Khóa luận Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ Nguyễn Văn Sáu NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VIRUT CÚM KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC HỆ CHÍNH QUY Ngành: khoa học máy tính HÀ NỘI – 2009 1Mục lục Mục lục ..................................................................................................................... 1 Lời nói đầu................................................................................................................ 3 Chương I. Giới thiệu về sinh học phân tử và tin-sinh học ....................................... 4 1. Giới thiệu về sinh học phân tử.............................................................................. 4 2. Giới thiệu về tin-sinh học ..................................................................................... 5 2.1. Sắp hàng đa chuỗi ......................................................................................... 5 2.2. Cây tiến hóa ................................................................................................... 7 Chương II. Virut cúm ............................................................................................... 8 1.Sơ lược về virut cúm ............................................................................................. 8 2. Các loại virut cúm ................................................................................................ 8 3. Cấu trúc và tính chất............................................................................................ 9 4. Một số thống kê và sự lây lan của virut cúm...................................................... 10 4.1. Một số thống kê về dịch cúm...................................................................... 10 4.2. Sự lây lan của virut cúm ............................................................................. 12 Chương III. Ngân hàng gene virut cúm.................................................................. 13 1. Giới thiệu tổng quan ........................................................................................... 13 2. Các chức năng đã xây dựng................................................................................ 13 2.1. Quá trình xây dựng ngân hàng gene ............................................................ 14 2.1.1. Quá trình thu thập dữ liệu chi tiết cho Việt Nam .................................. 15 Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 2 2.1.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu.......................................................................... 16 2.2. Tìm kiếm các chuỗi...................................................................................... 21 2.3. Tiện ích tải chuỗi.......................................................................................... 23 2.4. Tiện ích sắp hàng đa chuỗi........................................................................... 23 2.5. Tiện ích xây dựng cây tiến hóa .................................................................... 24 2.6. Bản đồ phân bố của virut cúm ..................................................................... 25 2.6. Biểu đồ thống kê về virut cúm..................................................................... 28 Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 31 Các hình ảnh tham khảo ......................................................................................... 33 Các bảng tham khảo ............................................................................................... 35 Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 3 Lời nói đầu Tin-sinh học (Bioinformatics) là một lĩnh vực nghiên cứu đang phát triển rất mạnh mẽ. Tin-sinh học áp dụng những phương pháp trong tin học để giải quyết các bài toán trong sinh học phân tử. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, một khối lượng lớn dữ liệu sinh học phân tử (gene, protein, genome) đã được thu thập, lưu trữ và chia sẻ tại các ngân hàng dữ liệu thế giới như NCBI (National Center for Biotechnology Information). Tin sinh học hiện đang được ứng dụng phổ biến trong sinh học phân tử, y-dược học, nông nghiệp, công nghệ thực phẩm, môi trường và kiểm soát bệnh. Hiện nay, tin-sinh học đang được ứng dụng rộng trong việc phát hiện và kiểm soát bệnh. Một trong các ứng dụng cụ thể là kiểm soát bệnh cúm, với các dịch bệnh đang lây lan như cúm gia cầm H5N1, cúm H1N1. Để góp phần vào việc cung cấp thông tin, cũng như các công cụ phân tích cho việc kiểm soát bệnh cúm ở Việt Nam, đề tài tập trung vào những mục tiêu chính sau: (1) cung cấp dữ liệu về cúm trên thế giới và Việt Nam, (2) cung cấp các công cụ phân tích cơ bản như tìm kiếm, sắp hàng đa chuỗi, xây dựng cây tiến hóa, (3) cung cấp dữ liệu về virut cúm chi tiết tới từng tỉnh thành của Việt Nam, (4) cung cấp bản đồ phân tán của virut cúm trên thế giới và cho các tỉnh thành ở Việt Nam, (5) cung cấp biểu đồ thống kê virut cúm cho các vùng của Việt Nam, và trên thế giới”. Đề tài hy vọng sẽ góp phần vào việc nghiên cứu và kiểm soát các dịch bệnh liên quan đến virut cúm ở Việt Nam. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 4 Chương I. Giới thiệu về sinh học phân tử và tin-sinh học 1. Giới thiệu về sinh học phân tử Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ các tế bào. Tế bào có cấu tạo gồm vỏ và nhân, trong đó nhân tế bào chứa ADN (hoặc ARN). Hình 1 mô tả cấu tạo của tế bào. ADN (acid deoxyribo nucleic) mang thông tin di truyền, được cấu tạo từ 4 thành phần cơ bản (gọi là các nucleotide – Brown, 2000) Adenine (A), Cytosine (C), Guanine (G), Thymine (T) như hình 2. Trong các chuỗi ADN, một số đoạn được gọi là gene mang thông tin di truyền của các loài sinh vật. Các nucleotide trong gene sẽ kết hợp với nhau để tổng hợp ra protein. Cụ thể là, một bộ ba nucleotide liên tiếp sẽ tạo ra 1 axit amin. Có 20 loại axit amin khác nhau (Brown, 2002) là Phe (Phenylalanine), Leu (Leucine), Ser (Serine), Tyr (Tyrosine), Cys (Cysteine), Trp (Tryptophan), Pro (Pro- line), His (Histidine), Gln (Glutamine), Arg (Arginine), Ile (Isoleucine), Thr (Threonine), Asn (Asparagine), Lys (Lysine), Val (Valine), Ala (Alanine), Asp (Aspartic Acid), Glu (Glutamic Acid), Gly (Glycine). Hình 3 mô tả sự kết hợp của các ADN để tạo ra các axit amin. Từ các axit amin này tạo nên các protein bằng cách liên kết với nhau. Sự sắp xếp khác nhau và số lượng khác nhau của các axit amin tạo thành vô số các protein khác nhau. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 5 ARN (Ribonucleic acid) cũng tương tự như ADN nhưng trong thành phần cơ bản của nó thì T được thay bằng U (Uracil). 2. Giới thiệu về tin-sinh học Trong phần này chúng tôi sẽ trình bày một số bài toán cơ bản trong tin-sinh học như 1. Sắp hàng đa chuỗi, 2. Cây tiến hóa. 2.1. Sắp hàng đa chuỗi Trong quá trình tiến hóa của các loài sinh vật, các chuỗi ADN bị biến đổi do 3 phép biến đổi chính là (Brown, 2002). 1. Thay thế là một hoặc vài nucleotide bị thay thế bởi một hoặc vài nucleo- tide khác trong chuỗi. 2. Chèn là một hoặc vài nucleotide được chèn thêm vào chuỗi cũ. 3. Xóa là một hoặc một vài nucleotide bị xóa đi ở chuỗi cũ. Do 3 phép biến đổi chính ở trên làm cho các ADN sinh vật bị thay đổi. Vì thế, để biết được mối quan hệ giữa các loài sinh vật (ADN) chúng ta phải dùng sắp hàng đa chuỗi để tìm ra mối quan hệ này. Gióng hàng các chuỗi ADN, ARN hay protein là cách gióng sao cho chúng giống nhau nhất. Các chuỗi này sau khi gióng hàng sẽ có cùng chiều dài. Trường hợp đơn giản nhất của gióng hàng là sắp hàng 2 chuỗi. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 6 Sắp hàng 2 chuỗi là trường hợp riêng của sắp hàng đa chuỗi. Ví dụ chúng ta có hai chuỗi ADN của Human và Chimpanzee như bảng 1 dưới đây. Sau khi gióng hàng hai chuỗi thì hai chuỗi sẽ có chiều dài bằng nhau như bảng 2 bên dưới (Waterman, 2000). Gióng hàng đa chuỗi là thực hiện tìm sự giống nhau của nhiều chuỗi thay cho một cặp như gióng hàng 2 chuỗi. Ví dụ, ta có gióng hàng đa chuỗi của 8 chuỗi sau ở bảng 3 (Waterman, 2000; Higgins, 2003). Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 7 Hiện tại có một số phần mềm sắp hàng đa chuỗi được sử dụng rộng rãi là MUSCLE (Edgar, R.C., 2004), CLUSTALAW (Thompson et al., 1994) hoặc T- COFFEE (Notredame et al., 2000). Sắp hàng đa chuỗi tạo ra tệp kết quả là đầu vào để cho ta tìm ra cây tiến hóa giữa các loài. Cây tiến hóa chính là biểu diễn trực quan của mối quan hệ giữa các loài. 2.2. Cây tiến hóa Cây tiến hóa là biểu diễn mối quan hệ tiến hóa giữa các loài sinh vật một cách trực quan dưới dạng cây. Dựa vào cây tiến hóa người ta có thể xác định được loài nào có quan hệ nguồn gốc với loài nào. Trong nghiên cứu về virut cúm, thông qua cây tiến hóa người ta xác định được loài virut nào có quan hệ tiến hóa từ loài virut nào, tức là xác định được sự lây lan virut từ nơi này qua nơi khác thông qua quan hệ nguồn gốc giữa chúng. Từ đó, người ta đề ra các biện pháp phòng, chống lây lan dịch tốt hơn. Trong hình 4 là ví dụ mô tả về cây tiến hóa của các loài virut cúm ở Việt Nam từ năm 2001 đến 2007 (Wan X-F, Nguyen T, Davis -CT, Smith CB, Zhao Z-M, et al, 2008), ta thấy virut HK79-like, GX22-like, F1-like có chung một gốc và nằm ở 2 nhánh nên chúng có quan hệ nguồn gốc với nhau. Hiện tại có phần mềm thông dụng sinh ra cây tiến hóa như CLUSTALAW (Thompson et al., 1994), PHYLIP (Joe Felsenstein, mid-1995) và phần mềm xem cây tiến hóa như TreeView (Ro- deric D. M. Page, 2000). Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 8 Chương II. Virut cúm 1.Sơ lược về virut cúm Virut cúm được biết đến từ một trận dịch cúm xuất phát từ chim ở Tây Ban Nha vào năm 1918 đã giết chết khoảng 40-50 triệu người (khoảng một nửa dân số thế giới vào thời điểm đó - Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO). Cho đến ngày hôm nay, các nhà khoa học mới giải mã được cách mà loại virut cúm này từng làm kinh hoàng thế giới bằng cách lây từ vật sang người và gây bệnh, vượt qua ranh giới về loài. Virut cúm tên khoa học là influenza virus, thường được gọi là cúm (flu), là tác nhân gây bệnh truyền nhiễm từ chim và động vật có vú, nó là virut ARN thuộc họ Orthomyxoviridae (Voyles, 2002). Dưới đây ta sẽ tìm hiểu các loài virut chính thường gặp nhất. 2. Các loại virut cúm Virut cúm là virut ARN của họ Orthomyxoviridae (Voyles, 2002), gồm có 3 loại chính cúm A, cúm B, cúm C (CDC). Cúm A là loại virut cúm phổ biến thường gặp trong các trận dịch (hầu hết các trận dịch xảy ra đều là cúm A như hình 5). Cúm A có 15 tuýp từ H1 đến H15 (CDC). Cho đến nay tất cả các tuýp virut cúm được biết đều đã được tìm thấy ở các loài chim di cư và chim sống gần nước (xem ở hình 5). Chúng có thể xâm nhập mà không gây triệu chứng gì trong đường ruột, dạ dày của vật chủ. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 9 Cúm B là một loại virut cúm thường gây bệnh ở người, thường gây bệnh nhẹ và xảy ra ít hơn so với cúm A. Người ta mới chỉ phát hiện ra một loài vật khác bị nhiễm cúm B là loài hải cẩu. Loại cúm B này có tần số thay đổi 2-3 lần và ít hơn sự thay đổi của cúm A. Cúm C là một loại virut cúm gây bệnh chủ yếu ở người và lợn, có thể gây ốm và lây lan cục bộ. Cúm C gặp ít hơn hai loại cúm A, cúm B rất nhiều và thường gây ốm nhẹ ở trẻ em. Tính chất dễ gây bệnh và lây lan của virut chính là do đặc điểm về cấu trúc genome của virut gây nên. Dưới đây chúng ta nói rõ hơn về cấu trúc và tính chất này. 3. Cấu trúc và tính chất. Cúm A, B và C có cấu trúc tương tự nhau. Chúng có chiều dài khoảng 80-120 na- nomet và thường có hình cầu, mặc dù có cả hình sợi (NBCI GenBank). Genome là thành phần lõi của virut. Virut cúm có 8 đoạn (với cúm A và B) và 7 đoạn (đối với cúm C) trong bộ genome của chúng (Nippon Rinsho, 1997). Trong GenBank người ta lần lượt ký hiệu các đoạn này theo số từ 1 đến 8 là 1 (PB2), 2 (PB1), 3 (PA), 4 (HA), 5 (NP), 6 (NA), 7 (M1 và M2), 8 (NS1 và NS2) đối với cúm A và B. Đối với cúm C thì 7 đoạn là 1 (PB2), 2 (PB1), 3 (P3), 4 (HE), 5 (NP), 6 (MP), 7 (NS) (Nippon Rinsho, 1997). Genome của cúm A và B mã hóa 11 loại protein là hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), nucleoprotein (NP), M1, M2, NS1, NS2 (NEP), PA, PB1, PB1-F2 và PB2. Còn genome của cúm C Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 10 mã hóa 9 loại protein PB1, PB2, P3, HE, NP, M1, CM2, NS1, NS2 (NCBI, Gen- Bank). Hai protein quan trọng của virut cúm là HA và NA. Virut cúm có 2 protein lớn HA và NA (nhưng đơn giản) hầu như quy định tính độc hại của virut. HA là đoạn liên kết của virut tới tế bào vật thể bị lây sang, trong khi NA là bao gồm thay đổi của virut mới sinh ra từ những tế bào bị nhiễm bằng cách chia tách phân tử này. Vì thế, những protein được sinh ra từ biến đổi này có tính kháng thuốc. Do đó, chúng được gọi là những gen kháng (antigen). Cúm A được phân loại dựa vào kiểu trên kháng thể tương ứng HA và NA, ví dụ: H5N1. Coding region của một gene là một phần của ADN hoặc ARN mà nó làm nhiệm vụ sao chép phiên mã sang ARN khác, giống như ARN thông tin hoặc một ARN không mã hóa (cho trường hợp chuyển ARN hoặc một ribosom ARN). Một đoạn mang phiên mã có thể dùng để giải mã protein. Đối với đoạn này thì nó không chứa những vùng gene như vị trí nhận dạng, chuỗi lặp, hoặc chuỗi kết thúc. Chính do cấu trúc và tính chất genome của virut cúm làm cho chúng dễ gây bệnh. Sau đây là một số thông kê về dịch cúm. 4. Một số thống kê và sự lây lan của virut cúm Dịch cúm H5N1, H1N1,... bùng phát đã làm kinh hoàng loài người kể từ trận đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 và đến nay nó vẫn là một trong những dịch hết sức nguy hiểm đối với loài người. Sau đây, chúng ta điểm qua những trận dịch trong lịch sử. 4.1. Một số thống kê về dịch cúm Các trận đại dịch kinh hoàng trong lịch sử được thống kê trong bảng 4 dưới đây. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 11 Các trận dịch cúm xảy ra gần đây (bảng 5). Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO “Cumulative Number of Confirmed Human Cases of A-vian Influenza A/(H5N) Reported to WHO 3 April 2008 ”. Để hiểu rõ hơn virut cúm truyền bệnh như thế nào, chúng ta sẽ tìm hiểu trong phần “sự lây lan của virut cúm” ở phần dưới đây. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 12 4.2. Sự lây lan của virut cúm Thông thường virut cúm không thể lây nhiễm trực tiếp sang người mà phải thông qua vật chủ trung gian như lợn, gà,… Khi ở trong vật thể trung gian này thì virut từ người và virut cúm của một loài khác sẽ kết hợp với nhau bằng cách trao đổi các thành phần trong tế bào của chúng để tạo nên loại virut cúm mới có khả năng gây bệnh ở người. Có hai quá trình lây lan của virut cúm là drift và shift. Chi tiết về hai quá trình lây lan này có thể tham khảo từ trung tâm ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh CDC “ info/flu-viruses.html”. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 13 Chương III. Ngân hàng gene virut cúm 1. Giới thiệu tổng quan Luận án này nghiên cứu về sự phát triển của virut cúm. Công việc của luận án là xây dựng một ngân hàng gene virut cúm cho tất cả các nước trên thế giới và chi tiết tới từng tỉnh thành/vùng miền của Việt Nam. Phần mềm này lấy dữ liệu tự động từ ngân hàng gene NCBI (một trong 3 ngân hàng gene lớn nhất thế giới NCBI http:// www.ncbi.nih.gov), tích hợp các công cụ phân tích dữ liệu tin sinh học tượng tự như của NCBI và “làm rõ thông tin cho hầu hết các chuỗi cập nhật được về Việt Nam mà chỉ có lượng rất nhỏ thông tin có sẵn khi cập nhật từ NCBI”. Để góp phần vào việc cung cấp thông tin, cũng như các công cụ phân tích cho việc kiểm soát bệnh cúm ở Việt Nam, đề tài tập trung vào những mục tiêu chính sau (1) cung cấp dữ liệu về cúm trên thế giới và Việt Nam, (2) cung cấp các công cụ phân tích cơ bản như tìm kiếm, sắp hàng đa chuỗi, xây dựng cây tiến hóa, (3) cung cấp dữ liệu về virut cúm chi tiết tới từng tỉnh thành của Việt Nam, (4) cung cấp bản đồ phân tán của virut cúm trên thế giới và cho các tỉnh thành ở Việt Nam, (5) cung cấp biểu đồ thống kê virut cúm cho các vùng của Việt Nam, và trên thế giới”. 2. Các chức năng đã xây dựng - Tự động cập nhật. - Tìm kiếm chuỗi. - Thực hiện sắp hàng đa chuỗi, sinh tệp tin biểu diễn toán học cây tiến hóa. - Cho phép tải tệp tin chứa các chuỗi dạng fasta, genbank, sắp hàng đa chuỗi, cây tiến hóa. - Xây dựng bản đồ phân tán của virut cúm. - Xây dựng biểu đồ thống kê virut cúm. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 14 Dưới đây sẽ đi vào trình bày cách xây dựng ngân hàng gen virut cúm như thế nào. 2.1. Quá trình xây dựng ngân hàng gene Mô hình hoạt động của ngân hàng gen xây dựng như hình 7 bên dưới. Việc đầu tiên và hết sức quan trọng cho việc xây dựng ngân hàng gene virut cúm cho Việt Nam là thu thập dữ liệu và thông tin chi tiết các gene của Việt Nam. Dưới đây là quá trình thu thập này. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 15 2.1.1. Quá trình thu thập dữ liệu chi tiết cho Việt Nam Quá trình thu thập dữ liệu chi tiết cho Việt Nam là quá trình đầu tiên và quan trọng nhất trong xây dựng ngân hàng gene virut cúm cho Việt Nam. Trong khi cập nhật dữ liệu trực tiếp từ NCBI thông qua việc lấy các tệp tin ‘genomeset.dat’, ‘influen- za.dat’, ‘influenza_aa.dat’, ‘influenza_na.dat’, ‘influenza.faa’, ‘influenza.fna’, ‘in- fluenza.cds’ chia sẻ từ địa chỉ ftp:// ftp.ncbi.nih.gov/genomes/INFLUENZA/. Các thông tin nhận được ở trên trong các tệp tin sẽ được tách ra để cho vào cơ sở dữ liệu được xây dựng ở bên dưới. Trong các tệp tin này thông tin rõ ràng chuỗi nào ở tỉnh thành/vùng nào của Việt Nam là rất ít. Vì thế, kết hợp với các tài liệu đáng tin cậy từ các thông tin tìm kiếm trên các bài báo của các tác giả nghiên cứu virut cúm ở Việt Nam (các bài báo đăng trên pubmed, thông tin trực tiếp từ tác giả của chuỗi gen đó,...). Sau đây là một số bài báo trên pubmed có thông tin chi tiết về các tỉnh thành của Việt Nam. 1. Evolution of Highly Pathogenic H5N1 Avian Ifluen-za Viruses in Vietnam between 2001 and 2007. 2. Multiple Subline- ages of Influenza A Virus (H5N1), Vietnam, 2005- 2007. Các thông tin tìm được chi tiết về Việt Nam kể trên sẽ được chuẩn hóa và được cập nhật vào tệp tin “listTown.txt” để cập nhật vào cơ sở dữ liệu. “listTown.txt” là tệp tin có dạng ký hiệu tỉnh thành Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 16 /vùng chưa chuẩn hóa => tỉnh thành/vùng của Việt Nam được chuẩn hóa. Ví dụ thông tin từ một bài báo tìm được (bài báo có dữ liệu năm 2005-2007 ở trên). Chuẩn hóa dữ liệu chi tiết về Việt Nam được cho ở bảng 6. Sau khi đã có thông tin chi tiết về Việt Nam chúng ta bắt tay vào xây dựng cơ sở dữ liệu lưu trữ các gene đó. 2.1.2. Xây dựng cơ sở dữ liệu Xây dựng cơ sở dữ liệu là phần tiếp theo sau khi đã có thông tin chi tiết hầu hết các gene về Việt Nam. Trước hết chúng ta xây dựng chương trình tự động cập nhật thông tin từ NCBI về để xây dựng cơ sở dữ liệu. Để có thể cập nhật dữ liệu người dùng phải đăng nhập vào hệ thống để quản lý cập nhật dữ liệu. Từ trang chủ, người dùng chọn tab “Login” để vào trang đăng nhập như hình 9 ở bên. Tên người dùng và mật khẩu của người dùng được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu “users” ở bảng “information” với hai trường là “user” và “pass”. Nếu người dùng có thông tin ở trong bảng “information” này thì sẽ được phép quản lý cập nhật cơ sở dữ liệu sau khi đăng nhập thành công như hình 10. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 17 Tự động cập nhật thông tin các chuỗi từ ngân hàng gene NCBI theo phương thức ftp từ địa chỉ sau ftp://ftp.ncbi- .nih.gov/genomes/INFLU ENZA/ từ các tệp tin ‘ge- nomeset.dat’, ‘influez- a.dat’, ‘influenza_aa.dat’, ‘influenza_na.dat’, ‘influ- enza.faa’, ‘influenza.f-na’, ‘influenza.cds’ (những tệp tin tổng hợp dữ liệu từ trước tới thời điểm hiện tại của NCBI) và ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/INFLUENZA/updates/yyyy-mm-dd/files (những thư mục chứa dữ liệu gần đây được cập nhật) những tệp tin này được tự động tải về. Sử dụng module Net::FTP trong perl để thực hiện việc này. Sau đây là các tệp tin được tải tự động về từ NCBI. Tệp genomeset.dat chứa thông tin về accession, host, segment, subtype, country, year, length, name, age, gender (như bảng 7). my $ftp = new NET::FTP(“ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/INFLUENZA”); $ftp->login(“annynomous”, “annynomous”); $ftp->cwd(“ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/INFLUENZA/updates/”); $ftp->get(“filename”); Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 18 Tệp influenza.cds chứa thông tin về gb(genbank), accession, length, name, seg- ment, sequence (như bảng 8). Tệp influenza.dat chứa thông tin về accession nucleotide (ANuc), accession pro- tein (APro) (như bảng 9 bên dưới). Tệp influenza.faa là tệp tin fasta chứa số accession của nucleotide của GenBank, số accession của protein của GenBank , chỉ ra là protein coding region, hai trường tiếp theo (nếu có) là lặp lại nếu một chuỗi của nucleotide mã hóa nhiều hơn một protein và sau cùng là chuỗi (bảng 10). Tệp influenza.fna là tệp tin fasta chứa thông tin về gi|genbank identify|gb| acces- sion|name và sau đó là chuỗi (như bảng 11). Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 19 Tệp influenza_aa.dat là tệp tin chứa thông tin về protein như accession, host, seg- ment, subtype, country, year, length, name, gender, full length of genomeset (như bảng 12). Tệp influenza_na.dat là tệp chứa thông tin về nucleotide như accession, host, seg- ment, subtype, country, year, length, name, gender, full length of genomeset (như bảng 13). Cập nhập thêm thông tin chi tiết về Việt Nam từ tệp “listTown.txt” được xây dựng ở trên. Từ đó xây dựng lên cơ sở dữ liệu influenza có các bảng sau. Bảng “genomeset” có các trường accession, host, segment, subtype, country, year, length, name, age, gender (bảng 14). Bảng này cung cấp thông tin cho quá trình tìm kiếm “genomset”. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 20 Bảng “coding_region” có các trường acc_nucleotide, host, segment, subtype, country, year, length, name, age, gerder, acc_protein, title, containt (như bảng 15 bên dưới). Bảng này cung cấp thông tin tìm kiếm “coding region”. Bảng “nucleotide” có các trường accession, host, segment, subtype, country, year, length, name, age, gender, title, contain (như bảng 16). Bảng “nucleotide” cung cấp thông tin cho quá trình tìm kiếm “nucleotide”. Bảng “protein” có các trường accession, host, segment, subtype, country, year, length, name, age, gender, type, title, contain (như bảng 17 cho bên dưới). Bảng “protein” cung cấp thông tin cho quá trình tìm kiếm các protein. Các tệp tin được tải tự động ngoài những tệp tin trong thư mục updates của NCBI là những tệp tin có định dạng “genbank” và “fasta” của các accession trong quá trình trích lấy thông tin từ tệp tin ở thư mực updates. Và chúng sẽ được tự động thêm link trong quá trình truy xuất của người dùng để có thể sử dụng khi Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 21 dùng offline cũng như online. Những file này được chứa tương ứng trong thư mục “GENBANK” và “FASTA”. Sau khi xây dựng xong dữ liệu thì việc đầu tiên ngân hàng gen cung cấp cho người dùng là tìm kiếm chuỗi. 2.2. Tìm kiếm các chuỗi Người dùng có thể tìm kiếm các chuỗi về protein, nucleo- tide, coding region, genome (ở tab Genomes set) bằng cách chọn nút radio tương ứng với phần đó. Trong phần tìm kiếm về kiểu virut cúm người dùng có thể chọn kiểu cúm A, B, C hay bất kỳ kiểu cúm A, B, C nào (any) trong trường “Virus Species”. Mục “Host” cho phép chọn cúm gia cầm, cúm Blow fly,... Trong trường “Country/Region” mặc định ban đầu được chọn là Việt Nam, người dùng có thể thay đổi chọn nước bất kỳ hoặc tất cả (any) các nước trên trường này. Mục “Segment/Protein” cho phép người dùng chọn các segment tương ứng của virut cúm. Trường kế tiếp là “Region of Vietnam” (các tỉnh thành/vùng của Việt Nam) chỉ có tác dụng nếu người dùng chọn Việt Nam trong phần “Country/Region”. Đây là những lựa chọn cơ bản có tác dụng trong các phần tìm kiếm chuỗi ở bên dưới. Dưới đây là các kiểu kèm thêm điều kiện tìm kiếm khác. 1. Tìm kiếm các chuỗi với các điều kiện kèm theo các trường bên dưới cho phép chọn “subtype” như H5N1, H1N1,... chọn chuỗi từ năm nào đến năm nào trong trường “From year” (ví dụ: 2000) và “To year” (ví dụ: 2009), hay chọn chiều dài tối thiểu và tối đa của chuỗi trong trường “Min.length” (ví dụ chiều dài nhỏ Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 22 nhất là 200) và “Max.length” (ví dụ chiều dài lớn nhất là 1000) hoặc thông tin có trong phần “name” của chuỗi tìm được trong phần “Search by a string” (ví dụ Vietnam/2003). 2. Tìm kiếm theo accession được cho ở trường “Search by ac- cession” cho phép chúng ta tìm kiếm theo “accession” (accession là key trong cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene được quy định chung cho các ngân hàng gene trên thế giới). 3. Tìm kiếm với các lựa chọn cơ bản là phần dưới cùng “Get se- quences” cho phép tìm kiếm các chuỗi với các điều kiện đã chọn ở đầu tiên, không bao hàm phần “search by string”. Kết quả chúng ta nhận được khi tìm kiếm như hình 12 bên. Phần tìm kiếm genomset cũng tìm kiếm giống như phần tìm kiếm chuỗi nêu ở trên. Hình 13 là giao diện của trang tìm kiếm genomeset. Kết quả khi tìm kiếm geno- set như hình 14. Sau khi tìm kiếm chuỗi xong thì Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 23 việc tiếp theo người dùng có thể rất cần là việc tải các chuỗi đã tìm kiếm được theo ý muốn của mình. Dưới đây là phần tiện ích tải chuỗi. 2.3. Tiện ích tải chuỗi Trong phần kết quả tìm kiếm các chuỗi của ‘protein’, ‘nucleotide’, ‘coding region’ hay ‘genome set’ người dùng có thể lựa chọn tải về các chuỗi theo loại ‘protein’, ‘nucleotide’ hay ‘coding region’ hoặc danh sách các ‘accesion’ của ‘protein’ hoặc ‘nucleotide’ với lựa chọn được tích ở phần trước tên của acces- sion. Hình ảnh minh họa tải tệp tin dạng FASTA khi người dùng nhấp vào lựa chọn tải chuỗi như hình 15 bên. Dạng tệp tin FASTA tải về có định dạng như bảng 18 dưới đây. Tệp tin chứa các chuỗi tải về chính là đầu vào cho phần “sắp hàng đa chuỗi” để tìm quan hệ nguồn gốc giữa các loài sinh vật (xem thêm phần 2.1.Sắp hàng đa chuỗi, chương I ở trên). 2.4. Tiện ích sắp hàng đa chuỗi Phần mềm xây dựng sử dụng phần mềm MUSCLE (Multiple squence comparison by log epectation) (Edgar, 2004) version 3.6 tải tại địa chỉ: Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 24 5.com/muscle để thực hiện sắp hàng đa chuỗi các chuỗi tìm kiếm được của người dùng. Phần mềm cho phép người dùng trực tuyến sử dụng sắp hàng đa chuỗi tối đa cho 1000 chuỗi. Nếu vượt quá con số này sẽ gặp thông báo lỗi và đưa ra địa chỉ trang web cho người dùng tải công cụ “muscle” về dùng trên máy của người dùng với đầu vào là tệp tin FASTA chứa các chuỗi mà người dùng có thể tải về được theo tiện ích ở trên. Hình 16 minh họa kết quả của sắp hàng đa chuỗi. Mục đích của “Sắp hàng đa chuỗi”(MSA) là đầu vào cho tạo cây tiến hóa (phylogentic tree) sau này (xem thêm về cây tiến hóa ở mục 2.2. Cây tiến hóa, ở chương I bên trên). 2.5. Tiện ích xây dựng cây tiến hóa Cây tiến hóa là cây xây dựng từ tệp MSA. Nhìn vào “cây tiến hóa” mà chúng ta dễ nhận ra loài nào có quan hệ nguồn gốc từ loài nào. Từ đó, trong phòng chống dịch cúm người ta có thể phát hiện về sự lây lan, nguồn gốc của các loài virut mới xuất hiện cũng như sẽ đề ra biện pháp phòng và chống lây lan dịch cúm. Hình 17 là ví dụ về một cây tiến hóa. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 25 Trong phần tích hợp công cụ xây dựng cây tiến hóa này, chúng tôi đã dùng gói PHYLIP (do Joe Felsenstein viết có thể tải tại địa chỉ .washington.edu/phylip.html). Trước hết, dùng phần mềm MUSCLE (Edgar, 2004) ở trên tạo ra tệp tin sắp hàng đa chuỗi với định dạng hộ trợ phần mềm phylip ví dụ là: “alignment.phyi”. Sau đó dùng chương trình “protdist” nếu là sắp hàng đa chuỗi của protein hoặc dùng chương trình “dnadist” (nếu không phải sắp hàng đa chuỗi của protein) để tạo tập tin ma trận của MSA làm đầu vào cho chương trình tạo cây “neighbor”. “Neighbor” là chương trình tạo cây dựa trên phương pháp “neighbor-joining” (Saitou and Nei, 1987) để tạo cây tiến hóa. Kết quả sinh ra tệp tin “out- file” (tệp tin chứa cây dạng biểu diễn dưới dạng toán học) và “outtree” (cây vẽ dưới dạng đơn giản). Người dùng tải tệp tin “tree.zip” (như hình 18) về và dùng những chương trình xem cây như view tree,… để xem. Để làm trực quan về phân bố của virut cúm thì trong phần tiếp theo chúng ta sẽ xây dựng “bản đồ phân bố của virut cúm” giúp người dùng dễ dàng có cái nhìn trực quan về phân bố virut cúm ở Việt Nam hay trên thế giới. 2.6. Bản đồ phân bố của virut cúm Người dùng có thể xem sự phân bố của virut cúm của các nước trên thế giới hay của các tỉnh thành của Việt Nam trong phần “prediction” từ trang chủ. Hình 19 là trang web cho phép người dùng lựa chọn xem phân bố cúm. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 26 Từ trang này, người dùng có thể chọn xem phát tán virut cúm theo loại cúm A, cúm B hay cúm C hoặc bất kỳ loại cúm nào trong 3 loại cúm trên. Người dùng có thể chọn cúm gia cầm (Avian) hay cúm “Blow fly”,…và có thể lựa chọn phát tán của virut từ năm nào (ví dụ từ năm 2000) đến năm nào (ví dụ đến năm 2009) trong hai trường “From year” và “To year”. Trong phần “Country/Region” người dùng có thể chọn “Viet Nam” để xem sự phát tán ở Việt Nam hoặc “any” để xem sự phát tán của virut cúm trên thế giới. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 27 Kết quả minh họa khi người dùng xem phân bố cúm ở Việt Nam và trên thế giới như hình 20, 21, 22 và 23 bên dưới. Phần này sử dụng kiến thức nền tảng về “google map API” (Google - googlemap.com) và gói GoogleMapAPI.class.php v.1.63 (viết bởi Monte Ohrt có thể tải tại địa chỉ Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 28 MapAPI) hộ trợ php để xây dựng bản đồ phát tán virut này. Người dùng có thể dùng chuột để kéo bản đồ để xem các vị trí khác nhau, kích đúp chuột để phóng to hình ảnh lên, hoặc có thể sử dụng thanh công cụ bên trái cùng để phóng to hoặc thu nhỏ hình ảnh. Người dùng cũng có thể biết thông tin về “số lượng chuỗi” và tên “địa điểm” bằng việc nhấp chuột (hoặc rê chuột) vào vị trí có màu đỏ hoặc da cam trên bản đồ, còn màu xanh lá cây là không có chuỗi nào. Số lượng chuỗi được tượng trưng thông qua màu trên bản đồ, màu da cam có kích thước nhỏ sẽ ít chuỗi hơn màu da cam có kích thước lớn và màu da cam có kích thước lớn sẽ có ít chuỗi hơn vòng tròn màu đỏ có kích thước nhỏ và vòng tròn màu đỏ có kích thước nhỏ sẽ ít chuỗi hơn vòng tròn màu đỏ có kích thước lớn hơn. Phần này đã cung cấp cho người dùng cái nhìn trực quan về phân bố virut cúm, thì phần “biểu đồ thống kê về virut cúm” dưới đây sẽ cung cấp cho người dùng những số liệu thống kê về virut cúm ở Việt Nam và trên thế giới. 2.6. Biểu đồ thống kê về virut cúm Trong trang “prediction” nhấp vào tab “Statistic” chúng ta vào trang thống kê về virut cúm như hình 24. Chương trình thống kê về virut cúm có sử dụng gói chương trình “ChartDirector v.5.0”(phần mềm này của công ty Advanced Software Engineering Limited, 2008, có thể tải theo địa chỉ Thống kê virut cúm cho các vùng ở Việt Nam, chúng ta có thể chọn năm thống kê từ năm nào (ví dụ năm 2000) đến năm nào (ví dụ năm 2009) trong trường Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 29 “From year” và “To year” ở bên dưới, mặc định 2 trường này thống kê tất cả các năm tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. Hình 25 minh họa thống kê virut cúm các vùng ở Việt Nam. Ngoài ra, chúng ta còn có thể thống kê virut cúm cho Việt Nam qua các năm chúng ta có thể chọn năm thống kê từ năm nào đến năm nào trong trường “From year” và “To year” ở bên dưới, mặc định 2 trường này thống kê tất cả các năm tìm thấy trong cơ sở dữ liệu. Chúng ta có thể xem số chuỗi tìm thấy trong cơ sở dữ liệu bằng cách rê chuột qua cột biểu diễn. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 30 Ngoài lựa chọn thống kê virut cúm ở Việt Nam thì chúng ta còn có thêm phần thống kê virut cúm trên thế giới qua các năm trong phần “World”. Để thống kê, chúng ta cũng có thể chọn năm thống kê từ năm nào đến năm nào thông qua 2 trường “From year” (ví dụ năm bắt đầu là 2000) và “To year” (ví dụ thống kê đến năm 2009) ở bên dưới cửa sổ thống kê. Mặc định của chương trình là thống kê tất cả các năm có trong cơ sở dữ liệu. Hình 27 minh họa thống kê virut cúm trên thế giới qua các năm. Chúng ta có thể xem số liệu (số chuỗi tìm thấy) thống kê qua bằng cách rê chuột qua cột muốn xem. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 31 Tài liệu tham khảo [1] Brown, T. (2002) Genomes. BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, UK, Second edn.. [2] CDC - Trung tâm ngăn chặn và kiểm soát dịch: /gen-info/flu-viruses.html, [3] Edgar, R. C. (2004) MUSCLE: multiple sequence alignment with high accura- cy and high throughput. Nucl. Acids Res., 32, 1792-1797. Link tải phần mềm MUSCLE: “www.drive5.com/muscle/”. [4] Higgins, D. (2003) Multiple alignment. In Salemi, M. and Vandamme, A.-M. (eds.), The Phylogenetics Handbook A Practical Approach to DNA and Protein Phylogeny, pages 45–60, Cambridge University Press, Cambridge. [5] NCBI Thông tin về cơ sở dữ liệu của NCBI như ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genom- es/INFLUENZA/README, ml. [6] Nippon Rinsho, 1997 Oct. Influenza virus genome structure and encode pro- teins, J Med Biol Res, 55(10): 2542-6. [7] Notredame, C., Higgins, D. and Heringa, J. (200) T-COFFEE: A novel method for multiple sequence alignments. Journal of Molecular biology, 302, 2005-217. [8] Roderic D. M. Page Division of Environmental and Evolutionary Biology In- stitute of Biomedical and Life Sciences University of Glasgow, Glasgow G12 QQ, Scotland, UK. Link tải phần mềm về tại địa chỉ /rod/treeview.html. [9] Thompson, J.D., Higgins, D. G. and Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: im- proving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through se- quence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 22. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 32 [10] Saitou N, Nei M (1987). "The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees". Mol Biol Evol 4 (4): 406-425. [11] Voyles, 2002: The biology of Viruses. Mc Graw Hill. [12] Thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO: / influeza/20- 080702_9, Cumulative Number of Confirmed Human Cases of A-vian Influenza A/(H-5N) Reported to WHO 3 April 2008, _influenza/en/. [13] Wan X-F, Nguyen T, Davis CT, Smith CB, Zhao Z-M, et al, (2008) Evolu- tion of Highly Pathogenic H5N1 Avian Influenza Viruses in Vietnam between 2001 and 2007. Plos ONE 3(10): e3462. doi: 10.1371/journal.pone.0003462, 3, 1- 12. [14] Waterman, M. S. (2000) Introduction to Computational Biology. Chapman and Hall, London, UK, first crc press edn.. Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 33 Các hình ảnh tham khảo Hình 1. Cấu trúc tế bào ( imal_cell.gif).............................................................................................................4 Hình 2. Mô hình cấu trúc phân tử ADN( ..................................................................................................................................4 Hình 3. Cách mã hóa 20 axit amin ( biological/G-enticCode.png )....................................................................................5 Hình 4. Cây tiến hóa(Wan X-F, Nguyen T, Davis -CT, Smith CB, Zhao Z-M, et al, 2008, Evolution of Highly Pathogenic H5N1, Avian Influenza Viruses in Vietnam between 2001 and 2007............................................................................................7 Hình 5. Một số virut xuất hiện trong các trận dịch ( stories/Oct05/pademic_timeline.jpg ).......................................................................9 Hình 6. Quá trình phát triển của virut cúm ( sbulletin/2005/no2/vol3no2-2005_image001_e.gif)...............................................12 Hình 7. Mô hình làm việc của chương trình...........................................................14 Hình 8. Ví dụ thông tin chi tiết về vi rút cúm ở Việt Nam trong các bài báo ở pub- med..........................................................................................................................15 Hình 9 . Giao diện trang đăng nhập vào để quản lý cập nhật dữ liệu.....................16 Hình 10. Tự động cập nhật dữ liệu.........................................................................17 Hình 11. Tran chủ tìm kiếm chuỗi..........................................................................21 Hình 12. Kết quả tìm kiếm Protein/Nucleotide/Coding region..............................22 Hình 13. Phần tìm kiếm genomeset........................................................................22 Hình 14. Kết quả tìm kiếm genomeset...................................................................22 Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 34 Hình 15. Kết quả sau khi chọn download file FASTA...........................................23 Hình 16. Sắp hàng đa chuỗi....................................................................................24 Hình 17. Ví dụ về cây tiến hóa “ /”.............................................................................................................................24 Hình 18. Download file tree.zip sau khi thực hiện build tree.................................25 Hình 19. Trang xem sự phân bố của virut cúm......................................................26 Hình 20. Phân bố cúm của các tỉnh/miền ở Việt Nam............................................27 Hình 21. Phóng to hình ảnh phân bố cúm ở Việt Nam...........................................27 Hình 22. Phân bố cúm ở các nước trên thế giới......................................................27 Hình 23. Phóng to hình ảnh phân bố cúm ở các nước trên thế giới........................27 Hình 24. Giao diện chương trình thống kê về virut cúm........................................28 Hình 25. Thống kê virut cúm cho các vùng của Việt Nam....................................29 Hình 26. Thống kê virut cúm cho Việt Nam..........................................................29 Hình 27. Thống kê virut cúm trên thế giới.............................................................30 Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 35 Các bảng tham khảo Bảng 1. Ví dụ 2 chuỗi gene của Human và Chimpanzee.........................................6 Bảng 2. Sau khi sắp hàng 2 chuỗi.............................................................................6 Bảng 3. Ví dụ gióng hàng đa chuỗi..........................................................................6 Bảng 4. Thống kê các trận đại dịch trên thế giới (theo thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO )................................11 Bảng 5. Thống kê những trận dịch cúm những năm gần đây (theo thống kê của tổ chức y tế thế giới WHO “Cumulative Number of Confirmed Human Cases of A- vian Influenza A/(H5N) Reported to WHO 3 April 2008 ” – csr/disease/avian_influenza/en/).............................................................................11 Bảng 6. Ví dụ về chuẩn hóa thông tin tỉnh thành Việt Nam...................................16 Bảng 7. Thông tin trong tệp genomeset.dat............................................................17 Bảng 8. Thông tin trong tệp influenza.cds..............................................................18 Bảng 9. Thông tin trong tệp influenza.dat..............................................................18 Bảng 10. Thông tin trong tệp influenza.faa............................................................18 Bảng 11. Thông tin trong tệp influenza.fna............................................................18 Bảng 12. Thông tin trong tệp influenza_aa.dat......................................................19 Bảng 13. Thông tin trong tệp influenza_na.dat......................................................19 Bảng 14. Bảng “genomeset”...................................................................................19 Bảng 15. Bảng “coding_region”.............................................................................20 Bảng 16. Bảng “nucleotide”...................................................................................20 Nghiên cứu sự phát triển của virut cúm 36 Bảng 17. Bảng “protein”.........................................................................................20 Bảng 18. Dạng của file FASTA..............................................................................23