Khóa luận Phân lập, khảo sát đặc điểm sinh học và tìm hiểu khả năng sinh enzyme của vi khuẩn bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 - 2007 Sinh viên thực hiện: BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN NGỌC HẢI BÙI THỊ PHI Thành phố Hồ Chí Minh - 2007 - iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Qúy thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. TS Nguyễn Ngọc Hải, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. TS Lê Anh Phụng, BSTY Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành quá trình thực tập trong thời gian vừa qua. Phòng Vi sinh truyền nhiễm khoa Chăn nuôi thú y đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng. Các bạn lớp CNSH 29 đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua. Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Phi iv TÓM TẮT BÙI THỊ PHI, Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tháng 9/2007. "PHÂN LẬP, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌM HIỂU KHẢ NĂNG SINH ENZYME (AMYLASE, PROTEASE) CỦA VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS ĐỂ SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CHẾ PHẨM SINH HỌC" Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Nhằm nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm chăn nuôi và để chế phẩm sinh học được ứng dụng rộng rãi hơn và có tác dụng tốt hơn trong chăn nuôi, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ), ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng của pH và thời gian nuôi cấy vi khuẩn, nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm để khảo sát khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Kết quả chúng tôi có được: Phân lập, xác định được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy (sục khí liên tục và không sục khí), thời gian nuôi cấy (nuôi ở 24 giờ và 48 giờ) đến khả năng sinh enzyme (amylase, protease) của vi khuẩn Bacillus subtilis thì chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và sản sinh enzyme tốt hơn. Khảo sát ảnh hưởng của các môi trường (rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đuờng + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton, TSB + 1% tinh bột) đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn thì ở môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis thì ở pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ, hoạt độ enzyme của vi khuẩn tốt nhất. Nhiệt độ 4 - 100C giữ được hoạt độ enzyme tốt hơn ở nhiệt độ 30 - 370C trong khảo sát về nhiệt độ và thời gian bảo quản chế phẩm. v ABSTRACT A survey to define some culture conditions that affect on enzyme (amylase, protease) productivity of Bacillus subtilis isolated strains was carried out and the results had showed: We subdivided and definned 10 strains Bacillus subtilis. Bacillus subtilis isolated strains could produce more enzyme (amylase, protease) in oxygen continuous supply conditions at 48 hours incubation. The best result obtained for enzyme (amylase, protease) production with sugar rust + 2% starch culture medium in comparing with the others (sugar rust + 1% starch, sugar rust + 1% starch + 0,5% peptone, TSB + 1% starch) and at pH = 7 for 48 hours culture. Enzyme activity conserved better in 4 – 100C than in 30 – 370C. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iii TÓM TẮT ................................................................................................................ iv ABSTRACT ............................................................................................................... v MỤC LỤC ................................................................................................................ vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix DANH SÁCH HÌNH ................................................................................................. x DANH SÁCH SƠ ĐỒ .............................................................................................. xi Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích đề tài ............................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu đề tài ............................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ........................................................... 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis ........ 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 4 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................ 4 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá ................................................................................. 5 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis .............. 6 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử ................................................................................ 6 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử ....................................................................... 6 2.1.7. Tính chất đối kháng .............................................................................. 6 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease ..................................... 7 2.3.1. Enzyme amylase ................................................................................... 7 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu ........................................................................ 7 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase .................................................................. 7 2.3.1.3. Đặc tính của amylase ..................................................................... 8 vii 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ............................................ 10 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase ....... 10 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật ..................................................... 11 2.3.2. Enzyme protease ................................................................................. 11 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease ................................................ 11 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ........................... 12 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật ............................... 13 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật ..................................................................................................... 14 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật .................................................... 14 2.3. Giới thiệu về probiotic................................................................................ 15 2.4.1. Định nghĩa ........................................................................................... 15 2.4.2. Chức năng sinh học ............................................................................. 15 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng .............................................. 15 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis ..................................................................................................... 16 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 18 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ....................................................... 18 3.1.1. Thời gian ............................................................................................. 18 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................. 18 3.2. Vật liệu thí nghiệm ..................................................................................... 18 3.2.1. Đối tượng khảo sát .............................................................................. 18 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ........................................................... 18 3.2.2.1. Thiết bị ......................................................................................... 18 3.2.2.2. Dụng cụ: ...................................................................................... 18 3.3. Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 19 3.4. Phương pháp thực hiện đề tài ..................................................................... 19 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ........................................... 19 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ....................................... 19 viii 3.4.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis........................ 19 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập được ............ 20 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 21 3.4.2.1. Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................... 21 3.4.2.2. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................................................................. 22 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis. ...................................................... 23 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis ............................................................................................................. 25 3.4.3.1. Quy trình thực hiện ...................................................................... 25 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản .............................. 25 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 26 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis ...................................... 26 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis ................ 26 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis .......... 26 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ................................................................ 27 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn. .................. 29 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis .......................................................................................... 31 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis .......................................................................................... 33 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất ......... 34 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 36 5.1. Kết luận ...................................................................................................... 36 5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 36 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 40 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................... 21 Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 ................................................................................... 23 Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 ................................................................................... 24 Bảng 4.1: Kết quả thử phản ứng sinh hoá ................................................................ 29 Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2)............................................. 29 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm ... 31 Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của môi trường đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. .............. 32 Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất .................... 33 Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm .................................. 34 x DANH SÁCH HÌNH Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................................................... 3 Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis ....................................................... 26 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ......................................... 27 xi DANH SÁCH SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất ................................................ 20 Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (theo Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006). .. 21 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, nền kinh tế ngày càng phát triển cùng với những tiến bộ khoa học đã làm cho cuộc sống con người có nhiều thay đổi lớn. Càng ngày đời sống tinh thần vật chất càng cao, do đó nhu cầu về chất lượng sản phẩm cũng tăng cao đòi hỏi những nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm của mình để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị ô nhiễm bởi các hoá chất độc hại, người ta hạn chế hoặc cấm sử dụng một số loại thuốc, đặc biệt là thuốc kháng sinh và thay thế thuốc kháng sinh bằng các chế phẩm sinh học. Chế phẩm sinh học hay còn gọi là “probiotic” bao gồm các vi sinh vật sống có lợi, có t ính đối kháng cao khi được đưa vào đường ruột sẽ tạo sự cân bằng có lợi của hệ sinh vật đường ruột, ức chế vi sinh vật có hại, phòng bệnh tiêu chảy cho thú đặc biệt là heo con. Ngoài ra, những chế phẩm sinh học còn cải thiện tốt quá trình tiêu hoá (nhờ những enzyme vi sinh vật, hoặc những sản phẩm do quá trình lên men của chúng), giúp nâng cao sức đề kháng, tăng trọng nhanh. Từ những thực tế trên, dưới sự hướng dẫn của Tiến sĩ Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu khả năng sinh enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học”. 2 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis nhằm ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic), với mục đích nâng cao năng suất và tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập được loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất, hoặc từ chế phẩm. Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Sơ lƣợc về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa năm 1941 bởi tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu được sử dụng chủ yếu là để phòng bệnh lỵ cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Việc điều trị phải đợi đến những năm 1949 - 1957, khi Henrry và các cộng sự tách được chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “subtilis therapy” có nghĩa là "thuốc subtilis" ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy trong rối loạn tiêu hoá. Ngày nay, vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, chăn nuôi, thực phẩm (trích Lý Kim Hữu, 2005). 2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố của vi khuẩn Bacillus subtilis  Đặc điểm phân loại: Theo phân loại của Bergy (1994) Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis Hình 2. 1. Vi khuẩn Bacillus subtilis www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... 4  Đặc điểm phân bố: Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc, chúng được phân bố hầu hết trong tự nhiên. Phần lớn chúng cư trú trong đất, thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, vùng đất hoang thì vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm. Nước và bùn cửa sông cũng như ở nước biển cũng có mặt bào tử và tế bào Bacillus subtilis (Vũ Thị Thứ, 1996). 2.1.3. Đặc điểm hình thái Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, G+, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước từ 0,8 - 1,8 m. Bào tử phát triển bằng cách nảy mầm do sự nứt của bào tử, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Tô Minh Châu, 2000). 2.1.4. Đặc điểm nuôi cấy  Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 370C  Nhu cầu O2: Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy.  Độ pH: Bacillus subtilis thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.  Môi trường Môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm. Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Môi trường thạch nghiêng TSA: dễ mọc, tạo thành màu xám, rìa nhăn gợn sóng. Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin. Thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng lấm tấm hạt. 5 Môi trường canh TSB: Bacillus subtilis phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, lắc lên khó tan đều. 2.1.5. Đặc điểm sinh hoá Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), Nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), di động (+), hiếu khí (+). Phản ứng sinh hoá Kết quả Hoạt tính catalase + Sinh indol - MR + VP + Sử dụng citrate + Khử nitrate + Tan chảy gelatin + Di động + Phân giải tinh bột + Arabinose + Xylose + Saccharose + Mannitol + Glucose + Lactose - Maltose + (Theo Holt, 1992) (trích Lý Kim Hữu, 2005). 6 2.1.6. Bào tử và khả năng tạo bào tử của vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.6.1. Cấu tạo bào tử Ngoài cùng của bào tử là một lớp màng, dưới lớp màng là vỏ. Vỏ bào tử có nhiều lớp. Đây là những lớp có tác dụng ngăn chặn sự thẩm thấu của nước và các chất hoà tan trong nước. Dưới lớp vỏ là lớp màng trong của bào tử và trong cùng là một khối tế bào chất đồng nhất. Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất, vì vậy có thể giữ ở trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). Bào tử khác tế bào dinh dưỡng về cấu trúc, thành phần hoá học và tính chất sinh lý. 2.1.6.2. Khả năng tạo bào tử Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacillus subtilis là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định. Bacillus subtilis có khả năng hình thành bào tử theo chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp điều kiện bất lợi (dinh dưỡng trong môi trường bị kiệt quệ) (Tô Minh Châu, 2000). Sự tạo bào tử diễn ra gồm nhiều giai đoạn, tổng cộng gần 8 giờ để hoàn tất. Lúc đầu lớp nguyên sinh chất trong tế bào được sử dụng. Tế bào chất và nhân tập trung tại một vị trí nhất định trong tế bào. Tế bào chất tiếp tục cô đặc lại và tạo thành tiền bào tử (Prospore). Tiền bào tử bắt đầu được bao bọc dần bởi các lớp màng. Tiền bào tử phát triển và trở thành bào tử. Khi bào tử trưởng thành, tế bào dinh dưỡng tự phân giải và bào tử được giải phóng khỏi tế bào mẹ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử sẽ hút nước và bị trương ra. Sau đó, vỏ của chúng bị phá huỷ và bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào mới. Mỗi tế bào dinh dưỡng chỉ tạo ra một bào tử (Lê Đỗ Mai Phương, 2004). 2.1.7. Tính chất đối kháng Với vi sinh vật gây bệnh, mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ xảy ra sự cạnh tranh dinh 7 dưỡng. Cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức Thuận, 1976). 2.2. Giới thiệu về enzyme amylase và enzyme protease 2.3.1. Enzyme amylase 2.3.1.1. Lịch sử nghiên cứu Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm (malt) và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nẩy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Theo tính chất và phương pháp tác dụng lên tinh bột người ta phân biệt α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase), oligo- 1,6 -glucoxydase (dextrinase). 2.3.1.2. Vi sinh vật tạo amylase Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả đó là nấm mốc, nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn. Để thu amylase người ta thường dùng các giống vi sinh vật sau: Nấm mốc: Aspergillus, Rhizopus. Nấm men: Candida, Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Gratrova, 1975; Conovalov, 1972; Fukumoto, 1962; Hattori, 1961). Vi khuẩn: Bacillus mesentericus, B. subtilis, B. macecassavanum, Clostridium acetobutylium, Penicillium saccharophila,… Các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng nhanh (4 – 6 lần so với vi khuẩn ưa ẩm) và phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối cao, nên khi nuôi chúng ở nhiệt độ cao ít bị nhiễm vi sinh vật khác. Trong số vi khuẩn ưa ấm tạo amylase mạnh, thì Bacillus subtilis được nghiên cứu 8 và sử dụng rộng rãi nhất. Riêng ở Nhật, hàng năm người ta sản xuất tới hàng chục nghìn tấn chế phẩm amylase và protease từ loài vi khuẩn ưa ấm và hiếu khí này. Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của Bacillus subtilis là 370C. 2.3.1.3. Đặc tính của amylase Hiện nay người ta đã biết rõ có 6 loại enzyme amylase trong đó α-amylase, β-amylase, gluco-amylase (γ-amylase) thủy phân các liên kết α – 1,4 - glucoside của tinh bột và các polysaccharide; 3 amylase còn lại (dextrine – 6 - glucanhidrolase, amilopectin - 6 - glucanhidrolase, oligodexin - 6 - glucanhidrolase hay dextrinase) thuỷ phân các liên kết α – 1,6 - glucoside trong polysaccharide và các dextrin cuối. Các enzyme amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thuỷ phân.  α-amylase: α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen và polysaccharide) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào. Khi tác dụng lên tinh bột, enzyme này giải phóng ra glucose ở dạng α- mutamer, nên năm 1924 Kuhn gọi nó là α-amylase. α-amylase không chỉ thuỷ phân hồ tinh bột mà nó thuỷ phân cả hạt tinh bột còn nguyên, song với tốc độ rất chậm. Dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, α-amylase thường thuỷ phân tinh bột thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iod và một ít maltose, do đó α-amylase có tác dụng làm giảm độ nhớt của hồ tinh bột rất mạnh (dịch hoá). Tinh bột α-amylase α- dextrin + maltose + glucose (hoặc glucogen) (nhiều) (ít) α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng, α -amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác. Tất cả các α-amylase đều bị kiềm hãm bởi kim loại nặng như: Cu2+, Ag+, Hg2+. So với α-amylase của nấm mốc, amylase của vi khuẩn có hoạt lực dextrin hoá trội hơn hoạt lực đường hóa. 9 α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị vỡ, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân huỷ các hạt tinh bột còn nguyên lẫn hồ tinh bột (Popadicts và cộng sự, 1971). Amylase của Bacillus subtilis phân giải tinh bột còn nguyên 2 – 2,5 lần nhanh hơn so với α-amylase của nấm mốc (Lixiuk và Popadicts, 1969) (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). Vận tốc phân hủy tinh bột bởi α amylase vi khuẩn ở giai đoạn đầu cao hơn α–amylase của Aspergillus oryzae tới 25%. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là 4,5 – 4,8; của vi khuẩn là 5,8 – 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH: 5,8 – 7,0). Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase là 500C. Amylase của vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C, trong khi đó amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C. Tính bền nhiệt cao của α–amylase vi khuẩn là một ưu điểm lớn: được sử dụng để xử lý nguyên liệu ở các công đoạn phải dùng nhiệt cao.  β-amylase β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β-amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 - glucan trong tế bào. β-amylase chỉ phổ biến trong giới thực vật (có nhiều trong các hạt nảy mầm). Vi khuẩn không có β-amylase.  Glucoamylase Glucoamylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết α – 1,4 và α – 1,6 - glucan trong polysaccharide. Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hòan toàn tinh bột, glucogen, amylopeptin, panose, isomantose và mantose tới glucose. Đa số glucoamylase đều thuộc loại enzyme acid, thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 – 5. Glucoamylase bền với acid nhưng lại kém bền với tác dụng của rượu etylic, aceton. 10 2.3.1.4. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật Khi nuôi vi sinh vật tạo amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường. Amylase của Bacillus subtilis được tạo thành ở vi khuẩn trong giai đoạn đã hoặc đang kết thúc quá trình sinh trưởng. Cả trong môi trường nuôi cấy lẫn trong bản thân tế bào vi khuẩn “ trẻ ” đều không tìm thấy amylase. Amylase ngoại bào được tổng hợp ở tế bào đang chuyển sang thời kỳ tự phân. 2.3.1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp amylase  Ảnh hưởng của thành phần môi trường: Ảnh hưởng của nguồn cacbon dinh dưỡng: Các nguồn cacbon và năng lượng dễ hấp thu có tác dụng kiềm hãm sinh tổng hợp amylase (nồng độ tinh bột tối thích trong nuôi cấy chìm là 0,5 – 0,7%). Để có hoạt lực α–amylase cao cần 6% tinh bột, oligo – 1,6 – glucozidase cần 2% tinh bột. Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng: Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Nguồn nitơ hữu cơ: gelatin, casein, nước chiết ngô. Ảnh hưởng của acid amin: Acid amin có ảnh hưởng tốt tới sinh lí của vi sinh vật tạo enzyme amylase do: acid amin có thể đồng thời vừa là nguồn cacbon, nitơ, vừa là nguồn năng lượng; một số acid amin riêng rẽ đóng vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp nhiều acid amin khác và trong quá trình chuyển hoá amin. Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng: Các nguyên tố đa lượng và vi lượng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng và tổng hợp các enzyme amylase của vi sinh vật. Mg2+ ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Photpho ảnh hưởng trực tiếp đến sinh sản của nấm mốc và của vi sinh vật khác. Ca2+ cần cho tổng hợp và ổn định α–amylase hoạt động bảo vệ amylase khỏi tác động của protease. 11 Lưu huỳnh kích thích sự tạo amylase. Coban kích thích tổng hợp amylase. Mangan, đồng, thuỷ ngân kiềm hãm sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật.  Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp amylase: Ảnh hưởng của pH môi trường: pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ tới sự tạo thành amylase. Việc lựa chọn giá trị pH ban đầu căn cứ vào đặc tính của chủng vi sinh vật. pH môi trường để nuôi Bacillus subtilis nhằm thu α– amylase thích hợp nhất là 6,8 – 7,5 còn để tổng hợp protease là 7,0 – 7,8. Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ nuôi cũng là yếu tố quan trọng đối với sinh trưởng của vi sinh vật và tạo thành các enzyme amylase. Độ thông khí: việc sục khí và khuấy đảo môi trường có tác dụng tốt tới sự sinh trưởng và tích lũy sinh khối cũng như tổng hợp các enzyme của vi sinh vật. 2.3.1.6. Ứng dụng amylase vi sinh vật Các amylase vi sinh vật được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: công nghiệp rượu bia (thay thế một phần mầm đại mạch), công nghiệp nước chấm, công nghiệp sản xuất glucose, thuốc hỗ trợ tiêu hoá tinh bột, công nghiệp bánh mì (nâng cao chất lượng bánh), công nghiệp chế biến rau quả, bổ sung vào khẩu phần chăn nuôi. 2.3.2. Enzyme protease 2.3.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc tiết vào môi trường nuôi cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với protease nội bào. Một số protease ngoại bào được sản xuất trong quy mô công nghiệp và sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, trong nông nghiệp, y học. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn: Streptomyces griseus, Streptomyces rimosus,…và một số loài nấm mốc: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger… (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 12 2.3.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp, … các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra làm ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tính: protease trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 – 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 – 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serin. Trong bốn nhóm kể trên, các protease - serin và protease – tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với dẫn xuất của aminoacid. Các protease – serin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20000 – 27000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease –serin vào khoảng 33800 – 48400 dalton. Protease – tiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30000 – 40000 dalton. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các protease – serin, protease – tiol còn tyrosin là 13 trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thuỷ phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S* + P1 E + P2 Trong đó: E – là enzyme, S – là cơ chất. E – S : là phức chất enzyme – cơ chất E – S* : là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hoá (axilenzyme) P1 : là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amin tự do mới được tạo thành) P2 : là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành). 2.3.2.3. Chức năng sinh học của protease vi sinh vật Theo nhiều tác giả protease ngoại bào và protease nội bào của vi sinh vật có thể có những vai trò khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong nhiều dung dịch thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật dễ dàng hấp thụ. Protease nội bào : cho đến nay các protease nội bào còn đang được nghiên cứu và cũng chưa biết rõ vai trò của chúng trong tế bào. Theo Hiroishi (1976), các protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào, chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau: Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các acid amin để tổng hợp protein trong tế bào hoặc đôi khi dùng làm nguồn C, N, S. Tham gia trong quá trình cải tiến một số phân tử protein, enzyme, điều này có thể có ‎ nghĩa đối với việc hình thành và nảy mầm của bào tử vi sinh vật. Protease nội bào cũng có thể tham gia trong việc hoàn thiện chuỗi polypeptide đã được tổng hợp (Waller, 1963 ; Pine, 1969). Ngoài ra, protease nội bào cũng có thể có tác dụng phân huỷ các protein vô dụng tổng hợp sai do đột biến, 14 hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của vi sinh vật (trích Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005). 2.3.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protease của vi sinh vật Quá trình tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : ẩm độ, nhiệt độ, pH, độ thông thoáng, thành phần môi trường... Ảnh hưởng của nhiệt độ : nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật cũng như tính chất của enzyme được tổng hợp. Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme không bền với nhiệt độ và bị kiềm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. Ảnh hưởng của pH môi trường : khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzyme ở vi sinh vật, hơn nữa pH môi trường hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Ngược lại, trong phương pháp bề sâu pH môi trường ảng hưởng rất lớn đến sự tích luỹ protease trong môi trường. Độ thông khí : độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tuỳ theo giống vi sinh vật. Ảnh hưởng thành phần môi trường : thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Để tăng lượng enzyme trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thích hợp. 2.3.2.5. Ứng dụng protease vi sinh vật  Trong công nghiệp: protease được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm khác nhau và một số ngành công nghiệp nhẹ như : ngành chế biến cá, thịt, sữa, làm bánh mì, nước giải khát, thuộc gia, dệt, phim ảnh.... Ngoài ra protease còn được sử dụng bổ sung vào các loại xà phòng, kem đánh răng, kem bôi mặt, ... 15 có tác dụng lọai bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn hoặc làm sạch cao răng chữa viêm lợi.  Trong công nghiệp dược phẩm và y học: protease được sử dụng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein cho những người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tuỵ tạng hoạt động không bình thường, thiếu enzyme, chữa bệnh nghẽn tĩnh mạch. Protease cũng được dùng làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp và thuỷ phân sơ bộ protein làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật.  Trong chăn nuôi: sử dụng protease để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăng khả năng hấp thu của động vật, dùng sản xuất các dịch thuỷ phân giàu đạm bổ sung vào thức ăn của lợn và gia cầm 2.3. Giới thiệu về probiotic 2.4.1. Định nghĩa Theo Fuller (1989; trích dẫn Lã Văn Kính, 1998), định nghĩa probiotic như một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật đường ruột. 2.4.2. Chức năng sinh học Làm tăng thức ăn ăn vào và làm tăng khả năng tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme. Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. Trung hoà độc tố ruột, khử độc và phân huỷ một số chất có độc tính. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đường ruột. 2.4.3. Một số chế phẩm probiotic thông dụng Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau như: ENZYMBIOSUB của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty vacxin và sinh phẩm số 2. BACIFLORA For Shrimp của công ty liên doanh Bio - Pharmachemie . 16 VIME - BACTEVIT của công ty Gấu Vàng. Ngoài ra còn có rất nhiều loại chế phẩm nước ngoài như: PROTEXIN, UNLEASH, hay FLORAZYMEEFA. 2.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis  Trong nông nghiệp: Theo tài liệu của Lê Minh Cẩm Ngọc (2005), ứng dụng của Bacillus subtilis trong nông nghiệp được tiến hành như sau: Chăn nuôi: Viện bào chế Pharimex và viện Pasteur Nha Trang đã sản xuất chế phẩm Biousubtyl để trị bệnh tiêu chảy phân trắng ở heo con. Từ năm 1983 đến nay Viện Vaccin cơ sở 2 Đà Lạt đã sản xuất thuốc Biosubtyl dạng bột khô rất thuận tiện cho người sử dụng. Ngoài ra, Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc, nấm men và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm EM, probiotic. Trồng trọt: Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae... ngoài ra còn ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch. Nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bactophyl (Bacillus subtilis) do trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hoá chất, Bộ Nông Nghiệp tại TPHCM trừ các loại nấm bệnh trên rau cải. Hồ Thị Mỹ Hồng, Nguyễn Thanh Bình ở trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm subtin (Bacillus subtilis) phòng trừ nấm bệnh Ostrinia furnacalis trên bắp. Năm 1940, Noriokimura Yokohamo đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm kumura từ Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus. 17 Kháng sinh: Vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tạo kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gr+ và Gr- (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). 18 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2007 đến tháng 7/2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa Chăn Nuôi Thú Y - Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Đối tƣợng khảo sát Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ đất. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.2.1. Thiết bị Tủ sấy, máy hấp tiệt trùng (autoclave), tủ lạnh, cân điện tử, máy lắc (vortex), lò vi sóng, kính hiển vi, tủ ấm, … 3.2.2.2. Dụng cụ Lam, đèn cồn, que cấy, que trang, đũa thuỷ tinh, ống nghiệm, đĩa petri, micropipete, giá ống nghiệm, … Tất cả các dụng cụ thuỷ tinh dùng trong thí nghiệm đều phải được rửa sạch, bao gói và hấp tiệt trùng ở 1210C /15 phút. 19 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập loài vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất Khảo sát khả năng sinh hai loại enzyme (protease, amylase) của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng. Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học. Khảo sát sự thay đổi hoạt độ của enzyme chế phẩm trong thời gian bảo quản. 3.4. Phƣơng pháp thực hiện đề tài 3.4.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ phần lớp đất mặt khoảng 2 - 3cm, lấy lớp đất ở dưới. Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90 ml nước muối sinh lí vô trùng và lắc đều, được nồng độ pha loãng 10-1. 3.4.1.2. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa 9 ml nước muối sinh lí vô trùng, đánh số thứ tự từ 1 đến 4. Dùng micropipete hút 1 ml từ bình tam giác chứa mẫu đất phân lập có nồng độ pha loãng 10-1 cho vào ống nghiệm 1 và lắc đều bằng máy vortex, được nồng độ pha loãng 10-2, tiếp tục làm cho đến ống nghiệm cuối cùng. Tiếp theo chọn các ống nghiệm có nồng độ pha loãng 10-3 ,10-4, 10-5 dùng micropipete hút 0,1 ml từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA (mỗi nồng độ lặp lại 2 lần) và trang đều bằng que trang vô trùng, sau đó cho những đĩa TSA này vào tủ ấm ủ ở 37 0C/24h. Sau đó quan sát khuẩn lạc hình thành trên đĩa, chọn những khuẩn lạc nghi ngờ là của vi khuẩn Bacillus subtilis, dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường TSA nghiêng. 20 Đồng nhất và pha loãng mẫu: 1 g mẫu + 9 ml dd NaCl 90/00 Lần lượt pha loãng được các nồng độ tiếp theo ủ ở 370C/ 24h Sơ đồ 3.1: Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 3.4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc Quan sát hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi. Lấy một ít sinh khối vi khuẩn từ ống TSA làm tiêu bản nhuộm Gram để quan sát dưới kính hiển vi, độ phóng đại 1000 lần. Các chỉ tiêu quan sát: sự bắt màu, hình dạng, cách sắp xếp của tế bào vi khuẩn, có hay không có bào tử. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu bản vi khuẩn phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis (như : là trực khuẩn, hai đầu tròn, G+, bắt màu tím, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào) thì tiếp tục thử các phản ứng sinh hoá để khẳng định. Khảo sát các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn phân lập được. Mẫu đất Dd pha loãng mẫu 10-1 Hút từ mỗi nồng độ pha loãng cho lên đĩa môi trường TSA Chọn khuẩn lạc diển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hoá Giữ giống trên môi trường TSA nghiêng 21 Thử phản ứng sinh hóa Sơ đồ 3.2: Định danh vi khuẩn Bacillus subtilis (Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006) 3.4.2. Các thí nghiệm về vi khuẩn Bacillus subtilis 3.4.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định thời gian và chế độ nào phù hợp nhất. Bảng 3. 1: Bố trí thí nghiệm 1 Chế độ sục Thời khí gian Lô1: sục khí liên tục Lô 2: không sục khí Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ 48 giờ  Cách làm: Lấy vi khuẩn Bacillus subtilis từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp tiệt trùng (1210C/15phút), sau đó đo độ đục để cân bằng số lượng vi khuẩn cho vào các lô. Sau đó chuẩn bị 2 bình (cho một ống giống), mỗi bình chứa 150 ml môi trường TSB, cấy giống Bacillus subtilis với tỉ lệ 3%. Cho vòi sục khí vào bình với Chủng vi khuẩn thuần đã quan sát dưới kính hiển vi Hoạt tính catalase (+), Lecithinase (-), Nitrat (+), Voges-Proskauer (+), Citrat (+), Maltose (-). Khẳng định vi khuẩn Bacillus subtilis 22 thời gian và chế độ sục khí khác nhau: bình 1 sục khí liên tục, bình 2 không sục khí. Lấy mẫu vào các thời điểm 24h, 48h. Thí nghiệm được thực hiện trong 48 giờ và ở nhiệt độ phòng, sau đó đọc kết quả. Kiểm tra hoạt độ enzyme vào các thời điểm 24h, 48h ở 2 chế độ nuôi cấy khác nhau. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Từ đó chọn được chế độ nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thích hợp, lựa chọn 4 chủng cho kết quả tốt để tiếp tục khảo sát các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis  Mục đích: xác định môi trường nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào 4 loại môi trường thử nghiệm: Rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, TSB + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton với các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Tỉ lệ giống 3% pH = 6 Thời gian nuôi cấy và chế độ được chọn theo kết quả thí nghiệm 1. Sau đó tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease. Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth. Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fluld. 23 Sau khi kiểm tra hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường, tiến hành chọn môi trường nuôi cấy thích hợp để làm thí nghiệm tiếp theo. Bảng 3. 2: Bố trí thí nghiệm 2 Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 1 Lần 2 Rỉ đường + 2% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton TSB + 1% tinh bột 24 3.4.2.3. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis  Mục đích: xác định pH và thời gian nuôi cấy thích hợp với các chủng đã chọn ở thí nghiệm 1.  Cách làm: Cấy vi khuẩn từ các ống giống vào các ống nghiệm chứa 4 - 5 ml nước muối sinh lí đã hấp khử trùng, đem đo độ đục. Sau đó chuyển vi khuẩn từ các ống nghiệm vào môi trường đã chọn ở thí nghiệm 2 ở các pH và thời gian khác nhau với tỉ lệ 3% và nuôi cấy ở chế độ đã chọn ở thí nghiệm 1. Kiểm tra hoạt độ amylase và protease (thí nghiệm được lập lại 2 lần). Bảng 3. 3: Bố trí thí nghiệm 3 pH 6,0 7,0 Hoạt độ enzyme Thời gian amylase protease amylase protease 24h 48h  Từ khảo sát trên, chọn mức pH, thời gian thích hợp mà các chủng Bacillus subtilis cho hoạt độ enzyme tốt nhất. 25 3.4.3. Thử nghiệm thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm từ Bacillus subtilis 3.4.3.1. Quy trình thực hiện 3.4.3.2. Kiểm tra chế phẩm trong thời gian bảo quản Chế phẩm được kiểm tra hoạt độ enzyme ở các khoảng thời gian: 10 ngày, 20 ngày, 30 ngày theo hai chế độ bảo quản: 4 - 100C và nhiệt độ phòng. Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm thống kê Statgraphic 7.0. Sấy khô chế phẩm ở nhiệt độ 40 – 500C Các giống vi khuẩn đã chọn ở thí nghiệm 1 Môi trường nhân giống: môi trường TSB với điều kiện nuôi cấy đã chọn Môi trường sản xuất: cám gạo Kiểm tra hoạt độ enzyme protease và amylase Thời gian 48h, nhiệt độ 370C Thu hoạch chế phẩm 26 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis 4.1.1. Quan sát đặc điểm khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis Sau khi pha loãng mẫu và cấy trang trên môi trường TSA đĩa, ủ 24 giờ, quan sát và bắt giữ giống những khuẩn lạc có đặc điểm như hình 4.1: khuẩn lạc có bề mặt khô, mọc lan trên mặt thạch, dạng tròn, rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám. Tiếp tục làm tiêu bản nhuộm Gram từng chủng vi khuẩn phân lập và quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại x 1000 lần) để khảo sát đặc điểm hình thái. Hình 4. 1. Đặc điểm khuẩn lạc Bacillus subtilis 4.1.2. Đặc điểm hình thái của vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Nhuộm Gram tiêu bản vi khuẩn và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy các chủng vi khuẩn được nghi ngờ có hình thái giống với Bacillus subtilis, là những trực khuẩn bắt màu Gram dương, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, kích thước 0,5 - 0,8 m x 1,5 - 3 m, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn, có bào tử và bào tử nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng. 27 Hình 4. 2: Đặc điểm hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis (www.biol.pmf.hr/.../odg-slike/odg451.jpg) 4.1.3. Khảo sát đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn nghi ngờ là Bacillus subtilis Các chủng phân lập có đặc điểm hình thái phù hợp với Bacillus subtilis được chọn làm một số phản ứng sinh hóa để khẳng định. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Sau khi thử phản ứng sinh hóa của 21 chủng nghi ngờ, chúng tôi xác định được 10 chủng là vi khuẩn Bacillus subtilis. Tiếp tục chúng tôi tiến hành các thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và protease trong những môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập được. 28 Bảng 4. 1: Kết quả thử phản ứng sinh hóa của các chủng phân lập Ghi chú: (+) là phản ứng dương tính (-) là phản ứng âm tính Chủng phân lập Các phản ứng sinh hóa Catalase Lecithinase Nitrate Citrate MR - VP Maltose 1 + + + + + 2 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 5 + + + + + 6 + + + + + 7 + + + + + 8 + + + + + 9 + + + + + 10 + + + + + 11 + + + + 12 + + + + 13 + + + + 14 + + + + 15 + + + + 16 + + + + 17 + + + + 18 + + + + 19 + + + 20 + + + 21 + + + 29 4.2. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của chế độ sục khí và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme amylase và protease của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập đƣợc Các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được đánh số thứ tự từ 1 đến 10. Các chủng vi khuẩn phân lập được nuôi cấy trong môi trường TSB ở hai chế độ sục khí và không sục khí với thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, nhiệt độ phòng, pH = 7, chúng tôi tiến hành theo dõi chỉ tiêu về khả năng sinh enzyme amylase và protease với kết quả như sau: Bảng 4.2: Kết quả thí nghiệm 1 (Bảng phụ lục 1 và 2) Chế độ sục khí Thời gian Lô 1: sục khí liên tục (n = 18) Lô 2: không sục khí (n = 18) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ml) 24 giờ 39,11 32,89 14,44 5,44 48 giờ 47,11 40 25,78 8 Hoạt độ trung bình 43,11 36,45 20,11 6,72 Qua kết quả được trình bày ở bảng 4.2 cho thấy hoạt độ trung bình của hai loại enzyme trong 1 ml canh khuẩn ở chế độ sục khí liên tục cao hơn hoạt độ trung bình của hai loại enzyme ở chế độ không sục khí. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở hai chế độ nuôi cấy và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở cả hai loại enzyme (với P < 0,05) (Phụ lục A). Như vậy cho thấy với chế độ sục khí do cung cấp oxy nhiều nên giúp cho vi khuẩn phát triển nhanh và sản sinh ra nhiều enzyme hơn so với chế độ không sục khí (vì Bacillus sinh sản và phát triển tốt). 30 Kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy có sự khác biệt về hoạt độ của hai loại enzyme giữa hai khoảng thời gian nuôi cấy (24 giờ, 48 giờ) (với P < 0,05) (Phụ lục A). Theo kết quả của chúng tôi khi nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis ở 48 giờ với chế độ sục khí liên tục sẽ cho hoạt độ enzyme cao hơn so với điều kiện nuôi cấy sục khí liên tục trong 24 giờ. Như vậy chứng tỏ khi vi khuẩn được cung cấp oxy càng nhiều thì chúng phát triển càng tốt và sinh càng nhiều enzyme. Cũng theo kết quả thống kê: có sự khác biệt về mặt thống kê giữa 9 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được nuôi cấy (cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng: chủng 2 – 5, chủng 2 – 6, chủng 2 – 8, chủng 1 - 9, chủng 4 - 9,...). Tuy nhiên giữa hai chế độ sục khí và không sục khí thì hoạt độ enzyme trong cùng một chủng không đồng nhất, có thể ở điều kiện cung cấp oxy một số chủng này phát triển tốt hơn và ở chế độ không cung cấp oxy một số chủng khác lại phát triển tốt hơn. Điều này cho thấy có sự khác biệt về đặc điểm sinh học giữa các chủng. Từ các kết quả có được như trên, chúng tôi quyết định chọn chế độ sục khí liên tục trong thời gian 48 giờ và chọn 4 chủng: 2, 7, 9, 10 trong 9 chủng phân lập được để tiếp tục khảo sát hoạt độ của hai loại enzyme trong các môi trường nuôi cấy khác nhau ở thí nghiệm tiếp theo. 31 Bảng 4. 3: Kết quả hoạt độ enzyme trung bình của 9 chủng vi khuẩn thí nghiệm Chủng vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Hoạt độ trung bình của 2 loại enzyme 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ amylase protease 1 40 48 16 32 44 24 2 64 56 24 32 60 28 4 40 48 20 32 44 26 5 32 48 20 32 40 26 6 32 40 24 40 36 32 7 32 48 56 48 40 52 8 32 40 32 32 36 32 9 48 48 64 56 48 60 10 32 48 40 56 40 48 4.3. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis trên 4 loại môi trường: rỉ đường + 2% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột với 4 chủng đã chọn và điều kiện nuôi cấy là: nhiệt độ phòng, tỉ lệ cấy giống là 3%, sục khí liên tục trong 48 giờ (mỗi chủng 4 loại môi trường) (thí nghiệm lặp lại 2 lần). Kết quả được trình bày qua bảng 4.4. 32 Bảng 4. 4. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến hoạt độ enzyme của vi khuẩn. Môi trường Hoạt độ enzyme amylase (W0/ml) Hoạt độ enzyme protease (Hdp/ml) Rỉ đường + 2% tinh bột (1) (n = 8) 26 30 Rỉ đường + 1% tinh bột (2) (n = 8) 18,5 22 Rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% pepton (3) (n = 8) 20 32 TSB + 1% tinh bột (4) (n = 8) 14,5 20 Qua kết quả khảo sát hoạt độ hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường + 2% tinh bột có hoạt độ enzyme trung bình cao hơn hoạt độ enzyme trung bình trên các môi trường rỉ đường + 1% tinh bột, rỉ đường + 1% tinh bột + 0,5% peptone, TSB + 1% tinh bột. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt ở 4 loại môi trường trên (cụ thể là có sự khác biệt giữa các môi trường: 1 - 2, 1 - 4, 2 - 3, 3 - 4) (Phụ lục B) và sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê (với P < 0,05) (Phụ lục B). Theo Nguyễn Đức Duy Anh, (2005): trong 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 (Edward, Fragie, Nomura, pepton - gelatin, rỉ đường + 2% tinh bột) thì môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cũng cho kết quả tốt nhất nhưng hoạt độ của cả hai loại enzyme đều rất cao (amylase: 256 W0/ml, protease: 128 Hdp/ml) so với hoạt độ enzyme của môi trường rỉ đường + 2% tinh bột trong thí nghiệm này (amylase: 26 W0/ml, protease: 30 Hdp/ml). Sự chênh lệch hoạt độ enzyme trong cùng một loại môi trường này có thể là do sử dụng hai nguồn vi khuẩn khác nhau, lượng giống cho vào với tỉ lệ khác nhau. 33 Từ kết quả trên chúng tôi quyết định chọn môi trường rỉ đường + 2% tinh bột để tiến hành khảo sát ở thí nghiệm tiếp theo. 4.4. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng Bacillus subtilis Dựa trên các kết quả có được ở các thí nghiệm trên chúng tôi tiến hành nuôi cấy 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường rỉ đường + 2% tinh bột ở hai điều kiện pH khác nhau: pH = 6 và pH = 7, thời gian khảo sát là 24 giờ, 48 giờ, với tỉ lệ giống 3%, nhiệt độ phòng (mỗi chủng nuôi ở hai pH khác nhau). Kết quả được trình bày ở bảng 4.5. Bảng 4. 5. Khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis. pH Thời gian 6,0 7,0 Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 24 giờ (n = 8) 27 13 32 18 48 giờ (n = 8) 32 18 36 18 Qua kết quả khảo sát điều kiện (pH, thời gian) thích hợp cho sự sản xuất enzyme của các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis ở bảng 4.5 chúng tôi thấy ở pH = 7 thì hoạt độ enzyme trung bình của vi khuẩn cao hơn so với pH = 6 và ở thời gian nuôi cấy là 48 giờ hoạt độ enzyme cũng cao hơn khi nuôi ở 24 giờ (kết quả này phù hợp với kết quả về thời gian nuôi cấy ở thí nghiệm 1). Tuy nhiên kết quả xử lý thống kê cho thấy không có sự khác biệt giữa hai điều kiện pH và thời gian ở cả hai loại enzyme (amylase, protease) và cũng không có ý nghĩa về mặt thống kê bởi vì mức ý nghĩa của hai loại enzyme đều lớn hơn mức ý nghĩa cho phép (Pamylase = 0,055 > 0,05 và Pprotease= 0,215 > 0,05) (Phụ lục C). 34 4.5. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm sau khi sản xuất Sau khi đã lựa chọn được 4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, chúng tôi tiến hành nuôi tăng sinh trong môi trường TSB, sau đó trộn với cám gạo để thử nghiệm thời gian bảo quản và nhiệt độ bảo quản sau khi thành chế phẩm của vi khuẩn Bacillus subtilis. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ lạnh (4 - 100C) và ở nhiệt độ phòng (30 - 37 0 C) trong thời gian là 10 ngày, 20 ngày và 30 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. Bảng 4.6. Khảo sát thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm Nhiệt độ Thời gian 4 - 10 0 C 30 - 37 0 C Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease 0 ngày 56 38 56 38 10 ngày 5,25 0,0 4,75 0,0 20 ngày 5,25 0,0 4,25 0,0 30 ngày 5,0 0,0 4,5 0,0 Từ kết quả ở bảng trên cho thấy trong điều kiện bảo quản lạnh thì hoạt độ của hai loại enzyme cao hơn so với điều kiện bảo quản thường. Hoạt độ của hai loại enzyme này giảm rất nhanh (hơn 10 lần) chỉ sau 10 ngày bảo quản. Ở kết quả xử lý thống kê cũng cho thấy kết quả cụ thể cho từng loại enzyme. Với enzyme amylase kết quả thống kê cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa hai nhiệt độ bảo quản (với P = 0,0026 < 0,05), còn với thời gian bảo quản có sự khác biệt có ý nghĩa giữa 0 ngày với các khoảng thời gian còn lại (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Riêng với enzyme protease kết quả thống kê cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa hai nhiệt độ bảo quản này (với P = 1,000 > 0,05) và ở thời gian bảo quản cũng có kết quả tương tự như đối với 35 enzyme amylase, đó là chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê giữa khoảng thời gian là 0 ngày với 10, 20, 30 ngày (với P = 0,000 < 0,05) (Phụ lục D). Qua những kết quả ở trên, do có sự giảm đáng kể của cả hai loại enzyme chỉ trong khoảng thời gian 10 ngày bảo quản, trong khảo sát của chúng tôi cho thấy cám gạo không phải là chất nền thích hợp cho chế phẩm enzyme amylase, đặc biệt với enzyme protease lại càng không thích hợp. 36 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau một khoảng thời gian thực hiện đề tài, chúng tôi có những kết luận sau: Phân lập được 10 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất. Chế độ sục khí liên tục và nuôi ở 48 giờ vi khuẩn sẽ phát triển và cho enzyme tốt hơn Môi trường rỉ đường + 2% tinh bột cho hoạt độ enzyme tốt nhất so với 3 loại môi trường còn lại. pH = 7 và thời gian nuôi cấy là 48 giờ thì hoạt độ enzyme của vi khuẩn là tốt nhất. Trong chất nền thử nghiệm cám gạo, kết quả cho thấy ở nhiệt độ 4 – 100C hoạt độ của enzyme amylase bảo toàn tốt hơn ở nhiệt độ 30 – 370C, riêng về thời gian bảo quản hoạt độ của hai loại enzyme có sự thay đổi lớn từ 0 ngày đến 10 ngày, còn từ 10, 20, 30 ngày thì không có sự thay đổi hoạt độ enzyme. 5.2. Đề nghị Cần phân lập thêm nhiều chủng vi khuẩn Bacillus subtilis từ nhiều nguồn khác nhau để có kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn cho hoạt độ enzyme tốt nhất. Cần khảo sát thêm các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh hai loại enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis. Thử nghiệm nhiều loại môi trường sản xuất khác nhau để có được môi trường sản xuất thích hợp nhất cho vi khuẩn. Tìm kiếm chất nền thích hợp cho việc bảo quản enzyme amylase và protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Vương Thị Việt Hoa, 2002, Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 74 trang. 2. Lê Minh Cẩm Ngọc, 2005. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic, tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3. Nguyễn Đức Duy Anh, 2005. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus và Bacillus subtilis. LVTN, Khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 4. Nguyễn Ngọc Hải, Tô Minh Châu, 2001. Giáo trình thực tập vi sinh. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 5. Lý Kim Hữu, 2005. Khảo sát đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis và tìm hiểu điều kiện nuôi cấy thích hợp sản xuất thử nghiệm chế phẩm Probiotic. LVTN, khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM 6. Vũ Thị Thứ, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng ứng dụng của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis. Luận án phó tiến sĩ khoa học, sinh học, Viện sinh học nhiệt đới. 38 7. Tô Minh Châu, 2000. Giáo trình thực tập vi sinh vật học. Tủ sách trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 8. Nguyễn Ngọc Thanh Xuân, 2006. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất và khảo sát khả năng sử dụng các chủng phân lập được trong xử lý nhiễm aflatoxin trên nguyên liệu bắp. LVTN, Khoa Chăn nuôi thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 9. Nguyễn Duy Khánh, 2006. Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis. LVTN, khoa Công nghệ Sinh học. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 10. Lê Đỗ Mai Phương, 2004. Phân lập và giám định vi khuẩn Bacillus subtilis trong tự nhiên, bước đầu khảo sát khả năng sinh enzyme amylase và enzyme protease. LVTN, trường Đại học Mở Bán Công TP.HCM. 11. Nguyễn Vĩnh Phước, 1976. Vi sinh vật gây bệnh thú y tập 1, 2, 3. NXB Nông nghiệp Hà Nội. 12. Nguyễn Lân Dũng, Hoàng Đức Nhuận, 1976. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học tập I, II, III. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 13. Nguyễn Thị Hiền, Nguyễn Đức Lượng, 2004. Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. 14. Lã Văn Kính, 1998. Những tiến bộ khoa học kỹ thuật trong công nghệ sản xuất thức ăn gia súc và vai trò của probiotic đối với động vật. Viện Khoa học Nông Nghiệp và Kỹ Thuật Miền Nam. 39 15. Nguyễn Vĩnh Phước, 1977. Vi sinh vật thú y tập I. Nhà xuất bản đại học và trung học chuyên nghiệp. Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. 16. Trần Linh Thước, 2005. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. 17. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội. 18. Nguyễn Văn Đông, 1993. Khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl phòng và trị bệnh tiêu chảy heo con. LVTN, khoa Chăn nuôi Thú y. Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. Tài liệu tham khảo trên internet 19. www.sciencebuddies.org/.../MicroBio_img_004.jpg 20. www.fam.br/microrganismos/bacteriologia_bacil... 21. www.mbc.ntu.edu.tw/faculty/LeeKT/fig3.jpg 22. www.biol.pmf.hr/e-skola/odgovori/odgovor451.htm 23. www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages/Ba... PHỤ LỤC Phụ lục 1 Bảng phụ lục 1: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi sục khí Chủng vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) Hoạt độ amylase (W0/ ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 1 32 64 16 32 48 32 16 32 2 64 64 24 32 64 48 24 32 4 32 64 16 32 48 32 24 32 5 32 64 16 32 32 32 24 32 6 32 48 32 32 32 32 16 48 7 32 48 48 64 32 48 64 32 8 32 32 32 32 32 48 32 32 9 32 48 64 64 64 48 64 48 10 32 48 48 64 32 48 32 48 Bảng phụ lục 2: Hoạt độ enzyme của 9 chủng vi khuẩn nuôi không sục khí Chủng vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) Hoạt độ amylase (W0/ ml) Hoạt độ protease (Hdp/ ml) 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 24 giờ 48 giờ 1 16 32 12 8 12 24 4 12 2 16 32 12 8 12 24 4 12 4 16 32 12 8 12 24 6 12 5 12 24 4 4 12 24 4 8 6 16 24 4 4 16 24 4 4 7 12 24 4 4 16 24 4 12 8 12 24 4 4 16 24 4 12 9 16 24 4 4 16 24 4 12 10 16 24 4 4 16 32 4 12 Bảng phụ lục 3: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong 4 loại môi trƣờng Môi trƣờng Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn 2 7 9 10 2 7 9 10 Rỉ đường + 2% tinh bột 28 28 24 24 32 32 32 24 Rỉ đường + 1% tinh bột 18 18 18 20 24 16 24 24 Rỉ đường + 1% tinh bột +0,5%pepton 20 20 20 20 32 32 32 32 TSB + 1% tinh bột 14 14 16 14 20 20 20 20 Bảng phụ lục 4: Hoạt độ enzyme của 4 chủng vi khuẩn trong thí nghiệm 3 pH Thời gian 6,0 7,0 Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Hoạt độ amylase Hoạt độ protease Chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10 2 7 9 10 24 giờ (n = 8) 28 24 28 28 12 12 12 16 32 32 32 32 24 16 16 16 48 giờ (n = 8) 32 32 32 32 24 16 16 16 32 48 32 32 24 16 16 16  A. Điều kiện sục khí và thời gian nuôi cấy Analysis of Variance for PHI1.ketquaa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI1.CON 1023.1111 8 127.8889 1.612 .1558 B:PHI1.dksuckhi 9522.0000 1 9522.0000 120.025 .0000 C:PHI1.thoigian 1682.0000 1 1682.0000 21.202 .0000 INTERACTIONS AB 792.00000 8 99.000000 1.248 .3007 AC 264.00000 8 33.000000 .416 .9038 BC 50.00000 1 50.000000 .630 .4409 ABC 296.00000 8 37.000000 .466 .8715 RESIDUAL 2856.0000 36 79.333333 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 16485.111 71 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI1.ketquap - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI1.CON 2570.000 8 321.250 7.292 .0000 B:PHI1.dksuckhi 15901.389 1 15901.389 360.939 .0000 C:PHI1.thoigian 420.500 1 420.500 9.545 .0039 INTERACTIONS AB 3209.1111 8 401.13889 9.105 .0000 AC 326.0000 8 40.75000 .925 .5078 BC 93.3889 1 93.38889 2.120 .1541 ABC 485.1111 8 60.63889 1.376 .2398 RESIDUAL 1586.0000 36 44.055556 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 24591.500 71 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.dksuckhi ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 36 20.111111 X 1 36 43.111111 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 1 -23.0000 4.25873 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquaa by PHI1.thoigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 36 26.777778 X 48 36 36.444444 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -9.66667 4.25873 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.dksuckhi ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 0 36 6.722222 X 1 36 36.444444 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 1 -29.7222 3.17361 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI1.ketquap by PHI1.thoigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 36 19.166667 X 48 36 24.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -4.83333 3.17361 * ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference.  B. Loại môi trƣờng nuôi cấy Analysis of Variance for PHI2.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI2.con 2.00000 3 .66667 .023 .9951 B:PHI2.moitruong 546.00000 3 182.00000 6.276 .0051 INTERACTIONS AB 42.000000 9 4.6666667 .161 .9956 RESIDUAL 464.00000 16 29.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1054.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI2.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI2.con 32.00000 3 10.66667 .267 .8484 B:PHI2.moitruong 832.00000 3 277.33333 6.933 .0033 INTERACTIONS AB 160.00000 9 17.777778 .444 .8906 RESIDUAL 640.00000 16 40.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1664.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI2.kqa by PHI2.moitruong ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 4 8 14.500000 X 2 8 18.500000 X 3 8 20.000000 X 1 8 26.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 1 - 2 7.50000 5.70944 * 1 - 3 6.00000 5.70944 * 1 - 4 11.5000 5.70944 * 2 - 3 -1.50000 5.70944 2 - 4 4.00000 5.70944 3 - 4 5.50000 5.70944 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference Multiple range analysis for PHI2.kqp by PHI2.moitruong -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 8 20.000000 X 2 8 22.000000 X 1 8 30.000000 X 3 8 32.000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference limits 1 - 2 8.00000 6.70539 * 1 - 3 -2.00000 6.70539 1 - 4 10.0000 6.70539 * 2 - 3 -10.0000 6.70539 * 2 - 4 2.00000 6.70539 3 - 4 12.0000 6.70539 * -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference  C. Điều kiện pH và thời gian nuôi cấy Analysis of Variance for PHI3.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI3.con 54.00000 3 18.00000 .474 .7049 B:PHI3.ph 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555 C:PHI3.thigian 162.00000 1 162.00000 4.263 .0555 INTERACTIONS AB 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038 AC 150.00000 3 50.000000 1.316 .3038 BC 2.00000 1 2.000000 .053 .8239 ABC 54.00000 3 18.000000 .474 .7049 RESIDUAL 608.00000 16 38.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1342.0000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI3.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI3.con 198.00000 3 66.000000 2.200 .1278 B:PHI3.ph 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150 C:PHI3.thigian 50.00000 1 50.000000 1.667 .2150 INTERACTIONS AB 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 AC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 BC 50.000000 1 50.000000 1.667 .2150 ABC 38.000000 3 12.666667 .422 .7396 RESIDUAL 480.00000 16 30.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 942.00000 31 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.ph ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 6 16 29.500000 X 7 16 34.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 6 - 7 -4.50000 4.62137 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI3.kqa by PHI3.thigian ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 24 16 29.500000 X 48 16 34.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 24 - 48 -4.50000 4.62137 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference.  D. Thời gian và nhiệt độ bảo quản chế phẩm Analysis of Variance for PHI5.kqa - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI5.con 279.500 3 93.167 248.444 .0000 B:PHI5.nhietdobq 4.000 1 4.000 10.667 .0026 C:PHI5.thoigianbq 31417.000 3 10472.333 27926.222 .0000 INTERACTIONS AB 3.50000 3 1.166667 3.111 .0400 AC 772.50000 9 85.833333 228.889 .0000 BC 2.00000 3 .666667 1.778 .1712 ABC 4.50000 9 .500000 1.333 .2592 RESIDUAL 12.000000 32 .3750000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 32495.000 63 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Analysis of Variance for PHI5.kqp - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:PHI5.con 432.000 3 144.0000 2.250 .1015 B:PHI5.nhietdobq .000 1 .0000 .000 1.0000 C:PHI5.thoigianbq 17328.000 3 5776.0000 90.250 .0000 INTERACTIONS AB .0000 3 .00000 .000 1.0000 AC 1296.0000 9 144.00000 2.250 .0443 BC .0000 3 .00000 .000 1.0000 ABC .0000 9 .00000 .000 1.0000 RESIDUAL 2048.0000 32 64.000000 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 21104.000 63 -------------------------------------------------------------------------------- 1 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.thoigianbq ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 20 16 4.750000 X 30 16 4.750000 X 10 16 5.000000 X 0 16 56.000000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 0 - 10 51.0000 0.44111 * 0 - 20 51.2500 0.44111 * 0 - 30 51.2500 0.44111 * 10 - 20 0.25000 0.44111 10 - 30 0.25000 0.44111 20 - 30 0.00000 0.44111 ------------------------------------------------------------------------- ------- * denotes a statistically significant difference. Multiple range analysis for PHI5.kqa by PHI5.nhietdobq ------------------------------------------------------------------------- ------- Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups ------------------------------------------------------------------------- ------- 30 32 17.375000 X 4 32 17.875000 X ------------------------------------------------------------------------- ------- contrast difference limits 4 - 30 0.50000 0.31191 * ------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 2:  Môi trƣờng Trypticase Soya Agar (TSA) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Agar 18 g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB + 18 g agar cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi cho hòa tan. Đem hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C/ 15 phút.  Môi trƣờng Tryticase Soya Broth (TSB) Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000 ml pH 7,3 ± 0,2 Cân 30 g bột môi trường TSB cho vào 1000 ml nước cất, đun sôi cho hòa tan. Đem hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.  Môi trƣờng Clark lubs Thành phần g/l Pepton bột 7 g Glucose 5 g KH2PO4 5 g Nước cất 1000 ml pH 6,7 – 7,1  Môi trƣờng lên men các loại đƣờng Thành phần g/l Cao thịt 5 g Pepton bột 10 g Đường 10 g Phenol red 0,01 g Nước cất 1000 ml pH 7,4 Hấp khử trùng ở 1210C/15 phút.  Môi trƣờng Simons Citrate Agar Thành phần g/l Sodium citrate 2 g K2HPO4 1 g MgSO4 0,2 g Brothymol blue 0,08 g NaCl 5 g NH4H2PO4 1 g Agar 18 g pH 6,9 ± 0,2  Môi trƣờng khử Nitrate Thành phần g/l Cao thịt 3 g Pepton bột 5 g NaNO3 1 g Agar 7 g Nước cất 1000 ml pH 7,0 ± 0,2  Môi trƣờng Lòng đỏ trứng Thành phần g/l Cao thịt 1 g Pepton bột 10 g Mannitol 10 g NaCl 10 g Phenol red 0,0025 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml pH 7,2 ± 0,2 Chia 225 ml môi trường vào bình tam giác. Khử trùng ở 1210C/15 phút. Khi môi trường nguội đến 500C thêm 12,5 ml dung dịch lòng đỏ trứng gà. Trộn đều rồi đổ vào các đĩa petri vô trùng. Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng: rửa sạch trứng, sát trùng trứng bên ngoài bằng cồn. Dùng kẹp đập trứng, bỏ phần lòng trắng, chuyển phần lòng đỏ vào bucher có chứa 25 - 30 ml nước muối sinh lí vô trùng. Bảo quản dung dịch này ở 4 0C để dùng.  Môi trƣờng Rỉ đƣờng + 2% Tinh bột Thành phần g/l KH2PO4 20 g K2HPO4 20 g MgSO4 0,5 g (NH)4SO4 40 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 20 g pH 5 – 6  Môi trường rỉ đường + 1% Tinh bột, môi trường rỉ đường 1% tinh bột + 0,5% peptone tương tự như môi trường rỉ đường + 2% tinh bột, chỉ thay đổi tỉ lệ tinh bột cho vào.  Môi trƣờng TSB + 1% Tinh bột Thành phần g/l Soy pepton 15 g Tryptone peptone 5 g NaCl 5 g Nước cất 1000 ml Tinh bột 10 g pH 7,3 ± 0,2  Hóa chất Nước muối sinh lí 9%o NaCl 9 g Nước cất 1000 ml Dung dịch Iod 0,02N Cân 2 g KI hòa tan trong 3 ml nước cất, lắc đều cho tan, them nước cất vào cho đến 100 ml Dung dịch tinh bột 0,1% Tinh bột 0,1 g Nước cất thêm đến 100 ml Trộn tinh bột với khoảng 10 ml nước cất, thêm tiếp 80 ml nước cất đang sôi, khuấy đều, để nguội, thêm nước cất đến 100 ml. Dung dịch casein 0,1% Casein 0,1 g NaOH 0,1N 5 ml Nước cất 25 ml Đun cách thủy cho đến khi tan hoàn toàn. Làm lạnh dùng HCl 0,1N chỉnh pH = 8. Thêm nước cất để đủ 100 ml. Nước muối 0,1% Cân 0,1 g muối NaCl hòa tan trong 100 ml nước cất. Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol Acid acetic đặc 1 ml Nước cất 49 ml Ethanol 96% 50 ml Hòa tan acid acetic đặc trong nước cất và ethanol.  Phƣơng pháp nhuộm Gram Các bước tiến hành : Phết canh khuẩn lên miếng lam Cố định mẫu bằng cách hơ qua ngọn đèn cồn Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm bằng crystal violet trong 2 phút Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Cố định màu bằng lugol trong 1 phút Rửa nước, thấm khô Tẩy cồn 960 khoảng 15 giây Rửa nước, thấm khô Đặt giấy lọc lên vết phết vi khuẩn Nhuộm màu bằng dung dịch Fuchsine kiềm loãng Rửa nước, thấm khô Xem kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần (vật kính dầu)  Thử các phản ứng sinh hóa  Khả năng lên men đường Chuẩn bị: Môi trường đường: maltose, glucose, saccharose Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Ống nghiệm, ống Durham Cách làm: cho vào ống nghiệm đã có sẵn môi trường đường một ống Durham hấp khử trùng ở 1210C/15 phút. Sau đó cấy vi khuẩn vào môi trường ủ ở 37 0C/24 giờ. Quan sát sự đổi màu sinh hơi. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường, chuyển đường thành rượu, rượu lên men thành acid làm pH môi trường giảm, sẽ chuyển màu môi trường. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu hồng đỏ Phản ứng (+): môi trường có màu vàng  Thử phản ứng Catalase Chuẩn bị: Dung dịch H2O2 30% Lame Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: dung piptte lấy một ít vi khuẩn, phết lên giữa lame kính sạch và khô. Sau đó nhỏ giọt H2O2 30% lên vết vi khuẩn. Đọc kết quả su khoảng 15 giây. Kết quả: Phản ứng (-): không có hiệ tượng sủi bọt Phản ứng (+): có hiện tượng sủi bọt  Thử phản ứng VP (Voges Proskauer) Chuẩn bị: Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Môi trường Clark lubs α – naphtol 10%, NaOH 40% Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ 37 0C/24 giờ. Sau đó nhỏ 3 – 5 giọt NaOH 40% và 3 – 5 giọt α – naphtol 10%. Sau 15 phút đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng VP (-): môi trường có màu vàng Phản ứng VP (+): môi trường có màu đỏ.  Thử phản ứng MR (Methyl – Red) Chuẩn bị: Môi trường Clark lubs Thuốc thử Methyl Red Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn cấy vào môi trường Clark lubs, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau đó nhỏ 2 – 3 giọt thuốc thử Methyl Red vào canh khuẩn và đọc kết quả. Kết quả: Phản ứng MR (-): môi trường có màu vàng Phản ứng MR (+): môi trường có màu đỏ.  Thử phản ứng khử Nitrate (NO3) Chuẩn bị: Môi trường Nitrate Dung dịch thuốc thử Giess A, Giess B Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn cấy sâu vào môi trường thạch nitrate, nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt Giess A, sau đó nhỏ tiếp 2 – 3 giọt Giess B. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu vàng Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ  Thử khả năng sử dụng Citrate Chuẩn bị: Môi trường Citrate Giống vi khuẩn Bacillus subtilis Cách làm: cấy vi khuẩn vào môi trường Citrate. Nuôi ở nhiệt độ 370C/24 giờ. Kết quả: Phản ứng (-): môi trường có màu xanh lá mạ non Phản ứng (+): môi trường có màu xanh dương  Các phƣơng pháp thực hiện  Phương pháp kiểm tra hoạt tính amylase (Phương pháp Wolhgemuth) Phương pháp này xác định lượng enzyme ít nhất có thể phân giải hoàn toàn lượng tinh bột với chất chỉ thị màu Iodine. Một đơn vị Wolhgemuth là lượng enzyme ít nhất mà sau 30 phút ở 300C, khi có ion clorine có thể phân giải 1 mg tinh bột đến các sản phẩm không tạo màu với Iodine. Hoạt tính của enzyme được biểu diễn bằng số đơn vị Wolhgemuth trên 1 ml dịch môi trường hoặc 1 ml dung dịch chiết enzyme. Thiết bị, vất liệu và hóa chất: Bình tam giác hay bình cầu Ống nghiệm Máy ly tâm hay máy lọc Pipette Dung dịch enzyme: Nghiền cẩn thận môi trường thạch có chưa vi sinh vật, cân 20 – 100 g cho vào bình tam giác hay bình cầu, thêm 500 – 1000 ml dung dịch NaCl 1%, lắc liên tục từ 1 – 2 giờ trên mấy lắc ở nhiệt độ phòng. Lọc hoặc ly tâm để thu được dịch chiết trong suốt. Nếu môi trường nuôi cấy là dịch thể chỉ cần ly tâm tách sinh khối rồi sử dụng phần chất lỏng trong suốt thu được để phân tích. Dung dịch tinh bột 0,1% Dung dịch NaCl 0,1% Dung dịch iod 0,02%  Cách tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm, cho vào mỗi óng 1 ml dung dịch NaCl 0,1%. Thêm vòa ống thứ nhất 1 ml enzyme ròi lắc đều, lấy 1 ml chuyển sang ống thứ hai lại lắc đều và lấy 1 ml chuyển sang ống thứ ba… Cứ thế cho đến ống thứ 10, sau cùng lấy 1 ml ở ống thứ 10 bỏ đi. Cho vào mỗi ống 2 ml dung dịch tinh bột 0,1%, lắc đều, giữ ở 300C trong 30 phút. Làm lạnh, cho vào mooyj giọt dung dịch Iodine 0,02 N. Ghi nhận ống có độ pha loãng lớn nhất mà không cho tạo màu với Iodine. Ví dụ: Các ống từ 1 đến 4 không tạo màu, nhưng ống thứ 5 trở đi có màu thì hoạt tính của enzyme trong 1 ml dung dịch enzyme là 16 x 2 = 32 đơn vị. Trong đó 16 là độ pha loãng của dung dịch enzyme trong ống thứ tư, 2 là số mg tinh bột trong mỗi ống nghiệm.  Phương pháp kiểm tra hoạt tính protease (Phương pháp Gross và Fluld) Trong môi trường kiềm yếu, casein bị hòa tan nhưng khi thêm acid acetic trong ethanol, casein bị kết tủa. Trái lại, các sản phẩm thủy phân của casein lại không bị kết tủa trong điều kiện này. Phương pháp Gross và Fluld dựa trên cơ sở xác định lượng enzyme ít nhất cần thiết để phân giải 2 mg casein đến mức không bị kết tủa bởi acid acetic trong ethanol. Một đơn vị hoạt động là lượng enzyme 1ml dung dịch nghiên cứu có khả năng phân giải 1 mg casein ở 380C trong thời gian 30 phút.  Thiết bị, vật liệu và hóa chất Bể điều nhiệt hay tủ ấm (380C) Máy lắc ống nghiệm (vortex mixer) Ống nghiệm Dung dịch casein 0,1% Dung dịch acid acetic 1% trong ethanol  Cách tiến hành: Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô Cho vào mỗi ống 1ml nước cất, trừ ống thứ nhất. Cho vào ống thứ nhất và ống thứ hai mỗi ống 1 ml dịch chứa enzyme, lắc đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ hai vào ống thứ ba, lắc đều. Chuyển 1 ml dung dịch của ống thứ ba vào ống thứ tư, lắc đều. Cứ như vậy cho đến ống thứ 12. Kaays 1 ml từ ống thứ 12 bỏ đi. Như thế thể tích chất lỏng trong tất cả các ống đều là 1 ml. Tăng nhiệt độ của các ống đến nhiệt độ 380C bằng cách đặt chúng vào bể điều nhiệt cài ở 380C từ 10 – 15 phút. Thêm vào mỗi ống 2 ml dung dịch casein 0,1% có nhiệt độ 380C, lắc đều. Giữ ở 380C trong 30 phút. Đúng 30 phút làm lạnh ngay trong nước đá để ngừng phản ứng. Nhỏ theo vách mỗi ống vài giọt dung dịch acid acetic trong dung dịch ethanol. Nếu thấy tất cả các ống đều có kết tủa trắng, chứng tỏ lượng enzyme không đủ để phân giải hết casein. Cần phải chuẩn bị lại dụng dịch enzyme có nồng độ cao hơn. Còn nếu ở tất cả các ống đều không xuất hiện kết tủa cần phải pha loãng dung dịch enzyme đem phân tích. Trong trường hợp có một số ống xuất hiện kết tủa, số còn lại không kết tủa thì chọn lấy ống không kết tủa cuối cùng (đứng trước ống bắt đầu cho kết tủa) là ống có lượng enzyme bé nhất có khả năng phân giải hoàn toàn 2 mg casein. Ví dụ: ở ống thứ 7 là ống cuối cùng không cho kết tủa, lượng enzyme ban đầu pha loãng 64 lần trong ống này, tương đương với 0,0156 ml dung dịch enzyme ban đầu, và như vậy 1 ml dung dịch enzyme ban đầu có hoạt độ là 2/0,0156 = 128 đơn vị. Từ đó tính ra hoạt độ của enzyme trong 1 g chế phẩm.