Khóa luận Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải ssr60f và coker 312 bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: PHẠM QUYẾT THẮNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Cúc Hoà Sinh viên thực hiện: Phạm Quyết Thắng 3 LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học. Các Thầy cô trong và ngoài Trƣờng Đại Học Nông Lâm. Đã truyền đạt cho em những kiến thức khoa học trong thời gian em học tập tại trƣờng. Đặc biệt xin chân thành cảm ơn: TS. Trần Thị Cúc Hòa- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, TS. Trần Thị Dung- Trƣởng bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong nghiên cứu và thực hiện khóa luận. TS. Trần Ngọc Thạch đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận. Các anh chị trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Xin cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã động viên giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những ngƣời đã sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ con và luôn bên con trong mọi thời điểm. Thủ Đức, ngày 15 tháng 09 năm 2005 Phạm Quyết Thắng 4 TÓM TẮT PHẠM QUYẾT THẮNG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ CÚC HÒA Nghiên cứu chuyển nạp gen vào cây bông vải nhằm đƣa vào những đặc tính mong muốn: kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, tăng cƣờng chất lƣợng sợi… là điều rất cần thiết đối với ngành trồng bông của nƣớc ta hiện nay. Việc ứng dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose và chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên cây bông hiện vẫn còn mới mẻ tại Việt nam. Việc sử dụng hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose có ƣu điểm vì không tạo ra sự lo ngại về an toàn sinh học nhƣ đối với hệ thống thanh lọc bằng chất kháng sinh. Khóa luận “Nghiên cứu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vảI SSR60F và Coker 312 bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đƣợc thực hiện nhằm mục đích nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp. Trong nghiên cứu này, véctơ (vector) pManCa đã đƣợc thiết kế mang gen đánh dấu chọn lọc pmi (để sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose) và gen gus và đƣợc chuyển nạp các khúc cắt trụ hạ diệp của cây mầm in vitro 5 - 7 ngày tuổi qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi đƣợc chuyển nạp, mẫu cây đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa mannose qua 3 vòng thanh lọc. Kết quả đƣợc ghi nhận nhƣ sau: Các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai vòng thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở vòng thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. Cần tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose ờ bông vải. Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 5 ABSRACT PHAM QUYET THANG, Nong Lam University. August 2005. “STUDY ON THE ABILITY OF GENE TRANSFORMATION OF TWO COTTON CULTIVARS SSR60F AND COKER 312 BY USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS ” Supervisor: Dr. Tran Thi Cuc Hoa Study on gene transformation of cotton in order to tranfer of desirable traits like pest resistance, herbicide reistance, improved fiber quality …is necessary for the cotton industry of our country at present. The application of mannose selection and Agrobacterium tumefaciens- mediated transformation method are still new in Vietnam. The application of mannose selection system has an advantage because it does not cause concerns on biosafety as the selection systems using antibiotics. The assignment “Study on the ability of gene transformation of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 by using Agrobacterium tumefaciens” were carried out to investigate the reponse ability of two cotton cultivars SSR60F and Coker 312 to gene transformation, in which the study was focused on the use of mannose to screen calli of cotton after transformed. In this study, the vector pManCa was constructed carryring the selective marker gene pmi (to facilate selection with mannose) and gene gus. The hypocotyl segments of 5 - 7 old seedlings in vitro of the two cotton cultivars were transformed by using Agrobacterium tumefaciens. After transformed the explants were cultured on the medium containing mannose passing three cycles of selection. The results were recorded as follows. During the 1 st and 2 nd cycle selection with manose, calli of both cotton cultivars grew normally. At the 3 rd cycle of selection, the effect of mannose appeared obviously. It was recorded that all the non-transformed calli died, while with the transformed calli, the surivial percentage were 1.73% for the cultivar Coker and 3.67% for the cultivar SSR60F. The separation of calli into smaller pieces before culturing on the medium at the 3 rd cycle of selection was necessary to prevent escape of non-transformed calli and to make the selection of putative transformed calli more precise. Further studies are needed to standardize the concentrations of mannose at each cycle of selection, the size of calli, etc. to improve the efficiency of mannose selection for cotton. Attention should be given to the cultivar SSR60F to be used in the breeding program to develop transgenic cotton cultivars in Vietnam. 6 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ .......................................................................................................... iii Tóm tắt ............................................................................................................... iv Mục lục .............................................................................................................. vi Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................... viii Danh sách các hình ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .............................................................................................x 1. LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ..................................................................................................1 1.2. Mục tiêu .....................................................................................................3 1.3. Hạn chế của khoá luận ...............................................................................3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................4 2.1. Cây bông vải ..............................................................................................4 2.1.1. Vị trí và phân loại ..............................................................................4 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố ................................................4 2.1.2.1. Gossypium hirsutum ....................................................................4 2.1.2.2. Gossypium arboreum ..................................................................5 2.1.2.3. Gosypium barbadense .................................................................5 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ...............................................6 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới ...............................................7 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải .......................................10 2.2.1. Hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống..........................10 2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải ....................10 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens ..................12 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............................13 2.3.2. Plamid Ti .........................................................................................14 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA ..............................................................15 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir .............................................................17 2.3.2.3. Cơ chế lây nhiễm .......................................................................19 7 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ..............................................................22 3.1. Vật liệu ..................................................................................................22 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................22 3.3. Phƣơng Pháp .........................................................................................22 3.3.1. Quy trình chuyển nạp gen ...............................................................22 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy ........................................................22 3.3.1.2. Nguồn Plasmid ..........................................................................23 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn ......................................................................24 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy ...........................................................................24 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh cây ...........................................................25 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi ........................................................................26 3.3.2.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ............................................................26 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc .......................................................................26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................28 4.1. Sự hình thành mô sẹo ............................................................................28 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo ..............................................................28 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo ..................................................................31 4.2 Kết quả thanh lọc ..................................................................................34 4.2.1. Thanh lọc lần 1 ................................................................................34 4.2.2. Thanh lọc lần 2 ................................................................................36 4.2.3. Thanh lọc lần 3 ................................................................................38 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................43 5.1. Kết luận .................................................................................................43 5.2. Đề nghị ..................................................................................................43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................44 PHỤ LỤC 8 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP Adenosine 5’- monophosphate ATP Adenosine 5’- triphosphate AS Acetosyringone CaMV35S Vùng khởi động phiên mã ctv. cộng tác viên DNA Deoxyribonucleotic acid gus gen gus (gen chỉ thị) GUS enzyme β-glucuronidase lacZ gen β-galactosidase LB Bờ trái (Left border) MLN mẫu lây nhiễm MS Murashige and Skoog (1962) MSCo Môi trƣờng đồng nuôi cấy MSS1, MSS2, MSS3 Môi trƣờng thanh lọc lần 1, 2, 3 OD600 Độ hấp thụ tối đa ở bƣớc sóng 600 nm ori Vùng khởi động sự tự tái bản PEG polyethylene glycol PMI Enzyme Phosphomannose isomerase pmi gen pmi plasmid Ti Plasmid kích thích tạo khối u (pTi) RB Bờ phải (Right border) rpm vòng/phút (round per minute) T-DNA DNA đƣợc chuyển (transferred DNA) YEP Yeast extract pepton Vir gen vir Vir virulence protein 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid v/v thể tích/thể tích (volume/volume) w/v trọng lƣợng/thể tích (weight/volume) 9 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra .........13 Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra ..............14 Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA............................................19 Hình 2.4. Quá trình hoà hợp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây ......................20 Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây .......21 Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm ..................................................23 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi .................................................24 Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp trên môi trƣờng đồng MSCo ...........................28 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng MSRe ............29 Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng MSS1 ......................29 Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS2 .............30 Hình 4.5. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng MSS3 .............31 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng MSRe ..........................................................33 Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1 ..........36 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc ..........38 Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng MSS3 ..............................39 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng MSS3 ........40 Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) trên môi trƣờng MSS3 ...........41 10 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam ..................................7 Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới .........................8 Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới ................................9 Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc ..........................25 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải ........................27 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 ................................32 Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F .....................................32 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 .........................................35 Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F .............................................35 Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 .........................................36 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F ..............37 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 .........................................41 Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F .............................................41 11 CHƢƠNG 1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Bông vải là cây trồng lấy sợi quan trọng hàng đầu để thỏa mãn nhu cầu bức thiết của con ngƣời sau ăn là mặc (Lê Quang Quyến, 2004). Cây bông cũng là cây lấy dầu từ hạt quan trọng thứ hai sau cây đậu tƣơng, hơn nữa hạt bông còn là nguồn cung cấp protein làm thức ăn cho gia súc (Jiang, 2004). Cây bông vải đƣợc trồng ở khắp nơi trên thế giới, nhƣng chủ yếu trồng ở điều kiện nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong các nƣớc trồng bông vải, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất (9,7 triệu ha) chiếm 32%, kế đến là Mỹ 24%, Trung Quốc 20% (Satyavathi và ctv., 2002). Ở Việt Nam, nghề trồng bông vải có từ lâu đời. Cây bông vải từng là cây trồng quan trọng ở vùng Duyên Hải Nam Trung Bộ đặc biệt ở các tỉnh Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp (Lê Kim Hỷ, 2003). Sau ngày thống nhất đất nƣớc, chúng ta đã nhiều lần cố gắng tổ chức trồng bông lại ở các địa phƣơng trên nhƣng các kế hoạch đó đều không thành công. Hai nguyên nhân chính làm thất bại các nỗ lực trên là: thị trƣờng giá cả bấp bênh, nông dân không trồng bông vì không trừ đƣợc sâu đục quả bông dẫn đến ngƣời trồng bông thua lỗ (Lê Quang Quyến, 2004). Trong những năm gần đây, do áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật và công nghệ nên đã cho ra đời các giống bông lai kháng sâu năng suất cao đƣa vào sản xuất. Tuy nhiên, sản lƣợng bông xơ chỉ mới đáp ứng một phần nhỏ (10-15%) nhu cầu vật liệu cho ngành dệt may. Trƣớc thực trạng đó, gia tăng sản lƣợng bông xơ là yêu cầu cấp thiết. Dự kiến đến năm 2010, sản lƣợng bông xơ đáp ứng 20% nhu cầu trong nƣớc và diện tích bông đạt 1 triệu ha vào năm 2010, tập trung chủ yếu ở vùng Duyên Hải Miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Đồng Bằng Sông Cửu Long (Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003). Việc cải thiện di truyền của các loài bông vải nhằm tăng năng suất cũng nhƣ tăng tính kháng sâu bệnh đã đƣợc quan tâm nhiều. Kết quả là nhiều giống bông vải tốt đƣợc tạo ra theo các phƣơng pháp lai tạo và chọn lọc truyền thống. Tuy nhiên, việc sử dụng các phƣơng pháp này khó có thể khai thác đƣợc các nguồn gen có lợi một cách 12 có hiệu quả do rào cản bất tƣơng hợp. Công nghệ sinh học nói chung và công nghệ gen trên thực vật nói riêng có thể thúc đẩy việc tạo ra các giống bông có nhiều đặc tính ƣu việt nhƣ: kháng sâu bệnh hại, kháng thuốc diệt cỏ, chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng (rét, khô, hạn, phèn, mặn…) và các tính trạng số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng của bông và sợi (Perlak và ctv., 2001). Tuy nhiên, việc chuyển nạp gen vào cây bông vải đã gặp phải nhiều khó khăn. Cây bông vải đƣợc xem là cây rất khó chuyển nạp gen với hiệu quả cao. Hơn nữa, ở Việt Nam các phƣơng pháp nuôi cấy mô hiện tại dùng để tái sinh cây chuyển gen từ các mô sẹo hoặc từ tế bào có khả năng sinh phôi chƣa đƣợc xây dựng hoàn chỉnh. Ngoài giới hạn về kiểu gen, một số cây tái sinh từ mô sẹo có khả năng sinh phôi sẽ có hình dạng dị thƣờng do biến dị soma phát triển trong quá trình nuôi cấy mô. Hiện nay, việc chuyển nạp gen mới chỉ thành công trên các giống nhóm Coker, hầu hết các gen mong muốn đều đƣợc chuyển vào các giống Coker và sau đó đem hồi giao với các giống khác (Nobre và ctv., 2001). Hiện nay ở Việt Nam, các hệ thống tái sinh cây bông vải qua mô sẹo chƣa thành công nhiều, việc chuyển nạp gen chỉ đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp vi tiêm vào ống phấn và chuyển trực tiếp trên đỉnh chồi (Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các phƣơng pháp chuyển gen này tuy có hiệu quả nhƣng sự biểu hiện của các gen chuyển nạp trên cây chuyển gen giả định là không đƣợc hoàn toàn, tạo ra các cây thể khảm, gây khó khăn cho việc phân tích và thu nhận cây chuyển gen sau này. Hơn nữa, ở Việt Nam hiện nay chƣa có nghiên cứu nào xác định loài bông vải nào đang đƣợc trồng thích hợp việc chuyển nạp gen. Chính vì thế chúng tôi thực hiện khóa luận: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS. 13 1.2. Mục tiêu Khóa luận: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHUYỂN NẠP GEN CỦA HAI GIỐNG BÔNG VẢI SSR60F VÀ COKER 312 BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium Tumefaciens” nhằm tìm hiểu khả năng chuyển nạp gen của hai giống bông vải SSR60F và Coker 312 bằng phƣơng pháp vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, trong đó tập trung nghiên cứu về sử dụng hệ thống chọn lọc bằng mannose để thanh lọc mô sẹo của bông vải sau khi đƣợc chuyển nạp. 1.3. Hạn chế của khoá luận Với quỹ thời gian ngắn (4 tháng) nên khóa luận chỉ có thể thực hiện phần chọn lọc bằng mannose (qua 3 lần chọn lọc), các bƣớc tiếp theo sau khi chọn lọc chƣa có điều kiện thực hiện. Khóa luận cũng chỉ giới hạn nghiên cứu ở hai giống bông vải, trong đó giống SSR60F là giống bông đang trồng ở Việt Nam. 14 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây bông vải 2.1.1. Vị trí phân loại Cây bông vải thuộc: Ngành hiển hoa bí tử (Angospermatophyta), Lớp song tử diệp (Dicotyledoneae), Họ Malvaceae, Chi Gossypium (Phạm Hoàng Hộ, 1997). 2.1.2. Tính đa dạng, nguồn gốc và phân bố Trong chi Gossypium có khoảng 39 loài và rất đa dạng, trong đó có sáu loài bông đƣợc canh tác là: G. hirsutum, G. arboreum, G. barbadense, G. herbaceum, G. tricuspidatum và G. perriri (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội,bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996). Nhƣng theo Jiang (2004), Brubaker và ctv. (2002) chi Gossypium có khoảng 50 loài và có bốn loài đƣợc canh tác là: G. hirsutum L., G. barbadense L., G. arboretum L., G. herbaceum L., loài trồng phổ biến nhất thế giới là G. hirsutum. Cũng theo Brubaker và ctv. (2002) chi Gossypium phân bố ở phía Tây và Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở Australia khoảng 17 loài. Trong sáu loài trên, ở Việt Nam trồng phổ biến ba loài đầu. 2.1.2.1. Gossypium hirsutum Loài G. hirsutum thƣờng đƣợc gọi là bông Luồi hay bông Tàu, có bộ nhiễm sắc thể 2n = 52 (Jiang, 2004). Bông Luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay đƣợc trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lƣợng xơ bông Luồi chiếm khoảng 70% sản lƣợng toàn thế giới (Bộ GD và ĐT,Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp, 1996). Bông Luồi đƣợc trồng nhiều nhất là ở Mỹ trên 95% (Jiang, 2004), Nga, Ấn Độ, Mehico, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc. Ở Việt Nam, bông Luồi du nhập vào nƣớc ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX. Phần lớn các giống thuộc loài này do ngƣời Pháp đƣa vào nhằm mục đích khai thác và sản xuất bông hàng hóa. Về sau, loài này đƣợc du nhập vào bằng nhiều con đƣờng khác nhau, chủ yếu thông qua các chƣơng trình viện trợ của các tổ chức quốc tế. Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp 15 với điều kiện trồng bông nhờ nƣớc trời ở nƣớc ta. Với tiềm năng cho năng suất cao và có chất lƣợng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bông Cỏ trƣớc đó (Lê Quang Quyến, 2004). Bông Luồi có nhiều loài phụ nhƣ: G. hirsutum ssp. Mexicanum, G. hirsutum ssp. Punctatum (Achum và Thonn), G. hirsutum ssp. Panicultum (Balanco)… 2.1.2.2. Gossypium arboreum Loài G. arboreum thƣờng đƣợc gọi là bông Cỏ. Loài này có lẽ đƣợc trồng lâu đời nhất, có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng có gió mùa khí hậu ẩm ƣớt. Bông Cỏ thƣờng đƣợc trồng ở vùng đồng bằng nhƣng cũng có trồng ở vùng núi cao 1500-2000 m. Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung Quốc,Việt Nam, Myanmar, Lào. Hằng năm sản lƣợng bông Cỏ chiếm 20% tổng sản lƣợng bông thế giới. Hiện nay, diện tích trồng bông Cỏ ngày càng thu hẹp do chất lƣợng xơ ngắn. Ở Việt Nam khoảng thế kỷ XIII- XIV loài bông này đƣợc trồng phổ biến khắp mọi miền đất nƣớc, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi. Đến năm 1955, loài bông Cỏ vẫn còn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc Bộ và một số vùng thuộc Bắc Trung Bộ, trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung Bộ đang dần thay thế bằng các giống bông Luồi. Các giống bông Cỏ hiện có ở Việt Nam thuộc hai loài phụ: G. arboreum ssp. Neglectum và G. arboreum ssp. Nanking, kể cả hai dạng bông lâu năm và hằng năm (Lê Quang Quyến, 2004). 2.1.2.3. Gossypium barbadense Loài G. barbadense thƣờng đƣợc gọi là bông Hải đảo, bông Ấn Độ. Bông Hải đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay đƣợc trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nƣớc khác. Bông hải đảo cung cấp khoảng 10% sản lƣợng bông sơ toàn thế giới và hiện nay diện tích trồng bông Hải đảo đang đƣợc mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt tốt. Ở Việt Nam, chƣa tìm thấy tài liệu nào nói về loài bông Hải đảo đƣợc trồng phổ biến trong sản xuất và bắt nguồn từ đâu. Loài này thƣờng gặp dƣới dạng cây lâu năm ở trong các vƣờn hoang và bờ giậu. Đến năm 1941- 1945 mới du nhập một số giống nhƣ 16 Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trƣờng Nhung, Menufi, Tiến Vọt vào miền Bắc năm 1955-1956 qua chƣơng trình hợp tác và trao đổi giống. Qua quá trình nghiên cứu và thử nghiệm cho thấy loài bông Hải đảo thích hợp trong vụ khô có tƣới, không hợp với điều kiện mƣa nhiều độ ẩm cao. Bông Hải đảo có nhiều loài phụ nhƣ: G. barbadense ssp. Darwwinii (Watt) Mauner, G. barbadense ssp. redurale Mauner, G. barbadense ssp. Ventifolum (Lam) và G. barbadense ssp. Eubarbadense Mauner. 2.1.3. Tình hình sản xuất bông ở Việt Nam Trƣớc thời Pháp thuộc, giống bông đƣợc sử dụng chủ yếu là các giống bông Cỏ địa phƣơng (Gossypium arboreum L.). Giống bông này cho năng suất thấp. Một số ít diện tích ở Trung Bộ và Nam Bộ đã đƣợc trồng các giống bông Luồi (Gossypium hirsutumL.) nhập nội, với năng suất đạt 300 – 500 kg/ha. Đầu thế kỷ 20, nƣớc ta đã xuất khẩu bông sang Nhật, Hồng Kông. Trong thời kỳ kháng chiến chống Pháp, diện tích trồng bông đã đƣợc phát triển mạnh trong đó liên khu V đạt khoảng 10.000 ha và liên khu IV đạt khoảng 13.000 ha. Sau năm 1954, các giống bông Luồi nhập nội đã thay thế một phần cho các giống bông Cỏ địa phƣơng. Sau năm 1975, năng suất bông hạt thấp chỉ đạt 3 – 4 tạ/ha. Nguyên nhân năng suất và diện tích bông giảm ở giai đoạn này là do sâu bệnh phá hoại nặng và chƣa có các giống bông thích hợp cho các vùng. Do chí phí sản xuất quá lớn vì đầu tƣ thuốc trừ sâu rất cao, ngƣời trồng bông luôn bị thua lỗ, thêm vào đó môi trƣờng bị ô nhiễm nặng, ngành bông Việt Nam gặp rất nhiều khó khăn. Từ sau những năm 1990, ngành bông Việt Nam có những bƣớc thay đổi mạnh mẽ, chúng ta đã tạo đƣợc các giống bông, đặc biệt là các giống bông lai có năng suất cao, chất lƣợng xơ tốt, chống chịu đƣợc sâu bệnh. Hàng loạt các tiến bộ kỹ thuật đƣợc áp dụng nhƣ: áp dụng biện pháp quản lý dịch hại tổng hợp giúp giảm chi phí thuốc bảo vệ thực vật, các biện pháp kỹ thuật canh tác khác nhƣ hệ thống luân canh xen canh hợp lý, phủ màng PE cho bông, phun các chất điều hòa tăng trƣởng…chính vì vậy mà năng suất và chất lƣợng bông xơ tăng, nghề sản xuất bông cho hiệu quả kinh tế cao. Hiện nay, diện tích đã đạt hơn 35.000 ha, năng suất đạt hơn 11 tạ/ha, tăng gấp hai lần so với bình quân trƣớc đây. 17 Bảng 2.1. Diễn biến tình hình sản xuất bông ở Việt Nam (Lê Quang Quyến, 2004). Niên Vụ Diện tích (ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (tấn) 1996/1997 1997/1998 1998/1999 1999/2000 2000/2001 2001/2002 2002/2003 10.676 11.716 19.963 17.705 13.250 29.573 35.200 6,0 9,0 8,0 10,0 9,0 11,0 10,5 6.866 10.986 16.245 17.578 20.340 32.530 36.960 2.1.4. Tình hình sản xuất bông trên thế giới Vụ bông 2001- 2002, tổng diện tích bông trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong đó các nƣớc đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nƣớc phát triển chỉ chiếm có 30% diện tích. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.2, trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha. Điều đáng chú ý là 70% diện tích bông thế giới đƣợc trồng ở các nƣớc miền nam và diện tích trồng của ba nƣớc châu Á là Ấn Độ , Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích trồng bông thế giới (ISAAA, 2002). 18 Bảng 2.2. Mƣời nƣớc có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới năm 2001- 2002 ( ISAAA, 2002) STT Nƣớc Diện tích (triệu ha) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Ấn Đ ộ M ỹ Trung Quốc Pakistan Uzbekistan Brazil Thổ Nhĩ Kỳ Turkmenistan Mali Benin 8,730 5,596 4,824 3,125 1,453 0,75 0,654 0,550 0,516 0,415 Sản lƣợng bông thế giới đã tăng từ 9,8 triệu tấn niên vụ 1960-1961 lên 21,1 triệu tấn niên vụ 2001-2002, tức là tăng hơn 116% sau 40 năm. Danh sách mƣời nƣớc có sản lƣợng bông xơ lớn nhất thế giới đƣợc liệt kê ở bảng 2.3, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 5,3 triệu tấn, tiếp theo là Mỹ 4,4 triệu tấn, Ấn Độ 2,5 triệu tấn. Điều đặc biệt là trong mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới thì có sáu nƣớc là các nƣớc đang phát triển. Về năng suất Australia dẫn đầu với năng suất là 1.658 kg bông xơ/ ha, tiếp theo là Syria 1.303 kg bông xơ/ha và Trung Quốc 1.103 kg bông xơ/ha (ISAAA, 2002). 19 Bảng 2.3. Mƣời nƣớc có sản lƣợng bông cao nhất thế giới năm 2001 – 2002 (ISAAA, 2002) STT Nƣớc Sản lƣợng (triệu tấn) Năng suất xơ (kg/ha) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Trung Quốc M ỹ Ấn Độ Pakistan Uzbekistan Thổ Nhĩ Kỳ Brazil Australia Syria Ai cập 5,320 4,420 2,508 1,853 1,055 0,880 0,750 0,670 0,335 0,314 1.103 790 287 593 726 1.345 999 1.658 1.303 994 Trong khi đó, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng. Diện tích trồng bông trên thế giới năm 2004 là 32 triệu ha (ISAAA, 2004), trong đó bông chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha). So với năm 2003 diện tích bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2004 so với 7,2 triệu ha trong năm 2003). Trong số các nƣớc trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nƣớc có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2003). Năm 2003, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhƣng năm 2004 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha. Trung Quốc cũng là nƣớc có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2003 có 2,8 triệu ha nhƣng năm 2004 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông). Theo dự báo của các chuyên gia diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hƣớng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu nhƣng bên cạnh đó chất lƣợng sợi bông cũng đƣợc quan tâm nhiều (ISAAA, 2004). 20 2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen ở bông vải 2.2.1. Những hạn chế của phƣơng pháp tạo giống truyền thống Cây bông đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dệt may thế giới. Chính vì vậy mà việc cải thiện giống bông để nâng cao năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sợi bông thì rất đƣợc chú ý. Các phƣơng pháp tạo giống truyền thống nhƣ: lai đơn, lai với loài hoang dại, hồi giao, đột biến... đã đƣợc sử dụng để đƣa các tính trạng nhƣ: năng suất cao, chất lƣợng sợi cao và kháng bệnh vào các giống bông. Kết quả là tạo ra những giống bông có năng suất cao và phẩm chất sợi tốt. Tuy nhiên, các phƣơng pháp tạo giống truyền thống đã không đáp ứng đƣợc yêu cầu ngày càng cao về chất lƣợng sợi bông, về sản lƣợng bông cũng nhƣ về khả năng kháng sâu bệnh. Thêm vào đó, hiện nay trong các giống bông chƣa tìm thấy các gen kháng sâu bệnh chính vì thế mà rất khó tạo ra một giống bông kháng sâu bệnh bằng phƣơng pháp lai tạo truyền thống. 2.2.2. Một số nghiên cứu chuyển nạp gen trên cây bông vải Hiện nay, trong nghiên cứu chuyển nạp gen với nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phƣơng pháp xung điện, phƣơng pháp vi tiêm, phƣơng pháp sử dụng PEG (polyethylene glycol), phƣơng pháp bắn gen và phƣơng pháp chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nhƣng phổ biến là chuyển nạp gen trực tiếp bằng súng bắn gen với vật liệu nuôi cấy là đỉnh chồi phân sinh hoặc từ tế bào huyền phù đã đƣợc báo cáo (McCabe và Martinell, 1993, Rajasekaran và ctv., 2000), phƣơng pháp chuyển nạp gen bằng Agrobacterium tumefaciens (Rajasekaran, 1996, Satyawathi và ctv., 2002, Umbeck và ctv., 1987). Nghiên cứu chuyển nạp gen thành công bằng Agrobacterium tumefaciens trên cây bông vải đƣợc công bố lần đầu tiên vào những năm 1980 (Firoozabady và ctv., 1987, Umbeck và ctv., 1987) với mẫu cấy là trụ hạ diệp và tử diệp. Trong nghiên cứu của mình, Firoozabady đã sử dụng mẫu cấy tử diệp 12 ngày tuổi để đồng nuôi cấy với vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang plasmid có chứa gen kháng kanamycin. Sau ba ngày đồng nuôi cấy, các mẫu cấy sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tạo mô sẹo có chứa kanamycin. Kết quả là có hơn 80% các mô sẹo sống sót trên môi trƣờng có chứa yếu tố chọn lọc kanamycin. Từ đó nhiều gen đƣợc chuyển thành công vào cây bông nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, bao gồm các gen kháng côn trùng, gen 21 kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990). Các loại mẫu cấy nhƣ trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng nhƣ phôi non đã đƣợc dùng trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990). Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã đƣợc sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv., 1995). Chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc Finer và McMullen (1990) thực hiện trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu đƣợc cây chuyển gen. Trƣớc đó Finer và Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và cuống lá. Súng bắn gen cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các mô thu đƣợc từ việc tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thƣờng khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã đƣợc công bố khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) đƣợc dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987). Chaudhary và ctv. (2003) cũng báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là 75%. Nhƣng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và gen gus. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng 20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phƣơng pháp bắn gen. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy đƣợc dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hƣởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái sinh cây. Ví dụ ngƣời ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dƣơng tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987). Nghiên cứu về chuyển nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thƣớc mẫu cấy cũng ảnh hƣởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trƣờng chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Theo Chen và ctv. (2000) để chuyển nạp gen có hiệu quả nhiệt độ trong giai đoạn đồng nuôi cấy không lớn hơn 280C, thời gian chiếu 22 sáng 16h sáng/8h tối là thích hợp cho tất cả các giai đoạn chuyển nạp gen và tái sinh. Ngoài ra, pH môi trƣờng nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp gen. Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một phƣơng pháp tái sinh cây hiệu quả đã đƣợc xem nhƣ là một rào cản chính cho việc áp dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv., 1987). Để cải tiến phƣơng pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải đƣợc phát triển, cùng với môi trƣờng cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phƣơng pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhƣng phƣơng pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000). 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang những tính trạng di truyền mong muốn. Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã đƣợc ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đƣa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 23 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis, loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990). Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv., 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. (Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 290C trong môi trƣờng có bổ sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000). Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu đƣợc tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn 24 khi chạm vào, nhƣng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối u có đƣờng kính đến 30 cm nhƣng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trƣờng. Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này nhƣ một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dƣỡng(Zhu và ctv., 2000). Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thƣớc là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thƣớc 200-800 kbp (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005). 2.3.2. Plamid Ti Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định pTi nhƣ một nguyên lý tạo bƣớu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bƣớc khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 25 Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine (Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen Vir (Gelvin, 2003). 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30 kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của protein VirD2. T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây đƣợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử 26 hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác đƣợc cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv., 1991). Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chƣa đƣợc giải thích (Tinland và ctv., 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen đƣợc chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh dƣỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc một đƣờng (Dessaux và ctv., 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lƣợng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thƣờng trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine đƣợc tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Dựa trên các kiểu opine đƣợc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng nhƣ là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Cho ví dụ, các plasmid Ti kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này đều đƣợc tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv., 1998). Sản phẩm của gen mas2’ đƣợc cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic axit với glucose (mặc dù điều này chƣa đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic axit (Dessaux và ctv., 1998). Bởi vậy, các khối u đƣợc tạo ra bởi plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 27 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen đƣợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thƣớc khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv., 1998). Theo Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò nhƣ: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003). Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thƣơng của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thƣơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thƣơng ở tế bào cây chủ tạo ra đƣợc nhận biết trƣớc tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir đƣợc kích hoạt tối đa ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon nhƣ là acetosyringone (AS), chất mà đƣợc giải phóng khi tế bào cây bị tổn thƣơng (Stachel và ctv., 1987). Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001). Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3) và đƣa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein đƣợc mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T- DNA. Protein VirD2 đƣợc tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở vị trí tƣơng đồng (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn 28 DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là protein chiếm số lƣợng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đƣa phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir cũng đƣợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã đƣợc thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cƣờng sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhƣng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000). Ngoài ra, protein VirD2 đƣợc cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đƣa T-DNA vào nhân tế bào và lƣu lại cùng với T-DNA trong các bƣớc kết nạp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã đƣợc đề nghị: VirD2 hoạt động nhƣ một enzyme integrase và VirD2 hoạt động nhƣ một ligase (Ziemienowicz, 2001). Cùng với protein VirD4, mƣời một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đƣa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA đƣợc mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tƣơng tự nhƣ chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và đƣợc cho là cung cấp năng lƣợng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ thống VirB đƣa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bƣớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây đƣợc thực hiện (Zhu và ctv., 2000). Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống VirB/VirD4 đƣa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đƣợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2 (Ziemienowicz, 2001). 29 2.3.3.3. Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dƣỡng do mô rễ tạo ra. Nhƣng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thƣơng do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thƣơng cho việc xâm nhiễm có thể dễ dàng đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thƣơng nhờ các dấu hiệu hoá học. Điều này có đƣợc là do đáp ứng giải phóng đƣờng và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thƣơng (hợp chất phenolic) nhƣ acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10-7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thƣơng. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10-5 – 10-4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên pTi (Deacon và ctv., 2005). Các gen vir đƣợc kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-270C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-200C (Gelvin, 2003) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (nguồn Valentine, 2003). Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn đƣợc thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA. Ngoài VirD1, VirD2 ngƣời ta còn cho rằng VirC1 và VirC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp 30 T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 đƣợc chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đƣa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (nguồn Valentine, 2003) Trong nhân tế bào cây, T-DNA đƣợc kết nạp vào bộ gen của cây (hình 2.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây đã đƣợc đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tƣơng đồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều đƣợc enzyme nuclease thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tƣơng đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây đƣợc hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001). Các opine đƣợc tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào đƣợc vi khuẩn biến dƣỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi. Tùy theo kiểu opine mà đƣợc chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). 31 Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển nạp gene cây trồng. Trong thời gian ban đầu, phƣơng pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hái lá mầm. Sau này, ngƣời ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhƣng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm và không tạo khối u. (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv., 2000). 32 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F đƣợc thu từ nhà lƣới của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hạt của các giống bông vải này phải đảm bảo là các hạt tự thụ. Mẫu cấy: Trụ hạ diệp của cây mầm 5-7 ngày tuổi. Dụng cụ, hóa chất, nguồn vi khuẩn và hóa chất: Các dụng cụ và hóa chất chuẩn bị cho nuôi cấy mô, chuyển nạp gen và xét nghiệm sinh học của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục). 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Địa điểm: Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Cờ Đỏ, Tp. Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ ngày 21 tháng 3 năm 2005 đến ngày 31 tháng 7 năm 2005. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Quy trình chuển nạp gen 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải đƣợc đốt lớp bông xơ bao quanh bằng axit sulfuric (H2SO4) đậm đặc (98%), rồi rửa với nƣớc máy cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 400C cho đến khi đạt độ ẩm 14% (khoảng 48h). Hạt đƣợc khử trùng bề mặt với cồn 700 (2 phút) và rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) bổ sung thêm 2 hoặc 3 giọt Tween 20 và lắc ở tốc độ 80 rpm. Thao tác khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) đƣợc lặp lại hai lần, mỗi lần 10 phút và giữa hai lần khử trùng hạt đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng. Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% (w/v), hạt đƣợc 33 rửa nhiều lần với nƣớc cất vô trùng (5lần) và ngâm qua đêm trong nƣớc cất vô trùng. Ngày hôm sau, hạt đƣợc lấy ra rửa hai lần với nƣớc cất tiệt trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% (w/v) trong 2 lần, mỗi lần khử trùng 5 phút. Giữa hai lần khử trùng bằng thủy ngân, hạt đƣợc rửa 3 lần bằng nứơc cất vô trùng. Sau khi khử trùng, hạt đƣợc bóc bỏ vỏ và cấy vào môi trƣờng nảy mầm MSG (phụ lục 4). Mẫu đƣợc nuôi cấy trong tủ cấy (Sanyo MLR35OH, Nhật) ở nhiệt độ 290C dƣới ánh sáng huỳnh quang, độ ẩm tƣơng đối bằng 50%. Từ cây mầm 5-7 ngày tuổi (hình 3.1) đã đƣợc chuẩn bị ở bƣớc trên, trụ hạ diệp đƣợc cắt cẩn thận (khoảng 5 mm) và đƣợc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm chuyển nạp gen. Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm. A: hạt mầm sau xử khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng nảy mầm, B: Cây Coker 312 5 ngày tuổi 3.3.1.2. Nguồn Plasmid Plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào thực vật biến dƣỡng đƣờng mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema và ctv..,1984) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này ( hình 3.2). 34 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vectơ pManCa, từ ống tồn trữ trong glycerol (50% v/v) trong tủ lạnh âm 800C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc ABG (Chilton và ctv., 1974) có 50 mg/l kanamycine. Từ vi khuẩn trên môi trƣờng ABG (phụ lục 3) chọn ra một khuẩn lạc tốt (single colony) cấy vào 3ml môi trƣờng YEP có bổ xung kanamycin 50 mg/l (phụ lục 2) và nuôi khoảng 24 – 28 giờ ở 280C, trên máy lắc với tốc độ 200 rpm. Sau khi nuôi cấy đƣợc khoảng 24-28 giờ, dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang 50 ml môi trƣờng YEP có bổ sung kanamycin 50 mg/l và nuôi cấy tiếp khoảng 16–18 giờ ở 280C, lắc 200 rpm. Sau khi nuôi cấy khoảng 16-18 giờ, lấy 1ml dịch vi khuẩn để đo OD600 nhằm xác định mật số vi khuẩn (OD600~ 0,5-1,0), dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 rpm trong 10 phút. Phần lắng sau khi ly tâm sẽ đƣợc pha loãng (để OD600= 0,6) với môi trƣờng lây nhiễm không có phytagel và lắc với tốc độ 220 rpm ở 280C trong 1giờ (có bổ sung 0,2 mM AS). 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy Cơ bản dựa theo qui trình của Chen và ctv., 2000 (WO 00/77230 A1, Syngenta) nhƣng có vài thay đổi. Mẫu trụ hạ diệp đƣợc cắt thành nhiều đoạn dài khoảng 5 mm. Các khúc cắt này đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn pha loãng (OD600= 0,6) trong 20 phút (thay vì 5 phút), sau đó đem lắc chung dịch vi khuẩn và mẫu trụ hạ diệp trên máy lắc với tốc độ 35 50 rpm trong 10 phút. Sau đó, dịch vi khuẩn đƣợc loại bỏ, mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô trên giấy thấm tiệt trùng. Khi các mẫu trụ hạ diệp khô sẽ đƣợc cấy chuyển sang các đĩa Petri chứa môi trƣờng lây nhiễm (thay vì đặt mẫu lên giấy lọc trong đĩa petri chƣa 50 ml môi trƣờng) MSCo (phụ lục 5). Các đĩa mẫu này đƣợc giữ trong tủ nuôi cấy mô thực vật ở 210C, với điều kiện chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh mẫu lây nhiễm Sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn các mẫu trụ hạ diệp đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng và kháng sinh carbenicillin để ức chế vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi rửa các mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển sang môi trƣờng phục hồi MSRec (phụ lục 6) có bổ sung thêm 500 mg/l carbenicillin. Các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy một tuần ở 280C với quang kỳ 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Sau đó, các mẫu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng thanh lọc MSS (phụ lục 7) chứa glucose và mannose ở nồng độ thăm dò theo sự tăng dần nồng độ mannose (25-35 g/l) và giảm dần nồng độ glucose (10-0 g/l). Qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần hoặc đến khi nghiệm thức đối chứng cho thấy tất cả các mẫu nuôi cấy đều chết. Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Chọn các mô kháng phát triển tốt trên môi trƣờng thanh lọc để cấy chuyển sang môi trƣờng phát sinh phôi. Các mô kháng đƣợc tách nhỏ khoảng 3 mm theo từng khối mô sẹo riêng biệt để tạo thành các dòng chuyển nạp gen giả định và cấy chuyển lên môi trƣờng phát sinh phôi DM (phụ lục 8). 36 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.2.1. Sự hình thành mô sẹo Tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm là sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi. Từ các số liệu này cho phép so sánh tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa mẫu đối chứng và giữa các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc Tỷ lệ sống sót của các mẫu lây nhiễm đƣợc theo dõi qua các lần thanh lọc. Tỷ lệ sống sót đƣợc theo dõi nhằm đánh giá hiệu quả thanh lọc của mannose cũng nhƣ cho phép có kết luận sơ bộ về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). 37 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobactrieum tumefaciens. Bƣớc Nội dung thực hiện Hình minh họa Thời gian (ngày) 1. Tạo vật liệu Hạt đƣợc khử trùng bằng cồn 70 0 trong 2 phút và dung dịch HgCl2 0,1% (w/v) trong 20 phút (2 lần), rửa lại bằng nƣớc cất tiệt trùng 5 lần, ngâm hạt trong nƣớc cất tiệt trùng qua đêm, bóc bỏ vỏ, cấy hạt lên môi trƣờng nảy mầm MSG. 5-7 2. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy Trụ hạ diệp cây 5-7 cắt thành khúc 5 mm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn (OD600= 0,6) 20 phút, làm khô mẫu và cấy lên môi trƣờng lây nhiễm MsCo. 2-3 3. Phục hồi Sau 3 ngày đồng nuôi cấy mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MSRec có bổ sung 500 mg/l carbenicillin. 7 4. Thanh lọc Sau 7 ngày phục hồi, mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc (MSS) có mannose với nồng độ tăng dần (2,5-3,5%, w/v) và glucose có nồng độ giảm dần (1%- 0%, w/v). Các mẫu đƣợc thanh lọc qua ba lần. 42-56 38 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành mô sẹo 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo Các khúc trụ hạ diệp (khoảng 5 mm) sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn (hình 4.1) đƣợc rửa với nƣớc và kháng sinh để ức chế vi khuẩn. Sau khi rửa, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MsRec. Sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi MsRec (sau 10 ngày), các mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng bắt đầu hình thành mô sẹo (hình 4.2). Đặc biệt là một số mẫu lây nhiễm hình thành mô sẹo khá sớm (sau 5 ngày trên môi trƣờng MsRec). Tuy nhiên, các mô sẹo lúc này còn nhỏ và có màu xanh trong. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp đồng nuôi cấy với vi khuẩn (A: Giống Coker 312, B: Giống SSR60F) 39 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm phát triển nhanh làm cho kích thƣớc khối mô sẹo gia tăng nhanh chóng. So với khi trên môi trƣờng phục hồi, các mô sẹo của mẫu lây nhiễm tăng gấp đôi về kích thƣớc sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc 1 (hình 4.3). Các khối mô sẹo lúc này có màu xanh đậm và cứng. Trong khi đó, mô sẹo của các mẫu đối chứng có kích thƣớc lớn hơn và mô sẹo của đối chứng 1 (đối chứng không thanh lọc) có màu xanh vàng. Sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 các mô sẹo đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (giống Coker 312) 40 Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các khối mô sẹo bắt đầu chuyển từ màu xanh đậm sang màu xanh vàng và không xốp. So sánh giữa mô sẹo của đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm thì thấy rằng các mô sẹo mẫu đối chứng có màu xanh vàng tốt hơn các mô sẹo mẫu lây nhiễm (hình 4.4). Ngoài ra, trên các khối mô sẹo thấy xuất hiện các mô sẹo mới có xu hƣớng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv. (2003) các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Tuy nhiên, sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, màu xanh vàng và mức độ rời của các mô sẹo chƣa rõ ràng. Sau 14 ngày (sau 38 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 các mô sẹo đƣợc tách nhỏ và cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3). Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (sau 52 ngày), trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các mô sẹo đƣợc cấy chuyển trực tiếp lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Khi đó, các mô sẹo của cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm có kích thƣớc lớn gấp khoảng 3-4 lần khối mô sẹo trên môi trƣờng thanh lọc lần 1. Các mô sẹo có xu hƣớng rời rạc và có màu xanh vàng rõ ràng hơn so với khi trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. Hơn nữa, trên các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có xuất hiện các vùng màu xám bên cạnh các cụm mô sẹo mới màu xanh vàng (hình 4.5 A). Các mô sẹo màu xanh vàng và màu xám này xuất hiện sau 42- 56 ngày, nhƣng Chaudhary và ctv. (2003) đã báo cáo các mô sẹo này xuất hiện sau 30-40 ngày. 41 Trong 7 thí nghiệm sau này, các mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Kết quả là các mô sẹo chuyển màu nâu đen rất nhiều (hình 4.5 B). Đây là các mô sẹo chết. Quan sát trên một số mô sẹo hóa nâu thấy có xuất hiện các mô sẹo mới. Các mô sẹo này có thể là những mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Hình 4.5. Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: Mô sẹo không tách nhỏ, B: Mô sẹo tách nhỏ 4.1.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo Trong nuôi cấy mô, sự phát sinh hình thái của mẫu cấy có một ý nghĩa rất quan trọng. Các mẫu cấy có thể phát sinh hình thái theo các hƣớng: hình thành mô sẹo, phát sinh phôi hay tái sinh thành cây. Tỷ lệ hình thành mô sẹo là một trong những chỉ tiêu quan trọng trong nuôi cấy mô thông thƣờng và chuyển gen. Tỷ lệ hình thành mô sẹo cho chúng ta biết đƣợc khả năng hình thành mô sẹo của mẫu nuôi cấy. Trong thí nghiệm, tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm sau 7 ngày. 42 Bảng 4.1. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống Coker 312 (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 158 100 98,75 2 60 130 60 128 100 98,46 3 60 155 60 154 100 99,35 4 60 120 60 120 100 100 Trung bình 100 99,14 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.2. Tỷ lệ hình thành mô sẹo của giống SSR60F (sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu tạo mô sẹo (sau 7 ngày) Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 59 169 98,33 91,35 2 60 176 58 160 96,67 90,91 3 60 190 60 176 100 92,63 4 60 190 59 176 98,33 92,63 5 60 200 57 180 97,67 90,00 Trung bình 96,67 91,50 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống có sự khác nhau. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, mẫu lây nhiễm có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất ở giống Coker 312 đạt 99,14%, giống SSR60F đạt 91,50%. Các mẫu lây nhiễm ở giống Coker 312 hình thành mô sẹo ngay khi còn trên môi trƣờng phục hồi. Trong khi đó, các mẫu lây nhiễm của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn (hình 4.6). 43 Hình 4.6. Mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi. A: Mô sẹo mẫu đối chứng giống SSR60F, B: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống SSR60F, C: Mô sẹo mẫu đối chứng giống Coker 312, D: Mô sẹo mẫu lây nhiễm giống Coker 312 Tất cả các mẫu đối chứng của giống Coker 312 đều hình thành mô sẹo ngay khi còn ở trên môi trƣờng phục hồi và đạt tỷ lệ 100%. Trong khi đó mẫu đối chứng của giống SSR60F hình thành mô sẹo chậm hơn và chỉ đạt tỷ lệ 96,67%. Các mẫu đối chứng hình thành mô sẹo mạnh hơn các mẫu lây nhiễm. Điều này có thể giải thích là do mẫu lây nhiễm bị tổn thƣơng do các tác nhân nhƣ: vật lý (thao tác khi cấy, va chạm giữa các mẫu, rửa mẫu…), hóa học (nƣớc, kháng sinh, môi trƣờng…). Tuy nhiên, sau khi chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần một tất cả các mẫu đều hình thành mô sẹo. Những mẫu chƣa tạo mô sẹo trên môi trƣờng phục hồi đều đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 và sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, tất cả những mẫu này đều hình thành mô sẹo. Kết quả bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy hai giống đáp ứng hình thành mô sẹo tốt. Trong khi đó Chaudhary và ctv. (2003) báo cáo một tỷ lệ hình thành mô sẹo thấp hơn (78% của mẫu lây nhiễm sau 10-15 ngày). Tỷ lệ hình thành mô sẹo khác nhau này có thể là do Chaudhary và ctv. (2003) đã chuyển các mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng thanh lọc (tác nhân thanh lọc là kanamycin) ngay. Hơn nữa, giống bông vải sử dụng cũng khác nhau (giống Coker 310). Tuy nhiên, tỷ lệ hình thành mô sẹo ở mẫu đối 44 chứng lại giống nhau (100%). Điều này có nghĩa là sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo của mẫu lây nhiễm là do thời điểm quan sát khác nhau và việc mẫu ngay lên môi trƣờng thanh lọc có ảnh hƣởng tới tỷ lệ hình thành mô sẹo. Theo Firoozabady (1987) và Rajasekaran (1996) khả năng tái sinh của cây bông còn phụ thuộc rất lớn vào kiểu gen và mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy rằng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống bông vải ở trên một phần cũng do ảnh hƣởng của kiểu gen. Ngoài ra không loại trừ khả năng sự khác nhau trong tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa các giống còn do thác tác trong thí nghiệm. Các thao tác giữa các lần thí nghiệm về mặt chi tiết có thể khác nhau. Ví dụ nhƣ trong thao tác rửa vi khuẩn chỉ cần để các mẫu lây nhiễm lâu hơn một chút trong nƣớc là cũng có thể làm cho mẫu thâm đen và do đó làm kéo dài thời gian hình thành mô sẹo. 4.2. Kết quả thanh lọc Trong chuyển nạp gen, thanh lọc mẫu là điều rất quan trọng. Thanh lọc các mẫu giúp loại bỏ bớt các mẫu không đƣợc chuyển nạp gen. Các mẫu không chuyển nạp gen đƣợc loại bỏ bằng cách đặt các mẫu trên môi trƣờng chứa tác nhân thanh lọc. Những mẫu không chuyển nạp gen sẽ không phát triển hoặc phát triển chậm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Trong khi đó, các mẫu đƣợc chuyển nạp lại sống sót và phát triển tốt trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc. Kết quả thanh lọc đƣợc đánh giá dựa trên số mẫu sống sót trên môi trƣờng thanh lọc. 4.2.1. Thanh lọc lần 1 Sau bảy ngày trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu đƣợc chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Môi trƣờng MSS1 có chứa 1% glucose và 2,5% mannose. 45 Bảng 4.3. Kết quả thanh lọc lần 1 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS1) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 160 60 157 100 98,13 2 60 130 60 126 100 96,92 3 60 155 60 153 100 98,71 4 60 120 60 115 100 95,83 Trung bình 100 97,40 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.4. Kết quả thanh lọc lần 1 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS1). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 185 60 180 100 97,29 2 60 176 60 173 100 98,29 3 60 190 60 185 100 97,36 4 60 190 60 188 100 98,94 5 60 200 60 197 100 98,50 Trung bình 100 98,08 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mô sẹo hình thành tốt. Giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm không có sự khác biệt (hình 4.7). Nguyên nhân chính là do trong môi trƣờng MSS1 có chứa 1% (w/v) đƣờng glucose nên các mẫu cả đối chứng và lây nhiễm đều sử dụng dạng đƣờng này trƣớc để phát triển. - Một số mẫu chết trong lần thanh lọc thứ nhất có mầu nâu đen và gần nhƣ không hình thành mô sẹo. Các mẫu này chết là do các tác nhân lý hóa học. - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 MSS1, mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có kích thƣớc nhỏ hơn so với mô sẹo của các mẫu đối chứng. 46 - Tỷ lệ mẫu mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt là: - Giống Coker312: 100% và 97,40%. - Giống SSR60F: 100% và 98,08%. Hình 4.7. Mô sẹo giống Coker 312 sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1. A: mẫu đối chứng, B: mẫu lây nhiễm. 4.2.2. Thanh lọc lần 2 Sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS1, các mẫu đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Môi trƣờng MSS2 là môi trƣờng thanh lọc lần 2 có chứa 0,5% glucose và 3% mannose. Bảng 4.5. Kết quả thanh lọc lần 2 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS2) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 157 60 150 100 98,12 2 60 126 60 125 100 96,92 3 60 153 60 147 100 98,71 4 60 119 60 117 100 99,17 Trung bình 100 97,28 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) 47 Bảng 4.6. Kết quả thanh lọc lần 2 các mẫu lây nhiễm giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS2). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 180 60 179 100 99,44 2 60 173 60 172 100 99,42 3 60 185 60 180 100 97,29 4 60 188 60 183 100 97,34 5 60 197 60 193 100 97,97 Trung bình 100 98,29 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Nhận xét: - Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2), các mô sẹo ra tăng kích thƣớc rất nhanh và theo quan sát thì kích thƣớc khối mô sẹo ra tăng gấp đôi so với kích thƣớc khi mới đặt lên trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (hình 4.8 A, B). - Giữa mô sẹo mẫu đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm vẫn chƣa có sự khác biệt rõ ràng (hình 4.8 C, D). Các khối mô sẹo của mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm trên môi trƣờng có tác nhân thanh lọc phát triển nhƣ nhau. - Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các mẫu đối chứng chƣa có dấu hiệu chậm phát triển lại, điều này có thể giải thích do trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 có 0,5% (w/v) glucose nên các mẫu đối chứng vẫn phát triển đƣợc. - Tỷ lệ mô sẹo sống sót giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm của mỗi giống lần lƣợt: - Giống Coker312: 100% và 97,28%. - Giống SSR60F: 100% và 98,295. - So sánh tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm thì thấy rằng tỷ lệ sống sót của mô sẹo mẫu đối chứng cao hơn mô sẹo mẫu lây nhiễm. Điều này có thể do tác nhân thanh lọc chƣa có ảnh hƣởng nhiều tới mô sẹo. Hơn nữa, các mẫu lây nhiễm phải chịu các tổn thƣơng trƣớc khi cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc. 48 Hình 4.8. Các khối mô sẹo giống Coker 312 trên môi trƣờng thanh lọc. A: trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, B: trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, C, D: mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. 4.2.3. Thanh lọc lần 3 Trên môi trƣờng thanh lọc MSS3, trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ, sau 14 ngày trên môi trƣờng MSS3 thì thấy rằng: - Ở các khối mô sẹo lây nhiễm xuất hiện hai loại mô sẹo: một có màu trắng xám và một có màu xanh vàng mọc ra ngay bên cạnh các mô sẹo màu trắng xám. Các mô sẹo màu trắng xám có thể do hai nguồn gốc: một là từ các tế bào già chết và một từ các tế bào không chuyển nạp gen chết. Các khối mô sẹo của mẫu lây nhiễm có nhiều mô sẹo màu trắng xám hơn các khối mô sẹo của mẫu đối chứng. - Không có sự khác biệt rõ ràng giữa mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm về mặt hình thái (hình 4.9 A, B). Nguyên nhân có thể do các khối mô sẹo không đƣợc tách nhỏ trƣớc khi chuyển lên môi trƣờng MSS3 nên trong các khối mô sẹo của mẫu đối chứng có thể có sự tích tụ đƣờng glucose. Tuy nhiên, sau 28 ngày trên môi trƣờng 49 MSS3, trên mẫu lây nhiễm có một số khối mô sẹo chuyển sang màu nâu xám và sậm màu dần, mẫu đối chứng cũng chuyển màu tƣơng tự (hình 4.10 A, B). Các khối mô sẹo này đƣợc cho kết luận đã chết. Ở mẫu đối chứng cũng có các khối mô sẹo tƣơng tự. Nhƣ vậy, có thể thấy rằng thanh lọc lần 3 chỉ có hiệu quả khi các mẫu đƣợc nuôi cấy ít nhất khoảng 28 ngày trên môi trƣờng MSS3. Tuy vậy, nồng độ mannose vẫn đƣợc đề nghị tăng lên ở các lần thanh lọc. Nồng độ mannose có thể bắt đầu là 3% (w/v) và thanh lọc lần 3 sẽ là 4% (w/v). Bởi vì hiệu quả thanh lọc chƣa cao. Hơn nữa, trƣớc khi đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3) các khối mô sẹo nên đƣợc tách nhỏ để rút ngắn thời gian thanh lọc. Hình 4.9. Mô sẹo giống Coker 312 (không tách nhỏ, sau 14 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng, C, D: khối mô sẹo có các tế bào hóa nâu và các cụm mô sẹo mới) 50 Hình 4.10. Mô sẹo giống Coker 312 sau 28 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3. A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng chết. Trong 7 thí nghiệm sau , sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc MSS2, các khối mô sẹo đƣợc tách nhỏ (khoảng 3 mm) và chuyển lên môi trƣờng MSS3 có 3,5% mannose và 0% glucose. Kết quả thanh lọc lần 3 các mẫu lây nhiễm (sau 14 ngày trên MSS3) đƣợc tóm tắt ở bảng 4.7 và bảng 4.8. Kết quả cho thấy, hiệu quả chọn lọc mannose có biểu hiện rõ. Các cụm mô sẹo đều chuyển sang màu nâu đen (cả đối chứng và mẫu lây nhiễm). Các cụm mô sẹo này không phát triển gia tăng kích thƣớc và chết (hình 4.11 A và B). Tuy nhiên một số mô sẹo sau khi hoá đen lại phát triển các mô sẹo mới ở các mẫu chuyển nạp gen. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc. 51 Bảng 4.7. Kết quả thanh lọc lần 3 giống Coker 312 (sau 14 ngày trên MSS3) Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 150 0 1 0 0,67 2 60 125 0 4 0 3,20 3 60 147 0 2 0 1,36 4 60 117 0 2 0 1,70 Trung bình 0 1,73 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm) Bảng 4.8. Kết quả thanh lọc lần 3 giống SSR60F (sau 14 ngày trên MSS3). Thí nghiệm Số mẫu ban đầu Số mẫu sống sót Tỷ lệ (%) Đối chứng MLN Đối chứng MLN Đối chứng MLN 1 60 179 0 5 0 2,79 2 60 172 0 10 0 5,81 3 60 180 0 6 0 3,33 4 60 183 0 7 0 3,83 5 60 193 0 5 0 2,59 Trung bình 0 3,67 Ghi chú: MLN (mẫu lây nhiễm). Hình 4.11. Mô sẹo giống Coker 312 (tách nhỏ) sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (A: mẫu lây nhiễm, B: mẫu đối chứng) 52 Hiệu quả thanh lọc cao giúp giảm bớt khó khăn trong việc xác định mô sẹo đƣợc chuyển nạp gen. Kết quả thanh lọc ở bảng 4.7 và bảng 4.8 cho thấy tỉ lệ mẫu sống sót sau khi đƣợc chuyển nạp gen ở bông vải là thấp. Hiện nay, trong chuyển nạp gen vào cây bông vải, các tác nhân thanh lọc đƣợc sử dụng chủ yếu là các kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromycin…và các tác giả này cũng báo cáo là hiệu quả chuyển nạp gen thấp (Firoozabady và ctv, 1987; Rajasekaran và ctv, 1996). Điều quan trọng ở đây đó là ý nghĩa của việc thiết kế các bƣớc thanh lọc và tác nhân đƣợc sử dụng. Các bƣớc thanh lọc nhƣ trên giúp cho các mẫu chuyển nạp gen thích nghi từ từ với sự thay đổi nồng độ đƣờng. Sự có mặt của đƣờng glucose sẽ giúp cho tất cả các mẫu đều phát triển, điều này giúp cho chúng ta tránh bị mất những mẫu chuyển gen. Một số tác giả dùng hệ thống thanh lọc với chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, hygromicin…, khi thanh lọc đặt ngay mẫu lây nhiễm lên môi trƣờng có nồng độ tác nhân thanh lọc cao sau đó mới giảm dần nồng độ tác nhân thanh lọc. Ví dụ nhƣ: trong nghiên cứu của mình Chaudhary và ctv. (2003) sử dụng hệ thống thanh lọc qua 4 lần thanh lọc với nồng độ Kanmycin lần lƣợt là 50mg/l, 50mg/l, 25mg/l và 0mg/l (Chaudhary và ctv., 2003). Hay nhƣ Haq (2004) thanh lọc mẫu chuyển gen qua 4 lần thanh lọc với nồng độ kanamycin lần lƣợt là 50mg/l, 25mg/l, 25mg/l và 25mg/l (Haq, 2004). Điều này có thể làm cho chúng ta mất đi một số mẫu chuyển nạp gen vì các mẫu chuyển nạp gen chƣa kịp thích nghi, gen đƣợc chuyển chƣa hoạt động ổn định do đó chƣa giúp cho mẫu chuyển gen có thể sống sót đƣợc. Trong khi đó, nếu áp dụng các bƣớc thanh lọc nhƣ trên sẽ giúp làm giảm việc mất đi các mẫu chuyển nạp gen vì với cách thiết kế nhƣ trên tất cả các mẫu đều có điều kiện phát triển nhƣ nhau nhƣng những mẫu đƣợc chuyển gen sẽ phát triển mạnh hơn và các mẫu sẽ đƣợc thanh lọc dần qua các lần thanh lọc tiếp theo. Hơn nữa, sử dụng đƣờng mannose để thanh lọc các mẫu sẽ giúp làm giảm những lo ngại về tính an toàn của cây chuyển nạp gen khi sử dụng kháng sinh trong thanh lọc. 53 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Với kết quả thu đƣợc về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens của hai giống bông vải Coker 312 và SSR60F, trong đó đã tập trung nghiên cứu về hệ thống thanh lọc bằng đƣờng mannose ở bông vải sau khi đƣợc biến nạp, chúng tôi có những nhận xét sau: - Sau khi lây nhiễm trụ hạ diệp bằng bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens (vắc tơ pManCa mang gen pmi và gen gus), các mô sẹo của hai giống bông phát triển bình thƣờng qua hai lần thanh lọc trong môi trƣờng có chứa mannose. Ở lần thanh lọc thứ 3, hiệu quả chọn lọc bằng mannose biểu hiện rõ. Ở mẫu đối chứng không chuyển nạp gen, tỷ lệ chết là 100% ở cả 2 giống; ở mẫu chuyển nạp gen, tỷ lệ sống sót là 1,73% ở giống Coker 312 và 3,67% ở giống SSR60F. - Việc tách nhỏ các khối mô sẹo trƣớc khi cho thanh lọc lần 3 là rất cần thiết để tránh tình trạng thoát (escape) trong thanh lọc và việc chọn mẫu sống sót do chuyển nạp gen thành công đƣợc chính xác. - Tỷ lệ sống sót của mẫu đƣợc biến nạp gen qua thanh lọc bằng mannose ở bông vải là thấp vì vậy cần tăng số lƣợng mẫu biến nạp. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu để chuẩn hoá nồng độ mannose ở các lần thanh lọc, kích thƣớc mô sẹo, v.v. để nâng cao hiệu quả chọn lọc bằng mannose. - Tiếp tục thực hiện các bƣớc tiếp theo để tạo ra cây biến đổi gen. - Chú ý giống bông vải SSR60F để sử dụng trong chƣơng trình tạo giống bông biến đổi gen ở Việt Nam. 54 55 CHƢƠNG 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Lê Trần Bình, 2001. Thực trạng chuyển nạp gen ở Việt Nam. Hội Nghị Nhận Thức Về Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 6-8 tháng 7 năm 2001. 2. Bộ GD và ĐT, Trƣờng ĐH Nông Nghiệp I Hà Nội, bộ môn Cây Công Nghiệp,1996. Cây Công Nghiệp. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, 2003. Mục tiêu và trƣơng trình phát triển năm 2003 của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn. Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 1/2003: 5-8. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000.Di truyền phân tử-Những nguyên tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng (tập II:Chuyển nạp gen ). Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp. 5. Phạm Hoàng Hộ, 1997. Cây cỏ Việt Nam. Tái bản lần thứ ba. Nhà Xuất Bản Trẻ. Tp. Hồ Chí Minh. 6. Lê Kim Hỷ, 2003. Phát Triển Cây Bông Vải Ở Các Tỉnh Duyên Hải Nam Trung Bộ. Hội nghị về phát triển cây bông vải ở Duyên Hải Nam Trung Bộ, tháng 5/2003. 7. Lê Quang Quyến, 2004. Phát Triển Cây Bông Và Nghề Trồng Bông Ở Việt Nam. Viện Nghiên Cứu Cây bông và Cây có sợi. 8. Trƣơng Thu Thủy, Nguyễn Hữu Cƣờng, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình, Trịnh Minh Hợp, Lê Quang Quyến, 2003. Nghiên cứu quy trình tái sinh cây bông (Gossypiym hirsutum L.) từ phôi Soma. Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc, Hà Nội. 831 – 836. 56 TIẾNG NƢỚC NGOÀI 9. Binns A.N. and Costantino P., 1998. The Agrobacterium oncogens, pp: 251-266. In: The Rhizobiaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria, (Spaink H.P., Kondorosi A., Hooykaas P.J. J. - editors). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 10. Brubaker C.L., Brown A.H.D., Stewart J.M., Kilby M.J. and Grace J.P., 1999. Production of fertile hybrid germplasm with diploid Australian Gossypium species for cotton improvement. Euphytica 108: 199-210. 11. Chauhary B., Kumar S., Prasad V.S.K., Oinam G.S., Burma P.K. and Pental D., 2003. Slow desiccation to high-frequency shoot recovery from transformed somatic embryos of cotton (Gossypium hirsutum L. cv. Coker 310). Plant Cell Reports 21: 955 – 960. 12. Chen Z.X., Liewellyn D.J., Fan Y.L., Li S.J., Guo S.D., Jiao G.L. and Zhao J.X., 1994. The 2,4-D resistant transgenic cotton plants produce by Agrobacterium mediated gene transfer. Scientina Agriculture Sinica 27(2): 31 – 37. 13. Chen Z.X, Zhi X.J. and Xian S.J., 2000. High-efficiency Agrobacterium-mediated transformation of cotton using petiole explants. US Patent No.: WO 00/77230 A1. 14. Chilton M.D., Currier T.C., Farrand S.K., Bendich A.J., Gordon M.P. and Nestor E.W., 1974. Agrobacterium tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DNA not detected in crown gall tumors. Proceeding of the National Academy of Sciences. USA 71: 3672- 3676. 15. Chlan Y.L., Lin J., Cary J.W. and Cleveland T.E., 1995. A producer for biolistic transformation and regeneration of transgenic cotton from meristematic tissues. Plant Molecular Biology Reporter 13: 31-37. 16. Deacon J., Robertson A. and Isbister A., 2005. The Microbial World: Biology and Control of Crown Gall (Agrobacterium tumefaciens). Institute of Cell and Molecular Biology, The University of Edinburgh. 17. Deng W., Chen L., Wood D.W., Metcalfe T., Liang X., Gordon M.P., Comai L. and Nester E.W., 1998. Agrobacterium VirD2 protein interacts with plant host cyclophilins. Proceeding of the National Academy of Sciences 95: 7040-7045. 57 18. Dessaux Y., Petit A., Farrand S.K. and Murphy P.J., 1998. Opines and opine-like molecules involved in plant-Rhizobiaceae interactions. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 19. Finer J.J. and Smith R.H., 1984. Initiation of callus and somatic embryos from explants of mature cotton (Gossypium klotzschianum Anderss). Plant cell reports 3: 41- 43. 20. Finer J.J. and McMullen M.D., 1990. Transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) via particle bombardment. Plant cell reports 8 (10): 586-589. 21. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halls E.J., Anderson I.N., Raska K.A. and Muray E.E., 1987. Transformation of cotton, Gossypium hirsutum L. by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants. Plant Molecular Bology 10: 105-116. 22. Gelvin S.B., 2000. Agrobacterium and plant genes involved in T-DNA transfer and integration. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Bology 51: 223-256. 23. Gelvin S.B., 2003. Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the "Gene-Jockeying" Tool. Microbiology and Molecular Biology Reviews 67: 16-37 24. Gould J.H. and Cedeno M.M., 1998. Adaption of shoot apex culture to Agrbacterium- mediated transformation. Plant Molecular Bology 16: 1-10. 25. Hansen G. and Chilton M.D., 1999. Lessons in gen transfer to plants by a gifted microbe. Current Topics Microbiology Immunology 240: 21-57. 26. Hoa T.T.C. and Bong B.B., 2003. Effcient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa) using mannose selection system. Viet Nam Journal of Agriculture & Rural Development 1+2: 60-63. 27. Hoekema L. 1984. A binary vector strategy base on separation of Vir- and T- region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303: 179-180. 28. Haq I.U., 2004. Agrobacterium-Mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutm L.) via vacuum infiltration. Plant Molecular Biology Reporter 22: 279- 288. 58 29. ISAAA, 2002. Global Review of Commercialized Transgenic Crops: 2001 Feature: Bt Cotton. 26b.pdf. 30. ISAAA, 2004. Preview: Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2004. Summary (English).pdf. 31. Jiang B.G., 2004. Optimization of Agrobacterium mediated cotton transformation using shoot apex explants and quantitative trait loci analysis of yeild and yeild component traits in Upland Cotton (Gossypium hirsutm L.). PhD. Dissertation, Louisiana State University, USA. 32. Jin S., Prusti R.K., Roitsch T., Ankenbauer R.G. and Nester E.W., 1990. Phosphorylation of the VirG protein of Agrobacterium tumefaciens by the autophosphorylated VirA protein: Essential role in biological activity of VirG. Journal of Bacteriology 172: 4945- 4950. 33. Korber H., Strizhov N., Staiger D., Feldwish J., Olsson O., Sandberg. G., Palme K., Schell J. and Koncz C., 1991. T-DNA gene 5 of Agrobacterium modulates auxin response by autoregulated synthesis of a growth hormone an tagonist in plants. EMBO Journal 10: 3983-3991. 34. Kumria S., Sunnichan V.G, Das D.K., Gupta S.K., Reddy V.S., Bhatnagar R.K. and Leelavathi S., 2003. High-frequency somatic embryo production and maturation into normal plants in cotton (Gossypium hirsutum L.) through metabolic stress. Plant Cell Reports 21(7): 635-639. 35. Lai E.M. and Kado C.I., 1998. Processed VirB2 Is the Major Subunit of the Promiscuous Pilus of Agrobacterium tumefaciens. Journal of Bacteriology 180: 2711-2717. 36. McCabe D.E. and Martinell B.J., 1993. Transformation of lite cotton cultivars via particle bombardment of meristems. Bio/Technology 11: 596-598. 37. Miranda A., Janssen G., Hodges L., Peralta E.G. and Ream W., 1992. Agrobacterium tumefaciens transfers extremely long T-DNAs by a unidirectional mechanism. Journal of Bacteriology 174: 2288-2297. 59 38. Mishra R., Wang H.Y., Yadav N.R. and Wilkins T.A., 2003. Development of a highly regenrable elite Acala cotton (Gossypium hirsutumcv. Maxxa)–a step towards genotype-independent regeneration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 73: 21–35. 39. Murashige T. and Skoog F., 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia platarum 15: 473-493 40. Nobre J., Keith J.D. and Dunwell J.M., 2001. Morphogenesis and regeneration from stomatal guard cell complexes of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell Reports 20: 8-15. 41. Ophel K. and Kerr A., 1990. Agrobacterium vitis sp. nov. for strains of Agrobacterium biovar 3 from grapevines. International Journal of Systematic Bacteriology 40: 236-241. 42. Perlak F.J., Deaton R.W., Armstrong T.A., Fruchs R.L, Sims S.R., Grennplate J.T. and Fischhoff D.A., 1990. Insect resistant cotton plants. Bio/Technology 8: 934- 943. 43. Perlak F. J., Oppenhuizen M., Gustafson K., Voth R., Sivasupramaniam S., Heering D., Carey B., Ihrig R.A. and Roberts J.K., 2001. Development and commercial use of Bollgard ® cotton in the USA- early promises versus today’s reality. The Plant Journal 27 (6): 489-501. 44. Rajasekaran K., Hudspeth R.I., Cary J.W., Anderson D.M. and Cleveland D.M., 2000. High-frequency stable transformation of cotton (Gossypium hirsutumL.) by particle bombardment of embryogenic cell suspension cultures. Plant Cell Reports 19: 539- 545. 45. Rajasekaran K., 1996. Regenration of plants from cryopreserved embrygenic cell suspension and callus cultures of cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Cell Reports 3: 859-864. 46. Reichert N.A., Lim T.K. and Young M.M., 2002. Method for transformation of cotton and organogenic regeneration. US Patent No: US 6,479,287 B1. 47. de la Riva G.A., González-Cabrera J., Vázquez-Padrón R. and Ayra-Pardo C., 1998. The Agrobacterium tumefaciens gene transfer to plant cell. Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458. 60 48. Sakhanokho H.F., Zipf A., Rajasekaran K., Saha S. and Shama G.C., 2001. Induction of highly embryogenic calli and plant regenration in Upland (Gossypium hirsutumL.) and Pima (Gossypium barbadense L.) cottons. Crop Science 41: 1235- 1240. 49. Satyavathi V.V., Prasad V., Laskmi B.G. and Sita G.L., 2002. High efficiency tranformation protocol for three Indian cotton varieties via Agrobacterium tumefaciens. Plant Science 162: 215-223. 50. Stachel S.E., Timmerman B. and Zambryski P., 1987. Activation of Agrobacterium tumefaciens vir gene expression genrates multiple single-stranded T-strand molecules from the pTiA6 T-region: requirement for 5' virD gene products. EMBO Journal 6: 857-863. 51. Sunilkumar G. and Rathore K.S., 2001. Transgenic cotton: factors influencing Agrobaterium-mediated transformation and regeneration. Molecular Breeding 8: 37- 52. 52. Tinland B., Fournier P., Heckel T. and Otten L., 1992. Expression of a chimeric heat-shock-inducible Agrobacterium 6b oncogene in Nicotiana rustica. Plant Molecular Biology 18: 921- 930. 53. Umbeck P.F., Johnson G., Barton K. and Swain S., 1987. Genetically transformed cotton (Gossypium hirsutumL.). Plant Biotechnology 5:263 – 266. 54. Valentine L., 2003. Agrobacterium tumefaciens and the Plant: The David and Goliath of Modern Genetics. Plant Physiology 133: 948-955. 55. Ziemienowicz A., 2001. Odyssey of Agrobacterium T-DNA. Acta biochimica polonica 48: 623.635. 56. Zupan J. R., Citovsky V. and Zambryski P., 1996. Agrobacterium VirE2 protein mediates nuclear uptake of single-stranded DNA in plant cells. Proceeding of the National Academy of Sciences 93: 2392-2397. 57. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J.J, Farrand S.K. and Winans S. C., 2000. The Bases of Crown Gall Tumorigensis. Journal of Bacteriology 182: 3885- 3895. 58. Winans S.C., Allenza P., Stachel S.E., McBride K.E. and Nester E.W., 1987. Characterization of the virE operon of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid pTiA6. Nucleic Acids Research 15: 825.837. 61 CÁC TRANG WEB THAM KHẢO: 59. 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần môi trƣờng MS (Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Nộng độ cuối Nồng độ dung dịch mẹ (mg/l) (mg/l) Khoáng đa lƣợng 20X NH4NO3 1650 33000 KNO3 1900 38000 CaCl2.2H2O 440 8800 MgSO4.7H2O 370 7400 KH2PO4 170 3400 Fe-EDTA 100X FeSO4.7H2O 27,85 2780 Na2-EDTA.2H2O 37,25 3725 Khoáng vi lƣợng 100X MnSO4.4H2O 22,300 2230,0 ZnSO4.7H2O 8,600 860,0 H3PO4 6,200 620,0 KI 0,830 83,0 Na2MoO4.2H2O 0,250 25,0 CuSO4.7H2O 0,025 2,5 CoCl2.6 H2O 0,025 2,5 Các vitamin MS 100X Glycin 2,0 100 Acit nicotinic 0,5 50 Pyridoxin. HCl 0,5 50 Thiamin. HCl 1,0 20 63 Phụ lục 2. Thành phần môi trƣờng YEP (An và ctv, 1988) Bacto pepton 10 g/l Chất trích nấm men 10 g/l NaCl 5 g/l Bacto Agar 15 g/l PH 7,0 (bằng NaOH) Phụ lục 3. Thành phần môi trƣờng AB ( Chilton và ctv, 1974 ) Thành phần nồng độ cuối (g/l ) Dung dịch đệm AB (hấp tiệt trùng riêng) K2HPO4.3H2O 3,0 NaH2PO4 1,0 Khoáng AB (hấp tiệt trùng riêng) NH4Cl 1,000 MgSO4.7H2O 0,300 KCl 0,150 CaCl2 0,010 FeSO4.7H2O 0,0025 Môi trƣờng ABG Glucoz 5,0 g Agar 15,0 g Nƣớc cất 900,0 ml Khoáng AB 20X 50,0ml Đệm AB 20X 50,0 ml Phụ lục 4. Thành phần môi trƣờng MSG (Murashige và Skoog, 1962) ½ MS salts (Duchefa, M0221) 2,15 g/l MgCl2. 6H2O 0,9 g/l Glucose 10 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l PH: 7,0 (Bằng KOH ) 64 Phụ lục 5. Thành phần môi trƣờng lây nhiễm MsCo MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l Glucoz (Art-Nr. 6780.2, Roth, Đức) 30 g/l 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) 0,05 mg/l Kinetin 0,1 mg/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l Acetosyringone 200 μM PH: 6,5 (Bằng KOH) Phụ lục 6. Thành phần môi trƣờng phục hồi MsRe Môi trƣờng Ms-Co Carbenicillin 500 mg/l PH: 6,5 (bằng KOH 0,1N) Phụ lục 7. Thành phần môi trƣờng thanh lọc lần MSS MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l Glucoz (Art-Nr. 6780.2, Roth, Đức) (10; 5; 0) g/l Mannose (25; 30; 35) g/l 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) 0,05 mg/l Kinetin 0,1 mg/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l Carbenicillin 200 μM pH: 6,5 (bằng KOH) Phụ lục 8. Thành phần môi trƣờng phát sinh phôi DM MS salts và B5 vitamin (M 0231) 4,4 g/l KNO3 1,9 g/l Glucose 30 g/l MgCl2.6H2O 0,9 g/l Phytagel (Sigma, P8169) 2 g/l pH: 6,5 (bằng KOH) 65 Phụ lục 10: DỤNG CỤ DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM - Keo thủy tinh - Nồi hấp tiệt trùng autoclave: Microm (Model No. SA- 252M) - Tủ nuôi cấy: VÖtsch VB 0714 và Sanyo chamber MLR-350H - Cân điện tử: chyo (MJ- 500) và AA-200 - Microwave: Sanyo EM-G4753 - Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) - Đĩa Petri Ф 60 và Ф 90 - Bình tam giác (10, 100, 250, 500 ml) - Ống đong (10, 25, 100, 250, 500, 1000 ml) - Ống ly tâm: Cell StarR (Cat.No. 227261) - Máy đo pH: Themo orion (Model 420) - Kính hiển vi: Olympus TL3 - Máy lắc (200 rpm): Orbital incubator S150 - Tủ cấy: Holten LaminAir (model 1.8) và Microflow laminar (ABS1200) - Tủ lạnh (0, 4, -200C) - Máy ly tâm: Hermle Z323 - Máy đo OD600: Bio-Rad Smartspec TM 3000 - Tủ sấy - Kéo, kẹp, dao - Pipet (6, 50, 200, 1000 µl) - Máy khuấy từ: Bioblock cimarec 1