Khóa luận Phân lập nấm fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dòng nấm tạo giberelin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC    KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LƯA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC    KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP NẤM Fusarium moniliforme GÂY BỆNH LƯA VON VÀ XÁC ĐỊNH DÕNG NẤM TẠO GIBERELIN Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐƠN DIỆP TUYẾT CHÂU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 i LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cơ trong Bộ mơn Cơng nghệ sinh học cùng các thầy cơ trực tiếp giảng dạy luơn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt bốn năm qua. TS. Lê Đình Đơn khơng những đã tận tình hướng dẫn, dạy dỗ con trong trong nghiên cứu khoa học mà thầy cịn dạy con nhiều bài học quí giá trong cuộc sống. Những lời thầy nĩi, thầy dạy là những bài học mà con sẽ nhớ mãi. Anh Nguyễn Kinh Long, Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, động viên, chia sẽ những vui buồn trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Chị Vy, chị Kiều và chị Vân ở phịng Bảo Vệ Thực Vật (Phịng 118, 105) khu Phượng Vỹ Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tơi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài. Chị Ly, anh Điền, anh Khang, anh Hưởng phụ trách phịng Hĩa Lý và các anh chị phụ trách phịng Hĩa Sinh thuộc Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại học Nơng Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tơi trong thời gian làm đề tài. Tồn thể lớp CNSH 29 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ đã nuơi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con cĩ thể hồn thành tốt khĩa luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con vượt qua mọi khĩ khăn trở ngại trong cuộc sống. Tp. Hồ Chí Minh ngày 01 tháng 09 năm 2007 Diệp Tuyết Châu ii TĨM TẮT LUẬN VĂN DIỆP TUYẾT CHÂU, Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 08/2007. “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dịng nấm tạo giberelin”. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đơn Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 03/2007 đến tháng 08/2007, tại Phịng bệnh cây, Bộ mơn Bảo vệ Thực vật, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM và Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. Cây lúa là cây gắn liền với lịch sử hình thành và phát triển nước ta. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng hình thành và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Đặc biệt bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong hai năm gần đây trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long làm giảm năng suất đáng kể. Để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa phát triển cao lên là do giberelin nên chúng tơi tiến hành các nghiên cứu sau: Phân lập và tách đơn bào tử các dịng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuơi cấy các dịng nấm Fusarium moniliforme trong mơi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. Các kết quả đạt được: Phân lập được 20 dịng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von. Khuếch đại thành cơng vùng tef của 14 dịng nấm bằng cặp mồi ef1-ef2 bằng kỹ thuật PCR. Trong 20 dịng nấm, chưa phát hiện được dịng nào sản xuất GA3 trong mơi trường 20% ICI bằng TLC. iii SUMMARY The title of graduation thesis is “Isolation the causal agent of bakanae disease, Fusarium moniliforme, and identification isolates’ production of gibberellin”. This thesis was conducted by Dr. LE DINH DON from 03/2007 to 08/2007 at Nong Lam university. In recent years, bakanae disease has broken out and caused the loss of yields. In order to understand clearly the fungi causing bakanae disease in different geographic regions in Mekong Delta, we based on symptoms and morphological characteristics to isolate 20 samples. However, one of the greatest impediments to study of Fusarium has been the incorrect and confused application of species names to toxigenic and pathogenic isolates, owing in large part to intrinsic limitations of morphological species recognition. Thus, we used molecular technique as PCR to make the base inferre the relationships among well-defined Fusarium as well as showing a great deal of species diversity that was vastly under-estimated by all previous morphological treatments. We sucessfully amplified tef gene region of 14 isolates with ef1 and ef2 primers. Moreover, we cultured 20 isolated Gibberella fujikuroi in gibberrellin-produced medium (20% ICI). Then we used TLC method to identify GA3 but our experiment did not go as well as planned. iv MỤC LỤC Lời cảm tạ ................................................................................................................. i Tĩm tắt luận văn ....................................................................................................... ii Summary ................................................................................................................. iii Mục lục .................................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... vii Danh sách các bảng, hình, sơ đồ ........................................................................... viii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .......................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ....................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.2.2 Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von ................................................................................. 3 2.1.1 Phân bố và thiệt hại ......................................................................................... 3 2.1.2 Triệu chứng ..................................................................................................... 3 2.1.3 Tác nhân .......................................................................................................... 5 2.1.4 Hình dạng và kích thước ................................................................................. 6 2.1.5 Đặc tính sinh lý ............................................................................................... 6 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển .................................................................... 7 2.2 Đại cương về nấm Gibberella fujikuroi ............................................................. 8 2.2.1 Phân loại học ................................................................................................... 8 2.2.2 Sơ lược về Gibberella fujikuroi ...................................................................... 8 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi .............................................. 9 2.3 Giới thiệu về gen tef ......................................................................................... 10 2.4 Tổng quát về giberelins .................................................................................... 11 2.4.1 Đại cương về các chất giberelins .................................................................. 11 2.4.2 Chức năng và vai trị sinh hĩa ....................................................................... 13 v 2.4.2.1 GAs kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị ............ 13 2.4.2.2 GAs điều hịa sự chuyển hĩa cây con sang giai đọan trưởng thành .......... 14 2.4.2.3 GAs ảnh hưởng giai đọan bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính ............ 14 2.4.2.4 GAs đẩy mạnh “fruit set” ........................................................................... 14 2.4.2.5 GAs thúc đẩy sự nảy mầm của hạt ............................................................. 14 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thương mại ................................................................. 15 2.4.3.1 Trong trồng trọt .......................................................................................... 15 2.4.3.2 Sản xuất bia ................................................................................................ 15 2.4.3.3 Tăng sản lượng mía .................................................................................... 15 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật ............................................................ 16 2.5 Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 16 2.5.1 Tổng quát về sắc ký lớp mỏng ..................................................................... 16 2.5.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................................................................... 20 2.5.3 Một số ứng dụng thơng thường của TLC ...................................................... 20 2.6 Ứng dụng của kỹ thuật PCR............................................................................. 20 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................... 21 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ....................................................................... 22 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .................................................................................... 22 3.1.2 Địa điểm thực hiện ....................................................................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 23 3.3 Vật liệu và phương pháp thí nghiệm ................................................................ 23 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm ........................................... 23 3.3.1.1 Dụng cụ và hĩa chất thí nghiệm ................................................................. 24 3.3.1.2 Phương pháp phân lập nấm ....................................................................... 25 3.3.1.3 Phương pháp cắt đơn bào tử ...................................................................... 25 3.3.1.4 Phương pháp nhân sinh khối ..................................................................... 25 3.3.2 Phương pháp ly trích DNA của nấm ............................................................ 26 3.3.2.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 26 3.3.2.2 Phương pháp ly trích DNA ....................................................................... 26 vi 3.3.2.3 Định tính DNA ........................................................................................... 27 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích ...................................................................... 28 3.3.3 Khuếch đại vùng tef ...................................................................................... 28 3.3.3.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm ................................................................. 28 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng ................................................................................... 29 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR ............................................................................ 29 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 ........................................................... 29 3.4.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm .................................................................... 29 3.4.2 Phương pháp sản xuất GA3 .......................................................................... 30 3.4.3 Phương pháp trích GA3 ................................................................................. 30 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC ............................................................................. 31 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 32 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở ĐBSCL ....................................................... 32 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử ................................................................ 33 4.3 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................... 35 4.4 Kết quả ly trích và tinh sạch DNA của nấm ................................................... 36 4.5 Kết quả PCR .................................................................................................... 38 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC .................................................................... 39 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 41 5.1 Kết luận ............................................................................................................ 41 5.2 Đề nghị ............................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 42 PHỤ LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AcOH: acid acetic. AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism. BVTV: bảo vệ thực vật. bp: base pair. CHCl3 : chloroform. dNTPs: deoxyribonucleotide-5-triphosphate. ĐBSCL: Đồng Bằng Sơng Cửu Long. EtOAc: ethyl acetate. HPLC: high performance liquid chromatography. ITS: Internal Transcribed Spacer. GAs: giberelins. GA3: acid giberelic. Gf: Gibberella fujikuroi MP: mating population. PCR: polymerase chain reaction. PDA: potato dextrose agar. RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. rDNA: ribosome Deoxynucleotide acid. Rf: ratio of fronts. STT: số thứ tự. TAE: TrisAcetic Ethylene diamine tetra acetate. TE: Tris Ethylene diamine tetra acetate. tef : translation elongation factor. TLC: thin-layer chromatography. Tm: melting temperature. UV: ultra violet. WA: water agar. viii DANH SÁCH CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, BẢNG Hình 2.1 Ruộng lúa ở Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von .............................................. 4 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh ..................................................................... 5 Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme ...................................... 5 Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic ................................................................................ 11 Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene ................................................................................... 11 Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane............................................................................ 12 Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao ................................. 13 Hình 2.8 Ảnh hưởng của GA3 đến giống nho khơng hạt của Thompson ................. 15 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC .................................................................. 19 Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ..................... 33 Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên mơi trường WA ............................................ 33 Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme sau 7 ngày cấy ............................. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc trên mơi trường PDA sau 7 ngày cấy ................................ 34 Hình 4.5 Đại bào tử Fusarium moniliforme ............................................................. 35 Hình 4.6 Tiểu bào tử Fusarium moniliforme ........................................................... 35 Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1 ....................................................... 36 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dịng nấm theo qui trình 2 ........................... 37 Hình 4.9 Sản phẩm PCR vùng tef ............................................................................. 39 Hình 4.10 Kết quả sắc ký .......................................................................................... 40 Sơ đồ 2.1 Con đường sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi .............................. 9 Sơ đồ 2.2 Bản đồ vùng gen tef Fusarium ................................................................. 10 Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3 ................................................................................... 30 Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3 ................................................................... 31 Bảng 3.1 Các dịng nấm được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL ........ 23 Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR................................................................. 29 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Việt Nam là một trong những nước Đơng Nam Á cĩ lịch sử lâu đời về sản xuất lúa. Cây lúa khơng những đã gắn bĩ với con người, đất nước ta từ hàng ngàn năm mà cây lúa cịn tạo nên lịch sử, văn hĩa Việt Nam, bảo vệ con người Việt Nam trong những năm chiến tranh, là niềm tự hào của Việt Nam vươn lên trong hịa bình. Điều đĩ thể hiện rõ ở chỗ nước ta trước năm 1985 là nước nhập khẩu gạo sau đĩ đã trở thành nước xuất khẩu gạo thứ hai trên thế giới. Nĩ được xem là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu của người Châu Á nĩi chung cũng như là người Việt Nam nĩi riêng. Cùng với quá trình phát triển của cây lúa thì các loại dịch bệnh cũng đã xuất hiện và gây hại ngày càng nghiêm trọng. Các loại dịch bệnh này cĩ thể do nhiều tác nhân như nấm, sâu bệnh, vi khuẩn, vi rút hay kí sinh trùng gây ra. Các loại dịch bệnh phổ biến do nấm gây ra trên lúa cĩ thể kể như lúa von, đạo ơn, khơ vằn. Những năm gần đây bệnh lúa von đã xuất hiện trở lại trong vụ Đơng Xuân ở các tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long, đặc biệt trên đồng ruộng An Giang. Theo thống kê của chi cục BVTV An Giang trong tháng 02/2007 tồn tỉnh cĩ hơn 8000 ha lúa bị nhiễm lúa von trên các trà lúa đang từ đẻ nhánh đến đang làm địng ( và đã làm giảm năng suất đáng kể. Bệnh lúa von đã được những nhà khoa học Nhật mơ tả cách đây hơn 100 năm nhưng vẫn chưa xác định rõ các lồi Fusarium gây triệu chứng của bệnh lúa von như thối gốc và ngọn, cây lúa phát triển cằn cỗi, triệu chứng thường thấy nhất là cây lúa cao lên đột biến do nấm tạo giberelin gây ra. Các nhà nghiên cứu Nhật đã xác định tác nhân gây bệnh là “Fusarium moniliforme” tuy nhiên hiện nay tên gọi này bao gồm nhiều lồi khác nhau bây giờ được gọi chung là phức hệ lồi 2 Gibberella fujikuroi (Gibberella fujikuroi species complex). Sự hình thành giai đoạn hữu tính Gibberella chỉ ra sự khác biệt các quần thể giao phối hay các lồi sinh học trong nhĩm này (A. E. Desjardins và ctv., 2000). Từ đĩ, để hiểu rõ hơn về nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long và nhằm xác định tác nhân làm cho cây lúa cao vống lên là giberelin nên chúng tơi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von và xác định dịng nấm tạo giberelin”. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu Tiến hành các nghiên cứu để xác định các dịng nấm gây bệnh lúa von và tác nhân làm cho cây lúa cao đột biến là giberelin từ đĩ là cơ sở để chọn ra các dịng nấm tạo nhiều giberelin nhất để tiến hành nuơi cấy, lên men sản xuất giberelin. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu Phân lập và tách đơn bào tử các dịng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở một số tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Phát hiện vùng gen tef của nấm Fusarium moniliforme bằng kỹ thuật PCR. Nuơi cấy các dịng nấm Fusarium moniliforme trong mơi trường sản xuất GA3 và định tính GA3 bằng TLC. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về bệnh lúa von 2.1.1 Phân bố và thiệt hại Bệnh đã được biết đến ở Nhật từ năm 1828, nhưng mãi đến năm 1898 mới được Hori mơ tả lần đầu tiên. Bệnh khá phổ biến trên thế giới. Ở Trung Quốc bệnh được gọi là „white stalk‟; cịn ở Philippines và Guyana bệnh được gọi là „lúa đực‟ (palay lalake hay man rice). Thất thu do bệnh cĩ thể rất đáng kể ở nhiều nơi, 20% ở Hokkaido, 40 – 50% ở Kinki Chugoku, Nhật (Ito, Kimura, 1931; Kinki – Chugoku Regional Agriculture Committee, 1975), 15% ở Đơng Uttar Pradesh, Ấn Độ (Pavgi, Singh, 1964), 3,7 – 14,7% ở Trung và Bắc Thái Lan (Kanjanasoon, 1965). Bệnh cũng phổ biến ở nhiều nước Đơng Nam Á nhưng thiệt hại khơng lớn. Ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long bệnh cũng cĩ mặt ở nhiều nơi, nhất là vụ Đơng Xuân, mức độ thiệt hại tùy giống và tùy năm. Trên giống IR-42 ở Huyện Mỹ Xuyên, Sĩc Trăng, tỉ lệ chồi nhiễm cĩ thể đến 10 – 20%. Bệnh cĩ khi thành dịch trên diện rộng, như vào năm 1980 ở Đồng Tháp. 2.1.2 Triệu chứng Bệnh cĩ thể xuất hiện ngay từ giai đoạn mạ. Triệu chứng dễ thấy và thơng thường nhất là cây mạ bị bệnh cĩ chiều cao hơn cây bình thường, mảnh và cĩ màu xanh vàng nhạt. Cây mạ bị bệnh cĩ thể chết trước khi nhổ cấy hay sau khi cấy. Những cây này nổi bật lên rất dễ thấy, nĩ phân bố khắp cánh đồng. Tuy vậy cũng cĩ một số cây mạ bị bệnh khơng cĩ triệu chứng von mà lại thấp lùn cịi cọc, phụ thuộc vào dịng nấm gây bệnh và các điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ và ẩm độ. 4 Ghi chú: Các mũi tên chỉ cây lúa bị nhiễm bệnh. Yamanaka và Honkura (1978) đã phân ra cĩ 5 loại triệu chứng. Vươn dài. Vươn dài sau đĩ phát triển bình thường. Vươn dài sau đĩ bị cịi cọc. Cây bị cịi cọc. Cây khơng phát triển. Trên lúa bệnh phát sinh từ khi bắt đầu đẻ nhánh đến cĩ địng. Những cây bị bệnh nặng sinh ra các rễ phụ ở đốt thân, đơi khi xuất hiện lớp sợi nấm màu trắng hay màu hồng ở các đốt phía dưới, đĩ là khuẩn ty và bào tử của nấm, lớp mốc này lan dần lên trên khi cây chết. Nấm cĩ thể thành lập quả nang bầu trên cây bệnh nếu điều kiện thuận lợi. Hình 2.1 Ruộng lúa ở Càng Long -Trà Vinh bị nhiễm bệnh lúa von tại thời điểm 01/05/2007. 5 Hình 2.2 Bào tử nấm trên thân lúa bệnh. (Nguồn ) 2.1.3 Tác nhân Bệnh do nấm Fusarium moniliforme, cĩ giai đoạn hữu tính sinh sản bằng nang nên cịn được gọi là Gibberella fujikuroi. (Nguồn ) Hình 2.3 Chu kỳ gây bệnh của nấm Fusarium moniliforme. 6 2.1.4 Hình dạng và kích thƣớc Giai đoạn quả tử nang của Gibberella fujikuroi cĩ hình khối cầu hay bầu dục, mặt ngồi xù xì, cĩ màu xanh đậm trong chứa các bào tử nang cĩ một vách ngăn, 250 – 330 x 220 – 280 (190 – 390 x 160 – 420) m; nang cĩ dạng hình trụ, phần trên hơi rộng hơn, 90 – 102 x 7 – 9 (66 – 129 x 7 – 14) m, chứa 4,6 và cĩ khi đến 8 bào tử, một dãy hay hai hàng khơng rõ; nang bào tử cĩ 1 vách ngăn, khoảng 15 x 5,2 m (đa số là 14 – 18 x 4,4 – 7 m) cĩ khi lớn 27 – 45 x 6 – 7 m (nếu nang chỉ chứa một bào tử) (S.H.Ou, 1985). Giai đoạn phân sinh bào tử của Gibberella fujikuroi cĩ hai dạng bào tử là tiểu bào tử và đại bào tử. Tiểu bào tử cĩ hình trứng dẹt, khơng cĩ hay cĩ một vách ngăn, thường xếp thành chuỗi, sau đĩ rời nhau và phân tán thành lớp bột trắng trên nền khuẩn ty trắng vàng hay trắng hồng. Cịn đại bào tử thanh mảnh, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng cĩ một cái mĩc ở đỉnh, màu xanh vàng nhạt cĩ 3 – 5 vách ngăn (S.H.Ou, 1985). Nấm khơng cĩ bào tử chống chịu, cĩ hay khơng cĩ hạch nấm hình cầu, màu xanh đậm, kích thước 80 – 100 m. Số vách ngăn của bào tử, việc thành lập tiểu bào tử, đại bào tử và hạch nấm của nấm gây bệnh cũng rất thay đổi. 2.1.5 Đặc tính sinh lý Theo S.H.Ou (1985) nấm dễ nuơi cấy trên nhiều loại mơi trường, thường dùng dung dịch của Richard và Knop. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của sợi nấm được nhiều người nghiên cứu, nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển là 27 – 30 C, tối đa 36 – 40 C và tối thiểu 7 – 8 C. Những nguyên tố vi lượng như borax, kẽm, mangan làm gia tăng sự phát triển của nấm. Quá trình phân lập nấm được thực hiện dễ dàng trên những mơi trường chọn lọc như mơi trường cĩ chứa quintozene (PCNB). Việc sinh tiểu bào tử hay đại bào tử cũng tùy thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong mơi trường, bào tử được sinh nhiều nếu cĩ ánh sáng liên tục. Rice straw-soybean meal agar và Sach‟s agar plus 7 rice straw giúp cho tạo tiểu bào tử trong khi glucose casamino acid agar và rice straw casamino acid agar giúp cho việc hình thành đại bào tử. Xylose là nguồn cacbon hydrat thích hợp nhất để tạo đại bào tử. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm sản sinh ra 2 chất là axít fusaric và giberelin. Axít fusaric hạn chế sinh trưởng làm cây cịi cọc, cịn giberelin cĩ tác dụng kích thích làm cây phát triển theo chiều cao, cao vống lên. Sự sản sinh ra hai chất này phụ thuộc vào dịng nấm và mơi trường sinh sống của nấm. Trên mơi trường cĩ KH2PO4 hay MgSO4 hay cĩ nhiều kali, nấm sẽ tạo ra nhiều giberelin trong khi glucose lại rất tốt để nấm tạo ra axít fusaric. Axít fusaric sản sinh nhiều ở nhiệt độ cao (33 C) và mơi trường kiềm (pH~9), cịn giberelin sản sinh ở nhiệt độ thấp hơn (từ 27 – 30 C) và mơi trường chua. Mật độ nấm bệnh càng cao, nấm cĩ khuynh hướng tạo axít fusaric. Muốn sinh sản hữu tính, nấm phải cần cĩ khuẩn ty khác nhĩm để phối hợp. Ngồi ra, nang bào tử nấm cũng cĩ tính đực, tính cái và lưỡng tính. 2.1.6 Điều kiện phát sinh và phát triển Bệnh lúa von chủ yếu truyền qua hạt giống. Hạt lúa bị nhiễm bệnh ở thời kì trổ hoa và kéo dài trong ba tuần sau đĩ, nhưng tỉ lệ hạt bị nhiễm cũng giảm dần đi. Nếu nhiễm nặng hạt sẽ cĩ màu đỏ và mạ mọc lên sẽ bị lùn. Các hạt nảy mầm sẽ sinh ra cây mạ bị von. Từ những cây mạ bị bệnh, bào tử nhờ giĩ và nước lan truyền xâm nhiễm cho cây khác. Nấm phát triển trong cây phá hủy tế bào cây, đồng thời những chất do chúng tiết ra tạo nên triệu chứng điển hình của cây lúa bị bệnh. Một số hạt giống khơng bị biến màu vỏ cũng cĩ thể mang nguồn nấm. Trên hạt giống bảo quản khơ ráo nấm tồn tại tới 3 năm. Ngồi ra nấm cịn tồn tại trong đất, tuy thời gian khơng lâu. Một thí nghiệm ở Thái Lan (Kanjanosoon, 1965) cho thấy đất sau khi lây nhiễm nấm cho số cây bệnh là 93%, sau đĩ tỉ lệ bệnh giảm dần, tới 90 ngày chỉ cịn 0,7% và sẽ khơng cĩ cây bệnh nếu để sau 6 tháng. Đại bào tử hay khuẩn ty vách dày của nấm cũng sống được 4 tháng trong đất (S.H.Ou, 1985). Trên hạt và thân lúa nhiễm, nấm cĩ thể sống 4 – 10 tháng ở nhiệt độ phịng, nếu trữ lạnh ở 7 C nấm cĩ thể sống hơn 3 năm. 8 2.2 Đại cƣơng về nấm Gibberella fujikuroi (giai đoạn vơ tính là Fusarium moniliforme) 2.2.1 Phân loại học Ngành: Ascomycota Ngành phụ: Pezizomycotina Lớp: Sordariomycetes Lớp phụ: Hypocreomycetidae Bộ: Hypocreales Họ: Nectriaceae Giống: Gibberella Lồi: Gibberella fujikuroi complex 2.2.2 Sơ lƣợc về Gibberella fujikuroi Năm 1931, Wollenweber đặt tên cho giai đoạn vơ tính của nấm gây bệnh lúa von là Fusarium moniliforme (Sheldon) và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (Saw.) Wr. (B. Tudzynski, 1999) Theo Stefan Malonek và ctv (2005), phức hệ lồi Gibberella fujikuroi bao gồm nhiều lồi nấm gây bệnh quan trọng trên nhiều cây trồng khác nhau như ngơ, lúa, lúa mạch, mía, thơng, xồi, dứa, lúa miến… Giai đoạn vơ tính trong phức hệ này thuộc giống Fusarium nhĩm Liseola. Phức hệ lồi này được chia thành ít nhất 9 lồi hữu tính (sexually fertile biological species) (được biết như những quần thể giao phối, MP-A đến MP-I) và cĩ 32 lồi vơ tính. Trong những năm gần đây, cĩ nhiều nghiên cứu nhằm xác định lồi trong phức hệ này như dựa vào hình thái, khả năng giao phối (mating experiment), phân tích cây phát sinh lồi dựa trên trình tự DNA từ những loci khơng liên kết như tiểu đơn vị nhỏ của ti thể (mtSSU) rDNA, nuclear 28S rDNA, -tubulin, calmodulin, EF-1 , và histon H3 gen. Những kĩ thuật phân tử khác như RAPDs, mitochondrial RFLPs và CHEF-gel karyotypes cũng được dùng để phân biệt những thành viên trong phức hệ lồi Gibberella fujikuroi. Ngồi ra những thành viên trong quần thể giao phối cĩ nhiều kí chủ khác nhau và khác nhau về khả năng tạo ra các hợp chất thứ cấp như fumonisins, axít 9 Sơ đồ 2.1 Con đƣờng sinh tổng hợp GA3 ở Gibberella fujikuroi. fusaric, fusaproliferin, moniliformin, fusarins và giberelin. Những dịng của những quần thể giao phối khác nhau sẽ tạo ra những chất thứ cấp khác nhau. Vì vậy những lồi của MP-A, -C, -D và -G tạo ra fumonisins, MP-A, -C và F tạo ra moniliformin, beauvericin và fusaprolifern được MP-D và E tạo ra. Ngược lại, chỉ cĩ lồi F.fujikuroi (MP-C) cĩ khả năng sản xuất giberelins (Stefan Malonek và ctv., 2005). 2.2.3 Sinh tổng hợp giberelin ở Gibberella fujikuroi Theo Hiroshi Kawaide (2006), quá trình nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp giberelin cĩ thể chia thành 3 bước như sau: Bước 1: ent-kaurene được tổng hợp từ isopentenyl diphosphate và dimethylallyl diphosphate thơng qua geranylgeranyl diphosphate (GGDP). Bước 2: chuyển ent-kaurene thành GA12-7-aldehyde dưới sự xúc tác của các enzyme cytochrome P450 monoxygenases. Bước 3: qua nhiều bước GA12-7-aldehyde sẽ tổng hợp thành GA3. (Nguồn www.aseanbiodiversity.info) 10 2.3 Giới thiệu về gen tef (translation elongation factor 1- ) Theo A.R.Pokalsky và ctv (1989), gen tef là gen mã hĩa cho protein EF-1 . EF-1 là một chuỗi polypeptide cĩ vai trị quan trọng trong sự kéo dài chuỗi polypeptide ở sinh vật nhân thật (eukaryotes). EF-1 xúc tác việc gắn nhĩm aminoacyl tRNAs vào vị trí A của ribosome, phản ứng này địi hỏi GTP. EF-1 cĩ trọng lượng phân tử là 45.000 – 55.000. Nĩ cũng cĩ chức năng tương đồng với EF-Tu (prokaryotic elongation factor), cả hai yếu tố này đều hình thành phức hợp aminoacyl tRNAs và GTP. Gen mã hĩa EF-1 của nhiều lồi đã được tạo dịng và được đọc trình tự. Đĩ là của các lồi nấm men, tơm Artemia sanila, nấm Mucor racemosus và người. Tất cả những gen này mã hĩa các protein cĩ độ tương đồng cao so với những protein khác. Điều hịa sự biểu hiện EF-1 là mối quan tâm của các nhà nghiên cứu do nĩ là một protein đa dạng và cĩ vai trị quan trọng trong việc điều khiển sinh tổng hợp protein. Khi hoạt tính EF-1 tăng thì mơ phát triển do cĩ nhiều protein được tổng hợp. Tuy nhiên hoạt tính EF-1 được điều khiển ở mức mRNA hay protein vẫn chưa được biết rõ (A.R.Pokalsky và ctv., 1989). Dựa vào vùng gen tef cĩ thể phân biệt được giữa các nhĩm với nhau hay giữa lồi cùng nhĩm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn vì chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhĩm lồi (Lại Hà Tố Hoa, 2006). (David M.Geiser và ctv., 2004) Sơ đồ 2.2 Bảng đồ vùng gen tef ở Fusarium trong FUSARIUM-ID. 11 2.4 Tổng quát về giberelins 2.4.1 Đại cƣơng về các chất giberelins Giberelins (GAs) là nhĩm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhĩm auxin. Năm 1950 trong lúc nghiên cứu bệnh “foolish seedling” hay “bakanae disease” các nhà khoa học Nhật Bản thấy rằng bệnh gây ra bởi một chất hĩa học do nấm tiết ra. Chất này được gọi là giberelin. Năm 1930, những nhà khoa học Nhật đã thành cơng trong việc thu tinh thể của hai hợp chất cĩ hoạt tính tăng trưởng tiết ra từ nấm, chúng là giberelin A và B, nhưng do sự giới hạn về giao tiếp và chiến tranh thế thứ hai nên mãi đến giữa năm 1950 cấu trúc của chất này mới được xác định và được đặt là axít giberelic: (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Sau đĩ, năm 1956 ở Anh, J MacMillan lần đầu tiên đã tách thành cơng được giberelin từ hạt đậu Phaseolus vulgaris. Từ đĩ đến nay, người ta đã tách được những giberelin khác nhau trên nhiều lồi cây. Ví dụ: Ở cây lúa chứa 14 loại giberelins, hạt ngơ chứa 12 giberelins và lúa mì chứa 5 giberelins (Đào Văn Hoằng, 2005). Đặc điểm cấu trúc của tất cả giberelins cĩ điểm chung là chúng được chuyển hĩa từ ent-kaurene: Hình 2.4 Cấu tạo axít giberelic. Hình 2.5 Cấu tạo ent-Kaurene. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 12 Sau khi axít giberelic đã được tìm hiểu khá rõ, các nhà thực vật học bắt đầu khảo nghiệm nĩ trên nhiều lồi cây khác nhau. Cĩ những phản ứng kì lạ được thấy ở sự tăng trưởng của những cây lùn và thực vật hoa thị (rosette plants), đặc biệt ở cây đậu Hà Lan lùn (Pisum sativum), cây ngơ lùn (Zea mays) và nhiều cây hoa thị. Ngược lại, ở những cây đã cĩ đặc tính di truyền cao thì sẽ khơng cĩ đáp ứng cao hơn nữa khi dùng giberelins. Gần đây những thí nghiệm trên cây đậu Hà Lan lùn và cây ngơ lùn chứng tỏ sự tăng trưởng tự nhiên của cây được điều hịa bởi giberelins. (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Khơng lâu sau khi phát hiện hiệu quả kích thích tăng trưởng của axít giberelic, những hợp chất giống giberelin được tách từ nhiều lồi cây khác nhau. Hợp chất này cĩ hoạt tính sinh học giống giberelin nhưng cấu trúc hĩa học thì chưa được xác định. Khi ngày càng nhiều GAs từ nấm và thực vật được xác định, chúng được đánh số thứ tự là giberelin Ax (hay GAx) với x là thứ tự phát hiện ra chúng. Tất cả GAs dựa trên cấu trúc của ent-gibbrellane skeleton nhưng đối với từng chất lại cĩ những thay đổi tinh vi làm cho hoạt tính của từng chất trở nên khác nhau. Axít giberelic (GA3) được sản sinh từ nấm Gibberella fujikuroi là giberelin được xác định cấu trúc đầu tiên và là giberelin quan trọng nhất và được nghiên cứu nhiều nhất. Hiện nay cĩ khoảng 136 loại giberelins được tách và xác định cấu trúc từ thực vật, nấm và vi khuẩn ( Mặc dù cĩ nhiều Hình 2.6 Cấu tạo ent-Gibberellane. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 13 loại GAs trong cây nhưng chỉ cĩ một vài GAs cĩ hoạt tính như một hormon, tất cả những loại khác ở dạng tiền chất hay dạng bất hoạt. 2.4.2 Chức năng và vai trị sinh hĩa (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Mặc dù GAs được phát hiện đầu tiên là nguyên nhân gây ra bệnh lúa von nhưng những GAs nội sinh cũng ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển của cây. Ngồi sự kéo dài của thân, GAs cịn kích thích quá trình nảy mầm của hạt bao gồm phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt. Trong quá trình sinh sản của thực vật, giberelin cĩ thể ảnh hưởng đến sự chuyển từ giai đoạn cịn non sang giai đoạn trưởng thành cũng như bắt đầu ra hoa, xác định phái tính của hoa. 2.4.2.1 Giberelins kích thích sự phát triển thân ở những cây lùn và cây hoa thị Giberelin được dùng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở nhiều lồi cây. Tuy nhiên kích thích mạnh nhất được tìm thấy ở những cây lùn và cây hoa thị (rosette plant) cũng như những cây họ hịa thảo. GA3 ngoại sinh gây ra sự kéo dài thân ở những cây lùn bên cạnh đĩ chúng làm thân cây ốm yếu, giảm kích thước lá và lá cĩ màu xanh nhạt. Dùng giberelin giúp thân cây hoa thị phát triển trong những ngày ngắn và sự phát triển thân bình thường được điều hịa bởi giberelin nội sinh. Ngồi ra nhiều cây hoa thị ngày dài địi hỏi điều kiện lạnh cho sự phát triển của than, ra hoa và địi hỏi này được khắc phục bởi việc dùng giberelin. GA cũng đẩy mạnh sự kéo dài của đốt ở những cây hịa thảo (lúa nước là một ví dụ dễ thấy). Mặc dù GAs cĩ tác động mạnh đến sự tăng trưởng của thân nhưng nĩ ít ảnh hưởng trực tiếp lên sự phát triển của rễ. Gần đây, người ta chưa biết rõ ảnh hưởng của Hình 2.7 GA3 kích thích cây bắp cải ra hoa và phát triển cao. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 14 giberelin lên sự tăng trưởng của rễ một cách gián tiếp hay trực tiếp. 2.4.2.2 Giberelins điều hịa sự chuyển hĩa cây con sang giai đoạn trƣởng thành Các nhà nghiên cứu thấy rằng nhiều cây lâu năm khơng ra hoa cho đến khi chúng đạt đến giai đoạn trưởng thành. Giai đoạn non và trưởng thành thường khác nhau về hình dạng lá như cây Thường Xuân ở Anh (Hedera helix), do đĩ việc dùng GAs cả hai hướng này phụ thuộc vào lồi. GA3 cĩ thể gây chuyển hĩa từ giai đọan trưởng thành sang giai đoạn cịn non ở cây Thường Xuân và việc dùng những GAs khơng phân cực như GA4 + GA7 cĩ thể làm cho nhiều cây Tùng Bách non chuyển sang giai đoạn sinh sản. 2.4.2.3 Giberelins ảnh hƣởng đến giai đoạn bắt đầu ra hoa và sự xác định giới tính Giberelins cĩ thể thay thế nhu cầu dài ngày hay khí hậu lạnh để ra hoa ở nhiều cây, đặc biệt cây hoa thị do vậy giberelin được dùng để kích thích ra hoa ở một vài cây. Ở cây cĩ hoa lưỡng tính thì sự xác định giới tính hoa được điều hịa bởi giberelin. Tuy nhiên, nĩ cũng bị ảnh hưởng bởi những nhân tố mơi trường như quang chu kì, dinh dưỡng và các nhân tố này cĩ thể được trung hịa bởi giberelin. 2.4.2.4 Giberelins đẩy mạnh “fruit set” Dùng GAs cĩ thể gây ra “fruit set” (quả bắt đầu tăng trưởng sau khi thụ phấn) và sự tăng trưởng của một vài quả mà auxin khơng cĩ tác dụng. Ví dụ: giberelin kích thích “fruit set” ở cây táo (Malus sylvestris). 2.4.2.5 Giberelins thúc đẩy sự nảy mầm của hạt GAs cần cho một hay nhiều bước trong quá trình nảy mầm của hạt. Giberelin đánh thức quá trình ngủ nghỉ của hạt để bắt đầu nảy mầm. Khi hạt được ngâm vào nước giberelin được giải phĩng, đánh thức và kích thích hạt nảy mầm. Ngồi ra giberelin cịn kích thích sự tạo nhiều hydrolases, đặc biệt -amylase, kích thích tổng hợp chất truyền tín hiệu RNA cho các men, qua đĩ nĩ tác động lên men di truyền. Như vậy tác dụng sinh học của giberelin rất đa dạng tùy thuộc vào từng loại giberelin cũng như lồi cây. 15 2.4.3 Ứng dụng GAs trong thƣơng mại (Lincoln Taiz và ctv., 2002) 2.4.3.1 Trong trồng trọt Sử dụng GAs chủ yếu để làm tăng chiều dài cuống của nho khơng hạt. Giberelin kích thích cuống phát triển dài hơn vì vậy làm cho quả phát triển lớn hơn và đẩy mạnh sự kéo dài của quả. Hỗn hợp benzyladenine (cytokinin) và GA4 + GA7 làm cho quả táo phát triển dài ra và được dùng để cải thiện hình dáng của quả táo loại ngon trong một vài điều kiện. Mặc dù việc xử lý này khơng làm tăng năng suất hay mùi vị, nĩ cũng được mong đợi để thương mại. Ở cây cĩ múi, GAs làm chậm sự già yếu. 2.4.3.2 Sản xuất bia Một trong những ứng dụng quan trọng là dùng để tăng sản lượng mạch nha từ lúa mạch dùng làm rượu bia. GAs được sử dụng để làm nẩy mầm hạt lúa mạch gia tăng tạo ra enzym thủy giải những chất dự trữ trong hạt thành acid amin và đường để thành mạch nha. 2.4.3.3 Tăng sản lƣợng mía Mía (Saccharum officinarum) là một trong số ít cây dự trữ đường thay vì tinh bột (cây dự trữ đường quan trọng khác là củ cải đường). Cĩ nguồn gốc từ New Hình 2.8 Ảnh hƣởng của GA3 đến giống nho khơng hạt của Thompson. (Lincoln Taiz và ctv., 2002) Cĩ xử lý GA3 Khơng xử lý GA3 16 Guinea, mía cĩ thể cao từ 4 – 6 m. Đường được dự trữ ở trung tâm khơng bào của tế bào mơ đốt. Phun giberelin cĩ thể tăng sản lượng mía lên 20 tấn trên mẫu và sản lượng đường 2 tấn trên mẫu. Kết quả này là do kích thích sự kéo dài của đốt trong suốt mùa đơng. 2.4.3.4 Sử dụng trong chọn giống thực vật Phun GA4 + GA7 làm giảm mạnh thời gian tạo hạt. Ngồi ra đẩy mạnh hoa đực ở cây họ bầu bí và kích thích kéo dài thân cây củ cải đường (Beta vulgaris) và bắp cải (Brassica oleracea). Do tác dụng đa dạng của giberelin, người ta cĩ thể căn cứ vào mục đích của từng trường hợp để sử dụng cho hiệu quả. Bản thân các chất giberelin khơng gây dị ứng cho da khi tiếp xúc, khơng nằm trong danh mục các chất gây ung thư hay chất độc do các tổ chức thế giới qui định. Vì vậy chúng được khuyến cáo sử dụng trong nơng nghiệp. Ngày nay trên thế giới cĩ rất nhiều chế phẩm thương mại của giberelin đang sử dụng như Activol, Berelex, Giberelin, Gibrel, Pro-gibb, Pro-gibb plus, regulex. Ở Việt Nam các giberelin cũng đã được sử dụng rộng rãi trên nhiều đối tượng cây trồng: lúa, các loại rau quả, kích thích mủ cao su (Đào Văn Hoằng, 2005). 2.5 Sắc ký lớp mỏng 2.5.1Tổng quát về sắc ký lớp mỏng Sắc lý lớp mỏng là kỹ thuật phân bố rắn lỏng, trong đĩ pha động là chất lỏng được cho đi qua một chất hấp thu trơ (ví dụ silicagel hay oxít nhơm), chất hấp thu này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một lớp phẳng như tấm kính, tấm nhơm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Theo Nguyễn Xuân Dũng và ctv (1985) quá trình thực hiện sắc ký gồm các bước sau: Chuẩn bị bản mỏng Bản mỏng cĩ thể là tấm kính, tấm nhơm hay tấm plastic cĩ tráng một chất hấp thu trơ (silicagel hoặc oxít nhơm). Thơng thường bản cĩ kích thước 5 x 20 cm, 10 x 20 cm, 20 x 20 cm. Đơi khi dùng vật kính cỡ 2,5 x 7,5 cm để phân tích nhanh. 17 Theo tiêu chuẩn Stahl bản cĩ kích thước 10 x 20 cm và 20 x 20 cm. Bề dày của kính từ 2 – 4 mm. Nếu đế bản kim loại thì mỏng hơn nhiều. Dùng kính tốt nhất vì cĩ thể rửa dễ dàng, sử dụng lại và đặc biệt cĩ thể dùng các thuốc hiện ăn mịn mạnh hoặc tác dụng phá hủy mạnh. Nếu cần hiện sắc ký đồ ở nhiệt độ lớn hơn 150oC cần dùng để làm bằng loại thủy tinh bosilic. Đưa mẫu lên bản sắc ký Trước khi chấm mẫu lên bản phải vạch sẵn đường “mức xuất phát‟ cách đáy bản 1 cm và đường “mức tiền tuyến dung mơi” cách đầu trên của bản 0,5 cm. Với bản bán sẵn, dùng viết chì vĩt nhọn vạch nhẹ; với bản tự tráng trong phịng thí nghiệm rất dễ trĩc nên vạch cẩn thận và nhẹ nhàng bằng đầu nhọn của vi quản. Lượng chất và hỗn hợp chất đưa lên bản cĩ ý nghĩa quan trọng đối với kết quả tách sắc ký, đặc biệt ảnh hưởng tới giá trị Rf. Lượng chất lớn làm cho vệt sắc ký lớn và thường kéo dài, các vệt của các chất cĩ giá trị Rf gần nhau bị chồng chập. Lượng chất nhỏ quá cĩ thể khơng phát hiện được do độ nhạt của thuốc thử khơng cho phép. Nếu mẫu là chất lỏng thì sử dụng trực tiếp cịn nếu mẫu là chất rắn hịa tan mẫu bằng loại dung mơi phù hợp (ví dụ như ete, cloroform, nước) để mẫu phải tan hồn tồn. Dung mơi dùng hịa tan mẫu để chấm lên bản là loại dung mơi càng dễ bay hơi; càng ít phân cực càng tốt. Nếu dung mơi dùng để hịa tan mẫu được hấp thu mạnh lên lớp mỏng thì khi dung mơi giải ly đi ngang qua vết chấm tại mức xuất phát, dung mơi giải ly sẽ gây nên những vết bất thường dẫn đến các vết tách được sẽ bị biến dạng nghiêm trọng. Nhúng nhẹ phần đầu nhọn vi quản vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ hút dung dịch mẫu vào vi quản. Chấm nhẹ phần đầu nhọn cĩ chứa mẫu lên bản mỏng, tại một điểm, ở mức xuất phát (đối với các dung dịch nồng độ rất lỗng thì cĩ thể làm giàu trước khi đưa lên bản hoặc cĩ thể làm giàu trực tiếp lên bản bằng cách chấm nhiều lần ở đúng một vị trí, chờ chấm trước khơ mới chấm chấm sau). Nhẹ nhàng để đầu nhọn của vi quản chạm vào bề mặt của lớp mỏng, tránh khơng làm thủng lỗ trên bề mặt này. Chạm vào và lấy vi quản ra thật nhanh để dung 18 dịch mẫu thấm vào bản tạo thành một điểm trịn nhỏ. Thổi hoặc dùng máy sấy tĩc để sấy nhẹ giúp dung mơi bay hơi mau, khơng lan thành vết to. Nếu cần chấm nhiều dung dịch khác nhau lên cùng một tấm bản, các vết cách đáy bản 1 cm; vết này cách vết kia 1 cm; các vết nên cách bờ cạnh của bản 1 – 1,5 cm (để tránh hiệu ứng bờ). Vi quản được sử dụng trở lại sau khi rửa bằng aceton. Sau khi chấm xong nên dùng máy sấy sấy nhẹ để dung mơi bay đi khỏi vết chấm rồi mới nhúng bản vào dung dịch ly giải. Khai triển sắc ký đồ là quá trình tách các cấu tử trên lớp mỏng. Trước khi đặt bản vào trong bình, bình cần được bảo hịa dung mơi để cĩ một bầu khí quyển đồng nhất bằng cách khi ta rĩt dung mơi vào bình cần để một tờ giấy lọc áp sát thành bình và sát đáy bình được tẩm dung mơi. Kích thước của bình và thể tích dung mơi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu cĩ thể. Nếu bình khơng được bão hịa dung mơi thì khi dung mơi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung mơi sẽ cĩ hình lõm do dung mơi đi ở bên cạnh nhanh hơn ở giữa bản. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản ta đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai cĩ kích thước phù hợp (bản phải thẳng đứng hoặc hơi nghiêng một gĩc nhỏ hơn 15 độ so với đường thẳng đứng), dung mơi trong bình phải ngập bản 0,5 cm, tối đa 0,7 cm, nghĩa là cách điểm xuất phát 0,8 – 1 cm. Một hệ dung mơi dung ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho vết chính cĩ giá trị Rf từ 0,3 đến 0,7. Tùy theo hướng chuyển động, cách chuyển động, thành phần dung mơi cĩ thể cĩ các cách khai triển sắc ký đồ sau: + Khai triển theo kiểu dung mơi giải ly di chuyển lên. + Khai triển theo kiểu dung mơi giải ly di chuyển xuống. + Khai triển hai chiều. Hiện sắc đồ: đối với những chất được sắc ký khơng màu hoặc màu rất nhạt, thì sau khai triển ta phải hiện sắc đồ bằng phương pháp hĩa học hoặc quang học, phĩng xạ đối với các đồng vị phĩng xạ. 19 Hình 2.9 Sơ đồ các bước thực hiện TLC Dụng cụ chuẩn bị TLC Chấm mẫu lên bảnTLC Chuẩn bị quá trình ly giải Quá trình ly giải Phát hiện vết trên đèn UV Phun thuốc thử thích hợp lên bản, rồi sấy 120o/5’ Hình 2.9 Sơ đồ các bƣớc thực hiện TLC. 20 2.5.2 Ƣu điểm của sắc ký lớp mỏng Cần ít mẫu. Cĩ thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng một điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ cĩ thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC những hợp chất cĩ tính phân cực mạnh sẽ cĩ sắc ký đồ ở dạng một mũi hấp thu rộng và lài nên khĩ phân biệt được đĩ là một mũi để chỉ sự hiện diện của một chất hay chỉ là tạp bẩn. Sau quá trình giải ly dung mơi sẽ được loại bỏ khỏi tấm bản mỏng trước khi dùng kỹ thuật vật lý hay hĩa học để phát hiện sự hiện diện chất nên khơng phải nghĩ đến vấn đề hậu sắc ký như ở HPLC. 2.5.3 Một số ứng dụng thơng thƣờng của TLC Xác định thành phần các chất trong hỗn hợp. Xác định tính đồng nhất của hai chất. Theo dõi quá trình phản ứng. Xác định hiệu quả của một qui trình tinh sạch của một chất. Xác định điều kiện thích hợp cho sự phân phân tách của sắc ký cột. Theo dõi quá trình sắc ký cột. 2.6 Ứng dụng kỹ thuật PCR để định danh và xác định mối quan hệ di truyền giữa các lồi nấm Kỹ thuật PCR là kỹ thuật sử dụng những cặp mồi “oligonucleotide” để khuếch đại một đoạn DNA đặc biệt nào đĩ trong một qui trình cĩ tính chất tự động hĩa. Cĩ rất nhiều ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nghiên cứu khoa học cũng như trong thương mại. Trong đĩ kỹ thuật PCR đặc biệt cĩ ý nghĩa quan trọng đối với các nhà Bảo vệ Thực vật vì kỹ thuật này giúp họ định danh đúng tên lồi sinh vật gây bệnh một cách chính xác mà điều này khĩ thực hiện được nếu dựa vào hình thái và khả năng tạo độc tố của nấm. Bên cạnh đĩ phản ứng PCR thì nhanh và nhạy hơn các kỹ thuật vi sinh khác. Phản ứng vẫn tiến hành tốt với một lượng mẫu rất ít và khơng cần đến sự cĩ mặt của vi sinh vật. Điều đĩ được 21 Kamel A. Abd-Elsalam và ctv (2003) chứng minh khi thực hiện phản ứng PCR bằng cặp mồi ITS-Fu-f và ITS-Fu-r và phản ứng này vẫn nhạy khi nồng độ DNA của F. oxysporum trong khoảng 10 ng – 100 fg. Ví dụ: Dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen tef của các lồi nấm thuộc giống Fusarium bằng cặp mồi ef1-ef2 để tạo nền tảng cho việc định danh đúng các lồi thuộc giống này đặc biệt là các lồi thuộc phức hệ Gibberella fujikuroi, phức hệ F.solani, F.oxysporum và những lồi tạo trichothecene loại A và B (David M. Geiser và ctv., 2004). 22 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2007 đến 08/2007. 3.1.2 Địa điểm thực hiện Phân lập và tách đơn bào tử tại phịng bệnh cây, Bộ Mơn Bảo Vệ Thực Vật, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. Nhân sinh khối nấm Fusarium moniliforme tại Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. Ly trích DNA tại Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. Tiến hành PCR tại Phịng Thí Nghiệm Cơng Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. Tiến Hành Sắc Ký Lớp Mỏng tại Phịng Hĩa Lý – Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. 23 3.2 Vật liệu nghiên cứu Bảng 3.1 Các dịng nấm Fusarium moniliforme đƣợc thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long trong tháng 02/2007 và tháng 05/2007. STT Kí hiệu các dịng nấm F.moniliforme Giống Lúa Địa điểm lấy mẫu 1 FM1 Jasmine 85 Thốt Nốt – Cần Thơ 2 FM2 Jasmine 85 Ơ Mơn – Cần Thơ 3 FM3 OM 2517 Cờ Đỏ - Cần Thơ 4 FM4 OM 2518 Ơ Mơn – Cần Thơ 5 FM5 OM 2518 Châu Thành – An Giang 6 FM6 Jasmine 85 Châu Phú – An Giang 7 FM7 OM 2517 Chợ Mới – An Giang 8 FM8 OM 2514 Thoại Sơn – An Giang 9 FM9 OM 2517 Càng Long – Trà Vinh 10 FM10 Jasmine 85 Châu Thành – Trà Vinh 11 FM11 OM 504 dịng 2 Tiểu Cần – Trà Vinh 12 FM12 OM 4698 Càng Long – Trà Vinh 13 FM13 Jasmine 85 Mỹ An – Đồng Tháp 14 FM14 OM 2518 Tháp Mười – Đồng Tháp 15 FM15 OM 4655 Châu Thành – Đồng Tháp 16 FM16 OM 2517 Mỹ An – Đồng Tháp 17 FM17 OM 4698 Châu Thành – Kiên Giang 18 FM18 Jasmine 85 An Biên – Kiên Giang 19 FM19 OM 1490 Tân Hiệp – Kiên Giang 20 FM20 OM 2517 Châu Thành – Kiên Giang 24 3.3 Vật liệu và phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1 Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1 Dụng cụ và hĩa chất thí nghiệm Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, que cấy các loại, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, nồi hấp, tủ sấy, máy lắc, bơng gịn khơng thấm, bút lơng, giấy thấm, máy khuấy từ, cá từ. Mơi trường agar nước (Water agar), PDA (Potato dextrose agar), mơi trường nhân sinh khối. Nước cất. *Cách pha mơi trường nhân sinh khối Thành phần mơi trường nhân sinh khối chứa trong một lít nước gồm: Glucose 20g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4 0,5g Yeast extract 5g CaCl2 1 ít Cho hỗn hợp trên vào trong becher 1 lít khuấy cho tan hết bằng máy khuấy từ. Rĩt vào mỗi bình tam giác 100 ml. Đậy bình bằng nút bơng và giấy bạc. Rồi đem hấp ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. *Cách pha mơi trường agar nước (WA – water agar) Cho 20 g agar vào 1 lít nước cất đun sơi khuấy đều rồi đem hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 15 phút sau đĩ cho vào đĩa petri, mỗi đĩa khoảng 15 ml. *Cách pha mơi trường PDA Mơi trường PDA là mơi trường giàu cacbo hydrate chứa: Dextrose 20g Agar 15g Khoai tây 200g Nước 1 lít 25 Khoai tây bào vỏ, rửa sạch, thái nhỏ nấu khoảng 1 giờ. Lọc lấy nước trong. Cho vừa đủ lượng agar, nước và đường khuấy đều trong lúc nấu. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. 3.3.1.2 Phƣơng pháp phân lập nấm Nấm được phân lập từ mẫu lúa bệnh theo các bước sau: Mẫu đưa về phịng thí nghiệm khử trùng bằng cồn 70oC. Cắt mẫu bệnh thành những đoạn nhỏ cĩ kích thước 3 – 5 mm sau đĩ ủ trên mơi trường agar nước để hạn chế nhiễm khuẩn. Ủ 2 – 3 ngày lấy sợi nấm mọc trên mẫu bệnh sang mơi trường WA. Ủ 2 ngày dùng dao cấy cắt miếng thạch cĩ sợi nấm sang PDA. Thấy khuẩn lạc đặc trưng của nấm Fusarium moniliforme sau 5 – 7 ngày ủ. Tiến hành tách đơn bào tử của nấm. 3.3.1.3 Phƣơng pháp cắt đơn bào tử Sau khi phân lập được dịng nấm mong muốn thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Qui trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau: Lấy khuẩn lạc nấm trên mơi trường PDA cho vào cốc nước cất đã khử trùng. Quan sát dưới kính hiển vi để xem lượng bào tử đã thích hợp chưa nếu quá nhiều bào tử ta tiến hành pha lỗng tiếp đến khi nồng độ thích hợp. Dùng pipet hút 10 µl dung dịch bào tử lên lam cĩ trải một lớp mỏng agar rồi trang đều sau đĩ ủ 12 giờ ở nhiệt độ phịng. Tiến hành quan sát trên kính hiển vi tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ rồi dùng dao cấy cắt vùng thạch chứa bào tử đĩ, cấy vào đĩa petri chứa mơi trường WA. Đem ủ ở nhiệt độ phịng 2 – 3 ngày rồi cấy sang PDA. Đem ủ ở nhiệt độ phịng 3 – 5 ngày bào tử sẽ mọc thành khuẩn lạc cĩ màu đặc trưng của nấm. 26 3.3.1.4 Phƣơng pháp nhân sinh khối Chuẩn bị mơi trường nhân sinh khối (Mục 3.3.1.1). Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong mơi trường đã chuẩn bị. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc từ 150 – 200 vịng/phút ở 26 – 30oC. Nên kiểm tra trong 2 ngày đầu vì rất dễ nhiễm khuẩn. Sau 3 – 5 ngày tiến hành thu sinh khối bằng cách lọc trên vải lọc đã hấp khử trùng. Đặt sinh khối nấm vào giấy bạc rồi cất vào tủ -70 C. 3.3.2 Phƣơng pháp ly trích DNA của nấm 3.3.2.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm Nitơ lỏng Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -mecaptoethanol. Phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Chloroform/isoamylalcohol (24:1). Isopropanol. Ethanol 70%. TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0. Dụng cụ thí nghiệm gồm cĩ: cối và chày để nghiền mẫu nấm, máy vortex, bồn ủ nhiệt Memmert, máy ly tâm, eppendorf, micropipette và đầu típ các loại. 3.3.2.2 Phƣơng pháp ly trích DNA Qui trình 1: DNA của nấm được ly trích theo qui trình Lee và Taylor cải tiến (Kurt Weising và ctv., 1995). Qui trình cĩ thay đổi một số bước cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Các bước ly trích DNA như sau: Bước 1: Mẫu nấm được nghiền trong nitơ lỏng cho đến mịn (trong lúc nghiền cho liên tục nitơ lỏng vào để mẫu nấm khơng bị tan). Cho mẫu nấm đã được nghiền mịn vào eppendorf. Bước 2: Thêm 400 l lysis buffer, vortex cho đến khi hỗn hợp đồng nhất. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer. Ủ ấm ở 65oC trong vịng 1 giờ. 27 Bước 3: Thêm vào 400 l phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1). Lắc đều, nhẹ. Ly tâm 14000 vịng/15phút ở nhiệt độ phịng. Hút lấy phần dịch nổi ở trên vào eppendorf mới. Bước 4: Thêm vào eppendorf mới 400 l chloroform/isoamylalcohol (24:1). Trộn đều, ly tâm 14000 vịng/10 phút/28oC. Hút lấy phần dịch nổi ở trên cho eppendorf khác. Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của ống nghiệm để tủa DNA. Lắc nhẹ, ủ ít nhất 30 phút ở 4oC. Ly tâm 14000vịng/15phút/ 28oC. Bước 6: Dùng que thu DNA tủa ở đáy ống. Rửa DNA tủa nhiều lần bằng ethanol 70%. Bước 7: Phơi DNA đến khơ rồi hịa tan DNA mẫu trong dung dịch TE 1X và giữ ở 4oC hay -20oC. Qui trình 2: Ở bước 3 chỉ thay phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/isoamylalcohol (24:1). 3.3.2.3 Định tính DNA Định tính DNA của nấm sau khi ly trích bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8% - 1% theo các bước sau: Chuẩn bị gel agarose bằng cách: Cân 0,15 g agarose cho vào 15 ml TAE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nĩng trong lị viba ở 650W trong 2 phút. Để nhiệt độ trong chai giảm xuống dần, đổ vào khuơn cĩ gắn lược với số giếng mong muốn. Chờ gel đơng, lấy lược ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Nạp mẫu, điện di và đọc kết quả: dùng micropipette hút lấy 4 l mẫu, trộn đều với 2 l loading buffer 6X, hút tổng lượng thể tích là 6 l bơm vào giếng tương ứng đã bố trí sẵn. Lần lượt bơm các mẫu khác đã được trộn đều với thuốc nhuộm vào tất cả các giếng cịn lại. Tiến hành điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 0,5X, hiệu điện thế là 100V, cường độ dịng điện 400mA trong 20 phút. Kết thúc quá trình điện di, bảng gel được chuyển vào thuốc nhuộm ethidium 28 bromide (1%) trong khoảng 15 – 20 phút, rửa sạch gel bằng nước máy và đọc kết quả bằng phần mềm Quality One của máy Gel doc 2000 (Biorad). 3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm ly trích DNA tổng số sau khi ly trích thường cĩ nhiều tạp cĩ thể do các nguyên nhân sau chưa loại bỏ hết protein, DNA bị gãy, tạp nhiễm RNA. Do đĩ trước khi tiến hành PCR, DNA tổng số nên được tinh sạch theo qui trình dưới đây: Bước 1: Pha lỗng mẫu ly trích với TE 1X hay nước cất vơ trùng theo tỷ lệ 3 mẫu : 1 TE 1X (hay nước). Bước 2: Hút 200 l hỗn hợp chloroform/isoamylalcohol (24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ. Bước 3: Đem ly tâm hỗn hợp ở 9800 vịng ở 10oC trong thời gian 10 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác. Bước 4: Lập lại bước 2 và 3. Bước 5: Thêm vào isopropanol lượng chất bằng 0,6 tổng thể tích của eppendorf. Ủ -20oC trong 30 phút. Bước 6: Ly tâm 9800 vịng trong 20 phút. Loại bỏ dịch nổi. Bước 7: Rửa DNA 2 lần bằng ethanol 70%. Bước 8: Phơi mẫu ở 37oC cho đến khơ rồi cho TE 1X vào. 3.3.3 Khuếch đại vùng tef của nấm Gibberella fujikuroi bằng kỹ thuật PCR 3.3.3.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm Trình tự 2 mồi được dùng trong phản ứng PCR để khuếch đại vùng tef. Mồi xuơi: 5‟-ATG GGT AAG GA(A/G) GAC AAG AC- 3‟ Mồi ngược: 5‟-GGA (G/A)GT ACC AGT (G/C)AT CAT GTT-3‟ Dụng cụ thí nghiệm: Máy PCR. Micropippette, đầu típ, eppendorf các loại. Lị vi sĩng. Cân kỹ thuật 4 số. 29 Bồn điện di . 3.3.3.2 Thực hiện phản ứng Bảng 3.2 Thành phần một phản ứng PCR Thành phần Nồng độ đầu Liều lƣợng phản ứng Nồng độ cuối 5X Buffer 5X 10 1X MgCl2 25 mM 3 1.5 mM dNTP 25 mM 0,4 0.2 mM EF1 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l EF2 10 pmol/ l 1 10 pmol/ l Taq polymerase 5 u/ l 0,2 1.25 u DNA mẫu 1 Nước Vừa đủ phản ứng 50 l Chu kì nhiệt của phản ứng PCR Giai đoạn 1: 95oC trong 3 phút Giai đoạn 2: Bước 1: 95oC trong 30 giây Bước 2: 53oC trong 45 giây 30 chu kỳ Bước 3: 72oC trong 45 giây Giai đoạn 3: 72oC trong 7 phút 3.3.3.3 Đánh giá sản phẩm PCR Thực hiện tương tự Mục 3.3.2.3. 3.4 Sắc ký lớp mỏng (TLC) phát hiện GA3 3.4.1 Hĩa chất và dụng cụ thí nghiệm Các dụng cụ dùng trong sắc ký như sau: máy khuấy từ, cá từ, máy đo pH, máy lắc, nồi hấp, giấy lọc, phễu, máy cơ quay, bình cầu, bình lắng, ống đong thể 30 tích 50 ml, pipet các loại, kẹp, kéo, bình ly giải, becher các loại, ống mao quản, bản mỏng, bình tam giác các loại, tủ sấy, đèn UV. Các hĩa chất: chloroform, methanol, acid acetic, acid sulfuric, ethanol, acetone, ethyl acetate, acid chlohydride 0,5N, natri bicarbonate. Thành phần mơi trường ICI: Glucose 80g MgSO4 5g KH2PO4 1g NH4NO3 5g Nước 1 lít 3.4.2 Phƣơng pháp sản xuất GA3 Chuẩn bị mơi trường 20% ICI như Mục 3.4.1. Cho 100 ml mơi trường vào mỗi bình tam giác 250 ml. Đem hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Lấy 0,1 ml dịch nấm cho vào bình chứa mơi trường. Lắc 200 vịng/phút ở 28oC trong vịng 7 ngày. 3.4.3 Phƣơng pháp trích GA3 Lọc dịch nấm bằng giấy lọc để loại bỏ sinh khối. Sau đĩ tiến hành trích mẫu theo qui trình phân tích GA3 của phịng Hĩa Lý, Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Trường Đại Học Nơng Lâm Tp.HCM. Dịch nuơi cấy Chỉnh pH=2,5 bằng HCl 0,5N Trích 3 lần bằng ethyl acetate (50 ml) Trích 3 lần với NaHCO3 8% Sắc ký lớp mỏng Pha nước (lớp dưới) Bỏ Pha ethyl acetate (lớp trên) 31 3.4.4 Định tính GA3 bằng TLC Qui trình định tính GA3 được xây dựng theo phương pháp của MacMillan (1963) trong đĩ chúng tơi đã thay đổi hệ dung mơi giải ly cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm: Sơ đồ 3.1 Qui trình trích GA3. Chấm mẫu lên bản sắc ký cĩ chất hấp thụ Silicagel Ly giải trong hệ dung mơi CHCl3:EtOAc:AcOH [60:40:5] Phun bản bằng EtOH:H2SO4[95:5] Sấy bản 120oC trong 5 phút Phát hiện GA3 bằng đèn UV (365nm) Sơ đồ 3.2 Qui trình TLC phát hiện GA3. 32 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu mẫu bệnh lúa von ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long Bệnh lúa von do nấm gây ra, cĩ giai đoạn vơ tính là Fusarium moniliforme và giai đoạn hữu tính là Gibberella fujikuroi (B.Tudzynski, 1999). Trong quá trình sinh trưởng và phát triển nấm tạo ra GAs làm cho cây lúa phát triển chiều cao vì thế gây ra các triệu chứng đặc trưng của bệnh lúa von. Dựa vào triệu chứng đặc trưng này là cây mạ bị nhiễm bệnh vươn dài ra cao hơn hẳn cây lúa bình thường, cĩ bộ lá mỏng màu xanh vàng, thối rễ và bị chết. Ở giai đoạn đẻ nhánh, cây bị bệnh ít nở bụi, gầy và cao, lá địng cĩ màu xanh vàng dễ nhận biết cao hơn lên hẳn phía trên tầng lá bình thường của ruộng, lĩng phát triển dài ra, thường mọc nhiều rễ phụ ở đốt (rễ giĩ) và cĩ thể thấy lớp phấn trắng phớt hồng bao quanh đốt thân và vị trí xung quanh đốt thân. Chúng tơi đã thu thập được 20 mẫu bệnh thuộc các giống Jasmine 85, OM 2517, OM 2514, OM 4655, OM 2518, OM 4698, OM 504 dịng 2 tại các tỉnh được biểu thị ở Bảng 3.1. Trong nhiều vụ lúa vừa qua, bệnh lúa von đã phát triển nặng trên một số giống lúa như Jasmine 85, OM 2517, IR42 ở An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ, Sĩc Trăng, Trà Vinh ( Thực tế thu mẫu cho thấy giống lúa Jasmine 85 và OM 2517 bị nhiễm bệnh lúa von nhiều hơn các giống khác (Hình 4.1a và Hình 4.1b). Cả hai ruộng lúa này đều ở Huyện Càng Long Tỉnh Trà Vinh tại thời điểm 01/05/2007 và đều bị nhiễm bệnh lúa von nhưng ở Hình 4.1a là ruộng được trồng với giống OM 4698 (nhiễm ít) cịn ruộng ở Hình 4.1b thì được trồng bằng giống OM 2517 (nhiễm nhiều). Vậy để hạn chế lúa bị nhiễm bệnh nên tiến hành các biện pháp phịng trừ sau: gieo cấy các giống lúa ít mẫn cảm với bệnh; khơng dùng hạt giống từ những hạt bị bệnh; xử lý hạt giống bằng nước nĩng 54oC hoặc thuốc hĩa học trừ nấm cĩ hiệu quả trong việc phịng trừ 33 bệnh lúa von (Phạm Văn Biên và ctv., 2003). Ngồi ra, theo S.H.Ou (1985) bào tử nấm Fusarium moniliforme cĩ thể tồn tại trong đất 4 tháng do đĩ nên xử lý đất sau khi thu hoạch và trồng cách vụ để hạn chế tối đa sự phát sinh của mầm bệnh. Ghi chú: các mũi tên chỉ cây lúa nhiễm bệnh lúa von. 4.2 Kết quả phân lập và tách đơn bào tử Sau 2 – 3 ngày đặt mẫu bệnh (3 mm x 3 mm) trên mơi trường WA (mơi trường nghèo dinh dưỡng nên loại sự tạp nhiễm trên mẫu bệnh), từ mẫu bệnh xuất hiện sợi nấm mọc lên trên mẫu và lan ra mơi trường (Hình 4.2). Hình 4.1 Ruộng lúa bị nhiễm bệnh lúa von ở Càng Long – Trà Vinh ngày 01/05/2007. (a) giống OM 4698 bị nhiễm nấm F.moniliforme; (b) giống OM 2517 bị nhiễm nấm F.moniliforme. (a) (b) Mẫu bệnh Sợi nấm mọc trên mẫu bệnh Hình 4.2 Mẫu bệnh sau 3 ngày ủ trên mơi trƣờng WA. 34 Hình 4.4 Màu khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme trên mơi trƣờng PDA sau 7 ngày cấy. Dùng que cấy lấy một ít sợi nấm trên mẫu bệnh sang mơi trường WA, sau 2 – 3 ngày sợi nấm mọc lan ra mơi trường. Tiến hành tách một phần mơi trường cĩ sợi nấm sang đĩa mơi trường PDA (mơi trường để tạo dịng thuần các dịng nấm và dùng để định danh nấm dựa vào hình thái), tiếp tục nuơi cấy ở nhiệt độ phịng. Sau 5 – 7 ngày thu được khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme cĩ những đặc điểm (Hình 4.3) như : màu trắng nhạt, mọc tỏa ra theo cấu trúc hình trịn, bề mặt khuẩn lạc xốp kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Trần Tùng (2005). Theo Lester W. Burgess và ctv (1994), khuẩn lạc nấm Fusarium moniliforme khi được nuơi cấy trên mơi trường PDA cĩ màu sắc rất đa dạng như khơng màu, cam nhạt (bright organe hay pale organe), xám tím (violet grey), tím đậm (dark violet) hoặc đỏ đậm (dark magenta). Trong 20 dịng nấm được phân lập thu được 18 dịng cĩ khuẩn lạc màu cam nhạt và 2 dịng cĩ màu đỏ đậm. Hình 4.3 Khuẩn lạc nấm F.moniliforme sau 7 ngày cấy. 35 Để khẳng định mẫu nấm thu được là Fusarium moniliforme tiếp tục xem bào tử dưới kính hiển vi. Kết quả nhận thấy đại bào tử (Hình 4.5) và tiểu bào tử (Hình 4.6). Quan sát đại bào tử và tiểu bào tử của các dịng nấm được phân lập dưới kính hiển vi ở vật kính 40X chúng tơi ghi nhận được các đặc điểm giống như mơ tả của (Vũ Triệu Mân và ctv., 1998): đại bào tử của nấm Fusarium moniliforme thanh mảnh, dài, hai đầu nhọn, hơi cong hình lưỡi liềm hay gần thẳng cĩ một cái mĩc ở đỉnh và cĩ 3 – 5 vách ngăn và tiểu bào tử cĩ hình trứng dẹt, khơng cĩ hoặc cĩ một vách ngăn. Sau khi thu được các dịng nấm cĩ khuẩn lạc thuần, tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền (Trích Ngơ Quang Hưởng, 2006) và hạn chế đột biến trong quá trình nuơi cấy (Paul E. Nelson, 1992). Dựa vào các đặc điểm trên chúng tơi tiến hành tách đơn bào tử theo Mục 3.3.1.3. Và tách thành cơng đơn bào tử của 20 dịng nấm được phân lập. 4.3 Kết quả nhân sinh khối Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Dùng dao cấy cắt 3 mẫu thạch chứa sinh khối nấm (mỗi mẫu kích thước khoảng 9 mm2) đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh khối. Các bình tam giác này chứa mơi trường nhân sinh khối và được lắc ở 160 vịng/phút, ở nhiệt độ 28 C. Nấm Hình 4.5 Đại bào tử F.moniliforme (xem ở vật kính 40X). Hình 4.6 Tiểu bào tử F.moniliforme (xem ở vật kính 40X). 36 được nhân sinh khối trong mơi trường lỏng nhằm tạo điều kiện cho khuẩn lạc nấm tiếp xúc với mơi trường nhiều hơn từ đĩ tăng nhanh sinh khối. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khĩ phát hiện bị nhiễm khuẩn trong khi lắc. Để đảm bảo khơng bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến hành quan sát kỹ dịch lỏng, thơng thường mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị đục trong khi lắc. 4.4 Kết quả ly trích DNA của nấm Sợi nấm được thu nhận sau khi nhân sinh khối các dịng nấm và được tiến hành ly trích DNA tổng số theo qui trình 1 nêu ở Mục 3.3.2.2. Kết quả ly trích được thể hiện ở Hình 4.7. Sản phẩm điện di DNA tổng số ly trích theo qui trình 1 cĩ quá nhiều tạp, do đĩ chúng tơi đã tiến hành ly trích DNA theo qui trình 2 là thay thế bước xử lý phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) bằng chloroform/Isoamyl alcohol (24:1) thì hạn chế được lượng DNA đứt gãy (Hình 4.8). Tạp Hình 4.7 Kết quả ly trích DNA theo qui trình 1. 37 Ghi chú: (1) FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM6; (7) FM7; (8) FM8; (9) FM9; (10) FM10; (11) FM11; (12) FM12; (13) FM13; (14) FM14; (15) FM15; (16) FM16; (17) FM 17; (18) FM18; (19) FM19; (20) FM20. Thời gian ở các lần ly tâm của qui trình Lee và Taylor cải tiến 10 – 15 phút do đĩ đã tăng thời gian để phá hủy lớp vỏ tế bào, lớp màng nhân, loại bỏ protein và cũng giúp cho sự phân lớp giữa phần dịch tế bào chứa DNA, lớp xác tế bào và protein tốt hơn vì vậy loại bỏ được nhiều tạp trong quá trình ly trích mặc dù qui trình này khơng dùng proteinase K để loại bỏ các protein và RNase để loại bỏ RNA. Bên cạnh đĩ, phenol cĩ thể làm đứt gãy DNA. Do đĩ khi tiến hành ly trích với qui trình 2 chúng tơi thu được kết quả tối ưu hơn qui trình 1. Theo Hình 4.8, DNA của các dịng FM12, FM13, FM14, FM17, FM19 cĩ lượng tạp rất ít nên cĩ thể tiến hành 15 12 13 14 16 17 18 19 20 DNA tổng số Phần tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 9 Hình 4.8 Kết quả ly trích DNA của 20 dịng nấm Fusarium moniliforme theo qui trình 2. 38 chạy PCR sau khi pha lỗng 10 lần bằng TE 1X hoặc nước khử ion. DNA của các dịng nấm cịn lại do lượng tạp tương đối nhiều nên phải tiến hành tinh sạch lại. 4.5 Kết quả PCR Theo David và ctv (2004) một trong những trở ngại lớn khi nghiên cứu Fusarium là việc định danh lồi dựa vào hình thái, độc tố hoặc khả năng gây bệnh vì những đặc điểm phân chia lồi dựa vào hình thái chưa rõ ràng đồng thời cũng cĩ nhiều biến đổi và đột biến trong quá trình nuơi cấy. Để giải quyết vấn đề này các tác giả trên đã tạo ra Fusarium ID.v.1.0 – dữ liệu trình tự DNA của vùng tef để xác định nhanh và chính xác các nấm tạo độc tố trichothecene loại B và phức hệ lồi Gibberella fujikuroi; Fusarium oxysporum; Fusarium solani. Vùng gen tef cĩ thể phân biệt được giữa các nhĩm với nhau hay giữa lồi cùng nhĩm. Vùng tef được nghiên cứu nhiều hơn do chứa trình tự DNA đặc trưng cho từng nhĩm lồi (Trích Lại Hà Tố Hoa, 2006). Đặc biệt đối với Fusarium vùng gen tef mã hĩa những protein thiết yếu trong quá trình dịch mã và rất hữu ích để xác định nguồn gốc phát sinh lồi. Ngồi ra gen này là bản sao đơn bền vững ở Fusarium và nĩ cho mức độ đa hình cao ở các lồi cĩ quan hệ gần gũi từ đĩ tef trở thành cơng cụ định danh Fusarium dựa trên locus đơn. Trên cơ sở đĩ chúng tơi sử dụng cặp mồi ef1 và ef2 được thiết kế bởi O‟Donnell và ctv (1998) để khuếch đại vùng gen tef của 20 dịng nấm Fusarium spp. gây bệnh lúa von ở các tỉnh Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Kết quả thu được sản phẩm khuếch đại của 14 dịng nấm cĩ kích thước gần bằng 700 bp rõ và ít tạp. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của David và ctv (2004). Bên cạnh đĩ kết quả PCR (Hình 4.9) cũng cho thấy sản phẩm PCR của các dịng nấm Fusarium moniliforme được thu thập trên các giống lúa ở các tỉnh ĐBSCL đều cĩ kích thước của vùng tef bằng nhau. Hạn chế của đề tài là chúng tơi chưa tiến hành PCR hết tất cả các dịng nấm được phân lập. 39 4.6 Kết quả định tính GA3 bằng TLC GAs là nhĩm hormon thực vật quan trọng thứ hai sau nhĩm auxin do những ứng dụng đa dạng của nĩ đối với sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản của cây trồng như kích thích sự kéo dài của đốt, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của hạt và xác định phái tính của hoa (Lincoln Taiz và ctv., 2002). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện được hơn 136 loại giberelins tiết ra từ vi khuẩn, nấm và thực vật ( Trong đĩ, nấm Gibberella fujikuroi gây bệnh lúa von sản xuất nhiều GA3. Vì vậy chúng tơi tiến hành nuơi 20 dịng nấm Fusarium moniliforme được phân lập trên mơi trường sản xuất GA3 – 20% ICI trong 7 ngày trên máy lắc 200 vịng/phút/28oC (Stefan Malonek và ctv., 2005). Sau đĩ tiến hành trích GA3 như Mục 3.4.3 rồi thực hiện TLC theo Mục 3.4.4. Kết quả nuơi 20 dịng nấm Fusarium moniliforme trong mơi trường 20% ICI tốt, khơng bị nhiễm trong quá trình nuơi cấy. Để kiểm tra giới hạn phát hiện GA3 của chuẩn chúng tơi tiến hành TLC chất chuẩn ở các nồng độ 1, 5, 10, 50 và 100 ppm. Kết quả các chuẩn ở nồng độ 1 và 5 ppm thấy khơng hiện vết khi quan sát dưới đèn UV, cịn các chuẩn 10 và 50 ppm thì hiện vết mờ vì thế chúng tơi chọn chuẩn 100 ppm để tiến hành cùng với mẫu. Hình 4.9 Sản phẩm PCR đƣợc khuếch đại từ DNA của các dịng Fusarium moniliforme bằng cặp primer ef1-ef2. (1) DNA được khuếch đại từ dịng nấm FM1; (2) FM2; (3) FM3; (4) FM4; (5) FM5; (6) FM7; (7) FM8; (M) ladder; (8) FM9; (9) FM11; (10) FM12; (11) FM14;(12) FM15; (13) FM16; (14) FM18. 4 9 1 2 3 5 6 7 10 8 11 12 13 14 M 700bp 40 Trong 20 mẫu nấm sau khi nuơi cấy, trích GA3 và tiến hành TLC trên hệ dung mơi chloroform: ethyl acetate: acid acetic (60:40:5) chúng tơi nghi ngờ 3 dịng nấm FM2, FM5 và FM15 cĩ thể tạo ra GA3 trong mơi trường nuơi cấy (Hình 4.10). Các dung dịch nuơi cấy 17 dịng cịn lại khơng hiện vết tại vị trí cĩ Rf tương đương với chuẩn. Theo Hình 4.10 nhận thấy vết đầu tiên trên bản TLC từ dưới lên của dung dịch nuơi cấy 3 dịng nấm FM2, FM5 và FM15 tương ứng với vị trí số 1, 2, 4 cĩ giá trị Rf tương đương với vết GA3 chuẩn 100 ppm ở vị trí số 3 (Rf=0,12). Ghi chú: (1); (2); (4) tương ứng là dung dịch nuơi cấy các dịng nấm FM2, FM5 và FM15. (3) chuẩn GA3 100 ppm. Tuy nhiên chúng tơi tiến hành trên hệ dung mơi chloroform:methanol:acid acetic (85:15:5) (Đỗ Thị Di Thiện, 2005) phân cực hơn hệ dung mơi cũ nhằm khẳng định Rf của các vết từ dung dịch nấm cĩ tương đương với vết chuẩn GA3 hay khơng. Kết quả thu được Rf của 3 mẫu thấp hơn Rf của chất chuẩn. Ngồi ra dựa vào Hình 4.10, các vết khác ở các mẫu cĩ thể là các giberelins khác do nấm tiết ra trong quá trình nuơi cấy. Thật vậy, theo tác giả Nguyễn Văn Uyển (1989), dung dịch nuơi cấy một số chủng nấm lúa von Gibberella fujikuroi đã phát hiện sự tồn tại của 25 loại giberelin. Từ những kết quả trên nhận thấy qui trình thực hiện trên 20 dịng nấm khơng hiệu quả do một số nguyên nhân sau: điều kiện nuơi cấy nấm, qui trình trích GA3 chưa tối ưu và nồng độ GA3 trong dung dịch nuơi cấy nấm quá thấp. Hình 4.10 Kết quả TLC dịch nấm sau khi nuơi cấy các dịng nấm F.moniliforme trong mơi trƣờng 20% ICI. 41 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Đã phân lập và tách đơn bào tử được 20 dịng nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von trên các ruộng lúa ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Cĩ thể áp dụng qui trình 2 ở Mục 3.3.2.2 để tiến hành ly trích DNA của nấm Fusarium moniliforme. Qui trình PCR ở mục 3.3.3.2 ổn định cho sản phẩm rõ và khơng cĩ tạp nên dùng để phân tích PCR trên vùng tef của nấm Fusarium moniliforme. Đã chạy thành cơng 14/20 dịng nấm được phân lập. Trong 20 dịng nấm, chưa phát hiện được dịng nào sản xuất GA3 trong mơi trường 20% ICI bằng TLC. 5.2 Đề nghị Tiến hành thí nghiệm chủng nấm in vitro từ đĩ cĩ thể xác định được dịng nấm cĩ độc tính mạnh nhất cĩ nghĩa là tìm dịng nấm nào tạo nhiều GA3 nhất. Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR rồi đem kết quả đọc trình tự so sánh với trình tự trên Genbank để cĩ thể xác định rõ lồi gây bệnh. Tìm điều kiện nuơi cấy thích hợp và quy trình trích giberelin hiệu quả để nấm Gibberella fujikuroi cĩ khả năng sản xuất giberelin. 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu trong nƣớc 1. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh gây hại cây trồng, quyển 1, cây lương thực, thực phẩm, hoa cảnh. Nhà xuất bản nơng nghiệp. Trang 123 – 125. 2. Bùi Chí Bửu, Ngyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nơng nghiệp. Trang 331 – 348. 3. Nguyễn Xuân Dũng và Phạm Hùng Việt, 1985. Các phương pháp sắc ký. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 225 – 297. 4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 5. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma dựa vào trình tự vùng ITS-rDNA và vùng tef.. Khĩa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. 6. Đào Văn Hoằng, 2005. Kỹ thuật tổng hợp các hĩa chất bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội. Trang 317 – 320. 7. Ngơ Quang Hưởng, 2006. “Phân tích đa dạng di truyền của quần thế nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) tại Lai Khê (Bến Cát – Bình Dương) bằng kỹ thuật RFLP – PCR”. Khĩa luận tốt nghiệp Kỹ sư Cơng nghệ sinh học, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. 8. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề, 1998. Bệnh cây nơng nghiệp. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. Trang 82 – 84. 9. Đỗ Thị Di Thiện, 2005. Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự ảnh hưởng của cây Hơng (Paulownia fortunai) và cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L. cv samsum) nuơi cấy invitro. Khĩa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên. 10. Trần Tùng, 2005. Bệnh hại hạt lúa giống sau khi thu hoạch và ảnh hưởng của biện pháp xử lý thuốc hĩa học đến tác nhân gây bệnh, chất lượng hạt giống. Luận án thạc sĩ khoa học nơng nghiệp, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. 43 11. Nguyễn Kim Phi Phụng. Các phương pháp nhận danh , trích ly cơ lập các hợp chất hữu cơ. Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 2000 – 2001. Trang 1 – 25. 12. Nguyễn Văn Uyển, 1989. Các chất sinh trưởng trong nơng nghiệp. Nhà xuất bản TP.HCM. Trang 18 – 49. 13. Tài liệu qui trình phân tích các hormon thực vật. Phịng Hĩa Lý, Viện Cơng Nghệ Sinh Học và Cơng Nghệ Mơi Trường, Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. 2. Tài liệu nƣớc ngồi 14. A.R.Pokalsky, W.R.Hiatt, N.Ridge, R.Rasmussen, C.M.Houck and C.K.Shewmaker, 1989. Structure and expression of elongation factor 1 in tomato. < =2748335> 15. B.Tudzynski, 1999. Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects. Appl Microbiol Biotechnol 52: 298 – 310. 16. David M. Geiser, María del Mar Jiménez-Gasco, Seogchan Kang, Izabela Makalowska, Narayanan Veeraraghavan, Todd J.Ward, Ning Zhang, Gretchen A. Kuldau and Kerry O‟Donnell, 2004. FUSARIUM-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 00. 17. Hiroshi Harada and Antom Lang, 1964. Effect of some (2-Chloroethyl) trimethylammonium chloride analogs and other growth retardants on gibberellin biosynthesis in Fusarium moniliforme. 18. Hiroshi Kawaide. Biochemical and molecular analyses of gibberellin biosynthesis in fungi.<www.aseanbiodiversity.info/scripts/count_article.asp?Article _code=51006656> 19. Kamel A. Abd-Elsalam, Ibrahim N. Aly, Mohmed A. Abdel-Satar, Mohmed S. Khalil and Joseph A. Verreet, 2003. PCR identification of Fusarium genus based on nuclear ribosomal-DNA sequence data. Africa journal of iotechnology vol.2. p82 – 85 . 20. Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten wolff and Wieland Meyer, 1995. DNA fingerprinting in plants and fungi.CRC Press. 322 pages. 21. Lester W. Burgess, Brett A. Summerell, Suzanne Bullock, Kathryn P. Gott, and David Backhouse, 1994. Laboratory manual for Fusarium research. 3 rd edition. University of Sydney. 44 22. Lincoln Taiz and Eduardo Zeiger, 2002. Plant Physiology. 3rd edition. p509 – 540. 23. MacMillan. J and Suter. P.J, 1963. Thin layer chromatography of the gibberellins. Nature 197: 790. 24. Paul E. Nelson, 1992. Taxonomy and biology of Fusarium moniliforme. Mycopathologia 117: 29 – 36. 25. Reyes Candau, Javier Avalos and Enrique Cerdá-Olmedo, 1992. Regulation of gibberellin biosynthesis in Gibberella fujikuroi. Plant Physiol 100: 1184 – 1188. 26. S.H.Ou, 1985. Rice diseases. Second edition. Commonwealth mycological institute. p262 – 272. 27. Stefan Malonek, Christiane Bomke, Erich Bornberg-Bauer, María C. Rojas, Peter Hedden, Paul Hopkins, Bettina Tudzynski, 2005. Distribution of gibberellin biosynthesis genes and gibberellin production in the Gibberella fujikuroi species complex. Phytochemistry 66: 1296 – 1331. 3. Tài liệu internet 28. 29. 30. 31. 32. 33. Techniques/TLC/thin_layer_chrom.html. 34. 35. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Bình sắc ký Phụ lục 2: Cơng thức tính Rf Trong đĩ: a: Khoảng đường di chuyển của dung mơi. b: Khoảng đường di chuyển của hợp chất. Rf = b/a