình thành để chống vi khuẩn bên ngoài xâm nhập khối thịt cá. Trong nƣớc mắm có chứa rất nhiều loại vi khuẩn hiếu khí: gồm Escherichia coli, Paracoli, Aerobacter, Bacillus subtilius….vi khuẩn gây bệnh: với tỉ lệ 1% nhƣ Staphilococcus aureus, vi khuẩn yếm khí: Clostridium Tonkimeirs, Clostridium welchii, Eubacterium; nấm mốc: Aspergillus Penicillium, Mucor; nấm men: Trichoderma, Tropicalis… Năm 1930, Boer và Guiller đã tách đƣợc từ nƣớc mắm một loại vi khuẩn kị khí sinh bào nha là Clostridium. Loại này cấy trong môi trƣờng thạch pepton sẽ sản sinh ra hƣơng vị của nƣớc mắm. Thêm chƣợp chín cũng có tác dụng rút ngắn ¼ - ½ thời gian trong điều kiện 36 0 C – 440C. Đồng thời phải cho muối từ nhạt đến mặn dần để lợi dụng khả năng lên men ban đầu của vi sinh vật, không làm ức chế các men hoạt động. Áp dụng phƣơng pháp cho muối nhiều lần sẽ phân giải nhanh hơn cho muối 1 lần. Nguyên liệu đƣợc băm, nghiền, đập dập có tác dụng rút ngắn đƣợc thời gian chế biến chƣợp hơn cá nguyên con. Nghề nƣớc mắm hiện nay ở Việt Nam vẫn sản xuất theo phƣơng pháp cổ truyền quá trình sản xuất thô sơ, thời gian kéo dài và hiệu quả kinh tế thấp. Đã có nhiều công trình nghiên cứu để cơ giới hóa nghề nƣớc mắm nhƣng còn gặp nhiều khó khăn và hạn chế vì sự ăn mòn của muối đối với kim loại. 7 2.1.3.Giá trị dinh dƣỡng của nƣớc mắm. Bảng 2.1. Thành phần hóa học của nƣớc mắm. Thành phần hóa học (g/l) Loại đặc biệt Loại I Loại II Loại III Độ acid 4,75 3,5 2,95 2,13 NaCl 210 280 280 285 N2 toàn phần 26 16 11,5 9,2 N2 amon 7,6 3,1 3,2 2,1 N2 formol 18,3 10,6 9,4 4,5 N2 hữu cơ 19 8,3 10,5 6 N2 amin 10,7 7,5 6,2 2,4 Tryptophan 1,05 0,64 0,45 0,31 Sắt 0,02 0,006 0,011 0,006 Magie 1,21 2,7 0,77 3,2 Canxi 0,21 0,39 0,35 0,41 (Lê Xuân Phƣơng, 2001 ). 2.2.Cơ chế quá trình hình thành nƣớc mắm. Quá trình hình thành nƣớc mắm gồm 2 quá trình cơ bản: 2.2.1.Quá trình chuyển hóa protid thành acid amin. Quá trình thủy phân protit của cá thành acid amin, peptit nhờ enzyme protease của cá hệ sinh vật có trong ruột cá hay vi sinh vật bên ngoài tác dụng vào qua các dạng trung gian nhƣ peptin, polypeptit, peptit, và cuối cùng là acid amin. Protein > polypeptid > acid amin Nếu quá trình xảy ra mạnh sẽ dẫn đến các sản phẩm cuối cùng là acid amin và 1 số loại khí có mùi rất khó chịu nhƣ: H2, NH3,…Các sản phẩm này làm giảm chất lƣợng nƣớc mắm, bay hơi tạo mùi khó chịu. Những vi sinh vật tiết ra enzyme protease thúc đẩy quá trình thủy phân xảy ra nhanh hơn. Bên cạnh đó các vi sinh vật 8 gây thối có tác dụng ngƣợc lại làm nát thịt cá và gây thối sản phẩm, những vi sinh vật này xuất hiện có khi ở giai đoạn đầu hay trong trong quá trình chế biến nếu không khống chế kịp thời sau khi tạo thành nƣớc mắm cũng dễ bị thối do vi sinh vật gây nên. 2.2.2.Quá trình tạo hƣơng thơm. Đây là một quá trình phức tạp, đòi hỏi phải có thời gian nhất định để sản phẩm tích lũy năng lƣợng đặc trƣng do sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo thành hƣơng thơm. Nƣớc mắm là một dung dịch mà trong đó không chỉ có acid amin, nƣớc, muối, vitamine và các chất khoáng mà phải có loại hƣơng thơm đặc trƣng của nó. Do đó nếu thiếu quá trình này thì nƣớc mắm không còn là nƣớc mắm mà chỉ là dung dịch acid amin thuần túy. Cho đến nay vẫn chƣa có sự giải thích rõ ràng nào về sự tạo hƣơng nƣớc mắm, nhiều ngƣời cho rằng các sản phẩm thủy phân trong quá trình kết hợp với nhau mà sinh hƣơng, một số khác thì cho ràng là do hoạt động của vi khuẩn lactid hoặc vi khuẩn thuộc giống Clostridium nhƣ công trình nghiên cứu cùa Boer và Guiller (1930), Creach và Koskopull (1940)… 2.3.Quy trình sản xuất nƣớc mắm. 2.3.1.Quy trình sản xuất nƣớc mắm dài ngày. Đây là phƣơng pháp làm nƣớc mắm thủ công, quá trình này thƣờng kéo dài 12 – 14 tháng để làm chuyển hóa protein của cá thành acid amin rùi đem lọc và nấu nƣớc mắm. Ở mỗi vùng mỗi địa phƣơng có phƣơng pháp làm khác nhau nhƣng ta có thể tóm tắt quy trình tổng quát nhƣ sau : 9 Cá + Muối Phƣơng pháp gài nén khu bốn Phƣơng pháp bổ sung nƣớc Phƣơng pháp của vùng Phú Quốc Phƣơng pháp khuấy trộn Lên men Chiết rút lần 1 Bã chƣợp chín Nƣớc mắm nguyên chất Chiết rút lần 2 Nƣớc mắm chiết rút lần 2 Pha đấu Thành phẩm nƣớc mắm các loại Bã Làm phân bón hoặc làm thực phẩm gia súc Sơ đồ 2.1. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm dài ngày. (Nguyễn Đức Lƣợng, 2006). Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất: *Cho muối trong quá trình lên men Cho muối thành nhiều lần khác nhau: Cơ sở khoa học của phƣơng pháp này là: Làm cho enzyme protease không bị ức chế bởi nồng độ muối cao, ngay từ đầu ở nồng độ muối thấp quá trình thủy phân xảy ra với tốc độ cao hơn. Kiềm hãm hoạt động của các vi sinh vật gây thối. Nếu với nồng độ muối cao thịt cá sẽ chắc lại khó thủy phân, do vậy làm chậm tốc độ thủy phân cá. 10 *Sự cho nước thêm vào chượp: Điều này có tác dụng làm loãng nồng độ muối, làm loãng chƣợp tạo điều kiện cho các enzyme hoạt động tốt, dễ khuấy trộn, thịt cá chóng nát, nhiệt độ phân phối đều trong chƣợp. Tuy nhiên, việc cho nƣớc thêm vào chƣợp dễ tạo điều kiện xâm nhập hoạt động của các vi sinh vật gây thối. Do đó cần theo dõi quá trình sản xuất để phát hiện các hiện tƣợng bất thƣờng, tạo mùi thối, vị xấu... để bổ sung muối kịp thời ngăn chặn sự hƣ hỏng của chƣợp cá. *Tác dụng phơi nắng: Tạo điều kiện thích hợp cho enzyme hoạt động làm tăng tốc độ thủy phân. Chƣợp càng phơi nắng nhiều nƣớc mắm càng ngon, càng rút ngắn đƣợc thời gian chƣợp chín làm tăng hiệu suất thủy phân. *Tác dụng của khuấy trộn, đánh nhuyễn: Tác dụng cơ học làm cho thịt cá chóng rã, tăng diện tích tiếp xúc với enzyme, nhiệt độ, nồng độ muối, khối cá đƣợc đồng đều, đồng nhất, tạo điều kiện thủy phân tốt hơn. *Tác dụng bổ sung bã mắm cá và chượp chín vào chượp mới ướp muối: Cơ sở áp dụng của phƣơng pháp này là: Làm tăng lƣợng enzyme và lƣợng vi sinh vật cần thiết giúp quá trình phân giải nhanh hơn. Giảm đƣợc lƣợng muối cho những lần men sau, giảm bớt mùi tanh. 2.3.2.Quy trình sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày. Có nhiều biện pháp để rút ngắn thời gian len men bằng cách tăng cƣờng lƣợng enzyme từ vi sinh vật, từ thực vật, điều chỉnh chế độ nhiệt độ, pH, lƣợng nƣớc thích hợp từ đó làm thay đổi đáng kển thời gian, hiệu suất và chất lƣợng sản phẩm. 11 Cá tƣơi Làm sạch Phân loại và trộn muối Ƣớp muối Lên men Lọc Bã Dùng chăn nuôi, làm phân bón Nƣớc mắm nguyên chất Pha chế Thành phẩm Sơ đồ 2.2. Quy trình tổng quát công nghệ sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày ( Nguyễn Đức Lƣợng, 2006) Một số điểm lưu ý trong công nghệ sản xuất: *Tăng lượng enzyme từ bên ngoài bổ sung enzyme vào cần hỗ trợ cho enzyme protease của vi sinh vật ruột cá Nguồn enzyme bên ngoài có thể lấy từ thực vật nhƣ bromelin của dứa, từ động vật nhƣ pepsin từ niêm mạc dạ dày, enzyme protease khác từ tụy tạng, ruột non… protease từ chƣợp cá đã chín của các mẻ nƣớc mắm trƣớc. Hiện nay ở nƣớc ta ngƣời ta áp dụng biện pháp sử dụng các chế phẩm enzyme protease vi sinh vật. Các 12 vi sinh vật này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng thích hợp bên ngoài sau đó bổ sung vào chƣợp cá. Biện pháp này rất có hiệu quả, rút ngắn đáng kể thời gian làm nƣớc mắm. Tuy nhiên khi sử dụng biện pháp này, điều cần chú ý là nếu ta sử dụng loại enzyme nào cần tạo các điều kiện cần thiết và tối ƣu cho hoạt động của enzyme đó nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ muối…) thì mới đạt đƣợc hiệu quả tác dụng cao. Thông thƣờng thời gian sản xuất nƣớc mắm từ 6 tháng đến 9 tháng, nếu thêm chế phẩm enzyme từ vi sinh vật thời gian có thể rút ngắn xuống còn 30 ngày. So sánh giữa hai phƣơng pháp sản xuất nƣớc mắm ngắn ngày và dài ngày, ngƣời ta thấy nƣớc mắm ngắn ngày có hàm lƣợng đạm toàn phần khá cao, tuy nhiên về hƣơng vị thơm ngon thì kém nƣớc mắm dài ngày. Ngƣời ta có thể khắc phục bằng cách pha trộn nƣớc mắm ngắn ngày với nƣớc mắm dài ngày hoặc bổ sung thêm chất tạo hƣơng vị đặc trƣng thơm ngon Bảng 2.2. So sánh thành phần hóa học nƣớc mắm ngắn ngày có dùng thêm chế phẩm enzyme vi sinh vật và nƣớc mắm dài ngày theo phƣơng pháp thông thƣờng. Phƣơng pháp Thời gian thủy phân Muối (g/l) Acid (g/l) N-tổng (g/l) Nitơ formol (g/l) N-NH3 (g/l) Nitơ formol N-tổng (%) Có bổ sung vi sinh vật 30 ngày 257 6,2 27,06 17,64 6,1 65,43 Không bổ sung vi sinh vật 6-9 tháng 262 5,09 25,48 14,82 3,82 58,35 (Đồng Thị Thanh Thu, 1999). *Yếu tố nhiệt độ Theo kinh nghiệm sản xuất từ lâu đời, ngƣời ta thấy rằng trong trƣờng hợp có bổ sung enzyme bên ngoài hay không thì nhiệt độ phù hợp là 450C + 20C với nồng độ muối 5 - 10%. Nếu không muối thì nhiệt độ phù hợp cho thủy phân và ức chế vi sinh vật gây thối phải > 450C và < 500C, nhiệt độ cao hơn 500C sẽ ức chế enzyme. 13 *Yếu tố xay nhỏ nguyên liệu Nhiều quan niệm cho rằng cá xay nhỏ làm tăng diện tích tiếp xúc với không khí và enzyme từ đó làm tăng tốc độ thủy phân. Tuy nhiên theo kinh nghiệm với cá xay nhỏ cần áp dụng phƣơng pháp cho muối nhiều đợt, nếu cho muối mặn ngay từ đầu sẽ làm đông vón protid và ức chế các enzyme hạn chế tốc độ thủy phân protid và làm chậm chƣợp chín. *Nồng độ muối Nồng độ muối cho vào sao chỉ ức chế các vi sinh vật gây thối mà không ức chế enzyme. Biện pháp cho muối nhiều đợt đáp ứng đƣợc hai yêu cầu trên. 2.4.Giá trị dinh dƣỡng của nấm ăn. Không chỉ dùng làm món ăn, các loại nấm còn có tác dụng tăng cƣờng sức đề kháng, chống lão hóa, làm giảm các nguy cơ mắc bệnh ung thƣ, tim mạch… Từ xa xƣa nấm đƣợc các y thƣ cổ đánh giá là thứ “ăn đƣợc, bồi bổ đƣợc, có thể dùng làm thuốc, toàn thân đều quý giá”. Trong giới sinh vật có gần 7 vạn loài nấm, nhƣng chỉ có hơn 100 loài có thể ăn hoặc dùng làm thuốc, thông dụng nhất là mộc nhĩ đen, ngân nhĩ, nấm hƣơng, nấm mỡ, nấm rơm, nấm kim châm, nấm trƣ linh... Ngoài nguồn thu hái từ thiên nhiên, ngƣời ta đã trồng đƣợc hơn 60 loài theo phƣơng pháp công nghiệp với năng suất cao. Nhiều nhà khoa học cho rằng, nấm sẽ là một trong những thực phẩm rất quan trọng và thông dụng của con ngƣời trong tƣơng lai. Về hàm lƣợng đạm: tuy nấm có hàm lƣợng đạm thấp hơn so với thịt cá nhƣng cao hơn các loại rau quả khác. Mặc khác, nấm có chứa các loại acid amin thiết yếu, trong đó có 9 loại acid amin cần thiết cho con ngƣời do đó xét về chất lƣợng đạm thì đạm nấm không thua gì đạm động vật. Nấm có chứa ít đƣờng với hàm lƣợng thay đổi từ 3% dến 28% trọng lƣợng tƣơi, đặc biệt nấm có nguồn đƣờng dự trữ dƣới dạng glycogen tƣơng tự nhƣ động vật thay vì dƣới dạng tinh bột nhƣ thực vật. Ngoài ra nấm còn chứa nhiều vitamin nhƣ A, B, C, D, E, K trong đó nhiều nhất là vitamine B. 14 Nấm có chứa nguồn khoáng dồi dào. Chứa nhiều Kali (K), Natri (Na), Calci (Ca) , Photpho (P) và Magie (Mg), chúng chiếm 56% - 70% trọng lƣợng tro tổng cộng. Bảng 2.3. Thành phần phân tích của một số nấm trồng phổ biến . Loại nấm Độ ẩm ban đầu (%) Protein thô (%) Béo (%) Carbonhyrat (%) Xơ (%) Tro (%) Năng lƣợng cung cấp (Kcal) Rơm tƣơi 90,1 21,2 10,1 58,6 11,1 10,1 369 Mèo 87,1 7,7 0,8 87,6 14,0 3,9 347 Bào ngƣ 90,8 30,4 2,2 47,6 8,7 9,8 345 Đông cô 91,8 13,4 4,9 78,0 7,3 3,7 392 Tuyết nhĩ 19,7 4,6 0,2 94,8 1,4 0,4 412 Mỡ 88,7 23,9 8,0 60,1 8,0 8,0 381 Kim châm 89,2 17,6 1,9 73,1 3,7 7,4 378 Trân châu 95,2 20,8 4,2 66,7 6,3 8,3 372 (Nguyễn Hữu Đồng, 2000). Bảng 2.4. Hàm lƣợng vitamine và chất khoáng (Đơn vị: mg/100g chất khô) Tên nấm Acid nicotinic Riboflavin Thiamine Acid ascobic Sắt Calci Phospho Mỡ 42,5 3,7 8,9 26,5 8,8 71 9,2 Hƣơng 54,8 4,9 7,8 0 4,5 12 171 Bào ngƣ 108,7 4,7 4,8 0 15,2 33 1348 Rơm 91,9 3,3 1,2 20,2 17,2 71 677 (Nguyễn Hữu Đồng, 2002). Bảng 2.5 Thành phần acid amin trong nấm Tên nấm Lysi n Histidi n Agini n Threonin Vali n Methyoni n Isoleuci n Leucin Rơm 388 187 366 375 607 80 491 312 Mỡ 572 199 446 366 420 126 366 580 Hƣơn g 174 87 348 261 261 87 218 348 Sò 312 87 306 204 390 90 266 390 (Nguyễn Hữu Đồng, 2002). 15 Ngoài giá trị cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể, nấm ăn còn có nhiều tác dụng dƣợc lý khá phong phú nhƣ: Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể: các polysaccharide trong nấm có khả năng hoạt hóa miễn dịch tế bào, thúc đẩy quá trình sinh trƣởng và phát triển của tế bào lympho, kích hoạt tế bào lympho T và lympho B. Nấm linh chi, nấm vân chi, nấm đầu khỉ và mộc nhĩ đen còn có tác dụng nâng cao năng lực hoạt động của đại thực bào. Kháng ung thư và kháng virus: trên thực nghiệm, hầu hết các loại nấm ăn đều có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ. Với nấm hƣơng, nấm linh chi và nấm trƣ linh, tác dụng này đã đƣợc khảo sát và khẳng định trên lâm sàng. Nhiều loại nấm ăn có công năng kích thích cơ thể sản sinh interferon, nhờ đó ức chế đƣợc quá trình sinh trƣởng và lƣu chuyển của virus. Dự phòng và trị liệu các bệnh tim mạch: nấm ăn có tác dụng điều tiết công năng tim mạch, làm tăng lƣu lƣợng máu động mạch vành, hạ thấp oxy tiêu thụ và cải thiện tình trạng thiếu máu cơ tim. Các loại nấm nhƣ ngân nhĩ (mộc nhĩ trắng), mộc nhĩ đen, nấm đầu khỉ, nấm hƣơng, đông trùng hạ thảo... đều có tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu, làm hạ lƣợng cholesterol, triglycerid và beta-lipoprotein trong huyết thanh. Ngoài ra, nấm linh chi, nấm mỡ, nấm rơm, nấm kim châm, ngân nhĩ, mộc nhĩ đen còn có tác dụng làm hạ huyết áp. Giải độc và bảo vệ tế bào gan: kết quả nghiên cứu cho thấy, nhiều loại nấm ăn có tác dụng giải độc và bảo vệ tế bào gan rất tốt. Ví nhƣ nấm hƣơng và nấm linh chi có khả năng làm giảm thiểu tác hại đối với tế bào gan của các chất nhƣ carbon tetrachlorid, thioacetamide và prednisone, làm tăng hàm lƣợng glucogen trong gan và hạ thấp men gan. Nấm bạch linh và trƣ linh có tác dụng lợi niệu, kiện tỳ, an thần, thƣờng đƣợc dùng trong những đơn thuốc Đông dƣợc điều trị viêm gan cấp tính. Kiện tỳ dưỡng vị: nấm đầu khỉ có khả năng lợi tạng phủ, trợ tiêu hóa, có tác dụng rõ rệt trong trị liệu các chứng bệnh nhƣ chán ăn, rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ dày tá tràng. Nấm bình có tác dụng ích khí sát trùng, phòng chống viêm gan, viêm 16 loét dạ dày tá tràng, sỏi mật. Nấm kim châm và nấm kim phúc chứa nhiều arginine, có công dụng phòng chống viêm gan và loét dạ dày. Hạ đường máu và chống phóng xạ: khá nhiều loại nấm ăn có tác dụng làm hạ đƣờng máu nhƣ ngân nhĩ, đông trùng hạ thảo, nấm linh chi... Cơ chế làm giảm đƣờng huyết của đông trùng hạ thảo là kích thích tuyến tụy bài tiết insulin. Ngoài công dụng điều chỉnh đƣờng máu, các polysaccharide B và C trong nấm linh chi còn có tác dụng chống phóng xạ. Thanh trừ các gốc tự do và chống lão hóa: gốc tự do là các sản phẩm có hại của quá trình chuyển hóa tế bào. Nhiều loại nấm ăn nhƣ nấm linh chi, mộc nhĩ đen, ngân nhĩ... có tác dụng thanh trừ các sản phẩm này, làm giảm chất mỡ trong cơ thể, từ đó có khả năng làm chậm quá trình lão hóa và kéo dài tuổi thọ. Ngoài ra, nhiều loại nấm ăn còn có tác dụng an thần, trấn tĩnh, rất có lợi cho việc điều chỉnh hoạt động của hệ thần kinh trung ƣơng. Gần đây, nhiều nhà khoa học còn phát hiện thấy một số loại nấm ăn có tác dụng phòng chống AIDS ở mức độ nhất định, thông qua khả năng nâng cao năng lực miễn dịch của cơ thể. Một số loại nấm ăn điển hình Nấm hƣơng: còn gọi là nấm đông cô, hƣơng cô, hƣơng tín, hƣơng tẩm..., đƣợc mệnh danh là “hoàng hậu thực vật”, là “vua của các loại rau” (can thái chi vƣơng). Trong 100 g nấm hƣơng khô có 12 - 14 g protein (vƣợt xa so với nhiều loại rau khác). Nấm hƣơng có tác dụng điều tiết chuyển hóa, tăng cƣờng năng lực miễn dịch của cơ thể, ức chế tế bào ung thƣ, hạ huyết áp, giảm cholesterol máu, phòng ngừa sỏi mật và sỏi tiết niệu, trợ giúp tiêu hóa... Đây là thức ăn lý tƣởng cho những ngƣời bị thiếu máu do thiếu sắt, cao huyết áp, tiểu đƣờng, rối loạn lipid máu, trẻ em suy dinh dƣỡng. Nấm rơm: còn gọi là bình cô, lan hoa cô, ma cô..., là một trong những loại nấm ăn đƣợc sử dụng rất rộng rãi, có giá trị dinh dƣỡng khá cao. Nấm rơm là thức ăn rất tốt cho những ngƣời bị cao huyết áp, rối loạn lipid máu, vữa xơ động mạch, tiểu đƣờng, ung thƣ và các bệnh lý mạch vành tim. 17 Nấm mỡ: còn gọi là nhục tẩm, bạch ma cô, dƣơng ma cô..., cũng là một trong những loại nấm có giá trị dinh dƣỡng cao. Nấm mỡ có tác dụng làm giảm đƣờng và cholesterol máu, phòng chống ung thƣ và cải thiện chức năng gan. Bởi vậy, đây là loại thực phẩm rất thích hợp cho những ngƣời bị ung thƣ, tiểu đƣờng, tăng cholesterol máu, cao huyết áp, giảm bạch cầu và viêm gan. Ngân nhĩ: còn gọi là mộc nhĩ trắng, bạch mộc nhĩ, nấm bạc, bạch nhĩ tử..., cũng là một loại nấm khá giàu chất dinh dƣỡng. Ngân nhĩ có tác dụng tăng cƣờng khả năng miễn dịch của cơ thể, nâng cao năng lực tạo máu của tủy xƣơng, cải thiện chức năng của gan và thận, thúc đẩy quá trình tổng hợp protid trong gan, làm giảm cholesterol máu, chống phù và chống phóng xạ. Bởi vậy, ngân nhĩ là thực phẩm rất tốt cho những ngƣời bị suy nhƣợc cơ thể, suy nhƣợc thần kinh, bị các bệnh lý đƣờng hô hấp, cao huyết áp, thiểu năng tuần hoàn não... Mộc nhĩ đen: còn gọi là vân nhĩ, thụ kê, mộc nhu, mộc khuẩn... Mộc nhĩ đen chứa nhiều protid, chất khoáng và vitamine. Mộc nhĩ đen có khả năng ức chế quá trình ngƣng tập tiểu cầu, phòng chống tình trạng đông máu do nghẽn mạch, ngăn cản sự hình thành các mảng vữa xơ trong lòng huyết quản. Ngoài ra, còn có tác dụng chống lão hóa, chống ung thƣ và phóng xạ. Bởi vậy, mộc nhĩ đen là thực phẩm lý tƣởng cho những ngƣời bị cao huyết áp, vữa xơ động mạch, thiểu năng tuần hoàn não, thiểu năng động mạch vành và ung thƣ. Bào ngƣ: còn gọi là nấm sò. Nấm bào ngƣ là loài nấm dễ trồng, cho năng suất cao, phẩm chất ngon, có nhiều tính chất quí. Tính về thành phần dinh dƣỡng, nấm bào ngƣ có nhiều chất đƣờng cao hơn cả nấm rơm, nấm mỡ, nấm đông cô. Nấm bào ngƣ cũng không thua các loại nấm trên về hàm lƣợng đạm, chất khoáng. Xét về năng lƣợng, nấm bào ngƣ cung cấp năng lƣợng ở mức tối thiểu, thấp hơn nấm đông cô, tƣơng đƣơng với nấm rơm và nấm mỡ, rất thích hợp cho những ngƣời ăn kiêng. Nấm bào ngƣ còn chứa 2 polysaccharide có hoạt tính kháng ung bƣớu, đồng thời nấm còn chứa nhiều acid folic, rất cần cho những ngƣời bị thiếu máu. Theo nghiên cứu của kỹ sƣ Lê Duy Thắng, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên thì với nguyên liệu làm nƣớc mắm là nấm rơm sẽ cho sản phẩm có mùi hăng hắc, màu 18 đục, vị lợ. Thế là, ông chuyển sang làm thử bằng nấm bào ngƣ. Sản phẩm nƣớc mắm làm từ nấm bào ngƣ có màu đỏ rƣợu chát, trong suốt, hƣơng thơm đặc trƣng của nƣớc mắm, vị không khác lắm so với nƣớc mắm thông thƣờng. Đặc biệt, nƣớc mắm nấm còn có mùi thơm của nấm bào ngƣ. Với xu hƣớng trên, chúng ta có thể tận dụng những nấm bị đổ đi, hƣ hỏng qua các khâu xử lí trong quá trình lên men có bổ sung thêm các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm để tạo ra sản phẩm nƣớc mắm từ nấm giúp bữa ăn của những ngƣời ăn chay thêm đậm đà phong phú mà ngƣời ăn mặn cũng có thể thƣởng thức đƣợc. 2.5.Sự phân giải của enzyme Quá trình phân giải protein dƣới tác dụng của enzyme phân giải (protease, peptidase, proteinase, disaminase…). Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác quá trình phân hủy protein. Dƣới tác dụng của chúng protein bi phân hủy: Protein  Pepton  Peptid  Acid amin. Đây là một quá trình thủy phân tƣơng đối phức tạp có sự tham gia của nhiều protease khác nhau gồm 2 loại chính: endoprotease và exoprotease. Cả hai loại này có thể lấy từ nhựa đu đủ, dạ dày tụy tạng… nhƣng nhiều nhất vẫn là từ vi sinh vật Vi sinh vật tiết protease vào môi trƣờng và nhờ đó mà protein có cấu trúc phức tạp đƣợc chuyển thành những hợp chất đơn giản mà tế bào có thể sử dụng đƣợc. Quá trình phân giải protein dƣới tác dụng của enzyme do vi sinh vật tiết ra có thể chia tóm tắt nhƣ sau: Protein Pepton Polypeptid Acid amin NH3 H2, CO2 Acid béo Phenol, Indol, Amin, H2S, CO2 CO2 + H2O Metan 2.5.1.Phân loại protease Protease đƣợc chia làm 2 loại Endoprotease còn gọi là proteinase phân hủy protein thành polypeptid và pepton. 19 Exoprotease còn gọi là peptidase có thể tác dụng trực tiếp lên protein tự nhiên .Sự thủy phân tiến hành dần dần tạo ra các sản phầm trung gian và sản phẩm cuối dùng là acid amin. 2.5.2.Một số nguồn enzyme đƣợc sử dụng 2.5.2.1.Protease từ vi sinh vật Vi sinh vật dùng trong sản xuất là vi khuẩn thuần chủng Bacillus sp và Clostridium sp phân lập từ chƣợp mắm. Bacillus là trực khuẩn, gram dƣơng, hiếu khí nên tƣơng đối dễ thích nghi với điều kiện nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng bằng cách tạo trên bề mặt môi trƣờng một lớp ván khuẩn lạc. Bacillus sp hoạt động trong khoảng nhiệt độ từ 370C – 550C. pH từ 4 – 11. Bacillus sp tham gia quá trình phân giải protein kèm theo sự tạo thành amoniac. Clostridium là vi khuẩn hình que, gram dƣơng, kị khí, sinh bào tử, phần lớn di động, có thể thủy giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lƣợng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đƣờng polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rƣợu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm. Hầu hết giống Clostridium thuộc nhóm ƣa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số thuộc nhóm ƣa nhiệt và một số loài khác thuộc nhóm ƣa lạnh. Enzyme của vi sinh vật có ƣu điểm hơn các loại enzyme khác nhƣ (enzyme trong nội tạng của động vật hoặc chiết từ thực vật) là bền và có hoạt tính sinh học cao hơn. Dƣới tác dụng của enzyme các phản ứng sinh hóa xảy ra nhanh hơn từ 10 8 đến 1020 lần so với bình thƣờng. Trong công nghiệp làm nƣớc mắm, làm nƣớc tƣơng, muối cá,… Ngƣời ta chủ động cấy vi sinh vật có khả năng phân giải protein để thu lấy sản phẩm 20 phân giải dễ dàng nhƣ acid amin, dipeptid, oligopeptid mà ngƣời và động vật dễ dàng đồng hoá. 2.5.2.2.Protease từ thực vật – enzyme bromelin Enzyme bromelin đƣợc thu nhận từ dứa Enzyme này hoạt động ở khoảng nhiệt độ từ 400C – 500C. pH từ 3 – 7. 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian và địa điểm Thời gian: từ tháng 03/2007 đến tháng 07/2007. Địa điểm: phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Thực Phẩm trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.Nguyên vật liệu thí nghiệm 3.2.1.Nguyên liệu Chƣợp mắm lấy từ cơ sở nƣớc mắm Cửa Bé, Thành Phố Nha Trang. Nấm rơm và nấm bào ngƣ loại 2, dứa, muối mua tại chợ Gò Vấp, quận Gò Vấp, thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2.Vật liệu Tủ sấy. Tủ ấm. Tủ cấy. Nồi hấp khử trùng Autoclave. Máy đo pH Metrohm 744. Bộ máy chƣng cất đạm. Kính hiển vi. Cân. Bếp gas. Microwave. Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, pipette, que cấy, đèn cồn, dao, rổ, keo thủy tinh. 22 3.2.3.Môi trƣờng sử dụng Môi trƣờng NA (Nutrient agar): đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 1). Môi trƣờng Czapek có bổ sung 10% sữa tiệt trùng: đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 3). Mội trƣờng NB ( Nutrient Broth): đƣợc sử dụng để phân lập vi khuẩn trong chƣợp mắm. (Phụ lục 2). Môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm: đƣơc sử dụng để tuyển chọn các chủng vi sinh vật và tăng sinh khối của các chủng đó. (Phụ lục 4). 3.2.4.Hóa chất sử dụng Nƣớc cất. Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn 900. Dung dịch NaOH 0,2 N. Dung dịch Ba(OH)2 bão hoà trong cồn metylic. BaCl2 tinh thể. Formol trung tính. MgO bột hoặc tinh thể. Cồn. Dung dịch alizarin natri sunfonat 1% trong nƣớc. Dung dịch H2SO4 0,1 N. Dung dịch NaOH 0,1 N. 23 3.3.Nội dung và phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm Các bƣớc thí nghiệm đƣợc tiến hành theo sơ đồ Chƣợp mắm Nấm, dứa Phân lập các chủng vi sinh vật Rửa sạch, xay nhuyễn. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật Phối trộn thành phần nấm, dứa. có khả năng phân giải cao, chịu mặn tốt và sinh hƣơng. Bổ sung vi sinh vật 15% muối Lên men Lọc Nƣớc mắm nguyên chất Sơ đồ 3.1. Các bƣớc tiến hành thí nghiệm. 3.4.Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm. 3.4.1.Thí nghiệm 1: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật hiện diện trong chƣợp mắm. Mục đích: nhằm phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh protease. Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc chia làm 3 giai đoạn. Phân lập, tuyển chọn hoàn toàn ngẫu nhiên dựa trên khả năng sinh protease. 24 Giai đoạn 1: phân lập Chƣợp mắm đƣợc pha loãng ở nồng độ 10-1,10-2, 10-3 với cất vô trùng. Chúng tôi tiến hành đỗ đĩa petri lần lƣợt các môi trƣờng NA và cơ bản có bổ sung 10% sữa tiệt trùng. Đối với vi khuẩn hiếu khí Phân lập vi khuẩn trên môi trƣờng NA ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C, quan sát hình dạng khuẩn lạc. Tiếp tục cấy chuyền các khuẩn lạc từ môi trƣờng NA sang môi trƣờng cơ bản có bổ sung 10% sữa, ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Đối với vi khuẩn kị khí Phân lập trên môi trƣờng NA bằng cách tiến hành đổ đĩa petri lồng vào nhau sau đó dán kín miệng đĩa bằng băng keo ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C, quan sát hình dạng khuẩn lạc. Cách đọc kết quả: Đối với vi khuẩn hiếu khí Quan sát khả năng sử dụng casein trong sữa của vi khuẩn trên môi trƣờng cơ bản có bổ sung 10% sữa tiệt trùng ủ 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Tuyển chọn sơ bộ các chủng vi khuẩn dựa vào hiện tƣợng tạo lớp quầng trong xung quanh khuẩn lạc (có sinh protease). Nhuộm gram: Quan sát hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (Phụ lục 5). Đối với vi khuẩn kị khí Quan sát hình dạng khuẩn lạc của các vi khuẩn đƣợc phân lập trên môi trƣờng NA trong đĩa petri sau 24 giờ - 48 giờ ở 400C. Nhuộm gram. Quan sát hình dạng vi khuẩn dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. (Phụ lục 5). Giai đoạn 2: thuần khiết chủng vi sinh vật. Từ các chủng vi sinh vật tuyển chọn sơ bộ, chúng tôi cấy vào môi trƣờng thạch nghiêng NA. đối với vi khuẩn hiếu khí, và môi trƣờng NB trong ống nghiệm 25 đối vi khuẩn kị khí. Giai đoạn 3: nhân sinh khối khuẩn lạc. Đối với vi khuẩn hiếu khí Cấy một que cấy vi khuẩn vào môi trƣờng NB ủ ở 400C sau 24 giờ. Cấy canh khuẩn vào bình tam giác có chứa 200 ml nƣớc chiết nấm rơm vô trùng với tỉ lệ canh khuẩn là 1%. Để bình tam giác vào tủ ấm sau 24 giờ quan sát sự biến đổi của môi trƣờng. Khảo sát tính chất sinh hóa: Phản ứng Catalase (Phụ lục 10). Đối với vi khuẩn kị khí Cấy canh khuẩn từ môi trƣờng NB sang môi trƣờng nƣớc chiết nấm ủ ở 400C sau 24 giờ. Cấy canh khuẩn vào chai cao và kín có chứa nƣớc chiết nấm rơm vô trùng với tỉ lệ canh khuẩn là 1%. Nuôi trong chai chứa ngập môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, đậy kín miệng bình. Sau 24 giờ - 72 giờ quan sát sự hiện diện sinh khối của vi khuẩn dƣới đáy chai. Khảo sát tính chất sinh hóa: Phản ứng Catalase (Phụ lục 10). 3.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Mục đích: Tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu đƣợc độ mặn cao. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 1. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 2. 26 Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm. Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nuớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lƣợng đạm formol đƣợc tạo thành sau mỗi lần bổ sung muối ở nhiệt độ 40 0 C - 50 0 C. Đạm formol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol (Phụ lục 7). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng cho mỗi nghiệm thức là 200 ml với 1% lƣợng canh khuẩn của các chủng vi sinh vật. Tăng dần dần lƣợng muối cho đến khi đạt đƣợc 20% so với lƣợng nƣớc chiết nấm rơm bằng cách cấy 1% lƣợng canh khuẩn các chủng vi sinh vật từ môi trƣờng ở nồng độ muối trƣớc sang môi trƣờng ở nồng độ muối tiếp theo. Thời gian và lƣợng muối tƣơng ứng đƣợc cho vào nhƣ sau: 0 giờ đến 12 giờ 0% muối. 12 giờ đến 18 giờ 3% muối. 30 giờ đến 48 giờ 7% muối. 72 giờ đến 84 giờ 10% muối. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 84 giờ. 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm. Mục đích: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân cao. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. 27 Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 6. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 7. Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm . Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ ở nồng độ muối 20%. Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lƣợng đạm formol tạo thành trong 24 giờ ở 400C - 500C. Đạm fomol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp chuẩn độ formol (Phụ lục7). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng 20% muối cho mỗi nghiệm thức là 200 ml với 1% canh khuẩn của các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi sau 24 giờ ở nồng độ muối 20%. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 24 giờ. 3.4.4. Thí nghiệm 4: khảo sát khả năng sinh hƣơng trên của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Mục đích: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng gây hƣơng mắm đặc trƣng. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố. Nghiệm thức I: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 1. Nghiệm thức II: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 2. Nghiệm thức III: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 3. Nghiệm thức IV: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 4. Nghiệm thức V: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn hiếu khí 5. 28 Nghiệm thức VI: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 6. Nghiệm thức VII: Nƣớc chiết nấm rơm + 1% canh khuẩn kị khí 7. Yếu tố thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập từ chƣợp mắm. Các lô thí nghiệm đƣợc khảo sát cùng điều kiện nhiệt độ, thời gian, lƣợng môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm, các chủng vi sinh vật trong nghiệm thức đƣợc dùng dƣới dạng canh khuẩn nuôi cấy sau 24 giờ ở nồng độ 20% muối . Chỉ tiêu theo dõi: Mùi nƣớc mắm tạo thành sau 3 ngày trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Phƣơng pháp đánh giá: mùi hƣơng mắm đƣợc đánh giá bằng phép thử cảm quan cho điểm. (Phụ lục 9). Bảng 3.1. Bảng tiêu chuẩn cho điểm về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Chỉ tiêu Điểm Yêu cầu Mùi 5 Sản phẩm có mùi hƣơng đặc trƣng rất giống hƣơng đặc trƣng của nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm dễ chịu. 4 Sản phẩm có mùi hƣơng giống hƣơng nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm dễ chịu 3 Sản phẩm có mùi hƣơng giống nƣớc mắm từ cá, hƣơng mắm tƣơng đối dễ chịu. 2 Sản phẩm có mùi hƣơng nƣớc mắm từ cá, mùi hơi nồng. 1 Sản phẩm không có hƣơng mắm, còn mùi nấm rơm. 0 Sản phẩm không có hƣơng mắm, còn mùi nấm rơm, có mùi thối. Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. Phƣơng pháp tiến hành: Lƣợng nƣớc chiết nấm rơm vô trùng 20% muối cho mỗi nghiệm thức là 200 ml 29 với 1% canh khuẩn của các chủng vi sinh vật đƣợc nuôi sau 24 giờ. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trong tủ ấm ở nhiệt độ 400C - 500C, thời gian khảo sát sau 3 ngày. 3.5. Sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Mục đích: Chọn công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu và chủng vi sinh vật tối ƣu đƣợc tuyển chọn từ thí nghiệm 1, thí nghiệm 2, thí nghiệm 3 và thí nghiệm 4. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, đƣợc chia làm 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: giai đoạn thủy phân có khuấy đảo, lên men ở nhiệt độ 400C – 50 0C trong 15 ngày. Nghiệm thức 1: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 2: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 3: 15% dứa + 35% nấm rơm + 35% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 4: 30% dứa + 27,5% nấm rơm + 27,5% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Nghiệm thức 5: 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và vi khuẩn Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1). Giai đoạn 2: sau 15 ngày thủy phân tiến hành bổ sung 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) vào mỗi nghiệm thức, không khuấy đảo ở 400C – 500C trong 15 ngày. Yếu tố cố định thí nghiệm: các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. 30 Chỉ tiêu theo dõi: Chỉ tiêu cảm quan: màu sắc, độ trong, mùi, vị. Chỉ tiêu cảm quan đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp cho điểm. Chỉ tiêu sinh hóa: đạm formol, đạm amoniac, đạm amin đƣợc kiểm tra 3 ngày một lần. Sau khi đã hoàn thành sản phẩm tối ƣu sẽ cho kiểm tra chỉ tiêu đạm tổng số tại Trung Tâm Phân Tích trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. Đạm amoniac/ đạm tổng số x 100%. Đạm formol/ đạm tổng số x 100%. Đạm amin/ đạm tổng số x 100%. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu: Chỉ tiêu sinh hóa. Đạm formol đƣợc xác định bằng phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol (Phụ lục 7). Đạm amoniac đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cất kéo hơi nƣớc (Phụ lục 8). Đạm amin = đạm formol - đạm amoniac. Chỉ tiêu cảm quan Đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp cảm quan cho điểm theo bảng chỉ tiêu (Phụ lục 11). Xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lí trên chƣơng trình STAGRAPHIC 7.0. 31 Bảng 3.2. Bảng chỉ tiêu cảm quan sản phẩm nƣớc mắm. Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Điểm Yêu cầu Màu sắc 0,8 5 4 3 2 1 Màu nâu vàng, nâu đỏ đặc trƣng. Màu vàng nâu. Màu vàng rơm.. Màu vàng nhạt, vàng xám, nâu xám. Màu vàng tái, xám của nƣớc mắm hỏng. Mùi 1,2 5 4 3 2 1 Có mùi thơm dịu đặc trƣng của nƣớc mắm.Không có mùi lạ. Có mùi thơm khá dịu đặc trƣng của nƣớc mắm.Không có mùi lạ. Có mùi thơm rất dịu đặc trƣng của nƣớc mắm. Không có mùi thơm đặc trƣng của nƣớc mắm, có chút mùi lạ. Có mùi lạ nhƣ mùi thối, mốc. Vị 1,2 5 4 3 2 1 Vị ngọt của đạm, có hậu vị rõ đặc trƣng của nƣớc mắm. Vị ngọt của đạm, có hậu vị đặc trƣng của nƣớc mắm. Vị ngọt của đạm, ít hậu vị. Vị ngọt của đạm kém, có vị lạ. Chát gắt, có vị lạ, không có vị của nƣớc mắm. Độ trong 0,8 5 4 3 2 1 Trong sáng, không vẫn đục, không có cặn. Trong sáng, có rất ít cặn muối đóng ở đáy chai. Nƣớc mắm trong, có ít cặn muối đóng ở đáy chai. Nƣớc mắm trong, có ít cặn và vật thể lạ lắng ở đáy. Vẫn đục, có nhiều vật thể lạ, muối lắng ở đáy. 32 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1.Kết quả quá trình phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm. 4.1.1.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi sinh vật. 4.1.1.1.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn hiếu khí. Quan sát hình dạng khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn hiếu khí trên môi trƣờng NA: Khuẩn lạc thứ nhất: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1,8 – 2 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.1. Khuẩn lạc Bacillus sp.1 Tế bào vi khuẩn (X100) 33 Khuẩn lạc thứ hai: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc bóng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 0,5 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.2. Khuẩn lạc Bacillus sp.2 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ ba: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, có quầng trong răng cƣa xung quanh, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, có tâm vàng đục nhô ở giữa, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ hay tạo thành chuỗi . Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. 34 Hình 4.3. Khuẩn lạc Bacillus sp.3 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ tƣ: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ hay kết thành chuỗi. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.4. Khuẩn lạc Bacillus sp.4 Tế bào vi khuẩn (X100) 35 Khuẩn lạc thứ năm: Khuẩn lạc hình tròn, nhô, màu trắng, có quầng trong răng cƣa xung quanh, bề mặt khuẩn lạc nhám tạo lớp màng, mọc trên bề mặt thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình que, kích thƣớc từ 1 – 2 µm, bắt màu gram dƣơng, bào tử nằm ở giữa, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (+) dƣơng tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.5. Khuẩn lạc Bacillus sp.5 Tế bào vi khuẩn (X100) 4.1.1.2.Kết quả quá trình phân lập các chủng vi khuẩn kị khí Khuẩn lạc thứ nhất: Khuẩn lạc có dạng rễ cây sợi nhỏ, màu trắng, mọc sâu trong thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kình hiển vi với độ phóng đại 1000 lần: tế bào vi khuẩn có dạng hình chìa khóa, phình to một đầu, bắt màu gram dƣơng, kích thƣớc từ 1 – 1,5 µm, bào tử nằm ở đầu tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (-) âm tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. 36 Hình 4.6. Khuẩn lạc Clostridium sp.1 Tế bào vi khuẩn (X100) Khuẩn lạc thứ 2: Khuẩn lạc có dạng rễ cây sợi to, màu trắng, mọc sâu trong thạch. Nhuộm gram và quan sát dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần: Tế bào có dạng hình chìa khoá, phình to 1 đầu, bắt màu gram dƣơng, kích thƣớc từ 2 – 6 µm, bào tử nằm ở giữa tế bào, tế bào đứng riêng lẻ. Phản ứng catalase (Phụ lục 10) (-) âm tính, không có hiện tƣợng sủi bọt khí. Hình 4.7. Khuẩn lạc Clostridium sp.2 Tế bào vi khuẩn (X100) 37 4.1.2.Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Thí nghiệm khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, số lần lặp lại là 2 trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Sau 84 giờ thuỷ phân, quan sát hiện tƣợng tạo lớp ván trên bề mặt môi trƣờng đối với các chủng Bacillus sp. và hiện tƣợng tạo khối tế bào nằm ở đáy chai đối với các chủng Clostridium sp. Tiến hành đo hoạt lực của các chủng vi sinh vật dựa vào khả năng thủy phân đƣợc đo bằng phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol sau mỗi lần bổ sung muối kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Bảng 4.1. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 0%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 0% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 2,016 1,904 1,960 B2 1,792 1,792 1,792 B3 1,344 1,456 1,400 B4 2,016 2,016 2,016 B5 1,344 1,232 1,288 C1 1,792 1,568 1,680 C2 1,568 1,568 1,568 38 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 3%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 3% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 1,568 1,568 1,568 B2 1,344 1,456 1,400 B3 0,896 1,120 1,008 B4 1,792 1,792 1,792 B5 1,120 1,232 1,176 C1 1,568 1,456 1,512 C2 1,344 1,344 1,344 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 10%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 10% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 1,792 1,792 1,792 B2 1,568 1,680 1,624 B3 1,344 1,456 1,400 B4 2,016 2,128 2,072 B5 1,344 1,456 1,400 C1 1,792 1,792 1,792 C2 1,680 1,568 1,624 39 Đồ thị 4.1. Biến thiên khả năng sinh đạm formol của các chủng vi sinh vật trong môi trường nước chiết nấm rơm theo nồng độ muối. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 0% 5% 10% 15% 20% Nồng độ muối H àm lư ợ n g đ ạm f or m ol l (g /l) B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 Bảng 4.4. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol sinh ra của các chủng vi sinh vật trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm ở nồng độ muối 20%. Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol ở nồng độ muối 20% (g/l) Lần Trung bình 1 2 B1 2,464 2,688 2,576 B2 2,016 2,016 2,016 B3 1,792 1,792 1,792 B4 2,688 2,912 2,800 B5 1,456 1,680 1,568 C1 2,240 2,464 2,352 C2 2,016 2,240 2,128 Chú thích: B1: Bacillus sp.1 B2: Bacillus sp.2 B3: Bacillus sp.3 B4: Bacillus sp.4 B5: Bacillus sp.5 C1: Clostridium sp.1 C2: Clostridium sp.2 40 Đồ thị 4.1 và bảng 4.1,bảng 4.2, bảng 4.3, bảng 4.4 cho thấy chủng Bacillus sp.4 có hàm lƣợng đạm formol cao nhất 2,8 g/l ở nồng độ muối 20%. Ở nồng độ muối 3% hàm lƣợng đạm formol của các chủng vi sinh vật giảm do có sự thay đổi độ mặn từ 0% sang 3% và sau đó tiếp tục tăng dần chứng tỏ các chủng vi sinh vật này đều có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối cao. Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 15) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa các các chủng vi khuẩn chứng tỏ nồng độ muối cũng ảnh hƣởng đến các chủng vi khuẩn. 4.1.3.Kết quả khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập được trên môi trường nước chiết nấm rơm. Quan sát hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh khuẩn lạc vi khuẩn hiếu khí trên môi trƣờng cơ bản bổ sung 10% sữa, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Hình 4.8. Hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease trên môi trƣờng cơ bản bổ sung 10% sữa.. Hình 4.8 cho thấy những khuẩn lạc có hiện tƣợng tạo quầng trong xung quanh chứng tỏ những khuẩn lạc này có khả năng sinh protease thủy phân nguồn casein. 41 Thí nghiệm khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, 2 lần lặp lại trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Sau 24 giờ thuỷ phân, quan sát hiện tƣợng tạo lớp ván trên bề mặt môi trƣờng đối với các chủng Bacillus sp. và hiện tƣợng tạo khối tế bào nằm ở đáy chai đối với các chủng Clostridium sp. Tiến hành đo hoạt lực của các chủng vi sinh vật dựa vào khả năng thủy phân đƣợc đo bằng phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol thu đƣợc kết quả: Bảng 4.5. Kết quả khảo sát hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức. Nghiệm thức Chủng vi sinh vật Hàm lƣợng đạm formol (g/l) Lần Trung bình 1 2 I B1 1,344 1,344 1,344 II B2 1,120 1,232 1,176 III B3 1,232 1,232 1,232 IV B4 1,456 1,344 1,400 V B5 1,120 1,120 1,120 VI VI 1,120 1,120 1,120 VII VII 1,120 1,232 1,176 42 Đồ thị 4.2. Khảo sát hàm lượng đạm formol sinh ra do các chủng vi sinh vật phân lập từ chượp mắm trong các nghiệm thức. 1.176 1.121.12 1.4 1.2321.176 1.344 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 B1 B2 B3 B4 B5 C1 C2 chủng vi sinh vật H àm lư ợn g đạ m fo rm ol (g /l) Chú thích: B1: Bacillus sp.1 B5: Bacillus sp.5 B2: Bacillus sp.2 C1: Clostridium sp.1 B3: Bacillus sp.3 C2: Clostridium sp.2 B4: Bacillus sp.4 Đồ thị 4.2, bảng 4.5 và kết hợp với thử nghiệm hoá sinh ở hình 4.8 chúng tôi kết luận chủng vi khuẩn B4 có khả năng phân giải protein cao nhất đạt 1,4 g/l hàm lƣợng đạm formol và chủng B1 có hàm lƣợng đạm formol đạt 1,344 g/l chứng tỏ 2 chủng này có khả năng thủy phân tốt trong môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 16) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa chủng Bacilus sp.1 và Bacillus sp.4 với các chủng vi khuẩn còn lại. Vì thế chủng vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 đƣợc chọn làm tác nhân thủy phân. 43 4.1.4.Kết quả khảo sát khả năng sinh hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập đƣợc. Thí nghiệm khảo sát khả năng thủy phân của các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm gồm 7 nghiệm thức, 1 yếu tố, trên mội trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Sau 3 ngày thuỷ phân, qua kết quả đánh giá cảm quan về chỉ tiêu mùi bằng phƣơng pháp cho điểm thu đƣợc kết quả sau: Bảng 4.6. Bảng điểm đánh giá cảm quan về khả năng gây hƣơng của các chủng vi sinh vật phân lập từ chƣợp mắm. Nghiệm thức Điểm các cảm quan viên Tổng số điểm Điểm trung bình A B C D E F G H I J I 2 1 2 1 2 3 1 2 2 1 17 1,7 II 0 3 1 1 0 0 2 2 1 1 11 1,1 III 2 1 2 1 1 2 0 2 2 1 14 1,4 IV 2 1 4 1 0 2 0 3 2 0 15 1,5 V 1 2 3 1 2 3 2 2 3 0 19 1,9 VI 4 4 3 3 4 4 4 1 3 3 33 3,3 VII 3 4 4 2 3 5 5 2 4 2 34 3,4 Bảng 4.6 kết quả đánh giá cảm quan cho thấy nghiệm thức VI và nghiệm thức VII đƣợc các cảm quan viên chấp nhận và đạt đƣợc số điểm trung bình là 3,3 đối với nghiệm thức VI và 3,4 đối với nghiệm thức VII. Chứng tỏ chủng vi khuẩn kị khí Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 có khả năng sinh mùi hƣơng đặc trƣng của nƣớc mắm trên môi trƣờng nấm. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Boer và Guillerm vào năm 1930 khi cho rằng loại vi khuẩn kị khí Clostridium có khả năng sinh hƣơng mắm trên môi trƣờng thạch pepton. 44 Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 17) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 so với các chủng còn lại. Bên cạnh đó, nấm là một nguồn nguyên liệu khác nhƣng vẫn có đƣợc mùi hƣơng đặc trƣng của nƣớc mắm vì vậy 2 chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 đƣợc chọn làm tác nhân sinh hƣơng. 4.2.Kết quả sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm có bổ sung các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc. Sau quá trình phân lập tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng chịu mặn, thủy phân tốt và sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm chúng tôi chọn đƣợc 2 chủng vi khuẩn hiếu khí Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 làm tác nhân thủy phân và 2 chủng vi khuẩn kị khí Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 làm tác nhân sinh hƣơng để bổ sung vào chƣợp mắm thực hiện quá trình sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm. Thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, đƣợc thực hiện ở nhiệt độ 400C – 500C, trên thành phần nguyên liệu chính là nấm rơm và nấm bào ngƣ theo tỉ lệ 1:1 có phối trộn thêm dứa và muối gồm các nghiệm thức sau: Nghiệm thức 1: Đƣợc chọn làm nghiệm thức đối chứng: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 2: 42,5% nấm rơm + 42,5% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 3: 15% dứa + 35% nấm rơm + 35% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 4: 30% dứa + 27,5% nấm rơm + 27,5% nấm bào ngƣ + 15% muối. Nghiệm thức 5: 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối. Thí nghiệm đƣợc chia làm 2 giai đoạn: giai đoạn 1 chúng tôi bổ sung 10% canh khuẩn hiếu khí lên men trong 15 ngày. Giai đoạn 2 chúng tôi bổ sung tiếp 10% canh khuẩn kị khí và lên men tiếp tục trong 15 ngày. Giai đoạn 1: bổ sung 10% canh khuẩn ( gồm vi khuẩn Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) sau 15 ngày thủy phân tiến hành đo các chỉ tiêu sinh hóa để theo dõi quá trình chín ngấu của các chƣợp mắm thu đƣợc kết quả sau: 45 Bảng 4.7. Kết quả hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian. Thời gian (ngày) Nghiệm thức Hàm lƣợng đạm amoniac (g/l) 3 6 9 12 15 NT1 0,844 1,019 1,081 1,157 1,216 NT2 0,989 1,054 1,107 1,203 1,274 NT3 0,735 1,006 1,074 1,141 1,207 NT4 0,712 1,004 1,066 1,128 1,191 NT5 0,689 0,841 1,003 1,067 1,128 Đồ thị 4.3. Khảo sát hàm lượng đạm amoniac của các nghiệm thức theo thời gian. 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 3 6 9 12 15 Thời gian (ngày) H àm lư ợn g đạ m a m on ia c (g /l) NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Đồ thị 4.3 và bảng 4.7 cho thấy sau 15 ngày thủy phân hàm lƣợng đạm amoniac của các nghiệm thức tăng dần theo thời gian. Tuy nhiên hàm lƣợng đạm amoniac ở nghiệm thức 2 có giá trị cao nhất (1,274 g/l) do bổ sung vi khuẩn nhƣng không có bổ sung dứa nên không ức chế hoạt động của các vi sinh vật gây thối làm tăng hàm lƣợng đạm amoniac. Bên cạnh đó các nghiệm thức 3, nghiệm thức 4, nghiệm thức 5 có bổ sung dứa nên hàm lƣợng đạm amoniac thấp hơn nghiệm thức 1 (nghiệm thức đối chứng), đặc biệt nghiệm thức 5 bổ sung 45% dứa có hàm lƣơng đạm amoniac thấp nhất (1,128 g/l). Kết quả này chứng tỏ với lƣợng dứa 45% tác 46 động tốt đến quá trình thủy phân, làm giảm khả năng tạo mùi thối gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng nƣớc mắm. Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 18) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa các nghiệm thức. Bảng 4.8. Kết quả hàm lƣợng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian. Thời gian (ngày) Nghiệm thức Hàm lƣợng đạm formol (g/l) 3 6 9 12 15 NT1 3,584 3,808 4,032 4,592 4,704 NT2 3,360 3,584 3,808 4,032 4,256 NT3 2,464 3,360 3,584 3,808 4,032 NT4 3,808 4,256 4,480 4,704 4,928 NT5 4,032 4,480 4,704 4,928 5,152 Đồ thị 4.4. Khảo sát hàm lượng đạm formol của các nghiệm thức theo thời gian. 0 1 2 3 4 5 6 0 3 6 9 12 15 Thời gian (ngày) H àm lư ợn g đạ m fo rm ol l (g /l) NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 47 Bảng 4.9. Kết quả hàm lƣợng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian. Thời gian (ngày) Nghiệm thức Hàm lƣợng đạm amin (g/l) 3 6 9 12 15 NT1 2,740 2,789 2,951 3,435 3,488 NT2 2,371 2,530 2,701 2,829 2,982 NT3 1,729 2,354 2,510 2,667 2,825 NT4 3,096 3,252 3,414 3,576 3,737 NT5 3,343 3,639 3,701 3,861 4,024 Đồ thị 4.5. Khảo sát hàm lượng đạm amin của các nghiệm thức theo thời gian. 0 1 2 3 4 5 0 3 6 9 12 15 Thời gian (ngày) H àm lư ợn g đạ m a m in (g /l) NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Đồ thị 4.4, đồ thị 4.5 và bảng 4.8, bảng 4.9 cho thấy sau 15 ngày thủy phân hàm lƣợng đạm formol và đạm amin của các nghiệm thức tăng theo thời gian.Tuy nhiên hàm lƣợng đạm formol và đạm amin của nghiệm thức 5 đạt giá trị cao nhất (5,152 g/l đạm formol và 4,024 g/l đạm amin), tiếp theo là nghiệm thức 4 (4,928 g/l đạm formol và 3,737 g/l đạm amin) cao hơn so với mẫu đối chứng ở nghiệm thức 1 (4,704 g/l đạm formol và 3,488 g/l đạm amin) chứng tỏ với lƣợng dứa bổ sung là 45% tác động tốt vào quá trình thủy phân 48 Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 20) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa các nghiệm thức. Giai đoạn 2: bổ sung tiếp 10% canh khuẩn (gồm vi khuẩn Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1), để yên sau 15 ngày tiến hành đánh giá cảm quan bằng phƣơng pháp cho điểm thu đƣợc kết quả sau: Bảng 4.10. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 1. Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm của các cảm quan viên Tộng số điểm Điểm trung bình Hệ số quan trọng Điểm có trọng lƣợng A B C D E F G H I J Màu sắc 5 5 4 2 5 2 4 4 3 4 38 3,8 0,8 3,04 Mùi 4 4 2 2 4 1 2 2 4 1 26 2,6 1,2 3,12 Vị 3 3 4 1 3 5 3 4 2 1 29 2,9 1,2 3,48 Độ trong 5 4 3 5 5 4 5 3 4 4 42 4,2 0,8 3,36 Số điểm chung 13,00 Bảng 4.11. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 2. Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm của các cảm quan viên Tộng số điểm Điểm trung bình Hệ số quan trọng Điểm có trọng lƣợng A B C D E F G H I J Màu sắc 3 3 2 2 3 3 3 3 2 2 26 2,6 0,8 2,08 Mùi 2 3 2 3 3 3 2 2 2 2 24 2,4 1,2 2,88 Vị 2 2 3 2 4 4 3 4 3 2 29 2,9 1,2 3,48 Độ trong 5 5 4 5 5 5 5 4 4 2 44 4,4 0,8 3,52 Số điểm chung 11,96 49 Bảng 4.12. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 3. Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm của các cảm quan viên Tộng số điểm Điểm trung bình Hệ số quan trọng Điểm có trọng lƣợng A B C D E F G H I J Màu sắc 2 3 2 2 3 3 3 4 1 2 25 2,5 0,8 2,00 Mùi 3 4 2 4 2 2 2 2 2 3 26 2,6 1,2 3,12 Vị 3 2 3 3 4 3 2 3 2 3 28 2,8 1,2 3,36 Độ trong 5 3 4 5 5 5 5 4 5 2 43 4,3 0,8 3,44 Số điểm chung 11,92 Bảng 4.13. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 4. Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm của các cảm quan viên Tộng số điểm Điểm trung bình Hệ số quan trọng Điểm có trọng lƣợng A B C D E F G H I J Màu sắc 4 4 5 5 4 5 5 3 5 5 45 4,5 0,8 3,60 Mùi 4 5 2 3 2 2 2 2 3 2 27 2,7 1,2 3,24 Vị 3 3 4 3 3 3 1 4 2 4 30 3,0 1,2 3,60 Độ trong 5 3 3 5 5 5 5 3 4 5 43 4,3 0,8 3,44 Số điểm chung 13,88 Bảng 4.14. Kết quả đánh giá cảm quan của nghiệm thức 5. Chỉ tiêu chất lƣợng Điểm của các cảm quan viên Tộng số điểm Điểm trung bình Hệ số quan trọng Điểm có trọng lƣợng A B C D E F G H I J Màu sắc 4 4 5 5 4 4 5 4 4 4 43 4,3 0,8 3,44 Mùi 3 3 3 4 3 4 3 3 3 3 32 3,2 1,2 3,84 Vị 4 4 3 3 4 4 3 4 3 3 35 3,5 1,2 4,20 Độ trong 5 4 4 5 5 5 5 5 4 4 46 4,6 0,8 3,68 Số điểm chung 15,16 50 Đồ thị 4.6. Điểm có trọng lượng về cảm quan màu sắc giữa các nghiệm thức. 2.00 3.44 3.60 2.08 3.04 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Điểm Đồ thị 4.7. Điểm có trọng lượng về cảm quan mùi giữa các nghiệm thức. 3.12 2.88 3.12 3.24 3.84 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Điểm 51 Đồ thị 4.8. Điểm có trọng lượng về cảm quan vị giữa các nghiệm thức. 3.48 3.48 3.36 3.6 4.2 0 1 2 3 4 5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Điểm Đồ thị 4.9. Điểm có trọng lượng về cảm quan độ trong giữa các nghiệm thức. 3.36 3.52 3.44 3.44 3.68 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Nghiệm thức Điểm Chú thích : NT1: Nghiệm thức 1. NT4: Nghiệm thức 4. NT2: Nghiệm thức 2. NT5:Nghiệm thức 5. NT3: Nghiệm thức 3. 52 Qua kết quả đánh giá cảm quan cho thấy nghiệm thức 5 màu sắc đạt 3,44 điểm thấp hơn nghiệm thức 4 đạt 3,6 điểm (Đồ thị 4.6) tuy nhiên nghiệm thức 5 có mùi, vị và độ trong đƣợc các cảm quan viên đánh giá cao nên đạt đƣợc số điểm chung cao nhất là 15,16 điểm. Nghiệm thức 1: Sản phẩm có màu sắc, mùi và vị đạt yêu cầu (Đồ thị 4.6, 4.7, 4.8) nhƣng độ trong kém (Đồ thi 4.9) nên có số điểm chung xếp loại trung bình 13,00 điểm. Nghiệm thức 2: Sản phẩm có độ trong, màu sắc và vị đạt yêu cầu (Đồ thi 4.6, 4.8, 4.9) nhƣng mùi kém đặc trƣng nƣớc mắm (Đồ thi 4.7) nên có số điểm chung xếp loại trung bình 11,96 điểm. Nghiệm thức 3: sản phẩm có mùi đặc trƣng nƣớc mắm (Đồ thị 4.7) nhƣng màu sắc, độ trong kém và có hậu vị kém (Đồ thị 4.6, 4.8, 4.9). nên không đƣợc các cảm quan viên đánh giá cao, có điểm chung xếp loại thấp nhất 11,92 điểm. Nghiệm thức 4: Sản phẩm có màu sắc đƣợc các cảm quan viên chấp nhận, có hậu vị của đạm và mùi thơm của nƣớc mắm (Đồ thị 4.6, 4.7, 4.8) nhƣng độ trong kém (Đồ thị 4.9) nên có số điểm chung 13,88 đƣợc xếp loại khá. Qua kết quả xử lí thống kê (Phụ lục 21) cho thấy có sự khác biệt với mức ý nghĩa 95% giữa các nghiệm thức. Từ kết quả cảm quan trên cho thấy nghiệm thức 5 có công thức phối trộn 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối + 10% canh khuẩn hiếu khí ( gồm Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4) + 10% canh khuẩn kị khí (gồm Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2) sau 1 tháng lên men cho sản phẩm có giá trị cảm quan cao nhất có màu nâu vàng độ trong suốt không cặn, thơm dịu mùi nƣớc mắm và có vị ngọt của đạm có số điểm chung cao nhất là 15,16 điểm nên chúng tôi quyết định chọn nghiệm thức này làm sản phẩm hoàn chỉnh. Chỉ tiêu sinh hóa sản phẩm Đạm tổng số: 10,4 g/l. Đạm amoniac: 1,128 g/l. Đạm formol: 5,152 g/l. 53 Đạm amin: 4,024 g/l. Đạm formol/đạm tổng số x 100 % = 49,54%. Đạm amin/đạm tổng số x 100% = 38,7%. Đạm amoniac/đạm tổng số x 100% = 10,85%. Nhƣ vậy theo tiêu chuẩn nƣớc mắm cá của Lê Xuân Phƣơng (Bảng 2.1) thì sản phẩm nƣớc mắm chay từ nấm của chúng tôi so với nƣớc mắm cá có chất lƣợng gần bằng sản phẩm loại 2 của nƣớc mắm cá. Sau thời gian nghiên cứu chúng tôi đƣa ra quy trình đề nghị cho sản phẩm nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm gồm các khâu: Xử lí nấm: rửa sạch để loại bỏ hết đất bẩn, xay nhuyễn giúp tăng diện tích tiếp xúc giúp tăng quá trình thủy phân. Phối trộn nguyên liệu: 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 15% muối. Khuấy đảo giúp thúc đẩy quá trình thủy phân của các vi khuẩn hiếu khí tốt hơn, nồng độ muối đồng nhất. Bổ sung 10% vi khuẩn kị khí nhằm thực hiện quá trình sinh hƣơng nƣớc mắm. Lọc bằng giấy lọc, bông gòn ,nút bần … cho đến khi đạt đƣợc độ trong cần thiết. Bã lọc đƣợc pha với nƣớc muối cho ra nƣớc mắm loại 2 sau đó đƣợc pha đấu với nƣớc mắm cốt để cho ra các sản phẩm có nồng độ đạm theo yêu cầu. 54 Nấm Xử lí Phối trộn nguyên liệu 10% vi khuẩn hiếu khí 15% muối Lên men 15 ngày, 400C – 500C Khuấy đảo Bổ sung 10% vi khuẩn kị khí 15 ngày, 400C – 500C Không khuấy đảo Chƣợp chín Lọc Nƣớc muối (15%) + Bã Sản phẩm nƣớc mắm nguyên chất Nƣớc mắm loại 2 Pha đấu Đóng chai thành phẩm Chiết rút lần 2 Bã Sản phẩm Đóng chai thành phẩm. Sơ đồ 4.1. Quy trình đề nghị sản xuất nƣớc mắm chay từ nấm. 55 Hình 4.9. Sản phẩm nƣớc mắm chay. 56 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật từ chƣợp mắm lấy từ cơ sở nƣớc mắm Cửa Bé, Thành Phố Nha Trang chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: Thí nghiệm 1: Phân lập đƣợc 5 chủng vi khuẩn hiếu khí Bacillus sp. và 2 chủng kị khí Clostridium sp.dựa vào khả năng sinh protease từ đó các chủng này đƣợc chọn làm tác nhân để tiến hành khảo sát khả năng chịu mặn, khả năng thủy phân và sinh hƣơng trên môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng chịu mặn cho thấy các chủng này đều có khả năng chịu đƣợc nồng độ muối cao từ đó làm cơ sở để tiến hành khảo sát khả năng thủy phân và sinh hƣơng ở nồng độ muối 20%. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thủy phân protein cho thấy chủng Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 là 2 chủng có khả năng thủy phân protein cao hơn các chủng khác từ đó chọn 2 chủng này để bổ sung vào chƣợp mắm làm tác nhân thúc đầy quá trình thủy phân cùa chƣợp mắm tốt. Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng sinh hƣơng cho thấy chủng Clostridium sp.1 và Clostridium sp.2 là 1 chủng có khả năng sinh hƣơng nƣớc mắm tốt hơn các chủng còn lại trên nguồn nguyên liệu nấm từ đó chọn 2 chủng này làm tác nhân bổ sung vào chƣợp mắm làm tác nhân thúc đẩy quá trình sinh hƣơng nƣớc mắm nhằm tạo sản phẩm nƣớc mắm chay có mùi thơm đặc trƣng của nƣớc mắm cá. Thí nghiệm 5: Chọn công thức phối trộn giữa các thành phần nguyên liệu và vi khuẩn cho thấy công thức phối trộn thành phần 45% dứa + 20% nấm rơm + 20% nấm bào ngƣ + 10% canh khuẩn vi khuẩn hiếu khí (gồm Bacillus sp.1 và Bacillus sp.4 theo tỉ lệ 1:1) + 10% canh khuẩn vi khuẩn kị khí (gồm Clostridium sp.1 và 57 Clostridium sp.2 theo tỉ lệ 1:1) cho sản phẩm có giá trị cảm quan tốt đƣợc các cảm quan viên chấp nhận từ đó chọn làm sản phẩm hoàn chỉnh và xây dựng quy trình đề nghị cho sản xuất nƣớc mắm chay ngắn ngày từ nấm. 5.2. Đề nghị Phân lập thêm một số chủng vi khuẩn từ chƣợp mắm cá có khả năng sinh hƣơng đặc trƣng nƣớc mắm trên nguồn nguyên liệu nấm. Nghiên cứu các phƣơng pháp tối ƣu hóa quá trình nhân giống các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc nhằm tạo nguồn giống cung cấp cho quá trình sản xuất nƣớc mắm ở quy mô lớn. Nghiên cứu thêm các phƣơng pháp tối ƣu hóa quá trình lên men nhằm rút ngắn thời gian chƣợp chín hơn nữa. Nghiên cứu các thành phần phụ gia ( thính gạo,…) và nồng độ muối bổ sung vào chƣợp mắm nhằm làm tăng hƣơng vị của nƣớc mắm. Nghiên cứu quy trình sản xuất với quy mô lớn. 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Lê Xuân Phƣơng. Vi sinh vật công nghiệp. NXB Đại Học Đà Nẵng, 2000, trang 309 – 310. 2. Đồng Thị Thanh Thu. Sinh hóa ứng dụng. NXB Đại Học Quốc Gia Tp.HCM, 1990. Trang 123 – 138. 3. Nguyễn Đức Lƣợng. Công nghệ vi sinh - Thực phẩm lên men truyền thống (tập 3). NXB Đại Học Quốc Gia Tp.HCM, 2006. Trang 83 – 97. 4. Trần Linh Thƣớc. Phương pháp phân tích vi sinh vật. NXB Giáo Dục. 232 trang, 2006. 232 trang. 5. Tiến sĩ Nguyễn Trọng Cẩn và Kĩ sƣ Đỗ Minh Phụng. Công nghệ chế biến thực phẩm thủy sản - Ướp muối, chế biến nước mắm, chế biến khô, thức ăn chín. NXB Nông Nghiệp, 1990. 6. PGS.TS Nguyễn Hữu Đồng và Kĩ sƣ Đinh Xuân Linh. Nấm ăn và nấm dược liệu – Công dụng và công nghệ nuôi trồng. NXB Hà Nội, 2000. 7. ThS Vƣơng Thị Việt Hoa. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Tủ sách trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, 2003. 69 trang. 8. Phạm Văn Sổ và Bùi Thị Nhƣ Thuận. Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm. NXB Khoa Học Kỹ Thuật, 1989. 598 trang. 9. Trần Bích Loan, Tôn Nữ Minh Nguyệt, Đinh Trần Nhật Thu. Thí nhiệm hóa sinh thực phẩm. NXB Đại Học Quốc Gia Tp.HCM, 2004. 83 trang. 10. Lƣơng Đức Phẩm. Vi sinh vật học và vệ sinh an toàn vệ sinh thực phẩm. NXB Nông Nghiệp, 2002. 331 trang. 59 CÁC TRANG WEB 11. Nước mắm chay làm từ nấm.Thƣ viện hoa sen. . 12. Lê Hoàng Minh. Sản xuất nước mắm chay từ đậu nành. Trƣờng Đại Học An Giang. <URI: h.pdf>. 13. Phần đấu nghề trồng nấm đến năm 2010 sản xuất được 1 triệu tấn nấm. Trung Tâm Thông Tin Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia. <URI: ham_dien_tu/nong_thon_doi_moi/2004/2004_00044/MItem.20041110.3830/M Article.2004-1110.5230>. 14. Thị trường trong nước. Trung Tâm Thông Tin Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia. <URI: ham_dien_tu/nong_thon_doi_moi/2004/2004_00014/MItem.2004-07- 15.2700/MArticle.2004-07-16.2355>. 15. Nấm ăn vừa bổ dưỡng vừa chữa được nhiều bệnh. Tháng 1/2005. <URI: >. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Môi trƣờng Nutrient Agar (NA). ( Trần Linh Thƣớc, 2006). Pepton: 10 g/l. Cao thịt: 3 g/l. NaCl: 5 g/l. Agar: 15 g/l. Nƣớc cất: 1lít. Khử trùng 15 phút, 1210C, pH = 7 ± 0,2. Phụ lục 2. Mội trƣờng Nutrient Broth (NB). ( Trần Linh Thƣớc, 2006). Pepton: 10 g/l. Cao thịt: 3 g/l. NaCl: 5 g/l. Nƣớc cất: 1 lít. Khử trùng 15 phút, 1210C, pH = 7 ± 0,2. Phụ lục 3. Môi trƣờng Czapek. ( Trần Linh Thƣớc, 2006). Saccharose: 30 g/l. KH2PO4: 0,5 g/l. MgSO4: 0,5 g/l. FeSO4: 0,01 g/l. Nƣớc cất: 1 lít. Agar: 20 g/l. Khử trùng 15 phút, 1210C , pH = 6. Phụ lục 4. Môi trƣờng nƣớc chiết nấm rơm. Nấm rơm: 500 g/l. NaCl: 50 g/l. Nƣớc: 1lít. Đun sôi 30 phút, để nguội, lọc bã, thêm NaCl, khử trùng 15 phút, 1210C. Phụ lục 5. Phƣơng pháp nhuộm Gram. Tạo vết bôi trên mặt phiến kính, để khô trong không khí. Cố định vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng Crystal Violet trong 1 phút. Rửa nƣớc nhẹ và nhanh. Nhuộm tiếp Glugol trong 1 phút. Rửa nƣớc và thấm khô. Tẩy nhanh bằng đèn cồn trong 30 giây. Rửa lại bằng nƣớc. Nhuộm Fuschin trong 30 giây. Rửa nƣớc và thấm khô. Quan sát dƣới kính hiển vi với giọt dầu xem kính. Phụ lục 6. Phƣơng pháp pha loãng. ( Trần Linh Thƣớc, 2006). Mẫu đƣợc pha loãng tuần tự thành dãy các nồng độ thập phân 1/10, 1/100, 1/1000,… Mỗi bậc pha loãng là 1/10 đƣợc thực hiện bằng 1 ml mẫu (hoặc dung dịch có độ pha loãng trƣớc đó) thêm vào 9 ml nƣớc hay môi trƣờng trong 1 ống nghiệm. Sau khi lắc kĩ sẽ đƣợc độ pha loãng 1/10. Phụ lục 7. Phƣơng pháp định lƣợng nitơ formol. (Phạm Văn Sổ và Bùi Nhƣ Thuận, 1989) Nguyên lý: Các acid amin trong dung dịch nƣớc thì trung tính, không những do 2 nhóm hóa chức acid (-COOH) và amin (NH2) trung hòa lẫn nhau, mà còn do cả 2 nhóm hóa chức ấy đều yếu, quá trình điện li rất kém. Khi gặp formol, nhóm NH2 kết hợp với formol tạo thành nhóm metylenic (N=CH2) mất tính chất kiềm, do đó tính chất acid của nhóm –COOH nổi bật lên và có thể định lƣợng đƣợc bằng 1 chất kiềm với phenolphtalein làm chất chỉ thị màu. Phƣơng pháp tiến hành: Cân chính xác P g chất thử đã xay nhuyễn (hoặc V ml mẫu chất thử là chất lỏng) cho vào bình định mức 100 ml với 50 ml nƣớc cất, lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan. Cho thêm 0,5 ml dung dịch phenolphtalein, khoảng 2 g BaCl2 và từng giọt Ba(OH)2 cho đến khi màu hồng nhạt, sau đó thêm 5 ml Ba(OH)2 để kết tủa các muối photphat và cacbonat.Cho nƣớc cất vào đủ 100 ml lắc đều và lọc. Lấy 25 ml dịch lọc cho vào bình nón với 20 ml dung dich formol trung tính. Chuẩn độ bằng NaOH 0,2 N cho đến màu đỏ tƣơi (pH 9 – 9,5). Tính kết quả: hàm lƣợng nitơ formol trong 100g chất thử: Nitơ formol (g/100 g) = 0,0028 g x n x 100 x 100. 25 P Hoặc hàm lƣợng nitơ formol trong 1000 ml chất thử: Nitơ formol (g/l) = 0,0028 x n x 100 x 1000 25 V Trong đó 0,0028 = số gam nitơ tƣơng ứng với 1 ml NaOH 0,2 N n = số ml NaOH 0,2 N sử dụng. V hoặc P = số ml hoặc số gam chất thử. Phụ lục 8. Phƣơng pháp định lƣợng amoniac bằng cất kéo hơi nƣớc. (Phạm Văn Sổ và Bùi Nhƣ Thuận, 1989). Nguyên lý: đẩy muối amoni ra thể tự do bằng 1 chất kiềm mạnh hơn amoniac, nhƣng không mạnh lắm để tránh ảnh hƣởng đến thực phẩm, ví dụ nhƣ Mg(OH)2, Na2CO3. Dùng hơi nƣớc kéo amoniac đã đƣợc giải phóng ra thể tự do sang bình chuẩn độ và định lƣợng bằng H2SO4 0,1 N alizarin natri sunfonat làm chỉ thị màu. Phƣơng pháp tiến hành: Sử dụng bộ dụng cụ chƣng cất đạm gồm: Bình cầu A đựng nƣớc và đun nƣớc sôi làm nguồn sinh hơi nƣớc. Bình cầu B đựng thực phẩm định lƣợng. Ống sinh hàn C. Bình chuẩn độ D. Cho nƣớc cất vào bình cầu A đến 2/3 thể tích bình, 5 giọt chỉ thị màu alizarin natri sunfonat và H2SO4 từng giọt 1 cho đến khi có phản ứng acid (màu vàng). Sau đó cho nƣớc cất vào bình cầu B đến hơn 1 nửa, lắp nguồn nƣớc lạnh vào ống sinh hàn, đun sôi cả 2 bình và cất kéo hơi nƣớc cho đến khi hơi nƣớc chảy ra. Đây là giai đoạn rửa máy cất kéo hơn nƣớc. Cân hoặc hút 1 lƣợng chính xác P g hoặc V ml thực phẩm cho vào bình cầu B với nƣớc đã cất kéo rửa máy ở trên, 0,5 ml chỉ thị màu. Cho MgO bột vào cho đến khi có phản ứng kiềm rõ rệt (màu tím). Đun sôi, hơi nƣớc bốc lên từ bình A qua bình đựg thực phẩm B kéo NH3 theo, khi qua ống sinh hàn sẽ đọng lại rơi xuống bình chuẩn độ D đã đựng sẵn nƣớc trung tính, chất chỉ thị màu và N ml H2SO4 0,1 N. Cất cho đến khi hơi nƣớc bay không còn NH3 nữa. Hơi NH3 bay ra kết hợp với H2SO4 thành (NH4)2SO4. H2SO4 thừa sẽ đƣợc chuẩn độ bằng NaOH 0,1 N. Tính kết quả hàm lƣợng NH3 trong 100 g thực phẩm: 1,7 x (N-n) x 100 P x 1000 Hoặc trong 1000 ml thực phẩm: 1,7 x (N – n) V Trong đó: N = số ml H2SO4 0,1 N cho bình chuẩn độ. n = số ml NaOH 0,1 N dùng chuẩn độ H2SO4 thừa. Phụ lục 9. Phiếu đánh giá cảm quan mùi dịch thủ phân nƣớc chiết nấm rơm. PHIẾU ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN Phép thử: cho điểm Tên sản phẩm: dịch thủy phân của nƣớc chiết nấm rơm. Họ tên ngƣời thử:…………………………………………….ký tên Ngày thử:…………………………………………. Mẫu Mức độ gây hƣơng mắm đặc trƣng 1 2 3 4 5 6 7 Phụ lục 10. Phƣơng pháp kiểm tra phản ứng Catalase. (Trần Linh Thƣớc, 2006) Nhỏ giọt H2O2 3 % lên phiến kính, dùng que lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn cần kiểm tra trộn vào giọt H2O2. Nếu thấy sủi bọt là Catalase dƣơng tính (+), không sủi bọt là Catalase âm tính (-). Phụ lục 11. Phiếu đánh giá cảm quan sản phẩm nƣớc mắm chay. ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN Phép thử: Cho điểm Tên sản phẩm: Nƣớc mắm chay. Họ tên ngƣời thử:……………………………………….Ký tên:………….. Ngày thử………………………………………………... Chỉ tiêu Mẫu Màu sắc Mùi Vị Độ trong 1 2 3 4 5 Phụ lục 12. Hình khả năng tạo sinh khối vi khuẩn kị khí trong môi trƣờng NB. A B C A: Ống đối chứng. B: Có sinh khối dƣới đáy ống nghiệm. C: Không có sinh khối dƣới đáy ống nghiệm. Phụ lục 13. Mô hình thử nghiệm khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc từ chƣợp mắm. Phụ lục 14. Mô hình chƣợp mắm. Chú ý: 1: Nghiệm thức 1. 2: Nghiệm thức 2. 3: Nghiệm thức 3. 4: Nghiệm thức 4. 5: Nghiệm thức 5. Phụ lục 15. Kết quả xử lí thống kê thí nghiệm 2 Analysis of Variance for TN2.ketqua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:TN2.Chungvsv 4.1265280 6 .6877547 78.726 .0000 B:TN2.muoi 4.4036160 3 1.4678720 168.026 .0000 INTERACTIONS AB .5057920 18 .0280996 3.217 .0028 RESIDUAL .2446080 28 .0087360 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 9.2805440 55 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for TN2.ketqua -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 56 1.7300000 .0124900 1.7044094 1.7555906 A:TN2.Chungvsv B1 8 1.9740000 .0330454 1.9062936 2.0417064 B2 8 1.7080000 .0330454 1.6402936 1.7757064 B3 8 1.4000000 .0330454 1.3322936 1.4677064 B4 8 2.1700000 .0330454 2.1022936 2.2377064 B5 8 1.3580000 .0330454 1.2902936 1.4257064 C1 8 1.8340000 .0330454 1.7662936 1.9017064 C2 8 1.6660000 .0330454 1.5982936 1.7337064 B:TN2.muoi 0% 14 1.6720000 .0249800 1.6208188 1.7231812 3% 14 1.4000000 .0249800 1.3488188 1.4511812 10% 14 1.6720000 .0249800 1.6208188 1.7231812 20% 14 2.1760000 .0249800 2.1248188 2.2271812 AB -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for TN2.ketqua by TN2.Chungvsv -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 1.3580000 X B3 8 1.4000000 X C2 8 1.6660000 X B2 8 1.7080000 X C1 8 1.8340000 X B1 8 1.9740000 X B4 8 2.1700000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits B1 - B2 0.26600 0.09575 * B1 - B3 0.57400 0.09575 * B1 - B4 -0.19600 0.09575 * B1 - B5 0.61600 0.09575 * B1 - C1 0.14000 0.09575 * B1 - C2 0.30800 0.09575 * * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for TN2.ketqua by TN2.muoi -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3% 14 1.4000000 X 0% 14 1.6720000 X 10% 14 1.6720000 X 20% 14 2.1760000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 0% - 3% 0.27200 0.07238 * 0% - 10% 0.00000 0.07238 0% - 20% -0.50400 0.07238 * 3% - 10% -0.27200 0.07238 * 3% - 20% -0.77600 0.07238 * 10% - 20% -0.50400 0.07238 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 16. Kết quả xử lí thống kê thí nghiệm 3. One-Way Analysis of Variance ---------------------------------------------------------------