Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình từ gen Pr1 và vùng rDNA-ITS

Tài liệu Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình từ gen Pr1 và vùng rDNA-ITS: BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SỰ ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: TRẦN NHÂṬ NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SƢ ̣ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: ThS. VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHÂṬ NAM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn:  Các Thầy Cô trong trƣờng Đạ...

76 trang | Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1215 | Lượt tải: 0

Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Khóa luận Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình từ gen Pr1 và vùng rDNA-ITS, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SỰ ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 - 2007 Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: TRẦN NHÂṬ NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CƢ́U SƢ ̣ĐA DAṆG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarhizium anisopliae DƢẠ VÀO TRÌNH TƢ ̣ GEN Pr1 VÀ VÙNG rDNA-ITS Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thƣc̣ hiêṇ: ThS. VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHÂṬ NAM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Con xin cảm ơn Ba Mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn:  Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học.  Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  TS. Lê Đình Đôn, ThS. Võ Thị Thu Oanh , CN. Lƣu Phúc Lợi đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.  Anh Nguyêñ Văn Lâm̃ đã hết lòng hƣớng dẫn em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa sinh đã động viên, chia sẻ kinh nghiêṃ và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận.  Xin cám ơn cuôc̣ sống đa ̃đem laị cho tôi nhƣ̃ng ngƣời baṇ , nhƣ̃ng ngƣời đa ̃cùng tôi chia sẻ và động viên tôi trong suốt quá trình thƣc̣ hiêṇ khóa luâṇ. Xin chân thành cảm ơn! TRẦN NHÂṬ NAM iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sƣ ̣tính đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA-ITS “ đƣợc thực hiện từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007 tại trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài do Trần Nhâṭ Nam thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS . Võ Thị Thu Oanh và TS. Lê Đình Đôn. Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây hại. Đây là giống nấm có hoaṭ tính tiêu diêṭ côn trùng maṇh . Mục đích đề tài nhằm nghiên cƣ́u sƣ ̣đa daṇg về măṭ di truyền giƣ̃a các dòng nấm dƣạ trên cơ sở trình tƣ ̣ nucleotide của gen Pr1 và vùng rDNA-ITS Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: - Xác định đƣợc những dòng nấm Metarhizium anisopliae sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u thuôc̣ dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae. - Phát hiện gen Pr1 ở trên 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae. Tiến hành giải trình tự gen Pr1 của10 mâũ nấm. Kích thƣớc của gen Pr1 ở 7 mâũ nấm là 1091bp. - Có sự khác biêṭ về măṭ di truyền giƣ̃a các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và giƣ̃a các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank .Tỉ lệ tƣơng đồng giữa các dòng trong nƣớc khoảng 95-100%, và giữa các dòng trong nƣớc so với các dòn g trên thế giới là 94-99% khi so sánh trình tƣ ̣gen Pr1 - Phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 so với nhƣ̃ng dòng còn lại. Nhƣ̃ng đôṭ biến này đều xảy ra ở vùng ITS1. - Có sự bảo tồn cao trong vùng 5.8S và vùng ITS2 giƣ̃a nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong đề tài . Tỉ lệ tƣơng đồng giữa những dòng trong nƣớc là 99- 100% và giữa các dòng trong nƣớc với các dòng trên genbank là 92-100% khi so sánh trình tƣ ̣ vùng rDNA-ITS. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .............................................................................................................iii Tóm tắt .................................................................................................................. iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................viii Danh sách các bảng ............................................................................................... ix Danh sách các hình ................................................................................................ x 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài .................................................................................... 2 1.2.1. Mục tiêu ...................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu đề tài .............................................................................................. 2 1.3.Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3 2.1. Giới thiêụ nấm Metarhizium anisopliae ............................................................... 3 2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. ................. 6 2.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................................. 7 2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm .................................................... 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. ............... 8 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc ............................................................................... 8 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc ............................................................................... 9 2.6. Giới thiêụ gen Pr1 .............................................................................................. 10 2.7. Vai trò của Protease Pr1 ..................................................................................... 10 vi 2.8.Tổng quan về ITS-rDNA ..................................................................................... 10 2.8.1. Giới thiêụ về vùng rDNA và vùng ITS ...................................................... 10 2.9. Môṭ số nghiên cƣ́u trong nƣớc và nƣớc ngoài về sƣ ̣đa daṇg của nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ................................. 12 2.9.1. Nghiên cƣ́u nƣớc ngoài ............................................................................. 12 2.9.2. Nghiên cƣ́u trong nƣớc .............................................................................. 14 2.10. Phƣơng pháp phát hiêṇ gen Pr1 và vùng rDNA-ITS ....................................... 14 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................. 16 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 16 3.1.1. Thời gian ................................................................................................... 16 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................... 16 3.2. Vật liệu và hoá chất ............................................................................................. 16 3.2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 16 3.2.2. Hoá chất .................................................................................................... 17 3.2.3. Các thiết bị chính ...................................................................................... 17 3.3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 18 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 18 3.4.1.Kiểm tra DNA tổng số đƣơc̣ ly trích tƣ̀ các dòng nấm Metarhizium anisopliae ............................................................................................................. 18 3.4.2. Khuếch đại gen Pr1 ................................................................................. 18 3.4.3. Khuếch đaị vùng rDNA-ITS ..................................................................... 21 3.5. Tiến hành giải trình tƣ ̣gen gây đôc̣ Pr1 và vùng ITS .................................... 22 3.6. Tinh sac̣h sản phẩm PCR ................................................................................ 22 3.7. Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự..................................................................... 24 3.8. Phƣơng pháp phân tích trình tƣ ̣...................................................................... 24 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 26 4.4. DNA của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ dùng trong nghiên vii cƣ́u ............................................................................................................................. 26 4.5. Kết quả tinh sac̣h DNA tổng số ...................................................................... 28 4.6. Kết quả khuếch đaị vùng ITS1-5.8S-ITS2. .................................................... 28 4.7. Kết quả giải trình tƣ ̣vùng ITS1-5.8S-ITS2 .................................................... 29 4.8. Kết quả khuếch đại gen Pr1………………………………………………...36 4.9. Kết quả đoc̣ trình tƣ ̣gen Pr1………………………………………………………36 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 42 5.4. Kết luận .......................................................................................................... 42 5.4.2. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 ............................................................. 42 5.4.3. Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS ................................................ 42 5.5. Đề nghị ........................................................................................................... 43 5.6. Hạn chế của đề tài ........................................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................... 47 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BXĐTG : Bọ xít đen Tiền Giang BXĐTV : Bọ xít đen Trà Vinh RBCQ9 : Rầy bông cúc Quận 9 BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6 BDTV5 : Bọ dừa Trà Vinh 5 BDTN : Bọ dừa Tây Ninh BDBD7 : Bọ dừa Bình Định 7 SCLLLA : Sâu cuốn lá lúa Long An RNBT : Rầy nâu Bến Tre RNLA : Rầy nâu Long An ng : nano gram nm : nano mol g : micro gram m : micro mol M : micro mol/lít l : micro lít TE : tris EDTA dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate TAE : tris acetic EDTA UI : unit international bp : base pair Kb : kilo base ctv : cộng tác viên PCR : Polymerase Chains Reaction Rpm : Revolutions per minute ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giới thiêụ nấm Metarhizium anisopliae ............................................... 3 Bảng 3.1 Nguồn nấm Metarhizium anisopiae đƣơc̣ thu thâp̣ ở môṭ số điạ phƣơng dùng trong thí nghiêṃ ........................................................................................ 16 Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR1/METPR4 ......................................................................................................... 19 Bảng 3.3 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR2/METPR5 ......................................................................................................... 20 Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại gen vùng rDNA -ITS .... .21 Bảng 3.5 Thành phần của phản ứng đọc trình tự ................................................ 23 Bảng 4.1 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơc̣ dùng để so sánh trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS. .................................................................................... 30 Bảng 4.2 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS ..................................................................... 31 Bảng 4.3 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS.................................................33 Bảng 4.4 Các nguồn nấm Metarhizium anisopliae trên genbank đƣơc̣ dùng để so sánh trình tự gen Pr1 ....................................................................................................... 37 Bảng 4.5 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1 .................................................................................. 38 Bảng 4.6 Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1..............................................................40 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau ........................................................................................................ 5 Hình 2.2 Sơ đồ của các vùng trên rDNA ............................................................. 12 Hình 3.1 Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg để khuếch đaị gen Pr1 .............................. 18 Hình 3.2 Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg để khuếch đaị vùng ITS ........................... 21 Hình 3.3 Nhƣ̃ng phƣơng pháp đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong phân tích trình tự ................ 24 Hình 3.4 Sơ đồ phân tích trình tƣ ̣có đô ̣tƣơng đồng cao ..................................... 25 Hình 4.1 DNA tổng số của nấm Metarrhizium anisopliae ...................................... 26 Hình 4.2 Sơ đồ tinh sac̣h DNA tổng số của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u ......................................... 27 Hình 4.3 DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ tinh sac̣h ........... 28 Hình 4.4 Hình khuếch đại vùng rDNA-ITS ........................................................ 28 Hình 4.5 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS ........................................................ 32 Hình 4.6 So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS.................................... 34 Hình 4.7 Hình khuếch đại gen Pr1 ..................................................................... 36 Hình 4.8 Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự gen Pr1 ...................................................................... 39 Hình 4.9 So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tƣ ̣gen Pr1 ................................................. 41 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề. Nông nghiệp đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế nƣớc ta. Trong sản xuất nông nghiệp ngƣời nông dân gặp rất nhiều khó khăn, trong đó khó khăn lớn nhất là việc phòng trừ và tiêu diệt các loại côn trùng gây hại cho cây trồng. Hiện nay trên thị trƣờng xuất hiện rất nhiều loại thuốc hóa học dùng trong nông nghiệp.Tuy nhiên việc sử dụng những sản phẩm này trong một thời gian dài cộng với liều lƣợng ngày càng tăng đã và đang ảnh hƣởng nặng nề đến môi trƣờng, làm xuất hiện nhiều loại sâu bệnh và côn trùng kháng thuốc, làm giảm chất lƣợng đất.Và nguy hiểm hơn cả là việc thuốc trừ sâu xuất hiện trong sản phẩm sau khi thu hoạch đã ảnh hƣởng trực tiếp tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Trƣớc thực trạng này các nhà khoc học đã nghiên cứu và đƣa ra phƣơng pháp mới trong việc phòng trừ và tiêu diệt các loài gây hại cho côn trùng. Một trong những phƣơng pháp đó là kiểm soát sinh học thông qua việc sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc từ nấm, virus, vi khuẩn hoặc sử dụng ký sinh thiên địch, các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thảo mộc để phòng trừ và tiêu diệt các loài côn trùng gây hại một cách hiệu quả và an toàn hơn. Trong các loại vi sinh vật gây hại cho côn trùng đáng chú ý nhất là ngành phụ nấm bất toàn mà đại diện tiêu biểu là nấm Metarhizium anisopliae-một trong những loài có đặc tính diệt côn trùng mạnh nhất. Trên thế giới nấm Metarhizium anisopliae là đối tƣợng nghiên cứu của rất nhiều công trình khoa và đã đƣợc thƣơng mại hóa từ lâu – nhƣ là một loại thuốc trừ sâu sinh học trong công tác phòng chống một số loại côn trùng gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau. 2 Trƣớc đây việc nghiên cứu về đa dạng sinh học chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá hình thái nên còn nhiều hạn chế. Ngày nay với sự ra đời của nhiều kĩ thuật mới nhƣ kĩ thuật PCR và những ứng dụng từ PCR nhƣ RAPD, RFLP, AFLP, Southern blot, Sequence v.v.. đã giúp cho quá trình nghiên cứu nhanh và chính xác hơn.Tuy nhiên những nghiên cứu nhƣ vậy ở nƣớc ta còn rất ít. Xuất phát từ những đặc điểm trên, đƣợc sự cho phép và phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự gen Pr1 và vùng rDNA- ITS “. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu đề tài. 1.2.1.Mục tiêu Nghiên cƣ́u sƣ ̣đa daṇg di truyền của nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ phân lâp̣ trên nhiều đối tƣơṇg cây trồng khác nhau ở các tỉnh th ành trên cả nƣớc dƣạ vào trình tƣ ̣của gen gây đôc̣ Pr1 và vùng rDNA-ITS. 1.2.2. Yêu cầu đề tài. - Kiểm tra DNA đƣơc̣ ly trích tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u. - Xác định gen gây độc Pr1 và vùng rDNA-ITS bằng kỹ thuâṭ PCR. - Xác định trình tự gen Pr1 và vùng rDNA -ITS và tìm sƣ ̣khác biêṭ về trình tƣ ̣ giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae. 1.3. Đối tƣợng nghiên cứu. Nấm Metarhizium anisopliae thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre, Bình Điṇh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau. 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Bảng 2.1: Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae. Kingdom (Giới) Fungi Phylum (Ngành) Ascomycota Class (Lớp) Sordariomycetes Order (Bộ) Hypocreles Family (Họ) Clavicipitaceae Genus (Giống) Metarhizium Species (Loài) Metarhizium anisopliae Nấm này đƣợc Metschinikov phát hiện đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung hại lúa mì. Nấm thƣờng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất, thuộc vi sinh vật đất trong tự nhiên. Bào tử của nấm sau 24 giờ tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong. Trong cơ thể côn trùng sợi nấm phát triển xâm nhập vào các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết. 4 Nấm Metarhizium anisopliae có 2 dạng chính: M. anisopliae var. major có bào tử dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9,0 (thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh (nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000). Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ: Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài), Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo. Metarhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm bệnh bởi Metarhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Ngoài ra Metarhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân bố rộng trong tự nhiên. M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng OA sau 10 ngày nuôi cấy ở 20 oC có đƣờng kính 2 cm. Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarhizium anisopliae: nang của Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất 5 rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông, đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân lập đƣợc Metarhizium anisopliae. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarhizium anisopliae: - Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin. - Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và O2 chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). - Ở dƣới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. - Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin (lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004). Hình 2.1: Nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên những côn trùng khác nhau 6 2.2. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng. Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật chủ không qua đƣờng miệng, mà qua lớp vỏ cơ thể, nghĩa là phải có sự tiếp xúc của nguồn nấm với bề mặt cơ thể vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký sinh đƣợc. Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng. Từ miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm ở nƣớc. Dƣới tác động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Thí dụ, trƣờng hợp bào tử nấm Aspergillus trong ruột ong mật. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít. Sự xâm nhiễm và phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng là một quá trình phức tạp, gồm 3 giai đoạn chính sau đây Sự xâm nhập Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhập vào cơ thể côn trùng bằng sự xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin, theo cách này thì nấm tiết ra enzyme phân hủy lớp cutin để có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng. Ngoài ra nấm ký sinh côn trùng còn có thể xâm nhập gián tiếp vào cơ thể vật chủ qua thành ống tiêu hoá, qua lổ thở, qua vết thƣơng trên cơ thể côn trùng. 7 Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển qua màu xanh lục Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấm gây bệnh côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng, có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau. Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào. 2.3. Hoạt tính sinh học. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết các nấm Muscardine (ví dụ nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana, nấm Muscardine xanh : Metarhizium anisopliae có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn các enzyme.Trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chitinase, proteinase, lipase và amylase. 2.4. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm Nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria đƣợc nghiên cứu sản xuất để trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối với 8 rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí nghiệm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài rầy hại lúa trong vụ. Dùng nấm B. bassiana để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng suất từ 19 – 95% so với đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần Văn Mão, 2004). Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều. (Trần Văn Mão, 2004). 2.5. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae và những nấm ký sinh côn trùng khác ứng dụng để phòng trừ sâu hại. 2.5.1. Nghiên cứu trong nƣớc Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarhizium để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium sau khi đã thử nghiệm trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho các chủng Metarhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau một năm xử lý. Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm , sản xuất và 9 ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy – Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng – Hemiptera. 2.5.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997). Theo Juntin L. Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawsski và Ray M.Miller (1999), các nghiên cứu về các nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng từ 1995-1998, và cho biết trong 8 loài nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết chết rầy mềm, gồm 6 loài thuộc Entomophthorales (Pandora neoaphidis, connidiobolus thromboides, C.coronatus, Entomophthora planchoniana và neozygites fresenii) và hai loài thuộc Hyphomycetes (Beauveria basssiana, Verticillium lecanii). Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm, 3mm, 4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể. 10 Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố ở nấm Metarhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể. 2.6. Giới thiệu gen Pr1 Những nấm gây bệnh trên côn trùng xâm nhập vào côn trùng bằng cách xâm nhập trực tiếp qua lớp cutin. Chúng sản xuất những enzyme ngoại bào ảnh hƣởng trực tiếp lên lên lớp vỏ bọc của côn trùng. Nấm Metarhizium sản xuất một protease subtilisinlike ngoại bào đƣợc gọi là Pr1. Pr1 gây thoái hoá protein của lớp cutin. Pr1 đƣợc tổng hợp nhƣ là một tiền chất lớn (40.3 kDa) chứa một peptide tín hiệu, một tiền peptide và một protein hoàn thiện . Cấu trúc sơ cấp của Pr1 có độ tƣơng đồng lớn (30- 60%) với những enzyme của phân lớp subtilisin của serine endopeptidase và serine, histidine và aspartyl. 2.7. Vai trò của protease Pr1 Những enzyme tác nhân gây bệnh hội tụ ngoài tế bào có thể làm suy thoái cấu trúc polymer của biểu bì (protein, chitin và lipid) trong suốt giai đoạn phát sinh bệnh, giúp cho quá trình thâm nhập của nấm đƣợc dễ dàng và cung cấp những dinh dƣỡng cho nấm phát triển nhanh hơn. Sản phẩm của những enzyme làm phân hủy biểu bì này thì thƣờng đƣợc phân lập bởi sự nuôi cấy trên môi trƣờng chứa biểu bì hoặc chitin (Raymond và ctv, 1995). 2.8. Tổng quan về ITS-rDNA 2.8.1. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS rDNA là nhóm gene mã hoá rRNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA đƣợc nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản sao và đặt biệt không mã hoá cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hoá. Ribosome hầu nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc. Phần lớn phân tử rDNA tƣơng 11 đối bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và cộng sự, 1996). rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5,8S (một tiểu đơn vị ribosome nhỏ hơn trở thành một phần của LSU), ITS2, 28S và vùng IGS (intergenic spacer). Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S cộng với 5,8S và một gen 5S thêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome RNA. Những vùng ITS đƣợc phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhƣng bị cắt trƣớc khi rRNA hoàn thiện đƣợc hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong sự hình thành ribosome (Albert và cộng sự 1994). Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết thúc 3’ của 28S, cũng có một vùng đƣợc biết đến là ETS (external transcribel spacer). IGS (intergenic spacer) là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA. Tuy nhiên vùng không gian không phiên mã của những rDNA chứa trình tự kết thúc phiên mã của những gene rRNA . Các rDNA 5,8S; 18S; 28S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã . Có một rDNA 5S thƣờng không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngƣợc với các gen còn lại, rDNA 5S thƣờng chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm (Guarro, 1999). rDNA 18 S thƣờng đƣợc quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8 S có kích thƣớc rất nhỏ và ít có sự biến đối song rRNA 5 S là thành phần không thể thiếu của nu-LSU- rRNA, có vai trò ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và cộng sự, 2001). 12 Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hoá của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thƣờng sử dụng ở mức độ xác định các biệt hoá trong cùng loài (Guarro, 1999). Những gene rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA) đƣợc tìm thấy nhƣ những phần đơn vị lặp lại đƣợc sắp xếp thành từng cặp. Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S và 5,8S) và một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS đƣợc tìm thấy trên gen 5,8S rRNA bao gồm ITS1 và ITS2. Hình 2.2: Sơ đồ của các vùng trên rDNA 2.9. Môṭ số nghiên cƣ́u trong và ngoài nƣớc về sƣ ̣đa daṇg của nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào gen Pr1 và vùng rDNA-ITS 2.9.1. Nghiên cƣ́u nƣớc ngoài Savita Bagga, Gang Hu, Steven E. Screen, Raymond J. St.Leger đa ̃phân tích sƣ ̣ giống nhau về măṭ trình tƣ ̣và cấu trúc exon -intron các subtilisin của nấm M.anisopliae và đã chia thành 4 nhóm: Nhóm I gồm có Pr1C Nhóm II đƣợc chia thành hai nhóm phụ có hoạt tính extracellular 13 Nhóm phụ I: gồm có Pr1A, Pr1B, Pr1G, Pr1I, Pr1K. Nhóm phụ II gồm có Pr1D, Pr1E, Pr1F, Pr1J. Nhóm III gồm có Pr1H có hoạt tính endocellular. Cheng Wang, Milton A. Typas, Tariq M. Butt (2002) đa ̃sƣ̉ duṇg kỹ thâṭ Nested-PCR để xác đi ̣nh nhƣ̃ng đôṭ biến ở hai gen Pr1A và Pr1B bằng cách sƣ̉ duṇg nhƣ̃ng căp̣ pr imer chuyên biêṭ cho tƣ̀ng gen và kiểm tra bằng kỹ thuật Southern Blot . Kết quả: phát hiện đƣợc gen Pr1 ở dòng cha mẹ , không phát hiêṇ đƣơc̣ ở nhƣ̃ng dòng đột biến .Tuy nhiên hoaṭ tính của enzyme giƣ̃a dòng cha me ̣và dòng đôṭ biến không thay đổi. Nhƣ vâỵ dòng đôṭ biến nếu bi ̣ mất gen quan troṇg nhấ t là gen Pr1 vâñ có thể gây bêṇh trên côn trùng. Sorayac C . M.. Leal và ctv (1997) đa ̃ mô tả môṭ phƣơng pháp để xác điṇh nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium bằng cách sƣ̉ duṇg kỹ thuâṭ RFLP để phân cắt sản phẩm PCR của gen Pr1 và phân tích những phân đoạn b ằng kỹ thuâṭ điêṇ di . Bằng kỹ thuâṭ này 40 dòng nấm Metarhizium thu đƣơc̣ tƣ̀ 15 loại ký chủ khác nhau đã đƣợc xác định và chia làm 4 nhóm. Chikako và Susumu Shimizu (2002) đa ̃tiến hành khuếch đaị vùng rDNA tƣ̀ đầu 3’ của 18S rDNA tới đầu 5’ của 28S rDNA bằng cách sƣ̉ duṇg căp̣ mồi đăc̣ hiê ̣u là TW 81 và AB28 và giải trình tự vùng 5.8S và vùng Flanking để nghiên cứu mối quan hệ di truyền giƣ̃a nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ phân lâp̣ tƣ̀ Nhâṭ Bản và Hàn Quốc với các loài có mối quan hệ. Malena P. Panton, Annoula Mavridou, Milton A.Typas (2003) so sánh sƣ ̣khác biê ̣trong trình tƣ ̣của vùng IGS và vùng rDNA -ITS để nghiên cƣ́u sƣ ̣khác biêṭ về măṭ di truyền của 40 dòng nấm Metarhizium. N.D.Pipe, D.Chandler, B. W. Bainbridge và J .B.Heale (1995) sƣ̉ duṇg kỹ thuâṭ RFLP-PCR để phân tích gen ma ̃hóa cho ribosome RNA (rDNA) tƣ̀ nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium khác nhau nhƣ M.anisopliae var. anisopliae, M.anisopliae var. majus, M.album và M.flavoviride có nguồn gốc từ nhiều quốc gia khác nhau. 14 Marilena Aquino de Muro, Samina Mehta, David Moore (2003) sƣ̉ duṇg kỹ thuâṭ RFLP, giải trình tự và AFLP để phân tích vùng ITS của 50 dòng nấm Beauveria bassiana. Trình tự vùng ITS đã chỉ ra sự khác biệt về trình tự của các dòng B.bassiana thấp hơn 2%. Mavridou và ctv (1998) đa ̃phân tích sƣ ̣đa hình trong loài Metarhizium anisopliae var. anisopliae bằng cách sƣ̉ duṇg phân tích RFLP đối với phƣ́c hơp̣ gen rDNA và mtDNA . Dƣạ vào viêc̣ phân tích sƣ ̣lai của DNA , 25 dòng đƣợc chia làm 20 nhóm khác biệt về di truyền . Driver và ctv (2000) đa ̃sƣ̉ duṇg kỹ thuâṭ RAPD và trình tƣ ̣của toàn bô ̣vùng ITS của rDNA để xác điṇh sƣ ̣phân loài . Nhƣ̃ng dòng nấm đƣơc̣ chia thành 10 nhánh riêng biêṭ. Curran và ctv (1994) đa ̃nghiên cƣ́u mối quan hê ̣phát sinh loài của nấm Metarhizium bằng viêc̣ sƣ̉ duṇg trình tƣ ̣rDNA. Rakotonirainy và ctv (1994) đa ̃phân tích sƣ ̣khác biêṭ về isoenzyme và trình tƣ ̣ của ribosomal RNA trong giống nấm Metarhizium. 2.9.2. Nghiên cƣ́u trong nƣớc Nhƣ̃ng nghiên cƣ́u về sƣ ̣đa daṇg di truyền trong quần thể nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào gen Pr1 và vùng rDNA -ITS ở Việt Nam có rất ít . Phần lớn nhƣ̃ng nghiên cƣ́u về sƣ ̣đa daṇg di truyền của quần thể nấm Metarhizium anisopliae chỉ dừng lại ở mức độ đánh giá hình thái của bào tử hoặc khuẩn lạc . 2.10. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng rDNA-ITS Có nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mô tả đặc điểm những giống Metarhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng 15 không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký chủ. Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của những giống Metarhizium anisopliae lây nhiễm trên côn trùng. Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR), dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S – ITS2. 16 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 26 tháng 3 năm 2007 đến ngày 31 tháng 8 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật - Trung tâm phân tích thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đaị hoc̣ Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh . 3.2. Vật liệu và hoá chất 3.2.1. Vật liệu DNA đƣợc ly trích từ những dòng nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng gây hại cây trồng theo quy trình của Leal, 1994 do anh Nguyễn Văn Lẫm cung cấp và đƣợc trữ ở -20oC . Các mẫu nấm Metarhizium anisopliae đƣợc thu thập và phân lập trên một số côn trùng gây hại ở một số tỉnh thành trong nƣớc. Bảng 3.1: Nguồn nấm Metarhizium anisopliae đƣợc thu thập ở một số địa phƣơng dùng trong thí nghiệm 17 3.2.2. Hoá chất Các hoá chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Công ty Sigma, Promega, Bio-Rad). Hoá chất cho phản ứng PCR (do công ty Promega cung cấp) - Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl - Dung dịch đệm 5X: đi kèm với Taq - dNTP (25 mM) - MgCl2 (25 mM) - Primer 1 (METPR1), primer 2 (METPR4), primer 3 (METPR2), primer 4 (METPR5), primer 5 (ITS 4), primer 6 (ITS 5) Các hoá chất dùng trong điện di: Gel agarose, thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1% agarose. Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện di với thành phần nhƣ sau:  Tris HCl 4,48 g  Na2EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml  Glacial acetic acid 1,14 ml  Nƣớc cất vừa đủ 1 lít Dung dịch nhuộm gel : Ethidium bromide 1%. Ladder 3kb. 3.2.3. Các thiết bị chính Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho một phòng thí nghiệm sinh học phân tử: máy đo pH, máy lắc, máy ly tâm lạnh, máy khuấy từ, bộ điện di ngang HorizonR 558 (Life Technologies), máy PCR (BIO-RAD), máy vortex, máy chụp hình gel Bio –Rad, máy đọc trình tự ABI PRISM 3100, các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl, các loại đầu tip 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl. 3.3. Nội dung nghiên cứu 18 1. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc (gen Pr1 )và vùng rDNA-ITS của nấm Metarhizium anisopliae. 2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của nấm Metarhizium anisopliae dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS và gen Pr1. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Kiểm tra DNA tổng số đƣơc̣ ly trích tƣ̀ các dòng nấm Metarhizium anisopliae. DNA tổng số đƣơc̣ kiểm tra bằng kỹ thuâṭ điêṇ di trên gel agarose 1% với hiêụ điêṇ thế 100V trong 20 phút. 3.4.2. Khuếch đại gen Pr1 Hình 3.1: Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg khuếch đaị gen Pr1 19 Tiến hành hai phản ứng PCR riêng biêṭ với 2 cặp mồi khác nhau. Đầu tiên đoạn DNA đƣợc khuếch đại với cặp primer có trình tự cụ thể nhƣ sau: - METPR1: 5’CAC TCT TCT CCC AGC CGT TC 3’ - METPR4 : 5’GTA GCT CAA CTT CCG CAC TC 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Thành phần hóa chất đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR1/METPR4 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 5X 5 l 1X MgCl2 25 mM 2.5 l 2.5 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0.2 M METPR1 10 pM 1 l 10 pM METPR4 10 pM 1 l 10 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 14.1 l Tổng thể tích 25 l Quy trình PCR khuếch đại gen Pr1 Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Tách đoạn DNA 940C 4 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) -Tách đoạn DNA 940C 1 phút -Ủ bắt cặp 560C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút Kéo dài 720C 6 phút Ủ 40C 10 phút 20 Sau khi có đƣợc sản phẩm của phản ứng PCR lần một, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR lần hai với cặp primer METPR2/METPR5. Trình tự cặp primer METPR2/METPR5. - METPR2: 5’AGG TAG GCA GCC AGA CCG GC 3’ - METPR5 : 5’TGC CAC TAT TGG CCG GCG CG 3’ (Nguồn : Leger St., 1992) Bảng 3.3: Thành phần hóa chất của phản ứng PCR khuếch đại gen Pr1 với căp̣ primer METPR2/METPR5 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 5X 5 l 1X MgCl2 25 mM 2.5 l 2.5 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0.2 M METPR 2 10 pM 1 l 10 pM METPR 5 10 pM 1 l 10 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng Nƣớc 14.1 l Tổng thể tích 25 l Quy trình PCR Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Tách đoạn DNA 940C 4 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) -Tách đoạn DNA 940C 1 phút -Ủ bắt cặp 560C 1 phút - Kéo dài 720C 2 phút Kéo dài 720C 6 phút Ủ 40C 10 phút 21 3.4.3. Khuếch đại vùng ITS Primer đƣợc sử dụng để khuếch đại vùng ITS có trình tự nhƣ sau: - ITS 4: 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’ - ITS 5 : 5’ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3’ Hình 3.2: Sơ đồ primer đƣơc̣ sƣ̉ duṇg khuếch đaị vùng ITS Bảng 3.4: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đaị vùng rDNA-ITS Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 5X 10 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 1.5 mM dNTP 25 mM 0.4 l 0.2 M ITS 4 10 pM 1 l 10 pM ITS 5 10 pM 1 l 10 pM Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 33.4 l Tổng thể tích 50 l 22 Quy trình PCR Các bƣớc Nhiệt độ Thời gian Tách đoạn DNA 950C 3 phút Số chu kỳ lặp lại (37 chu kỳ) - Tách đoạn DNA 950C 1 phút - Ủ bắt cặp 580C 45 giây - Kéo dài 720C 1 phút Kéo dài 720C 5 phút Ủ 40C 10 phút 3.5. Tiến hành giải trình tự gen gây độc Pr1 và vùng ITS trên nấm Metarhizium anisopliae Sau khi chạy PCR chúng tôi tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR vừa khuếch đại để xác định chính xác đây là đoạn gen gây độc Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 nhằm xác định trình tự nucleotide của đoạn gen độc này, từ đó so sánh với nhƣ̃ng trình tƣ ̣trên Genbank . Đầu tiên để đạt đƣợc kết quả cao nên phải tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để việc đọc trình tự đạt kết quả cao. 3.6. Tinh sạch sản phẩm PCR 1.Lấy GFX cho vào ống thu dịch lọc đã khử trùng sạch (số lƣợng GFX tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch). Cho vào GFX 500µl capture buffer. 2.Cho 100 µl sản phẩm PCR vào GFX. 3.Trộn đều lên xuống bằng pipette khoảng 4-6 lần. 4.Ly tâm với tốc độ khoảng 12000 vòng trong 30 giây ở 40C. 5.Loại bỏ dung dịch trong ống thu dịch lọc, sau đó đặt lại GFX vào ống thu dịch lọc. 6.Thêm 500 µl wash buffer vào cột GFX. Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng khoảng 30 giây ở 40C. 7.Loại bỏ ống thu dịch lọc và chuyển GFX sang effpendorf mới. 23 8.Thêm 50 µl elution buffer trực tiếp vào giữa cột GFX. 9.Giữ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút. 10.Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút ở 40C. Sản phẩm tinh sạch đƣợc bảo quản ở- 40C Thành phần của phản ứng đọc trình tự Buffer đƣợc sử dụng ở nồng độ 5X nhƣng nồng độ cuối cùng phải đạt là 1X. Bảng 3.5: Thành phần phản ứng đọc trình tự Thành phần Nồng độ Thể tích(µl) - BDT mix 2,5 X 4 µl - Buffer 5 X 2 µl - Primer 3.2 pmol 1 µl - DNA khuôn 10-40 ng 1 µl - Nƣớc cho đến 10 µl  Quy trình nhiệt của phản ứng PCR trong đọc trình tự. Đối với gene Pr1 1. Đặt tube vào máy PCR và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 960C trong 1 phút. 3. Lặp lại 25 chu kỳ: 960C trong 10 giây. 50 0C trong 5 giây. 60 0 C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. Đối với vùng ITS 1. Đặt tube vào máy và chỉnh đúng các thông số. 2. Biến tính hoàn toàn: 950C trong 5 phút. 3 .Lặp lại 25 chu kỳ: 950C trong 30 giây. 50 0C trong 10 giây. 60 0C trong 4 phút. 4. Giữ ở 40C. 24 3.7. Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự Sản phẩm đọc trình tự đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp EDTA . - Cho 5 µl EDTA vào mỗi eppendorf. - Thêm vào 60 µl ethanol 100% mỗi eppendorf. - Trộn đều lên xuống hỗn hợp vài lần. - Đem ủ mẩu ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút. - Ly tâm tốc độ 12000 vòng trong 30 phút. - Loại bỏ phần dịch bên trên, thêm vào 60µl ethanol 70%. - Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. - Lọai bỏ dịch, thu DNA, làm khô ở nhiệt độ phòng. - Làm tan DNA bằng cách cho vào 2 µl hidiformamide, biến tính 950C trong 3 phút. Chạy điện di và ghi nhận tính hiệu trên máy sequencer ABI PRISM 3100. 3.8. Phƣơng pháp phân tích trình tự Hình 3.3: Sơ đồ những phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong phân tích trình tự 25 Trình tự Sắp gióng cột bằng chƣơng trình ClustalX Gói phần mềm Phylip Seqboot DNApars Consense Chọn ra cây phân loài tốt nhất Hình 3.4: Sơ đồ phân tích trình tƣ ̣có đô ̣tƣơng đồng cao 26 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kiểm tra DNA tổng số của các mẫu nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong nghiên cứu DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 tạp nhiễm Tạt Hình 4.1: DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae Ghi chú: 1.BDTN 6.BDBD7 2.SCLLLA 7.BXDTV 3.RNBT 8.BDTV5 4.RNLA 9.BDQ96 5.BXDTG 10.RBC96 Kết quả điêṇ di cho thấy DNA tổng số của tất cả các dòng nấm dùng trong nghiên cƣ́u đ ƣợc ly trích khá tốt , không xuất hiêṇ hiêṇ tƣơṇg DNA bi ̣ gaỹ hoăc̣ bi ̣ smear. Tuy nhiên vâñ còn xuất hiêṇ tap̣ trong quá trình ly trích . Tạp nhiễm sẽ ảnh hƣởng không tốt tới kết quả của phản ƣ́ng PCR vì se ̃ƣ́c chế phản ứng. Chính vì lý do 27 đó chúng tôi đa ̃tiến hành tinh sac̣h DNA tổng số . Quy trình tinh sac̣h đƣơc̣ thể hiêṇ ở hình 4.2 50 µl DNA +150 µl H2O cất Thêm 120 µl Choloroform :Isoamylalcohol (24:1) Ly tâm 5-10 phút/9000-9800 rpm Thu dic̣h nổi Thêm 120 µl Choloroform :Isoamylalcohol (24:1) Ly tâm 5-10 phút/9000-9800 rpm Thu dic̣h nổi Điêṇ di kiểm tra kết quả Cho 0.6 V isopropanol Cho TE 1X Ủ ở -20oC trong 30 phút Phơi khô mâũ Ly tâm 20 phút/5000 rpm Ly tâm bỏ dic̣h nổi Bỏ dịch nổi Ethanol 70% Ethanol 70% Ly tâm bỏ dic̣h nổi Hình 4.2: Sơ đồ tinh sac̣h DNA tổng số của các mâũ nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong nghiên cƣ́u 28 4.2. Kết quả tinh sac̣h DNA tổng số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hình 4.3: DNA tổng số của nấm Metarhizium anisopliae đƣơc̣ tinh sac̣h Ghi chú: 1.BDTN 6.BDBD7 2.SCLLLA 7.BXDTV 3.RNBT 8.BDTV5 4.RNLA 9.BDQ96 5.BXDTG 10.RBC96 DNA tổng số sau khi đƣơc̣ tinh sac̣h đƣơc̣ kiểm tra bằng điêṇ d i trên gel 1% ở hiêụ điêṇ thế 100V trong 20 phút. Kết quả tinh sac̣h cho thấy không còn xuất hiêṇ tap̣ . Chúng tôi quyết định chọn những mẫu DNA tổng số sau khi đã tinh sạch để thực hiện nhƣ̃ng nghiên cƣ́u tiếp theo. 4.3. Kết quả khếch đại vùng rDNA-ITS 1 2 3 4 5 L 6 7 8 9 10 Hình 4.4: Khuếch đại vùng rDNA-ITS 29 Ghi chú: 1.BDTN 4.BDBD7 2.SCLLLA 5.BXDTV 3.RNBT 6.BDTV5 4.RNLA 7.BDQ96 8.BXDTG 9.RBC96 10.BDBD7 L. Ladder Tất cả các nguồn nấm Metarhizium anisopliae phân lập từ những địa phƣơng khác nhau và trên các đối tƣợng ký chủ khác nhau đều cho sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc giống nhau. Kích thƣớc của sản phẩm khuếch đại là 590 bp. 4.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS1-5.8S - ITS2 Sản phẩm khếch đại đƣợc tinh sạch và đọc trình tự bằng máy ABI PRISM 3100. Nhận xét kết quả: Trình tự của 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc đọc bằng cả hai primer ITS4 và ITS5 đều cho kết quả rõ ràng và ổn định.Tuy nhiên trình tự của mỗi dòng nấm khi đƣợc đọc bằng một primer là không hoàn chỉnh (mất một số nucleotide ở vị trí kết thúc quá trình giải trình tự ). Vì thế chúng tôi đã tiến hành đọc bằng cả hai primer và chọn ra vùng đáng tin cậy nhất để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo. Để đánh giá sự khác biệt về mặt di truyền giữa những dòng Metarhizium anisopliae ở trong nƣớc so với trên thế giới, chúng tôi tiến hành so sánh trình tự của các dòng trong nƣớc với những trình tự thu thập đƣợc trên genbank trong NCBI. Những dòng nấm đƣợc sử dụng trong so sánh đƣợc trình bày trong bảng 4.1 30 Bảng 4.1: Các nguồn nấm Metarhizum anisopliae trên genbank đƣợc dùng để so sánh trình tự vùng rDNA-ITS Trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 đọc đƣợc là 473 nu. Vùng gen 5,8 S có kích thƣớc 158 nu nằm ở vị trí từ nu thứ 138 đến nu thứ 296. Kích thƣớc vùng ITS1 và ITS2 lần lƣợt là 138 nu và 177 nu. Kích thƣớc này giống với kích thƣớc vùng ITS của những nấm gây bệnh trên côn trùng khác đã đƣợc báo cáo nhƣ Beauveria bassiana và Paecilomyces fumosoroseus (Driver và Milner, 1998).Tỷ lệ G+C của vùng ITS1 là 43,2 %, của vùng ITS2 là 59,3 %, của vùng 5,8 S là 45,9 %. Tỷ lệ G+C trên toàn vùng trình tự đọc đƣợc là 51,2 %. Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc đƣơc̣ tạo bởi chƣơng trình Phylip Distance Matrix trong phần mềm ClustalX Ký hiệu Dòng phân lập Nơi phân lập Tác giả Ngày công bố AB071712 AB071714 AF136376 AF137064 AF137065 AF137066 AF516320 AF516324 AY635454 DQ177432 DQ679899 EF051717 EF051721 EF113338 EF113341 M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.lepidiotum M.a.var.lepidiotum M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.anisopliae M.a.var.lepidiotum M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.anisopliae M.a.var.acridum M.a.var.anisopliae Japan Japan Australia Australia Australia Australia Greece Greece Canada China USA Brazil Brazil China China Yazawa,C. và Shimizu,S Yazawa,C. và Shimizu,S Driver và ctv Driver,F. và Milner,R.J Driver,F. and Milner,R.J Driver và ctv Pantou và ctv Pantou và ctv Small,C.-L.N. và ctv Huang,B và ctv Flor,L.B Arruda,W. và ctv Arruda,W. và ctv Guo,L. và Huang,J Guo,L. và Huang,J 18-9-2001 18-9-2001 19-3-1999 25-3-1999 25-3-1999 25-3-1999 29-3-2002 29-3-2002 25-3-2004 23-8-2005 07-6-2006 09-10-2006 09-10-2006 10-10-2006 10-10-2006 31 Bảng 4.2: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc khi so sánh trình tƣ ̣vùng rDNA-ITS BDQ96 BXDTV BDTN BDTV5 SCLLLA RNBT RNLA BDBD7 BXDTG RBCQ9 BDQ96 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BXDTV 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDTN 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDTV5 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 SCLLLA 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 RNBT 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 RNLA 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BDBD7 100 100 100 100 100 100 100 100 99 99 BXDTG 99 99 99 99 99 99 99 99 100 100 RBCQ9 99 99 99 99 99 99 99 99 100 100 Kết quả so sánh cho thấy sự giống nhau cao về trình tƣ ̣nucleotide trong vùng rDNA-ITS (99-100%) giƣ̃a các dòng nấm . Nhƣ vây có sƣ ̣tƣơng đồng cao về mặt di truyền giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae. Tuy nhiên có sự khác biệt giữa dòng BXDTG và RBCQ9 với những dòng còn lại. Sự khác biệt giữa BXDTG và RBCQ9 với những dòng còn lại là 1%. Chúng tôi đã phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở hai dòng BXDTG và RBCQ9 so với những dòng còn lại. Đó là đột biến thay thế T bằng C ở vị trí Nu thứ 32 , đột biến thêm T ở vị trí nu thứ 109 và 122, đột biến còn lại là thêm một A ở vị trí nu thứ 133. Những đột biến này rất có ý nghĩa trong việc chọn lọc những dòng nấm có hoạt tính mạnh trong việc tiêu diệt côn trùng có hại. Sự tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các dòng BDTN, BDTV5, BDBD7 và BDQ96, giữa RNLA và RNBT là 100% . Những dòng nấm này gây bệnh trên cùng một ký chủ là bọ dừa và rầy nâu nhƣng lại có sự khác biệt về vị trí địa lý nhƣ Bình Định, Trà Vinh, Tây Ninh, Bến Tre và Quận 9-Thành phố Hồ chí minh. Điều này cho thấy sự khác biệt về vị trí địa lý không ảnh hƣởng tới sự đa dạng về mật di truyền giữa những dòng nấm với nhau. 32 Mặt khác kết quả so sánh cũng cho thấy sự khác biệt giữa RNLA và SCLLLA là 0%. Những dòng nấm này có cùng nơi phân bố là Long An nhƣng lại gây bệnh trên các ký chủ khác nhau là rầy nâu và sâu cuốn lá. Nhƣ vậy sự khác biệt về ký chủ không là yếu tố ảnh hƣởng tới sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc. Sử dụng ph ƣơng pháp Bootstrap Maximum Parsimony trong gói phần mềm Phylip chúng tôi xác định đƣợc cây phân nhánh di truyền tốt nhất giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae với 100 lần lăp̣ laị. Đơn vi ̣ di truyền 0.1 Hình 4.5: Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS Có sự phân nhánh giữa các dòng nấm trong nƣớc với nhau: Nhóm I gồm các dòng : RNBT, BXDTV, SCLLLA, RNLA, BDTV5, BDTN, BDBD7 và BDQ96. Các dòng này không có sự khác biệt về trình tự trong vùng rDNA - ITS. Nhóm II gồm các dòng :BXDTG và RBCQ9 với 1% sƣ ̣khác biêṭ so với nhƣ̃ng dòng còn lại. Vùng ITS1-5.8S-ITS2 của nấm bao gồm vùng bảo tồn 5.8S nên không có ý nghĩa nhiều trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền và 2 vùng biến động là ITS1 và 33 ITS2. Kết quả so sánh ở trên cho thấy toàn bộ những điểm đột biến đều nằm trong vùng ITS1 và không có sự khác biệt trong vùng ITS2. Nhƣ vậy so với vùng ITS2, vùng ITS1 có sự biến động hơn so với vùng ITS1. Kết quả này cũng phù hơp̣ với nghiên cƣ́u của Hershkovitz và Lewis ,1996; Kuninaga và ctv , 1997 và Zare và ctv , 1999. Do đó chúng tôi tiến hành so sánh trình tự vùng ITS1. Tỉ lệ đột biến trong vùng ITS1 là 2.9% (4/139 nu), đó đều là những điểm đột biến xảy ra ở 2 dòng BXDTG và RBCQ9. Do sƣ ̣tƣơng đồng về trình tƣ ̣giƣ̃a các dòng RNBT, BXDTV, SCLLLA, RNLA, BDTV5, BDTN, BDBD7 và BDQ 96 là 100% nên chúng tôi tiến hành choṇ ra môṭ dòng đại diện để tiến hành so sánh với các dòng nấm Metarhizium anisopliae có trên genbank. Ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm đƣơc̣ thiết lâp̣ dựa vào chƣơng trình Draw N-J trong phần mềm ClustalX. Bảng 4.3: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dựa vào trình tự vùng rDNA-ITS 34 Có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền giữa các dòng trong nƣớc với những dòng trên thế giới, tỉ lệ thấp nhất là 92% và cao nhất là 100%.Chúng tôi nhận thấy toàn bộ những dòng nấm trong nƣớc có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền (99%-100%) so với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣợc phân lập tại nhiều quốc gia khác nhau, trên những ký chủ khác nhau. Nhƣ vậy chúng tôi khẳng định những dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài là dòng Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Cây phân loài đƣợc dựng bằng chƣơng trình Draw N-J Tree trong phần mềm ClustalX Đơn vị di truyền là 0.01 Hình 4.6: So sánh quan hê ̣giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào trình tự vùng rDNA-ITS Những dòng nấm đƣợc chia thành 3 nhóm: Nhóm I : Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Những dòng nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài đều thuộc nhóm này. 35 Nhóm II: Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. acridum. Nhóm II: Dòng nấm Metarhizium anisopliae var. lepidiotum. Hầu hết nhƣ̃ng dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣơc̣ sƣ̉ duṇg trong đề tài có quan hê ̣gần với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae đƣơc̣ phân lâp̣ tƣ̀ Trung Quốc . Viêṭ Nam và Trung Quốc có khoảng cách điạ lý gần nhau do đó không có sƣ ̣khác biêṭ lớn về trình tƣ ̣nucleotide trong vùng rDNA -ITS. Tuy nhiên 2 dòng BXDTG và RBCQ 9 lại có độ tƣơng đồng cao với dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae có nguồn gốc từ Australia . Nhƣ vâỵ có thể 2 dòng nấm này của Việt Nam có quan hệ gần với những dòng phụ Metarhizium anisopliae var anisopliae có nguồn gốc tƣ̀ Australia. Sau khi xác định đƣợc các dòng nấm dùng trong đề tài thuộc dòng phụ Metarhizium anisopliae var. anisopliae, chúng tôi tiến hành so sánh với những dòng Metarhizium anisopliae var anisopliae trên thế giới nhằm tìm hiểu xem có xảy ra sự đột biến giữa các dòng nấm của Việt Nam so với các dòng trên thế giới hay không. Kết quả so sánh đƣợc trình bày trong phần phụ lục 1. Chúng tôi đã tìm thấy có 4 vị trí có sự khác biệt về trình tự nucleotide giữa nhƣ̃ng dòng nấm của Việt Nam (đƣợc sử dụng trong đề tài) so với thế giới. Nhƣ̃ng đôṭ biến đầu tiên xảy ra đối với dòng BXDTG và RBCQ9 gồm thêm 1 nu T tại vị trí nu thứ thứ 100 và 173 và thêm môṭ nu A xảy ra tại vị trí nu thứ 174 so với trình tƣ ̣của các dòng khác Và vị trí đột biến quan troṇg là đột biến thay thế A bằng G ở vị trí nu thứ 417. Bởi vì đột biến này xảy ra trên tất cả những dòng nấm của Việt Nam và đaị diêṇ cho sƣ ̣khác biêṭ về trình tƣ ̣nucleotide giƣ̃a dòng nấm Metarhizium anisopliae của Việt Nam so với thế giới. 36 4.5. Kết quả khuếch đại gen Pr1 1 2 3 4 5 M L 6 7 8 9 10 1.2 kb Hình 4.7: Khuếch đại gen Pr1 Ghi chú: 1.BDTN 4.BDBD7 2.SCLLLA 5.BXDTV 3.RNBT 6.BDTV5 4.RNLA 7.BDQ96 8.BXDTG 9.RBC96 10.BDBD7 L. Ladder M.BXDTG 1.5kb Sản phẩm thu đƣợc là một đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1.2 kb. Sản phẩm đƣợc tạo ra trên toàn bộ 10 mẫu nấm. Điều này chứng có tất cả những mẫu nấm Metarhizium anisopliae đƣợc sử dụng trong đề tài đều có gen Pr1. 4.6. Kết quả đọc trình tự gen Pr1 Sản phẩm khếch đại đƣợc tinh sạch và đọc trình tự bằng máy ABI PRISM 3100 với cặp primer METPR2/METPR5, là cặp primer nằm bên trong cặp primer METPR1/METPR4. 37 Nhận xét: Trình tự đƣợc đọc bằng cặp primer METPR2/METPR5 có tín hiệu không ổn định ở đầu và cuối của trình tự. Trình tự khi đƣợc đọc bằng một primer là không hoàn chỉnh. Chúng tôi đã tiến hành đọc bằng hai primer và chọn ra vùng đáng tin cậy để tiến hành những nghiên cứu tiếp theo. Trong 10 mẫu đƣợc đem đọc trình tự chúng tôi nhận thấy có 3 mẫu: BXDTG, RBCQ9 và BDBD7 trình tự có nhiều sai sót trong quá trình đọc nên không đạt độ tin cậy. Do đó chúng tôi loại bỏ 3 mẫu trên. Trình tự của 7 mẫu còn lại đƣợc sử dụng trong những nghiên cứu tiếp theo. Trình tự của các nguồn nấm trên genbank đƣợc sử dụng trong các phân tích tiếp theo có thông tin cụ thể đƣợc nêu ở bảng 4.3. Trình tự của các mẫu nấm đƣợc tiến hành so sánh bằng phần mềm ClustalX. Bảng 4.4: Các nguồn nấm Metarhizum anisopliae trên genbank đƣợc dùng để so sánh trình tƣ ̣gen Pr1 Ký hiệu Dòng phân lập Nơi phân lâp̣ Tác giả Ngày công bố AY389128 M.a.var.anisopliae Taiwan Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389132 M.a.var.anisopliae USA Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389127 M.a.var.anisopliae Finland Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389122 M.a.var.anisopliae China Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389129 M.a.var.anisopliae UK Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389126 M.a.var.anisopliae Ethiopia Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY289123 M.a.var.anisopliae China Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389119 M.a.var.anisopliae Austria Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389121 M.a.var.anisopliae Brazil Wang,C.và ctv 12-9 -2003 AY389133 M.a.var.anisopliae USA Wang,C.và ctv 12-9 -2003 38 Trên cở sở có kết quả của sự so sánh chúng tôi đã thiết lập đƣợc ma trận khoảng cách giữa các dòng nấm với nhau dựa vào chƣơng trình Draw N-J trong phần mềm ClustalX. Kết quả so sánh đƣơc̣ trình bày trong phần phu ̣luc̣ 2 Bảng 4.5: Ma trận khoảng cách giữa các dòng Metarhizium anisopliae trong nƣớc dƣạ vào trình tự gen Pr1 BDTV5 RNLA RNBT BDTN BXDTV BDQ96 SCLLLA BDTV5 100 100 99 99 99 99 95 RNLA 100 100 99 99 99 99 95 RNBT 99 99 100 99 99 99 95 BDTN 99 99 99 100 100 100 95 BXDTV 99 99 99 100 100 100 95 BDQ96 99 99 99 100 100 100 95 SCLLLA 95 95 95 95 95 95 100 Kết quả so sánh cho thấy: Có sự khác biệt về trình tự nuleotide giữa dòng SCLLLA với những dòng còn lại. Sự khác biệt chiếm khoảng 5% (54nu/1091nu) .Điều này có thể đƣợc giải thích là dòng SCLLLA đƣợc phân lập trên sâu cuốn lá thuộc Cánh vảy (Lepidoptera) trong khi đó những dòng nấm còn lại đƣợc phân lập trên bọ dừa, rầy nâu và bọ xít đen thuộc bộ cánh cứng (Coleoptera), do đó có sự khác biệt về mặt ký chủ . Nhƣ vậy sự khác biệt về mặt ký chủ đã ảnh hƣởng tới sự đa dạng về mặt di truyền của gen Pr1. Cây phát sinh loài giữa các dòng Metarhizium anisopliae đƣợc dựng bằng chƣơng trình Bootstrap Maximum Parsimony cũng đã cho thấy mức độ tƣơng đồng giữa những dòng nấm . 39 Đơn vị di truyền: 10 Hình 4.8: Cây phát sinh loài giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae dƣạ vào trình tự gen Pr1 Với mục đích nghiên cứu sự đa dạng của gen Pr1 giữa những dòng trong nƣớc với những dòng trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành so sánh với những trình tự thu thập trên genbank. Các nguồn nấm đƣợc sử dụng trong so sánh đƣợc thể hiện trong bảng 4.4. Kết quả so sánh cho thấy sự tƣơng đồng cao giữa những dòng nấm trong nƣớc và các dòng trên genbank. Tỉ lệ tƣơng đồng cao nhất là 99% và tỉ lệ tƣơng đồng thấp nhất là 94%. Chúng tôi đã phát hiện đƣợc một s ố vị trí đột biến trong một số dòng so với quần thể . Trong đó đối với dòng RNBT chúng tôi đa ̃tìm thấy có 5 vị trí đột biến bao gồm chèn môṭ nu G ở vi ̣ trí 197, thay nu C bằng G ở vi ̣ trí 906 và thay nu C bằng T ở 3 vị trí : 872, 943, 922. Còn ở hai dòng BDTV 5 và RNLA xuất hiêṇ 4 vị trí đột biến. 2 đôṭ biến thay C bằng G ở vi ̣ trí nu thƣ́ 943 và 1039, 1 đôṭ biến thay thế G bằng T ở vi ̣ trí 861 và một đột biến thay C bằng A ở vị trí nu 926. Trong dòng BDQ96 có môṭ đôṭ biến ở vi ̣ trí 922 và kiểu đột biến là thay thế môṭ nu C bằng môṭ nu T. 40 Bảng 4.6: Ma trâṇ khoảng cách giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và trên thê giới dựa vào trình tự gen Pr1 Chúng tôi cũng nhận thấy có sự khác biệt về trình tự xảy ra ở 6 dòng nấm của Viêṭ Nam so với thế giới ngoaị trƣ̀ dòng SCLLLA . Nhƣ̃ng sƣ ̣khác biêṭ xảy ra ở 6 vị trí trên toàn bô ̣trình tƣ ̣của gen Pr1, chiếm tỉ lê ̣0.6%. Sƣ ̣khác biêṭ đầu tiên mà chúng tôi nhâṇ thấy là taị vi ̣ trí nu thƣ́ 217, tại vị trí này có sự thay thế một nu T bằng một nu G . Nhƣ̃ng đôṭ biến tiếp theo xảy ra ở các vi ̣ trí : 583, 974 với các kiểu đôṭ biến là thay t hế giƣ̃a nu A và C , giƣ̃a A và T ở vi ̣ trí 637 và 1055.Và đột biến cuối cùng xảy ra ở vị trí nu thƣ́ 754, tại đây 1 nu G đƣơc̣ thay bằng 1 nu C. Nhƣ̃ng đôṭ biến này có thể đƣơc̣ hình thành trong quá trình phát sinh bào tử dƣới ảnh hƣởng của các yếu tố bên ngoài . Kết quả khác biệt giữa các mẫu nấm Metarhizium anisopliae của Việt Nam so với thế giới là điều hoàn toàn có thể xảy ra . Bởi lẽ, vị trí địa lý có sự khác biệt rất lớn về điều kiện tự nhiên, khí hậu và thời tiết. Bản thân các nguồn nấm genbank cung cấp cũng có sự khác biệt. Điều đó chứng tỏ có nhiều yếu tố ảnh hƣởng đến sự đa dạng di truyền của gen Pr1, cụ thể nhƣ vị trí địa lý, ký chủ, cây trồng. 41 Cây phát sinh loài đƣợc vẽ bằng chƣơng trình Bootstrap Maximum Parsimony trong gói phần mềm Phylip với 100 lần lăp̣ laị. Đơn vi ̣ di truyền là 10 Hình 4.9: So sánh quan hê ̣ giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc và thế giới dƣạ vào trình tự gen Pr1. Các dòng nấm của Việt Nam và thế giới đƣợc chia làm 2 nhóm: - Nhóm I: gồm những dòng Metarhizium anisopliae đƣợc phân lập tại Việt Nam. - Nhóm II: gồm những dòng Metarhizium anisopliae đƣợc phân lập tại nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên do trong quá trình đọc trình tự gen Pr1 không hoàn toàn do đó việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền dựa vào trình tự gen Pr1 còn nhiều hạn chế. 42 Chƣơng 5. KẾT LUÂṆ VÀ ĐỀ NGHI ̣ 5.1. Kết luâṇ 5.1.1. Phát hiện và đọc trình tự gen Pr1 Xác định đƣợc gen gây độc Pr1 của 10 dòng nấm Metarhizium anisopliae. Kích thƣớc của gen Pr1 sau khi đƣơc̣ đoc̣ bằng 2 primer METPR2/METPR5 là 1091 bp. Có sự tƣơng đồng cao về mặt di truyền của gen Pr1 giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisoplise trong nƣớc. Tỉ lệ tƣơng đồng c ao nhất là 100% và thấp nhất là 95%. Xác định đƣợc sự khác biệt giữa dòng SCLLLA với những dòng còn lại . Tỉ lệ khác biệt chiếm 5% (54/1091). Xác định đƣợc sự khác biệt về trình tự của 6 dòng nấm trong nƣớc so với thế giới bao gồm các dòng BDTV5, RNLA, RNBT, BDTN, BXDTV, BDQ96. Tỉ lệ tƣơng đồng giữa các dòng nấm Metarhizium anisopliae so với nhƣ̃ng dòng trên genbank khá cao. Tỉ lệ này nằm trong khoảng 94%-99%. 5.1.2. Phát hiện và đọc trình tự vùng rDNA-ITS. Trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 đọc đƣợc có kích thƣớc là 473 nu. Vùng gen 5,8 S có kích thƣớc 158 nu. Kích thƣớc vùng ITS1 và ITS2 lần lƣợt là 138 nu và 177 nu..Tỷ lệ G+C của vùng ITS1 là 43,2 %, của vùng ITS2 là 59,3 %, của vùng 5,8 S là 45,9 %. Tỷ lệ G+C trên toàn vùng trình tự đọc đƣợc là 51,2 %. Phát hiện đƣợc 4 vị trí đột biến ở hai dòng BXDTG và RBCQ9 so với những dòng còn lại. Đó là đột biến thay thế T bằng C ở vị trí Nu thứ 32 , đột biến thêm T ở vị trí nu thứ 109 và 122, đột biến còn lại là thêm một nu A ở vị trí nu thứ 133. 43 Tỉ lệ đột biến trong vùng ITS1 là 2.9% (4/139 nu), đó đều là những điểm đột biến xảy ra ở 2 dòng BXDTG và RBCQ9. Sƣ ̣tƣơng đồng cao giƣ̃a các dòng nấm Metarhizium anisopliae trong nƣớc so với các dòng trên thế giới .Tuy nhiên có 5 vị trí xảy ra đột biến giữa dòng nấm của Việt Nam (đƣợc sử dụng trong đề tài) so với thế giới, chiếm tỷ lê ̣1%. 5.2. Đề nghi ̣. Tiến hành đoc̣ trình tƣ ̣gen Pr1 của nhiều mẫu nấm Metarhizium anisopliae khác nhau trong cả nƣớc nhằm đánh giá mối quan hê ̣giƣ̃a hoaṭ lƣc của enzyme Protease với sƣ ̣thay đổi trong trình tƣ ̣nucleotide của gen Pr1. Tìm hiểu sự khác biệt về trình tự trong vùng rDNA -ITS với sƣ ̣thay đổi về tính đôc̣ của nấm Metarhizium anisopliae. Sƣ̉ duṇg thêm nhƣ̃ng phƣơng pháp nghiên cƣ́u đa daṇg di truyền khác nhƣ RAPD, AFLP, RFLP….nhằm đánh giá chính xác mối quan hê ̣về măṭ di truyền giƣ̃a các dòng nấm với nhau. 5.3. Hạn chế của đề tài Do trình tƣ ̣gen Pr1 đƣơc̣ đoc̣ không hoàn chỉnh do đó viêc̣ so sánh còn haṇ chế . Chƣa so sánh đƣợc trình tự lúc bắt đầu và kết thúc quá trình đọc. 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bùi Chí Bửu-Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. TP.Hồ Chí Minh. Trang 195 – 236. 2. Nguyễn Lân Dũng, 1981. Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại cây trồng. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 197 – 206. 4. Nguyễn Thị Thƣ Hƣơng, 2004. Xác định gen gây độc của nấm Metarhizium ký sinh trên sâu hại cây trồng bằng kỹ thuật PCR. Luận án thạc sĩ. Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Trang 7 –30. 5. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật có ích tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. Trang 49 – 90. 6. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Trang 140 – 145. 7. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. Trang 19 – 44. 8. Lƣu Phúc Lơị , 2005. Bài giảng sinh tin học ứng dụng phần II .Trƣờng Đaị Hoc̣ Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 45 9. Nguyêñ Thi ̣ Tiến Si ̃ , 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiêp̣. Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 10. Huỳnh Ngọc Phƣơng , 2005. Xác điṇh gen gây đôc̣ và tính đa daṇg di truyền của nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng. Luận văn tốt nghiêp̣ . Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 11. Soraya C.M.L., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1997. Amplification and restriction endonuclease digestion of the Pr1 gene for the detection and characterization of Metarhizium strains. Mycological research 101 (3): 257 – 265 12. Chengshu Wang, Milton A. Typas, Tarig M. Butt.,2002.Detection and characterisation of Pr1 virulent gene deficienciens in the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters 213 (2002): 251-255. 13.Chikako Yazawa and Susumu Shimiz,2002.Sequence Comparison of the 5.8S rDNA Region with the Flanking among Metarhizium anisopliae and the Related species. Journal of Insect Biotechnology and Sericology 71,55-59. 14.Savita Bagga, Gang Hu, Steven E.Screen, Raymond J. ST.Leger.Reconstructing the diversification of subtilisins in the pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. An international journal on genes and genomes, gene 324(2004), 159-169. 15. M.S.Rakotoninainy, M.L.Cariou, Y.Brygoo and G.Riba. Phylogenetic relationships within the genus Metarhizium anisopliae on 28S rRNA sequences and isozyme comparison. Mycol.Res.98:225-230. 16. Chengshu Wang, Anke Skrobek, Tariq M. Butt. Concurrence of losing a chromosome and the ability to produce destruxins in a mutant of Metarhizium anisopliae .FEMS microbiology Lettters 226 (2003) 373-378. 46 17. Savita Bagga, Gang Hu, Steven E. Screen, Raymond J. St.Leger. Reconstructing the diversification of subtilisins in the pathogenic funfus Metarhizium anisopliae. Gene 324(2004) 159-169. 18. Leal S.C.M., Bertioli D.J., Butt T.M., Carder J.H., Burrows P.R., and Feberdy J.F., 1994. Characterization of isolates of the entomopathogenic fungus Metarrhizium anisopliae by RAPD – PCR. Mycological Research 98: 1077 – 1081. 19. Berbee, M. L., Yoshimura A., Sugiyama J., and Taylor J. W., 1995. Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylogeny in the family Trichocomaceae from 18S, 5.8S and ITS ribosomal sequence data. Mycologia 87: 210-222. 20. Joshi L., Leger R.J.St., and Roberts D.W., 1997. Isolation of a cDNA encoding a novel subtilisin – like protease (Pr1B) from the enthomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae using differential display RT-PCR. Gene 197: 1 – 8. 21. Marilena Aquino de Muro, Samina Mehta, David Moore, 2003.The use of amplified fragment length polymorphism for molecular analysis of Beauveria bassiana isolates from Kenya and other countries, and their correlation with host and geographical origin. FEMS Microbiology Letters 229: 249-257 22. N.D.Pipe, D.Chandler, B.W.Bainbridge and J.B.Heale, 1995. Restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal RNA gene complex of isolates of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae.Mycol.Res 99: 485-491 23. Malena P. Panton, Annoula Mavridou, Milton A.Typas, 2002. IGS sequence variation, group-I introns and the complete nuclear ribosomal DNA od entomopathogenic fungus Metarhizium: excellent tools for isolate detection and phylogenetic analysis. Fungal Genetics and Biology 38 (2003) 159-174. 23. MJ Bidochka, CL Small. Phylogeography of Metarhizium, an insect pathogenic fungus. Ecology and evolution, 28-50. 47 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Kết quả sắp gióng côṭ triǹh tƣ ̣các dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào triǹh tƣ ̣vùng rDNA-ITS. BDTN CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC 50 BDTV5 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC BDQ96 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC BDBD7 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC RNBT CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC RNLA CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC BXDTV CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC EF113339 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC SCLLLA CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC EF113341 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC BXDTG CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC RBCQ9 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC AF136376 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC EF051717 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC EF051721 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATCATACCTTTAATTGTTGC AF516320 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC DQ679899 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC AB071714 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC AB071712 CCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTG-AATTATACCTTTAATTGTTGC **************************** *** ***************** BDTN TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- 100 BDTV5 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- BDQ96 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- BDBD7 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- RNBT TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- 48 RNLA TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- BXDTV TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- EF113339 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- SCLLLA TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- EF113341 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- BXDTG TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTT RBCQ9 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTT AF136376 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- EF051717 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCGAACCTTCTGAATTTTTT- EF051721 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCGAACCTTCTGAATTTTTT- AF516320 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- DQ679899 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- AB071714 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- AB071712 TTCGGCGGGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTT- ******************************* ***************** ITS1 5.8S BDTN AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC 150 BDTV5 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC BDQ96 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC BDBD7 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC RNBT AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC RNLA AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC BXDTV AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC EF113339 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC SCLLLA AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC EF113341 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC BXDTG AATAAGTATCTTCTGAGTGGTTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC RBCQ9 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTTTAAAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC AF136376 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC EF051717 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT---AAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC EF051721 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT---AAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC AF516320 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAA-TGAATCAAAACTTTCAAC DQ679899 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT--AAAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC AB071714 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT---AAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC AB071712 AATAAGTATCTTCTGAGTGGTT---AAAAAAATGAATCAAAACTTTCAAC ********************** ****** ****************** 49 BDTN AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA 200 BDTV5 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA BDQ96 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA BDBD7 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA RNBT AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA RNLA AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA BXDTV AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA EF113339 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA SCLLLA AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA EF113341 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA BXDTG AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA RBCQ9 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AF136376 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA EF051717 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA EF051721 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AF516320 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA DQ679899 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AB071714 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA AB071712 AACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATA ************************************************** BDTN AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 250 BDTV5 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA BDQ96 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA BDBD7 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA RNBT AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA RNLA AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA BXDTV AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA EF113339 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA SCLLLA AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA EF113341 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA BXDTG AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA RBCQ9 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA AF136376 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA EF051717 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA 50 EF051721 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA AF516320 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA DQ679899 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA AB071714 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA AB071712 AGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACA ************************************************** 5.8S ITS2 BDTN TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC 300 BDTV5 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC BDQ96 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC BDBD7 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC RNBT TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC RNLA TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC BXDTV TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC EF113339 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC SCLLLA TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC EF113341 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC BXDTG TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC RBCQ9 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC AF136376 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC EF051717 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC EF051721 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC AF516320 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC DQ679899 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC AB071714 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC AB071712 TTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGC ************************************************** BDTN CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT 350 BDTV5 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT BDQ96 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT BDBD7 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT RNBT CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT RNLA CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT BXDTV CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT EF113339 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT 51 SCLLLA CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT EF113341 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT BXDTG CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT RBCQ9 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT AF136376 CCCTCAAGTCCCCTGTGGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT EF051717 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT EF051721 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT AF516320 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT DQ679899 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT AB071714 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT AB071712 CCCTCAAGTCCCCTGTGG-ACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTT ****************** ******************************* BDTN TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC 400 BDTV5 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC BDQ96 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC BDBD7 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC RNBT TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC RNLA TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC BXDTV TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC EF113339 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC SCLLLA TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC EF113341 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC BXDTG TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC RBCQ9 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC AF136376 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC EF051717 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC EF051721 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC AF516320 TCCAGCGCAGCCGTCCCTCAAATCAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC DQ679899 TCCAGCACAGCCGTCCCTCAAATCAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC AB071714 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC AB071712 TCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCC ****** *********** **** ************************** BDTN TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC 450 BDTV5 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC 52 BDQ96 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC BDBD7 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC RNBT TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC RNLA TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC BXDTV TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC EF113339 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC SCLLLA TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC EF113341 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC BXDTG TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC RBCQ9 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC AF136376 TCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC EF051717 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC EF051721 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC AF516320 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC DQ679899 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC AB071714 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC AB071712 TCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCCGGCGCGGTCCACTGC **************** ********************************* BDTN CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- 473 BDTV5 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- BDQ96 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- BDBD7 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- RNBT CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- RNLA CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- BXDTV CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- EF113339 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- SCLLLA CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- EF113341 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- BXDTG CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- RBCQ9 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- AF136376 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- EF051717 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- EF051721 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- AF516320 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- DQ679899 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- 53 AB071714 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- AB071712 CGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAG------- ************************* Dấu * biểu thị sự tƣơng đồng giữa các dòng so sánh, vùng in đậm là 5.8S, trình tự đƣợc gạch chân thể hiện sự đột biến. 54 Phụ lục 2. Kết quả sắp gióng côṭ triǹh tƣ ̣các dòng nấm Metarhizium anisopliae var. anisopliae trong nƣớc và trên thế giới dƣạ vào triǹh tƣ ̣gen Pr1. BDTV5 --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA 50 RNLA --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA RNBT --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA BDTN --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA BXDTV --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA BDQ96 -------------------------AGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389121 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389133 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA SCLLLA --------------------------GGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389128 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCAGACAA AY389132 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389119 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCAGACAA AY389123 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCAGACAA AY389126 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCAGACAA AY389122 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389129 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA AY389127 GAGCCAGCTCCTCTCTTCACTCCTCAGGCTGAGAGCATCATTGCCGACAA ****************** ***** BDTV5 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA 100 RNLA GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA RNBT GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA BDTN GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA BXDTV GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA BDQ96 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA AY389121 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA AY389133 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA SCLLLA GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389128 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389132 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGATA AY389119 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389123 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389126 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA 55 AY389122 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389129 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA AY389127 GTATATTGTCAAGTTCAAGGATGATATTGCCCGTATCGCTACCGATGACA ************************************************ * BDTV5 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC 150 RNLA CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC RNBT CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC BDTN CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC BXDTV CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC BDQ96 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389121 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389133 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC SCLLLA AGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389128 AGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389132 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389119 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389123 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389126 CGGTGAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389122 CGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389129 CGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC AY389127 CGGTCAGCGCTCTTACCTCCAAAGCCGACTTCGTTTACGAGCACGCCTTC *** ********************************************* BDTV5 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG 200 RNLA CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG RNBT CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCGGTG BDTN CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG BXDTV CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG BDQ96 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389121 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389133 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG SCLLLA CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389128 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389132 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389119 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG 56 AY389123 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389126 CACGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389122 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389129 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG AY389127 CATGGGTTTGCAGGCTCCCTCACCAAGGAGGAGCTGAAGATGCTTCG-TG ** ******************************************** ** BDTV5 AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA 250 RNLA AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA RNBT AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA BDTN AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA BXDTV AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA BDQ96 AGCACCCCGGTGTAAGGACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAA AY389121 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG AY389133 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG SCLLLA AGCACCCCGGTGTAAGTTCCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG AY389128 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG AY389132 AGCACCCCGGTGTAAGCACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG AY389119 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGAG AY389123 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGAG AY389126 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAAGGAG AY389122 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGAG AY389129 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGAG AY389127 AGCACCCCGGTGTAAGTACCCCCTCCCACTTACCTAGGTAGTCAAGGGAG **************** **************************** **** BDTV5 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG 300 RNLA ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG RNBT ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG BDTN ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG BXDTV ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG BDQ96 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG AY389121 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG AY389133 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG SCLLLA ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG AY389128 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTCGATTTCATTG 57 AY389132 ACATGTAGTTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCGCCATAGGTTGATTTCATTG AY389119 ACATGTAGGTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTG AY389123 ACATGTAGGTGTTTGTTCCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATCTCATTG AY389126 ACATGTAGTTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCACCATAGGTCGATTTCATTG AY389122 ACATGCAGGTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTG AY389129 ACATGTAGGTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTG AY389127 ACATGTAGGTGTTTGTTGCTGACCCGCTGCCCCATAGGTCGATTTCATTG ***** ** ******** ************ ******** *** ****** BDTV5 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT 350 RNLA AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT RNBT AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT BDTN AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT BXDTV AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT BDQ96 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389121 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389133 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT SCLLLA AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389128 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389132 AGAAGGACGCCTTGATGCGTATCAGCGGCCTCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389119 AGAAGGACGCCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389123 AGAAGGACGCCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389126 AGAAGGACGCCGTGATGCGTATCAGCAGCTTCACTGACCAGAGCGGTGCT AY389122 AGAAGGACGCCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389129 AGAAGGACGCCGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT AY389127 AGAAGGACGCTGTGATGCGTATCAGCGGCATCACTGAGCAGAGCGGTGCT ********** ************** ** ******* ************ BDTV5 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT 400 RNLA CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT RNBT CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT BDTN CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT BXDTV CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT BDQ96 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT AY389121 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAGTAAGGGAAGCACCACCT 58 AY389133 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAGTAAGGGAAGCACCACCT SCLLLA CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCT AY389128 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAGTAGGGGAAGCACCACCT AY389132 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAGGGGAAGCACCACCT AY389119 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAAGGGAAGCACCACCT AY389123 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAAGGGAAGCACCACCT AY389126 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAATAAGGGAAGCACCACCT AY389122 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCACACCGCCAGAAGGGAAGCACCACCT AY389129 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCACACCGCCAGAAGGGAAGCACCACCT AY389127 CCCTGGGGTCTTGGGCG-CATCTCTCACCGCAGTAAGGGAAGCACCACCT ***************** ****** ****** * ************** BDTV5 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC 450 RNLA ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC RNBT ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC BDTN ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC BXDTV ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC BDQ96 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389121 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTCAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389133 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTCAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC SCLLLA ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389128 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389132 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389119 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389123 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389126 ATCGCTACGATGATAGTGCCGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389129 ATCGCTACGATGATAGTGCCGGTGAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC AY389127 ATCGCTACGATGATAGTGCTGGTCAGGGTACTTGCGTATATATCATTGAC ******************* *** ************************** BDTV5 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA 500 RNLA ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA RNBT ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA BDTN ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA BXDTV ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA BDQ96 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCAGTCAAAATTCCATA 59 AY389121 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCAAAACTCCATA AY389133 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCAAAACTCCATA SCLLLA ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCAAAACTCCATA AY389128 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCAAAACTCCATA AY389132 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCAAAACTCCATA AY389119 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCAAAACTCCATA AY389123 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCAAAACTCCATA AY389126 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGTCAAAACTCCATA AY389122 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCAAAACTCCATA AY389129 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGCCAAAACTCCATA AY389127 ACTGGTATTGAGGCCTCCCACCCCGTAAGTTGTGCCGGCAAAACTCCATA *********************************** * ***** ****** BDTV5 GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC 550 RNLA GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC RNBT GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC BDTN GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC BXDTV GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC BDQ96 GTGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389121 GTGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389133 GTGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC SCLLLA GGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389128 GGGAGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389132 GGGCGGAGTAGGAAATTTAACAATATCATCCAGGAGTTTGAGGGTCGCGC AY389119 GTGCGGAGTAGGAAATTTACCAATATCATCCAGGAGTTTCAGGGTCGCGC AY389123 GTGCGGAGTAGGAAATTTACCAATATCATCCAGGAGTTTCAGGGTCGCGC AY389126 GTGCGGAGTAGAAAATTTACCAATATCATCCAGGAGTTTCAGGGTCGCGC AY389122 GTGCGGAGTAGGAAATTTACCAATATCATCCAGGATTTTGGGGGTCGCGC AY38

Các file đính kèm theo tài liệu này:

TRAN NHAT NAM.pdf