Khóa luận Nghiên cứu sản xuất acid acetic theo phương pháp lên men nhanh bằng nguồn nguyên liệu tự nhiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC dôc KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ACID ACETIC THEO PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN NHANH BẰNG NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỰ NHIÊN Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS.TRỊNH VĂN DŨNG MAI THANH THẬT MSSV: 01126146 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Độc Lập - Tự do - Hạnh Phúc …oOo… …oOo… NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ và tên sinh viên: MAI THANH THẬT Phái: Nam Ngày, tháng, năm sinh: 09 – 04 – 1981 Nơi sinh: Tiền Giang Chuyên ngành: Công nghệ sinh học MSSV: 01126146 I - TÊN ĐÊ TÀI: “Nghiên cứu sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh bằng nguồn nguyên liệu tự nhiên” II - NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Đối chứng để thấy được tính hiệu quả của phương pháp nhanh so với phương pháp chậm. - Thử nghiệm sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh bằng dung dịch đường, nước dừa; qua đó khẳng định tính hiệu quả của nguồn nguyên liệu tự nhiên, rẻ tiền thay thế. - Khảo sát khả năng thay thế của thân tre dùng làm chất mang trong lên men acid acetic theo phương pháp nhanh. III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 01/03/2005 IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/08/2005 V - CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS.TRỊNH VĂN DŨNG Nội dung và đề cương khóa luận tốt nghiệp đã được thông qua bộ môn và giáo viên hướng dẫn. Tp.Hồ Chí Minh, Ngày 01 Tháng 03 năm 2005 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (kí tên) (kí tên) TS.TRẦN THỊ DUNG TS.TRỊNH VĂN DŨNG Lời cảm ơn Xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi học tập và rèn luyện trong thời gian qua. Thầy Nguyễn Sĩ Xuân Ân và quý Thầy – Cô trong Trường Đại Học Bách Khoa, Khoa Công Nghệ Hóa, Bộ Môn Máy và Thiết Bị đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn. Các anh, chị và các bạn trong và ngoài lớp công nghệ sinh học 27 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn. Vô cùng biết ơn: Quý Thầy – Cô trong và ngoài Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã giảng dạy và truyền đạt kiến thức trong suốt quãng đường đại học. Và đặc biệt xin bài tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy, Tiến Sĩ Trịnh Văn Dũng, người đã tận tâm dìu dắt, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quí báo cho tôi trong quá trình học tập và làm luân văn này. i Tóm tắt Đề tài “nghiên cứu sản xuất acid acetic theo phương pháp lên men nhanh bằng nguồn nguyên liệu tự nhiên”, do sinh viên Mai Thanh Thật, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh thực hiện từ ngày 1/3/2005 đến 1/8/2005 dưới sự hướng dẫn của TS. Trịnh Văn Dũng, giảng viên khoa Công Nghệ Hóa Học, Trường Đại Học Bách Khoa Tp.Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm: Lên men chậm môi trường đã thay đổi hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường. Tiến hành lên men nhanh các môi trường mà hàm lượng nước dừa và hàm lượng đường đã thay đổi. Lên men đối chứng giữa lên men nhanh và lên men chậm trên cùng một môi trường. Khảo sát định tính khả năng thay thế của thân tre dùng làm chất mang trong lên men acid acetic theo phương pháp nhanh. Kết quả: Chọn được phương pháp lên men nhanh và bằng thực nghiệm đã khẳng định phương pháp này là thích hợp hơn phương pháp chậm để nghiên cứu và triển khai công nghệ sản xuất acid acetic. Chứng minh được vật liệu trong nước (thân cây tre) hoàn toàn có thể thay thế được vật liệu truyền thống nước ngoài (gỗ sồi) để làm chất mang vi khuẩn acid acetic. Tìm được thành phần môi trường nước dừa và nước đường có hiệu quả tốt trong quá trình lên men nhanh. Sản phẩm giấm đạt nồng độ gần 5% acid chỉ sau khoảng 50h lên men với hệ thống lên men nhanh hồi lưu qua giá thể. Mục lục trang Lời cảm ơn iii Tóm tắt …………………………………………………………………………iv Mục lục …………………………………………………………………………....v Danh sách các hình ix Danh sách các bảng biểu và đồ thị …………………………...................................x Danh sách các hình trang Hình 1.1 Thiết bị lên men acid aceti theo phương pháp chậm 15 Hình 1.2 Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 17 Hình 1.3 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm 18 Hình 1.4 Thiết bị lên men acid theo phương pháp tổ hợp 19 Hình 1.5 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp nhúng 24 Hính 1.6 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp trống quay 25 Hình 1.7 Thiết bị lên men nhanh phương pháp cố định (Generator thông khí tự nhiên) 26 Hình 2.1 Fermenter làm việc gián đoạn 32 Hình 2.2 Fermenter hoạt động liên tục dạng thùng có cánh khuấy 33 Hình 2.3 Fermenter dạng tầng sôi 34 Hình 2.4 Fermenter dạng ống 35 Hình 2.5 Biểu diễn màng sinh học bám trên các vật rắn trơ 37 Hình 3.1 Hệ thống thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 40 Hình 3.2 Vật liệu mang vi khuẩn acid acetic được làm từ thân tre 41 Hình 3.3 Tháp lên men trước và sau khi cấy giống vi khuẩn acid acetic 45 Hình 3.4 Sơ đồ hệ thống thiết bị thí nghiệm lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 47 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí lấy mẫu trên thân tháp 49 Danh sách các bảng biểu và đồ thị trang Bảng 3.1. Thành phần của môi trường cấy giống và lên men 44 Bảng 3.2 Nồng độ % acid theo thời gian lên men chậm (môi trường nước dừa) 54 Bảng 3.3 Độ chuyển hóa (Ci/C0) của môi trường nước dừa 56 Bảng 3.4 Kết quả lên men nhanh của môi trường nước dừa 30% 58 Bảng 3.5 Kết quả lên men chậm của môi trường nước dừa 30% 58 Bảng 3.6 Nồng độ % acid theo thời gian lên men chậm (môi trường nước đường) 60 Bảng 3.7 Nổng độ chuyển hóa (Ci/C0) của các môi trường nước đường lên men nhanh 62 Bảng 3.8 Kết quả lên men nhanh của môi trường nước đường 64 Bảng 3.9 Kết quả lên men chậm của môi trường nước đường 64 Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra định tính các tính chất của chất mang chế tạo từ tre 66 Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa trong quá trình lên men chậm 55 Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa trong quá trình lên men nhanh 57 Hình 4.3 So sánh đối chứng giữa phương pháp nhanh và chậm của môi trường nước dừa 59 Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ nước đường trong quá trình lên men chậm 61 Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ nước đường trong quá trình lên men nhanh 63 Hình 4.6 So sánh đối chứng giữa phương pháp nhanh và chậm của môi trường nước đường 65 MỞ ĐẦU I.1 Đặt Vấn Đề Acid acetic đóng vai trò quan trọng trong đời sống cũng như trong công nghiệp. Nó được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp như: công nghiệp tổng hợp hữu cơ, công nghiệp thực phẩm,… mà đặc biệt là trong công nghiệp chế biến mủ cao su. Trong ngành công nghệ thực phẩm, trên thị trường hiện nay có hai loại giấm: giấm hóa học (tổng hợp hóa học) và giấm nuôi (giấm được sản xuất theo phương pháp lên men). Giấm tổng hợp theo phương pháp hóa học. Qua kiểm nghiệm người ta thấy trong giấm tổng hợp ngoài thành phần chính là acid acetic, còn chứa nhiều thành phần phụ khác, chúng là chất độc gây ung thư như: acidfocmic, metanol, metylaxetac,… mặc dù các nhà sản xuất đã áp dụng những thiết bị và phương pháp khử độc hiện đại. Giấm nuôi được sản xuất theo phương pháp lên men vi sinh vật. Nó là loại thực phẩm an toàn được các chuyên gia thực phẩm khuyên dùng. Ngoài thành phần chính là acid acetic, còn chứa một số acid amin và vitamin cần thiết cho cơ thể. Ở Việt Nam, acid acetic có thể được chế biến từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như: mật rỉ, nước hoa quả chín, tinh bột, cồn và các loại chứa cellulose như gỗ,…. Nước ta là nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên các nguyên liệu này rất dồi dào, đặc biệt là rỉ đường, nước dừa, quả điều và dứa. Ở nước ta acid acetic dùng để làm thực phẩm trong gia đình chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp lên men truyền thống. Nhưng hiện nay, tại các chợ và các quầy hàng người ta thường bán giấm hóa học với tên gọi “giấm ăn”. Vấn đề ở đây là giá thành 1lít giấm nuôi đắt gấp 10 lần so với giá thành 1lít giấm hóa học. Lý do là sản xuất giấm ăn theo phương pháp lên men phải tốn thời gian dài, độ chua không cao nên ít người sản xuất nó. Người tiêu dùng đành phải mua giấm tổng hợp để dùng. Còn trong ngành công nghiệp chế biến mủ cao su, lượng acid acetic dùng trong chống đông mủ cao su (sử dụng dung dich acid acetic 2,5% với lượng là 3,5-10 kg/tấn dung dịch mủ cao su) chủ yếu nhập khẩu từ Trung Quốc. Ở nước ta hiện nay, diện tích trồng cao su khoảng 400000 ha, mỗi năm thu hoạch gần 800000 tấn/năm. Từ đó cho thấy rằng lượng acid acetic dùng trong ngành công nghiệp chế biến mủ cao su này rất lớn. Mặc khác, diện tích trồng cao su ngày một tăng, ước tính đến 2010 diện tích trồng cao su trên cả nước khoảng 700000 ha. Do đó, việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp sản xuất, nguồn nguyên liệu để sản xuất cho năng suất, hiệu quả kinh tế cao là rất có ý nghĩa thực tế ở nước ta hiện nay và trong tương lai. I.2 Mục Đích Yêu Cầu - Đối chứng để thấy được tính hiệu quả của phương pháp nhanh so với phương pháp chậm. - Thử nghiệm sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh bằng dung dịch đường, nước dừa; qua đó khẳng định tính hiệu quả của nguồn nguyên liệu tự nhiên thay thế. - Khảo sát khả năng thay thế của thân tre dùng làm chất mang trong lên men acid acetic theo phương pháp nhanh.  TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 1. Công Nghệ Sản Xuất Acid Acetic 1.1 Tính chất và ứng dụng của acid acetic Các tính chất hóa lý của acid acetic Acid acetic có công thức phân tử CH3COOH, khối lượng phân tử 60,5 kg/kmol. Nó là một chất lỏng không màu, có mùi xốc, có vị chua, có khả năng hút ẩm từ không khí. Nhiệt độ nóng chảy tnc =16,63 oC, nhiệt độ sôi ts=118 oC, tỷ trọng 1,049, độ nhớt ở 20 oC là 1,21.10-3 Ns/m2. Trong dung dịch acid acetic tồn tại các dạng (CH3COOH)2, (CH3COOH)3, sự tồn tại các phân tử kép như trên là do các liên kết hidro giữa các phân tử với nhau. Acid acetic tan trong nước và các dung môi thường (rượu, aeton, cloruafooc …) với bất kỳ tỉ lệ nào. Ngoài ra nó cũng chính là dung môi tốt cho nhiều hợp chất hữu cơ (nhựa, tinh dầu, …). Đặc biệt acid acetic hòa tan tốt ngay cả xelluloz và các hợp chất của nó. Acid acetic có tác dụng phân hủy da, gây bỏng, ăn mòn nhiều kim loại và hợp kim, hòa tan tốt nhiều chất vô cơ. Ứng dụng của acid acetic Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi trong đời sống và trong sản xuất công nghiệp. Những ứng dụng quan trọng của acid acetic bao gồm: Ứng dụng trong chế biến mủ cao su Trong ngành công nghiệp sản xuất mủ cao su, người ta rất sợ hiện tượng đông đặc của mủ trước khi về đến nhà máy chế biến. Để chống đông mủ cao su, người ta cho thêm vào mủ nước những chất chống đông. Thường người ta dùng dung dịch NH3 3%. Thời điểm cho dung dịch NH3 vào mủ là lúc trút mủ vào xô, thùng,…. Khi đông tụ mủ, người ta pha loãng và khuấy trộn đều, sau đó cho thêm vào dung dich acid acetic 2,5% với lượng là 3,5-10 kg/tấn dung dịch mủ cao su. Ở Việt Nam hiện nay, mỗi năm sản xuất khoảng 800000 tấn cao su (50% trong đó được sử dụng trong nước, còn 50% thì xuất khẩu). Như vậy lượng acid acetic sử dụng trong chế biến mủ cao su là rất lớn. Mặc dù vậy, nước ta vẫn phải nhập acid acetic từ nước ngoài (chủ yếu là từ Trung Quốc). Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm Với hàm lượng acid acetic từ 2 – 5%, người ta gọi dung dịch này là giấm ăn. Giấm ăn được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để chế biến đồ hộp, rau, quả, gia vị trong các bữa ăn gia đình. Lượng giấm ăn sử dụng trong công nghiệp thực phẩm là rất lớn, do đó, việc sản xuất giấm ăn không thể mang tính chất thủ công truyền thống mà đã trở thành một ngành sản xuất theo quy mô công nghiệp ở nhiều nước trên thế giới. Ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác Acid acetic được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ (etyl acetat, butyl acetat, xelluloz, axetat, axeton,…). Tổng hợp chất dẻo, tơ sợi, nhựa PVA, trong dược phẩm (điều chế aspirin). Và ngày nay, thì acid acetic và các dẫn xuất của nó đã được nghiên cứu và ứng dụng cho các ngành công nghệ cao như sản xuất phim ảnh không cháy, thủy tinh không vỡ,…. Những ngành sản xuất này đòi hỏi lượng acid acetic nhiều và có chất lượng cao hơn dung dịch acid acetic dùng trong công nghệ thực phẩm và trong công nghệ chế biến mủ cao su. Các phương pháp sản xuất acid acetic Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ rất lâu. Do đó, loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic, những phương pháp sản xuất acid acetic bao gồm: Phương pháp hóa gỗ Phương pháp hóa học Phương pháp sinh học Phương pháp kết hợp Phương pháp hóa gỗ Cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp khai thác và chế biến gỗ, loài người đã biết cách sản xuất ra acid acetic từ dạng nguyên liệu này. Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men (giấm gỗ, bột gỗ, tách acid acetic trực tiếp từ nước ngưng khi chưng gỗ). Người ta thu được nhiều chất khác nhau, trong đó có acid acetic có hàm lượng rất lớn. Hiện nay phương pháp này không còn được sử dụng. Phương pháp hóa học Từ C2H2 hay C2H5OH, C2H4 tiến hành tổng hợp có xúc tác sẽ thu được axetandehyd, oxy hóa axetandehyd nhờ có xúc tác ở nhiệt độ và áp suất cao sẽ thu được acid acetic. Giai đoạn oxy hóa axetandehyd thành acid, dùng xúc tác magan, rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ: 50 – 800C để thu được acid có hiệu suất cao. Phương pháp này có giá trị thực tế khá cao, nhưng do tạo nhiều sản phẩm phụ nên làm giảm hiệu suất phản ứng. Phương pháp mới nhất hiện nay là tổng hợp từ metanol và CO bằng phản ứng cacbonyl hóa: CH3OH + CO " CH3COOH Phương pháp sinh học Hiện nay người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng phương pháp lên men (sản phẩm là giấm ăn). So với những phương pháp khác, phương pháp lên men có những ưu điểm Công nghệ sản xuất acid acetic hoàn toàn không gây ô nhiễm môi trường. Quá trình chuyển hóa (hay quá trình lên men) được thực hiện ở điều kiện rất ôn hòa, không cần nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc thiết bị phức tạp Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm. Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước ép dứa, nước ép mía….), có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công nghiệp * Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa Giai đoạn chuyển hóa tinh bột thành đường Giai đoạn chuyển đường thành cồn Giai đoạn chuyển cồn thành acid * Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì chỉ cần qua 2 giai đoạn Giai đoạn chuyển hóa đường thành cồn Giai đoạn chuyển cồn thành acid * Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì ta chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi để vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic. Sản xuất acid acetic theo phương pháp sinh hóa thực chất là quá trình oxy hóa rượu etylic thành acid acetic nhờ một số vi khuẩn acetic khi có mặt của oxy. Từ trước đến nay đã xuất hiện 4 phương pháp: Phương pháp chậm Phương pháp nhanh Phương pháp chìm Phương pháp hỗn hợp Phương pháp hỗn hợp Phương pháp này ra đời cùng với sự phát triển của công nghiệp hóa dầu và hóa gỗ nhằm tận dụng những phế liệu của nó, nâng cao hiệu quả kinh tế của các ngành này. Một vài quá trình của phương pháp này như sau: Trước tiên người ta tiến hành oxy hóa các hydro cacbon thấp như propan, butan sẽ tạo thành acetandehyd, formandehyd, aceton và các sản phẩm khác. Acetandehyd được oxy hóa có xúc tác thành acid acetic. Sau đó người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acid axetic. Phương pháp hỗn hợp được sử dụng nhiều hơn cả phương pháp thủy phân tinh bột gỗ bằng acid (phương pháp hóa học). Phân tích lựa chọn phương pháp sản xuất acid acetic: Trong bốn phương pháp sản xuất acid acetic đã nêu trên, hiện nay trên thế giới chiếm ưu thế nhất là phương pháp tổng hợp hóa học, nhất là ở những nước phát triển vì phương pháp này có hiệu quả kinh tế cao do thiết bị tương đối gọn nhẹ, năng suất cao, acid thu được có nồng độ cao và ít tạp chất. Phương pháp hóa gỗ vẫn còn được sử dụng ở những nước có nhiều gỗ nhưng sản lượng chỉ nhỏ hơn 10% tổng sản lượng acid acetic sản xuất hàng năm trên thế giới. Phương pháp hỗn hợp vẫn ở giai đoạn thăm dò chưa có quy trình nào được sử dụng rộng rãi vì hiệu quả kinh tế không cao, hệ thống phức tạp, không cạnh tranh được với acid acetic tổng hợp và hóa gỗ. Còn phương pháp sinh hóa hiện nay trên thế giới đang dùng để sản xuất giấm ăn và giấm cho công nghiệp. Ở Việt Nam, khi lựa chọn phương pháp sản xuất acid actic cần phải chú ý đến nguồn nguyên liệu, thiết bị và trình độ kỹ thuật cũng như nhu cầu sử dụng acid acetic và khuynh hướng chung của tiến bộ khoa học kỹ thuật trên thế giới. Hiện nay, chưa thể đặt vấn đề sản xuất acid acetic bằng phương pháp tổng hợp vì nước ta vẫn chưa có đủ điều kiện để đáp ứng được những yêu cầu của phương pháp này. So với phương pháp tổng hợp, phương pháp hóa gỗ có đơn giản hơn về mặt quá trình và thiết bị nhưng với yêu cầu khắt khe về việc bảo vệ môi trường (đặc biệt là rừng) hiện nay thì việc tiến hành phương pháp này sẽ gặp nhiều khó khăn về mặt nguyên liệu. Việc sử dụng enzyme của vi sinh vật để sản xuất acid hữu cơ không những tận dụng được phế liệu của các ngành khác (nông nghiệp, công nghiêp thực phẩm,…) mà nó còn bảo vệ môi trường khỏi bị ô nhiễm, duy trì cân bằng sinh thái cho giới tự nhiên. Không những vậy, phương pháp này chỉ yêu cầu thiết bị đơn giản, nguyên liệu dễ kiếm, … mặc dù nó cũng có những nhược điểm là thiết bị cồng kềnh, không thu được sản phẩm có nồng độ cao. Từ những phân tích trên, so sánh các ưu – nhược điểm của các phương pháp sản xuất acid acetic, cũng như đánh giá tình hình nhu cầu và tiến bộ khoa học trong nước, luận văn chọn phương pháp sinh hóa để nghiên cứu công nghệ sản xuất acid acetic. Sản xuất acid actic bằng phương pháp len men 1.3.1 Bản chất của quá trình lên men acid acetic Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa cồn thành acid acetic, nhờ vi khuẩn acetic trong điều kiện hiếu khí. Chúng ta đều biết mọi quá trình muốn hoạt động được đòi hỏi phải có năng lượng. Để thực hiện được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình thì vi sinh vật cần phải có năng lượng. Quá trình lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào sinh vật. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng hóa năng tàng trữ trong mạch cạcbon và được phóng ra do sự chuyển electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro. Nhưng sự chuyển hydro cũng tương đương với sự chuyển electron, vì lẽ nguyên tử hydro có thể tách thành proton H+ và electron. Các enzyme xúc tác quá trình tách nguyên tử hydro khỏi cơ chất gọi là enzyme dehydrogenaza. Trong quá trình lên men giấm, rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic. Ở đây sự chuyển hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (Nicotinamit ađenin dinucleotit photphat dạng oxy hóa). Hydro được NADP nhận (trở thành NADPH2) được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng. Song cơ chất không bị phân giải hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hoàn toàn. 1.3.2 Cơ chế phản ứng của quá trình lên men acid acetic Lên men giấm là quá trình oxy hoá rượu etylic thành acid acetic nhờ có enzyme alcohol oxydaza xúc tác trong điều kiện hiếu khí: CH3CH2OH + O2 = CH3OOH + H2O + 117 kcal Để chuyển hoá thành acid acetic, rượu và oxy phải thâm nhập vào tế bào vi khuẩn, ở đây nhờ có enzyme của vi khuẩn xúc tác, rượu được chuyển hoá thành acid acetic theo một quá trình sau: CH3CH2OH + ½ O2 = CH3CHO + H2O CH3CHO + H2O = CH3CH(OH)2 CH3CH(OH)2 + 1/2O2 = CH3COOH + H2O Acid acetic tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào của vi khuẩn và đi vào môi trường. Khi môi trường hết rượu thì vi khuẩn giấm sẽ oxy hoá acid acetic thành CO2 và H2O theo phương trình sau: CH3COOH + 2O2 = 2CO2 + 2H2O Đây chính là sự “quá oxy hoá” rất có hại cho quá trình lên men giấm. Vì vậy, trong dịch lên men phải còn dư một lượng rượu khoảng 0,3-0,5% để đảm bảo không bao giờ cho oxy hoá hết rượu nhầm tránh hiện tượng “quá oxy hóa”. 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men acid acetic 1.3.3.1 Ảnh hưởng của oxy (sự thoáng khí) Theo cơ chế phản ứng ta nhận thấy phản ứng giấm hóa là phản ứng oxy hóa, trong đó oxyl đóng vai trò chất nhận hydro, nên sự có mặt của oxyl đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men. Phương trình tổng quát: C2H5OH + O2 " CH3COOH + H2O + 117Kcal Ta thấy về mặt lý thuyết, để oxy hóa hết 1 mol rượu thì cần 1 mol oxy tự do, tức là để oxyl hóa hết 1kg rượu khan cần 2,3m3 không khí ở điều kiện tiêu chuẩn. trong sản xuất, điều kiện thoáng khí càng tốt thì quá trình lên men càng nhanh. Trong phương pháp chậm, dịch lên men tiếp xúc với không khí và hấp thụ oxy qua bề mặt thoáng . Do hạn chế của bề mặt tiếp xúc nên phương pháp này chậm, năng suất thấp. Trong phương pháp nhanh, do được bổ sung các vật liệu xốp (vỏ bào, than gỗ, cốc…) nên làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa môi trường dinh dưỡng và không khí, cải thiện điều kiện không khí do đó thúc đẩy quá trình lên men. Ở phương pháp chìm thì người ta sục khí mạnh liên tục qua dung dịch lên men nhờ đó đã phân tán đều không khí vào môi trường lên men, tạo nên bề mặt tiếp xúc pha lớn làm tăng quá trình lên men. Như vậy, phương pháp nào tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa không khí và dịch lên men lớn hơn sẽ là phương pháp có hiệu quả và năng suất cao hơn. 1.3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật và hiệu quả lên men. Vì vậy, trong thực tế sản xuất, người ta sử dụng yếu tố này để điều chỉnh vận tốc phản ứng. Nhiệt độ thích hợp để vi khuẩn giấm sinh trưởng và phát triển đối với mỗi loài vi khuẩn khác nhau. Đối với vi khuẩn Acetobacter Aceti phát triển tốt trong khoảng 25-300C. Đối với vi khuẩn Acetobacter Schuitzenbachi phát triển tốt ở nhiệt độ lớn nhất 290C. Đối với vi khuẩn Acetobacter Kutzingianum lại phát triển tốt trong khoảng 35-370C. Nhìn chung khoảng nhiệt độ để các vi khuẩn giấm tồn tại và phát triển tốt khá rộng từ 15-340C. Tuy nhiên cần lưu ý nếu nhiệt độ quá thấp thì tốc độ quá trình lên men sẽ chậm. Ngược lại, khi nhiệt độ quá cao sẽ làm tổn thất do bay hơi rượu, acid acetic. Do đó nhiệt độ thích hợp cho quá trình sản xuất giấm là 30-340C. 1.3.3.3 Nồng độ acid acetic và nồng độ rượu a. Nồng độ acid acetic: Môi trường acid (pH=3) là điều kiện thuận lợi đối với vi khuẩn giấm. Acid acetic tích tụ trong môi trường đến một mức độ nào đó sẽ ức chế hoạt động của chính vi khuẩn. Khi dung dịch tích tụ được 8% acid acetic thì hoạt động của các vi khuẩn trở nên ngày càng giảm dần và ngừng họat động khi lượng acid đạt được 12-14%. Nồng độ rượu: Tùy từng loài mà chúng có khả năng tồn tại, thường người ta sử dụng nồng độ rượu từ 6-14%. Nếu trong môi trường không còn rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để tiếp tục thu năng lượng dùng trong sự sống. Vì thế đây là một quá trình có hại. Trong sản xuất người ta thường để lại trong môi trường sau lên men độ rượu 0,3-0,5%. Dires (1973) cho rằng lượng rượu sót trong giấm có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic và muối axetat. 1.3.3.4 Các chất dinh dưỡng: Trong cơ thể vi sinh vật có khoảng 40 hợp chất khoáng khác nhau có thể ở dạng tự do hay liên kết hữu cơ cao phân tử, thông thường tổng hàm lượng khoáng trong vi sinh vật chiếm 5-8% trọng lượng chất khô. Các chất khoáng chia làm 2 loại: Khoáng đa lượng: S, P, K, Na, Fe, Mg, Cu, ….. Khoáng vi lượng: Cl, Br, I, As, Pb, Zn, Mn, ….. Do đó, để cho vi khuẩn giấm phát triển tốt, khi sản xuất giấm ngoài các chất: nước, acid, rượu, cần đưa vào môi trường lên men các muối tan có chứa các nguyên tố khoáng cần thiết. Nếu sản xuất giấm từ rượu vang, bia, nước ép trái cây,.. thì trong dịch lên men đã có đủ các nguyên tố khoáng đa lượng và vi lượng không cần bổ sung. Nếu sản xuất giấm từ dịch cồn pha loãng để lên men giấm thì cần bổ sung các nguyên tố khoáng đa lượng cần thiết nhờ các muối vô cơ dễ tan. Ngoài các nguyên tố vi lượng vô cơ, các nguyên tố vi lượng hữu cơ cũng rất cần thiết và quan trọng trong quá trình lên men, tuy sử dụng với nồng độ cực nhỏ cũng có hiệu quả rõ rệt. Thông thường các nguyên tố vi lượng đã có mặt trong những nguyên liệu tự nhiên ban đầu khi đưa vào lên men như dịch trái cây, nước chiết malt, nấm men, dịch thủy phân. Sau đây là một số môi trường để sản xuất giấm, với thành phần các chất dinh dưỡng được xem là có lợi nhất: Môi trường dinh dưỡng cho một lít rượu khan như sau: Glucoza 0,7g Diphotphat amon 1,25g Diphotphat Kali 0,5g Sunphat magic 0,2g Môi trường dinh dưỡng cho một hectolit rượu khan (100l): Glucoza kỹ thuật hay đường tinh bột 500g Sunpho photphat 25g Sunphat amon 25g Cacbonat Kali 0,9g Trong đó: Photphat có vai trò quan trọng trong chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học. Vì thế photphat cần thiết trong thành phần dung dịch lên men, nó được đưa vào môi trường ở dạng muối vô cơ như photphat Kali hay photphat amon. Nồng độ photphat thường nằm trong khoảng 0,1-0,5%. Nitơ là cấu tạo quan trọng trong thành phần protein và acid nucleic là thành phần rất cần thiết cho sự sống của vi sinh vật. Nitơ được đưa vào môi trường dưới dạng muối vô cơ như nitrat, muối amon, urê,…. Glucoze đóng vai trò như nguồn cung cấp glucid để cung cấp năng lượng bổ sung cho cơ thể vi sinh vật. Ngoài ra, còn là nguồn cung cấp vật liệu xây dựng sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào. Theo Enber và Hromatka (1949 – 1953) acid acetic được tạo thành bởi các tế bào sinh sản. Do vậy tác động quan trọng nhất đối với quá trình lên men giấm là thành phần môi trường, nhiệt độ và chế độ thông khí, sự thay đổi chế độ nuôi cấy làm thay đổi các thông số: Tốc độ sinh sản Sinh khối (%) Nồng độ sản phẩm giấm. 1.3.3.5 Các kim loại nặng và các chất gây độc hại Có 5 Kim loại nặng như: Pb, Cu, Fe, Zn, Sn trong dịch lên men sẽ làm giảm hiệu suất lên men, người ta đã thử nghiệm và tìm ra ngưỡng độc hại của 5 kim loại nặng trên tương ứng là 10:15:20:100 và lớn hơn 100ppm. Các chất gây độc hại và ức chế: các chất như tinh dầu lignin, tanin (có trong gỗ)…và một số hợp chất khác có mặt trong môi trường lên men với nồng độ vượt quá ngưỡng giới hạn cho phép đều có tác dụng gây độc hại đến vi sinh vật. Vì thế khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị cần lưu ý đến những vấn đề này. Mặt khác, chất lượng nước khoáng: chất lượng nước pha loãng cũng có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình lên men giấm. Yếu tố quan trọng nhất là nước pha loãng có độ sạch sinh học cao (vô trùng) và hàm lượng Clo thấp. Nói chung, nước pha loãng tốt là nước có độ sạch sinh học cao, hàm lượng Clo, các kim loại nặng, các chất rắn thấp, có đủ các nguyên tố vi lượng. 1.3.4 Vật liệu chế tạo thiết bị lên men acid acetic Do acid acetic là một acid có tính ăn mòn kim loại và hợp kim. Tốc độ ăn mòn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ, nhiệt độ, vận tốc chuyển động của acid,… cho nên khi chọn vật liệu chế tạo thiết bị sản xuất phải hết sức thận trọng. Mặt khác, quá trình sản xuất giấm là quá trình có vi sinh vật tham gia nên năm kim loại nặng như: Pb, Cu, Fe, Sn, Zn có tác dụng độc hại đối với vi khuẩn giấm không được dùng làm thiết bị sản xuất giấm bằng phương pháp sinh học nhưng vẫn có thể sử dụng chúng nếu sử dụng những phương pháp khác. Trong hệ thống sản xuất giấm bằng phương pháp sinh học có thể dùng các kim loại đó để chế tạo thiết bị ở những khâu khác như: thùng bảo quản, thiết bị chưng cất,… nhưng các khâu nối với bộ phận lên men thì không được dùng. Vật liệu chế tạo thiết bị để sản xuất giấm bằng phương pháp sinh hóa tốt nhất là thép hợp kim, nhôm, gỗ (những loại gỗ chứa ít tinh dầu tanin,lignin, … và các chất độc hại cho vi khuẩn giấm) và ngày nay thì ngành nhựa phát triển nên có thể sử dụng để chế tạo thiết bị lên men. 1.4 Các phương pháp sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men Yếu tố quan trọng nhất quyết định năng suất và hiệu suất của một phương pháp sản xuất giấm đó chính là bề mặt tiếp xúc giữa oxy của không khí và hợp chất. Từ đó con người không ngừng cải tiến, hoàn thiện các phương pháp cũ, tìm ra các phương pháp mới để sản xuất giấm có hiệu quả và kinh tế hơn. Đến thời điểm hiện tại, đã có 4 phương pháp sản xuất acid bằng cách lên men: Phương pháp chậm Phương pháp nhanh Phương pháp chìm Phương pháp hỗn hợp 1.4.1 Phương pháp chậm (phương pháp Pháp) Đây là phương pháp thủ công đã có từ lâu đời, quá trình lên men giấm diễn ra ở bề mặt tiếp xúc pha giữa khối dịch lên men và không khí (bề mặt thoáng) trong thùng lên men đặt nằm ngang. Rượu vang được acid hóa bằng acid acetic, dịch sản xuất phải đảm bảo 2% acid acetic và 4% rượu hay 3% acid acetic và 3% rượu. Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250 l – 300 l bằng gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang). Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho. Giống vi khuẩn được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse. (theo Nguyễn Đức Lượng, 2002) Hình 1.1 Thiết bị lên men acid aceti theo phương pháp chậm Để tiến hành sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta làm như sau: đổ vào thùng 1/5 thể tích giấm tươi chất lượng cao để acid hóa, sau đó đổ thêm dịch lên men vào cho đến khoảng ½ thể tích thùng. Tiếp theo cứ mỗi chu kỳ đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy. Khi nào nhận thấy rượu đã được oxy hóa gần hết (còn lại 0,3-0,5% rượu) thì lấy giấm ra để đem chế biến và bảo quản, đồng thời cho tiếp dịch lên men vào để lên men tiếp. Khi lên men, vi khuẩn giấm phát triển tạo thành màng vi sinh vật trên bề mặt thoáng, khi bị chấn động (do va chạm hay do quá trình đổ dịch lên men vào và tháo sản phẩm ra) nó sẽ bị phá vỡ, chìm xuống tiêu thụ cơ chất mà không tạo thành acid acetic. Dần dần trên mặt thoáng lại hình thành màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men tiếp tục. Do hạn chế của bề mặt thoáng nên phương pháp này có nhược điểm: Thời gian lên men dài Nồng độ acid thấp Năng suất thấp Thiết bị cồng kềnh Nhưng bù lại phương pháp này có ưu điểm là giấm thơm ngon, thiết bị đơn giản dễ chế tạo. 1.4.2 Phương pháp nhanh (phương pháp Đức) Phương pháp này tạo được bề mặt tiếp xúc pha giữa lỏng và khí lớn nhờ bổ sung vật liệu bám trong thiết bị lên men nên năng suất và hiệu suất cao hơn. Đã khắc phục được nhược điểm của phương pháp lên men chậm do người Pháp thực hiện. Người ta thiết kế những thùng lên men rất lớn, hình trụ, thường có kich thước như sau: Chiều cao thùng 2,5 – 6m. Có dường kính đáy thùng d = 1,2 -3m. Tỷ lệ đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được chất đầy phôi bào hay lõi ngô (bắp). Phôi bào hay lõi ngô được xem như chất mang, giữ vi sinh vật trong quá trình lên men. Nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị người ta lắp một hệ thống phân phối không khí đưa từ dưới lên. Môi trường lên men được đưa từ trên xuống. Toàn bộ thiết bị được thiết kế như hình 1.2. Hình 1.2 Thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh Ở phương pháp này, người ta tưới dịch lên men từ trên xuống qua hệ thống phân phối lỏng như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được phân phối đều và chảy chậm qua thùng lên men (gọi là generator) bên trong có đổ đầy vật liệu bám có màng vi khuẩn ở trên bề mặt, cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn. Cùng lúc đó, không khí đi ngược chiều từ dưới lên trên và oxyl thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn, dịch lên men được chuyển hóa nhanh nhờ vi khuẩn. Nếu generator đủ cao, điều kiện vận hành được khống chế tốt thì chỉ cần cho dịch lên men qua tháp một lần là có thể thu được giấm đặc ở đáy. Tuy nhiên, vì thổi khí từ dưới lên nên xảy ra quá trình làm mất rượu etylic và acid acetic trong quá trình lên men. Ưu điểm của phương pháp: Thời gian lên men ngắn Thiết bị tương đối đơn giản, năng suất cao, ổn định Giấm thu được có nồng độ cao (có thể đến 10 – 11%) Nhược điểm của phương pháp: Hiệu suất không cao do mất mát rượu và axit Dùng vật liệu bám phải phù hợp 1.4.3 Phương pháp chìm (phương pháp sục khí): Cho không khí sục qua khối dịch lên men mãnh liệt sẽ tạo thành một thể huyền phù có pha rắn là các vi khuẩn giấm, pha lỏng là dịch lên men trong các thiết bị lên men có tên là acetator, dịch rượu được chuyển hóa thành giấm rất nhanh. Hình 1.3 Thiết bị lên men acid acetic theo phương pháp chìm Phương pháp này có hiệu suất cao, tối thiểu là 91 – 92%, nếu khống chế tốt ở điều kiện vận hành có thể đạt 98 – 99%. Nó được ra đời từ những kết quả của phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất thuốc kháng sinh, sản xuất men bánh mì. Tuy có được ưu điểm lớn nhưng mãi đến gần đây, phương pháp này mới được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất, nguyên nhân là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao và quan trọng là yêu cầu nghiêm ngặt về việc cấp oxy liên tục. 1.4.4 Phương pháp hỗn hợp (phương pháp lai): Đây là phương pháp lai giữa hai phương pháp nhanh và chìm. Hệ thống lên men để sản xuất được thiết kế như sau: Hình 1.4 Thiết bị lên men acid theo phương pháp tổ hợp Phần trên như generator có đổ đầy đệm, hoạt động theo nguyên tắc lên men nhanh. Ở giữa chỉ là một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống. Phần cuối cùng là hệ thống thổi khí mạnh tạo thành vùng oxy hóa bổ sung như một acetator của phương pháp chìm. Phương pháp kết hợp này có rất nhiều ưu điểm, trong đó ưu điểm nhất là hiệu suất lên men rất cao, nồng độ acid acetic thu được thường nằm trong khoảng 10 – 12%. Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả hai phương pháp nhanh và chìm, nhưng thiết bị yêu cầu quá phức tạp, cồng kềnh, giống vi khuẩn phải phù hợp với cả hai phương pháp. 1.5 Chọn chủng vi khuẩn acid acetic: Hiện nay người ta đã tìm ra hơn 20 loài vi khuẩn acid acetic. Gọi chung là Acetobacter là trực khuẩn khá lớn thuộc loài hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích hợp là 30 – 400C. Trong tự nhiên chúng phân bố rất rộng rãi trong không khí và rau quả, nhiều trường hợp có thể phát triển đồng thời cùng với nấm men trên cơ chất thực vật có nhiều đường. Vi khuẩn acetic thuộc loại giống Acetobacter (chu mao) và Acetomonas (tiêm mao ở một đầu). Nhiều loài khi phát triển lâu trên môi trường dễ dàng sinh ra những dạng có hình thái đặc biệt (tế bào phình to hay kéo dài, có thể phân nhánh) Việc nghiên cứu vi khuẩn do Pasteur thực hiện từ năm 1862 khi ông dùng kính hiển vi quan sát màng mỏng xuất hiện trên rượu vang chua. Một số chủng Acetobacter điển hình: Acetobacter aceti: là trực khuẩn ngắn, xếp thành chuỗi, không di động nhuộm màu vàng với dung dịch iot, có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao 11% và có khả năng tích lũy được khoảng 6% acid acetic. Nhiệt độ thích hợp nhất ở 34%. Acetobacter pasteurianum: tế bào hình que, có khi xếp liên tiếp thành hình sợi dài, tạo thành lớp váng khô nhăn nheo, nhuộm màu xanh với Iod. Có thể tạo được 6,2% acid acetic. Acetobacter orleaneuse: tế bào hình que nhỏ, đôi khi dị dạng (nhiệt độ cao), không di động, trên cơ chất tạo váng dày trong, có khả năng phát triển ở nồng độ rượu khá cao 10 – 12% và có khả năng tích lũy 9,5% acid acetic. Acetobacter xylinum: tế bào hình que, không di động, tạo thành váng dày trên cơ chất, nhuộm bằng Iod và acid sunfuric sẽ có màu xanh, có khả năng tạo được 4,5% acid acetic. Acetobacter Shuitzenbachii: trực khuẩn dài, khi già mới tạo thành váng dày không bền, có khả năng tích lũy 11,5% acid acetic. Đối với mỗi phương pháp khác nhau cần phải chọn những chủng vi khuẩn có đặc tính thích hợp để quá trình lên men đạt hiệu quả cao nhất. Nhưng chúng phải thỏa mãn một số yêu cầu sau: Phải oxy hóa rượu tốt nhất và oxy hóa giấm thấp nhất. Phải tạo ra giấm có chất lượng tốt (thơm, có nồng độ acid cao). Chịu được độ rượu và acid cao. Các tính chất ban đầu của chúng phải được giữ nguyên trong suốt quá trình. Điều kiện nuôi cấy, phân lập và bảo quản giống đơn giản, không tốn kém. Do khảo sát nghiên cứu trên phương pháp nhanh, do đó cần yêu cầu chủng vi khuẩn phải tạo được màng mỏng tơi xốp, có độ bám dính cao, có độ bám dính cao, tích lũy và chịu được độ acid cao thì những giống hay dùng nhất là Actobacter Aceti, Acetobacter Schuitzenbachii… 1.6 Nguồn nguyên liệu sản xuất acid acetic Từ cơ chế quá trình lên men (xem phần 1.3.2) ta thấy bất cứ một sản phẩm nào có thể lên men rượu được đều dùng làm là nguyên liệu để lên men giấm. Nguyên liệu trong sản xuất giấm thường là các loại nước ép trái cây có đường, các loại siro có đường, sản phẩm thủy phân của các nguyên liệu chứa tinh bột, rượu vang, mạch nha, mật ong… nếu dùng các sản phẩm chứa tinh bột thì phải qua hai khâu trung gian là chuyển hoá tinh bột thành đường nhờ enzyme amylaza của nấm mốc, rồi tiếp tục lên men rượu nhờ enzyme deareloxylaza của vi sinh vật, sau đó vi khuẩn giấm mới chuyển hóa rượu thành acid acetic. Nếu sản phẩm có đường thì không phải qua giai đoạn đầu. Trong công nghiệp sản xuất giấm, người ta thường dùng rượu cất pha loãng để lên men, yêu cầu rượu không có lẫn dầu fuzel, aldehyt … vì nó có tác dụng ức chế hoạt động sống của vi sinh vật, mà rượu có thể được lên men từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như ngũ cốc, rĩ đường,… Hiện nay người ta dùng nước ép trái cây để lên men giấm sẽ có sản phẩm thơm ngon và có mùi đặc trưng phù hợp với yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. Tuy nhiên, để duy trì các hoạt động sống bình thường của vi khuẩn thì trong thành phần của môi trường lên men phải có không những nước, rượu và acid acetic mà cả muối khoáng, gluxit và các chất có nitơ dể đồng hoá (muối amon). Lượng acid acetic tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn. Nói chung nguồn nguyên liệu để sản xuất giấm là phong phú và đa dạng. Mặc dù nguồn nguyên liệu có phong phú và đa dạng thì khi thực hiện quá trình lên men thành phần môi trường lên men cũng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau: Về thành phần cơ chất: rượu etylic hoặc những hợp chất có thể chuyển hoá thành rượu etylic (đường, tinh bột, …). Tuỳ từng chủng vi khuẩn sử dụng trong lên men mà hàm lượng rượu trong môi trường có thể thay đổi cho phù hợp. Thường hàm lượng rượu trong môi trường có thể thay đổi từ 4-13%. Về thành phần acid acetic: trong sản xuất người ta thường cho vào cơ chất ban đầu một lượng giấm nhất định để acid hoá môi trường nhầm mục đích: Acid hoá môi trường để tạo pH thích hợp cho vi khuẩn giấm hoạt động. Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật có hại. Đưa vào dịch lên men một lượng tế bào nhất định. Độ acid acetic ban đầu có thể dao động từ 2-6%. Theo nghiên cứu của Eapan và Rao năm 1979, hiệu suất cao nhất đạt được ở nồng độ acid ban đầu là 2%. Nhưng những nghiên cứu gần đây cho thấy để đạt hạm lượng acid cao hơn người ta tiến hành lên men ở nồng độ acid ban đầu cao hơn, khoảng từ 2-6%. Về thành phần các chất dinh dưỡng như: C, H, O, N, P, S, …rất cần trong quá trình sống, sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Các nguyên tố này là thành phần chính của nguyên liệu xây dựng tế bào. Dựa vào hàm lượng tồn tại của chúng trong tế bào mà người ta chia chúng thành hai loại: Nguyên tố khoáng đa lượng: C, H, O, N, S, P, K, Ca, Mg, … Nguyên tố khoáng vi lượng: Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu,… Và một thành phần cũng rất quan trọng cần quan tâm đến đó chính là chất lượng nước pha môi trường trong quá trình lên men. Nước là thành phần cơ bản và thường được sử dụng với số lượng rất nhiều trong quá trình lên men. Do đó, chất lượng nước phải được bảo đảm để không xảy ra những phản ứng hoá học khi tiến hành lên men, hoặc không để xảy ra những tác động của vi sinh vật lạ từ nước vào quá trình lên men. Chất lượng nước phải được xem xét ở ba chỉ số sau: Độ cứng Khả năng oxy hoá. Vi sinh vật, đặc biệt là những vi sinh vật gây bệnh. Vì thế, nước pha môi trường lên men phải đạt độ sạch sinh học cao (vô trùng) và hàm lượng Clo thấp. Mặc khác nguyên liệu lên men cũng phải được xử lý các hợp chất như: tanin, ligin, … nếu nguyên liệu là nước ép trái cây như: điều,dứa, … Vì thế nên khi thực hiện quá trình lên men thì thành phần môi trường phải đảm bảo các yêu cầu đã nêu trên cho dù sử dụng nguyên liệu lên men là: cồn, nước ép điều, dứa, nước dừa, dung dịch pha từ đường, … 1.7 Sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh 1.7.1 Các phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp nhanh: 1.7.1.1 Phương pháp nhúng: Hình 1.5 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp nhúng Thiết bị lên men là một thùng thẳng đứng bên trong có một hay nhiều giỏ bằng gỗ đổ đầy phoi gỗ và có thể nâng lên hạ xuống được. Khi tiến hành lên men người ta đổ vào thùng khoảng ½ thể tích dịch lên men. Sau đó hạ giỏ xuống nhúng chìm lượng vỏ bào đã có màng vi khuẩn bám trong khối dịch lên men, để một thời gian nhất định để dịch lên men có thể thấm ướt toàn bộ lượng vật liệu bám thì nâng giỏ lên phơi trong không khí. Rồi lặp lại các thao tác đó theo môt chu kỳ nhất định, đã được tính toán trước sao cho quá trình oxyl hóa rượu đạt hiệu quả nhất. Tiến hành như vậy cho đến khi giấm hóa toàn bộ khối dịch lên men thì tháo ra để thanh trùng và bảo quản, rồi tiến hành mẻ khác. Phương pháp này có ưu điểm: đơn giản, dễ làm, gọn. Nhưng nó cũng có nhược điểm là năng suất thấp, dễ bị nhiễm khuẩn do không khí chưa được khử trùng. Phương pháp dịch chuyển: Thiết bị lên men của phương pháp này gồm một thùng, bên trong có một cái phao và bên ngoài lắp với hai thùng phản ứng đặt bên cạnh thùng chính. Khi phao chứa đầy nước hay các vật liệu nặng khác, khối dịch lên men chứa trong thùng chính bị ép phải dịch chuyển vào hai thùng phản ứng bên cạnh (có chứa đầy vỏ bào có vi khuẩn giấm bám trên bề mặt) khi những đệm chứa trong hai thùng phản ứng đã bảo hòa dịch lên men, phao được lấy ra và dịch lên men lại tràn về thùng chính. Phương pháp này đơn giản nhưng cồng kềnh, năng suất không cao, khó điều chỉnh quá trình nén chất lỏng từ thùng chính sang thùng phản ứng, không khí dễ bị nhiễm bẩn. Phương pháp trống quay Hính 1.6 Thiết bị lên men nhanh bằng phương pháp trống quay Gồm một thùng hình trụ bên trong có cấu trúc sao cho nhận được một lượng không khí lớn nhất đối với vật liệu chứa trong đó. Trống được bao bọc trong thùng hình trụ lớn và kín, có chứa những lỗ hút không khí. Một nửa trống được tiếp xúc với không khí, còn phần còn lại nằm trong khối dịch lên men. Trống được quay với vòng quay thích hợp sao cho trong quá trình tiếp xúc không khí, các vi khuẩn giấm trên đệm có thể oxy hóa triệt để rượu có trong dịch lên men. Phương pháp cố định: Trong phương pháp này thùng phản ứng (gọi là generator) là một thùng hình nón cụt thẳng đứng bằng gỗ (hoặc bằng một vật liệu nào đó chống ăn mòn) bên trong có tráng một lớp Parafin. Đồng thời có đổ đầy những vật liệu bám có màng vi khuẩn giấm che phủ. Phần vật liệu này được giới hạn giữa hai đáy, đáy trên và đáy dưới cách khoảng 250mm có khoan những lỗ nhỏ để phân phối khí và lỏng. 1. Cửa đổ dịch lên men 4. Đĩa phân phối lỏng 2. Lưới đỡ đệm 5. Van hút không khí 3. Nhiệt kế 6. Cửa khí ra Hình 1.7 Thiết bị lên men nhanh phương pháp cố định (Generator thông khí tự nhiên) Ở đáy trên có những lỗ để tưới dịch lên men vào và cho không khí đi ra. Không khí được hút vào generator qua những lỗ nhỏ được khoan xung quanh dưới thành đáy giả. Để không khí vào mà lỏng không ra được thì các lỗ này được khoan dưới những góc nhọn với đường nằm ngang. Hai pha khí và lỏng đi ngược chiều nhau tiếp xúc trong generator sẽ được vi khuẩn chuyển hóa thành giấm. Nếu chiều cao generator đủ lớn thì dịch lên men chỉ cần đi qua một lần là được giấm hóa toàn bộ. Nếu quá trình lên men tốt, nhiệt độ ở phần làm việc của generator sẽ cao hơn ở nhiệt độ bên ngoài từ 10 – 120C tạo điều kiện cho sự thông khí tự nhiên. Nhìn chung ba phương pháp đầu không được sử dụng rộng rãi trong sản xuất, chỉ có phương pháp cuối là phổ biến nhất và không ngừng được cải tiến, do đó nó có những ưu điểm sau: năng suất tương đối lớn, thiết bị tương đối gọn nhẹ, có thể tiến hành sản xuất trong mọi điều kiện vì có sự thông khí tự nhiên nên không phụ thuộc vào nguồn điện. 1.7.2 Chất mang vi khuẩn acid acetic 1.7.2.1 Một số yêu cầu đối với chất mang vi khuẩn acid acetic: Bản chất của quá trình lên men giấm là quá trình hiếu khí, vì thế phải tạo điều kiện tối đa vi khuẩn tiếp xúc với oxy và cồn (rượu etylic). Trong phương pháp lên men nhanh, giá thể được dùng để tăng diện tích tiếp xúc của oxy với vi khuẩn giấm nhầm thúc đẩy quá trình lên men acid acetic và nâng cao chất lượng giấm. (Nguyễn Công Huân, 1985). Đây là một yếu tố quyết định tính hơn hẳn của phương pháp nhanh so với phương pháp chậm. Vấn đề này đã được nghiên cứu và sử dụng với nhiều loại vật liệu bám khác nhau, khi lựa chọn vật liệu bám cần căn cứ vào các yếu tố sau: Thỏa mãn các yêu cầu chung của đệm như: nhẹ, có độ bền cơ học cao, diện tích tự do (bề mặt riêng) lớn, chống ăn mòn, rẻ tiền, dễ kiếm,… Không phản ứng với dịch lên men, không khí và sản phẩm lên men, cũng như không tiết ra các hợp chất hóa học gây độc hại đối với vi sinh vật và mùi khó chịu cho giấm. Đủ độ nhám và xốp để màng vi khuẩn có thể bám chặt ở một chế độ thủy động lực học nhất định. Dựa vào tính chất hóa học và nguồn gốc, chất mang được chọn để nghiên cứu là chất mang hữu cơ Celluloze. 1.7.2.2 Lựa chọn chất mang: Trong các loại chất mang thì chất mang có nguồn gốc celluloze có những ưu điểm phù hợp với điều kiện Việt Nam hiện nay như công nghệ gia công không phức tạp, rẻ tiền, dễ kiếm ( ví dụ như: tre, bã mía, gỗ sồi,…) Trước đây, nhiều công trình đã nghiên cứu thử nghiệm với nhiều loại vật liệu bám chứa celluloze khác nhau như phôi gỗ (sồi, dẻ, bạch dương,..), lõi ngô, tre nứa,…Trong đó gỗ sồi được đánh giá rất cao vì nó có độ cứng tốt và trong các thớ gỗ có nhiều mao quản xốp. Nếu dùng gỗ sồi làm vật liệu bám thì được gia công như sau: gỗ được bào thành những lá mỏng, sấy khô bằng khí nóng và tự nó sẽ tạo thành những cuộn xoắn có độ xốp cao. Nếu dịch lên men từ rượu trắng và chế độ vận hành tốt thì phôi gỗ sồi có thể làm việc trong 20 – 30 năm, có khi đến 50 năm mới thay. Nếu dịch lên men từ nước ép quả, rượu vang thì chóng phải thay hơn do vi khuẩn Acetobacter tạo màng dày, bít chặt khoảng không gian tự do của các phôi bào. Ở Việt Nam không có gỗ sồi, còn họ dẻ ở nước ta có bảy loại thuộc họ dẻ đều có tính chất tương tự, dẻ gai có thể dùng làm vật liệu bám khá tốt. nhưng chúng có ít và phân bố rải rác khắp nơi các tỉnh Bắc Bộ và Bắc Trung Bộ, nên khó khai thác và vận chuyển, khả năng sử dụng chúng rất thấp. Vì vậy, việc tìm kiếm và thăm dò các vật liệu bám có sẵn, dễ kiếm, rẽ tiền để thay thế cho gỗ sồi, đồng thời vẫn đảm bảo được các yêu cầu của vật liệu bám là một trong những vấn đề mấu chốt trong việc thăm dò phương pháp nhanh để sản xuất giấm ở Việt Nam. Vấn đề xử lý vật liệu bám cũng khá quan trọng nhằm tách các chất độc hại như: tanin, lignin, các loại tinh dầu,…thường hay có trong các vật liệu có nguồn gốc thực vật. Vì vậy cần xử lý cẩn thận vật liệu bám trước khi sử dụng, một trong những phương pháp hay làm trong công nghiệp là trích ly sơ bộ bằng nước nóng. Sau đó ngâm chúng trong dung dịch axit hay kiềm để trích ly triệt để hơn các chất đã nêu trên. Trên những yêu cầu đó chất mang được luận văn chọn nghiên cứu là thân cây tre. Vì ở Việt Nam, tre là loại cây dễ kiếm (có thể tìm thấy ở khắp nơi), rẽ tiền và rất dễ gia công. 1.7.3 Chuẩn bị cấy giống vào generator Đây là khâu quan trọng nhất quyết định sự thành công của quá trình lên men, nhờ khâu này mà vi khuẩn bám được trên bề mặt vật liệu đệm. Vật liệu bám đã được xử lý, chất đầy vào generator rồi thanh trùng Pasteur bằng hơi nước. Để cấy giống vi khuẩn lên bề mặt vật liệu bám người ta dùng giấm tươi (chưa lọc, chưa thanh trùng ) lấy từ một generator hiệu suất cao tuần hoàn chậm qua generator trong khoảng 8 – 12h. Vào ngày thứ hai thêm vào một lượng rượu đủ để đưa hàm lượng rượu trong dịch khoảng 2 - 3% thể tích và lại tuần hoàn hỗn hợp trong 8 – 12h. Ban đầu generator được cách ly với không khí bằng cách đóng chặt các van không khí để tránh sự tạp nhiễm từ bên ngoài do không khí. Sau ngày thứ hai generator được thông khí rất nhẹ cho đến khi vi khuẩn sinh sản trên bề mặt vật liệu bám (biểu hiện ở đây là khi nhiệt độ trong generator bắt đầu tăng so với bên ngoài do nhiệt phản ứng) generator sẵn sàng hoạt động. Chấm dứt giai đoạn cấy giống chuyển sang giai đoạn lên men. Thời gian tổng cộng của giai đoạn cấy giống đến 8 – 12 ngày đêm, ngoại lệ có thể nhanh hơn, nhưng có khi dài hơn. Lượng giấm tiêu hao cho quá trình cấy giống khoảng 400 l/m3 vỏ bào. 1.7.4 Vận hành generator Trong thực tế sản xuất, người ta vận hành generator theo hướng khác nhau nhưng phổ biến nhất là trong ba hướng sau: 1. Vận hành đơn: Hỗn hợp dịch lên men chỉ đi qua generator một lần, trong kiểu vận hành này dung dịch ban đầu được acid hóa đến 3 – 3,5% acid. Dịch sau khi qua generator sẽ đạt nồng độ cỡ 6%. Vận hành kép: Dịch lên men sau khi đi qua generator được acid hóa một phần và sẽ được giấm hóa hoàn toàn sau khi qua generator thứ 2, thứ 3,…đặt nối tiếp với generator đầu (đặt chồng lên nhau). Generator tuần hoàn: Dịch lên men sau khi đi qua generator được bơm tuần hoàn liên tục qua generator cho đến khi được giấm hóa hoàn toàn. Trong loại này và vận hành kép dịch lên men ban đầu có thể không cần acid hóa hoặc chỉ acid hóa đến 1% acid. Các generator tuần hoàn được sử dụng rộng rãi nhất do nó có những ưu điểm sau: Hoạt động với giá thành thấp Tương đối đơn giản, dễ khống chế, điều khiển Tiết kiệm nhiều không gian, để sản xuất cùng một lượng giấm, trong cùng một thời gian cần dùng ít đệm hơn Điều kiện cần thiết của phương pháp này là duy trì nhiệt độ trong buồng oxy hóa ở một giới hạn xác định đảm bảo cho quá trình tạo acid mạnh nhất (tốt nhất là giữ phần trên ở 300C, phần dưới gần 33 – 340C). Nhờ nhiệt độ này không khí bên ngoài không ảnh hưởng đến sự làm việc của generator do đó sản xuất không phụ thuộc vào thời tiết. Khi tuần hoàn có thể đưa generator luôn làm việc với nồng độ acid cao, như vậy một mặt tránh được sự tạp nhiễm có thể có (do thông khí tự nhiên), mặc khác luôn kích thích cho vi khuẩn phát triển và như vậy tốc độ tạo acid là rất cao, rút ngắn thời gian lên men. 1.7.5 Năng suất và hiệu quả của generator: Năng suất và hiệu suất là chỉ tiêu quan trọng đặc trưng cho sự làm việc của generator (và cũng chính là phương pháp nhanh sản xuất giấm). Năng suất của generator được xác định bằng lượng giấm (acid acetic 100%) nhận được từ 1m3 vỏ bào (vật liệu bám) trong một ngày đêm. Ở các generator làm việc tốt có thể đạt 2,9 kg acid acetic/1m3 vỏ bào. Hiệu suất lý thuyết theo cơ chế phản ứng là 103 kg acid acetic từ 100kg rượu khan. Nhưng thực tế ở các thiết bị lên men không có tháp ngưng tụ chỉ đạt 75 kg acid acetic mà thôi, còn các thiết bị ngưng tụ có thể đạt 93 kg acid acetic (tương đương 72,8% và 90,2%). Hiệu suất của quá trình sản xuất giấm không cao là do các nguyên nhân sau: Do oxy hóa không hoàn toàn rượu để đảm bảo còn lại trong giấm khoảng 0,3 – 0,5% rượu nhầm tránh sự quá oxyl hóa rượu. Tổn thất do quá oxy hóa, đặc biệt khi generator làm việc với nồng độ acid thấp (khi nồng độ gần 10% thì mất mát này không đáng) Tổn thất do rượu và giấm bay hơi, đây là dạng mất mát lớn nhất trong các dạng, mất mát có thể đến 2 – 6 % lượng rượu. Nhưng cũng có thể khắc phục được bằng cách đặt một thiết bị ngưng tụ bao gồm hai thiết bị lọc than đặt kế tiếp nhau sau tháp lên men để ngưng tụ rượu, acid acetic và một số khí khác (có thể dùng than hoạt tính hoặc silicagel để nạp cho tháp lọc). Chương 2: Mô Hình Fermenter Sử Dụng Màng Sinh Học Cố Định Trong Lên Men Acid Acetic 2.1 Thiết bị phản ứng sinh học-fermenter 2.1.1 Khái niệm, phân loại Khái niệm: Thiết bị phản ứng sinh học (hay gọi là fermenter) là thiết bị thực hiện những biến đổi sinh hóa với sự tham gia của vi sinh vật hay enzyme trực tiếp. Trong công nghiệp vi sinh, dùng nhiều loại fermenter có cấu trúc và phương thức làm việc khác nhau và được phân loại như sau: Theo phương thức làm việc: fermenter làm việc liên tục và fermenter làm việc gián đoạn Theo kết cấu: Fermenter và không có cánh khuấy Theo chế độ nhiệt: Fermenter đẳng , đoạn và đa biến nhiệt Theo cấu trúc dòng: Fermenter khuấy lý tưởng, đầy lý tưởng… Theo số pha tham gia: đồng thể và dị thể Các Fermenter thường dùng: Fermenter làm việc gián đoạn: T Hình 2.1 Fermenter làm việc gián đoạn Trong các fermenter loại này cơ chất được nạp vào từng mẻ và chỉ tháo ra sau khi đã chuyển hóa xong. Tuy năng suất thấp, chất lượng sản phẩm không ổn định, nhưng do cơ cấu tương đối đơn giản, dễ thao tác, vận hành nên loại này được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp vi sinh. Fermenter hoạt động liên tục dạng thùng có cánh khuấy: Hình 2.2 Fermenter hoạt động liên tục dạng thùng có cánh khuấy Cơ chất được đưa vào fermenter liên tục, được khuấy trộn mãnh liệt trong đó và sản phẩm được lấy ra liên tục. Do sản phẩm ở dạng huyền phù nên khi lấy ra liên tục sẽ cuộn vi sinh vật ra khỏi fermenter gây tổn hao chủng vi sinh vật lớn. Vì vậy việc sử dụng fermenter dạng này bị hạn chế. Các fermenter dạng tầng sôi: Hình 2.3 Fermenter dạng tầng sôi Loại này khắc phục được nhược điểm của loại dạng thùng có cách khuấy là việc vi sinh vật bị cuốn trôi. Trong các fermenter dạng này các phân tử vi sinh vật lơ lửng trong môi trường lên men nhờ dòng chảy từ dưới lên còn lực trọng trường sẽ giữ chúng lại, không bị cuốn trôi ra khỏi fermenter. Ở trạng thái tự nhiên, vi sinh vật có khoảng 60 – 90% nước trong cơ thể, do đó chúng có khối lượng riêng xấp xỉ khối lượng riêng của nước. Vì vậy để tạo lớp tầng sôi vận tốc của dòng chảy vào fermenter phải rất nhỏ. Điều này đôi khi không phù hợp yêu cầu của công nghệ. Vì vậy việc sử dụng các fermenter dạng này còn hạn chế. Fermenter dạng ống: Chúng có tên như vậy là vì dạng bên ngoài của chúng có dạng ống. Dòng chuyển động các tác nhân phản ứng trong các fermenter dạng này là chuyển động piston, trái ngược với fermenter dạng tầng sôi và dạng thùng có cánh khuấy liên tục có quỹ đạo chuyển động là ngẫu nhiên. Hình 2.4 Fermenter dạng ống 2.1.2 Những yêu cầu chung đối với fermenter Đây là cơ sở để lựa chọn cấu trúc thích hợp khi thiết kế fermenter, đối với fermenter nói chung cần thỏa mãn một số yêu cầu sau: Yêu cầu nghiêm ngặt về độ sạch và tính bất biến của chủng vi sinh vật, yêu cầu này đòi hỏi phải tiến hành quá trình trong những điều kiện vô khuẩn. Do đó, fermenter phải có cấu trúc tương đối đơn giản, đảm bảo khả năng thanh trùng các khoang bên trong. Dễ bố trí các cơ cấu trao đổi nhiệt để khống chế nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men. Dễ chế tạo, gia công, an toàn và có hiệu quả cao. Trong các yêu cầu trên, yêu cầu đầu tiên là quyết định việc lựa chọn cấu trúc của fermenter cho hợp lý, đó là do tính đặc thù của quá trình vi sinh công nghiệp có vi sinh vật tham gia vào quá trình 2.2 Sự hình thành và phát triển của màng sinh học trên chất mang trong fermenter sử dụng màng sinh học cố định để lên men acid acetic 2.2.1 Trạng thái vi khuẩn acid acetic trong fermenter Trong fermenter sử dụng màng sinh học cố định để lên men giấm, các vi khuẩn giấm tham gia vào quá trình biến đổi sinh hóa có dạng màng bám trên bề mặt các vật rắn trơ. Trong các thiết bị dạng ống, màng sinh học bám trên bề mặt các vật rắn trơ có thể tồn tại ở hai trạng thái: cố định (tĩnh) hay linh động (các vật rắn trơ có màng sinh học che phủ lơ lửng trong môi trường lên men). Việc lựa chọn một trong hai dạng màng sinh học trên là tùy thuộc vào màng vi sinh vật đã phát triển được tách ra khỏi fermenter thế nào (trong trường hợp muốn khống chế bề dày màng). Nếu fermenter đòi hỏi làm việc trong điều kiện vô khuẩn, để đảm bảo điều đó chỉ có thể lấy màng vi khuẩn ra khỏi fermenter nhờ các biện pháp lực cắt thủy lực, tức là nhờ chuyển động của dòng lỏng và khí để tách màng sinh học ra khỏi bề mặt bám và cuốn chúng ra ngoài cùng dòng chảy. Muốn vậy các phân tử đệm phải được làm lơ lửng trong môi trường chuyển động mạnh. Còn các vi khuẩn giấm thì có khả năng lắng xuống đáy fermenter (như trong xử lý nước thải) và tách ra ngoài, lúc này lớp đệm nằm ở trạng thái tĩnh và lỏng chảy qua thiết bị ở dạng màng mỏng che phủ vùng hoạt động sinh học. 2.2.2 Cấu tạo màng vi khuẩn acid acetic Bề mặt bám Khối gel giữa các tế bào Tế bào của vi sinh vật Hình 2.5 Biểu diễn màng sinh học bám trên các vật rắn trơ Màng vi khuẩn giấm được tạo thành nhờ các biến đổi sinh hóa diễn ra trong các fermenter và bám được vào vật rắn là nhờ khả năng bám dính của màng nhầy (khối gel giữa các tế bào) của vi khuẩn. Một bề mặt nhám bất kỳ tiếp xúc với môi trường chứa các vi khuẩn giấm lơ lửng sau một thời gian nhất định sẽ trở nên hoạt động sinh học do vi sinh vật bám vào và phát triển thành lớp màng liên tục. Cơ chế quá trình bám dính này có liên quan đến bề mặt vật liệu bám (độ nhám, xốp,…) và chính bản thân vi sinh vật. 2.2.3 Sự phát triển của màng acid acetic Sự tạo thành màng vi khuẩn sẽ kèm theo sự hoạt động của thiết bị. Độ “hoạt động bề mặt” phụ thuộc vào diện tích che phủ bởi lớp màng, bề dày màng và nồng độ rượu trong môi trường dinh dưỡng. Sự phát triển của màng vi khuẩn giấm, khi giữ nguyên các thông số đầu vào, tạo nên sự phụ thuộc của sản phẩm chính vào thời gian, điều đó là sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào bề dày màng. Nếu sau một quá trình tích lũy nhất định bề dày màng không thay đổi nữa thì ta có thể coi các thông số đầu ra đạt được trạng thái ổn định. Điều đó có thể đạt được khi tải trọng vi khuẩn giấm đối với không gian tự do trên một bề mặt thể tích lớp đệm là nhỏ. Nhưng nếu tải trọng của vi khuẩn đủ lớn thì sẽ làm dạng hình học bên trong lớp biến đổi liên tục do tác động của quá trình phát triển, vi sinh vật và sự thoát đi một phần vi khuẩn ra khỏi bề mặt bám dưới tác dụng của lực trường. Kết quả là đường đi của dòng lỏng và bề mặt tiếp xúc pha rắn lỏng biến đổi. Về nguyên tắc trong môi trường có nồng độ rượu đủ lớn, màng vi khuẩn sẽ phát triển không ngừng. Nếu tốc độ tăng của bề dày màng này không lớn lắm thì profile nồng độ trong chúng ở một thời điểm bất kỳ sẽ được xem gần giống như trong lớp vi sinh vật có bề dày không đổi. Khi đó, có thể mô tả cặn kẽ sự biến đổi bề dày màng và quá trình làm việc của thiết bị. Sự tiêu thụ cơ chất để nuôi màng sinh học đã được nghiên cứu từ thực nghiệm. 2.2.4 Bề dày màng vi khuẩn acid acetic: Trong thực tế tùy theo cách nuôi màng, nồng độ các sản phẩm dạng khí khi hô hấp trong chiều sâu nhỏ của màng tăng đến mức các sản phẩm này sẽ thoát ra từ dung dịch và tạo thành những túi khí. Khí này làm cho sự bám dính giữa khối màng và bề mặt bám sẽ kém đi. Cuối cùng màng rơi ra khỏi bề mặt bám dưới tác dụng của trọng lực và còn lại một lớp vi khuẩn giấm đã giảm khả năng sống Sau đó lớp màng lại bắt đầu tăng, tuy nhiên không thể tạo bề dày màng như ban đầu vì lực bám dính giữa màng và bề mặt bám đã bị yếu đi do có mặt các vi khuẩn giấm chết trong màng. Từ đó cho thấy rằng ở một mức độ nhất định màng vi khuẩn giấm có khả năng điều chỉnh được. Tuy nhiên không nên mong đợi nhiều vào cơ chế này để đảm bảo độ dày không đổi của màng vì những nguyên nhân sau: Các sản phẩm tạo thành trong bề dày màng có thể gây độc hại cho vi khuẩn, ức chế sự phát triển của chúng, cũng như gây nhiễm bẩn cho môi trường lỏng. Màng vi khuẩn giấm bị tách ra khỏi bề mặt bám có thể gây tắc lưu thông cho dòng lỏng và gây rối loạn chế độ làm việc trong thiết bị. Dao động về bề dày ở các phần riêng biệt của màng có thể lớn đáng kể. Các vùng khác nhau của màng vi sinh vật tách khỏi bề mặt bám ở các thời điểm khác nhau. Các thiết bị có bề dày màng không đổi được sử dụng làm thiết bị thực nghiệm để nghiên cứu động học vi sinh. Còn các thiết bị có bề dày màng thay đổi được sử dụng trong xử lý H2O thải và sản xuất giấm theo phương pháp nhanh. Trong các thiết bị dạng không khống chế bề dày màng quần thể vi sinh vật lộn xộn ở mức độ cao và ở các thời điểm khác nhau là khác nhau. Chất lỏng chảy qua thiết bị ở dạng màng dưới tác dụng của lực trọng trường. Thường diện tích màng lỏng thấm ướt nhỏ hơn nhiều so với diện tích hoạt động sinh học có thể đạt cực đại. Sự phát triển của vi khuẩn giấm chỉ xảy ra ở những vùng có đủ chất dinh dưỡng. Sự phát triển màng ngay trong những vùng này chỉ được tạo ra do sự chuyển động của chất lỏng. Do đó, trong thiết bị dạng này có quan hệ tương hỗ phức tạp giữa động học vi sinh, bề dày mang sinh học và bề dày được thấm ướt. Tuy nhiên, khi mô tả động học của thiết bị phải chấp nhận một vài giả thuyết gần đúng như sau: Mặc dù một phần nào đó của bề dày hoạt động sinh học không được thấm ướt liên tục nhưng giá trị thực tế của nó không đổi Vì quần thể vi sinh vật trong thiết bị dạng này lớn nên bề dày màng sinh học có kích thước đáng kể. Khi thiết bị làm việc, ban đầu là quá trình tích lũy vi sinh vật, nó diễn ra cho đến khi sự làm việc của thiết bị không phụ thuộc và quá trình tích lũy tiếp theo. Tuy nhiên, người ta đã xác định rằng ngay khi những đặc trưng của dòng vào là không thay đổi, sự làm việc của thiết bị vẫn biến đổi theo thời gian do sinh khối phá hủy bởi sự tương tác của dòng lỏng. Sự làm việc của thiết bị sẽ biến đổi theo thời gian dao động quanh một giá trị trung bình nào đó mà không thể dự đoán được sai lệch này. THỰC NGHIỆM Chương 3: Thực nghiệm lên men giấm theo phương pháp nhanh 3.1 Thời điểm, địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm máy và thiết bị - khoa Công Nghệ Hóa – trường Đại Học Bách Khoa Thành Phố Hồ Chí Minh từ ngày 1/3/2005 đến 1/8/2005. 3.2. Thiết bị, nguyên liệu, phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thiết bị Chú thích: 1. Thùng cao vị 2. Bộ phận phân phối lỏng 3. Tháp lên men 4. Nhiệt kế 5. Bộ phận thông khí 6. Bình chứa sản phẩm 7. Bơm hoàn lưu 7 6 5 4 3 2 1 Hình 3.1 Hệ thống thiết bị lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh 3.2.1.1 Thiết bị chính (tháp lên men) Đặc điểm: loại tháp đệm, thân hình trụ được chế tạo từ vật liệu thủy tinh hữu cơ, đáy inox hoặc bằng thép không rỉ, hệ thống van và đường ống nhựa. Thông số kích thước tháp: Đường kính D=100 mm. Bề dày δ=2 mm. Chiều cao H = 1200 mm; có chiều cao lớp đệm h = 1025 Vật liệu làm chất mang vi khuẩn giấm: Trên cở sở các yêu cầu về vật liệu làm chất mang vi sinh vật đã trình bày ở phần I, nhận thấy thân tre Việt Nam có thể đáp ứng được vì có các ưu điểm: rẻ tiền, dễ kiếm, có tính trơ và độ nhám cao, bề mặt riêng lớn, không chứa các chất gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, dễ gia công và xử lý. Vì thế, chọn thân tre làm chất mang để nghiên cứu và khảo nghiệm khả năng thay thế cho phôi gỗ sồi. Hình 3.2 Vật liệu mang vi khuẩn acid acetic được làm từ thân tre Phương pháp gia công – xử lý: thân tre về được gọt bỏ lớp vỏ trơn bên ngoài để tăng độ nhám, sau đó được cắt thành những đoạn ngắn có kích thước: (xem hình 3.2) Đường kính ngoài: dN = 11.9 mm Đường kính trong: dT=8,3 mm Chiều cao: h = 12,2 mm Vật liệu bám (thân tre) được xử lý triệt khuẩn bằng hơi nước nên trước khi cho vào tháp, vật liệu đệm được đem luộc và sấy khô nhiều lần nhằm tách hết những chất không có lợi cho vi khuẩn giấm và quá trình lên men như: tinh dầu, lignin, …Sau đó, đem ngâm với dịch cấy giống trong một ngày rồi cho vào tháp một cách ngẫu nhiên để tiến hành cấy giống. 3.2.1.2 Các thiết bị phụ Bộ phận phân phối lỏng: đây là bộ phận biến dòng liên tục thành dòng gián đoạn cung cấp cho tháp lên men dưới dạng xung. Nó hoạt động theo cơ cấu máng lật. Lưu lượng lỏng được đo bằng cách thay đổi đối trọng ở máng lật để đo thể tích dịch lên men trong mỗi lần lật, và dùng thì kế để đo thời gian mỗi lần lật. Lưu lượng dòng lỏng: 50÷200ml/phút; Lưu lượng kế khí (rotameter): thang đo từ 0 đến 1,54m3/ph; Bình mariot: ổn định lưu lượng lỏng theo nguyên tắc chiều cao hình học của dòng chảy không đổi; Bơm hoàn lưu: công suất 1/4 Hp; năng suất 0,1 m3/h Các thiết bị được mô tả theo sơ đồ hệ thống hình 3.4 3.2 Nguyên liệu 3.2.1 Giống vi khuẩn giấm Chọn giống: như đã trình bày ở phần I, giống vi khuẩn giấm được chọn để nghiên cứu quá trình lên men là giống acetobacter – loài aceti vì có nhiều ưu điểm thích hợp cho phương pháp lên men nhanh: Có độ bám dính cao. Tạo màng mỏng tơi xốp. Tích lũy và chịu được nồng độ axit cao khoảng 6%. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn acetobacter: chúng là trực khuẩn ngắn, không chuyển động và có thể liên kết với nhau tạo thành chuỗi dài, nhuộm màu vàng với dung dịch iod, có thể sống ở nồng độ cồn khá cao 11%. Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 340C. Nếu nhiệt độ cao quá (400C) sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Nhiệt độ trung bình của miền Nam rất phù hợp cho sự phát triển của con giấm. (Theo Nguyễn Công Huân, 1985). Những chủng vi khuẩn aceti này rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh. Từ một tế bào sau 12h có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng. (Lương Đức Phẩm, 1998) Giống vi khuẩn giấm acetobacter aceti được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, vi khuẩn này đã được phân lập và nuôi thuần chủng. 3.2.2 Thành phần môi trường và cấy giống lên men Trong quá trình lên men vi sinh vật thường lấy chất dinh dưỡng từ dịch lên men. Do đó, việc cung cấp đầy đủ và cân đối các thành phần dinh dưỡng trong dung dịch lên men là một trong những yếu tố quyết định đến năng suất của cả quá trình lên men. Thành phần dịch lên men hay môi trường lên men phải có đầy đủ các thành phần cơ bản sau: nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Các chất hữu cơ dùng làm nguồn dinh dưỡng cacbon cho sự phát triển của vi khuẩn giấm có thể kể đến như: cồn, các loại nước ép trái cây có đường, mật rỉ, đường đơn, đường kép,… Như đã trình bày ở phần trên (xem 1.6) thì nước dùng trong quá trình lên men phải đảm bảo đúng tiêu chuẩn nước uống. Nước này phải không có màu, mùi, vị lạ, không chứa kim loại nặng (thuỷ ngân, bari, chì,…). Vì vậy, nước được chọn dùng để pha môi trường lên men trong thí nghiệm này là nước máy đã qua quá trình xử lý. Môi trường cấy giống và lên men được pha theo thực đơn tham khảo do Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh có thành phần ở bảng 3.1 sau: Bảng 3.1. Thành phần của môi trường cấy giống và lên men Môi trường Thành phần Số lượng Cấy giống Nước máy 5lít Đường glucose 50g Cao nấm men 25g Pepton 15g Cồn thực phẩm 25ml Acid acetic 1,5ml Nước dừa già 1lít Giống (từ lên men chậm) - Lên men Nước máy 20lit Đường glucose 200g Cồn thực phẩm 800ml Nước dừa già 2lit Acid acetic 200ml Dung dịch môi trường (khi chưa bổ sung dịch giống) thì được đem khử trùng. Chế độ khử trùng chung cho hai môi trường trên là: 1210C, trong 20 phút. Trước khi lên men thì mới bổ sung dịch giống vào môi trường đã khử trùng. 3.2.3 Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm khác: Máy đo pH: 744 pH Meter Các dung dịch dùng chuẩn độ: NaOH 0,1N; HCl 0,1N và phenolphthalein. Nhiệt kế, đồng hồ, pipet, buret, phiểu, bình tam giác, ống đong, … 3.3 Phương pháp thí nghiệm 3.3.1 Cấy giống (a) (b) (a). Chưa có màng vi khuẩn (b). Màng vi khuẩn đã phát triển Hình 3.3 Tháp lên men trước và sau khi cấy giống vi khuẩn acid acetic Pha dịch cấy giống theo bảng 3.1. Sau đó, đem khử trùng và tiến hành lên men theo phương pháp chậm trong 7 ngày. Kiểm tra nồng độ acid acetic 2% là được và cho tưới dịch qua tháp đã có sẵn chất mang vi khuẩn giấm (hình) với lưu lượng dòng lỏng không đổi 80ml/ph, tháp được thông khí tự nhiên. Tiếp tục tuần hoàn dịch với chế độ trên, theo dõi nhiệt độ trong và ngoài tháp (nhiệt kế được cắm trực tiếp vào tâm tháp như sơ đồ hệ thống lên men hình 3.4). Khi thấy nhiệt độ trong và ngoài tháp chênh lệch từ 2÷50C, nồng độ acid ở đầu vào và đầu ra có biến đổi và có màng mỏng màu trắng đục của vi khuẩn giấm bám trên bề mặt chất mang, đó là những dấu hiệu cho thấy vi khuẩn đã bám vào chất mang, đang sinh trưởng và phát triển. Lúc này, có thể tiến hành thí nghiệm lên men. Thời gian cấy trong vòng 04 ngày – đêm. 3.3.2 Lên men Pha dịch lên men theo bảng 3.1 rồi đem khử trùng. Sau đó, dịch lên men được tưới vào tháp lên men theo sơ đồ hệ thống thí nghiệm (hinh 3.4). Chú thích: 1. Lưu lượng kế 2. Quạt 3. Thùng cao vị 4. Thùng phân phối lỏng 5. Lổ lấy mẫu 6. Nhiệt kế 7. Cột chêm 8. Bộ phận thông khí 9. Thùng chứa sản phẩm 10. Bơm hoàn lưu Hình 3.4 Sơ đồ hệ thống thiết bị thí nghiệm lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh Với sơ đồ hình 3.4, dịch lên men được cho vào bình mariot (3) và chảy xuống bộ phận phân phối lỏng (4) theo cơ cấu máng lật, dịch được tưới đều vào khối đệm trong tháp lên men (7) theo một chu kỳ thích hợp. Dịch lên men chảy từ đỉnh tháp xuống tiếp xúc với màng vi khuẩn giấm bám trên các đệm tre. Tại đây, quá trình lên men sẽ diễn ra. Tùy vào chế độ khảo sát mà không khí được thông tự nhiên bởi ống thông khí (8) hay cưỡng bức nhờ quạt thổi (2) qua lưu lượng kế (1) từ dưới đáy tháp lên. Dịch lên men sau khi qua tháp, chảy vào bình chứa sản phẩm (9), một phần sẽ được hoàn lưu lên đỉnh tháp nhờ bơm hoàn lưu (10) (khi cần khảo sát dòng hoàn lưu). Trong quá trình lên men, nhiệt độ được theo dõi nhờ nhiệt kế (6). Mỗi chế độ thí nghiệm, cho hệ thống chảy ổn định khoảng một giờ để vi khuẩn giấm có thời gian thích ứng với điều kiện thí nghiệm. Sau đó mới lấy mẫu đem chuẩn độ, ở đây chọn chế độ thí nghiệm thông khí tự nhiên. 3.3.3 Cách lấy mẫu Mỗi thí nghiệm giữ nguyên cố định lưu lượng lỏng là 80ml/phút. Tùy theo yêu cầu của mỗi chế độ thí nghiệm thực nghiệm mà mẫu được lấy ra theo các vị trí khác nhau trên tháp. Tháp lên men được chia thành các vị trí lấy mẫu khác nhau như sau: Ra Vào Hình 3.5 Sơ đồ vị trí lấy mẫu trên thân tháp Nhưng trong quá trình thí nghiệm thực nghiệm này chúng ta chỉ lấy mẫu ở vị trí 0 và 6 tức là đầu vào và đầu ra của hệ thống lên men. Để tránh sai số ở mỗi thí nghiệm, lấy 3 mẫu cách nhau 15 phút đem phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. 3.3.4 Khảo sát thí nghiệm của thành phần môi trường lên tốc độ lên men 3.3.4.1 Trên thành phần môi trưòng nước dừa 3.3.4.1.1 Thay đổi nồng độ phần trăm môi trường nước dừa A Thí nghiệm thăm dò bằng lên men chậm Mục đích: tìm thành phần môi trường lên men đạt hiệu quả cao nhất khi thay đổi hàm lượng nước dừa trong môi trường. Thành phần môi trường: tổng thể tích 1 lít Nước máy: 0,79 l Cồn: 40 ml Acid acetic: 20 ml Đường: 10 g Nước dừa già: 100 ml (10%- thay đổi theo từng môi trường) Dịch giống 50 ml Chỉ thay đổi hàm lượng nước dừa và nước máy trong môi trường để tổng thể tích là 1lít. Khi đó ta thay đổi thành phần môi trường bằng việc tăng hàm lượng phần trăm nước dừa: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Sau đó tiến hành lên men thử nghiệm bằng phương pháp lên men chậm. Sau khi pha môi trường, mỗi môi trường cho vào một bình riêng, đậy kín và để ở nơi yên tĩnh. Mỗi ngày lấy 5ml dịch lên men ở từng môi trường lên men khác nhau đem chuẩn độ acid bằng dung dịch NaOH 0.1N. B Thí nghiệm chính bằng lên men nhanh Mục đích: kiểm tra bằng thực nghiệm lên men nhanh các môi trường với thành phần môi trường đã thay đổi nồng độ nước dừa, để đánh giá chính xác hiệu quả lên men nhanh của thành phần môi trường đem thí nghiệm. Ở từng thành phần môi trường khác nhau: 10%, 20%, 30%. Pha 20l môi trường nước dừa. Sau đó cho lên men nhanh từng môi trường ở cùng điều kiện thí nghiệm. Thành phần môi trường cơ bản với hàm lượng nước dừa 10%: tổng thể tích 20l Nước máy: 16,8 l Nước dừa già: 2 l (10%) Cồn: 800 ml Acid acetic: 400 ml (2%) Đường: 200 g Tiến hành lên men nhanh từng môi trường: dịch lên men được tưới qua tháp với lưu lượng không đổi 80ml/phút và hoàn toàn thông khí tự nhiên. Dịch mẫu thí nghiệm được lấy định kỳ, mỗi lần lấy 5ml ở hai vị trí đầu vào và đầu ra của thiết bị lên men nhanh (như vị trí lấy mẫu ở hình 3.5), đem chuẩn độ acid acetic bằng dung dịch NaOH 0,1N. 3.3.4.1.2 So sánh quá trình lên men nhanh và lên men chậm của môi trường nước dừa Mục đích: đánh giá tính hiệu quả của quá trình lên nhanh so với lên men chậm. Thành phần môi trường như thí nghiệm chính ở trên với hàm lượng nước dừa 30 %. Pha 20l môi trường nước dừa. Sau đó lấy ra 2l môi trường vừa pha đem lên men chậm. Cùng lúc đó đem dung dịch môi trường còn lại tiến hành lên men nhanh. Lên men chậm: dịch lên men được cho vào bình, đậy kín và để ở nơi yên tĩnh. Mẫu được lấy định kỳ, mỗi lần lấy 5ml dịch lên men đem chuẩn độ acid. Lên men nhanh: dịch lên men được tưới qua tháp với lưu lượng không đổi 80ml/phút và hoàn toàn thông khí tự nhiên. Dịch mẫu thí nghiệm được lấy định kỳ, mỗi lần lấy 5ml ở hai vị trí đầu vào và đầu ra của thiết bị lên men nhanh (như hình 3.5), đem chuẩn độ acid acetic bằng dung dịch NaOH 0,1N. 3.3.4.2 Trên môi trường dung dịch nước đường 3.3.4.2.1. Thay đổi thành phần nước đường trong môi trường lên men A. Thí nghiệm thăm dò (lên men chậm) Mục đích: tìm môi trường có hiệu quả lên men khả quan, thử nghiệm xem khả năng thích ứng của vi khuẩn giấm trong điều kiện nhiều đường (do theo lý thiết thì vi khuẩn giấm có khả năng chuyển hóa môi trường có nhiều đường thành acid acetic –qua giai đoạn trung gian là chuyển hoá đường thành cồn). Thành phần môi trường: tổng thể tích 1 lít Nước máy: 0,79 l Cồn: 40 ml Acid acetic: 20 ml Đường: 10 g (1% - thay đổi) Nước dừa già: 100 ml Dịch giống 50 ml Thực hiện thí nghiệm thăm dò bằng quá trình lên men chậm, với nhiều môi trường có hàm lượng đường khác nhau: 1%, 2.5%, 5%, 7.5% và 10% tương ứng với hàm lượng đường trong môi trường là: 10g, 25g, 50g, 75g và 100g . Sau khi pha môi trường, mỗi một môi trường cho vào một bình riêng, đậy kín và để ở nơi yên tĩnh. Mỗi ngày lấy 5ml dịch lên men ở từng môi trường lên men khác nhau đem chuẩn độ acid bằng dung dịch NaOH 0.1N. B. Thí nghiệm chính (lên men nhanh) Tiến hành lên men nhanh với các môi trường đã thay đổi hàm lượng đường 2.5%, 5%, 7.5% ở cùng điều kiện thí nghiệm. Mỗi môi trường pha 20l, với thành phần cơ bản như sau: Nước máy: 16,8 l Nước dừa gia: 2 l Cồn: 800 ml Acid acetic: 400 ml Đường: 200 g (1%) Dịch lên men được tưới qua tháp lên men với lưu lượng không đổi 80ml/phút và hoàn toàn thông khí tự nhiên. So sánh môi trường lên men nhanh và lên men chậm của môi trường nước đường Pha 20l môi trường dung dịch nước đường . Sau đó lấy ra khoảng 2l môi trường vừa pha đem lên men chậm. Cùng lúc đó đem dung dịch môi trường còn lại tiến hành lên men nhanh. Lên men chậm: dịch lên men được cho vào bình, đậy kín và để ở nơi yên tĩnh. Mẫu được lấy định kỳ, mỗi lần lấy 5ml dịch lên men đem chuẩn độ acid. Lên men nhanh: dịch lên men được tưới qua tháp với lưu lượng không đổi 80ml/phút và hoàn toàn thông khí tự nhiên. Dịch mẫu thí nghiệm được lấy định kỳ, mỗi lần lấy 5ml ở hai vị trí đầu vào và đầu ra của thiết bị (lên men nhanh) đem chuẩn độ acid acetic bằng dung dịch NaOH 0,1N. 3.3.5 Khảo sát khả năng thay thế của thân tre làm chất mang vi khuẩn acid acetic Mục đích: tìm vật liệu bám thích hợp có khả năng thay thế gỗ sồi trong quá trình lên men nhanh acid acetic. Pha dịch lên men, tưới qua tháp với lưu lượng không đổi 100ml/phút, thông khí tự nhiên. Sau thời gian lên men kiểm tra tính chất của các phần tử đệm bằng quan sát và nhận xét định tính. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chương 4: Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên tốc độ lên men 4.1 Khảo sát môi trường mới khi thay đổi thành phần nước dừa 4.1.1. Thí nghiệm thăm dò: (lên men chậm) Thí nghiệm với các môi trường có hàm lượng nước dừa khác nhau: sau 9 ngày tiến hành quá trình lên men chậm ta thu được kết quả được trình bày ở Bảng 3.2 Bảng 3.2 Nồng độ % acid theo thời gian lên men chậm (môi trường nước dừa) Môi trường nước dừa Ngày 10% 20% 30% 40% 50% 0 2.19 2.24 2.19 2.14 2.15 1 2.23 2.27 2.23 2.15 2.18 2 2.28 2.35 2.29 2.41 2.48 3 2.59 3.03 3.02 3.3 3.16 4 3.33 3.71 3.87 4.21 4.13 5 3.9 4.3 4.4 5.15 5.17 6 4.61 5.57 5.75 5.35 5.51 7 5.09 5.95 6.26 5.59 5.75 8 5.42 6.1 6.78 5.44 5.59 9 5.78 6 6.53 5.17 5.32 Qua bảng 3.2 ta thấy (xem h ình 4.1): Hình 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa trong quá trình lên men chậm Thảo luận: từ hình 4.1 trên ta nhận thấy rằng khi tăng hàm lượng nước dừa trong môi trường lên thì nồng độ acid aetic được sinh ra cũng tăng lên, cao nhất ở hàm lượng 30%. Nhưng khi tăng hàm lượng nước dừa lên: 40%, 50%. Thì nồng độ acid sinh ra không tăng theo nữa mà nằm ở mức độ gần như bão hòa bằng với lượng acid được sinh ra ở nước dừa 10%, 20%. Từ đó ta có thể kết luận rằng với môi trường nước dừa 30% thì hiệu quả lên men chậm là tốt nhất. Thí nghiệm chính (lên men nhanh) Sau quá trình lên men nhanh thực nghiệm các môi trường có thành phần nước dừa khác nhau. Ta có kết quả được trình bày ở Bảng số liệu 3.3. Bảng 3.3 Độ chuyển hóa (Ci/C0) của môi trường nước dừa Ci/C0 Giờ (h) 10% 20% 30% 2 1.0528 1.08092 1.1081 4 1.0448 1.05882 1.0792 6 1.0441 1.04734 1.0786 8 1.0296 1.04582 1.0724 12 1.0278 1.04279 1.061 14 1.0254 1.04251 1.0597 16 1.0199 1.0411 1.0429 18 1.0158 1.04098 1.0442 22 1.0165 1.04082 1.0435 24 1.0155 1.03465 1.0371 26 1.0128 1.03311 1.031 28 1.0109 1.02917 1.0302 30 1.0106 1.02869 1.0238 34 1.0071 1.02427 1.0237 36 1.0053 1.01439 1.0174 38 1.0053 1.02621 1.0202 40 1.013 1.01976 1.0201 44 1.0076 1.00954 1.009 C0: nồng độ acid acetic đầu vào cơ chất của dịch lên men Ci: nồng độ acid acetic đầu ra sản phẩm lên men Qua bảng số liệu 3.3 ta thấy (xem h ình 4.2): Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ nước dừa trong quá trình lên men nhanh Thảo luận: nhưng với quá trình lên men nhanh các môi trường có thành phần với hàm lượng nước dừa khác nhau, từ kết quả được thể hiện qua hình 4.2 thì qua quá trình lên men nhanh cũng đã chứng minh được rằng môi trường nước dừa nồng độ 30% có tốc độ chuyển hóa cơ chất Ci/C0 tốt hơn. Điều này cho chúng ta thấy rằng khi lên men nhanh với hàm lượng nước dừa 30% trong môi trường sẽ đạt hiệu quả lên men tốt nhất. 4.2 So sánh giữa lên men nhanh và lên men chậm với môi trường nước dừa Sau quá trình thực nghiệm được trình bày ở phần 3.3.4.1.2 ta thu được kết quả được thể hiện qua bảng số liệu 3.4 và 3.5: Bảng 3.4 Kết quả lên men nhanh của môi trường nước dừa 30% Bảng 3.5 Kết quả lên men chậm của môi trường nước dừa 30% Bảng 3.4 Bảng 3.5 T (h) C(%) acid T (h) C(%) acid 0 2.22 0 2.22 2 2.46 8 2.226 4 2.58 24 2.238 6 2.598 48 2.28 12 3.024 60 2.568 14 3.066 72 3.87 16 3.12 84 4.4 22 3.186 92 5.15 24 3.624 26 3.636 28 3.912 30 3.984 36 4.032 38 4.128 40 4.152 42 4.212 44 4.248 46 4.272 Qua bảng số liệu 3.4 và 3.5 ta thấy (xem hình 4.3): Hình 4.3 So sánh đối chứng giữa phương pháp nhanh và chậm của môi trường nước dừa Thảo luận: từ đồ thị 4.3 cho ta thấy trong cùng điều kiện về môi trường lên men, nhiệt độ, giống vi khuẩn. Với phương pháp lên men nhanh chỉ sau 46h nồng độ acid đạt xấp xỉ 4,3% acid. Trong khi đó, cùng điều kiện thí nghiệm phương pháp lên men chậm chỉ cho nồng độ acid khoảng 2,6%. Điều này chứng tỏ thiết bị lên men nhanh có bề mặt lên men lớn hơn rất nhiều so với lên men chậm nên tạo được bề mặt tiếp xúc pha lớn dẫn đến việc cho năng suất lên men lớn hơn. Mặc khác, với thiết bị lên men của quy mô phòng thí nghiệm, ta thấy rằng để đạt nồng độ xấp xỉ 2,6%,quá trình lên men chậm cần phải tốn khoảng thời gian gần 60h còn với quá trình lên men nhanh chỉ cần khoảng 4h là đã có nồng độ acid tương đương. Từ quy mô nhỏ phòng thí nghiệm nếu nghiên cứu phát triển thành quy mô công nghiệp thì sự khác biệt này có ý nghĩa rất lớn. Ngoài ra, khi để lên men chậm đạt nồng độ acid cực đại thì giá trị này còn cao hơn nồng độ đạt được trong quá trình lên men nhanh. Lý do là rượu và acid bay hơi ở nhiệt độ thường, nên trong quá trình tưới dung dịch môi trường qua tháp, một lượng lớn cơ chất rượu đã bay hơi làm nồng độ đạt được sau quá trình lên men giảm. 4.3 Khảo sát thực nghiệm khi thay đổi thành phần nước đường pha 4.3.1 Thí nghiệm thăm dò (lên men chậm) Sau 9 ngày khảo sát thực nghiệm lên bằng quá trình lên men chậm (xem phần 3.3.4.2.1) ta có kết quả được thể hiện qua bảng số liệu 3.6 sau: Bảng 3.6 Nồng độ % acid theo thời gian lên men chậm (môi trường nước đường) Môi trường nước đường Ngày 1% 2.50% 5% 7.50% 10% 0 2.19 2.11 2.106 2.09 2.02 1 2.23 2.12 2.136 2.1 2.05 2 2.28 2.15 2.15 2.14 2.08 3 2.59 2.85 2.78 2.54 2.62 4 3.33 3.66 3.26 3.01 3.04 5 3.9 4.25 3.73 3.4 3.43 6 4.61 5.5 5.25 4.63 4.55 7 5.09 5.28 5.37 4.81 4.84 8 5.18 5.14 5.35 5.62 5.14 9 5.14 5 5.29 5.51 5.02 Qua bảng số liệu 3.6 ta thấy (xem hình 4.4): Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ nước đường trong quá trình lên men chậm Thảo luận: từ biểu đồ hình 4.4 của thí nghiệm lên men chậm thăm dò có thể rút ra một số nhận xét sau: qua khảo sát thực nghiệm môi trường nước đường hàm lượng 7,5% tạo ra được nồng độ cao nhất nhưng tốn thời gian lâu hơn so với môi trường nước đường hàm lượng 2,5% (nồng độ acid tạo ra gần xấp xỉ). Về vấn đề này có thể được giải thích như sau: Do giống vi sinh vật acetobacter aceti này được nuôi cấy và giữ giống trong môi trường hàm lượng đường 1%. Cho nên khi tăng hàm lượng đường lên: 2.5%, 5%, 7.5%,… đem so ra thì là quá cao so với điều kiện sống của vi khuẩn. Vì thế với môi trường nước đường hàm lượng 7,5% thì vi khuẩn giấm cần thời gian thích nghi lâu hơn so với môi trường nước đường lượng 2,5%. Mặc khác, trong quá trình thích nghi với môi trường giàu đường thì vi khuẩn đã chuyển một phần đường thành rượu. Sau đó vi khuẩn phát triển thực hiện quá trình lên men chuyển hóa rượu thành acid acetic nên lượng acid được sinh ra cao hơn. 4.3.2 Thí nghiệm chính (lên men nhanh) Sau quá trình lên men, khảo sát thực nghiệm ta thu được bảng số liệu sau: Bảng 3.7 Nồng độ chuyển hóa (Ci/C0) của các môi trường nước đường lên men nhanh Ci/C0 Giờ (h) ND2.5% ND5% ND7.5% 2 1.221212 1.142857 1.082888 4 1.116279 1.071429 1.040816 6 1.098143 1.054038 1.050725 10 1.075556 1.02381 1.040724 12 1.06278 1.028384 1.038961 14 1.060345 1.030435 1.037815 16 1.044905 1.027957 1.032258 20 1.039451 1.025586 1.02439 22 1.040076 1.017143 1.031553 24 1.037951 1.018657 1.020492 26 1.014815 1.01107 1.012097 28 1.016544 1.023766 1.023891 32 1.009091 1.006897 1.023569 34 1.013962 1.010309 1.019934 36 1.013937 1.012007 1.018062 38 1.019064 1.010256 1.006061 Qua bảng số liệu 3.7 ta thấy (xem hình 4.5): Hình 4.5 Ảnh hưởng của nồng độ nước đường trong quá trình lên men nhanh Thảo luận: qua biểu đồ 4.5 quá trình lên men nhanh môi trường nước đường hàm lượng 2,5% có độ chuyển hóa tốt hơn là do vi sinh vật thích nghi nhanh hơn so với môi trường hàm lượng đường cao (5% hay 7.5%). Với môi trường giàu đường khi tưới qua tháp thì vi khuẩn không đủ thời gian vừa thích nghi, vừa tạo hệ enzym chuyển hóa đường thành rượu. Nên độ chuyển hóa môi trường hàm lượng 5% và 7.5% sẽ không bằng độ chuyển hóa sản phẩm của môi trường hàm lượng 2,5%. Qua đấy chúng ta cũng thấy rằng: nếu sử dụng môi trường nhiều đường đem rượu hóa trước khi lên men nhanh sẽ đạt hiệu quả tốt hơn vì khi đó không mất thời thời gian thích nghi cũng như tạo hệ enzym chuyển hóa đường thành rượu. 4.4 Thí nghiệm thực nghiệm so sánh giữa lên men nhanh và lên men chậm với môi trường nước đường Sau quá trình khảo sát lên men thực nghiệm nhanh và chậm (xem phần 3.3.4.2.2) ta thu được kết quả qua bảng số liệu 3.8 và 3.9 sau: Bảng 3.8 Kết quả lên men nhanh của môi trường nước đường Bảng 3.9 Kết quả lên men chậm của môi trường nước đường Bảng 3.8 Bảng 3.9 T (h) C(%) acid T (h) C(%) acid 0 2.244 0 2.232 2 2.43 8 2.244 4 2.448 24 2.262 6 2.496 48 2.472 8 2.52 60 3.18 16 2.55 72 3.5 18 2.76 84 4.4 20 2.88 96 5.15 22 2.964 24 2.988 30 3.012 32 3.48 34 3.6 36 3.648 38 3.684 44 3.72 46 3.984 48 4.068 50 4.116 52 4.176 Qua bảng số liệu 3.8 và 3.9 ta thấy (xem hình 4.6): Hình 4.6 So sánh đối chứng giữa phương pháp nhanh và chậm của môi trường nước đường Thảo luận: từ đồ thị 4.6 ta thấy rằng về thời gian lên men lâu cho cả hai phương pháp nhanh và chậm thì nồng độ acid sinh ra không khác biệt nhau là mấy (nếu không muốn nói là lượng acid sinh ra ở lên men nhanh còn thấp hơn chậm). Nhưng trong khoảng thời gian ngắn khoảng 40h thì lên men chậm vi khuẩn cần thích nghi, tăng trưởng và phát triển để thực hiện quá trình lên men sau đó. Còn lên men nhanh thì màng vi sinh vật đã bám và phát triển trên vật liệu bám chỉ làm nhiệm vụ chuyển hóa rượu thành acid. Trong quá trình thí nghiệm ta thấy sau khoảng thời gian gần 60 h, trong bình lên men chậm bắt đầu xuất hiện màng vi khuẩn giấm trên mặt dung dịch. Từ lúc đó acid trong dịch lên men được sinh ra rất nhanh (phù hợp với đồ thị hình 4.6). Đây chính là ưu điểm làm quá trình lên men nhanh. Để đạt được nồng độ acid cao khoảng 4,5 lên men nhanh chỉ cần thời gian khoảng 40h còn lên men chậm thì cần thời gian gấp đôi và phảI qua thời gian tiềm phát. Từ hình trên ta thấy rằng, trong quá trình lên men nhanh muốn đạt nồng độ acid là 4.5 % thì phải qua 4 chu kỳ hoàn lưu. Qua đó trong sản xuất muốn đạt nồng độ acid đó ta có thể thiết kế hệ thống cột chêm có chiều dài gấp 4 lần (nhược điểm là khi đó thiết bị lên men sẽ khá cao rất khó tìm vị trí lắp đặt và bất tiện) hoặc lắp 4 hệ thống riêng biệt nối tiếp nhau. Khảo sát khả năng thay thế của thân tre làm chất mang vi khuẩn acid acetic Sau thời gian lên men nhanh các môi trường thí nghiệm. Kiểm tra bằng quan sát và nhận xét định tính các tính chất của các phần tử đệm ở bảng 3.10: Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra định tính các tính chất của chất mang chế tạo từ tre STT Chỉ tiêu Tính chất 1 Độ rắn Không giảm nhiều 2 Độ nhám Không đổi 3 Bề mặt riêng Không đổi 4 Độ xốp Không đổi 5 Màu sắc Đậm hơn Qua đó cho thấy sau quá trình lên men, chất mang vi khuẩn làm từ thân tre vẫn còn đảm bảo tốt mọi yêu cầu về công nghệ lên men đưa ra. Đặc biệt là trong quá trình lên men, đệm tre không tiết ra chất gây hại cho vi khuẩn giấm. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết quả thu được chúng ta có thể rút ra một số kết luận sau: 1.Trong cùng điều kiện lên men: môi trường, nhiệt độ giống vi khuẩn giấm acetobacter aceti phương pháp lên men nhanh cho sản phẩm có nồng độ acid xấp xỉ 4.2% sau thời gian 52h, với cùng thời gian này, phương pháp lên men chậm cho sản phẩm có nồng độ chỉ đạt gần 2,6%. Điều này chứng tỏ thiết bị lên men nhanh có bề mặt lên men lớn hơn lên men chậm nhiều lần nên cho năng suất cao hơn. Rõ ràng, phương pháp lên men nhanh được chọn để nghiên cứu có ưu thế vượt trội so với phương pháp chậm. 2. Để đạt hiệu suất cao trong quá trình lên men nhanh, môi trường lên men có thể tăng hàm lượng nước dừa lên đến hơn 30%. Nếu môi trường là dung dich nước đường pha thì hàm lượng đường có thể nằm trong khoảng 2 – 7%. 3. Sự cung cấp oxy là yếu tố quyết định đến kỹ thuật sản xuất giấm. 4.Kết quả cho thấy đệm làm từ thân tre Việt Nam sau khi gia công – xử lý hoàn toàn có thể dùng để thay thế cho phôi gỗ sồi trong lên men giấm theo phương pháp nhanh. Vì sau thời gian dài chịu tác dụng của môi trường lên men, các tính chất của các phần tử đệm cho thấy vẫn còn đảm bảo tốt mọi yêu cầu của công nghệ lên men. Kiến nghị Cần có biên pháp để giảm được lượng rượu và acid acetic bay hơi ở nhiệt độ thường với từng nồng độ xác định. Cần thí nghiệm khảo sát thêm tốc độ sục khí ảnh hưởng để quá trình lên men đạt được hiệu suất cao nhất. Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu tự nhiên (nguồn phế liệu của công nghệ chế biến thực phẩm: nước ép dứa -từ vỏ và cùi quả dứa, nước ép từ mía,…) lên men nhằm tận dụng nguồn nước ép có chứa đường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Hữu Hiếu, 2004. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid acetic bằng phương pháp sinh học. Luận văn thạc sĩ. Đại học Bách Khoa TP.HCM 2. Đinh Khắc Hải, 2001. Thiết kế phân xưởng sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men phục vụ chế biến mủ cao su. Luận văn tốt nghiệp. Đại học Bách Khoa TP.HCM 3. Nguyễn Đức Lượng,2002. Công nghệ vi sinh. Tập 2. NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM 4. Đinh Thị Kim Nhung, 1996. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter và ứng dụng chúng trong lên men acetic theo phương pháp chìm. Luân văn phó tiến sĩ Khoa Học Sinh Học, Hà Nội. 5. Lương Đức Phẩm, 1998. Công nghệ vi sinh. Nxb Nông Nghiệp Hà Nội. 6. Lê Ngọc Tú, 1998. Hóa sinh công nghiệp. Nxb Khoa Học và Kỹ Thuật. 7. Nguyễn Công Huân, 1985. Tiểu công nghiệp thực phẩm. Nxb Tp.Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Lân Dũng và ctv, 1997. Vi sinh vật học. Nhà xuất bản giáo dục. 9. Vương Thị Việt Hoa, 2003. Giáo trình thực tập vi sinh thực phẩm. Trường Đại Học Nông Lâm. 10. Trần Minh Tâm, 2000. Công nghệ vi sinh ứng dụng. Nxb Nông Nghiệp, Tp.Hồ Chí Minh. 11. Vương Thị Việt Hoa, 1999. Giáo trình vi sinh vật học đại cương. Trường Đại Học Nông Lâm. 12. Các luận văn có liên quan về sản xuất giấm. 13. Các chất gia vị - giấm, 2003. www.thuvienhoasen.org/u-dd-10-giavinauan.htm.