Khóa luận Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang

LỜI MỞ ĐẦU Trong các loại cây lương thực cĩ củ, khoai lang chiếm vị trí quan trọng. Trên thế giới khoai lang là 1 trong 5 cây cĩ củ quan trọng (sắn, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, khoai tây). Thành phần chính khoai lang gồm tinh bột, đường, protein, vitamin, và các chất khống. Khoai lang được dùng làm lương thực thực phẩm chính cho con người, làm thức ăn cho gia súc và là nguồn nguyên liệu của ngành cơng nghiệp chế biến: bánh kiện kinh tế cịn khĩ khăn cây khoai lang được coi là cây trồng cứu đĩi nhưng hiện nay nĩ là một cây trồng mang lại nhiều lợi nhuận kinh tế. Ở nước ta, khoai lang là một trong bốn cây lương thực chính sau lúa, ngơ, sắn. Trên thế giời, Việt Nam được xếp thứ năm về sản lượng khoai lang xuất khẩu. Tuy nhiên, năng suất cịn thấp và bấp bênh do sử dụng giống đã thối hĩa, ít quan tâm đến biện pháp canh tác, sâu bệnh. Hiện nay, những giống khoai lang Nhật nổi tiếng về chất lượng cao và đã thích nghi trong điều kiện ở Việt Nam và trở thành đối tượng nghiên cứu thời sự. Sự ra đời của kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật từ thế kỷ 20 đã mở ra cuộc cách mạng mới trong cơng tác tạo giống. Kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật ngày càng hồn thiện giúp cho việc nhân giống và phục hồi giống tốt hơn. Do đĩ việc ứng dụng kỹ thuật này vào trong sản xuất khoai lang sẽ tạo ra nhiều triển vọng mới trong việc tăng năng suất cũng như diện tích khoai lang Nhật, nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường tiêu thụ ngày càng cao.. Mục đích của khĩa luận này nghiên cứu ảnh hưởng của mơi trường khống lên sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai lang. Đề tài này được thực hiện tại phịng CƠNG NGHỆ TẾ BÀO THỰC VẬT- VIỆN SINH HỌC NHIỆT ĐỚI-VIỆN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ VIỆT NAM. 1.1. Giới thiệu về cây khoai lang 1.1.1. Sơ lược về khoai lang 1.1.1.1. Phân loại khoa học Tên khoa học: Ipomoea Batatas L. Giới: Plantae Lớp: Magnoliopsida Bộ : Solanales Họ: Convolvulaceae Chi: Ipomoea Lồi : I. batatas Tên tiếng Anh: Sweet potato Hình 1.1. Cây khoai lang 1.1.1.2. Nguồn gốc Khoai lang cĩ nguồn gốc ở Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Cơng Nguyên. Dấu tích củ khơ tồn tại lâu nhất được khám phá tại Caves của Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970). Người ta cũng tìm thấy sự hiện diện của khoai lang đầu tiên tại vùng Mayan của Trung Mỹ. Astin (1977) đã giả thuyết cĩ hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang tại Guatamala và nam Peru. Trong một số cơng trình khác cũng chỉ ra sự đa dạng lồi khoai lang cao nhất ở Colombia, Equador và nam Peru. Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểm tìm ra châu Mỹ năm 1492. Ơng đã đưa nĩ vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tây Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang. Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nha giới thiệu vào châu Âu sau đĩ truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn. Con đường khác do người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982) vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau đĩ tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin, 1963). Khoai lang được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến (Fukien) năm 1594. Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm 1674. Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615. Khoai lang được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đơng Nam Á. Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh nam tạp kỷ” và “Quảng Đơng tân ngữ“ của Lê Quí Đơn thì khoai lang được du nhập vào nước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta. Cây được trồng trong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao 2.300 m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996). 1.1.1.3. Phân bố Ø Trên thế giới Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và ơn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nĩ. Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng tồn thế giới là 127 triệu tấn. Trong đĩ phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn và diện tích trồng là 49.000 km². Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc được dùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm . Sản lượng trên đầu người lớn nhất tại các quốc gia mà khoai lang là mặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với 160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg. Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ về sản xuất khoai lang, hiện nay cung cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của quốc gia này. Mississippi cũng là bang chủ lực trong việc trồng khoai lang, tại đây khoai lang được trồng trên diện tích khoảng 8.200 mẫu Anh. Khoai lang từ Mississippi đĩng gĩp khoảng 19 triệu USD vào nền kinh tế bang này và hiện nay cĩ khoảng 150 trang trại ở Mississippi trồng khoai lang. Năm quận đứng đầu canh tác khoai lang ở Mississippi là Calhoun, Chickasaw, Pontotoc, Yalobusha và Panola. Lễ hội khoai lang quốc gia (Hoa Kỳ) được tổ chức hàng năm tại Vardaman vào tuần đầu tiên của tháng 11, và Vardaman được gọi là "The Sweet Potato Capital" (tạm dịch: Thủ đơ khoai lang). Thị trấn Benton, Kentucky kỷ niệm khoai lang hàng năm cùng với Lễ hội Ngày Tater vào thứ hai đầu tiên của tháng 4. Ø Trong nước Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp hàng thứ ba sau lúa và ngơ. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven biển. Đây là một trong những loại cây cĩ củ quan trọng, cĩ khả năng thích ứng mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ, đất thịt, đất cát. Khoai lang lại cĩ thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sơng Hồng, Đồng bằng Sơng Cửu Long,... Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây cĩ củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đĩ cĩ Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung tâm Cây cĩ củ thuộc Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nơng nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nơng nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dịng lai. Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu Nơng nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển chọn được 36 dịng triển vọng cĩ năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518. Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn cơng nhận (Hồng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995). 1.1.2. Đặc điểm thực vật, sinh trưởng và phát triển của khoai lang 1.1.2.1. Đặc điểm thực vật Hình 1.2 Cây khoai lang và các bộ phận ØRễ Khoai lang sau khi trồng 3 - 4 ngày sẽ mọc rễ mới, trong điều kiện khơ hạn hoặc nhiệt độ và ẩm độ thấp thì khoai mọc rễ non chậm. Rễ mọc đầu tiên ở các đốt thân dưới đất. Mỗi đốt cĩ khả năng ra 15 - 20 rễ, nhưng thường chỉ cĩ 5 - 10 rễ được phân hố thành rễ dầy mới cĩ cơ hội hình thành củ. Rễ khoai lang chia làm ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ. ØThân Thân khoai lang cĩ dạng bị hay nửa đứng. Thân phổ biến màu xanh, tím và xanh tím. Thân cĩ nhiều đốt với chiều dài lĩng khác nhau. Ở mắt đốt mọc ra rễ phụ. Độ dài đốt phụ thuộc vào giống. Căn cứ vào độ dài thân chính người ta chia làm hai loại: Loại thân dài khoảng 2- 5 m , loại thân ngắn: 0,5 -1 m. Thân phát triển dài ngắn ngồi yếu tố chính là giống cịn phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa, loại đất và phân bĩn. ØLá Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mắt một lá gồm cuống lá và phiến lá. Cuống lá dài 6 - 20 cm, cĩ lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảng khơng gian và cĩ thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sử dụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân nằm bị dưới mặt đất. Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ cĩ năng suất chất xanh cao. Màu sắc cuống lá do giống qui định. Đa số các giống khoai lang cĩ cuống lá màu xanh, một số khác cĩ cuống màu tím nhạt, tím. ØHoa Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngọn thân, hoa hình chuơng cĩ cuống dài. Hoa mọc thành chùm hay riêng rẽ. Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớt hồng, bên trong nĩ cĩ nhiều lơng tơ và tuyến mật hấp dẫn cơn trùng. Một hoa gồm 5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái. ØQuả và hạt Quả khoai lang thuộc loại quả sĩc hình trịn màu nâu đen, sau khi thụ tinh một đến hai tháng thì quả chín và cịn tùy thuộc giống và mùa vụ. Một quả cĩ từ 1 đến 4 hạt, hạt cĩ vỏ cứng, hạt dễ bị rụng khi quả chín. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển Khoai lang cĩ bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm và ra rễ; Phân cành và tạo củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ . ØThời kỳ ra rễ và chồi xanh Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống và điều kiện sinh thái của các vùng khác nhau. ØThời kỳ phân cành và hình thành củ Từ khi trồng đến khi hồn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày. Các nhánh trên thân bắt đầu phát triển và bị trải dần trên mặt luống. Củ hình thành khoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc giống và điều kiện mơi trường. Đây là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu cĩ sự hoạt động của các bĩ mạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ ØThời kỳ phát triển thân lá Thời gian từ lúc trồng đến hồn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75 - 85 ngày. Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bị lan phủ kín mặt và rãnh luống. Sự hình thành thêm rễ củ mới là khơng đáng kể. Nhưng những củ đã được hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chĩng. Một số củ hình thành sớm bắt đầu quá trình tích lũy chất khơ. ØThời kỳ phát triển củ Từ khi trồng đến khi hồn thành giai đoan này khoảng 90 - 105 ngày đối với các giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam. Điều kiện thuận lợi cho quá trình phình to của củ là cĩ sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng ấm, ban đêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuối thì năng suất củ khoai lang càng cao. Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trong khi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây khoai lang 1.1.3.1. Thế giới Cây khoai lang được coi là một trong 7 lồi cây lương thực quan trọng trên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nĩ được trồng trên hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệu thơ cho các ngành cơng nghiệp chế biến. Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ lồi cây trồng nào. Trong một nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 lồi trái cây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng. Ngồi ra khoai lang cịn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng. Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nơng nghiệp khác nhau, nĩ cĩ thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khơ hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổng diện tích là 11.200 hectares với năng suất là 30 tấn/ha. Trong vịng vài ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho khoai lang ở Ai Cập đạt được năng suất tối đa. Trong đĩ bệnh virus được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đĩ, Viện Kỹ thuật Gen trong Nơng nghiệp của Ai Cập (AGERI) đã áp dụng kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang gồm các bước như sau: ü Cải tạo giống địa phương bằng việc sản xuất nguồn cây giống sạch bệnh. ü Phát triển một hệ thống nhân giống cĩ hiệu quả cĩ khả năng ngăn chặn sự lây lan của virus. ü Phát triển một hệ thống phát hiện virus ở các cánh đồng trồng khoai lang. ü Ngồi ra họ cịn thiết lập các hệ thống theo dõi đảm bảo chất lượng của sản phẩm khoai lang được sản xuất ra. Kết quả nghiên cứu nuơi cấy đỉnh sinh trưởng của Castro và Andrate (1995) chỉ ra trên mơi trường MS bổ sung 0,005 mg/l NAA, 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l GA3 cho kết quả tốt. Các nghiên cứu của Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), Castro và Andrate (1995) trên các giống khoai lang khác nhau: Kết quả đều khơng thấy sự khác biệt giữa các giống. Các nghiên cứu về cây khoai lang trên thế giới rất đa dạng và phong phú. Ø Hướng nghiên cứu tạo cây khoai lang in vitro sạch virus: Năm 1975, Alconero và ctv đã kết hợp phương pháp nuơi cấy đỉnh sinh trưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng cĩ kích thước từ 0,4 -0,8 mm được cấy trên mơi trường MS, bổ sung kinetin và auxin (NAA, IAA). Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mơ sẹo. Trong số cây con được test virus thì cĩ 47% khơng nhiễm bệnh. Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), sử dụng mơi trường MS bổ sung auxin (2,4-D), cytokinins (KN, BA), GA3 (0,1 mg/l) để nuơi cấy đỉnh sinh trưởng cây khoai lang. Đỉnh sinh trưởng với 2 - 3 lá mầm được cắt và cấy trên các mơi trường cĩ các chất điều hịa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau, và đặt trong phịng nuơi cấy ở nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux. Kết quả thí nghiệm cho thấy 2,4-D (1 mg/l) và BA (0,25 mg/l) tạo được cây con tốt hơn. Trường hợp 2,4-D và KN ở nồng độ cao hơn tương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo ra mơ sẹo. Mervat và ctv (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sĩng khoai lang (SPFMV). Các mẫu ngồi đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virus bằng phương pháp dot- ELISA. Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý nhiệt ở nhiệt độ 420C/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 390C/ đêm (8giờ bĩng tối) trong thời gian 3 tuần trước khi tách đỉnh sinh trưởng. Những cây hình thành từ nuơi cấy đỉnh sinh trưởng tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA. Kết quả nghiên cứu cho thấy khơng cĩ cây nào bị nhiễm. Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hồ sinh trưởng đến sự nuơi cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và ctv (2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng mơi trường MS cĩ bổ sung 2 mg/l KN và 0,5 mg/l GA3. Và các chồi này hình thành trực tiếp thành cây mà khơng phát triển mơ sẹo. Theo tác giả, TDZ và BA làm cho chồi phát triển qua mơ sẹo nên khơng dùng trong nuơi cấy đỉnh sinh trưởng. Ø Vi nhân giống: Đây là nghiên cứu sớm nhất của cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự cơng bố vào năm 1974 về tái sinh khoai lang thơng qua mơ sẹo. Kết quả cho thấy sự hình thành mơ sẹo từ rễ củ trên mơi trường White cĩ bổ sung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên mơi trường MS cĩ bổ sung 1 mg/l ABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D. Năm 1984, sự tái sinh chồi qua mơ sẹo từ lá, đỉnh chồi, thân và rễ cũng thực hiện bởi Liu và Cantiliffe trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5 đến 2 mg/l 2,4 – D. Sự tái sinh chồi khoai lang in vitro từ rễ đã được cơng bố bởi Hwang và cộng sự (1983). Theo nghiên cứu này, đầu tiên các đoạn rễ kích thước 2 – 3 cm được nuơi cấy lên mơi trường MS biến đổi cĩ bổ sung nồng độ muối khống cao, 100 mg/l meo – inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 mg/l đường và 10 g/l agar. Sau đĩ, từ các nốt rễ sẽ tạo mơ sẹo và các vùng giống như mơ phân sinh để phát triển tiếp thành chồi. Mười năm sau, Berlamino (1993) đã thực hiện lại quá trình tái sinh chồi từ các nốt rễ khoai lang in vitro trên giống Benni Azuma thơng qua nuơi cấy mơ lá trên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l BA và thu được tần số tái sinh là 60% với 9 chồi/rễ . Chee và cộng sự (1990) cho rằng bằng cách giảm nồng độ đường trong mơi trường nuơi cấy xuống cịn 1,6% cùng với việc bổ sung 2,4 – D sẽ tăng cường sự phát triển phơi. Năm 1995, sự tái sinh khoai lang qua cuống lá được Desai và ctv thực hiện thành cơng trên 27 giống. Giai đoạn đầu, các lá được cấy lên mơi trường MS cĩ bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/l zeatin cho tới khi cuống lá bắt đầu phình lên (2 – 4 ngày). Giai đoạn thứ hai, chúng được cấy truyền sang mơi trường MS cĩ bổ sung 0,8 mg/l zeatin và đạt tần số tái sinh chồi cao. Một tần số tái sinh cây cao được thiết lập từ các mơ sẹo cĩ nguồn gốc từ các mảnh lá khoai lang in vitro nuơi cấy trên mơi trường LS cĩ bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D, 3g/l dịch chiết nấm men, 50 g/l đường và chuyển sang mơi trường thứ hai gồm khống LS cĩ bổ sung 2 mg/l ABA hoặc 2 mg/l AgNO3 để tái sinh thành cây (Otani và ctv, 1996). Một quy trình tái sinh cây trực tiếp gồm 2 giai đoạn cũng đã được cơng bố bởi Prakash và ctv (1996). Các mơ cuống lá trong mơi trường MS cĩ bổ sung 2,4 – D trong giai đoạn đầu tiên và TDZ trong giai đoạn thứ hai. Cơng bố này cho thấy khả năng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu di truyền, giai đoạn phát triển và hướng đặt mơ cuống lá trên mơi trường nuơi cấy. Năm 1997, Liu và ctv đã thiết lập thành cơng một hệ thống hiệu quả qua nuơi cấy dịch huyền phù tế bào cĩ khả năng phát sinh phơi và tái sinh thành cây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4 – D và ABA. Cũng trong năm 1997, Sihachakr đã nghiên cứu thành cơng hệ thống tái sinh cây khoai lang qua con đường phát sinh phơi. Các nhân tố ảnh hưởng đến việc tạo mơ sẹo và hình thành chồi cũng đã được thực hiện. Cơng bố này đã cung cấp một loại mơi trường cải biên trong nghiên cứu tái sinh khoai lang, mơi trường SPM (Standard Sweet Potato Medium). SPM là mơi trường MS cĩ bổ sung vitamin Dtaba 100mg/l; meo – inositol 50 mg/l và 30 g/l đường. Kết quả cho thấy trên mơi trường SPM cĩ bổ sung tổ hợp của 0,5 mg/l kinetin và 0,1 mg/l 2,4 – D mơ sẽ tái tạo chồi. Ø Quang tự dưỡng: Sự phát triển của cây khoai lang in vitro được cải thiện dưới các điều kiện vi nhân giống quang tự dưỡng (khơng bổ sung đường trong mơi trường nuơi cấy, cường độ chiếu sáng 100 µM.m-2.s-1 PPFD và nồng độ CO2 cao) (Kozai và ctv, 1993). 1.1.3.2. Việt Nam Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp hàng thứ ba sau lúa và ngơ. Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng ven biển. Đây là một trong những loại cây cĩ củ quan trọng, cĩ khả năng thích ứng mạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ, đất thịt, đất cát. Khoai lang lại cĩ thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, cho năng suất cao, tương đối ổn định. Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miền Trung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sơng Hồng, Đồng bằng Sơng Cửu Long... Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây cĩ củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đĩ cĩ Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh tham gia. Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trung tâm Cây cĩ củ thuộc Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nơng nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nơng nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dịng lai. Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứu Nơng nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tuyển chọn được 36 dịng triển vọng cĩ năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giới thiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-518. Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nơng thơn cơng nhận (Hồng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995). Hiện nay, trên lĩnh cơng nghệ sinh học, cây khoai lang chưa được nghiên cứu nhiều ở nước ta. Tuy nhiên vẫn cĩ một số các nghiên cứu nổi bật, trong đĩ cĩ nghiên cứu của Nguyễn Mỹ Uyên và ctv (2006) khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây khoai lang Ipomoea batatas L. trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên. 1.2. Tổng quan về nuơi cấy mơ thực vật 1.2.1. Khái niệm nuơi cấy mơ thực vật Kỹ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật ngữ mơ tả các phương pháp nuơi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mơ, cơ quan) trong ống nghiệm cĩ chứa mơi trường dinh dưỡng thích hợp như muối khống, vitamin, đường và các chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong điều kiện vơ trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009) 1.2.2. Lịch sử và thành tựu trong nuơi cấy mơ 1.2.2.1. Lịch sử hình thành Vào năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đưa ra học thuyết tế bào và nêu rõ: “ Tế bào là đơn vị cơ bản của sự sống, mọi sinh vật dù phức tạp đến cũng đều được cấu tạo từ các đơn vị rất nhỏ, đĩ là các tế bào”. Bảng 1.1. Các mốc quan trọng trong lịch sử nuơi cấy mơ tế bào thực vật Năm Sự kiện 1902 Haberlandt lần đầu tiên thực hiện nuơi cấy mơ tế bào thực vật, ơng nhận thấy cĩ sự ảnh hưởng của muối khống tới sự chuyển hĩa tế bào. 1922 Kotte và Robins nuơi cấy đỉnh sinh trưởng của rễ một cây hịa thảo và nhận thấy sự ảnh hưởng của khống và glucose. Tuy nhiên, sự sinh trưởng ngừng lại sau đĩ dù đã được cấy chuyền. 1934 White nuơi cấy thành cơng đầu rễ cà chua trong thời gian vơ hạn trên mơi trường chứa khống, glucose và dịch chiết nấm men. Sau đĩ, phát hiện ra sự ảnh hưởng của các vitamin nhĩm B (B1, B6) và acid nicotinic và sử dụng để thay thế cho dịch chiết nấm men. 1938 Went và Thimann phát hiện ra chất điều hịa sinh trưởng thực vật đầu tiên là IAA. 1939 Nobécourt và Gautheret duy trì thành cơng mơ sẹo cà rốt trong mơi trường agar bằng cách cấy chuyền 6 tháng một lần. 1948 Sterward xác định tác dụng của nước dừa trong quá trình phân chia mơ sẹo cà rốt. Tổng hợp thành cơng các chất điều hịa sinh trưởng thực vật thuộc nhĩm auxin như NAA, 2,4-D. 1954 Skoog phát hiện ra kinetin (thuộc nhĩm cytokinin) và ảnh hưởng của nĩ trong việc phân chia tế bào mơ thân cây thuốc lá. 1957 Skoog và Miller nhận thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệ cytokinin/auxin lên sự biệt hĩa và tái sinh cơ quan của mơ sẹo thuốc lá. 1954 -1959 Bắt đầu nghiên cứu tách và nuơi cấy tế bào đơn của thực vật. 1956 Muir, Hildebrandt và Riker tách thành cơng tế bào đơn từ mơ sẹo bằng máy lắc. 1960 Bergman tiến hành thu tế bào đơn bằng lọc đơn giản và đưa ra kỹ thuật gieo tế bào đơn. Cooking tạo ra các tế bào trần bằng enzym cellulase. 1962 Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường nuơi cấy và mơi trường của họ được dùng làm cơ sở cho việc nuơi cấy nhiều loại cây khác nhau cây khác nhau. 1966 Guha và Maheswari cơng bố nuơi cấy thành cơng túi phấn của cà độc dược và tạo thành các cây đơn bội. 1970 Nagata và Takebe tái tạo thành cơng vách tế bào trần cây thuốc lá và mở rộng ra khả năng lai các giống khác nhau của cùng một lồi thực vật và tái sinh cây mới bằng các kỹ thuật dung hợp tế bào trần. 1980 – 1992 Sử dụng kỹ thuật gen vào việc nghiên cứu và lai tạo nhiều loại thực vật khác nhau. Nna Và kết quả cho đến nay, các kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào thực vật vẫn đang phát triển và được áp dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống cây trồng; sản xuất các sản phẩm thứ cấp cĩ hoạt tính sinh học nhằm đáp ứng một phần tương đối lớn cho nhu cầu nhiều mặt của con người. Sự phát triển của kỹ thuật nuơi cấy mơ tế bào thực vật vẫn đang tiếp tục hứa hẹn nhiều điều trong tương lai. 1.2.2.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật cĩ ý nghĩa quan trọng đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nĩ cĩ giá trị đĩng gĩp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: ü Lai tạo giữa những lồi xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp ( nuơi cấy tế bào trần ). ü Nuơi cấy tế bào thực vật trong mơi trường lỏng ( nuơi cấy huyền phù tế bào) trên quy mơ lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glucoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cơng nghệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nơng nghiệp. ü Chọn lọc tế bào cĩ những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (nuơi cấy tế bào đơn). üSản xuất dịng cây đồng hợp tử (nuơi cấy bao phấn và túi phấn). ü Vi nhân giống những giống cây cĩ giá trị khoa học và thương mại. ü Bảo quản phơi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. ü Nuơi cấy phơi sinh dưỡng, phơi hợp tử. ü Nuơi cấy quan tự dưỡng. 1.2.3. Các bước thực hiện trong vi nhân giống Quá trình vi nhân giống được chia thành các giai đoạn sau: 1.2.3.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phịng tăng trưởng Kết quả nhân giống tốt nhất cĩ thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm sinh trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vơ trùng và vẫn cĩ khả năng sinh trưởng. Khử trùng bề mặt bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. Mẫu thu được phải rửa dưới vịi nước từ 30 phút – 2 giờ, sau đĩ rửa mẫu bằng xà phịng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. Mẫu sau khi rửa sách sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường sử dụng để khử trùng mẫu là hupochloride sodium 0,5 – 5,25% , cồn, hupochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromie, clorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữ nước và mơ thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Sau khi khử trùng, mẫu cấy phải được rửa lại vài lần với nước cất vo trùng trong tủ cấy để sửa sạch các chất khử trùng cịn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thường phải cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và cĩ thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong mơi trường nuơi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. Mẫu cấy của vài lồi thực vật cĩ thể hĩa nấu haowjc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuơi cấy. Khi bị hĩa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hĩa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy cĩ chứa một lượng lớn tanin haowjc các hợp chất hydroxyphenol. Các mơ non thường ít bị hĩa nâu hơn mơ trưởng thành hay mơ già. Hiện tượng hoại tử hoặc hĩa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase cĩ nhân Cu( ví dụ như polyphenoloxidase và tryoxidase), nĩ được tổng hợp và phĩng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hĩa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thu bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5g/l. Ngồi ra cịn cĩ một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone(PVP),acid ascorbic, acid citric, L-cytein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercatoethanol. Từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để lam giảm hiện tượng hĩa nâu của mẫu cấy nên: ü Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mơ non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. ü Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào mơi trường. ü Nuơi cấy mẫu trong mơi trường lỏng cĩ lượng O2 thấp, khơng cĩ ánh sáng trong 1 – 2 tuần. ü Chuyển mẫu từ mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. ü Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần lể từ khi bắt đầu nuơi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ khơng tích tụ. ü Tạo thể nhân giống in vitro: - Mẫu nuơi cấy được cấy trên mơi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Cĩ hai thể nhân giống in vitro: thể chồi , thể cắt đốt. - Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, cĩ những lồi cây trồng khơng cĩ khă năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mơ sẹo. - Để nhân giống, trong mơi trường nuơi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. 1.2.3.2. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuơi cấy là những thể chồi, mơi trường nuơi cấy thơng thường giống với mơi trường tạo thể chồi, đơi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Cây nhân giống in vitro cĩ trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vơ hạn. 1.2.3.3. Tái sinh cây hồn chỉnh in vitro Ở giai đoạn này cây non được tạo ra hồn chỉnh cĩ đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra mơi trường bình thường. Các chất cĩ tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đĩ là các chất kích thích quá trình tạo rễ. điều kiện nuơi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngồi, một thước thuần hĩa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hĩa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. 1.2.3.4. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khĩ khăn nhất trong quá trình nhân giống vơ tính. Cây in vitro nuơi cấy trong điều kiện ơne định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm... Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng vcĩ cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệ độ khơng khí mát, ẩm độ cao... cây non thường được cấy trong luống ươm cây cĩ cơ chất dễ thốt nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thốt nước ở lá( thường 7 – 10 ngày kể từ ngày cấy). rễ được tạo ra trong quá trình cấy mơ sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ. 1.2.4. Vai trị các chất điều hịa sinh trưởng trong nuơi cấy mơ Chất điều hịa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ. Các chất điều hịa nội sinh cĩ thể được kiểm sốt do cơ chế chuyển hĩa của tế bào nên chúng được khảo sát hoặc đào thải khá nhanh. Ngược lại, các chất điều hịa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng thực tế. Cĩ 5 nhĩm chất điều hịa quan trọng trong nuối cấy mơ thực vật: auxin, cytokinin, gibberillin, abscisic acid và etylen. 1.2.4.1. Auxin Auxin là hợp chất cĩ nhân indole, gồm cĩ 2 loại là auxin cĩ nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra ( IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …) Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nĩ tùy thuộc vào nồng độ và tác động hỗ trợ của chúng với các chất điều hịa sinh trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bài kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phĩng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hĩa, đặc biệt nhất là sự tổng hơp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phơi sinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mơ sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả cịn non và lưu thơng từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật cịn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hĩa do các hoạt động của các enzyme auxin-oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luơn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. 1.2.4.2. Cytokinin Cytokinin (gồm Kinetin, IBA, Zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong mơi trường nuơi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, cĩ 2 nhĩm cytokinin nội sinh được biết đến là Zeatin và IBA, ngồi ra cịn cĩ 2 nhĩm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong mơi trường nuơi cấy mơ thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin cĩ vai trị trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, ngược lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hĩa, bảo vệ các chất chuyển hĩa chống lại tác dụng của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hĩa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ phát triển và cạnh tranh với các chồi ngọn. Tĩm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mơ, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong quá trình phân hĩa, tạo điều kiện nuơi cấy in vitro . 1.2.4.3. Gibberellin Gibberellin cũng như auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3. đây là các chất cĩ cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng cĩ sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt thân. Tác động này cũng cĩ thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép cĩ một sự chín tốt hơn hoặc những phát hoa phát triển hơn( trên các lồi nho cĩ chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thống hơn). Trong nuơi cấy in vitro, gibberellin cĩ tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng cĩ tác động trên sự đậu trái của các trái khơng hạt, chằng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống. Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt. 1.2.4.4. Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái được sử dụng cho phép thu hoạch cơ giới trái (ví dụ: trái olive, cerise,...) Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều cĩ khả năng tổng hợp etylen, nơi sản xuất quan trọng nhất là trái cây, kế đến ở mức độ kém hơn là hoa, cũng như chúng cĩ ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. 1.2.4.5. Abscisic acid Abscisic acid (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuơi cấy phơi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium ( K+), do tác động này nĩ đã ảnh hưởng trên sự đĩng các lỗ khí khổng của lá. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuơi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nĩ cĩ thể hồn tồn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nĩ cĩ thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây Equinard , Lolium tenmulentum). Trong nuơi cấy mơ, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuơi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khĩ khăn. Tĩm lại, trong nuơi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hịa với nhau và trong số đĩ cĩ hai chất chính mà vai trị tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: ü Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ. Nếu tỉ lệ auxin/cytokinin thấp, mơ sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. ü Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mơ sẹo. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình hình thành và phát triển của cây nuơi cấy in vitro Trong điều kiện nuơi cấy in vitro, các yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của cây bao gồm các yếu tố hĩa học lẫn vật lý. 1.2.5.1. Carbon Carbon là một nguồn dinh dưỡng quan trọng cĩ ảnh hưởng đến sự phát triển, phân chia và tăng sinh khối của mơ, tế bào thực vật. Trong tự nhiên, nguồn carbon này được cây lấy từ khơng khí (CO2) thơng qua quá trình quang tự dưỡng nhờ ánh sáng mặt trời và tổng hợp nên các thành phần của tế bào. Trong điều kiện in vitro, ban đầu các mơ, tế bào thực vật khơng cĩ khả năng tự tổng hợp hoặc khả năng tổng hợp tế bào kém nên ta phải bổ sung các loại đường để cung cấp carbon cho cây in vitro. Thơng thường, đường saccharose tạo nên nguồn carbon tốt nhất. Việc trải qua quá trình khử trùng trong nồi hấp autoclave gây ra việc phân hủy đường do sự thủy phân, nhưng điều này khơng thể hiện điều bất lợi nào đến sự phát triển của thực vật. 1.2.5.2. Vitamin Việc sử dụng các vitamin khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển của cây nuơi cấy in vitro. Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình nuơi cấy mơ tế bào thực vật thuộc nhĩm B như: ü B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong autoclave, nhưng các chất bị phân hủy này cũng cĩ tác động lên sinh trưởng của mơ như chưa phân hủy ü B6 hoặc Pyridoxine ü Biotin ü Pantotheate Canxi ü Myo – inositol 1.2.5.3. Ánh sáng Ánh sáng mang ý nghĩa là yếu tố năng lượng. Quá trình tổng hợp các hợp phần Carbon của một cơ thể tự dưỡng như thực vật thơng qua quá trình quang hợp, thế nhưng trong điều kiện nuơi cấy in vitro, mức độ quang hợp của cây tương đối thấp và các cấu phần của cây được tạo thành chủ yếu nhờ sự bổ sung dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy. Người ta cũng đã nghiên cứu và nhận thấy khả năng kéo dài thân cây thơng qua tác động của ánh sáng trong quá trình nuơi cấy nhờ hệ thống phytochrome của thực vật (Jabben, 1980). 1.2.5.4. Nhiệt độ Mỗi một lồi cây cĩ một khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển. Thậm chí, sự chênh lệch nhiệt độ giữa các chu kỳ sáng tối cũng cĩ những ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của cây. Những nghiên cứu về ảnh hưởng của sự chênh lệch này đã được Kozai và cộng sự tiến hành và đưa ra kết quả vào năm 1992 trên đối tượng là cây khoai tây in vitro. 1.2.5.5. Độ ẩm Trong mơi trường nuơi cấy in vitro, độ ẩm luơn duy trì ở mức cao, độ ẩm tương đối khoảng 90-95%. Áp suất hơi bên trong mặt lá gần cân bằng với mơi trường xung quanh dẫn đến tình trạng cây con in vitro bị thiểu năng khí khổng, nhiều khi bị tiêu biến lơng sừng và cây dễ bị mất nước khi đưa ra vườn ươm. Đây cũng là một hạn chế trong nuơi cấy mơ tế bào thực vật trong điều kiện in vitro. Hiện nay nhiều hệ thống thống khí đã được nghiên cứu, một phần cũng để giảm bớt hiện tượng bất lợi trên. 1.2.5.6. Khơng khí Thực vật cĩ khả năng quang hợp, thế nên trong bình nuơi cấy luơn cĩ sự thay đổi nồng độ CO2 và O2 theo chu kì sáng, tối là do hoạt động quang hợp và hơ hấp của mơ thực vật. Trong bình, cịn cĩ sự phĩng thích ethylene từ mẫu cấy. Chính sự hình thành ethylene cũng đã gây ra những ảnh hưởng xấu lên sự phát triển bình thường của cây như làm giảm sự mở lá, làm ngắn chồi, cây hướng ngang đất,… 1.3. Mơi trường khống đối với sự phát triển của thực vật 1.3.1. Các nguyên tố trong cơ thể thực vật Thưc vật là sinh vật tự dưỡng, chúng cĩ thể sống trong mơi trường vơ cơ hồn tồn, lấy CO2 từ khí quyển (qua lá), nước và các chất khống từ đất (qua rễ). C, O và H là thành phần của mọi chất hữu cơ, chiếm trên 90% trọng lượng khơ: ü C, 40 – 50% chất khơ; ü O, 42 – 45% chất khơ; ü H, 6 -7 % chất khơ. Các nguyên tố khác, gọi là nguyên tố khống (vì cĩ nguồn gốc từ đất), được sắp xếp thành hai nhĩm ( gồm 13 nguyên tố): ü Các nguyên tố đa lượng (S, P, Mg, Ca, K, N, O, C, H) cĩ tỉ lệ vài %o – vài %; ü Các nguyên tố vi lượng (Mo, Cu, Zn, Mn, Fe, B, Cl) cĩ tỉ lệ dưới 1 %o. Các nguyên tố được cho vào các mơi trường dinh dưỡng nhân tạo ở dạng ion và tỉ lệ thích hợp. 1.3.2. Vai trị của các nguyên tố thiết yếu Ø Các nguyên tố đa lượng Các chất dinh dưỡng đa lượng được dùng làm thành phần của các chất hữu cơ, tạo thể thẩm thấu cho tế bào. Các cation hĩa trị 2 như Ca²+ hay Mg²+ cĩ khả năng làm biến đổi tính thẩm thấu của màng. Vài chất dinh dưỡng đa lượng cũng hoạt hĩa enzyme. Ø Các nguyên tố vi lượng Các chất dinh dưỡng vi lượng là thành phần của coenzyme hay enzyme, hoạt hĩa enzyme. 1.3.3. Các hiện tượng của thực vật thiếu yếu tố thiết yếu Các chất dinh dưỡng đa lượng và vi lượng đều cĩ vai trị vi lượng (điều hịa hoạt động enzyme). Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khống, tuy nhiên việc thiếu một nguyên tố thiết yếu sẽ gây những rối loạn biến dưỡng, dẫn tới hiện tượng thiếu dinh dưỡng đặc trưng. Trong thiên nhiên thực vật cĩ thể thiếu đồng thời vài nguyên tố. Một số bệnh do virus hay vi sinh vật cũng gây những hiện tượng tương tự. Ø N (nitrogen) N là thành phần của acid amin, nucleotid, hormon, coenzyme,... Thiếu N, sườn carbon khơng được dùng cho sự tổng hợp các hợp chất nitrogen (tỉ lệ C/N cao), khiến lá bị hĩa vàng (đặc biệt là các lá già ở gốc cây) hay cĩ mày đỏ, cây chậm phát triển, thân mảnh và thường hĩa gỗ. Ø P (phosphor) P là thành phần của ATP, phospholipid, acid nucleic, coenzyme. Thiếu P, cây non giảm sinh trưởng (thân mảnh, nhưng khơng hĩa gỗ), chậm phát triển, lá hĩa vàng (thường ở ngọn, phần này trở nên vàng và khơ, trong khi ở gốc hầu như cịn màu xanh lục đậm). Ø K (potassium) K cĩ vai trị trong sự cân bằng ion (điều hịa thế thẩm thấu), cử động khí khổng, hoạt hĩa vài kinase (chuyển nhĩm phosphat từ chất này sang chất khác), tổng hợp polyholosid và protein. Thiếu K, cây thường tích tụ các acid amin, lá hĩa vàng (các đốm vàng xuất hiện ở ngọn và mép lá, giữa các gân, sau đĩ phát triển thành hoại mơ), lá cĩ thể xoắn và nhăn, thân mảnh và yếu ớt với những lĩng ngắn bất thường. Vì K rất linh động và được huy động mạnh bởi các lá non, nên triệu chứng xuất hiện trước ở các lá già ở gốc. Ø S (sulfur) S là thành phần của cystein, cystin, methionin, acid lipoic, coenzyme A, thiamin pyrophosphat, glutathion, biotin,... Thiếu S, cây cĩ nhiều hiện tượng giống sự thiếu nitrogen: lá hĩa vàng, chậm phát triển và tích tụ anthocyanin. Tuy nhiên, sự hĩa vàng của lá là do thiếu sulfur thường xảy ra trước ở các lá non, vì sulfur khĩ được huy động tới các lá non. Ø Ca (calcium) Ca cĩ trong vách tế bào, thoi phân chia, là yếu tố phụ của vài enzyme thủy giải ATP và phospholipid, cần cho hoạt động bình thường của màng và đặc biệt là thơng tin thứ cấp cho nhiều phản ứng đáp lại các dấu hiệu của mơi trường và hormon. Ngược với K, Ca ít linh động. Thiếu Ca, cây biểu hiện sự thiếu sắt (úa vàng), mơ bị mền nhũn, lá non hẹp và cong xuống. Ø Mg (magnesium) Mg là thành phần của porphyrin diệp lục tố, cĩ vai trị hoạt hĩa các enzyme trong sự hơ hấp, quang hợp và sinh tổng hợp acid nucleic. Thiếu Mg, hiện tượng vàng lá xảy ra trước ở các lá già (do tính di động cao của Mg), sự rụng lá non cĩ thể xảy ra. Ø Fe (sắt) Fe là thành phần của nhiều enzyme (trong porphyrin của cytochrome, catalaze, peroxidaze, leghemoglobin và trong ferrendoxin, nitrogenase), cĩ vai trị quan trọng trong sự tổng hợp diệp lục tố. Thiếu Fe, hiện tượng vàng lá bắt đầu ở các lá non. Sắt ít di động, do trầm hiện trong các lá già ở dạng oxide hay phosphat, hay do tạo phức với phytoferritin, một protein dính với sắt. Ø Cu (đồng) Giống với sắt, Cu liên kết với các enzyme liên quan trong sự chuyển điện tử (như plastocyanin). Thiếu Cu, lá cĩ màu lục sẫm và cĩ thể bị xoắn hay biến dạng . Lá non cĩ các vết hoại mơ (bắt đầu từ chĩt lá, sau đĩ kéo dài xuống, dọc theo mép lá), và cĩ thể rụng (nếu sự thiếu trở nên nghiêm trọng). Ø B (bor) B liên quan trong sự tổng hợp acid nucleic, các phản ứng hormon và các chức năng của màng, trong sự vận chuyển carbohydrat (borat thành lập các phức hợp với vài carbohydrat), và trong sự dùng calcium cho quá trình thành lập vách. Thiếu B, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mơ đen xảy ra ở lá non (chủ yếu ở gốc lá), nụ hay củ; trái và rễ phù to; cây cĩ thể mất ưu tính ngọn và phân nhánh nhiều (tuy nhiên ngọn nhánh bị hoại mơ ngay sau đĩ). Ø Mn (mangan) Mn cần cho sự quang hợp và hoạt động của nhiều enzyme, đặc biệt là các dehydrogenase và decarboxylase trong chu trình acid tricaboxylic. Thiếu Mn, cĩ hiện tượng vàng lá (trên lá già hay non, tùy lồi) và sự phát triển của các vết hoại mơ nhỏ. Ø Zn (kẽm) Zn cần cho hoạt động của nhiều enzyme (như alcol dehydrogenaze) tổng hợp auxin và diệp lục tố. Thiếu Zn, sự tăng trưởng lĩng giảm (cây cĩ dạng hoa hồng) vì sự tổng hợp auxin bị xáo trộn. Lá nhỏ và vặn vẹo, bìa lá nhăn; hiện tượng vàng lá xảy ra ở lá già (bắp , lúa miến, đậu) dẫn tới sự phát triển của các vết hoại mơ trắng. Ø Mo (molypden) Mo là thành phần của nitrat reductase. Thiếu Mo, cĩ hiện tượng vàng lá và hoại mơ ở các lá già; hoa rụng sớm hay khơng thành lập được. Ở vài lồi thực vật (bơng cải), lá khơng bị hoại mơ nhưng xoắn và chết sau đĩ. Hiện tượng thiếu nitrogen xảy ra nếu nguồn nitrogen là nitrat. Ø Cl (chlor) Cl cần cho sự quang hợp (như Mn) và sự phân chia tế bào của lá và rễ. Thiếu Cl, hiện tượng vàng lá và hoại mơ xảy ra, dẫn tới sự héo của ngọn lá, lá cĩ màu đồng và phát triển chậm, rễ dày lên ở vùng gần ngọn. Cl dễ hịa tan và thường sẵn sàng trong đất, nên sự thiếu Cl ít xảy ta trong tự nhiên. Tĩm lại, sự thiếu các chất khống làm thực vật giảm sinh trưởng. Các hiện tượng thiếu dinh dưỡng thấy được bằng mắt là những chỉ dẫn khác chính xác cho nơng nghiệp, giúp ta biết nhu cầu sinh dưỡng cần bổ sung cho cây trồng. Mặt khác, các hiện tượng thiếu cịn giúp ta biết tính linh động của nguyên tố. Khi nguyên tố di chuyển dễ dàng (N, P, K), các hiện tượng thiếu xảy ra ở các lá già trước ; ngược lại, khi nguyên tố bất động (B, Fe, Ca) các hiện tượng thiếu được thấy ở các lá non trước. Các hormon thực vật, đặc biệt là cytokinin liên quan tới tính linh động của các nguyên tố. Giới thiệu các bước trong nhân giống cây khoai lang in vitro từ đốt thân 2.1.1. Quy trình Mẫu cấy â Khử trùng mẫu â Tạo thể nhân giống â Nhân giống in vitro Tái sinh cây hồn chỉnh in vitro â Chuyển cây ra vườn ươm â 2.1.2. Thuyết minh quy trình 2.1.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu Ø Chọn lựa mẫu Đoạn thân cĩ mang chồi nách kích thước khoảng 2 cm được sử dụng làm mẫu cấy ban đầu. Vật liệu nuơi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro. Khi lựa chọn mẫu cần lưu ý đến tuổi sinh lý của đốt thân, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu. Ø Khử trùng mẫu - Bên ngồi tủ cấy: Các mẫu cấy đoạn thân khoai lang sau khi thu nhận được đặt dưới vịi nước chảy trong 30 phút để loại bớt bụi bẩn bám trên thân cây, dùng xà phịng lỗng rửa sơ bề mặt lá sau đĩ ngâm trong cồn 70o (30 giây) rồi rửa lại 3 – 4 lần bằng nước cất vơ trùng. - Bên trong tủ cấy: Mẫu sau khi khử trùng sơ bộ được chuyển vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung dịch Javel cĩ bổ sung 2 – 3 giọt Tween-20 trong 10 phút, sau đĩ được rửa lại bằng nước cất vơ trùng (4 – 5 lần). 2.1.2.2. Tạo thể nhân giống Trong giai đoạn này, mẫu được nuơi cấy trên mơi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân giống in vitro. Cĩ 2 thể nhân giống in vitro là thể chồi và thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro phụ thuộc vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng. Đối với những cây khoai lang, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi. Mẫu cấy đoạn thân sau khi khử trùng được chuyển vào mơi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) bổ sung 0.5 mg/l IAA, NAA hoặc GA3 trong 1 tuần để cảm ứng bật chồi. 2.1.2.3. Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu là thể chồi, mơi trường nuơi cấy giống với mơi trường tạo thể chồi. Điều kiện nuơi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh diễn ra nhanh. Trong giai đoạn này, nhiều yếu tố cĩ thể ảnh hưởng đến hệ số nhân in vitro như thành phần khống trong mơi trường, loại và nồng độ chất điều hịa sinh trưởng thực vật sử dụng,... Mẫu cấy ban đầu được cấy chuyển sang mơi trường MS bổ sung 20 hoặc 60 g/l đường sucrose cĩ hoặc khơng cĩ kết hợp với 0.1 mg/l BA để kéo dài chồi. Trong khuơn khổ khĩa luận tốt nghiệp này, bên cạnh việc tìm hiểu quy trình nhân giống in vitro cây Khoai lang từ đốt thân, em cịn trực tiếp tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số mơi trường khống lên sự phát triển của chồi Khoai lang Nhật in vitro (được trình bày cụ thể trong phần 2.2). 2.1.2.3. Tái sinh cây in vitro hồn chỉnh Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh cĩ đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm. Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra mơi trường bình thường. Các chất cĩ tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đĩ là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Trong quy trình này, chồi in vitro được cảm ứng ra rễ trên mơi trường MS chứa 20 g/l đường sucrose khơng bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật. 2.1.2.4. Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Cây con đã ra rễ được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt trong chậu nơi cĩ bĩng râm, độ ẩm cao, cường độ chiều sáng thấp,... Sau khoảng 2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngồi, lúc này cĩ thể tăng cường độ chiếu sáng và hạ độ ẩm. Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình nhân giống vơ tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống giữa in vitro và ex vitro. Để tránh tình trạng cây con bị stress, mất nước hay mau héo và chết, vườn ươm cần mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ ẩm cao. Cây con được chuyển ra vườn ươm đạt tỉ lệ sống sĩt 95%. Theo quy trình này, từ một mẫu cấy ban đầu, sau 9 lần cấy chuyền cĩ thể tạo ra được từ 2 – 8 triệu cây con sạch bệnh (Mervat, 2007). 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật 2.2.1. Vật liệu 2.2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Các cây khoai lang in vitro HL518 giống β sạch virus được lấy từ phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới . 2.2.1.2. Mẫu thí nghiệm Mẫu nuơi cấy là các đốt khoai lang in vitro cĩ kích thước 1 ± 0,3 cm. Các đốt này lấy từ đốt thứ 2 hoặc 3 tính từ ngọn xuống. Hình 2.1. Cây khoai lang in vitro Hình 2.2. Mẫu đốt thân dùng cho thí nghiệm 2.2.1.3. Mơi trường nuơi cấy Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật được thực hiện trên 6 mơi trường : MS1/2 ( là mơi trường MS cĩ thành phần đa lượng giảm đi một nửa) MS1/8 ( là mơi trường MS cĩ thành phần đa lượng giảm đi 8 lần) MS White B5 Vacin & Went Bổ sung đường 20g/l và agar 8g/l mơi trường, trước khi hấp khử trùng điều chỉnh pH = 5,7 – 5,8. Hấp khử trùng bằng Autoclave ở 121ºC, 1 atm trong 20 phút. 2.2.1.4. Điều kiện nuơi cấy Ø Địa điểm, thời gian thí nghiệm Thời gian thực hiện thí nghiệm: 4 tuần (3/5 - 3/6/2011) tại Phịng thí nghiệm trọng điểm phía Nam về Cơng nghệ tế bào Thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Ø Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ü Trang thiết bị - Tủ cấy SANYO (Sanyo Electric Co. Ltd., Nhật Bản) - Nồi hấp Hirayama, model HV-85 (Hirayama Manufacturing Co., Nhật Bản) - Máy đo pH Presia pH 900 - Cân phân tích model TE1502S (d = 10 mg) và TE214S (d = 0,1 mg) (cơng ty Satorius, AG Gưttingen, Đức).. - Bĩng đèn huỳnh quang (1,2 m) - Kệ đặt bình - Máy đo diện tích lá ü Dụng cụ Pince, kéo, dao cấy, ống đong (1000 ml, 100 ml, 25 ml, 10 ml), chai nước biển 500 ml, bình tam giác 370 ml. Hình 2.3. Máy đo diện tích lá Hình 2.4. Một số trang thiết bị sử dụng trong thí nghiệm a. Nồi hấp Hirayama, model HV-85 b. Tủ cấy Sanyo c. Cân phân tích d. Máy đo pH Thermo 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, một yếu tố với 6 nghiệm thức , mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình 4 mẫu. Hình 2.5. Mẫu bố trí thí nghiệm Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm khống Nghiệm thức Mơi trường 1 MS 20 2 MS ½ 3 MS 1/8 4 B5 5 White 6 Went 2.3. Chỉ tiêu theo dõi: Số rễ : tính số rễ cái hình thành trên 1 cây (chỉ tính các rễ cĩ chiều dài hơn 1cm vào ngày kết thúc thí nghiệm) Số lá : số lá hình thành sau thời gian nuơi cấy đếm được Chiều dài rễ: chiều dài rễ được tính từ gốc cây đến đầu rễ dài nhất trên cây. Đơn vị tính (cm) Chiều dài thân: chiều dài thân được tính từ gốc tới ngọn cây. Đơn vị tính (cm) Diện tích lá: diện tích lá ở 4 lá đầu tiên từ đỉnh xuống. Đơn vị (mm2) Gia tăng trọng lượng tươi thân Gia tăng trọng lượng tươi rễ Gia tăng trọng lượng khơ thân Gia tăng trọng lượng khơ rễ 2.4. Phương pháp phân tích thống kê Số liệu thí nghiệm đươc phân tích thơ bằng Microsoft Office Excel và phân tích thống kê ANOVA bằng phần mềm Statgraphics Plus 3.0. Thí nghiệm : Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống đối với sự phát triển của cây khoai lang Nhật HL518 giống β sạch virus. Hình 3.1. Cây khoai lang được nuơi cấy in vitro trong 4 tuần. Bảng 3.1. Thành phần ion trong các mơi trường sử dụng (theo George và Sherrington, 1984). Ion Nồng độ (mM) MS MS ½ MS ⅛ B5 White Went NO3- 39,4 19,7 4.9 24,7 3,3 24,7 H2PO4- 1,3 0,7 0.2 1,1 0,1 2,6 SO42- 1,5 0,8 0.2 2,0 4,4 1,6 Cl- 6,0 3,0 0.8 2,0 0,9 2,7 K+ 20,0 10,0 2.5 24,7 1,7 24,7 Ca2+ 3,0 1,5 0.4 1,0 1,2 1,4 Na+ - - - 1,1 2,9 - Mg2+ 1,5 0,8 0.2 1,0 2,9 1,6 NH4+ 20,6 10,3 2.6 2,0 - 2,6 N tổng 60,0 30,0 7.5 26,7 3,3 27,3 NH4+/NO3- 0,52 0,52 0.1 0,08 - 0,11 Nồng độ ion tổng 93,3 46,7 11.7 59,6 17,4 61,9 Trong thí nghiệm này, sử dụng thành phần khống đa lượng của 6 loại mơi trường thường được sử dụng trong lĩnh vực nuơi cấy mơ và tế bào thực vật: MS, MS½, MS⅛, B5, White, Went. Mỗi mơi trường đều được bổ sung thành phần vi lượng và vitamin của MS. Sau 4 tuần nuơi cấy, kết quả được ghi nhận và trình bày trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của khống đa lượng lên sự tạo chồi của cây khoai lang in vitro Thành phần khống đa lượng Chiều cao Số lá Diện tích lá Trọng lượng tươi thân Trọng lượng khơ thân MS 1.99 bc 5.62a 7.63 bc 0.437b 0.026b MS½ 5,53 a 6.00a 21.98 a 1.073a 0.059 a MS⅛ 2.26 b 4.50bc 11.47 ab 0.477a 0.036b B5 1.063c 4.63ab 5.69 c 0.109b 0.019c White 1.50 bc 3.38bc 5.34 c 0.133b 0.023b Went 1.40 bc 2.50c 15.66 ab 0.107c 0.020 c * Chú thích: những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử LSD. Kết quả được chỉ ra trong bảng 3.3 cho thấy hầu hết các mơi trường đều ảnh hưởng đến sự tạo chồi của cây khoai lang HL518 in vitro. Số lượng lá hình thành và phát triển mạnh ở mơi trường cĩ thành phần khống đa lượng của MS, MS½, B5. Khơng cĩ sự khác biệt đáng kể nào giữa các nghiệm thức khống đa lượng khác nhau được ghi nhận ngoại trừ trên mơi trường Went sự tạo chồi và phát triển của lá khơng nổi trội. Trên mơi trường Went, chồi của tất cả các mẫu cấy phát triển chậm, mặc dù diện tích lá tương đối lớn nhưng số lượng ít và lá hĩa vàng nhiều. Kết quả đạt được trong thí nghiệm này cho thấy rằng trong số những mơi trường nuơi cấy khác nhau, MS½ dường như thích hợp cho sự tạo chồi và phát triển của cây khoai lang in vitro nhất. Hình 3.2. Sự phát sinh chồi từ đốt thân cây khoai lang in vitro Bảng 3.3. Ảnh hưởng của khống đa lượng lên sự hình thành và phát triển rễ của cây khoai lang in vitro Thành phần khống đa lượng Số rễ Chiều dài rễ Trọng lượng tươi rễ TRọng lượng khơ rễ MS 2.25c 14.86a 0.185ab 0.005c MS½ 5.50a 15.09a 0.291a 0.014 a MS⅛ 5.75a 7.61c 0.173abc 0.008 ab B5 2.62ab 11.15bc 0.047c 0.005b White 2.50bc 11.26ab 0.067bc 0.009 ab Went 3.88a 9.58bc 0.070bc 0.009 ab * Chú thích: những chữ cái khác nhau (a,b,c,…) trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa ở mức α = 0,05 trong phép thử LSD. Kết quả từ bảng 3.3 cho thấy sự hình thành rễ khoai lang in vitro ở mơi trường MS½, MS⅛, Went là như nhau. Tuy nhiên, sự phát triển của rễ lại thể hiện tốt ở mơi trường MS, MS½, và White. Ở mơi trường MS⅛, sự kéo dài rễ diễn ra chậm so với các mơi trường khác. Kết quả về sự hình thành và phát triển rễ của cây khoai lang in vitro dựa vào các chỉ tiêu theo dõi ở bảng 3.3 cĩ thể nĩi rằng, thành phần khống đa lượng của MS½ là thành phần tối ưu cho qua trình hình thành và phát triển của rễ cây khoai lang in vitro. Hình 3.3. Hình thái khoai lang sau 4 tuần nuơi cấy ( MS½, MS⅛, MS). Hình 3.4. Hình thái cây khoai lang sau 4 tuần nuơi cấy (White, Went, B5) Nhân giống in vitro cĩ ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đĩng gĩp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Mục đích của việc nhân giống in vitro tạo ra các giống cây trồng sạch bênh, sạch virus với số lượng lớn, nhân nhanh và bảo quản các giống cây trồng quý, cĩ giá trị kinh tế cao. Khảo sát ảnh hưởng mơi trường khống đối với sự phát triển của thực là một trong những giai đoạn quan trọng trong nhân giống in vitro. Khống là thành phần khơng thể thiếu đối với các lồi thực vật nĩi chung và cây khoai lang nĩi riêng. Trong quy trình nhân giống để tạo ta cây khoai lang HL518 với năng suất cao và mang lại hiệu quả kinh tế, việc lựa chọn mơi trường khống thích hợp cho giống khoai lang này là một trong những nhiệm vụ quan trọng. Theo kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của mơi trường khống đối với sự phát triển của cây khoai lang HL518 như trên, cĩ thể thấy sự phát triển của cây khoai lang HL518 ở mơi trường MS, MS ½, B5 tốt hơn so với các mơi trường khống khác. Tuy nhiên, cần tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng cùa những mơi trường khống lên sự phát triển cây khoai lang HL518. Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt [1.] Dương Cơng Kiên. 2002. Nuơi cấy mơ thực vật. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh. [2.] Hồng Kim (2009), Bài giảng cây lương thực. Trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. [3. ] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, tập 1 và 2, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM. [4.] Bùi Văn Thế Vinh (2008), Bài giảng cơng nghệ sinh học thực vật, Trường đại học Kỹ thuật cơng nghệ Tp.Hồ Chí minh. [5.] Bùi Văn Thế Vinh (2008), Ứng dụng tin học trong cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Kỹ thuật cơng nghệ TP.HCM. Tài liệu tiếng Anh [6.] T. Kozai, C. Chun, A.F.M.S. Islam, C. Kubota and K. Ohyama. Efficient Production of Sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Propagules and Transplants Using Single Node Leafy Cuttings in Closed Systems with Artificial Lighting. Department of Bioproduction Science, Faculty of Horticulture, Chiba University, Matsudo, Chiba 271,Japan. [7.] Iftekhar Alam, Shamima Akhtar Sharmin, Mst Kamrun Naher, M. Jahangir Alam, M. Anisuzzaman, and Mohammad Firoz Alam. 2010. Effect of growth regulators on meristem culture and plantlet establishment in sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam). POJ 3(2):35-39 [8.]Pierik, R.L.M. 1987. In Vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers. [9.] Mervat M.M.El Far and A. Ashoub. 2009. Utility of Thermotherapy and meristem Tip for Freeing Sweetpotato from Viral Infection. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(1): 153-159 [10.] Mervat M.M. (2007). Optimization of growth conditions during sweetpotato micropropagation. African Potato Association Conference Proceedings. Vol. 7, pp. 204-211 Tài liệu từ internet [10.] [11.] [12.] Phụ Lục 1 Bảng 1. Thành phần mơi trường MS ( Murashige và Skoog, 1962) Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1lit Đa lượng NH4NO3 550 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Vi lượng MnSO4.H20 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3B03 6,2 KI 0,83 Na2Mo4.2H2O 0,25 CuSO4.5H20 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 139 Vitamin và amino acid Thiamine HCl 0,1 Acid nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 2 Bảng 2. Thành phần mơi trường White Thành phần Hàm lượng (mg/l) Đa lượng KNO3 80 Ca(NO3)2.4H2O 300 MgSO4.7H20 750 NaH2PO4 19 KCl 65 Vi lượng MnSO4.4H2O 5 ZnSO4.7H2O 3 H3BO3 1,5 KI 3,75 Na2MoO4.2H2O 0,005 CuSO4.5H2O 0,05 Na2EDTA 1000 NaFeEDTA 12,5 Vitamin và amino acid Thiamine HCl 2,5 Acid nicotinic 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glycine 15 Bảng 3. Thành phần mơi trường B5 Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1 lit Đa lượng (NH4)2SO4 134 KNO3 2500 CaCl2.2H20 150 MgSO4.7H2O 250 NaH2PO4 150 Vi lượng MnSO4.4H2O 10 ZnSO4.7H2O 2 H3BO3 3 KI 0,75 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Vitamin Thiamine HCl 10 Acid nicotinic 1 Pyridoxine HCl 1 Bảng 4. Thành phần mơi trường Vacin và Went Thành phần Hàm lượng (mg/l) trong 1 lit Đa lượng (NH402SO4 50 KNO3 53,1 MgSO4.7H20 25 KH2PO4 25 Ca3(PO4)2 20 Vi lượng MnSO4.4H2O 0,75 NaFe.EDTA 3,7 Phụ Lục 2 Số lá ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 70.1875 5 14.0375 5.69 0.0004 Within groups 103.625 42 2.46726 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 173.813 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 2.5 0.555345 1.70752 3.29248 Ms 8 5.625 0.555345 4.83252 6.41748 Ms0.125 8 4.5 0.555345 3.70752 5.29248 Ms0.5 8 6.0 0.555345 5.20752 6.79248 went 8 4.625 0.555345 3.83252 5.41748 white 8 3.375 0.555345 2.58252 4.16748 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 4.4375 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 2.5 X white 8 3.375 XX Ms0.125 8 4.5 XX went 8 4.625 XX Ms 8 5.625 X Ms0.5 8 6.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-3.125 1.58496 B5 - Ms0.125 *-2.0 1.58496 B5 - Ms0.5 *-3.5 1.58496 B5 - went *-2.125 1.58496 B5 - white -0.875 1.58496 Ms - Ms0.125 1.125 1.58496 Ms - Ms0.5 -0.375 1.58496 Ms - went 1.0 1.58496 Ms - white *2.25 1.58496 Ms0.125 - Ms0.5 -1.5 1.58496 Ms0.125 - went -0.125 1.58496 Ms0.125 - white 1.125 1.58496 Ms0.5 - went 1.375 1.58496 Ms0.5 - white *2.625 1.58496 went - white 1.25 1.58496 Diện tích lá ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 1709.42 5 341.885 5.27 0.0008 Within groups 2727.04 42 64.9294 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 4436.46 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 5.6925 2.84889 1.62713 9.75787 ms 8 7.62875 2.84889 3.56338 11.6941 ms 0.125 8 11.4663 2.84889 7.40088 15.5316 ms 0.5 8 21.9825 2.84889 17.9171 26.0479 went 8 15.6625 2.84889 11.5971 19.7279 white 8 5.335 2.84889 1.26963 9.40037 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 11.2946 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- white 8 5.335 X b5 8 5.6925 X ms 8 7.62875 XX ms 0.125 8 11.4663 XX went 8 15.6625 XX ms 0.5 8 21.9825 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -1.93625 8.13075 b5 - ms 0.125 -5.77375 8.13075 b5 - ms 0.5 *-16.29 8.13075 b5 - went *-9.97 8.13075 b5 - white 0.3575 8.13075 ms - ms 0.125 -3.8375 8.13075 ms - ms 0.5 *-14.3538 8.13075 ms - went -8.03375 8.13075 ms - white 2.29375 8.13075 ms 0.125 - ms 0.5 *-10.5162 8.13075 ms 0.125 - went -4.19625 8.13075 ms 0.125 - white 6.13125 8.13075 ms 0.5 - went 6.32 8.13075 ms 0.5 - white *16.6475 8.13075 went - white *10.3275 8.13075 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Chiều cao ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 107.844 5 21.5687 20.03 0.0000 Within groups 45.2213 42 1.0767 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 153.065 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 1.0625 0.366861 0.538988 1.58601 Ms 8 1.9875 0.366861 1.46399 2.51101 Ms0.125 8 2.2625 0.366861 1.73899 2.78601 Ms0.5 8 5.525 0.366861 5.00149 6.04851 went 8 1.4 0.366861 0.876488 1.92351 white 8 1.5 0.366861 0.976488 2.02351 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 2.28958 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 1.0625 X went 8 1.4 XX white 8 1.5 XX Ms 8 1.9875 XX Ms0.125 8 2.2625 X Ms0.5 8 5.525 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms -0.925 1.04702 B5 - Ms0.125 *-1.2 1.04702 B5 - Ms0.5 *-4.4625 1.04702 B5 - went -0.3375 1.04702 B5 - white -0.4375 1.04702 Ms - Ms0.125 -0.275 1.04702 Ms - Ms0.5 *-3.5375 1.04702 Ms - went 0.5875 1.04702 Ms - white 0.4875 1.04702 Ms0.125 - Ms0.5 *-3.2625 1.04702 Ms0.125 - went 0.8625 1.04702 Ms0.125 - white 0.7625 1.04702 Ms0.5 - went *4.125 1.04702 Ms0.5 - white *4.025 1.04702 went - white -0.1 1.04702 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Số rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 97.25 5 19.45 7.72 0.0000 Within groups 105.75 42 2.51786 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 203.0 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 2.625 0.56101 1.82444 3.42556 ms 8 2.25 0.56101 1.44944 3.05056 ms 0.125 8 5.75 0.56101 4.94944 6.55056 ms 0.5 8 5.5 0.56101 4.69944 6.30056 went 8 3.875 0.56101 3.07444 4.67556 white 8 2.5 0.56101 1.69944 3.30056 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 3.75 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 8 2.25 X white 8 2.5 XX b5 8 2.625 XX went 8 3.875 X ms 0.5 8 5.5 X ms 0.125 8 5.75 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms 0.375 1.60112 b5 - ms 0.125 *-3.125 1.60112 b5 - ms 0.5 *-2.875 1.60112 b5 - went -1.25 1.60112 b5 - white 0.125 1.60112 ms - ms 0.125 *-3.5 1.60112 ms - ms 0.5 *-3.25 1.60112 ms - went *-1.625 1.60112 ms - white -0.25 1.60112 ms 0.125 - ms 0.5 0.25 1.60112 ms 0.125 - went *1.875 1.60112 ms 0.125 - white *3.25 1.60112 ms 0.5 - went *1.625 1.60112 ms 0.5 - white *3.0 1.60112 went - white 1.375 1.60112 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Chiều dài rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 344.987 5 68.9973 1.45 0.2257 Within groups 1994.73 42 47.4936 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 2339.72 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 11.15 2.43653 7.67306 14.6269 ms 8 14.8625 2.43653 11.3856 18.3394 ms 0.125 8 7.6125 2.43653 4.13556 11.0894 ms 0.5 8 15.0875 2.43653 11.6106 18.5644 went 8 9.575 2.43653 6.09806 13.0519 white 8 11.2625 2.43653 7.78556 14.7394 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 11.5917 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 0.125 8 7.6125 X went 8 9.575 XX b5 8 11.15 XX white 8 11.2625 XX ms 8 14.8625 X ms 0.5 8 15.0875 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -3.7125 6.95388 b5 - ms 0.125 3.5375 6.95388 b5 - ms 0.5 -3.9375 6.95388 b5 - went 1.575 6.95388 b5 - white -0.1125 6.95388 ms - ms 0.125 *7.25 6.95388 ms - ms 0.5 -0.225 6.95388 ms - went 5.2875 6.95388 ms - white 3.6 6.95388 ms 0.125 - ms 0.5 *-7.475 6.95388 ms 0.125 - went -1.9625 6.95388 ms 0.125 - white -3.65 6.95388 ms 0.5 - went 5.5125 6.95388 ms 0.5 - white 3.825 6.95388 went - white -1.6875 6.95388 -------------------------------------------------------------------------------- Gia tăng trọng lượng tươi rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.358021 5 0.0716041 4.01 0.0046 Within groups 0.750244 42 0.017863 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 1.10826 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.046625 0.0472532 -0.0208055 0.114055 Ms 8 0.185125 0.0472532 0.117695 0.252555 Ms0.125 8 0.172625 0.0472532 0.105195 0.240055 Ms0.5 8 0.291 0.0472532 0.22357 0.35843 went 8 0.070375 0.0472532 0.00294452 0.137805 white 8 0.06725 0.0472532 -0.000180479 0.13468 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.138833 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.046625 X white 8 0.06725 XX went 8 0.070375 XX Ms0.125 8 0.172625 XXX Ms 8 0.185125 XX Ms0.5 8 0.291 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-0.1385 0.134861 B5 - Ms0.125 -0.126 0.134861 B5 - Ms0.5 *-0.244375 0.134861 B5 - went -0.02375 0.134861 B5 - white -0.020625 0.134861 Ms - Ms0.125 0.0125 0.134861 Ms - Ms0.5 -0.105875 0.134861 Ms - went 0.11475 0.134861 Ms - white 0.117875 0.134861 Ms0.125 - Ms0.5 -0.118375 0.134861 Ms0.125 - went 0.10225 0.134861 Ms0.125 - white 0.105375 0.134861 Ms0.5 - went *0.220625 0.134861 Ms0.5 - white *0.22375 0.134861 went - white 0.003125 0.134861 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Gia tăng trọng lượng tươi thân ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 5.61263 5 1.12253 19.90 0.0000 Within groups 2.36898 42 0.0564043 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 7.98161 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- B5 8 0.1085 0.0839675 -0.0113218 0.228322 Ms 8 0.436875 0.0839675 0.317053 0.556697 Ms0.125 8 0.4765 0.0839675 0.356678 0.596322 Ms0.5 8 1.07288 0.0839675 0.953053 1.1927 went 8 0.10675 0.0839675 -0.0130718 0.226572 white 8 0.132875 0.0839675 0.0130532 0.252697 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.389062 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- went 8 0.10675 X B5 8 0.1085 X white 8 0.132875 X Ms 8 0.436875 X Ms0.125 8 0.4765 X Ms0.5 8 1.07288 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- B5 - Ms *-0.328375 0.239644 B5 - Ms0.125 *-0.368 0.239644 B5 - Ms0.5 *-0.964375 0.239644 B5 - went 0.00175 0.239644 B5 - white -0.024375 0.239644 Ms - Ms0.125 -0.039625 0.239644 Ms - Ms0.5 *-0.636 0.239644 Ms - went *0.330125 0.239644 Ms - white *0.304 0.239644 Ms0.125 - Ms0.5 *-0.596375 0.239644 Ms0.125 - went *0.36975 0.239644 Ms0.125 - white *0.343625 0.239644 Ms0.5 - went *0.966125 0.239644 Ms0.5 - white *0.94 0.239644 went - white -0.026125 0.239644 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Gia tăng trọng lượng khơ rễ ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.000498021 5 0.0000996042 1.43 0.2318 Within groups 0.00291609 42 0.0000694307 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.00341411 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0051125 0.00294599 0.000908571 0.00931643 ms 8 0.005 0.00294599 0.000796071 0.00920393 ms 0.125 8 0.008025 0.00294599 0.00382107 0.0122289 ms 0.5 8 0.014625 0.00294599 0.0104211 0.0188289 went 8 0.009075 0.00294599 0.00487107 0.0132789 white 8 0.009175 0.00294599 0.00497107 0.0133789 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.00850208 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- ms 8 0.005 X b5 8 0.0051125 X ms 0.125 8 0.008025 XX went 8 0.009075 XX white 8 0.009175 XX ms 0.5 8 0.014625 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms 0.0001125 0.00840786 b5 - ms 0.125 -0.0029125 0.00840786 b5 - ms 0.5 *-0.0095125 0.00840786 b5 - went -0.0039625 0.00840786 b5 - white -0.0040625 0.00840786 ms - ms 0.125 -0.003025 0.00840786 ms - ms 0.5 *-0.009625 0.00840786 ms - went -0.004075 0.00840786 ms - white -0.004175 0.00840786 ms 0.125 - ms 0.5 -0.0066 0.00840786 ms 0.125 - went -0.00105 0.00840786 ms 0.125 - white -0.00115 0.00840786 ms 0.5 - went 0.00555 0.00840786 ms 0.5 - white 0.00545 0.00840786 went - white -0.0001 0.00840786 -------------------------------------------------------------------------------- Gia tăng trọng lượng khơ thân ANOVA Table Analysis of Variance ----------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value ----------------------------------------------------------------------------- Between groups 0.00873921 5 0.00174784 3.32 0.0129 Within groups 0.022108 42 0.00052638 ----------------------------------------------------------------------------- Total (Corr.) 0.0308472 47 Table of Means with 95.0 percent LSD intervals -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0189 0.00811157 0.00732477 0.0304752 ms 8 0.0265125 0.00811157 0.0149373 0.0380877 ms 0.125 8 0.035875 0.00811157 0.0242998 0.0474502 ms 0.5 8 0.0593625 0.00811157 0.0477873 0.0709377 went 8 0.0402375 0.00811157 0.0286623 0.0518127 white 8 0.022925 0.00811157 0.0113498 0.0345002 -------------------------------------------------------------------------------- Total 48 0.0339687 Multiple Range Tests -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- b5 8 0.0189 X white 8 0.022925 X ms 8 0.0265125 X ms 0.125 8 0.035875 X went 8 0.0402375 XX ms 0.5 8 0.0593625 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- b5 - ms -0.0076125 0.0231505 b5 - ms 0.125 -0.016975 0.0231505 b5 - ms 0.5 *-0.0404625 0.0231505 b5 - went -0.0213375 0.0231505 b5 - white -0.004025 0.0231505 ms - ms 0.125 -0.0093625 0.0231505 ms - ms 0.5 *-0.03285 0.0231505 ms - went -0.013725 0.0231505 ms - white 0.0035875 0.0231505 ms 0.125 - ms 0.5 *-0.0234875 0.0231505 ms 0.125 - went -0.0043625 0.0231505 ms 0.125 - white 0.01295 0.0231505 ms 0.5 - went 0.019125 0.0231505 ms 0.5 - white *0.0364375 0.0231505 went - white 0.0173125 0.0231505 --------------------------------------------------------------------------------