Khóa luận Nghiên cứu tạo cây dứa cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (pmwav- Pineapple mealybug wilt associated virus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: TÔN BẢO LINH Thành phố Hồ Chí Minh 2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus) GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: TÔN BẢO LINH CN. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh 2005 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Dung và CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Trung tâm phân tích môi trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. - Hai bạn Nguyễn Phú Dũng, Lê Thái Bảo Ngọc, chị Trƣơng Bùi Nguyệt Hảo cùng toàn thể lớp CNSH27 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2005 Tôn Bảo Linh iv TÓM TẮT TÔN BẢO LINH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2005. “NGHIÊN CỨU TẠO CÂY DỨA CAYENNE IN VITRO SẠCH VIRUS GÂY BỆNH HÉO ĐỎ ĐẦU LÁ (PMWaV- Pineapple mealybug wilt associated virus)” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  CN. Lưu Phúc Lợi Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro thuộc 3 giống Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng bắt nguồn từ chồi ban đầu nhiễm virus gây bệnh héo đỏ đầu lá (PMWaV). Tiến hành tạo chồi dứa Cayenne in vitro sạch PMWaV từ chồi in vitro bị nhiễm virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST). Nguồn chồi tái sinh theo phương pháp tạo cây sạch virus sẽ được kiểm chứng bằng kĩ thuật RT-PCR với mồi đặc hiệu cho PMWaV. Trên cơ sở tạo chồi sạch virus, tiến hành nghiên cứu khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy với 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu theo dõi như thời gian tái sinh, tỉ lệ tái sinh và hệ số nhân chồi; nghiên cứu sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST với các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao chồi, số lá, số rễ và chiều dài rễ. Bằng kĩ thuật RT – PCR, thực hiện kiểm tra PMWaV – 1 và PMWaV – 2 đối với 12 mẫu lá của chồi tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy. Những kết quả thu được: 1. Khả năng tái sinh của ĐST: thời gian và tỉ lệ tái sinh chủ yếu do kích thước mẫu cấy quyết định. Mẫu cấy có kích thước từ 0,5 – 1 mm tái sinh trong vòng 14 – 15 ngày và tỉ lệ tái sinh vào khoảng 79,63%. 2. Sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST: sự khác biệt có ý nghĩa của các chỉ tiêu theo dõi chủ yếu do giống quyết định, giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan sinh trưởng nhanh hơn so với giống Cayenne Lâm Đồng. Nhìn chung, quá trình xử lí nhiệt (370C, 30 ngày) không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chồi tái sinh. v 3. Việc tạo cây sạch virus bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST hiệu quả hơn so với phương pháp đối chứng chỉ nuôi cấy ĐST. Với phương pháp kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST, tỉ lệ cây sạch PMWaV -1 đạt 66,67% và PMWaV – 2 đạt 100%, trong khi chỉ nuôi cấy ĐST chồi tái sinh vẫn còn nhiễm PMWaV – 1. vi SUMMARY TON BAO LINH, Nong Lam University Ho Chi Minh City. August, 2005. “Study of producing in vitro free PMWaV (Pineapple mealybug wilt associated virus) Cayenne pineapple plants”. Two free – virus plant producing methods involving heat treatment followed by meristem culture and simply meristem culture were used to eliminate PMWaV-1 and PMWaV-2 from in vitro PMWaV infected pineapple plants. Three Smooth Cayenne cultivars originated from China, Thailand and Lam Dong were used as culturing materials. With the completely randomized design, factors that influenced on the regeneration and growth of propagated meristem tip, especially heat treatment at 37 0 C in 30 days was also studied. The experiment result showed that meristem regeneration was mainly influenced by the size of the excised tissue. Meanwhile, the growth of the regenerative shoots were influenced by cultivar factors. Heat treatment did not considerably influence on the regeneration and subsequent growth of propagated meristem. All samples (3/3) without heat treatment were still infected with PMWaV-1 and one third of samples (3/9) with heat treatment showed negative infection results with PMWaV-1. Finally, all samples (12/12) had negative results when tested for PMWaV-2 with RT-PCR. vii MỤC LỤC Trang tựa ...................................................................................................................... i Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm tắt .......................................................................................................................... iv Summary ...................................................................................................................... vi Mục lục ...................................................................................................................... vii Danh sách các bảng ..................................................................................................... xi Danh sách các hình và sơ đồ ...................................................................................... xii Danh sách các chữ viết tắt xiii PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1 1.1.Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu...................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ...................................................................................... 2 1.3.Giới hạn của đề tài .............................................................................................. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 2.1.Nguồn gốc của cây dứa ....................................................................................... 3 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa .................................................... 3 2.2.1. Đặc điểm thực vật học .................................................................................... 3 2.2.2.Sinh thái cây dứa ............................................................................................. 4 2.3.Phân loại .............................................................................................................. 5 2.4.Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ....................... 6 2.4.1.Các nhóm dứa chính ....................................................................................... 6 2.4.1.1. Nhóm Cayenne ............................................................................................. 6 2.4.1.2. Nhóm Queen ................................................................................................. 7 2.4.1.3. Nhóm Spanish .............................................................................................. 7 2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................................................. 7 viii 2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ ......................................................................................... 7 2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) ........................................................................ 8 2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) ............... 8 2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne .................................................................................... 8 2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ............................................................. 9 2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới .................................... 9 2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam ...................................... 9 2.5.2.1. Tình hình sản xuất ...................................................................................... 9 2.5.2.2. Sản lƣợng dứa .............................................................................................. 10 2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa ..................................................................... 10 2.6.1. Các loại sâu hại dứa ....................................................................................... 10 2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ ............................................................................ 11 2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ ............................................................................... 11 2.6.2.2. Bệnh thối mềm ............................................................................................ 11 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” .............................................................................................. 12 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa .................................................................................... 12 2.7.Bệnh héo do virus ............................................................................................... 13 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus ....................................................................... 14 2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật ............. 14 2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ........................................... 15 2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus ............................................................ 15 2.8.3.1. Xử lí nhiệt ..................................................................................................... 16 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng .......................................................................... 16 ix 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST ............................................................... 19 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ............................... 20 2.8.3.5. Vi ghép .......................................................................................................... 21 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus ............................................. 21 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học ............. 21 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học ........................................... 21 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ............... 21 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) ...................................... 22 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử ............................................. 22 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học ..................................................... 22 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử ............................................................ 22 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ................................................... 23 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử ....... 23 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) .................................................................................................. 23 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) .................................................. 23 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) ............................................................. 24 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) ....................................... 24 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ......................................................................... 24 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ......................................................................... 26 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 28 3.1. Nội dung.............................................................................................................. 28 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 28 x 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng ......................................................................... 28 3.3.1. Vật liệu ............................................................................................................. 28 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy ................................................................................................. 28 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ...................................................................................... 28 3.3.1.3. Hóa chất ........................................................................................................ 29 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................... 29 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................ 30 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng .................................................................................................................................... 32 3.4.1. Vật liệu ............................................................................................................. 32 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 32 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 35 4.1.Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS .............. 35 4.1.1Thời gian tái sinh ............................................................................................. 35 4.1.2. Tỷ lệ tái sinh .................................................................................................... 36 4.1.3. Hệ số nhân chồi .............................................................................................. 36 4.2.Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST .......................................................................................................... 38 4.2.1 Chiều cao chồi ............................................................................................... 38 4.2.2. Số lá .................................................................................................................. 39 4.2.3. Số rễ ................................................................................................................. 40 4.2.4 Chiều dài rễ ...................................................................................................... 41 4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST ............................................ 43 4.3.1. Kết quả kiểm tra PMWaV-1 ......................................................................... 43 xi 4.3.2. Kết quả kiểm tra PMWaV-2 ........................................................................ 44 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 47 5.1.Kết luận ............................................................................................................... 47 5.2.Đề nghị ................................................................................................................. 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC xii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 30 Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST ............................................................. 31 Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT – PCR .................................................... 33 Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR .......................................................................................................... 34 Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne ........................................................................................... 35 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne ............................................................... 36 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST chồi dứa Cayenne ................................................................................. 37 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái sinh từ ĐST ............................................................................................................ 38 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 40 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 41 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST ................................................................................................................ 42 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy .................................................................................................................. 46 xiii ] DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình Trang Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng ...................................................... 16 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST ........................................................................... 19 Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST .......................................................................................................... 20 Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi SZ40 ................................................................................................................. 36 Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy ..................................... 39 Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy ..................................... 39 Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 ................ 43 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST đã qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 ........................... 44 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-2 ........................................................ 45 xiv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tp. HCM: Thành phố Hồ Chí Minh c.s.: cộng sự PMWaV: Pineapple mealbug- wilt associated virus TT PTTN: Trung tâm phân tích thí nghiệm ĐST: đỉnh sinh trưởng RT-PCR: Reverse transcription-polymerase chain reaction MWP: mealybug wilt of pineapple GLRaV-3: Grape leafroll associated virus TMV: Tobacco mosaic virus ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay TBIA: Tissue blot immunoassay QCM: Quartz crystal microbalance PCR: polymerase chain reaction cDNA: complementary deoxynucleic acid DNA: deoxy nucleic acid RT: Reverse transcription RFLP: Restriction fragment length polymorphism RNA: ribose nucleic acid HSPA: Heat- shocked protein A PCV: pineapple closterovirus 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Dứa là một trong những loại cây ăn quả được ưa chuộng trên thị trường thế giới bởi hương vị đặc trưng và giàu chất dinh dưỡng (vitamin C, tiền vitamin A, acid hữu cơ…). Enzyme bromelin chiết xuất từ dứa có nhiều ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, thuộc da và nhiều ngành khác. Với những đặc điểm về dinh dưỡng và mùi vị, dứa được gọi là “Nữ hoàng” của các loại trái cây. Trên thế giới, cây dứa đứng hàng thứ 9 về tầm quan trọng sau nho, chuối, táo [7]… Riêng ở Việt Nam, cây dứa có ưu thế về tính chống chịu với ngoại cảnh như: không kén đất, có thể trồng trên những vùng đất phèn hay vùng đất không thể canh tác cây rau quả nào khác. Từ những điều kiện thuận lợi trên, trong 5 năm qua dứa Cayenne với đặc điểm đạt tiêu chuẩn về năng suất, chất lượng cũng như các yêu cầu cần thiết khác cho chế biến đồ hộp đã được ưu tiên phát triển. Năm 2004 được Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn xác định là năm tập trung cho phát triển vùng nguyên liệu dứa [25]. Từ đó, các Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn các tỉnh thực hiện qui hoạch phát triển dứa và rà soát lại vùng nguyên liệu phục vụ các nhà máy chế biến. Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Thành phố Hồ Chí Minh (Tp. HCM) đã thực hiện chương trình giống cây - con chất lượng cao (gồm bò sữa, tôm, rau an toàn và cây dứa Cayenne) từ năm 2003- 2005 [30]. Ngoài Tp. HCM, các tỉnh thuộc vùng Đông Nam bộ (Đồng Nai, Bình Dương), Tây Nguyên (Gia Lai) và miền Trung cũng dự kiến qui hoạch vùng nguyên liệu quả các loại gắn với xây dựng nhà máy chế biến các sản phẩm quả đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, sản phẩm chủ lực là các sản phẩm từ cây dứa [29,31,32]. Tuy nhiên, một khi tăng diện tích gieo trồng và sản lượng thì bệnh hại trên dứa cũng bắt đầu phát triển. Theo kết quả điều tra của nhóm nghiên cứu bệnh hại trên dứa thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 [3,6,8,9], trên hầu hết các ruộng dứa tại Tp. HCM, Long An, Tiền Giang, Lâm Đồng xuất hiện những bệnh như: bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt), thối trái, thối nõn làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất và chất lượng dứa, gây thiệt hại về mặt kinh tế. Một trong những nguyên nhân lây 2 lan bệnh hại là nguồn chồi giống ban đầu không sạch các mầm bệnh, đặc biệt là virus gây bệnh đỏ đầu lá PMWaV (Pineapple mealybug wilt – associated virus). Giống dứa 3 Cayenne nhập nội mẫn cảm với bệnh đỏ đầu lá hơn dứa Queen; giống nhập từ Thái Lan, Trung Quốc có mức độ nhiễm cao và lây lan nhanh hơn giống của Lâm Đồng [1]. Chồi dứa nhiễm PMWaV không thể nhận biết bằng mắt thường ở giai đoạn đầu và hiện nay không có loại hóa chất nào để diệt trừ virus hiệu quả. Để cây dứa Cayenne ngày càng mở rộng và chuyên canh hơn nhằm đáp ứng nhu cầu quả tươi và nguyên liệu phục vụ cho việc chế biến đồ hộp xuất khẩu, cần phải có cây giống sạch bệnh đảm bảo chất lượng để cung cấp cho các khu vực trồng dứa. Với đề tài “Nghiên cứu tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus gây bệnh héo đỏ đầu lá” chúng tôi hi vọng sẽ góp phần tạo được nguồn dứa Cayenne sạch bệnh. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của đề tài nhằm tạo ra các chồi dứa Cayenne sạch virus thông qua xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (ĐST) và kiểm tra virus PMWaV – 1 và PMWaV – 2 ở chồi dứa in vitro bằng kĩ thuật RT-PCR. 1.3. Giới hạn của đề tài Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị phục vụ thí nghiệm, đề tài chỉ giải quyết được các vấn đề cơ bản về mặt kĩ thuật nuôi cấy ĐST chồi dứa in vitro mà chưa thực hiện nuôi cấy ĐST của chồi dứa ngoài đồng đã qua xử lí nhiệt; chưa thực hiện được thí nghiệm xử lí nhiệt chồi dứa nhiễm virus ở các mức nhiệt độ và thời gian khác nhau. Do giới hạn về kinh phí nên thí nghiệm chỉ thực hiện với qui mô nhỏ; không kiểm tra PMWaV cho toàn bộ số chồi tái sinh từ ĐST. Mặt khác do hạn chế về kinh nghiệm nên đề tài chưa khai thác hết các mối tương quan giữa các yếu tố thí nghiệm. Đề tài chỉ khái quát một trong những qui trình tạo chồi dứa sạch virus từ mẫu chồi ngoài đồng bị nhiễm virus PMWaV và bước đầu chứng minh hiệu quả loại trừ virus của phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Nguồn gốc của cây dứa[4] Cây dứa có nguồn gốc từ Nam Mỹ, được người Châu Âu phát hiện vào năm 1493. Cây dứa thuộc loài A. comosus var ananassoides được thuần hóa bởi những người thổ dân Tupi-Guarani và được phát tán đến Antilles, bắc Andes và trung Mỹ (Bertoni, 1919; trích dẫn bởi [4]). Theo khảo sát của Baker và Colin (1939; trích dẫn bởi [4]) nguồn gốc cây dứa có thể là vùng tứ giác nằm giữa vĩ tuyến nam 150 - 300 và kinh tuyến tây 400 - 600 bao gồm miền trung và nam Brazil, miền bắc Argentina và Paraguay. Trong khu vực này dạng hoang dại các loài dứa được tìm thấy theo những hoàn cảnh thích hợp riêng cho từng loài: o A. ananasoides trong rừng khô của Brazil, cây mọc rải rác và thấp lùn. o A. bracteatus dưới bóng cây thưa thớt thường ưa mọc ven rừng. o Pseudananas sagenarius trong những vùng ẩm ướt hơn, dọc theo bờ sông hay trong những khu rừng ẩm ướt. o A. erectifolius ở lưu vực sông Amazon trong những vùng nóng ẩm. 2.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa 2.2.1. Đặc điểm thực vật học[4,22] Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 – 1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới. Hoa Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt; thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân 5 giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên và chồi rễ. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Hạt Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống mới. Thân Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Lá Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. 2.2.2. Sinh thái cây dứa [4,7] Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 28 – 320C, nhiệt độ giới hạn 15 – 400C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến phẩm chất của quả. 6 Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát. Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến màu sắc quả. Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0. 2.3. Phân loại [7,35] Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc: o Phân lớp: Magnoliophyta o Lớp: Liliopsida o Bộ: Poales o Họ: Bromeliaceae o Giống: Ananas o Loài: A. comosus Giống này cùng với giống lân cận Pseudananas khác biệt với các giống khác trong họ ở chỗ quả dứa là một quả kép trong khi đó các giống khác có quả nhỏ đứng rời nhau. Smith (1939; trích dẫn bởi [7]) đề nghị cách phân loại rõ hơn giữa các chi Ananas và Pseudananas: i. Quả kép khi chín mang một chùm nhỏ lá bắc giống như vảy ở cuống quả không có chồi cuống, trên thân có các chồi ngầm, cánh hoa có nhiều u nổi như những nếp thịt là chi Pseudananas (P. sagenarius). i. Quả kép khi chín mang một chùm lá bắc rất dễ nhận, ở gốc cuống quả có các chồi, trên thân không có chồi ngầm, hoa có 2 vảy hình phễu là chi Ananas. 7 ii. Quả kép khi chín dài hơn 15 cm, thịt quả thơm ngon, cuống quả chắc chắn và ngắn. ii. Quả kép ngắn, dài tối đa 15 cm, quả ít thịt, hương vị kém, cuống quả nhỏ và dài. iii. Gai lá mọc chĩa lên, lá bắc có màu sắc khi quả chín, cánh hoa hình vảy (A. bracteatus). iii. Gai lá cong xuống, lúc quả chín lá bắc có màu xanh nhạt. Cánh hoa có nếp nhăn dọc (A. fritzmuelleri). iii. Lá bắc không biểu hiện rõ, để lộ sớm đầu nhị cái, ít hoặc không có răng cưa, không có hoặc rất ít hạt; quả dùng để ăn (A. comosus). iv. Lá mọc đứng, cứng, không gai trừ 1 gai ở đầu lá, lá rộng 35 cm (A. erectiflius). iv. Lá cong, nhiều răng cưa nhỏ ở biên lá, lá rộng không quá 25 cm (A. ananassoides). 2.4. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam [1,4,7] 2.4.1. Các nhóm dứa chính Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Mỹ [38]. Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3 nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish (nhóm Tây Ban Nha). 2.4.1.1. Nhóm Cayenne Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng. Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện chăm sóc kém có thể không có chồi cuống. Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển. Vì thế việc chọn vùng, địa điểm trồng và qui hoạch đồng ruộng phải quan tâm đến đặc điểm này. 8 2.4.1.2. Nhóm Queen Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Mặt trong của lá có 3 đường vân trắng hình răng cưa chạy song song theo chiều dài, hoa có màu xanh hồng. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi, cứng do đó tương đối dễ vận chuyển. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Ưu điểm của nhóm dứa này là không kén đất, có thể trồng trên các loại đất nghèo dinh dưỡng, cây có hệ số nhân giống cao, trung bình 4 – 6 chồi/gốc, có thể chịu được bóng râm. Thịt quả dòn, có màu sắc và hương vị phù hợp để ăn tươi. Nhược điểm: quả bé, trọng lượng bình quân chỉ đạt từ 500 – 700 g. Dạng quả hơi bầu dục khó thao tác trong khi chế biến. Thịt quả có nhiều khe hở, không chặt nên khó đạt tiêu chuẩn để làm đồ hộp xuất khẩu. 2.4.1.3. Nhóm Spanish Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng, hoa tự có màu đỏ nhạt. Quả ngắn, kích thước to hơn so với nhóm Queen nhưng bé hơn so với nhóm Cayenne. Trọng lượng quả trung bình xấp xỉ 1kg. Khi chín vỏ quả có màu nâu đỏ, sẫm hơn nhiều so với quả Cayenne và cũng có dạng hình trụ cân đối. Thịt quả màu vàng trắng không đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Chồi ngọn và đặc biệt là chồi cuống nhiều, ảnh hưởng đến phẩm chất quả. Nhìn chung, các giống dứa trong nhóm Spanish tuy dễ trồng, chịu được bóng nhưng phẩm chất kém nên được trồng chủ yếu ở qui mô hộ gia đình, không nên tập trung thành vùng lớn. Ngoài ba nhóm dứa trên, còn có nhóm Abacaxi tách ra từ nhóm Spanish nhưng mức độ phổ biến còn thấp. 2.4.2. Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam 2.4.2.1. Dứa hoa Phú Thọ Còn được gọi là Queen cổ điển. Nó có những đặc tính điển hình nhất của giống Queen như quả nhỏ; mắt nhỏ, lồi; gai ở rìa lá nhiều và cứng…Đây là giống nhập nội vào Việt Nam khoảng đầu thế kỉ XX, được trồng rải rác ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung. Ưu điểm nổi bật của dứa hoa Phú Thọ là thịt vàng giòn, rất thơm và hấp dẫn nên nó được dùng để pha trộn vào nước dứa ép từ các giống khác hay các loại quả 9 khác để tạo ra mùi thơm đặc trưng. Giống này dễ trồng, chịu được đất xấu, đất chua, dễ ra hoa trái vụ. Nhược điểm là quả nhỏ, năng suất nhìn chung thấp, khó chế biến đồ hộp nên hiệu quả kinh tế không cao. 2.4.2.2. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) Giống dứa này có đặc tính của nhóm mắt nhỏ, lồi, khi chín vỏ và thịt quả đều có màu vàng. So với dứa hoa Phú Thọ, giống này có lá ngắn và to, quả cũng to hơn. Bình quân trọng lượng từ 0,9 – 1,2 kg/quả. Khi chín kĩ, nước trong thịt quả cũng nhiều hơn. Đây là giống dứa khá phổ biến ở các vùng trồng tập trung với ưu điểm dễ canh tác, có thể duy trì năng suất đến vụ thứ 2, thứ 3 nếu áp dụng kĩ thuật chăm sóc thích hợp; hệ số nhân giống tương đối cao. Tuy nhiên, do có mắt sâu, quả hơi bầu dục nên khó đạt tỉ lệ cái cao khi chế biến đồ hộp, hiệu quả kinh tế thấp. 2.4.2.3. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) Một số tác giả liệt kê các giống này vào cùng với giống dứa Na Hoa. Trong điều kiện khí hậu miền Nam, cây sinh trưởng mạnh, quả có kích thước lớn hơn so với trồng ở miền Bắc, đồng thời một số đặc điểm cũng khác đi. So với dứa Bến Lức, dứa Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt quả to hơn và thịt quả có nhiều nước hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. 2.4.2.4. Nhóm dứa Cayenne Đặc điểm của nhóm dứa này là lá không gai ngoài một vài gai ở đầu mút lá, lá dày, lòng máng sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc. Giống này du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, đầu những năm bốn mươi ở một số địa phương miền Bắc chủ yếu trong những đồn điền do người Pháp quản lí. Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống đầu tiên, về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng. Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền Nam [1], giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận. Giống Cayenne Lâm 10 Đồng đã phát triển lâu đời ở Việt Nam, chống chịu bệnh wilt và phẩm chất tốt nên phát triển trong giai đoạn hiện nay. Với ưu điểm năng suất cao, quả to và dễ thao tác trong chế biến làm đồ hộp, có chất lượng cao cả về hóa sinh lẫn tỉ lệ cái nên giống Cayenne đang được chú ý phổ biến ra diện rộng. Các vùng trồng dứa nguyên liệu được hình thành nhằm cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa. 2.5. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa 2.5.1. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới Theo thống kê năm 2001 [26] sản lượng dứa của thế giới đạt 13.739.000 tấn, phân bố theo các châu lục và khu vực như sau: Châu Phi 2.229.000 tấn, Bắc Mỹ 1.512.000 tấn, Nam Mỹ 2.556.000 tấn, Châu Á 7.275.000 tấn, Châu Phi 2.000 tấn và Châu Đại Dương 164.000 tấn. Các nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan 2.300 tấn, Philipin 1.572 tấn, Brazil 1.442 tấn, Trung Quốc 1.284 tấn, Nigeria 881 tấn… 2.5.2. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam 2.5.2.1. Tình hình sản xuất Theo tài liệu thống kê [27], diện tích trồng dứa cả nước năm 1995 là 25.734 ha đến năm 2000 lên đến 36.541 ha. Tính đến năm 2000 diện tích trồng dứa của miền Bắc là 9.675 ha chiếm 26,48% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu ở vùng Đông Bắc và đồng bằng sông Hồng; trong khi diện tích gieo trồng của miền Nam là 26.866 ha chiếm 73,52% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Các tỉnh có diện tích gieo trồng dứa khá lớn là Kiên Giang (9.200 ha), Tiền Giang (7.803 ha), Bạc Liêu (3.625ha), Cần Thơ (1.338 ha), Long An (661 ha), Quảng Nam (2.320 ha), Bình Định (500 ha), Thanh Hóa (2.900 ha), Ninh Bình (1.572 ha), Nghệ An (600 ha), Bắc Giang (657 ha)… Bên cạnh đó, các tỉnh miền Đông Nam Bộ có diện tích dứa tăng đáng kể trong khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2000: Tp. HCM tăng từ 76 ha lên đến 150 ha, Đồng Nai tăng từ 61 ha lên 123 ha, Bình Thuận tăng từ 12 ha lên 40 ha. Hiện nay cây dứa Cayenne được các nhà nông học đánh giá cao do phù hợp với đất đai thổ nhưỡng của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và các vùng đất nhiễm phèn khác. Nhiều dự án mở rộng vùng trồng dứa Cayenne được thực hiện ở khu vực Đông Nam Bộ như Chương trình phát triển cây dứa Cayenne ở Tp. HCM thời kì 2003 – 2005 [30], ở khu 11 vực Tây Nguyên (Gia Lai, Đaklak) [32]. Một số tỉnh miền Trung như Bình Định, Phú Yên …cũng đề nghị Tp. HCM cung cấp giống dứa Cayenne để nhân rộng [29]. 2.5.2.2. Sản lƣợng dứa Theo tài liệu thống kê [27] sản lượng dứa của cả nước năm 2000 là 291.428 tấn phân bố trên các khu vực trồng dứa cả nước như sau: miền Bắc đạt 57.246 tấn, khu vực Bắc trung bộ 25.218 tấn, miền Nam 234.164 tấn trong đó các tỉnh thuộc khu vực Duyên Hải Nam Trung Bộ đạt 20.832 tấn, Tây Nguyên 2.357 tấn, khu vực Đông Nam Bộ 1.417 tấn và khu vực có sản lượng dứa lớn nhất trong nước – Đồng Bằng Sông Cửu Long 209.558 tấn. Các tỉnh có sản lượng dứa cao là Kiên Giang (89.094 tấn), Tiền Giang (79.880 tấn), Bạc Liêu (24.860 tấn), Ninh Bình (20.315 tấn), Quảng Nam (15.724 tấn), Thanh Hóa (11.107 tấn), Hà Tây (1.725 tấn), Bắc Giang (1.495 tấn), Phú Thọ (1.159 tấn)… 2.6. Tình hình sâu bệnh trên cây dứa 2.6.1. Các loại sâu hại dứa Theo Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2000), dứa ít bị côn trùng gây hại so với nhiều loại cây trồng khác. Đối tượng sâu hại quan trọng và phổ biến hầu hết khắp các vùng trồng dứa trên thế giới là rệp sáp (Dysmicoccus hoặc Pseudococcus brevipes). Rệp sáp và bệnh wilt thường xuất hiện cùng lúc và có quan hệ mật thiết với nhau. Rệp sáp thường tiết ra một chất hơi dính như mật ong nên thường có nhiều loài kiến sống kết hợp chặt chẽ với rệp. Kiến sống bằng chất mật do do rệp tiết ra và làm tổ cho rệp ở, mang rệp phân tán đi khắp nơi. Nhờ có các tổ này mà rệp được bảo vệ chắc chắn, ít bị ảnh hưởng của biến đổi thời tiết bên ngoài, tạo nên một tiểu khí hậu rất thích hợp cho việc sinh sản. Vì vậy, muốn tiêu diệt rệp sáp một cách triệt để và có hiệu quả, phải tiến hành phòng trừ rệp đồng thời với các loại kiến và phải tiến hành ngay từ đầu. Ngoài rệp sáp, một số vùng trồng dứa ở Việt Nam còn có một loại côn trùng gây hại rễ là một loại sâu non có tên Adoretus chinensis Thanber thuộc họ Scarebicideae, bộ cánh cứng (Coleopera). Loại côn trùng này trực tiếp phá hoại rễ, tạo vết thương cơ giới giúp tuyến trùng và nấm bệnh (chủ yếu là Thiellaviopsis paradoxa) xâm nhập và làm vườn dứa tàn lụi nhanh chóng. Có thể phòng trừ loại sâu hại rễ này bằng hóa chất trên thị trường. Tuy nhiên, đối với những vườn dứa bị hại nặng phải luân canh cây trồng khác từ 1 – 2 năm. 12 Biện pháp phòng trừ Khi làm đất, tất cả tàn dư thực vật (cả cây trồng cữ và cỏ dại) phải được gom lại, phơi khô rồi đốt đi, làm mất chỗ ẩn náu của các loại sâu hại . Chồi giống phải được lấy từ các vườn sạch bệnh và không có rệp, xử lí chồi bằng dung dịch chống rệp và sâu hại. Trong thời kì cây chưa ra hoa, nên phun định kì 5 – 6 tuần một lần các loại thuốc diệt rệp và nên phun tập trung vào mùa mưa ẩm để diệt rệp triệt để. 2.6.2. Bệnh hại dứa và phòng trừ 2.6.2.1. Bệnh thối lõi và thối rễ Nguyên nhân Bệnh do Phytopthora parasitica và P. cinnamonii gây ra [7]. Một số tác giả khác ở Costa Rica và Hawaii cho rằng tác nhân gây thối nõn là vi khuẩn Erwinia chrysanthemi. Theo Viện nghiên cứu cây công nghiệp – cây ăn quả phối hợp với cục bảo vệ thực vật (Đinh Văn Đức và Vũ Khắc Nhượng; trích dẫn bởi [7]) vi khuẩn gây bệnh thối nõn là Pseudomonas ananas. Tuy nhiên, sự thiếu cân bằng về dinh dưỡng cũng góp phần tạo điều kiện cho sự xâm nhập của nấm bệnh và vi khuẩn. Triệu chứng Bệnh gây hại nghiêm trọng trên các chân đất úng, thường kết hợp với Pythium sp. Bắt đầu thối từ tâm hoa thị của cây do đất bùn có mang mầm bệnh bắn vào. Cây bị bệnh lá từ màu xanh ngả vàng rồi qua đỏ và sau đó đầu lá trở nên nâu xám, gốc lá thối tỏa mùi hôi, dễ bứt lá ra khỏi thân. Biện pháp phòng trị Xử lí cây con, thoát nước tránh để líp thơm ẩm thấp, bón vôi nâng pH, vệ sinh đồng ruộng nhổ bỏ cây bệnh, phun thuốc quanh các cây bị bệnh. 2.6.2.2. Bệnh thối mềm Nguyên nhân Bệnh do Thielaviopsis paradoxa gây ra. 13 Triệu chứng Đây là bệnh cần kiểm dịch khi xuất quả tươi. Nấm gây thối trên chồi, trên thân, lá và đặc biệt trên quả. Nấm theo vết xây xát xâm nhập vào bên trong. Trên quả có thể nhận biết nấm này do màu xám đen và mùi thối của vị trí bị bệnh. Biện pháp phòng trừ Tránh làm xây xát quả, giảm tối đa thời gian từ thu hoạch tới lúc trữ lạnh xuất khẩu, nhiệt độ bảo quản khoảng 80C. Trừ ruồi, phun thuốc trừ nấm; phun, nhúng quả, cuống quả vào thuốc trừ nấm để sát trùng các vết thương. 2.6.2.3. Bệnh “luộc lá” Khi nhiệt độ không khí dưới 150C và kéo dài, cây dứa có hiện tượng lá bị mất dần diệp lục, từ màu xanh chuyển dần sang trắng nhạt rồi bạc hẳn như bị luộc trong nước sôi. Nguyên nhân bệnh là do sự thiếu hụt magie và sự mất cân bằng về các yếu tố đa lượng và vi lượng nên chỉ cần bón đạm, lân, kali cân đối kết hợp với magie và canxi ( N:P:K:Mg:Ca = 8:4:12:4:3 g/cây) là có thể làm giảm bệnh rất đáng kể. 2.6.2.4. Tuyến trùng hại dứa Các loại tuyến trùng phổ biến Tuyến trùng là nguyên nhân thường xuyên gây thiệt hại lớn thông qua phá hoại bộ rễ của cây. Theo Trần Thế Tục và Vũ Mạnh Hải (2000) trên các vùng trồng dứa lớn có các loại tuyến trùng chủ yếu sau đây: - Pratylenchulus brachyurus: đây là loài phá hoại mạnh nhất. Kết quả điều tra của Guerout cho thấy ở vụ dứa thứ 2, riêng loài này đã chiếm 75% động vật kí sinh ở rễ dứa. - Meloidogyne incognita acaita: tương đối phổ biến đối với tất cả các loại đất trồng dứa nhưng chỉ gây tổn thất trên những vườn trước đó trồng cây lương thực, thực phẩm. Ngoài ra còn có Helicotylenclus dihptera Cabb và Criconemoides onoeusis nhưng tác hại không đáng kể. Phòng trừ tuyến trùng Xử lí đất trước khi trồng một cách hiệu quả như cày bừa đất trước khi trồng một tháng, tiêu diệt tất cả mọi tàn dư thực vật có trên đồng ruộng. 14 Vùng trồng dứa phải được luân canh với các cây trồng khác mà tuyến trùng hại dứa không có hoặc ít xuất hiện. 2.7. Bệnh héo do virus Theo Sether và cộng sự (1998) [16], bệnh héo do virus (Mealybug wilt of pineapple- MWP) là bệnh gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới. Bệnh biểu hiện đầu tiên trên các lá già nhất, sau đó đến các lá già và lá bên trên; các lá đỏ dần lên, vỏ lụa bung ra, lá kém trương nước, mép lá và đầu lá bị héo, hóa nâu và khô dần [13]. Tùy theo giống từ khi cây bị nhiễm bệnh tới khi biểu hiện triệu chứng mất từ 2 tuần đến 6 tháng. Nhiều cây con bị nhiễm trong vườn ươm không có dấu hiệu bệnh, sau một thời gian trồng mới biểu hiện. Bệnh trở nên nặng hơn khi cây ra hoa, nuôi quả và ở các mùa gốc. Nguyên nhân gây bệnh Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một yếu tố tiềm tàng liên quan đến bệnh là virus. Một dạng closterovirus hình que gấp khúc được phân lập từ những cây có triệu chứng MWP ở Hawaii. Tuy nhiên sau đó những tiểu phần closterovirus cũng được tìm thấy ở cả cây dứa có và không có thể hiện triệu chứng trên phạm vi thế giới. Virus liên quan đến bệnh héo ở dứa (PMWaV) thực chất là phức hợp của 2 loại virus PMWaV-1 và PMWaV-2. Dựa vào các đặc điểm về di truyền, hai loại virus này được xếp vào họ Closterovirus, loài Ampelovirus, giống Vinivirus [14]. Các phân tích về phát sinh loài ở trình tự gen cho thấy PMWaV-1 và PMWaV-2 có độ tương đồng trung bình 50%. PMWaV-2 liên quan rất mật thiết với virus gây bệnh cuốn lá ở nho (GLRaV-3) có độ tương đồng từ 64% - 72% thông qua 4 khung đọc (open reading frame-ORF) [14]. Tác nhân lây truyền bệnh PMWaV-1 và PMWaV-2 được truyền bởi 2 loài rệp sáp: Dysmicoccus brevipes (rệp màu hồng) và D. neobrevipes (rệp màu xám) [18]. Rệp sáp có kích thước khoảng 2 – 3 mm, mình phủ một lớp sáp để tự vệ. Rệp sáp bám vào các lá non, vào gốc là già, vào mắt quả, vào rễ cây để hút dịch cây. Rệp thực chất không chứa virus; chúng sống trên cây dứa nhiễm PMWaV và thu được virus. Rệp tiếp thu và truyền virus trong suốt quá trình dinh dưỡng. Không có kí chủ khác của virus được tìm thấy ngoài cây dứa mặc dù nhiều loài cỏ cũng là kí chủ của hai loài rệp này. Điều đó cho thấy cây dứa nhiễm PMWaV là nguồn chứa virus duy nhất cho rệp truyền sang các cây khác. 15 Kiến thường xuất hiện đồng thời với rệp tạo điều kiện thuận lợi cho rệp phát triển. Với sự che chở của kiến cùng chu kì sinh sản ngắn từ 35 – 45 ngày, rệp mắn đẻ và phát triển rất nhanh. Cách phòng trị Chọn giống kháng bệnh Lấy giống từ vùng ít bệnh Chú trọng sản xuất cây con sạch bệnh. Phòng chống kiến và rệp sáp qua việc bóc các lá vảy rồi khử con giống bằng thuốc trừ rệp sáp; phun định kì và phun kĩ các lô mới trồng vì thời gian đầu lá còn ít và nhỏ nên chỗ ẩn núp của kiến và rệp ít hơn. Làm cỏ sạch, phủ bạt, khử đất trước khi trồng 2.8. Phƣơng pháp tạo cây sạch virus 2.8.1. Sơ lƣợc về hình thái, cấu tạo và sự di chuyển của virus thực vật [2] Hình thái Virus thực vật có hình thái và kích thước rất đa dạng. Virus có thể có dạng hình gậy (virus khảm thuốc lá - TMV, virus khảm sọc lá lúa mạch…), hình cầu (virus khảm dưa chuột, virus khảm súp lơ), hình khối đa diện, hình sợi (virus X khoai tây, Closterovirus…)… Cấu tạo Thông thường mỗi virus đều được cấu tạo từ protein và acid nucleic. Trường hợp đặc biệt một số virus có chứa polyamin, lipid hay enzyme đặc hiệu (ở Bacteriophage). Các phân tử protein cấu tạo nên vỏ (capside) của virus. Lớp vỏ bao lấy phần lõi là các chuỗi acid nucleic. Phần lớn virus thực vật có cấu tạo lõi là RNA (ribonucleic acid). Một số ít (khoảng 25 virus) virus thực vật có lõi DNA (deoxyribonucleic acid). Sự di chuyển của virus Ở góc độ tế bào, virus di chuyển theo dòng tế bào chất hay di chuyển theo dòng nhựa nguyên và nhựa luyện của cây. Theo các mạch dẫn, virus được truyền trong cây từ vùng này sang vùng khác. Nhờ cầu nối nguyên sinh virus có thể di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác. 16 Trong phạm vi quần thể bao gồm những cây nhiễm virus và những cây không bị nhiễm virus, virus chỉ có thể truyền sang cây khỏe nhờ vào môi giới truyền bệnh (vector). Ngoài ra, virus có thể lan truyền trên diện rộng (không nhờ môi giới) do nguồn giống, nguyên liệu nhân giống ban đầu không sạch virus. Trên thực tế, diện tích cây trồng bị nhiễm virus ngày càng lan rộng vì nguồn giống ban đầu chưa đảm bảo sạch virus nói riêng và các mầm bệnh khác nói chung; từ đó, các loại môi giới tiếp tục truyền virus sang cây khỏe giúp virus thực hiện quá trình xâm nhiễm, gây bệnh. 2.8.2. Cơ sở của các phƣơng pháp tạo cây sạch virus “Sạch virus” có nghĩa là không có sự hiện diện của loài virus đã được xác định thông qua các thí nghiệm kiểm tra (Quak, 1966; trích dẫn bởi [15]). Mô phân sinh là mô sạch virus nhất. Mô phân sinh gồm các tế bào chưa phân hóa, có hoạt động phân chia tế bào mạnh. DNA polymerase có trong quá trình phân chia tế bào này sẽ ức chế sự nhân lên của virus. Virus sẽ không theo kịp sự tăng trưởng của ĐST và không thể di chuyển đến các tế bào ở ĐST [36]. Nhiệt độ cao cũng có thể làm virus bất hoạt và chết. Do đó, trong qui trình tạo cây sạch virus phương pháp xử lí nhiệt và nuôi cấy ĐST được áp dụng. 2.8.3. Các phƣơng pháp tạo cây sạch virus Sự nhiễm bệnh do virus, mycoplasma, vi khuẩn và nấm rất khó loại trừ. Hầu như không thể tiêu diệt các tác nhân gây bệnh kí sinh trên cây bằng hóa chất, đặc biệt là virus. Theo Pierik (1987) có 5 phương pháp tạo cây sạch virus: Xử lí nhiệt (heat treatment) Nuôi cấy ĐST (meristerm culture) Xử lí nhiệt sau đó nuôi ĐST Tạo chồi ngẫu nhiên kết hợp nuôi cấy ĐST Ghép ĐST lên cây sạch virus (micro grafting) Khi nghi ngờ cây bị nhiễm virus cần thực hiện các bước sau (Quak, 1977; trích dẫn bởi [15]): Xác định virus Thực hiện các biện pháp loại trừ virus Tiến hành thí nghiệm xác định cây nghi ngờ có nhiễm virus hay không 17 Ngăn chặn bất kì sự tái nhiễm nào 2.8.3.1. Xử lí nhiệt Xử lí nhiệt là một cách hiệu quả nhằm bất hoạt một số virus (Quak, 1972; và Houten và c.s., 1968; trích dẫn bởi [15]). Đôi khi xử lí nhiệt không hiệu quả do cây quá mẫn cảm với nhiệt độ hay virus không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ với lí do chưa được xác định. Cần xét đến nhiệt độ và thời gian xử lí, đảm bảo cây (chồi, cành) sống sót trong khi virus bị bất hoạt. Phương pháp này đã được áp dụng và mang lại kết quả tốt chống lại virus và mycoplasma hiệu quả ở cây ăn quả, cây mía, sắn dây và cây khoai mì (Morel, 1964; Quak, 1966, 1977; và Kartha và Gamborg, 1975; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp này rất thuận tiện đối với cây ăn quả vì nuôi cấy ĐST khó áp dụng cho đối tượng này. Ở cây thân gỗ, chỉ xử lí nhiệt chồi bên rồi ghép với cây con (cây từ hạt được vô mẫu). Thường thời gian xử lí nhiệt dao động từ 20 – 40 ngày hay vài tháng với nhiệt độ cố định hay thay đổi từ 37 – 380C. Với phương pháp này có thể thu được cây sạch bệnh với một tỉ lệ cao (Fridlund, 1980; trích dẫn bởi [15]). 2.8.3.2. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Đỉnh sinh trƣởng [5] Mô phân sinh ngọn chứa những tế bào ĐST, được bao bọc bởi một lớp vỏ cutin để hạn chế tối đa sự mất nước. Lớp cutin này bao bọc luôn cả chồi ngọn. Hình 2.1 Cấu tạo cơ bản của đỉnh sinh trưởng (Nguồn: tài liệu internet [36]) Ở thực vật, sự hình thành mới cơ quan bắt đầu từ trong các mô phân sinh ngọn, các mô này được phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu tiên của phôi do sự 18 phân hóa của các tế bào sơ khởi. Tất cả các tế bào còn lại đều xuất phát từ tế bào sơ khởi. Vì mô phân sinh có kích thước tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ tế bào sơ khởi qua vài lần phân chia sẽ tách rời khỏi mô phân sinh. Quá trình sinh trưởng của đỉnh sinh trưởng được chia thành 3 giai đoạn: i. Giai đoạn thứ nhất thường được gọi là giai đoạn khởi sinh, trong các điểm sinh trưởng (trong các mô phân sinh ngọn) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt. ii. Giai đoạn thứ hai là giai đoạn kéo dài do sự tăng trưởng nhanh chóng, mầm cơ quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định. iii. Giai đoạn thứ ba, kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu dẫn đến sự hóa gỗ các thành tế bào, và kết quả là mô không còn khả năng sinh trưởng.Trước hết các u lồi dần dần được tạo thành và được gọi là những u lá. Thể tích và chiều dài của u lá tăng rất nhanh kéo theo phần lớn của ĐST. U lồi chuyển dần thành phác thể lá (thể nguyên thủy của lá) và phác thể lá phát triển nhanh về chiều dài. Sau khi lá được tách ra, sự phân chia tế bào sẽ được lặp lại. Kết quả là ĐST được khôi phục nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu. Ở mỗi nách lá đều có chồi nách (chồi bên). Chồi bên thực chất có cấu tạo không khác ĐST thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chồi bên không phát triển, nhưng khi thoát khỏi sự áp chế của chồi ngọn thì chúng bắt đầu tăng trưởng và có lá đầy đủ như thân chính. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng [5,14] White (1943; trích dẫn bởi [5]) cho rằng virus khảm thuốc lá (TMV) có mặt trong các phần khác nhau trên rễ cây thuốc lá, mật độ virus giảm dần khi đến chóp rễ, và ngay ở chóp rễ hoàn toàn không có virus. Limasset và Cornuet (1949; trích dẫn bởi [5]) cho rằng có một khuynh độ về mật độ virus trong chồi ngọn cây thuốc lá và ở mô phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Các nghiên cứu cho rằng ĐST ngọn và chóp rễ không mang virus. Tuy nhiên ở một số loài thực vật virus cũng hiện diện trong ĐST của cây (Pierik, 1987) . Theo Quak (1966; trích dẫn bởi [15]) ở ĐST có sự canh tranh giữa sự sinh sản của virus và sự phân chia của tế bào mô phân sinh (Pierik, 1987). Trong quá trình phân chia của tế bào, quá trình sinh tổng hợp acid nucleic được tăng 19 cường do đó gây bất lợi cho sự tăng sinh của virus. Lúc này các tế bào phía dưới ĐST chủ yếu gia tăng kích thước do đó virus có thể sản sinh được. Quak (1966) còn cho rằng trong ĐST không có sự hiện diện của bó mạch và cầu liên bào nên gây trở ngại cho sự chuyển động của virus. Có nhiều giả thuyết về yếu tố gây trở ngại cho sự xâm nhập của virus vào ĐST như nồng độ auxin và cytokinin, enzym cần thiết cho sự tăng sinh của virus…nhưng các giả thuyết trên chưa được chứng minh. Morel và Martin (1952; trích dẫn bởi [15]) đã đưa ra sáng kiến cô lập ĐST cây thược dược bị nhiễm virus đưa vào nuôi cấy in vitro và thu được cây sạch bệnh. Họ cũng là những người đầu tiên tạo được cây thược dược và khoai tây sạch bệnh bằng cách nuôi cấy ĐST. Sau đó, phương pháp này được áp dụng với những cây trồng quan trọng như khoai tây, Trifolium, mía … và những cây thân gỗ. Khi nuôi cấy ĐST nên chọn những cây đang tăng trưởng để thu ĐST. Nếu ĐST cô lập đang ở trong trạng thái hoạt động (gồm vùng mô phân sinh và cả phần dưới ngọn) thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn. Nên tách lấy vòm mô phân sinh (meristematic dome) và 1 cặp lá đầu tiên. Nếu lấy đoạn lớn hơn sẽ tạo điều kiện truyền virus. Kích thước của mô phân sinh và lá từ 0,1 – 0,5 mm [36]. Vòm đỉnh (apical dome) có kích thước từ 0,1 – 0,25 mm phụ thuộc vào loài và sự cân bằng về kích thước. ĐST phải đủ nhỏ để đảm bảo sạch virus và các tác nhân gây bệnh khác đồng thời đủ lớn để có thể phát triển thành chồi. Mặc dù rễ có thể hình thành trực tiếp từ chồi trong cùng môi trường, nhưng thường chồi phải được chuyển sang môi trường tạo rễ để phát triển. Tỉ lệ cây sạch virus thu được phụ thuộc vào nhiều yếu tố như vật liệu khởi đầu như ĐST của chồi ngọn hay chồi bên (Styer và Chin, 1983; trích dẫn bởi [5]), thời gian thu mẫu trong năm (Van Os, 1964; trích dẫn bởi [5]), thành phần môi trường, nhiệt độ nuôi cấy, nhiệt độ xử lí… Tỉ lệ cây sạch bệnh thu được bằng phương pháp nuôi cấy ĐST thường rất nhỏ. Nguyên nhân là do mẫu bị nhiễm, bị hư hại, bị khô nước và bị hóa nâu, môi trường nuôi cấy không phù hợp; có khi ĐST không tăng trưởng do đang ở trong trạng thái hưu miên. Trong trường hợp thu được cây hoàn chỉnh từ nuôi cấy ĐST thì cần kiểm tra xem cây có thực sự sạch virus không. Nếu cây sạch virus thì sẽ được sử dụng làm cây mẹ để nhân giống vô tính, tạo ra nhiều cây sạch virus. 20 Hình 2.2 Qui trình nuôi cấy ĐST. (A) phần mô phân sinh đỉnh được cắt. (B) ĐST được cấy trên môi trường agar. (C) cây con tái sinh từ ĐST. (D) cây con được chuyển ra đất đã khử trùng (Nguồn: theo tài liệu internet [39]) 2.8.3.3 Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST Để làm tăng cơ hội thu được cây sạch bệnh trong những trường hợp khó khăn (cây bị nhiễm bởi nhiều loại virus) thì nên xử lí nhiệt trước khi thu ĐST để nuôi cấy nhằm làm giảm số lượng virus hoặc làm tăng diện tích vùng không bị nhiễm virus. Thời gian xử lí nhiệt thay đổi từ 5 – 10 tuần với nhiệt độ 35 – 380C (Quak, 1977; trích dẫn bởi [15]). Phương pháp trên đã được sử dụng thành công với khoai tây, cúc, cẩm chướng và dâu tây. Theo Morel (1964; trích dẫn bởi [5]), khi giữ củ khoai tây ở nhiệt độ 37 – 380C trong một tháng trước khi tiến hành nuôi cấy ĐST thì sẽ thu được cây sạch bệnh. Xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST có thể loại bỏ virus, vi khuẩn, và nấm nhưng không loại bỏ được viroid. Khác với virus, viroid là RNA không có vỏ protein – chúng là RNA trần và rất khó loại bỏ. Thường những cây bị nhiễm phải bị hủy [36]. 21 Sơ đồ 2.3 Qui trình tạo cây sạch bệnh bằng phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST. (Nguồn: theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002) 2.8.3.4 Tạo chồi bất định kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Brierley (1962; trích dẫn bởi [15]) mô tả sự tạo căn hành bất định in vitro từ vảy của Lilium longiflorum. Hildebrant (1971; trích dẫn bởi [15]) cũng có những kết luận tương tự trên cây glaieul. Phôi soma hình thành từ mô phôi tâm Citrus khi tái sinh thường tạo ra những cây sạch bệnh (Button và Bornman, 1971; và Bitters và c.s., 1972; trích dẫn bởi [15]). Việc tạo cây sạch bệnh từ phương pháp tạo chồi bất định đã được tiến hành thành công ở Lili (Allen, 1974; và Asjes và c.s., 1974; trích dẫn bởi [5]) và cây dạ lan hương. Trong thí nghiệm này, các mẫu cấy Lili bị nhiễm virus được kích thích để tạo thành củ bi bất định in vitro; khi kích thước ĐST của các chồi mọc từ củ tăng đến 1mm thì được chuyển sang môi trường nuôi cấy khác để ĐST tiếp tục phát triển. Phương pháp tạo chồi bất định được thực hiện theo một hướng khác để thu được cây sạch bệnh ở một số loài như: Petunia, thuốc lá, bắp cải. Ở những cây này, trên lá có những vùng đặc biệt không bị nhiễm virus trong khi toàn cây đã bị nhiễm. Những vùng này được cô lập và kích thích để tạo chồi bất định thì sẽ tạo được những cây sạch bệnh (Murakishi và Carlson, 1979; trích dẫn bởi [15]). Nhân giống cây mẹ sạch bệnh Chồi ra rễ Cây mẹ Kiểm tra virus Chuyển cây ra đất Kiểm tra virus Tăng sinh chồi Xử lí nhiệt Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Chồi hình thành Cây bị nhiễm virus 22 2.8.3.5. Vi ghép Nếu như không cảm ứng được sự tăng trưởng của ĐST hoặc thu hút được chồi từ nuôi cấy ĐST thì có thể ghép ĐST vào cây con in vitro để nó có thể tăng trưởng. Phương pháp vi ghép này rất có ý nghĩa đối với những cây thân gỗ không thể tiến hành nuôi cấy ĐST. Phương pháp này lần đầu tiên được thực hiện bởi Morel và Martin trên đối tượng là cây thược dược vào năm 1952. Sau đó, vi ghép được thực hiện thành công bởi Murashige và c.s. (1972; trích dẫn bởi [5]), Navaro và c.s. (1975; trích dẫn bởi [5]) trên cây Citrus và đã loại trừ được hai loại virus. Trong một số trường hợp (mơ ghép với nho) thì trước khi ghép, mẫu phải được xử lí nhiệt . 2.9. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây do virus Các kĩ thuật chẩn đoán virus gây hại thực vật được phân thành các quá trình huyết thanh học, các quá trình liên quan nucleic acid và kết hợp cả hai quá trình. Yêu cầu của các phương pháp chẩn đoán virus phải nhanh, nhạy và chính xác. 2.9.1. Các phƣơng pháp kiểm tra dựa trên quá trình huyết thanh học [21] 2.9.1.1. Cơ sở khoa học của kĩ thuật huyết thanh học Cơ sở khoa học của phương pháp này chủ yếu dựa vào hoạt động hệ miễn dịch ở động vật: khi có protein lạ (kháng nguyên) xâm nhập vào máu của cơ thể động vật, hệ thống bạch huyết sẽ sinh ra protein đặc hiệu (kháng thể) để chống lại protein lạ trên. Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ tạo kết tủa. Đây là phản ứng tự vệ của động vật, làm cho kháng nguyên gây bệnh bất hoạt và cơ thể động vật được bảo vệ. 2.9.1.2. Phƣơng pháp ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) Nguyên tắc phương pháp dựa trên khả năng gắn kết giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể nhận biết protein của virus quan tâm (thường là protein vỏ) được tạo ra trong cơ thể động vật. Sử dụng kháng thể phủ lên đĩa kiểm tra sau đó cho mẫu cần kiểm tra vào giếng (nhựa cây hay mẫu bệnh phẩm đã được ly trích). Nếu virus quan tâm có trong mẫu kiểm tra, kháng nguyên của viurs sẽ gắn vào kháng thể cố định. Bất kì thành phần không gắn kết nào sẽ bị loại bỏ khi rửa giếng, trước khi kháng thể thứ hai nhận biết kháng thể thứ nhất được thêm vào. Kháng thể thứ hai cho phép phát hiện virus gián tiếp nhờ phân tử tín hiệu (reporter molecule), thường là do một enzyme tác động lên cơ chất đổi màu. Sự đổi màu cơ chất được đánh giá bằng quang phổ. Với sự hiệu chỉnh hợp lí, ELISA có thể định tính cũng như định lượng. 23 Phương pháp này có thể được sử dụng để kiểm tra một loại virus trên nhiều cây, mỗi giếng một mẫu cây. Có thể kiểm tra đồng thời nhiều virus trong 1 đĩa đơn với các kháng thể khác nhau phủ ở mỗi giếng với 2 hoặc 3 lần lặp lại. Ưu điểm: độ chính xác cao, đơn giản và giá thành thấp. Hạn chế : đòi hỏi huyết thanh kháng thể đơn dòng hay đa dòng đặc hiệu với virus và không phản ứng chéo protein thực vật. Một hình thức khác của ELISA gọi là Thí nghiệm đo điện thế miễn dịch enzyme (Voltametric enzyme immunoassay). Phương pháp nhằm mục đích phát hiện sự thay đổi độ dẫn điện của cơ chất khi enzyme gắn vào kháng thể thứ hai. Phương pháp này nhạy hơn ELISA, được sử dụng để phát hiện virus khảm dưa leo (Cucumber mosaic virus). 2.9.1.3. Phƣơng pháp TBIA (Tissue blot immunoassay) Giống ELISA, phương pháp này sử dụng kháng thể kháng virus. Nhựa từ mô thực vật được chuyển lên giấy thấm, màng nylon hay nitrocellulose và virus được phát hiện nhờ các probe đã đánh dấu thường là các chất phát quang. Quá trình này ít thao tác hơn so với ELISA, nhanh hơn, nhạy hơn, đơn giản (không đòi hỏi tách chiết virus) và rẻ tiền hơn (cần rất ít thiết bị), thích hợp khi cần kiểm tra 1000 – 2000 mẫu mỗi ngày. Bên cạnh các kĩ thuật hiện đại, các phương pháp quan sát phản ứng huyết thanh như: quan sát kết tủa của phản ứng dưới kính hiển vi có tụ quang đen, phản ứng khuếch tán gel…[2] cũng được sử dụng để chẩn đoán virus. 2.9.2. Phƣơng pháp hiển vi quang học và vi điện tử 2.9.2.1. Quan sát bằng kính hiển vi quang học [2] Trong quá trình kí sinh, virus thực vật thường có khả năng tạo dạng kết tinh vô định hình hoặc dạng đặc trưng do vô số cá thể virus kết hợp lại với nhau. Virus khảm thuốc lá thường tạo dạng kết tinh trong suốt ở mô tế bào cây bệnh. Tinh thể virus có thể nhuộm màu và quan sát được trên kính hiển vi quang học thông thường ở độ phóng đại 80 lần. 2.9.2.2. Quan sát bằng kính hiển vi điện tử Nhờ kính hiển vi điện tử, sợi virus hay hạt virus có thể được quan sát chính xác hình thái và cấu tạo. Hình thái virus có thể được mô tả một cách chính xác ở độ phóng 24 đại hàng vạn lần. Ngày nay, kính hiển vi điện tử tia xuyên được sử dụng như một công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu tạo của virus thực vật. 2.9.3. Phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử 2.9.3.1. Cơ sở khoa học của các phƣơng pháp chẩn đoán sinh học phân tử Các kĩ thuật sinh học phân tử dựa trên vật chất di truyền của virus (RNA/DNA) và quá trình tái tổ hợp của chúng. Khi xâm nhập vào tế bào kí chủ, RNA virus được phóng thích khỏi lớp vỏ protein. Các enzyme cảm ứng tổng hợp RNA (RNA replicase, RNA synthetase) cùng với RNA virus (sợi +) đóng vai trò là sợi khuôn mẫu giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi - và sợi +). Với các loại virus có RNA (sợi -) thì chúng buộc phải chuyển sang dạng mRNA (sợi +). Khi xâm nhiễm vào tế bào kí chủ, virus đã đưa RNA (sợi -) và enzyme vào tế bào. Các virus có RNA sợi kép thì quá trình hình thành RNA (sợi – và sợi +) được thực hiện nhờ RNA polymerase. Với các virus chứa DNA thì sự tổng hợp vật chất di truyền được sự trợ giúp của enzyme từ tế bào kí chủ. 2.9.3.2. Polymerase chain reaction (PCR) và Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) PCR và RT-PCR là các kĩ thuật phổ biến để phát hiện và xác định RNA và DNA của virus thực vật. Phương pháp này cực kì nhạy, không quá đắt tiền và đòi hỏi ít kĩ năng thực hiện. Trong trường hợp RNA virus, một sợi cDNA bổ sung với RNA virus được tổng hợp với xúc tác reverse transcriptase (RT). Các primer được kéo dài bởi DNA polymerase bền nhiệt trong một chuỗi các bước biến tính và kéo dài, làm tăng DNA mục tiêu theo cấp số nhân. Hiện nay có 3 loại primer cơ bản được sử dụng để khuếch đại RNA virus (xem Phụ lục 3)[12]. Đối với DNA virus thì bước RT không cần thiết. Có nhiều dạng khác nhau phát triển trên kĩ thuật cơ bản nhằm tăng độ nhạy, thay đổi tính đặc hiệu hay cho phép tự động phát hiện. Các dạng thường gặp: Multiplex RT-PCR, Fluorescence RT-PCR using Taqman TM technology, Competitive flourescence PCR (CF-PCR), Immunocapture PCR (IC-PCR), Nested PCR. 2.9.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các đoạn đa dạng về chiều dài hạn chế (Restriction fragment length polymorphism – RFLP) RFLP được sử dụng kết hợp với PCR để xác định sự khác nhau giữa các virus dựa trên sự hiện diện của các vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Sau khi khuếch 25 đại PCR, các mẫu được phân cắt bởi enzym cắt giới hạn và các kích thước của đoạn phân cắt được phân tích bằng điện di. RFLP là một phương pháp phân biệt các dòng virus không cần thực hiện cloning và sequencing. Hiệu của quả phương pháp này phụ thuộc vào sự đa hình trong phạm vi vị trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn. 2.9.3.4. Probe đánh dấu (Labelled probes) Việc lai probe DNA hay RNA giúp cho việc phát hiện nucleic acid virus ở cả hai dạng, sợi đơn và sợi đôi. cDNA probe có thể được gắn nhãn với các isotope hay probe không có chất phóng xạ. cDNA probe thường được sử dụng để phát hiện RNA virus vì dạng lai giữa RNA/RNA bền vững hơn dạng lai DNA/RNA. Dịch ly trích RNA từ mô nhiễm được chuyển lên màng, cho lai với probe và phát hiện RNA virus. 2.10. Các nghiên cứu về bệnh héo đỏ đầu lá (bệnh wilt) 2.10.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc Bệnh wilt lần đầu tiên được mô tả bởi các nhà khoa học thuộc phòng thí nghiệm Hiệp hội những người trồng mía Hawaii (HSPA) năm 1910. Năm 1900 bệnh này gây thiệt hại nặng nề cho công nghiệp trồng dứa ở Hawaii; cho đến nay bệnh xuất hiện ở hầu hết các khu vực trồng dứa trên thế giới [11,13]. Sự liên hệ giữa bệnh wilt-rệp-kiến Những nghiên cứu bước đầu về bệnh wilt trên cây dứa bắt đầu từ mối liên hệ giữa bệnh wilt-rệp sáp-kiến được thực hiện bởi Kenneth G. Rohrbach và cộng sự (1988). Ở cây bệnh wilt luôn có sự hiện diện của rệp sáp và kiến. Không có kiến quần thể rệp sáp không thể gia tăng số lượng (Rohrbach và c.s., 1988). Sự có mặt của kiến cho phép 2 loài rệp sáp Dysmicoccus brevipes (Cockerell) và D. neobrevipes Beardsley phát triển. Kiến bảo vệ rệp sáp tránh các loài kí sinh và các loài tấn công rệp đồng thời kiến tiêu thụ chất “mật” do rệp tiết ra giúp cho quá trình xâm nhập của rệp diễn ra thuận lợi. Nguyên nhân gây bệnh Năm 1989, các tiểu phần tương tự closterovirus được tinh sạch từ mô dứa Hawaii bệnh và phân loại. Đến năm 1997, các virion tương tự closterovirus (PCV) liên quan về mặt huyết thanh với quần thể PCV Hawaii được tinh sạch từ cây dứa bệnh ở Australia. Kháng thể đơn dòng (Mab) đặc hiệu closterovirus dứa được sử dụng trong thử nghiệm miễn dịch mô (TBIA) để phát hiện PCV ở dứa. 26 Hu và c.s. (1997) đã thực hiện nghiên cứu kiểm tra sự hiện diện của PCV trên hơn 20.000 mẫu dứa bằng phương pháp TBIA. PCV được phát hiện trên những cây dứa không thể hiện triệu chứng bệnh. Phân tích các kiểu bệnh PMW ở Sri Lanka được G. Hughes và S. Samita (1997) [10] thực hiện tìm ra sự tương quan giữa triệu chứng và các yếu tố lây nhiễm. Các kết quả này góp phần quan trọng cho lời giải đáp nguyên nhân gây bệnh héo lá liên quan đến rệp sáp. Nguyên nhân gây bệnh là virus PMWaV, được xếp vào họ Closteroviridae dựa vào đặc tính lây truyền. Yếu tố lây truyền virus Sether và c.s. (1998) thực hiện thí nghiệm về sự lây truyền virus của 2 loài rệp sáp Dysmicoccus spp. thông qua tỉ lệ giữa cây nhiễm virus (-) và cây không nhiễm virus (+) trước và sau khi tiếp xúc với rệp trong trường hợp có kiến và không có kiến. Tình trạng PMWaV của cây thí nghiệm được xác định bằng phương pháp TBIA và ISEM (immunosorbent electron microscopy). Thí nghiệm sự lan truyền virus của D. brevipes khi không có kiến Nghiệm thức 1(NT1): cây (-) trồng xen kẽ cây (+), không chủng rệp. NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus. NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) được chủng rệp mang virus. Kết quả ở nghiệm thức 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không thay đổi trong khi ở nghiệm thức 3 có sự gia tăng số cây nhiễm virus. Thí nghiệm sự lan truyền virus bởi D. brevipes khi có kiến NT 1: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) và không chủng rệp NT 2: cây (-) được chủng rệp không mang virus NT 3: cây (-) trồng xen kẽ cây (+) , chủng rệp không mang virus Kết quả cho thấy ở NT 1 và 2 tỉ lệ cây ban đầu không đổi; ở NT 3 tỉ lệ cây nhiễm virus cao hơn và thời gian lây nhiễm ngắn hơn so với trường hợp không có kiến. Nghiên cứu trên cho thấy rõ vai trò chính của rệp trong việc lây lan virus và yếu tố thúc đẩy sự lây lan là kiến. Ở thí nghiệm với D. neobrevipes cũng cho kết quả tương tự. 27 Các phƣơng pháp phát hiện PMWaV Sether và c.s. (2001) đã sử dụng kĩ thuật RT-PCR và Southern Blot để phát hiện PMWaV. Mô lá hay rệp được nghiền trong nitơ lỏng và tách chiết RNA tổng số sử dụng Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA). Mẫu RNA tinh sạch được bảo quản ở -800C cho đến khi sử dụng. cDNA thứ nhất dựa trên vùng gene mã hóa HSP 70 của PMWaV-1 và PMWaV-2 được tổng hợp từ 2,5 – 7 g RNA sử dụng primer tái tổ hợp 223 và 226 cho PMWaV-1 và PMWaV-2; việc tổng hợp thực hiện ở 42 0C (45 phút) sau đó bất hoạt ở 950C (5 phút). Sau đó phản ứng PCR được tiếp tục trong cùng tube với primer 224 và 225 với chương trình nhiệt như sau: giai đoạn biến tính 940C (4 phút); 45 chu kì 940C (1 phút), 540C (1 phút), 720C (1 phút) và giai đoạn kéo dài cuối cùng 720C (10 phút). Sản phẩm PCR được quan sát trên gel agarose 1% được nhuộm ethidium bromide. Gel chứa sản phẩm khuếch đại được làm biến tính, trung hòa và chuyển lên màng Zeta- Probe GT (Biorad, Hercules, CA) thực hiện Southern blot. Kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng trong kĩ thật TBIA; Mab 35-6-5 cho PMWaV-1 và Mab 63-2-2 cho PMWaV-2. RT-PCR và TBIA được sử dụng song song để phát hiện PMWaV. Loại bỏ virus Theo Sether và c.s. (2001), PMWaV-1 ở chồi dứa nhiễm bệnh được loại bỏ bằng xử lí nhiệt. Quá trình xử lí nhiệt gồm 2 giai đoạn: 350C trong 24 giờ tiếp theo ngay sau đó là 580C trong 40 phút hay 560C trong 60 phút trong bồn nước (water bath). Lá được cắt khỏi chồi 24 giờ sau giai đoạn 2 xử lí nhiệt. Thực hiện vô mẫu với các khối vuông cắt ra từ chồi ngọn và chồi đỉnh có kích thước 1mm . Các môi trường nuôi cấy khác nhau đã được sử dụng để tái sinh mẫu cấy. Khi rễ phát triển, cây tái sinh hoàn chỉnh được chuyển ra trồng ngoài đất. Thực hiện việc kiểm tra PMWaV bằng RT-PCR trước đó. Thử nghiệm TBIA đặc hiệu cho PMWaV được sử dụng 1 – 2 tháng sau khi trồng cây ngoài đất. Kết quả thực hiện cho thấy 92% cây hồi phục ở tất cả các nghiệm thức. 2.10.2. Các nghiên cứu trong nƣớc Nhìn chung, Việt Nam chưa nghiên cứu nhiều về bệnh đỏ đầu lá. Các đề tài nghiên cứu chỉ dừng lại ở bước xác định mối liên quan mật số rệp và mức độ bệnh ở dứa. Theo kết quả điều tra tình hình bệnh wilt của nhóm điều tra bệnh hại trên dứa 28 thuộc trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM năm 2003 cho thấy bệnh wilt xuất hiện ở tất cả các ruộng với tỉ lệ bệnh cao: nông trường Thọ Vực (Đồng Nai) có tỉ lệ bệnh cao nhất: 12,1%, tiếp theo là nông trường Phạm Văn Hai 6% và nông trường Lê Minh Xuân 7%; còn ở Bến Lức (Long An), Tân Phước (Tiền Giang) và Đức Trọng (Lâm Đồng) tỉ lệ bệnh lần lượt là 9,3%, 8,1% và 4,1% (Phạm Văn Khánh, 2004; Võ Thị Mỹ Hân, 2004; và Võ Thị Thúy Huệ, 2004). Phòng trừ bệnh Theo Nguyễn Văn Kế (2000), để phòng chống bệnh wilt cần áp dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp như: chọn giống ít nhiễm bệnh để trồng (giống Cayenne rất dễ nhiễm bệnh). Với các giống trong nước thì dứa Kiên Giang ít bệnh hơn dứa Bến Lức. Lưu ý không lấy chồi ở những vườn bị bệnh kết hợp với sử dụng thuốc trừ sâu để xử lí chồi trước khi trồng. Khử đất để trừ kiến và rệp. Làm sạch cỏ và các cây dứa của mùa trước còn sót lại để hạn chế chỗ ẩn nấp của rệp và kiến. 29 PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung Đề tài thực hiện gồm 2 nội dung như sau: Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne sạch virus bằng nuôi cấy ĐST và xử lí nhiệt. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV-1 và PMWaV-2 trên cây dứa in vitro nuôi cấy từ ĐST đã qua xử lí nhiệt bằng kĩ thuật RT-PCR. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 1/3 – 30/8/2005 tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học và Trung tâm phân tích thí nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.3. Nội dung 1: Tạo cây dứa Cayenne in vitro sạch virus bằng cách kết hợp xử lí nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Thí nghiệm tiến hành trên chồi dứa Cayenne in vitro có nguồn gốc khác nhau: Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Cây dứa in vitro cao từ 4 – 5 cm được xử lí nhiệt trong thời gian 30 ngày. Sau đó tiến hành tách ĐST các cây đã xử lí nhiệt để nuôi cấy. Chồi dứa tái sinh từ đỉnh sinh trưởng sau 70 ngày nuôi cấy được kiểm tra virus PMWaV bằng RT-PCR để đảm bảo là cây sạch virus. 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1 Mẫu nuôi cấy Sử dụng chồi dứa Cayenne bị bệnh wilt gồm 3 giống như sau: Giống 1: giống Trung Quốc do Nông trường Thọ Vực, Đồng Nai cung cấp. Giống 2: giống Thái Lan do Nông trường Phạm Văn Hai, Tp HCM cung cấp. Giống 3: giống Lâm Đồng do Chi cục BVTV Đơn Dương, Lâm Đồng cung cấp. 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như Autoclave, tủ cấy vô trùng, đèn UV, dụng cụ nuôicấy mô… Bình nuôi cấy 500ml, ống nghiệm 2,5x 10 cm Tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 Kính hiển vi soi nổi Olympus SZ40 30 3.3.1.3. Hóa chất Môi trường nuôi cấy cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) Chất điều hòa tăng trưởng N6-benzyladenine [BA] (2mg/l) 3.3.1.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Dùng môi trường khoáng cơ bản MS bổ sung BA (2mg/l) để nhân chồi 3 giống dứa Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng. Sử dụng bình nuôi cấy 500ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường được hấp tiệt trùng bằng Autoclave ở điều kiện 1210C, 1,2 atm trong 25 phút trước khi sử dụng. Sau 1 tháng, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng. Các bình nuôi cấy được bảo quản trong phòng tăng trưởng ở điều kiện như sau: Nhiệt độ: 24 + 20C Thời gian chiếu sáng: 16 giờ ( từ 6 giờ – 21 giờ) Cường độ ánh sáng: 1000 – 2000 lux Ẩm độ: 55% – 60% Xử lí nhiệt Cây dứa in vitro cao khoảng 4 – 5 cm được cấy chuyền sang môi trường MS trước xử lí nhiệt 2 tuần. Các bình nuôi cấy được đặt trong tủ xử lí nhiệt Environmental Test Chamber MLR-350 (ETC) của TT PTTN ĐH Nông Lâm. Nút đậy cao su của bình được thay bằng nylon chịu nhiệt để tạo điều kiện trao đổi nhiệt tốt. Điều kiện xử lí Nhiệt độ: 370C + 0,1 .Ẩm độ: 55% Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày Cường độ chiếu sáng: 2000 lux Thời gian xử lí: 30 ngày Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Mẫu nuôi cấy là ĐST chồi dứa Cayenne in vitro đã qua xử lí nhiệt và đối chứng là ĐST không xử lí nhiệt. Các thao tác nuôi cấy mô được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Môi trường và dụng cụ nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 1210C, 1,2 atm trong 25 phút. Quan sát bằng kính hiển vi soi nổi Olympus, dùng dao lam tách ĐST kích thước 31 0,3 – 1 mm và đặt nhẹ lên bề mặt môi trường. Mỗi ĐST được cấy vào một ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MS . Các ống nghiệm chứa ĐST được bảo quản ở điều phòng tăng trưởng và ghi nhận các chỉ tiêu theo dõi sau 30, 50 và 70 ngày. 3.3.1.5. Phƣơng pháp nghiên cứu Thí nghiệm 1: Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 yếu tố, 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST. Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của ĐST chồi dứa Cayenne Nghiệm thức Giống Xử lí nhiệt Kích thƣớc mẫu 1 TQ - * 2 TL - * 3 LĐ - * 4 TQ + * 5 TL + * 6 LĐ + * 7 TQ - ** 8 TL - ** 9 LĐ - ** 10 TQ + ** 11 TL + ** 12 LĐ + ** Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt; (*): mẫu ĐST có kích thước từ 0,3 - 0,5 mm; (**): mẫu ĐST có kích thước từ 0,5 – 1mm. 32 Các chỉ tiêu theo dõi Thời gian tái sinh: được tính từ khi cấy ĐST đến khi lá đầu tiên của chồi tái sinh xuất hiện. Tỉ lệ sống: tỉ lệ giữa số ĐST tái sinh và số ĐST cấy ban đầu. Tỉ lệ này được ghi nhận 30 ngày sau khi cấy ĐST. Hệ số nhân chồi 70 ngày sau khi cấy. Hệ số nhân chồi = tổng số chồi đếm được/ tổng số mẫu cấy ban đầu. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), hai yếu tố, 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chồi tái sinh từ ĐST. Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trưởng của chồi tái sinh từ ĐST Nghiệm thức Giống Xử lí nhiệt 1 TQ - 2 TL - 3 LĐ - 4 TQ + 5 TL + 6 LĐ + Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt (+): xử lí nhiệt Các chỉ tiêu theo dõi Chiều cao chồi (cm): tính từ mặt thạch đến đầu lá dài nhất khi được vuốt thẳng. Số lá: tổng số lá của chồi Số rễ: tổng số rễ của chồi. 33 Chiều dài rễ (cm): tính theo chiều dài của rễ dài nhất. Các số liệu được ghi nhận sau 30, 50 và 70 ngày nuôi cấy. Xử lí số liệu Sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0 để xử lí số liệu. 3.4. Nội dung 2: Kiểm tra PMWaV trên chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trƣởng Cây dứa tái sinh từ ĐST ở Nội dung 1 được kiểm tra virus PMWaV-1 và PMWaV-2 bằng kĩ thuật RT-PCR. 3.4.1. Vật liệu Mẫu kiểm tra Mẫu lá của chồi dứa in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng. Thiết bị và dụng cụ Máy điện di Máy PCR Máy ly tâm Tủ lạnh -200C, tủ mát 40C Pipet, cối nghiền mẫu... Hóa chất Kit tách chiết RNA: Arum Total RNA Mini Kit (Bio- rad). Primer chuyên biệt để nhận biết PMWaV-1 và PMWaV-2. Primer đặc trưng cho PMWaV-1 có trình tự như sau: 5’-ACAGGAAGGACAACACTCAC-3’ 5’-CGCACAAACTTCAAGCAATC-3’ Primer đặc trưng cho PMWaV-2 có trình tự như sau: 5’-CATACGAACTAGACTCATACG-3’ 5’-CCATCCACCAATTTTACTAC-3’ Access RT-PCR kit (Promega) Tris-Acetic acid-EDTA (TAE) 0,5X 3.4.2. Phƣơng pháp tiến hành Ly trích RNA tổng số 34 Sử dụng qui trình ly trích RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) để thu RNA tổng số. Dịch ly trích RNA được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR. RNA của PMWaV (nếu có) sẽ được khuếch đại nhờ các primer đặc hiệu với đoạn gen HSP 70 của virus. Sản phẩm khuếch đại RT-PCR được thể hiện trên gel điện di. Nhuộm ethidium bromide và chụp hình gel bằng tia UV để đọc kết quả. Thực hiện RT-PCR Bƣớc 1: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Các hoá chất cần chuẩn bị như sau: Nuclease –free light mineral oil (Sigma Cat # M5904) Hỗn hợp phản ứng (reaction mix) Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT - PCR Thành phần mix RT - PCR Thể tích sử dụng Nuclease – Free water X l MMV/Tfl 5X ( ủ ở 650C 15 phút trước khi pha) 10 l dNTP (*) 1 l Primer xuôi và ngược (**) 50 pmol/loại 25 nM MgSO4 (*) 2 l AMV RT ( 5 u / l ) 2 l Tfl DNA polymerase ( 5 u / l ) 1 l Dịch ly trích RNA 2 l Thể tích cuối V = 50 l Ghi chú: (*) Vortex trước khi sử dụng (**) Primer đặc trưng cho HSP 70 của PMWaV-1,2 do IDT (Intergrated of DNA technologies, USA) cung cấp Pha mix trong tube 0,5 ml và trộn đều bằng pipet. Sau khi thêm AMV RT và Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp trong 10 giây. Phủ lên mỗi tube 1- 2 giọt Nuclease – free mineral oil. Đặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ ở 450C trong 45 phút. Bƣớc 2 Thực hiện phản ứng RT- PCR 35 Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước gồm quá trình tổng hợp cDNA và khuếch đại RNA. Chu kì nhiệt cho phản ứng Giai đoạn 1 (thực hiện phiên mã ngược) Tổng hợp sợi cDNA : 450C/ 45 phút (1 chu kì); 940C/2 phút (1 chu kì) Giai đoạn 2 (phản ứng PCR) cDNA được khuếch đại theo chương trình nhiệt sau: 920C/30 giây, 580C/1 phút, 680C/90 giây (10 chu kì); 920C/30 giây, 540C/1 phút, 680C/90 giây (35chu kì). 680C/8 phút (1 chu kì). Điện di sản phẩm Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5 l/ giếng (3,5 l mẫ + 1,5 l loading dye) Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% và chạy điện di trong 60 phút ở 50V cho đến khi vạch màu loading dye chạy đến 2/3 chiều dài gel. Buffer điện di là TAE 0,5X. Nhuộm Ethidium bromide 15 phút và chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết quả. Mẫu kiểm tra Gồm 12 mẫu lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau: Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ thuật RT-PCR Giống Xử lí nhiệt Số mẫu kiểm tra TQ - 1 TL - 1 LĐ - 1 TQ + 3 TL + 3 LĐ + 3 Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt. 36 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS 4.1.1 Thời gian tái sinh Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (TGTS) của ĐST chồi dứa Cayenne như sau: Bảng 4.1 Ảnh hưởng các yếu tố giống, xử lý nhiệt và kích thuớc mẫu đến TGTS của ĐST chồi dứa Cayenne Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức TGTS trung bình (ngày) Giống TQ 1, 4, 7, 10 12,56 a TL 2, 5, 8, 11 12,78 a LĐ 3, 6, 9, 12 12,56a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3, 7, 8, 9 12,50 a + 4, 5, 6, 10, 11, 12 12,76 a Kích thƣớc mẫu (mm) 0,3 – 0,5 1, 2, 3, 4, 5, 6 13,44b 0,5 – 1 7, 8, 9, 10, 11, 12 11,81a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả Bảng 4.1 cho thấy sự khác biệt về thời gian tái sinh xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê do ảnh hưởng của kích thước mẫu (P 0,05). Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm có thời gian tái sinh trung bình là 13 ngày trong khi với kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm thời gian tái sinh trung bình là 11 ngày. Nhìn chung thời gian tái sinh là 12,62 ngày (xem Phụ lục). 37 Trong các tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng, chỉ có tương tác giữa yếu tố giống – xử lí nhiệt và giống – kích thước mẫu ảnh hưởng đến thời gian tái sinh (P 0,05); các tương tác còn lại đều không có ý nghĩa (P 0,05). Tương tác giữa giống – xử lí nhiệt kéo dài thời gian tái sinh và mức độ ảnh hưởng khác nhau tùy theo giống. Tương tác giữa giống – kích thước mẫu làm thay đổi thời gian tái sinh trung bình. Tuy nhiên mẫu có kích thước từ 0,5 – 1 mm vẫn tái sinh sớm hơn so với mẫu có kích thước từ 0,3 – 0,5 mm. Hình 4.1 Chồi dứa trước khi tách ĐST và ĐST được tách quan sát dưới kính hiển vi soi nổi SZ40 4.1.2 Tỷ lệ tái sinh Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne như sau: Bảng 4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu đến tỉ lệ tái sinh (TLTS) của ĐST chồi dứa Cayenne Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức TLTS trung bình (%) Giống TQ 1, 4, 7, 10 55,56 a TL 2, 5, 8, 11 58,33 a LĐ 3, 6, 9, 12 69,44 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3, 7, 8, 9 59,26 a + 4, 5, 6, 10, 11, 12 62,96 a Kích thƣớc mẫu (mm) 0,3 – 0,5 1, 2, 3, 4, 5, 6 42,59 a 0,5 – 1 7, 8, 9, 10, 11, 12 79,63 b 38 Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả phân tích thống kê cho thấy tỉ lệ tái sinh trung bình của ĐST chồi dứa Cayenne in vitro là 61,11% (Phụ lục 4). Qua Bảng 4.2 có thể thấy tỉ lệ tái sinh ở các nghiệm thức xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt không có sự khác biệt về mặt thống kê (P 0,05). Sự khác biệt có ý nghĩa của tỉ lệ tái sinh do kích thước mẫu tác động. Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,5 – 1 mm có tỉ lệ tái sinh là 79,63% trong khi với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5 mm tỉ lệ tái sinh thấp chỉ đạt 42,59%. Theo kết quả phân tích thống kê (Phụ lục 4) sự tương tác giữa các yếu tố xem xét (giống, xử lí nhiệt và kích thước mẫu) không ảnh hưởng đến tỉ lệ tái sinh của ĐST. 4.1.3 Hệ số nhân chồi Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST chồi dứa Cayenne như sau: Bảng 4.3 Ảnh hưởng của các yếu tố giống, xử lí nhiệt đến hệ số nhân chồi (HSNC) của ĐST chồi dứa Cayenne Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức HSNC trung bình Giống TQ 1, 4, 7, 10 1,19 a TL 2, 5, 8, 11 1,05 a LĐ 3, 6, 9, 12 1,08 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3, 7, 8, 9 1,06 a + 4, 5, 6, 10, 11, 12 1,17 a Kích thƣớc mẫu (mm) 0,3 – 0,5 1, 2, 3, 4, 5, 6 1,02 a 0,5 – 1 7, 8, 9, 10, 11, 12 1,20 b Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). 39 Nhìn chung hệ số nhân chồi của chồi dứa tái sinh từ ĐST rất thấp. Theo kết quả thống kê, hệ số nhân chồi trung bình của các nghiệm thức là 1,11 (Phụ lục 4). Xét theo yếu tố giống và xử lí nhiệt, sự khác biệt hệ số nhân chồi ở các nghiệm thức là do sai số ngẫu nhiên, không có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05). Sự khác biệt hệ số nhân chồi có ý nghĩa chủ yếu do kích thước mẫu chi phối (P 0,05). Các nghiệm thức với kích thước mẫu từ 0,5 – 1mm có hệ số nhân chồi là 1,20 trong khi với kích thước mẫu từ 0,3 – 0,5mm hệ số nhân chồi chỉ đạt 1,02. Ngoài ra, sự tương tác giữa 2 yếu tố xử lí nhiệt – kích thước mẫu cũng ảnh hưởng đến hệ số nhân chồi của các nghiệm thức (P 0,05). Các nghiệm thức có xử lí nhiệt và kích thước mẫu từ 0,5 – 1mm có hệ số nhân chồi cao hơn các nghiệm thức còn lại. 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của giống và quá trình xử lí nhiệt lên sự sinh trƣởng của cây tái sinh từ ĐST 4.2.1 Chiều cao chồi Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiếu cao chồi của ĐST chồi dứa Cayenne như sau: Bảng 4.4 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến chiều cao chồi dứa tái sinh từ ĐST Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức Chiều cao trung bình (cm) 30 ngày 50 ngày 70 ngày Giống TQ 1, 4 0,66 b 1,05 b 1,90 b TL 2, 5 0,58 ab 0,80 ab 1,16 a LĐ 3, 6 0,46a 0,65a 0,87a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3 0,57 a 0,92 a 1,45 a + 4, 5, 6 0,55 a 0,75 a 1,17 a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy chiều cao trung bình của chồi dứa tái sinh sau 30 ngày, 50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 0,56 cm, 0,83 cm và 1,31 cm (Phụ lục 4). Sự khác biệt có ý nghĩa về chiều cao (P 0,05) ở các nghiệm thức chủ yếu do 40 giống chi phối. Bảng 4.4 cho thấy chồi dứa Cayenne Trung Quốc và Thái Lan tăng trưởng chiều cao nhanh hơn so với Cayenne Lâm Đồng. Sự khác biệt về chiều cao xét theo yếu tố xử lí nhiệt là do sai số ngẫu nhiên (P > 0,05). Sự tương tác giữa yếu tố giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến chiều cao của các nghiệm thức 30 ngày và 50 ngày sau khi cấy nhưng ảnh hưởng của tương tác này thể hiện rõ ở chồi dứa tái sinh 70 ngày sau khi cấy. Ảnh hưởng của tương tác thay đổi tùy theo giống. Theo kết quả xử lí số liệu (Phụ lục 4), đối với giống Cayenne Trung Quốc, chồi được xử lí nhiệt cao hơn so với chồi không xử lí nhiệt. Đối với giống Cayenne Thái Lan, chồi dứa được xử lí nhiệt thấp hơn so với chồi không xử lí nhiệt; trong khi ở giống Cayenne Lâm Đồng việc xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến chiều cao của chồi dứa tái sinh. Hình 4.2 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 30 ngày nuôi cấy cuả NT1 - NT6 Hình 4.3 Chồi dứa tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy cuả NT1 – NT6 4.2.2 Số lá 41 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến số lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau: Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức Số lá trung bình 30 ngày 50 ngày 70 ngày Giống TQ 1, 4 3,39 a 5,17 a 7,17 b TL 2, 5 3,22 a 4,83 a 6,11 ab LĐ 3, 6 3,50 a 4,44 a 5,56 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3 2,70 a 4,52 a 6,22 a + 4, 5, 6 4,04 b 5,11 a 6,33 a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy số lá trung bình của chồi dứa tái sinh sau 30 ngày, 50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 3,37; 4,81 và 6,28 lá (Phụ lục 4). Xét theo yếu tố giống, sự khác biệt về số lá của các nghiệm thức ở 30 ngày và 50 ngày sau khi cấy là do sai số ngẫu nhiên; ở thời gian 70 ngày sau khi cấy giá trị trung bình của các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê (P 0,05). Sau 70 ngày có thể thấy chồi dứa tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan có số lá nhiều hơn so với Cayenne Lâm Đồng. Yếu tố xử lí nhiệt chỉ ảnh hưởng đến chồi tái sinh 30 ngày; chồi tái sinh 30 ngày được xử lí nhiệt có số lá nhiều hơn so với chồi không xử lí nhiệt. Sự tương tác giữa giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến số lá trung bình của các nghiệm thức. 4.4.3 Số rễ 42 Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến số lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau: Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức Số rễ trung bình 30 ngày 50 ngày 70 ngày Giống TQ 1, 4 0 1,83 b 3,17 a TL 2, 5 0 0,94 a 2,67 a LĐ 3, 6 0 1,00 ab 2,67 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3 0 1,11 a 3,19 a + 4, 5, 6 0 1,40 a 2,48 a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy số rễ trung bình của chồi dứa tái sinh sau 50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 1,26 và 2,83 rễ (Phụ lục 4). Xét theo yếu tố giống, sự khác biệt về số rễ chỉ có ý nghĩa về mặt thống kê ở chồi dứa tái sinh 50 ngày; chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc có số rễ cao nhất 1,83 rễ khác biệt rất ý nghĩa so với giống Cayenne Thái Lan có số rễ trung bình chỉ đạt 0,94. Xét theo yếu tố xử lí nhiệt, sự khác biệt giữa giá trị trung bình của các nghiệm thức là do sai số ngẫu nhiên. Sự tương tác giữa yếu tố giống và xử lí nhiệt không ảnh hưởng đến số rễ trung bình của các nghiệm thức. 4.2.4 Chiều dài rễ Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chiều dài rễ của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau: 43 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các yếu tố giống và xử lí nhiệt đến số rễ của chồi dứa tái sinh từ ĐST Yếu tố ảnh hƣởng Nghiệm thức Chiều dài rễ trung bình (cm) 30 ngày 50 ngày 70 ngày Giống TQ 1, 4 0 0,46 b 0,77 b TL 2, 5 0 0,24 a 0,82 b LĐ 3, 6 0 0,17 a 0,39 a Xử lí nhiệt - 1, 2, 3 0 0,29 a 0,79 b + 4, 5, 6 0 0,29 a 0,54 a Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Trong cùng một cột và cùng yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05). Kết quả xử lí số liệu cho thấy chiều dài rễ trung bình của chồi dứa tái sinh sau 50 ngày và 70 ngày nuôi cấy lần lượt là 0,29 cm và 0,66 cm (Phụ lục 4). Xét theo yếu tố giống, chiều dài rễ trung bình của các nghiệm thức 50 ngày và 70 ngày sau khi cấy đều có sự khác biệt về mặt thống kê. Trong thời gian 50 ngày sau khi cấy, chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc có chiều dài rễ trung bình cao nhất đạt 0,46 cm khác biệt rất ý nghĩa so với chồi tái sinh của hai giống còn lại. Trong khi đó ở chồi tái sinh 70 ngày thì giống Cayenne Thái Lan có chiều dài rễ trung bình cao nhất đạt 0,82 cm, kế đến là giống Cayenne Thái Lan; chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Lâm Đồng có chiều dài rễ trung bình thấp nhất và khác biệt rất có ý nghĩa so với chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Thái Lan. Xét theo yếu tố xử lí nhiệt, sự khác biệt ý nghĩa về chiều dài rễ trung bình giữa các nghiệm thức chỉ có ở chồi tái sinh 70 ngày; 44 các nghiệm thức với chồi không xử lí nhiệt có chiều dài rễ trung bình cao hơn và khác biệt có ý nghĩa so với chồi đã xử lí nhiệt. Kết quả xử lí số liệu cho thấy ảnh hưởng của sự tương tác giữa yếu tố giống và xử lí nhiệt thể hiện rõ ở chồi dứa tái sinh 70 ngày. Đối với chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc, việc xử lí nhiệt làm tăng chiều dài rễ trung bình nhưng làm giảm chiều dài rễ trung bình của chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Thái Lan; trong khi chồi tái sinh thuộc giống Cayenne Lâm Đồng không bị ảnh hưởng bởi việc xử lí nhiệt. 4.3. Kết quả kiểm tra PMWaV chồi tái sinh từ ĐST 4.3.1 Kết quả kiểm tra PMWaV-1 Sau khi kiểm tra PMWaV -1 bằng kĩ thuật RT- PCR ta có kết quả như sau: 1500bp 589 bp Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1. . Giếng 1: thang chuẩn với các kích thước từ 100 – 1500 bp Giếng 2,3,4: mẫu Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng Giếng 5: đối chứng âm không chứa RNA khuôn mẫu Giếng 6: đối chứng dương Kết quả điện di của mẫu chồi dứa tái sinh từ ĐST không xử lí nhiệt (Hình 4.4) cho thấy cả 3 mẫu kiểm tra đều có PMWaV-1. Ở giếng 2, 3 và 4 đều xuất hiện band kích thước 589 bp đặc trưng của PMWaV-1. Những vạch trắng mờ ở cuối gel có thể là những RNA bị đứt gãy hay RNA tạp được khuếch đại một cách ngẫu nhiên bởi primer. Vệt trắng mờ ở giếng đối chứng âm có thể do gắn kết dimer của primer. Hiện tượng này có thể khắc phục được bằng cách tăng nhiệt độ bắt cặp làm tăng tính đặc hiệu của primer. Hình 4.3 cho thấy các mẫu chồi dứa tái sinh từ ĐST không qua xử lí nhiệt vẫn còn PMWaV-1. 1 2 3 4 5 6 45 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST đã qua xử lí nhiệt sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-1 Giếng 1: thang chuẩn với các kích thước từ 100 – 1500 bp Giếng 2, 3, 4: mẫu Cayenne Trung Quốc Giếng 5: đối chứng dương Giếng 6, 7, 8: mẫu Cayenne Thái Lan Giếng 9, 10, 11: mẫu Cayenne Lâm Đồng Giếng 12: đối chứng âm không có RNA khuôn mẫu Hình 4.5 cho thấy trong 9 mẫu chồi tái sinh từ ĐST đã xử lí nhiệt chỉ có 3 mẫu có kết quả PMWaV-1 dương tính. Ở giếng 2, 4, và 9 xuất hiện band kích thước 589 bp giống như giếng đối chứng dương. Như vậy các mẫu còn nhiễm PMWaV-1 bao gồm 2 mẫu Cayenne Trung Quốc và 1 mẫu Cayenne Lâm Đồng; cả 3 mẫu Cayenne Thái Lan đều không nhiễm PMWaV-1. 4.3.2 Kết quả kiểm tra PMWaV-2 Sau khi kiểm tra PMWaV -2 bằng kĩ thuật RT- PCR kết quả đạt được như sau: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1500bp 589bp 46 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sử dụng primer đặc trưng cho PMWaV-2 Giếng 1, 2, 3: mẫu Cayenne Trung Quốc, Thái Lan và Lâm Đồng không qua xử lí nhiệt. Giếng 4: thang chuẩn từ 100 – 1500 bp Giếng 5, 6, 7: mẫu Cayenne Trung Quốc đã qua xử lí nhiệt Giếng 8, 9, 10: mẫu Cayenne Thái Lan đã qua xử lí nhiệt Giếng 11,12, 13: mẫu Cayenne Lâm Đồng đã qua xử lí nhiệt Giếng 14: đối chứng PMWaV-2 dương tính Giếng 15: đối chứng PMWaV-2 âm tính (không chứa RNA khuôn mẫu) Hình 4.6 cho thấy tất cả các mẫu kiểm tra đều âm tính với PMWaV-2. Kết quả này có độ chính xác cao do mẫu đối chứng dương và đối chứng âm đều thể hiện tốt. Như vậy 100% mẫu kiểm tra đều có kết quả PMWaV-2 âm tính. Kết quả kiểm tra PMWaV của các mẫu chồi tái sinh từ ĐST được tóm tắt qua bảng sau: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 609 bp 1500bp 47 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra PMWaV ở chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST sau 70 ngày nuôi cấy Giống Xử lí nhiệt Tỉ lệ chồi dứa nhiễm PMWaV (%) PMWaV-1 PMWaV-2 TQ - 100 0 TL - 100 0 LĐ - 100 0 TQ + 66,67 0 TL + 100 0 LĐ + 33,33 0 Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt Bảng 4.8 cho thấy số chồi dứa tái sinh nhiễm PMWaV-1 khá cao trong khi 100% mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính với PMWaV- 2. Các ĐST tái sinh thuộc giống Cayenne Trung Quốc và Lâm Đồng không xử lí nhiệt vẫn còn nhiễm PMWaV-1. Nguyên nhân chồi tái sinh còn nhiễm virus có thể do mật độ virus trong chồi dứa in vitro ban đầu cao, phần mô phân sinh đỉnh sạch virus rất nhỏ và xác suất có được chồi dứa tái sinh sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy ĐST rất thấp. Phương pháp xử lí nhiệt kết hợp nuôi cấy ĐST bước đầu cho thấy hiệu quả loại bỏ virus. Với phương pháp này 100% chồi dứa tái sinh thuộc giống Cayenne Thái Lan sạch PMWaV-1, ở giống Cayenne Trung Quốc tỉ lệ này rất thấp chỉ đạt 33,33% (66,67% nhiễm PMWaV-1) và giống Cayenne Lâm Đồng đạt 66,67%. Sự khác biệt này có thể do mức độ nhiễm PMWaV-1 của chồi dứa in vitro ban đầu và sự khác nhau về hiệu quả xử lí nhiệt ở từng giống. Ngoài ra, kích thước mẫu cấy cũng ảnh hưởng đến hiệu quả loại bỏ virus. Kích thước mẫu càng lớn thì khả năng nhận được cây sạch virus càng thấp. Tuy nhiên, từ kết quả trên chưa đánh giá được hiệu quả của các phương pháp tạo cây sạch virus áp dụng trong đề tài trong việc loại bỏ PMWaV-2 do 100% mẫu kiểm tra cho kết quả âm tính với PMWaV-2. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu được có