Khóa luận Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN CHU THỊ BÍCH PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ***000*** Graduation thesis Major: Biotechnology RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE Doctor Student LE DINH DON CHU THI BICH PHUONG Ho Chi Minh City 8/ 2007 4 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:  Ban giám hiệu Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.  TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận.  Anh Nguyễn Văn Lẫm, anh Nguyễn Anh Khoa và các anh chị tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Trường đại học Nông Lâm.  Chị Kiều, chị Vy, Chị Vân cùng toàn thể các bạn sinh viên cùng thực hiện khóa luận tại phòng 105, khu Phượng Vĩ, Trường đại học Nông Lâm đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian qua.  Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học K29 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sau cùng, con xin bày tỏ lòng kính yêu và biết ơn sâu sắc nhất đối với bố mẹ; cám ơn bố mẹ và hai em đã luôn tin tưởng, yêu thương, tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt. Em cũng xin cám ơn anh đã luôn ủng hộ, động viên, giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Sinh viên thực hiện, Chu Thị Bích Phượng 5 TÓM TẮT Đề tài: "NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC" được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại Trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Hiện nay, cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nước ta cũng như nhiều nước trên thế giới (Cuba, Ấn Độ, Australia); vì vậy, diện tích trồng mía cũng như sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên, ở cây mía có đến 126 loại bệnh xảy ra làm giảm đáng kể đến năng suất và sản lượng của cây, gây thiệt hại to lớn đối với ngành công nghiệp đường trên thế giới (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó, bệnh cằn mía gốc được phát hiện ở hầu hết các khu vực trồng mía, có thể làm giảm đến 50 % sản lượng đối với các giống nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995). Đối tượng nghiên cứu là vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. Đây là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 μm, đôi khi dài đến 10 m), dạng conryne, kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch của cây, làm giảm sức sống và số lượng chồi tạo thành, đặc biệt là các chồi hình thành sau khi thu hoạch. Cây bị bệnh này thường còi cọc, đường kính cũng như chiều dài thân nhỏ hơn so với cây bình thường (Davis và ctv., 1980). Mục đích của đề tài nhằm khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng và khảo sát thời gian kí sinh gây tắc mạch của vi khuẩn khi xâm nhập vào cây; phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh; sau đó tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. Các thí nghiệm khảo sát trên nhằm tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó đưa ra chiến lược xử lý và kiểm soát bệnh hiệu quả. Các nội dung thực hiện (1) Khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng bằng phương pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method). (2) Chủng bệnh các cây nuôi cấy 6 mô 3 tháng tuổi bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. (3) Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh và thực hiện các phản ứng sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. Các kết quả thu đƣợc (1) Kết quả cho thấy hầu hết mía được khảo sát đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình. Vi khuẩn Lxx tập trung chủ yếu ở lóng thứ nhất từ dưới lên và có mật độ giảm dần trong các lóng ở phía trên. (2) Hầu hết các cây nuôi cấy mô sau khi chủng đều bị nhiễm bệnh. Kết quả khảo sát cho thấy cây bắt đầu bị tắc mạch sau khoảng 30 ngày chủng bệnh, tỉ lệ mạch tắc tăng dần theo thời gian quan sát (45, 60 ngày). (3) Các dòng khuẩn lạc phân lập được sau 28 – 42 ngày nuôi cấy đều có dạng tròn lồi, đường kính 0,1 – 0,3 mm, trong suốt giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền trên môi trường MSC và SC, sau đó tăng sinh trong môi trường lỏng S8 và thực hiện các thử nghiệm sinh hóa. Tuy nhiên, kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy chỉ có một dòng vi khuẩn phân lập được có thể là Leifsonia xyli subsp. xyli. Giới hạn của đề tài (1) Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này không thể tiến hành ở giai đoạn sớm mà chỉ có thể tiến hành đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi; do đó, việc kiểm soát bệnh ở giai đoạn cây còn nhỏ rất khó khăn. (2) Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, do môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. (3) Kết quả thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được, cần phải tiến hành các thử nghiệm phân tử để xác định lại kết quả đã đạt được. 7 SUMMARY The thesis titled: "RESEARCH ON Leifsonia xyli subsp. xyli, THE CAUSAL AGENT OF RATOON STUNTING DISEASE ON SUGARCANE" was submitted to Biotechnology Department, Nong Lam University by CHU THI BICH PHUONG in partial fulfillment of the requirements for the degree of Bachelor in Biotechnology. Ratoon stunting disease (RSD), caused by the xylem–limited coryneform bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), is a major constraint for worldwide sugarcane production. However, RSD is difficult to detect in the field because the typical symptoms of this disease, such as thinner, weaker and fewer stalks per stool, could be due to unknown factors. Since Lxx spread mechanically by infected planting and harvesting equipments, as well as by infected plant materials, it is necessary that the initial planting material be free of RSD. Our research was conducted to investigate the Lxx's distribution along the stalk, the infection level of the inoculated plants and the time for Lxx colonized the vascular; in order to develop the best control strategy to prevent losses from RSD. Although Lxx's colonization in the sugarcane is a systemic infection, the results of staining by Transpiration Method (STM) showed that the titer of the bacterium was different between the internodes. The bacteria titer was highest in the basal internode, it is suitable for conclusions of Dean (1984) and Grisham (2007); so that diagnoses should be conducted on this position. It took about 30 days for Lxx to colonize in the xylem vascular of the inoculated plants. After 28 – 42 days inoculated, bacteria strains isolated from sap of infected plants were subjected to the biochemical tests for identifing Lxx. The preliminary results showed that only one strain was recommended to be Lxx; consequently, molecular biology tools should be used to dissect Leifsonia xyli subsp. xyli, the causal agent of RSD. 8 MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................ vii Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các hình ............................................................................................. xii 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ..................................................................... 3 1.2.1. Mục đích ..................................................................................................... 3 1.2.2. Nội dung ..................................................................................................... 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 4 2.1. Giới thiệu sơ lược về cây mía ....................................................................... 4 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển ................................................................. 4 2.1.2. Phân loại học .............................................................................................. 4 2.1.3. Phân bố ....................................................................................................... 5 2.1.4. Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 5 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía ......................................................................... 5 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển .................................................. 6 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía ......................................................................... 8 2.2. Các loại bệnh hại trên mía ............................................................................. 9 2.3. Sơ lược về bệnh cằn mía gốc ....................................................................... 12 2.3.1. Tác nhân gây bệnh .................................................................................... 12 2.3.2. Triệu chứng ............................................................................................... 13 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh ........................................................... 14 9 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh ........................................... 15 2.4. Các phương pháp chẩn đoán, phát hiện vi khuẩn Lxx .................................. 16 2.4.1. Phương pháp chẩn đoán truyền thống ....................................................... 16 2.4.2. Phương pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi ................................. 16 2.4.3. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 16 2.4.4. Phương pháp huyết thanh học ................................................................... 17 2.4.5. Phương pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ..................... 18 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc ...................................................... 19 2.5.1. Trên thế giới .............................................................................................. 19 2.5.2. Trong nước ................................................................................................ 20 3. VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP ....................................................................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 21 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm ................................................................... 21 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................... 21 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm .................................................................................. 21 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ ....................................................................................... 22 3.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 22 3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................................ 22 3.3.2. Phương pháp nhuộm STM ........................................................................ 24 3.3.3. Phương pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh ........................................................................................ 24 3.3.4. Phương pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được .......................... 24 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn .................................................................. 24 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate ......................................... 26 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật ............................................................................................................. 26 3.4. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................... 27 10 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 29 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ..................................................................................... 29 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng ............................................................................ 34 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx ........................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được ..................................................... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 45 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 45 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 45 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt ............................................................................ 47 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh ............................................................................ 48 Tài liệu tham khảo Internet ................................................................................. 51 7. PHỤ LỤC ....................................................................................................... 52 Phụ lục 1: Môi trường SC ................................................................................... 52 Phụ lục 2: Môi trường MSC ................................................................................ 52 Phụ lục 3: Môi trường lỏng S8............................................................................ 53 Phụ lục 4: Môi trường Phenol Red Carbohydrate Broth ................................... 53 Phụ lục 5: Môi trường Starch ............................................................................. 53 Phụ Lục 6: Bảng sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx ............................................. 54 11 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Lxx : Leifsonia xyli subsp. xyli STM : Staining by Transpiration Method RSD : Ratoon Stunting Disease PCR : Polymerase Chain Reaction ctv. : cộng tác viên rRNA : Ribosome ribonuleic acid Mb : Mega bases bp : base pair ITS : Intergenic transcribed spacer region LT – EIA : Liquid Transfer Enzyme immunoassay EB – ELISA : Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay TBIA : Tissue Blot Enzym Immunoassay NCM : Nitrose cellulose membrance TRITC : Tetramethylrhodamine isothiocyanate FAT : Indirect flourescent antibody technique FADCF : Flourescent antibody directed counting filter µl : Micro litre µg : Micro gram µM : Micro mol mM : Mili mol IgG : Immunoglobulin 12 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến ............................ 11 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây............................................................ 29 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình ......................................................................... 35 Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được .................................................................. 41 13 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Cây mía ............................................................................................ 5 Hình 2.2. Một số bệnh hại phổ biến trên cây mía ........................................... 10 Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx – tác nhân gây bệnh cằn mía gốc .............................. 12 Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli được phân lập từ dịch chiết nước mía ..................................................... 13 Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc ................................ 14 Hình 3.1. Quy trình nhuộm STM để chẩn đoán cây mía bị bệnh ................... 23 Hình 3.2. Phương pháp chủng bệnh cằn mía gốc vào cây mía nuôi cấy mô ................................................................................................... 25 Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM ................. 30 Hình 4.2. Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh ........................................................................ 31 Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc................................................................ 36 Hình 4.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng sinh hóa .......................................... 42 14 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Mía là một loại cây công nghiệp ngắn ngày có vị thế ngày càng quan trọng ở nước ta. Nó là một trong những cây mũi nhọn, có hiệu quả kinh tế cao, là cây có ưu thế trong việc chuyển đổi cơ cấu cây trồng ở vùng đất cao chưa chủ động nước và vùng đồi thấp. Mía là cây có khả năng bảo vệ và bồi dưỡng đất, là cây làm giàu của trung du. Trước mắt, mía là cây lấy đường phục vụ cho tiêu dùng trong nước và xuất khẩu, trong tương lai mía còn là nguyên liệu quý của ngành năng lượng, ngành giấy và sợi nhân tạo (Trần Văn Sỏi, 2001). Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, vì vậy đây là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày càng đa dạng hơn. Trên thế giới hiện có 126 bệnh hại mía (Ricaud và ctv., 1989). Trong đó không thể không kể đến bệnh cằn mía gốc (Ratoon Stunting Desease - RSD); đây là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất, đặc biệt đối với những nước nông nghiệp tiên tiến có trình độ cơ giới hóa cao. Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra. Đây là bệnh có tác động nguy hiểm nhất đến sản lượng mía trên thế giới. Bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 – 15 % sản lượng (Comstock, 2005) và mức tổn thất có thể lên đến 50 % đối với vụ mía gốc (Davis, 1980). Vi khuẩn Lxx không gây ra các triệu chứng bên ngoài đặc trưng, hơn nữa sự lan truyền vi khuẩn lại diễn ra rất nhanh trong các ruộng mía làm cho thiệt hại do bệnh gây ra càng nặng nề hơn. Nhìn chung, cây bị nhiễm Lxx sẽ phát triển chậm hơn so với các cây khác cùng độ tuổi nên người nông dân thường lầm tưởng các triệu chứng của bệnh là do điều kiện canh tác (cây bị thiếu chất dinh dưỡng, đất trồng thiếu độ ẩm). 15 Lxx kí sinh chuyên tính trong bó mạch nên việc nghiên cứu loại vi khuẩn này rất khó khăn. Trên thế giới, vi khuẩn Lxx mới được quan tâm nghiên cứu trong thời gian gần đây. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc như: phân lập thành công vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh (Davis, 1980); thiết lập quy trình phát hiện Lxx trong dịch chiết và dịch khuẩn lạc bằng kĩ thuật PCR (Y Pan và ctv., 1998); giải mã trình tự bộ gen của Lxx (Luis và ctv., 2004). Ở nước ta, bệnh cằn mía gốc là một loại bệnh đã được phát hiện từ lâu, trong lịch sử cũng đã có nhiều vùng bị thiệt hại nặng nề do bệnh gây ra (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh này cũng như vi khuẩn Lxx; người nông dân thậm chí không biết ruộng mía của mình bị bệnh, sản lượng thu hoạch mía giảm đáng kể làm cho công suất của các nhà máy đường trong nước chỉ còn 50 – 60 % (Hà Đình Tuấn, 2004). Để phòng tránh được những thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và phẩm chất mía do bệnh gây ra, cần phải đề ra những biện pháp kiểm soát và quản lý bệnh một cách hiệu quả. Do đó, việc phát hiện sớm vi khuẩn Lxx trên cây mía là một yêu cầu cấp thiết trong công tác tuyển chọn và kiểm định giống nhằm tạo ra một nền nông nghiệp ổn định, hiệu quả, trực tiếp thúc đẩy ngành công nghiệp mía đường phát triển, đáp ứng đủ nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Do sự thiệt hại về sản lượng đã ra gây tổn thất đáng kể cho ngành công nghiệp mía đường cũng như tính cấp thiết của việc nghiên cứu, chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu và phát hiện vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli, tác nhân gây bệnh cằn mía gốc" nhằm tìm hiểu kĩ lưỡng hơn về tác nhân gây bệnh. Từ đó, đưa ra được một phương pháp phát hiện vi khuẩn nhanh chóng và chính xác, góp phần vào chiến lược kiểm soát và hạn chế bệnh. 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Thực hiện các nghiên cứu cơ bản về bệnh cằn mía gốc và vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli để tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử (PCR, 16 dot blot, nghiên cứu cấu trúc gen, cơ chế gây bệnh), từ đó tìm ra phương pháp kiểm soát và xử lý bệnh hiệu quả. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu Đề tài thực hiện gồm bốn nội dung chính như sau: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx trong bó mạch dọc theo vị trí lóng bằng phương pháp nhuộm STM. Chủng bệnh các cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx. Sau đó, khảo sát thời gian vi khuẩn kí sinh gây tắc mạch và thống kê tỉ lệ cây được chủng bị nhiễm. Phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường thạch MSC và SC. Thử nghiệm sinh hóa nhằm xác định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn được phân lập. 17 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu sơ lƣợc về cây mía (Saccharum spp.) 2.1.1. Nguồn gốc và lịch sử phát triển Qua nhiều năm tranh luận, ngày nay New-Ghine được thừa nhận là nơi nguyên sản của cây mía. Theo các tài liệu nghiên cứu về kiến tạo địa chất, nhiều tác giả cho rằng cây mía xuất hiện trên trái đất từ khi lục địa châu Á và châu Úc còn dính liền, cách đây hàng vạn năm. Ấn Độ và Trung Quốc là hai nước trồng mía có lịch sử lâu đời nhất trên thế giới. Ở Trung Quốc, căn cứ vào những tài liệu ghi chép cổ xưa cùng với sự phân bố rộng rãi của mía dại ở nhiều nơi trong nước và mức độ phong phú của những giống mía thương mại cho thấy cây mía được trồng rất lâu đời, khoảng thế kỉ VI trước công nguyên. Nghề trồng mía ở châu Á được truyền bá đi khắp nơi trên thế giới theo hai con đường: từ Trung Quốc truyền sang phía Đông Nam đến Philippine, Nhật Bản, Indonexia; từ Ấn Độ sang phía Tây tới Iran, Ai Cập, Tây Ban Nha, Ý,... Cây mía được trồng ở các nước vùng Địa Trung Hải vào khoảng đầu thế kỉ XIII. Năm 1940, trong chuyến vượt biển lần 2, Christopher Columbus mới đưa mía sang châu Mỹ, đầu tiên trồng ở đảo Santo Domingo, sau đó tới Mexico (1502), Brazil (1532), Peru (1533), Cuba (1650) (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). 2.1.2. Phân loại học Cây mía thuộc: Ngành có hạt (Spermatophyta) Lớp một lá mầm (Monocotyledoneae) Họ hòa thảo (Gramineae) Giống Saccharum. Trong giống Saccharum có năm loài: Loài nhiệt đới (Saccharum officinarum L.) Loài Trung Quốc (Saccharum sinence Roxh Ement Jesw) Loài Ấn Độ (Saccharum barberi Jesw) 18 Hình 2.1. Cây mía (Nguồn: www.apsnet.org/ online/slideset/sugarcane) Loài hoang dại thân nhỏ (Saccharum spontaneum L.) Loài hoang dại thân to (Saccharum robustum Bround and Jesw) Các giống mía thương mại hiện nay là sản phẩm lai tự nhiên, lai nhân tạo giữa các loài kể trên với nhau hoặc do quá trình tuyển chọn từ ba loài Saccharum officinarum, Saccharum sinence, Saccharum barberi (Trần Văn Sỏi, 2003). Điều này cho thấy sự phong phú của các giống mía trồng hiện nay. 2.1.3. Phân bố Hiện nay, cây mía là cây trồng chính ở nhiều nước nhiệt đới trên thế giới. Nơi có vĩ độ cao nhất mà cây mía được trồng là Natal, Argentina, cực nam của Australia (khoảng 30 độ S), phía tây nam Pakistan (khoảng 34 độ N) và phía nam Tây Ban Nha (37 độ N) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). 2.1.4. Đặc điểm thực vật học 2.1.4.1. Các bộ phận của cây mía Rễ mía: cây mía có hai loại rễ là rễ sơ sinh và rễ thứ sinh. Rễ sơ sinh (rễ hom) mọc ra từ đai rễ của hom trồng; loại rễ này có nhiệm vụ bám đất, hút nước, cung cấp chất dinh dưỡng cho sự nảy mầm ở thời kì đầu sinh trưởng. Khi mầm mía chuyển thành cây con, các rễ thứ sinh mọc ra từ đai rễ của cây con tự hút nước và chất dinh dưỡng để cung cấp cho cây, các rễ sơ sinh sẽ teo dần và biến mất. Thân mía: được hình thành bởi nhiều lóng mía hợp lại, có màu sắc và hình dạng khác nhau. Thân mía không chỉ là nơi để giữ bộ lá mà còn có nhiệm vụ dẫn nước, chất dinh dưỡng từ rễ tới lá và dự trữ đường nhờ quá trình quang hợp ở bộ lá. Thân mía là đối tượng thu hoạch và là nguyên liệu chính để chế biến đường ăn. Lá: gồm có bẹ lá và phiến lá. Bẹ lá là phần bao bọc thân mía, bảo vệ mắt mầm; phiến lá có hình lưỡi mác (màu xanh hoặc màu xanh thẩm), có một gân giữa 19 màu sáng và hình dáng, kích thước khác nhau tùy giống. Lá là tổ chức đồng hóa thực sự của cây, lá có nhiệm vụ hô hấp và thực hiện quá trình quang hợp. Hoa (bông cờ): hoa mía có tổ chức sinh sản ngầm với cấu trúc đơn giản. Mỗi hoa bao gồm cả tính đực và tính cái với ba nhị, một bầu noãn và hai nhụy. Khi hoa mía nở, các bao phấn của nhị tung phấn, nhờ gió mà nhụy cái dễ dàng tiếp nhận hạt phấn. Ở cây mía, có giống ra hoa, có giống không ra hoa, có giống ra hoa sớm, có giống ra hoa muộn,... đó là kết quả sinh lý tự nhiên của cây trồng nói chung và cây mía nói riêng. Tuy nhiên, trong sản xuất người ta không thích mía ra hoa. Hạt mía: là vật liệu sinh sản hữu tính của cây mía, đây là kết quả cuối cùng của giai đoạn sinh thực. Hạt mía giống một chiếc vảy nhỏ, hình thoi và nhẵn, độ dài 1 - 1,25 mm, nặng 0,15 - 0,25 mg. Hạt mía chỉ có ý nghĩa trong lai tạo tuyển chọn giống mía (Nguyễn Huy Ước, 1999; Trần Thùy, 1996). 2.1.4.2. Các giai đoạn sinh trƣởng và phát triển Theo Đoàn Thị Thanh Nhàn (1996), chu kì sinh trưởng của cây mía trong một vụ thường kéo dài 1 năm (trường hợp đặc biệt như ở Hawai là 2 năm). Nhưng chu kì khai thác của 1 ruộng mía có thể kéo dài từ 3 - 10 năm tùy vào điều kiện từng vùng. Dù là mía tơ hay mía gốc, chu kì sinh trưởng của cây mía gồm 5 thời kì: Thời kì nảy mầm: thời kì nảy mầm tính từ khi đặt hom trồng cho tới lúc mầm mía nảy thành cây con, mở đầu cho hoạt động sống của cây mía. Hom mía từ trạng thái ngủ chuyển sang trạng thái hoạt động trải qua một loạt biến đổi sinh hóa phức tạp. Trong quá trình nảy mầm, hom mía hô hấp mạnh. Dưới tác dụng của enzyme, đường saccharose và protein được phân giải thành glucose và acid amine cung cấp cho hoạt động sống của mầm, rễ. Nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự nảy mầm là đường glucose và acid amine, do đó hàm lượng các chất này trong hom mía nhiều hay ít có quan hệ trực tiếp đến tốc độ nảy mầm. Giữa hàm lượng đường glucose và số ngày cần thiết cho sự nảy mầm có tương quan nghịch, hàm lượng đạm tan trong hom mía tương quan thuận với tỉ lệ nảy mầm. Thời kì cây con: bắt đầu từ khi cây có lá thật thứ nhất cho đến khi phần lớn cây trong ruộng mía có 5 lá thật. Rễ cây bắt đầu phát triển khi cây con có hai lá thật, 20 như vậy trong suốt thời gian đầu cây con sống một phần dựa vào rễ hom. Sau khi rễ cây đã phát triển mạnh thì nhiệm vụ cung cấp dinh dưỡng chính do rễ cây đảm nhiệm. Do đó, trong thời kì này, phải tạo điều kiện cho lá sinh trưởng mạnh để cây quang hợp tốt, đồng thời thúc đẩy rễ cây phát triển nhanh. Thời kì đẻ nhánh (nhảy bụi hoặc đâm chồi): đẻ nhánh thực chất là sự nảy mầm của những mầm ở phần gốc của cây. Khi cây mía có từ 6 - 7 lá thật, các mầm nằm ở dưới mặt đất nảy thành nhánh. Từ thân mẹ đẻ ra nhánh cấp 1, nhánh cấp 1 đẻ ra nhánh cấp 2 và tiếp tục thành một bụi mía. Thời gian đẻ nhánh thường kéo dài từ 3 - 4 tháng tùy thuộc giống mía, thời vụ trồng, kĩ thuật chăm sóc. Thời kì vươn cao (vươn lóng): trong thời kì này, thân vươn cao nhanh, đường kính thân tăng mạnh, rễ, ngọn phát triển, số lá tăng thêm và đổi mới không ngừng. Trong các thời kì trước, mía sinh trưởng chậm vì quá trình quang hợp ở lá và sự hấp thụ ở rễ còn yếu, sản phẩm quang hợp tạo ra có hạn và một phần quan trọng phải dùng để tạo nên thân, lá, rễ. Trong thời kì vươn cao, trên cơ sở bộ lá và bộ rễ đã phát triển hoàn chỉnh, các quá trình sinh lý của cây đạt tới đỉnh cao, hiệu lực sử dụng độ phì đất đai, phân bón, năng lượng ánh sáng mặt trời tăng lên. Trong thời kì này mía sinh trưởng nhanh, tốc độ tăng trưởng chiều cao đạt từ 10 cm/tháng đến 50 cm/tháng. Do đó, thời kì vươn cao là thời kì quyết định trọng lượng thân, tức là thời kì quyết định năng suất mía cây. Thời kì chín công nghiệp và trổ cờ: vào cuối thời kì vươn lóng, nhiệt độ và lượng mưa giảm dần (ở nước ta thường là từ tháng 11 trở đi), cây mía sinh trưởng chậm lại và bước vào thời kì tích lũy đường mạnh mẽ. Sự hình thành và tích lũy đường trong cây mía bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn một là sự kết hợp của CO2 và H2O thành đường đơn glucose với sự có mặt của diệp lục và ánh sáng. Giai đoạn hai là quá trình chuyển hóa đường đơn thành đường saccharose và các đường đa khác, giai đoạn này không cần ánh sáng và diệp lục. Các bộ phận của cây mía như thân, lá đều có thể tổng hợp đường mía từ đường đơn. Đường mía tổng hợp từ lá chuyển vào thân, một phần dùng cho hô hấp và cấu tạo thân, lá, rễ; phần còn lại tích lũy trong thân dưới dạng saccharose. 21 Chín công nghiệp là khi hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để thu hoạch ép đường. Lúc cây mía đang sinh trưởng hàm lượng đường glucose trong cây thấp, khi cây sinh trưởng chậm lại phần lớn các sản phẩm đồng hóa do bộ lá tạo thành chuyển sang dạng đường tích lũy trong thân, hàm lượng đường trong cây tăng lên nhanh chóng. Quá trình tích lũy đường trong cây mía diễn ra từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên. Lúc mía sắp chín, tốc độ tăng hàm lượng đường ở những lóng trên nhanh hơn lóng dưới; do đó, hàm lượng đường trong ngọn "đuổi kịp" gốc cho đến lúc bằng nhau. Khi hàm lượng đường của phần thân ngọn tương đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp. Trổ cờ là thời kì chín sinh học của cây mía. Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ tháng 10 (miền Nam) đến tháng 12 (miền Bắc). Trổ cờ thường không trùng với thời kì chín công nghiệp và có ảnh hưởng không tốt đến nguyên liệu mía cây phục vụ cho nhà máy đường. Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ xơ tăng. Vì vậy, trong sản xuất mía thường tìm cách hạn chế sự ra hoa kết hạt. 2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía Mía là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đường. Đường là loại thực phẩm cần thiết trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới. Trong cơ thể con người, đường mía được chuyển hóa thành glucose và fructose, các loại đường tham gia vào quá trình oxy hóa để tạo năng lượng cho cơ thể hoạt động. Trung bình 1 kg đường cung cấp năng lượng tương đương 0,5 kg mỡ hoặc 50 - 60 kg rau quả. Ngoài sản phẩm chính là đường, những phụ phẩm của cây mía gồm: Bã mía: chiếm 25 - 30 % trọng lượng mía đem ép. Bã mía chứa trung bình 49 % nước, 48,5 % xơ, 2,5 % chất hòa tan (đường). Bã mía có thể dùng ngay làm nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc. Cao hơn nữa, từ bã mía có thể làm ra furfural là nguyên liệu của ngành sợi tổng hợp. Mật gỉ: chiếm 3 - 5 % trọng lượng mía đem ép. Thành phần mật gỉ gồm nước (10 %), đường saccharose (35 %), đường khử (20 %), tro (15 %). Mật gỉ là nguyên liệu để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công nghiệp (từ 1 tấn mật gỉ có thể 22 sản xuất được 300 lít cồn tinh và 3800 lít rượu). Ngoài ra, mật gỉ còn được sử dụng để sản xuất các loại men và các loại acid (acid acetic, acid citric). Bùn lọc: chiếm 1,5 – 3 % trọng lượng mía đem ép, là sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đường. Bùn lọc chứa 0,5 % N, 1,6 % P2O5, 0,4 % K2O, 3 % protein thô và một lượng lớn chất hữu cơ. Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa xerezin làm sơn, xi đánh giày, bản sáp roneo. Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận dụng làm phân bón. Về phương diện nông học, mía là loại cây trồng có khả năng thích ứng mạnh, có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, cho phép tận dụng, cải tạo những vùng đất khó khăn. Tóm lại, mía là cây trồng có khả năng cho sinh khối lớn, lại có khả năng tái sinh mạnh (trồng một năm thu hoạch được nhiều năm) nên có hiệu quả kinh tế cao (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). 2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày càng đa dạng hơn. Từ năm 1989 đến nay, thành phần bệnh hại mía trên thế giới và các tác nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2 bệnh do phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí sinh, 2 bệnh do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân (Joaquin, 2001) (Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004). Ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu và khảo sát bệnh trên cây mía không nhiều. Theo kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn (2004) cho thấy vùng nguyên liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa biết tác nhân và một số bệnh khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi trường và dinh dưỡng gây ra. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến được trình bày ở bảng 2.1 23 24 Bảng 2.1. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến Nguồn: Hà Đình Tuấn (2004) Tên Việt Nam Tên tiếng Anh Tác nhân gây hại I Bệnh do nấm 1 Bệnh sọc nâu Brown stripe Cohliobalus stenospilus Drechs 2 Bệnh mốc sương Downy mildew Peronosclerospora sacchri T. Miyake 3 Bệnh đốm mắt én Eye spot Bipolaris sacchari shoemaker 4 Bệnh đốm trắng White speck Bipolaris sacchari T.C.Lo 5 Bệnh cháy lá Leaf scorch Stagonospora sacchari Lo and Ling 6 Bệnh dứa Pinapple disease Ceratosystis paradoxa Moreau 7 Bệnh xoắn cổ lá Pokkah boeng Fusarium moniliform Sheldon 8 Bệnh thối đỏ Red rod Colectotrichum falcatum Went 9 Bệnh rỉ sắt đỏ Rust Puccinia melanopcephala H. & P. Syd 10 Bệnh rỉ sắt vàng Rust orange P. kuehnii Butl 11 Bệnh than Smut Ustilago senaminea Syd 12 Bệnh đốm vàng Yellow spot Mycovellosiella koepket 13 Bệnh đốm vòng Ring spot Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan II Bệnh do vi khuẩn 14 Bệnh gôm Gumming diease Xanthomonas camestris pv. Vasculorum 15 Bệnh thân ngọn đâm chồi Leaf scald Xanthomonas alibilineans 16 Bệnh cằn mía gốc Ratoon stunting disease Leifsonia xyli subsp. xyli 17 Bệnh sọc đỏ Red stripe Pseudomonas rubrilineans III Bệnh do Phytoplasma 18 Bệnh chồi cỏ Grassy shoot Chưa rõ 19 Bệnh trắng lá White leaf Chưa rõ VI Bệnh do virus 20 Bệnh sọc vàng Chlorotic streak Chưa rõ 21 Bệnh Fiji Fiji disease Fiji disease virus 22 Bệnh khảm Mosaic Sugarcane mosaic virus 23 Bệnh đốm sọc Streak Sugarcane streak virus 24 Bệnh vàng gân lá Yellow leaf disease Sugarcane yellow leaf virus 25 2.3. Sơ lƣợc về bệnh cằn mía gốc 2.3.1. Tác nhân gây bệnh Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía trên thế giới: Antigua, Argentina, Australia, Bangladesh, Barbados, Belize, Bolivia, Brazil, Burkina Faso, Cameron, Trung Quốc, Colombia, Congo, Costa Rica, Cuba, Ấn Độ, Indonesia, Nhật, Malaisia, Mali, Mexico, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam,... (Gillaspie và Teakle, 1989; Davis và Bailey, 2000). Đây được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới, bệnh có thể gây thiệt hại từ 5 - 15 % sản lượng (Comstock và Lentini, 2005), đôi khi tổn thất lên đến 30 - 50 % tổng sản lượng mía thu được đối với các giống mía nhạy cảm và không có khả năng kháng (Bailey và Bechet, 1995; Pan và ctv., 1998, Brumbley và ctv., 2006). Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu tiên ở Australia từ năm 1944 - 1945 nhưng vào thời điểm đó người ta vẫn chưa tìm ra nguyên nhân. Hughes và Steindl (1955) đã tìm ra tác nhân gây bệnh và cho rằng đó là do virus. Năm 1973, một loại vi khuẩn nhỏ được phát hiện là có liên kết với bệnh cằn mía gốc (Gillaspie và Teakle, 1989; Teakle và ctv., 1978) (Trích dẫn bởi Claudia B. Monteiro-Vitorello và ctv., 2004). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã phân lập thành công loại vi khuẩn này từ dịch chiết của cây bị bệnh trên môi trường nhân tạo. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) là một loại vi khuẩn có kích thước nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) (Davis và ctv., 1980), dạng coryne, hiếu khí và rất khó nuôi cấy do cần nguồn dinh dưỡng phức tạp. Chúng sống ở các bó mạch gỗ của cây mía gây tắc bó mạch và lây truyền sang cây khác thông qua vật liệu trồng bị nhiễm bệnh hay các dụng cụ trồng và thu hoạch (Taylor và ctv., 2003). Ban đầu, loại vi khuẩn này được xếp vào loài Clavibacter do các đặc Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx - tác nhân gây bệnh cằn mía gốc (Nguồn: www.leifsonia.lncc.br/ lxxsite/index.php) 26 tính kiểu hình nhưng gần đây đã được thay đổi thành Leifsonia dựa vào các kết quả phân tích gen rRNA. Cách phân loại này đã được xác nhận bởi Young và ctv. (2006) (Trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006). Vi khuẩn Lxx có dạng thẳng hay gậy mảnh nhưng một vài tế bào lại căng phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào, sinh sản theo hình thức nhân đôi (hình 2.3). Mesosome thường hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn (hình 2.4). Cho đến nay, người ta nhận thấy cây mía là kí chủ tự nhiên duy nhất của Lxx, loại vi khuẩn này kí sinh chuyên tính trên cây mía nhưng không tạo ra các triệu chứng bệnh đặc trưng (Davis và Bailey, 2000). 2.3.2. Triệu chứng Thông thường, triệu chứng cằn cỗi và khả năng mọc chồi kém được cho là hậu quả của sự tắc mạch. Tuy nhiên, Leifsonia xyli subsp. xyli không tạo ra các triệu chứng bên trong hoặc bên ngoài đáng tin cậy (Brumbley và ctv., 2006). Triệu chứng nghi ngờ là cây bị cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, số lượng cây (bụi) ít hơn bình thường. Trong các vụ gốc, cây bệnh sinh trưởng chậm và có thể chết đối với các giống mẫn cảm cao. Ở các giống mẫn cảm cao, cây bị rũ xuống Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đƣợc phân lập từ dịch chiết nƣớc mía (Nguồn: Brumbley và ctv., 2006) Chú thích: Có 4 mesosome rõ ràng (3 trong tế bào dài và 1 trong tế bào ngắn). Đường kính của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đo được là 195 - 220 nm, chiều dài của hai tế bào gắn với nhau là 2610 nm. Tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli không xuyên qua màng lọc 0,22 m nhưng có thể xuyên qua màng lọc 0,4 m. Các vi khuẩn hình que này có thể phồng ra ở một đầu làm cho chúng có dạng hình chùy. 27 trong điều kiện thiếu ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh phát triển kém hơn so với cây khỏe mạnh bình thường. Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của cây bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi màu này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và Bailey, 2000) (Hình 2.5). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng đến nâu đỏ của tế bào mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể có là làm cho 1 phần thân bị chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng của chồi non hay hóa đỏ cam tại các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã trưởng thành (Brumbley và ctv., 2006). 2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh Vi khuẩn Lxx kí sinh chuyên tính trong cây mía và không có môi giới lan truyền bệnh; bệnh lây nhiễm trong cánh đồng do sử dụng hom giống đã bị nhiễm bệnh. Bởi vì triệu chứng của bệnh không thể quan sát được bằng mắt nên vi khuẩn có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông dân vẫn không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Nguồn: www.pakissan.com/english/allabout/crop/sugarcane.shtml) a) Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; b) Đốt thân ngắn; c) Vết đổi màu trong thân cây mía bệnh 28 mía có dấu hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác như: điều kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng. Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan trong đồng ruộng một cách nhanh chóng thông qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự lây nhiễm do máy móc khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía cũng có thể là tác nhân truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại tiếp tục gặm sang một thân mía khỏe khác. Ngoài ra, có một vài báo cáo mới đây cho rằng vi khuẩn Lxx vẫn tiếp tục sống sót trong đất sau khi thu hoạch và tái nhiễm vào rễ cây khỏe mạnh thông qua vết thương; tuy nhiên, quy mô của sự lây nhiễm này vẫn chưa được biết (Comstock và Lentini, 2005; Davis và Bailey, 2000). Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv. (1996), tùy thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm cũng như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất lợi về nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng tỉ lệ bệnh. Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003). 2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới. Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước và chất dinh dưỡng của cây (Kao và Damann, 1978; 1980). Bởi vì cây mía có thể phát triển thành 4 - 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng, tránh sự xâm nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và Mirkov, 2003). Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong nước nóng (50 C) trong hai giờ trước khi đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước khi thu hoạch sang ruộng khác. Các chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol, dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5 phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng. Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là 29 miễn dịch hoàn toàn đối với sự xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80- 1743 là 2 giống đã được chứng minh là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía gốc (Comstock và Lentini, 2005). 2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx 2.4.1. Phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống Phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên ngoài như sự cằn cỗi của cây, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của cây mía trưởng thành và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl, 1955). Tuy nhiên cường độ biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây cũng như giữa các cây trong cùng một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện của bệnh không khác gì mấy so với bệnh do các tác nhân thông thường gây ra trên mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ học (Gillaspie và Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Do đó, bệnh cằn mía gốc thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm. 2.4.2. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi Kiểm tra trực tiếp dịch chiết nước mía bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi nền tối ở độ phóng đại X-1000 để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp này có độ nhạy thấp (khoảng 1 x 106 tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng mẫu lớn (Taylor và ctv., 2003). Việc phát hiện vi khuẩn dưới kính hiển vi đặc biệt khó khăn đối với cây bị nhiễm Lxx ở giai đoạn đầu, sau khi tưới hoặc trong mùa mưa; bởi vào các thời điểm này, nồng độ vi khuẩn Lxx ở trong dịch chiết nước mía rất thấp (Davis và Bailey, 2000). Do đó, hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người quan sát. 2.4.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method ) Sự kí sinh của các tế bào vi khuẩn Lxx làm ngăn cản sự hấp thu nước và chất dinh dưỡng của cây; sự tạo gel và chất gôm trong bó mạch mộc là dấu hiệu sinh lý quan trọng liên quan đến sự giảm sản lượng ở cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Giglioti và ctv., 1999). Dựa vào các đặc điểm trên, phương pháp nhuộm STM đã được phát triển nhằm chẩn đoán, phát hiện cây mía bị bệnh. 30 2.4.4. Phƣơng pháp huyết thanh học Kĩ thuật huyết thanh bao gồm nhuộm kháng thể huỳnh quang (fluorescent- antibody staining - FAT), kĩ thuật miễn dịch dot blot (dot blot immunoassay) và kĩ thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay). Gần đây, người ta đã cải tiến kĩ thuật miễn dịch dot blot thành kĩ thuật phân tích miễn dịch học enzyme liên kết với mô mẫu (Tissue Blot Immunoassay - TBIA) để chẩn đoán bệnh và đánh giá mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể phát hiện Lxx trong một số lượng lớn mẫu mía một cách nhanh chóng; ngoài ra, kĩ thuật này còn được sử dụng để chọn lọc dòng kháng bệnh và xác định mức độ tác động của bệnh đối với cây giống (Comstock và Lentini, 2005). Nhuộm kháng thể huỳnh quang: Harris và Gillaspie (1978) là những người đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (FAT) sử dụng kháng huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Brlansky và ctv. (1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Năm 1985, Davis phát triển kỹ thuật đếm trực tiếp kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) cho độ nhạy gấp 100 lần FAT. Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần (Trích dẫn bởi Westphal and Mirkov, 2003). Kĩ thuật miễn dịch dot blot: dịch chiết nước mía (50 μl) được trộn với 10 mM PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 (v:v). 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua màng NCM 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80°C trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dương tính được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng. Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu: vi khuẩn được tách ra khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm, được dính lên màng nitrocellulose (NCM) và được nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học. 31 Evaporative binding - Enzym Linked immunosorbent assay (EB – ELISA): phương pháp EB - ELISA do Croft và ctv. đưa ra năm 1994 để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Dịch chiết nước mía được ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong 5 phút. Dịch nổi được loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm. Mẫu phân tích được cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 35°C. Sau khi ủ, mẫu được đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể. Phương pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường với mật độ thấp hơn 105 tế bào/ml và 5.105 tế bào/ml trong dịch chiết. Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT – EIA): Leaman và ctv. (1991) sử dụng phương pháp LT - EIA để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc và so sánh phương pháp này với phương pháp FADCF. Phương pháp LT - EIA phát hiện được Lxx ở nồng độ 5.101 tế bào/ml dịch chiết và cho độ chính xác đến 98 %. FADCF có khả năng phát hiện 5.101 tế bào/ml và với độ chính xác đến 100 %. Tuy nhiên, FADCF không thể thực hiện nhiều mẫu cùng một lúc còn LT - EIA thích hợp cho việc kiểm tra một số lượng mẫu lớn (Trích dẫn bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Mặc dù những kĩ thuật này được chấp nhận vì đủ độ nhạy, tương đối rẻ tiền và hiệu quả nhưng đòi hỏi người phân tích phải có kinh nghiệm, đặc biệt khi giải thích các kết quả kiểm tra âm tính. Tất cả các kĩ thuật huyết thanh để phát hiện vi khuẩn này đều dựa vào huyết thanh miễn dịch đa dòng chống lại tất cả các vi khuẩn. Theo Davis và Dean (1984), giới hạn phát hiện là 104 tế bào/ml dịch chiết có thể được cải thiện bằng cách dùng các kháng thể đơn dòng. 2.4.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử Dưới kính hiển vi hay bằng phương pháp miễn dịch học ta có thể phát hiện được Lxx vào cuối vụ mía lúc mà nồng độ vi khuẩn cao nhất trong cây (Pan và ctv., 1998). Tuy nhiên, việc phát hiện sớm tác nhân gây bệnh trên mía có ý nghĩa đặc biệt quan trọng trong các chương trình trao đổi giống để tránh sự lan truyền bệnh từ vùng này sang vùng khác hay từ quốc gia này sang quốc gia khác (Taylor và ctv., 2003). Gần đây, việc ứng dụng các kĩ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và phát hiện vi khuẩn Lxx ở cây mía đã đem lại các kết quả đáng tin cậy, có độ nhạy, 32 độ đặc hiệu cao trong giai đoạn sớm. Theo Taylor và ctv. (2003), phương pháp chẩn đoán dựa vào kĩ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao hơn (104 tế bào/ml) so với các phương pháp khác: phương pháp kiểm tra miễn dịch học (104 - 105 tế bào/ml) (Gilaspie và Harris, 1979; Davis và Dean, 1994); quan sát vi khuẩn Lxx trên nền kính hiển vi đối pha (106 tế bào/ml). Chẩn đoán dựa vào việc sử dụng các probe DNA: Chung và ctv. (1994) đã sử dụng probe DNA để làm tăng độ nhạy trong phát hiện vi khuẩn Lxx ở nồng độ 104 tế bào/ml. Tuy nhiên, kĩ thuật này dựa vào sự lai của mỗi mẫu vi khuẩn với các probe DNA được đánh dấu, chậm và tốn kém nên không hiệu quả trong công tác chẩn đoán bệnh (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Kỹ thuật PCR: Pan và ctv. (1998); Taylor và ctv. (2003); Grisham và ctv. (2007) đã thành công trong chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kĩ thuật PCR. Primer cho các phản ứng này được thiết kế từ vùng ITS (intergenic transcribed spacer region) giữa gen rRNA 16S và 23S của operon rRNA vi khuẩn Lxx. 2.5. Tình hình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc 2.5.1. Trên thế giới Bệnh cằn mía gốc là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất tác động đến năng suất và sản lượng mía trên thế giới. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã đạt được một số thành công nhất định từ quá trình nghiên cứu bệnh cằn mía gốc. Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia (trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Đến năm 1980, Davis và ctv. đã thành công khi phân lập vi khuẩn Lxx từ dịch chiết nước mía trên môi trường nhân tạo. Năm 1998, Pan và ctv. dùng kĩ thuật PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và dịch chiết nước mía; cặp mồi Cxx được sử dụng để khuếch đại đoạn DNA dài 438 bp đặc hiệu cho tác nhân gây bệnh. Hoy và ctv. (1999) đã tiến hành so sánh hiệu quả của các phương pháp khác nhau trong phát hiện dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chuyển gen và gây đột biến Transposon thành công trên đối tượng vi khuẩn Lxx. Cặp mồi có độ nhạy và tính đặc 33 hiệu cao hơn cho phản ứng PCR phát hiện Lxx trong dịch chiết nước mía đã được phát triển bởi Taylor và ctv. (2003). Năm 2004, Monteiro-Vitorello và ctv. đã thành công trong quá trình nghiên cứu trình tự genome của vi khuẩn Gram dương Lxx. Cũng trong năm này, viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc đã phát hiện được vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR. Đến năm 2006, Young và ctv. đã chứng minh sự ổn định về mặt di truyền của 105 quần thể Lxx được phân lập từ các vùng trồng mía có sự phân bố địa lý khác nhau trên thế giới (Indonesia, Nhật Bản, Hoa Kỳ, Brazil, Mali, Zimbabwe, Nam Phi và Réunion). Gần đây nhất, vào tháng 4 năm 2007, Grisham và ctv. đã tuyên bố thành công trong việc chẩn đoán sớm dịch bệnh cằn mía gốc trên cánh đồng. Tác giả đã tiến hành phản ứng Real – Time PCR để phát hiện vi khuẩn Lxx từ lá của cây mía còn non. Đây là một nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong chiến lược đề phòng và kiểm soát dịch bệnh từ giai đoạn sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra. 2.5.2. Trong nƣớc Bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện ở nước ta từ rất lâu và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với nhiều vùng sản xuất (Hà Đình Tuấn, 2004). Tuy nhiên, loại bệnh này vẫn chưa thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. Các nghiên cứu về bệnh cằn mía gốc trong nước chỉ tập trung vào khía cạnh điều tra, khảo sát, đánh giá tỉ lệ bệnh cũng như tác hại của bệnh trên cánh đồng. Cho đến nay, ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào về tác nhân gây bệnh cằn mía gốc. 34 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ ngày 1 tháng 4 năm 2007 đến ngày 30 tháng 8 năm 2007 tại phòng Bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và hóa chất thí nghiệm 3.2.1. Vật liệu thí nghiệm Mẫu mía bệnh làm vật liệu thí nghiệm thuộc các giống C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427 được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, Bình Dương. Cây mía được chọn là cây có các biểu hiện bên ngoài của bệnh cằn mía gốc (cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, có vết đổi màu trong thân). Cây con nuôi cấy mô trong thí nghiệm chủng được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm Hóa chất trong dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: Safranin (BDH Chemicals, Anh), cồn 96 . Hóa chất trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx: cornmeal agar (Việt Nam), Bactoagar (BioRad, Mỹ), Bactopeptone (Himedia, Ấn Độ), bovine hemine chloride (Nacalai Tesque, Nhật), MgSO4. 7H2O (Merk, Đức), K2HPO4 (Merk, Đức), KH2PO4 (Merk, Đức), glucose (Merk, Đức), cystein (Nacalai Tesque, Nhật), bovine serum albumine (Nacalai Tesque, Nhật), nalidixic acid (Nacalai Tesquie, Nhật), soytone (Nacalai Tesquie, Nhật), hemine chloride (Sigma, Đức). Ngoài ra, HCl (Merk, Đức) và NaOH (Merk, Đức) được sử dụng để điều chỉnh pH môi trường về giá trị thích hợp cho sự sống của vi khuẩn. 35 Hóa chất trong các thử nghiệm sinh hóa khẳng định vi khuẩn Lxx: dung dịch KOH 3 % (Merk, Đức), proteone peptone (Oxoid, Anh), NaCl (Merk, Đức), beef extract (Himedia, Ấn Độ), phenol red (Merk, Đức), manitol (Merk, Đức), sorbitol (Merk, Đức), H2O2 30 % (Trung Quốc), dung dịch thuốc thử KI (Trung Quốc), peptone (Himedia, Ấn Độ), starch (Việt Nam), agar (Việt Nam), casein (Oxoid, Anh), ferric citrate (Trung Quốc). 3.2.3. Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ được sử dụng trong toàn bộ quá trình thí nghiệm bao gồm: kính hiển vi quang học, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow), máy đo pH, tủ định ôn, màng lọc vô trùng (0,2 m và 0,45 m), màng parafilm, cối, chày, dao, hộp nhựa, bercher, kim tiêm, túi nilon, ống nghiệm, ống Durham, bình tam giác, đĩa petri, micropipet và đầu típ các loại. 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu Bệnh cằn mía gốc không tạo ra các triệu chứng biểu hiện rõ rệt và đặc trưng nên rất khó phát hiện cây bị bệnh (Pan và ctv., 1998; Brumbley và ctv., 2006; Taylor và ctv., 2003). Do đó, cần phải rất thận trọng trong quá trình thu thập mẫu để chọn đúng cây bị bệnh vì đây là khâu quan trọng đầu tiên quyết định thành công của tất cả các thí nghiệm. Chỉ tiêu quan sát Cây sinh trưởng và phát triển chậm, có đường kính nhỏ, lóng ngắn hơn so với các cây xung quanh. Tuy nhiên, nếu hầu hết cây trong ruộng mía đều bị bệnh thì sẽ không có sự khác biệt (Comstock và Lentini, 2005). Do đó, chúng tôi tiến hành so sánh với cây trong một ruộng khác có các điều kiện canh tác tương tự (cùng giống, cùng thời gian trồng, cùng lượng nước tưới và phân bón). Ngoài ra, cây bị bệnh còn có sự đổi màu của các bó mạch ở phía dưới mắt mía (khi dùng dao chặt chéo thân qua phần mắt mía có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn) (Comstock và Lentini, 2005; Brumbley và ctv., 2006; Pan và ctv., 1998). 36 37 3.3.2. Phƣơng pháp nhuộm STM Chuẩn bị dung dịch thuốc nhuộm Safranin 2,5 ‰: hòa tan 2,5 g safranin trong 100 ml cồn 96 . Sau đó, thêm nước cất vào dung dịch cho vừa đủ 1000 ml. Quy trình nhuộm STM để phát hiện cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.1): nhổ cây mía, chặt sát gốc, nhúng vào dung dịch thuốc nhuộm safranin 2,5 ‰ và để dưới trời nắng. Sau khoảng 30 phút, lấy cây mía ra; cây mía được lóc bỏ vỏ để lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Cắt thân mía thành từng lát mỏng theo chiều ngang và quan sát màu của các bó mạch dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần. Tiến hành ghi nhận số liệu tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng của thân mía đem nhuộm STM (trong đó, bó mạch đỏ là bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn; bó mạch vàng là bó mạch bị nhiễm vi khuẩn). Mức độ nhiễm bệnh của cây có thể được đánh giá dựa vào tỉ lệ của các loại bó mạch. Theo đó, cây mía được đánh giá là nhiễm nặng, nhiễm trung bình hay nhiễm nhẹ khi có tỉ lệ mạch đỏ lần lượt chiếm < 70 %, 70 – 84,9 % và 85 – 99,9 %. Ngược lại, cây mía không bị bệnh cằn mía gốc khi không có sự hiện hiện của mạch vàng, tức tỉ lệ mạch đỏ là 100 % (Hà Đình Tuấn, 2004). 3.3.3. Phƣơng pháp chủng bệnh lên cây nuôi cấy mô bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh Tiến hành chủng bệnh cho cây nuôi cấy mô ba tháng tuổi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (hình 3.2). Quy trình chủng bệnh được tiến hành như sau: cắt ngang ngọn của cây mía nuôi cấy mô ở ngay phía trên phần mô phân sinh ngọn, dùng kim tiêm bơm 1ml dịch chiết từ cây mía bị nhiễm bệnh lên bề mặt mới cắt. Sau đó, bọc túi nilon vào phần ngọn mới cắt và cột lại để tránh sự tấn công của côn trùng phá hoại (Young và Brumbley, 2004). 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành các thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.3.4.1. Xác định Gram của vi khuẩn Dùng que cấy lấy dịch vi khuẩn và khuấy đều trong giọt KOH trên miếng lam. Sau đó, nhấc nhẹ que cấy, nếu xuất hiện dịch nhớt kéo theo que cấy (dài 2 – 3 cm) thì 38 39 vi khuẩn cần xác định là vi khuẩn Gram (-). Ngược lại, ở vi khuẩn Gram (+) không có dịch nhớt (Malcolm và Charles, 1997). 3.3.4.2. Thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate Tiến hành kiểm tra khả năng lên men của các dòng vi khuẩn phân lập được với 2 loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Cách thực hiện như sau: hút 20 l dịch vi khuẩn cho vào các ống nghiệm chứa môi trường Phenol Red Carbohydate Broth (phụ lục 4; trong đó, carbohydrate là manitol hoặc sorbitol). Chỉ tiêu quan sát: sau khi ủ ở 28 C trong 48 h, khả năng lên men của vi khuẩn được đánh giá dựa vào khả năng sinh acid và khả năng sinh hơi. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu. Vi khuẩn có khả năng sinh hơi khi có bọt khí xuất hiện trong ống Durham và ngược lại. Nếu vi sinh vật lên men chậm, sự đổi màu thường không rõ ràng và không có bọt khí xuất hiện trong ống Durham, cần phải so sánh với ống đối chứng không cấy vi sinh vật hoặc thực hiện lại thử nghiệm để thu được kết quả chính xác (Trần Linh Thước, 2003). 3.3.4.3. Thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào ở vi sinh vật Thử nghiệm Catalase: tất cả các vi sinh vật hiếu khí chứa chuỗi chuyền điện tử cytochrome đều có enzyme catalase, đây là enzyme có vai trò bảo vệ tế bào khỏi các tổn thương bởi dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử thông qua quá trình thủy phân H2O2 thành H2O và O2. Thử nghiệm được tiến hành bằng cách nhỏ trực tiếp 1 ml dung dịch H2O2 30% lên sinh khối chủng thuần trên bề mặt môi trường thạch SC; phản ứng được ghi nhận thông qua hiện tượng sủi bọt khí. Thử nghiệm Catalase được ghi nhận dương tính khi có hiện tượng sủi bọt khí; ngược lại, thử nghiệm âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt khí (Trần Linh Thước, 2003). Thử nghiệm amylase: trong thí nghiệm này, môi trường Starch Agar (phụ lục 5) và dung dịch thuốc thử KI được sử dụng để xác định hoạt động phân giải tinh bột của enzyme amylase ngoại bào. Phản ứng được thực hiện bằng cách chuyển 20 l dịch vi khuẩn phân lập được lên đĩa môi trường Starch Agar. Sau khi ủ ở 28 C 40 trong 24 h, tiến hành kiểm tra lượng tinh bột trên đĩa môi trường bằng dung dịch KI. Phản ứng amylase được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải tinh bột xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn. Ngược lại, phản ứng âm tính khi không có vòng phân giải tinh bột quanh vùng phát triển của vi khuẩn (Schaad, 1994). Thử nghiệm protease: nhằm xác định khả năng phân giải protein bởi enzyme protease ngoại bào của vi sinh vật. Thử nghiệm này được thực hiện trên môi trường SC có bổ sung 1% (w/v) casein và 0,05 % (w/v) ferric citrate (trong đó, nguồn protein được thử nghiệm là casein, đây là loại protein chính có trong sữa). Phản ứng được ghi nhận là dương tính khi có vòng phân giải trong suốt xung quanh vùng phát triển của vi khuẩn; ngược lại là phản ứng âm tính (Schaad, 1994). 3.4. Bố trí thí nghiệm Luận văn bao gồm bốn thí nghiệm như sau: Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, quan sát dưới kính hiển vi và thống kê tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong mỗi lóng; từ đó suy ra vị trí lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất (tức là lóng có tỉ lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn cao nhất). Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Dịch chiết này được lọc qua màng lọc 0,45 m và chủng bệnh vào các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi. Sau các khoảng thời gian 15, 30, 45, 60 ngày, khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp STM. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Từ kết quả của thí nghiệm 1, tiến hành chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm cao nhất và thu nhận dịch chiết từ lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất. Sau đó, lọc dịch 41 chiết qua màng lọc 0,45 m và tiến hành cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, các khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố) (Davis, 1980) được cấy chuyền sang các đĩa môi trường khác. Tăng sinh các khuẩn lạc thuần sau 2 lần cấy chuyền trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. Thành phần các môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng phụ lục 1, 2, 3. Thí nghiệm 4: Thử nghiệm sinh hóa bước đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 (thí nghiệm 3) được sử dụng trong các thử nghiệm sinh hóa phát hiện vi khuẩn Lxx. Trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ tiến hành một số thử nghiệm sinh hóa đặc trưng của vi khuẩn Lxx (xác định Gram, thử nghiệm khả năng lên men carbohydrate (manitol, sorbitol), thử nghiệm xác định hoạt động của enzyme ngoại bào (catalase, amylase, protease). Từ bảng liệt kê các thử nghiệm sinh hóa của Lxx (phụ lục 6) cho thấy loại vi khuẩn này cho kết quả dương tính với manitol và catalase; âm tính với sorbitol, amylase, protease. Kết quả của các phản ứng sinh hóa chính là cơ sở ban đầu nhằm phát hiện vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập được. 42 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây mía bị bệnh Tiến hành nhuộm STM đối với 20 cây mía có biểu hiện của bệnh cằn mía gốc được thu thập ngẫu nhiên ngoài đồng ruộng. Sau đó, tiến hành khảo sát tỉ lệ bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch đỏ) và bó mạch bị nhiễm vi khuẩn (bó mạch vàng) trong từng lóng dọc theo chiều cao cây. Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tỉ lệ bó mạch đỏ và bó mạch vàng trong mỗi lóng dọc theo chiều cao cây Số lóng Số bó mạch đỏ trung bình Số bó mạch vàng trung bình Tổng số bó mạch trung bình Tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (%) 1 2 3 4 5 6 7 142 156 168 182 185 180 176 49 36 25 10 8 13 16 191 192 193 192 193 193 192 74,4 81,3 87,1 94,8 95,9 93,3 91,7 * số lóng được tính theo vị trí từ gốc lên ngọn. ** số bó mạch trung bình của 20 cây đã được làm tròn. Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình của các cây bị bệnh thấp nhất ở lóng số 1 (74,4 %), tỉ lệ này tăng dần theo chiều cao cây ở các lóng tiếp theo và cao nhất ở lóng số 5 (95,9 %). Ngoài ra, trong quá trình quan sát, sự phân bố vi khuẩn trong cùng một lóng theo tiết diện ngang của cây cũng được ghi nhận, số lượng bó mạch bị nhiễm vi khuẩn tập trung nhiều nhất ở phần lõi bên trong và ít nhất ở các bó mạch bên ngoài gần biểu bì. Ghi nhận này có độ tin cậy cao bởi theo kết quả khảo sát bằng phương pháp nhuộm STM trên 8 giống mía khác nhau của Giglioti và ctv. (2000) cho thấy sự phân bố của các bó mạch bị mất chức năng trên một lát cắt lần lượt là 29,8 %, 15,5 % và 6,7 % đối với những mô ở trong, mô ở 43 giữa và mô ở ngoài gần biểu bì. Bó mạch bị mất chức năng khi có sự xâm nhiễm của vi khuẩn Lxx gây tắc bó mạch. Nước đi lên trong mạch mộc và thoát ra ngoài khí quyển nhờ 3 lực: lực đẩy nước từ rễ, lực mao dẫn và lực kéo nước từ lá (sự thoát hơi nước). Tuy nhiên, đối với những cây cao như cây mía, lực đẩy nước do áp suất dương ở gốc (rễ) không đủ mạnh để dẫn nước trong mạch mộc đi lên, chính lá tạo sức căng lớn (áp suất thủy tĩnh âm) kéo cột nước đi lên (Bùi Trang Việt, 2002). Phương pháp nhuộm STM được thực hiện dựa vào sự thoát hơi nước của lá, trong đó, thuốc nhuộm safranin được dẫn lên thân qua các bó mạch còn chức năng tức là chỉ nhuộm được các bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn chứ không nhuộm các bó mạch bị nhiễm khuẩn. Nếu mạch mộc bị tắc ở lóng bên dưới thì không thể dẫn thuốc nhuộm safranin lên các lóng tiếp theo; do đó, tỉ lệ bó mạch đỏ trong lóng bên trên sẽ bằng hoặc giảm hơn so với lóng bên dưới nếu ở lóng này xuất hiện các mạch tắc mới do sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Vì vậy, trên lý thuyết, tỉ lệ bó mạch đỏ sẽ giảm dần trong các lóng dọc theo chiều cao cây. Tuy nhiên, kết quả thực tế ghi nhận được ở bảng 4.1 cho thấy, tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình thấp nhất ở lóng sát gốc và tăng dần trong các lóng tiếp theo dọc theo chiều cao cây. Có thể giải thích được sự thay đổi tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình dọc theo các lóng dựa vào cấu tạo mạch mộc. Hình 4.1. Lát mỏng cắt ngang của thân mía sau khi nhuộm STM a: quan sát bằng mắt thƣờng; b: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 40 lần; c: quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần 1. Bó mạch vàng: bó mạch bị nhiễm vi khuẩn Lxx; 2. Nội bì; 3. Bó mạch đỏ: bó mạch không bị nhiễm vi khuẩn Lxx. Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ không có vi khuẩn; c: nội bì 1 2 3 44 45 46 Theo Bùi Trang Việt (2002), sợi mộc có cấu tạo là sợi dài với vô số các lỗ trên vách và các yếu tố mạch ngắn hơn có hai đầu bị "xoi lỗ" một phần hay hoàn toàn. Các yếu tố mạch xếp chồng lên nhau, tạo nên những ống liên tục rất dài. Các yếu tố mạch cũng thông thương với nhau và với các sợi mạch qua các lỗ trên vách dọc, đây là điều kiện thuận lợi để nước vào và di chuyển khá tự do trong mạch mộc. Trong quá trình vận chuyển nước lên lá, vấn đề quan trọng của thực vật là phải tránh các bọt khí xuất hiện làm gián đoạn cột nước trong mạch mộc. Đây là một vấn đề rất phức tạp vì lực cần để loại bỏ các bọt khí trong cột nước rất lớn, hơn nữa, bóng khí nhỏ khi xuất hiện sẽ kéo dài dưới sức kéo, lan rộng cả hệ thống mạch làm thực vật bị khô và chết. Tuy nhiên, điều này thường không xảy ra vì nước có thể đi vòng bóng khí để qua các ống dẫn xung quanh nhờ các lỗ trên vách (Bùi Trang Việt, 2002). Nguyên tắc này được áp dụng để giải thích khả năng dẫn truyền của thuốc nhuộm safranin trong các mạch mộc bị vi khuẩn kí sinh. Trong trường hợp này, có thể các lỗ trên vách dọc của mạch mộc cũng đóng vai trò như một cửa thông cho phép thuốc nhuộm safranin vòng qua vị trí tắc trong mạch mộc do vi khuẩn gây ra và tiếp tục quá trình dẫn truyền lên các lóng mía phía trên. Do vậy, dựa vào sự hiện diện của bó mạch tắc và tỉ lệ bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng (Giglioti và ctv., 1999). Phương pháp nhuộm STM được Giglioti và ctv. (1999, 2000); Hà Đình Tuấn (2004) sử dụng để phát hiện và đánh giá tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc. Do tính chất định tính của nghiên cứu, các tác giả này đã đề nghị thời gian thực hiện phương pháp nhuộm STM là 30 phút; tuy nhiên, khoảng thời gian 30 phút có thể là quá ngắn đối với thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo lóng của cây bị bệnh. Lập luận này được chứng minh thông qua sự giảm tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7, có lẽ thuốc nhuộm safranin không thể dẫn lên được toàn bộ các lóng của cây, đặc biệt là các lóng gần ngọn (lóng 6, 7, 8) sau thời gian 30 phút. Mặc dù tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình ở lóng số 6 và lóng số 7 không phù hợp với quy luật đã được khảo sát ở 5 lóng gần gốc, nhưng kết quả ở bảng 4.1 đã khẳng định lóng số 1 là nơi có sự phân bố của vi khuẩn Lxx nhiều nhất so với tất cả các lóng còn 47 lại dọc theo chiều cao của cây bị bệnh. Kết quả này phù hợp với nhận định của Grisham và ctv. (2007), tác giả cho rằng mặc dù Lxx là một loại vi khuẩn gây tắc bó mạch có sự xâm nhiễm mang tính hệ thống trên toàn cây mía nhưng mật độ vi khuẩn khác nhau giữa các mô; trong đó, Lxx tập trung nhiều nhất ở mô thân. Ông kết luận rằng mật độ vi khuẩn trong thân cao nhất ở lóng sát gốc và giảm dần ở các lóng hướng về phía ngọn. Trong các công trình nghiên cứu đã được công bố, Davis và Dean (1984) cũng thấy rằng có nhiều vi khuẩn trong thân ở các giai đoạn sau của mùa vụ và nồng độ vi khuẩn cao nhất ở phần sát gốc. Sự phân bố của vi khuẩn dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh có thể liên quan đến hàm lượng đường trong quá trình chín của mía. Trong quá trình chín, đường được tích lũy trong cây mía theo hướng từ dưới lên trên, lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996). Ngoài ra, sự đổi màu bên trong bó mạch ở các đốt của thân cây mía bệnh đã trưởng thành cũng có thể liên quan đến sự phân bố của vi khuẩn trong các lóng; theo Davis và Dean (1984), sự đổi màu thường diễn ra ở lóng dưới rồi mới lên đến các lóng phía trên và các vết đổi màu này thường được định vị ở những vùng dưới bẹ lá ngay tại vị trí xuất dịch cây, đây là nơi phát sinh ra lá và nhánh của các bó mạch. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ cây bị bệnh sau khi chủng Nguồn cây con nuôi cấy mô được thu thập tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương và trồng tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Sau thời gian 3 tháng, tiến hành chủng bệnh đối với tất cả các cây trong mỗi bụi bằng dịch chiết của cây mía bị bệnh cằn mía gốc. Kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1 cho thấy VN85-1427 là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84-4137, DLM24, R570, VN85-1427). Do đó trong thí nghiệm này, chúng tôi chọn cây từ bụi mía có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất thuộc giống VN85-1427 để thu nhận dịch chiết. Dịch chiết được thu nhận từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn cao nhất) (theo kết quả thí nghiệm 48 1) và lọc qua màng lọc 0,45 m nhằm hạn chế sự tạp nhiễm với các loại mầm bệnh khác trước khi chủng vào cây nuôi cấy mô (Brumbley và ctv., 2006). Sau các khoảng thời gian khác nhau (15, 30, 45, 60 ngày), tiến hành khảo sát thời gian vi khuẩn gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô được chủng bằng phương pháp nhuộm STM; số liệu được ghi nhận là tỉ lệ mạch đỏ của một cây mía đã được chủng trong mỗi bụi ở các thời điểm khảo sát. Bảng 4.2. Kết quả khảo sát thời gian vi khuẩn Lxx gây tắc mạch và tỉ lệ bị bệnh của các cây nuôi cấy mô đƣợc chủng thông qua tỉ lệ mạch đỏ trung bình Số liệu khảo sát được trình bày trong bảng 4.2 cho thấy tỉ lệ thành công của phương pháp chủng rất cao, hầu hết các cây nuôi cấy mô 3 tháng tuổi sau khi chủng đều bị bệnh với tỉ lệ nhiễm khác nhau từ nhẹ đến trung bình (77,5 % - 98,5 %). Sau quá trình thử nghiệm hiệu quả của các phương pháp khác nhau, Young và Brumbley (2004) cho rằng phương pháp chủng bệnh bằng cách cắt ngang cây mía ở phía trên mô phân sinh ngọn và chuyển 100 l dịch vi khuẩn nuôi cấy vào bề mặt mới cắt là tốt nhất. Các tác giả cũng đã chứng minh rằng chủng bệnh bằng dịch chiết từ cây mía bị nhiễm Lxx được vô trùng qua màng lọc sẽ làm tăng khả năng tạo thành khuẩn lạc của vi khuẩn trong thân mía. Vi khuẩn Lxx bắt đầu phát triển làm tắc bó mạch của các cây nuôi cấy mô sau thời gian chủng khoảng 30 ngày, điều này được thể hiện trong bảng 4.2 thông qua tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình (92,9 %). Trong các lần khảo sát tiếp theo (45 ngày và 60 ngày sau chủng), tỉ lệ bó mạch đỏ trung bình lần lượt là 90,4 % và 89,5 % cho thấy tỉ lệ này có sự giảm dần theo thời gian sau khi chủng bệnh, điều này đồng nghĩa với tỉ Thời gian sau chủng Tỉ lệ mạch đỏ (%) Bụi đối chứng Bụi 1 Bụi 2 Bụi 3 Bụi 4 Bụi 5 Bụi 6 Bụi 7 Trung bình 15 ngày 30 ngày 45 ngày 60 ngày 100 100 100 100 100 98,5 81,8 77,5 100 93,2 91,5 89,5 100 92,0 92,1 94,0 100 97,1 86,0 94,6 100 89,4 86,7 83,0 100 83,1 96,2 94,0 100 97,3 98,4 94,1 100 92,9 90,4 89,5 49 lệ bó mạch bị nhiễm vi khuẩn trong cây tăng dần lên theo thời gian; do đó, có thể kết luận rằng mật độ vi khuẩn Lxx trong thân mía gia tăng dần theo thời gian. Sau khi chủng khoảng 30 ngày, sự tắc mạch do vi khuẩn mới có thể phát hiện được bằng phương pháp nhuộm STM; trước khoảng thời gian này, rất khó nhận biết được sự hiện diện của vi khuẩn trong bó mạch và dường như không thể xác định được tình trạng bệnh của cây. Kết luận này phù hợp với phát biểu của nhiều nhà nghiên cứu trước đây trên thế giới. Theo Hoy và ctv. (1999), nồng độ vi khuẩn trong dịch chiết gia tăng trong suốt quá trình phát triển của cây, vì vậy giai đoạn lan truyền bệnh quan trọng nhất diễn ra trong quá trình trồng và thu hoạch. Pan và ctv. (1998) cũng cho rằng nồng độ vi khuẩn Lxx cao nhất ở trong cây vào thời điểm cuối vụ mía và có thể được phát hiện bằng kính hiển vi hoặc phương pháp miễn dịch học. Tuy nhiên, các phương pháp này lại cho kết quả không chắc chắn nếu thực hiện vào đầu hay giữa vụ mía vì lúc này nồng độ vi khuẩn trong thân thấp hơn. Kết quả quan sát vi khuẩn của Bailey (1977) bằng kính hiển vi đối pha trên tất cả các mô và vị trí lóng cho thấy nồng độ vi khuẩn cao nhất khi cây mía đã trưởng thành (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Theo Grisham và ctv. (2007), các phương pháp miễn dịch có thể phát hiện vi khuẩn Lxx trong mô thân của cây lớn hơn 5 tháng tuổi một cách hiệu quả vì ở giai đoạn này trong thân có nồng độ vi khuẩn cao hơn. Hình 4.3. Mẫu thân cây mía cắt dọc a. cây mía đối chứng không bị bệnh; b. cây mía bị bệnh sau khi chủng có vết đổi màu tại các bó mạch ở phía dưới mắt mía 50 Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành chủng bệnh ở phần ngọn của cây nhưng kết quả vẫn cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở phần gốc. Để giải thích cơ chế lan truyền của vi khuẩn Lxx sau khi được chủng vào cây khỏe mạnh phải dựa vào vai trò của mạch libe và mạch mộc cũng như sự liên hệ giữa chúng trong chu trình vận chuyển vật chất của thực vật. Mạch mộc có cấu tạo là những ống liên tục, rất dài với các tế bào chết có vách thứ cấp, tẩm lignin, không còn màng và nguyên sinh chất (Bùi Trang Việt, 2002). Sau khi chủng bệnh, có thể dịch vi khuẩn lan truyền xuống phần gốc theo con đường mạch mộc. Ngoài ra, dịch vi khuẩn cũng có thể hiện diện ở phần gốc thông qua con đường dẫn truyền của mạch libe. Nếu mô mộc vận chuyển nước và các chất khoáng từ rễ tới các phần hiếu khí (lá), thì libe chuyển vị các sản phẩm đồng hóa từ lá tới các vùng đang tăng trưởng và dự trữ (thân, rễ).Tuy nhiên, giữa mạch mộc và mạch libe có sự liên hệ với nhau nhờ các tia. Tia là các dãy tế bào nhu mô nằm xuyên mô mộc, đây là con đường vận chuyển ngang của các chất dinh dưỡng, từ con đường này có sự lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe do có sự chênh lệch về nồng độ (Bùi Trang Việt, 2002). Do đó, có khả năng vi khuẩn Lxx được chủng ở phần ngọn của cây sẽ lan truyền xuống phần gốc theo dịch nhựa luyện được tổng hợp ở lá và “cư trú” trong mạch mộc nhờ các con đường lưu thông vật chất giữa mạch mộc và mạch libe. Giả thiết này cũng có cơ sở để chứng minh do phương pháp nhuộm STM chỉ phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn trong mạch mộc sau khi chủng bệnh khoảng 30 ngày. Có lẽ trong thời gian đầu sau khi chủng bệnh, phần ngọn và lá của cây đã bị cắt mất nên không có khả năng quang hợp tạo đường; do đó, sự chuyển vị trong mạch libe diễn ra rất hạn chế, chỉ sau khi bộ lá phát triển lại đầy đủ, quá trình quang hợp xảy ra thì vi khuẩn mới có khả năng đi xuống phần gốc theo dịch libe. Steindl (1949) cũng xác nhận rằng sự di chuyển của tác nhân gây cằn mía gốc nhờ vào sự di chuyển của dịch cây và từ đó lây bệnh khắp cây (trích dẫn bởi Davis và Dean, 1984). Davis và Dean (1984) nhận thấy có sự xuất hiện của chất kết dính có màu ở bên trong các bó mạch và nằm bịt kín các mạch mộc lớn. Một số cấu trúc libe cũng bị hủy hoại và bít kín, đồng thời các tế bào nằm bên cạnh các mô này cũng bị 51 chuyển sang màu nâu đỏ. Ngoài ra, Hoy và ctv. (1999) đã chứng minh rằng nồng độ vi khuẩn có trong dịch chiết cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng lan truyền và gia tăng dịch bệnh sau khi chủng. Kết quả được trình bày trong bảng 4.2 còn cho thấy mức độ nhiễm bệnh sau khi chủng của các cây khác nhau trong cùng một bụi không giống nhau. Cụ thể trong bụi 3, tỉ lệ bó mạch đỏ của cây được quan sát sau 30 ngày là 92 %, tỉ lệ này tăng lên đến 92,1 % ở cây quan sát sau 45 ngày và 94 % ở cây quan sát sau 60 ngày. Trường hợp tương tự cũng xảy ra trong quá trình khảo sát bụi 4, bụi 6, bụi 7 cho thấy sự đáp ứng đối với vi khuẩn của các cây khác nhau trong cùng một bụi có thể không giống nhau. Theo Brumbley và ctv. (2006), hiện nay vẫn chưa biết được sự tắc mạch là do sản phẩm của vi khuẩn tạo ra, do cơ chế đáp ứng của cây trồng, hay là do sự kết hợp của cả hai. Sau quá trình quan sát dưới kính hiển vi điện tử, Kao và Damanm (1978) đã nhận thấy sự cư trú của vi khuẩn ở bên trong các hốc của mạch gỗ, gần với thành tế bào và đôi khi tồn tại cả bên trong thành tế bào. Sự liên kết giữa tế bào vi khuẩn và các cơ chất ở đây là nguyên nhân dẫn đến sự tắt nghẽn tại các mạch gỗ của cây. Năm 1980, các tác giả đã kiểm tra mẫu mô mía bị bệnh dưới kính hiển vi và nhận thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong các bó mạch, quản bào, nhu mô, và các kẽ hở của mạch mộc (trích dẫn bởi Monteiro – Vitorello, 2004). 4.3. Thí nghiệm 3: Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx Dịch chiết sử dụng để phân lập vi khuẩn Lxx được thu nhận tương tự như trong thí nghiệm 2. Sau đó, tiến hành lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m và cấy trãi dịch chiết trên môi trường thạch SC và MSC. Sau 28 – 42 ngày ủ ở 28°C, chúng tôi ghi nhận được sự xuất hiện của 11 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc mang các đặc điểm giống như mô tả của Davis (1980): có đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố. Các khuẩn lạc này được cấy chuyền tiếp tục trên môi trường thạch MSC và SC để thu nhận khuẩn lạc thuần. Tuy nhiên, sau 3 ngày ủ ở 28 C, chỉ có 8 dòng khuẩn lạc vẫn duy trì các đặc điểm của khuẩn lạc ban đầu, các dòng này được tiếp tục cấy chuyền sang môi trường thạch SC và MSC; sau đó, tăng sinh trong môi trường lỏng S8 để thu sinh khối. 52 Lxx là một loại vi khuẩn rất khó nuôi cấy. Do vi khuẩn Lxx không tạo ra các triệu chứng đáng tin cậy ở bên ngoài hay bên trong cây mía nên sự nhầm lẫn rất dễ xảy ra trong quá trình thu thập mẫu. Hơn nữa, dưới điều kiện tưới tiêu đầy đủ hoặc trong mùa mưa, triệu chứng cằn cỗi của bệnh có thể giảm xuống đến mức không thể nhận thấy (Brumbley và ctv., 2006). Ngoài ra, Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường nuôi cấy SC (Davis và ctv., 1980) hoặc MSC (Brumbley và ctv., 2006), đây là hai loại môi trường rất phức tạp. Bên cạnh đó, thời gian nuôi cấy đối với loại vi khuẩn này thường rất dài (28 – 42 ngày). Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra; để hạn chế điều này, nalidixic acid được bổ sung vào môi trường nuôi cấy qua màng lọc nitrocellulose (0,2 m). Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng nó nhạy cảm cao đối với ampicillin (100 g/mL); tetracycline (2 g/mL) và kanamycin (50 g/mL). Năm 2002, Brumbley và ctv. đã chứng minh rằng để vi khuẩn phát triển một cách hiệu quả trong môi trường lỏng cần gia tăng nồng độ của KH2PO4 và glucose, giảm nồng độ của K2HPO4 và cystein trong môi trường S8 được đề nghị bởi Davis và ctv. (1980). Nhiều công trình nghiên cứu về sinh học phân tử đã được thực hiện nhằm giải thích sự khó phát triển của vi khuẩn Lxx trên môi trường nhân tạo. Bộ gen của Leifsonia xyli subsp. xyli Brazillian (CTCB07) đã được giải trình tự hoàn chỉnh bởi nhóm di truyền môi trường và nông nghiệp (AEG) Brazil. Vi khuẩn Lxx có bộ gen dài 2,6 Mb, có tỉ lệ G – C là 68 % và chứa khoảng 2022 khung đọc mở (open reading frame); trong đó thiếu các gen trao đổi chất và sinh tổng hợp acid amine, đặc biệt là gen sinh tổng hợp cystein và methionin nên chúng trở nên rất khó nuôi cấy. Monteiro – Vitorello và ctv. (2004) đã tiến hành thí nghiệm và phát hiện rằng sự phát triển của vi khuẩn sẽ nhanh hơn nếu bổ sung cysteine và methionine vào môi trường nuôi cấy. Năm 2004, Monteiro – Vitorello và ctv. đã tiến hành phân tích trình tự nhiễm sắc thể của vi khuẩn Lxx và phát hiện có một số lượng lớn pseudogen (gen khuyết). Pseudogen là các đoạn gen được hình thành do sự xê dịch khung đọc mở, sự mất 53 nucleotide hoặc do các đột biến điểm dẫn tới sự thừa hoặc thiếu các codon kết thúc và tạo ra các gen không hoàn chỉnh (Monteiro – Vitorello và ctv., 2004), theo tác giả đây chính là sự thoái hóa về mặt di truyền trong quần thể Lxx. Ông cũng cho rằng sự thoái hóa này được xảy ra bởi quá trình thích nghi kí chủ và phổ kí chủ hẹp; các pseudogen của Lxx đã được xác định bao gồm 51 gen mã hóa transposase, các gen cần thiết cho sự biến dưỡng galactose và glutarate, các gen cần cho sự tổng hợp cystein và methionine, 20 gen gây bệnh và gây độc; số lượng lớn các gen rối loạn chức năng giải thích sự kém chịu đựng về dinh dưỡng của Lxx, qua đó, lý giải tại sao loại vi khuẩn này chỉ sống được trong bó mạch của cây mía và rất khó nuôi cấy. Gillaspie và Teakle (1989) nhận thấy rằng vi khuẩn Lxx có thể xâm nhiễm vào các loài cây thân cỏ khác (bắp, cỏ voi, cỏ kê, cỏ tranh, cỏ lồng vực) trong thí nghiệm chủng, nhưng chưa bao tìm thấy khuẩn lạc Lxx ở các loài thân cỏ này một cách tự nhiên hay sự hiện diện của Lxx một cách tự do trong môi trường. Brumbley và ctv. (2006) đã kết luận rằng bộ gen của Lxx cũng mã hóa một vài sản phẩm cho phép chúng chống lại cơ chế phản vệ của cây chủ và sống sót được trong bó mạch của cây chủ như các mầm bệnh thực vật khác. Chẳng hạn như các gen mã hóa cho hai enzyme phân giải vách tế bào - pectinase và cellulase (Monteiro - Vitorello và ctv., 2004). Theo Kao and Damann (1978), các gen này có thể liên quan đến sự hút chất dinh dưỡng từ bó mạch và cũng có thể khởi đầu việc sản xuất chất kết dính làm bít bó mạch dẫn của cây bị bệnh. Ngoài ra, Monteiro - Vitorello và ctv., (2004) cho rằng các gen này còn có thể liên quan đến sự tổng hợp hormone acid abscisic ở thực vật, đây là một chất ức chế tăng trưởng có thể liên quan đến sự cằn cỗi và làm giảm lượng chồi trên cây mía bị nhiễm bệnh cằn mía gốc (trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006). 4.4. Thử nghiệm sinh hóa bƣớc đầu khẳng định vi khuẩn Lxx từ các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc Dịch vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh trong môi trường lỏng S8 từ thí nghiệm 3 được sử dụng để tiến hành các thử nghiệm sinh hóa nhằm phát hiện sơ bộ vi khuẩn Lxx. 54 Các kết quả thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập được trình bày trong bảng 4.3, hình ảnh minh họa được trình bày trong hình 4.4. Bảng 4.3. Bảng kết quả của các thử nghiệm sinh hóa đối với 8 dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc Dòng vi khuẩn phân lập được Xác định Gram Phản ứng Manitol Sorbitol Catalase Amylase Casein Dòng 1 + + + + - - Dòng 2 + + - + - - Dòng 3 + - - - - - Dòng 4 + - - - - - Dòng 5 + + + + + - Dòng 6 + - - - ND - Dòng 7 + + + + ND + Dòng 8 + - - - ND + ND: không xác định được do các dòng vi khuẩn này không phát triển thành khuẩn lạc trên các môi trường thử nghiệm sinh hóa. Do vi khuẩn Lxx có kích thước rất nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) nên không thể quan sát được dưới kính hiển vi quang học thông thường mà đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi nền tối hoặc kính hiển vi đối pha ở độ phóng đại X 1000 (Davis và Bailey, 2000). Do đó, phương pháp nhuộm để xác định Gram không thích hợp đối với Lxx, chúng tôi tiến hành xác định Gram của 8 dòng vi khuẩn phân lập được bằng dung dịch KOH 3% (Malcolm và Charles, 1997). Thử nghiệm khả năng lên men nhằm xác định nguồn carbon được vi khuẩn sử dụng trong quá trình tăng trưởng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng hai loại nguồn carbon là manitol và sorbitol. Khi vi khuẩn có khả năng lên men, các sản phẩm hữu cơ được tạo ra (rượu, acid hữu cơ và CO2) đều làm giảm pH của môi trường dẫn đến sự đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Vi khuẩn có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường chuyển thành màu vàng; ngược lại, vi khuẩn không có khả năng sinh acid khi chỉ thị đỏ phenol trong môi trường không đổi màu (Trần Linh Thước, 2003). 55 56 Theo bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy chỉ có 4 dòng vi khuẩn (1, 2, 5, 7) từ 8 dòng vi khuẩn phân lập được cho kết quả dương tính với manitol; 5 dòng vi khuẩn (2, 3, 4, 6, 8) cho kết quả âm tính với sorbitol. Kết quả thử nghiệm catalase cho thấy 4 dòng (1, 2, 5, 7) dương tính; chỉ có 2 dòng (1, 2) cho phản ứng âm tính với amylase. Trong phản ứng casein, hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được đều cho kết quả âm tính (ngoại trừ dòng 7, 8). Đối chiếu bảng kết quả 4.3 với bảng phụ lục 6, chúng tôi nhận thấy trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx. Để giải thích kết quả trong bảng 4.3, có 2 giả thiết được đặt ra. Một là trong dịch chiết đem nuôi cấy không có sự hiện diện của vi khuẩn Lxx, điều này có nghĩa là phương pháp nhuộm STM cho kết quả dương tính giả trong quá trình phát hiện bệnh. Nói cách khác, phương pháp STM là phương pháp không hiệu quả trong chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Hai là có sự tạp nhiễm xảy ra trong quá trình nuôi cấy hoặc ủ vi khuẩn. Giả thiết thứ nhất được loại bỏ do phương pháp nhuộm STM là một phương pháp thông dụng đã được thừa nhận bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới (Hà Đình Tuấn, 2004). Theo Giglioti và ctv. (1999), phương pháp nhuộm STM là phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc, dựa vào tỉ lệ bó mạch tắc và bó mạch thông trong thân mía người ta có thể xác định, đánh giá mức độ nhiễm bệnh của cây trên cánh đồng. Từ kết quả khảo sát ở thí nghiệm 1, chúng tôi đã tiến hành thu nhận dịch chiết từ lóng 1 (lóng có mật độ vi khuẩn lớn nhất) của cây mía ở trong bụi có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất. Cây mía được chọn thuộc giống VN85-1427, đây là giống có tỉ lệ nhiễm bệnh cao nhất trong 5 giống mía sản xuất được trồng tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương (C90-127, VN84- 4137, DLM24, R570, VN85-1427). Kết quả khảo sát của Nguyễn Anh Khoa (2006) về tình hình nhiễm bệnh cằn mía gốc trên các giống mía khác nhau tại Trung tâm nghiên cứu mía đường Bến Cát, tỉnh Bình Dương cho thấy vào thời điểm khảo sát, giống mía VN85-1427 đã bị nhiễm Lxx ở mức trung bình. Từ đó, có thể khẳng định rằng vi khuẩn Lxx vẫn tồn tại và ngày càng phát triển trên giống mía này vì cho đến nay, vẫn chưa có biện pháp xử lý và kiểm soát dịch bệnh cằn mía gốc nào được thực hiện tại Trung tâm. 57 Như vậy, trong 8 dòng vi khuẩn phân lập được chỉ có dòng 2 có thể là vi khuẩn Lxx, 7 dòng vi khuẩn còn lại là các dòng tạp nhiễm. Sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra trong quá trình nuôi cấy do vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian ủ từ 28 – 42 ngày. Môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian quá dài nên sự tạp nhiễm là vấn đề rất khó tránh khỏi. Bên cạnh đó, sự tạp nhiễm cũng có thể xảy ra trong quá trình thu nhận dịch chiết do ở thân mía có chứa hàm lượng đường cao, đây là điều kiện thuận lợi cho các loại vi khuẩn và nấm phát triển. Đối tượng nuôi cấy là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính gây tắc bó mạch nên việc khử trùng thân mía rất khó khăn, trong thí nghiệm này, chúng tôi chỉ sử dụng cồn 70 vì nếu sử dụng các chất có tác dụng khử trùng bề mặt mạnh thì sự sống của vi khuẩn Lxx trong thân mía sẽ không đảm bảo. Theo bảng 4.3, cả 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều là vi khuẩn Gram dương. Do nalidixic acid chỉ có tác dụng tiêu diệt vi khuẩn Gram âm nên sự xuất hiện của các loại vi khuẩn Gram dương khác trên môi trường nuôi cấy là điều không thể tránh khỏi. Ngoài ra, Brumbley và ctv. (2006) đã chứng minh rằng vi khuẩn Lxx có khả năng kháng lại nalidixic acid nhưng lại nhạy cảm cao đối với kháng sinh (ampicilin, tetracycline, kanamycin); do đó, không thể bổ sung các loại chất kháng sinh này vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lxx. Sự tạp nhiễm nấm và các loại vi khuẩn có kích thước lớn đã được hạn chế bằng cách lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45 m. Tuy nhiên, phương pháp này không thể loại bỏ được các loại vi khuẩn có kích thước nhỏ khác cùng tồn tại trong dịch chiết, điều này lý giải tại sao 7 dòng vi khuẩn tạp nhiễm đều có kích thước và mô tả khuẩn lạc tương tự như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx. Trong quá trình ủ, các loại vi khuẩn tạp nhiễm này sẽ phát triển rất nhanh trên môi trường giàu dinh dưỡng, qua đó, ức chế sự phát triển của vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli. 58 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra là một trong những bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng nhất đối với sản lượng mía nói riêng và ngành công nghiệp mía đường nói chung. Ở Việt Nam, bệnh cằn mía gốc đã được phát hiện từ lâu, tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu cụ thể nào về căn bệnh nguy hiểm này. Qua quá trình tiến hành các thí nghiệm, chúng tôi đã rút ra được một số kết luận sau: Kết quả khảo sát sự phân bố của vi khuẩn Lxx dọc theo các lóng của cây mía bị bệnh cho thấy mật độ vi khuẩn tập trung cao nhất ở lóng thứ nhất (lóng gần gốc nhất), mật độ này có xu hướng giảm dần theo chiều cao cây. Ngoài ra, sự phân bố của vi khuẩn trong cùng một lóng tập trung chủ yếu ở phần lõi bên trong. Thời gian cần thiết để vi khuẩn Lxx gây tắc mạch là khoảng 30 ngày sau khi cây bị nhiễm bệnh. Trước khoảng thời gian này, không thể phát hiện được sự hiện diện của vi khuẩn ở trong bó mạch. Trong quá trình tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi nhận thấy đây là một loại vi khuẩn kí sinh chuyên tính rất khó nuôi cấy, đòi hỏi môi trường dinh dưỡng phức tạp và thời gian nuôi cấy rất dài. Sau 28 – 42 ngày nuôi cấy, chúng tôi đã phân lập được 8 dòng khuẩn lạc có đặc điểm giống như mô tả khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx (đường kính 0,1 – 0,3 mm, hình tròn lồi, có rìa và không có sắc tố). Kết quả thử nghiệm sinh hóa cho thấy trong 8 dòng khuẩn lạc được phân lập thì chỉ có dòng 2 có khả năng là vi khuẩn Lxx. 5.2. Đề nghị Phương pháp nhuộm STM là một phương pháp hiệu quả để phát hiện bệnh cằn mía gốc. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ tiến hành được đối với những cây mía trên 3 tháng tuổi. Chính điều này làm cho việc quản lý bệnh trở nên rất khó 59 khăn. Do đó, cần nghiên cứu và phát triển một quy trình chẩn đoán bệnh ngay từ khi cây còn nhỏ để có biện pháp xử lý kịp thời. Kết quả đạt được trong các thử nghiệm sinh hóa chỉ nhằm loại bớt những trường hợp không phải là vi khuẩn Lxx trong 8 dòng được phân lập chứ không thể xác định chính xác dòng nào là vi khuẩn Lxx. Do đó, cần phải tiến hành các thí nghiệm sinh học phân tử để xác định lại xem dòng 2 (dựa trên kết quả phản ứng sinh hóa) có phải là vi khuẩn Lxx hay không. Quá trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx rất khó khăn do đây là loại vi khuẩn ký sinh chuyên tính trong bó mạch của cây mía. Vi khuẩn Lxx chỉ có thể phát triển trên môi trường MSC hoặc SC sau thời gian 28 – 42 ngày, môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng lại được ủ trong thời gian dài nên sự tạp nhiễm rất dễ xảy ra. Vì vậy, cần phải thiết lập một quy trình nuôi cấy vô trùng hiệu quả nhằm hạn chế tối đa sự tạp nhiễm trên môi trường nuôi cấy. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 1. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh lý thực vật đại cương. Phần I: Dinh dưỡng. Nhà xuất bản đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Trang 34, 67 – 75. 2. Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996. Chương 8: Cây mía. Giáo trình cây công nghiệp (Đoàn Thị Thanh Nhàn). Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Trang 151 – 165. 3. Hà Đình Tuấn, 2004. Điều tra thành phần bệnh hại mía trên một số giống mới nhập nội và khảo sát diễn biến bệnh hại quan trọng ở vùng mía nguyên liệu miền Đông Nam Bộ. Luận văn thạc sĩ khoa học Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 4. Nguyễn Anh Khoa, 2006. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kĩ thuật ELISA và bước đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kĩ thuật PCR. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Nguyễn Huy Ước, 1994. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Trang 78 – 79. 6. Nguyễn Huy Ước, 1999. Cây mía và kĩ thuật trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 11 – 16. 7. Trần Linh Thước, 2003. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 74 – 77, 216. 8. Trần Thùy, 1996. Kỹ thuật trồng mía. Nhà xuất bản Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh. Trang 4 – 8. 9. Trần Văn Sỏi, 2001. Kỹ thuật trồng mía ở vùng đồi núi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. Trang 3. 10. Trần Văn Sỏi, 2003. Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. Trang 7. 61 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 11. Bailey R. A. and Bechet G. R., 1995. Further evidence of the effects ratoon stunting disease on production under irrigated and rainfed conditions. Proc. S. Afr. Sugar Technol. Assoc. 69: 74 – 78. 12. Bailey R. A., Tough S. A., 1992. Ratoon Stunting Disease: survival of Clavibacter xyli subsp. xyli, in field soil and its spread to newly planted sugarcane. Proceedings South African Sugar Techonogists Association Annual Congress 66: 75 – 77. 13. Brumbley S. M., Petrasovits L. A., Hermann S. R., Young A. J. and Croft B. J., 2006. Recent advances in the molecular biology of Leifsonia xyli subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease. Australian Plant Pathology 35: 681 – 689. 14. Brumbley Stevens M., Petrasovits Lars A., Birch Robert G., and Taylor Paul W. J., 2002. Transformation and transposon mutagenesis of Leifsonia xyli subsp. xyli, causal organism of ratoon stunting disease of sugarcane. Molecular Plant- Microbe Interactions 3: 262 – 268. 15. Comstock J. C. and Lentini R. S., 2005. Sugarcane Ratoon Disease. Florida Sugarcane Handbook, an electronic publication of the Agronomy Department. 16. Comstock J. C., Shine J. M., Davis M. J., and Dean J. L., 1996. Relationship between resistance to Clavibacter xyli subsp. xyli colonization in sugarcane and spread of ratoon stunting disease in the field. Plant Disease 80: 704 – 708. 17. Damann K. E., 1992. Effect of sugarcane cultivar susceptibility on spread of ratoon stunting disease by the menichal harvester. Plant Disease 76: 1148 – 1149. 18. Davis M. J. and Bailey R