Khóa luận Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn

CHƯƠNG 1 : MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thời đại đất nước phát triển và hội nhập như ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao và nhu cầu về ăn uống càng phải được cải thiện. Tuy nhiên, cuộc sống của họ ngày càng bận rộn và hối hả, nên thời gian dành cho việc tự nấu nướng cho các bữa ăn trong gia đình ngày càng hạn chế, vì thế những suất ăn nhanh, cơm tiệm, các thức ăn chế biến sẵn là giải pháp mà rất nhiều người lựa chọn. Từ đó cho các thực phẩm được chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng trong xã hội, vừa đáp ứng nhu cầu nhanh gọn vừa tiết kiệm được thời gian. Tuy nhiên, về mặt vệ sinh thì không có gì đảm bảo được. Vì mọi người không thể kiểm soát quá trình chế biến và nếu sản phẩm chế biến có vấn đề thực sự thì cũng không có cách nào nhận biết. Từ đó dẫn đến một số vấn đề về sức khỏe ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình làm việc và thậm chí còn gây tử vong, đó là hậu quả của ngộ độc thực phẩm. Vấn đề kiểm soát mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng được quan tâm nhiều hơn. Đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm không phải là một việc dễ dàng mà cần phải có đủ khả năng chuyên môn về lý thuyết cũng như thực hành. Để góp phần đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm cũng như đưa ra những khuyến cáo cho mọi người, tôi tiến hành thực hiện khóa luận “Kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn”. Hy vọng sau đề tài tốt nghiệp này sẽ giúp tôi hiểu rõ hơn về ngộ độc thực phẩm và góp phần phản ánh hiện trạng vệ sinh an toàn thực phẩm của một số thực phẩm được chế biến sẵn. Mục tiêu của đề tài Đánh gía mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm của một số loại thực phẩm được chế biến sẵn Đưa ra một số đề nghị cho mọi người Nội dung Phân tích và đánh giá dựa trên một số chỉ tiêu vi sinh: Tổng vi sinh vật hiếu khí; Coliforms; Escherichia coli; Tổng nấm men,nấm mốc. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu quy trình phân tích bốn chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn Tổng số vi sinh vật hiếu khí Coliforms Escherichia coli Tổng nấm men, nấm mốc CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN 2.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm Hiện nay có rất nhiều vụ ngộ độc hay các bệnh gây ra do thực phẩm, mặc dù có các luật về an toàn vệ sinh thực phẩm đã được ban hành và ngày càng chặt chẻ và được sự quan tâm của công đồng. Cho đến nay vẫn còn có những cách hiểu và phân biệt không thống nhất về khái niệm các bệnh gây ra do thực phẩm hay ngộ độc thực phẩm. Song để phân biệt hai vấn đề này thông thường dựa vào các khái niệm như sau: Ngộ độc thực phẩm là các biểu hiện bệnh xuất hiện sau khi tiêu thụ thực phẩm có chứa số lượng lớn vi sinh vật, chúng nhân lên nhanh trong quá trình chế biến hay bảo quản. Các vi sinh vật có thể hiện diện một số lượng rất ít ban đầu trong thực phẩm hay nhiễm vào do sự tiếp xúc trong quá trình chế biến. Các bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm do tiêu thụ những thức ăn chứa các vi sinh vật hay sản phẩm của chúng, không phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít, do đó không phụ thuộc vào sự chế biến hay bảo quản. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm thường có các biểu hiện như tiêu chảy, chóng mặt, nôn mữa, đau nhức người, sốt, đau đầu. Các biểu hiện bệnh lý này phụ thuộc vào từng loài vi sinh vật gây nên. Mức độ nguy hiểm và triệu chứng của bệnh có thể gây nên do độc tố của chúng tiết vào thực phẩm hay do chính tế bào của chúng gây nên. Ngộ độc thực phẩm dùng để chỉ tất cả các bệnh gây ra bởi các mầm bệnh có trong thực phẩm. Bệnh do ngộ độc thực phẩm được chia làm hai nhóm: Bệnh gây ra do chất độc Bệnh gây ra do nhiễm trùng Bệnh gây ra do chất độc, có thể do vi sinh vật tạo ra hoặc do hóa chất trong quá trình sản xuất nguyên liệu thực phẩm tạo nên. Các chất độc này có trong thực phẩm trước khi người tiêu dùng ăn phải. Bệnh do nhiễm trùng là trong thực phẩm có vi khuẩn gây bệnh. Vi khuẩn này vào cơ thể người bằng con đường tiêu hóa và tác động đến cơ thể do sự hiện diện của nó hoặc do các chất độc của chúng tạo ra. 2.1.1 Các tác nhân gây ngộ độc Ngộ độc thực phẩm hay còn gọi là trúng độc thực phẩm là do ăn trúng thức ăn có chứa độc tố, thường xảy ra một cách đột ngột và hàng loạt. có những biểu hiện cấp tính như nôn mửa, tiêu chảy. Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, các chất độc hại hóa học, độc hại,vật lý. Chúng có thể gây ngộ độc và nguy hiểm tới sức khỏe người tiêu dùng. Có ba nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chất bảo quản thực phẩm (thuốc trừ sâu, hóa chất chống sâu mọt...), do hóa chất dùng trong trong chế biến thực phẩm (ví dụ phẩm màu trong các loại bánh, xôi, rượu...) và do các vi sinh vật và tác nhân vật lý. 2.1.1.1 Các tác nhân vật lý Mảnh kim loại, Xương, tóc … Vật lạ gỗ, kim loại, đá sạn… Chất phóng xạ Các mảnh thuỷ tinh Và các vật lạ khác lẫn vào thực phẩm cũng gây nguy hại đáng kể như gãy răng, hóc xương, tổn thương niêm mạc dạ dày, miệng… 2.1.1.2 Các tác nhân hoá học Các chất ô nhiễm trong công nghiệp và môi trường như: các dioxin, các chất phóng xạ, các kim loại nặng (chì, thuỷ ngân, asen, cadimi…) Các chất hoá học sử dụng trong nông nghiệp: thuốc bảo vệ thực vật, động vật, thuốc thú y, chất tăng trưởng, phân bón, thuốc trừ giun sán và chất hun khói. Các chất phụ gia sử dụng không đúng qui định: các chất tạo màu, tạo mùi, tạo ngọt, tăng độ kết dính, ổn định, chất bảo quản, chất chống ôxy hóa, chất tẩy rửa… và các hợp chất không mong muốn trong vật liệu bao gói, chứa đựng thực phẩm. Các chất độc hại tạo ra trong quá trình chế biến thịt hun khói, dầu mỡ bị cháy khét, các hợp chất tạo ra do phản ứng hóa học trong thực phẩm, sự sản sinh độc tố trong quá trình bảo quản, dự trữ bị nhiễm nấm mốc (độc tố vi nấm) hay biến chất ôi hỏng. Các độc tố tự nhiên có sẵn trong thực phẩm như mầm khoai tây, sắn, đậu mèo, măng, nấm độc, cá nóc, cá cóc… Các chất gây dị ứng trong một số hải sản, nhộng tôm… Các tác nhân sinh học Vi khuẩn có ở mọi nơi xung quanh chúng ta. Phân nước thải, rác bụi, thực phẩm tươi sống là ổ chứa của nhiều loại vi khuẩn gây bệnh. Mặt khác, trong không khí và ngay ở trên cơ thể người (đặc biệt là ở bàn tay), ở miệng, ở đường hô hấp, đường tiêu hóa, bộ phận sinh dục, tiết niệu cũng có rất nhiều loaị vi khuẩn. Thức ăn chín để ở nhiệt độ bình thường là môi trường tốt cho vi khuẩn trong không khí xâm nhập và phát triển rất nhanh, đặc biệt các thức ăn còn thừa sau các bữa ăn chỉ cần một vài giờ là số lượng vi khuẩn có thể sinh sản đạt đến mức gây ngộ độc thực phẩm. Nấm mốc thường gặp trong môi trường sống, nhất là ở trong các loại ngũ cốc, quả hạt có dầu dự trữ trong điều kiện khí hậu nóng ẩm như ở nước ta. Nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm, một số loại còn sản sinh ra các độc tố nguy hiểm như Aflatoxin. Aflatoxin là độc tố vi nấm do nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus sản sinh ra trong ngô, đậu và lạc, Aflatoxin là tác nhân có thể gây ung thư gan. Ký sinh trùng thường gặp trong thực phẩm là giun sán. Người ăn phải thịt có ấu trùng sán dây trong thịt bò (sán dây bò), trong thịt lợn (thịt lợn gạo) chưa nấu chín, khi vào cơ thể thì ấu trùng sẽ phát triển thành sán trưởng thành ký sinh ở đường tiêu hóa và gây rối loạn tiêu hóa. Khi ăn cá nước ngọt như cá diếc, cá rô, cá chép, cá trôi… có nang trùng sán lá gan nhỏ chưa nấu chín thì nang trùng chuyển tới ống mật, lên gan và phát triển ở gan thành sán trưởng thành gây tổn thương gan mật. Nếu ăn phải tôm, cua có nang trùng sán lá phổi chưa nấu chín hoặc uống nước có nang trùng thì chúng sẽ xuyên qua thành ruột và qua cơ hoành lên phổi, phát triển thành sán trưởng thành gây viêm phế quản, đau ngực, ho khạc ra máu nguy hiểm. Bệnh do giun sán cũng bởi tập quán ăn thịt tái, nem làm từ thịt sống, ăn tiết canh có ấu trùng gây nhiễm độc, dị ứng, sốt cao, liệt cơ hô hấp có thể dẫn đến tử vong. 2.1.2 Tác hại Sự có mặt của các tác nhân này trong thực phẩm cho thấy thực phẩm có thể không an toàn đối với người sử dụng. Thực phẩm rất dễ bị ô nhiễm bởi các tác nhân sinh học, tác nhân hóa học, tác nhân vật lý có thể gây ngộ độc nguy hiểm và ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng. Có 3 nguyên nhân chính gây ngộ độc hay gặp, đó là do hóa chất bảo quản thực phẩm ( chất chống mối, kiến, sâu bọ…), do hóa chất dùng trong trong chế biến thực phẩm ( phẩm màu trong thực phẩm) và do các vi sinh vật và tác nhân vật lý. Biểu hiện của tác hại do thực phẩm nhiễm bẩn: - Nhiễm độc tiềm ẩn: là sự nhiễm các chất độc hại dưới ngưỡng có thể gây ra các triệu chứng cấp tính, bán cấp tính; có thể bị nhiễm liên tục hoặc không liên tục; có thể sau một thời gian không biết trước sẽ có: ung thư, các rối loạn chức năng không rõ nguyên nhân, vô sinh... - Bệnh mạn tính: là bệnh mắc phải, có biểu hiện phát bệnh lặp lại thường xuyên hoặc theo chu kỳ; có thể do di chứng của ngộ độc cấp hoặc do hậu quả của nhiễm độc tiềm ẩn tới liều gây bệnh; có thể trở thành bệnh khó chữa hoặc không chữa khỏi. - Bệnh bán cấp tính (ngộ độc thức ăn): các rối loạn tiêu hóa hoặc thần kinh nhẹ, hoặc các triệu chứng cấp tính, có thể tự chữa khỏi hoặc tự khỏi. - Bệnh cấp tính (ngộ độc thức ăn): các triệu chứng trước đây tương đối điển hình và bệnh nhân cần đến  sự can thiệp của bác sĩ. + Biểu hiện rối loạn tiêu hóa: nôn, ỉa chảy (gồm cả ỉa ra máu), đau bụng. + Biểu hiện rối loạn thần kinh: rối loạn cảm giác, nhức đầu, mệt lả, hôn mê, liệt chi. + Các rối loạn chức năng khác: thay đổi huyết áp, bí tiểu... - Thời gian lành bệnh (đến khi hết triệu chứng nhưng bệnh nhân chưa thể sinh hoạt và làm việc một các bình thường). + Với người  mắc bệnh  bán cấp và cấp tính : 02 ngày – 01 tháng + Với người mắc bệnh mạn tính: không khỏi hẳn và thỉnh thoảng tái phát. -   Thời gian phục hồi sức khỏe (đã có thể sinh hoat và làm việc một cách bình thường): tuỳ theo nguyên nhân, tình trạng sức khỏe và độ tuổi, thường là:  + Với người bình thường bị mắc bệnh bán cấp và cấp tính: 01 – 04 tuần với người lớn và trẻ độ tuổi học đường: 01 tháng đến vài tháng với trẻ dưới 7 tuổi  và người già. + Với người mắc bệnh mạn tính bị tái phát: 01 – 02 tuần trong trường hợp bệnh tái phát có thể chữa được; không xác định được trong trừơng hợp đã thành bệnh nặng. -  Tử vong là hậu quả của ngộ độc cấp rất nặng, ngộ độc cấp không được cứ chữa kịp thời hoặc hậu quả của nhiễm độc tiềm ẩn kéo dài đã dẫn đến bệnh hiểm nghèo không cứu chữa được. 2.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên Thế Giới và Việt Nam Ở các nước phát triển có tới 10% dân số bị ngộ độc thực phẩm và mắc bệnh truyền qua thực phẩm mỗi năm; với các nước kém phát triển tỷ lệ này cao hơn nhiều. Nhiều nước có quy định báo cáo nhưng chỉ đạt 1% số ca bị ngộ độc thực phẩm. Ngộ độc thực phẩm ở Mỹ chiếm 5% dân số/năm (>10 triệu người/năm), trung bình 175ca/100.000 dân, mỗi năm chết 5.000 người; ở Anh : 190ca/100.000 dân; ở Nhật : 20-40 ca/100.000 dân, ở Úc là 4,2 triệu ca/năm Thực trạng vi phạm vệ sinh an toàn thực phẩm ở nước ta rất đáng báo động. Ngộ độc thực phẩm cấp tính trong những năm qua vẫn có chiều hướng gia tăng cả về số vụ và quy mô mắc. Tỷ lệ mắc/100.000 dân trung bình từ năm 2001 – 2005 là 5,48. Có nhiều nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm trong toàn quốc như thực phẩm ô nhiễm, môi trường ô nhiễm; thực phẩm có độc; điều kiện sản xuất, chế biến thực phẩm không bảo đảm an toàn, nhận thức – hành vi đúng về phòng chống ngộ độc thực phẩm của cộng đồng còn nhiều hạn chế… Ở Việt Nam, trung bình mỗi năm có 202,2 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với 5.525,1 người mắc và 55,2 người chết. Số vụ ngộ độc xảy ra nhiều nhất là từ tháng 4 – 7 và tháng 9 – 11. Tỷ lệ mắc ngộ độc trung bình là 7,14/100.000 dân, tỷ lệ chết là 0,06/100.000 dân/năm. Hàng năm có khoảng ba triệu trường hợp nhiễm độc, gây thiệt hại hơn 200 triệu USD. Nguyên nhân chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật 42,2%, do hoá chất 24,9%, do độc tố tự nhiên 25,2%. Trong những năm gần đây, khi nền kinh tế nước ta chuyển sang cơ chế thị trường, các loại thực phẩm chế biến sẵn ngày càng nhiều, đặc biệt là dịch vụ thức ăn nhanh và thức ăn đường phố ngày càng phát triển. Các dịch vụ này thuận tiện cho người tiêu dùng nhưng cũng tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây ngộ độc thực phẩm. Thống kê tình hình ngộ độc trong những năm gần đây cho thấy số vụ và mức độ ngày càng gia tăng. Cụ thể tình hình từ năm 2000-2008 trên địa bàn cả nước ( bảng 2.1) Bảng 2.1 Báo cáo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm từ năm 2000 – 2008 Năm Kết quả điều tra Vụ ngộ độc (vụ) Số mắc (người) Chết (người) 2000 213 4.233 59 2001 245 3.901 63 2002 218 4.9641 71 2003 238 6.428 37 2004 145 3.584 41 2005 144 4.304 53 2006 165 7.135 57 2007 247 7.329 55 2008 205 7.828 61 Trung bình/năm 202,2 ( 247-144) 5.525,1 (7.828 – 3.584) 55,2 (71 – 31) Tổng cộng 1.820 49.726 497 (Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, bộ Y tế) 2.3 Giới thiệu một số vi sinh vật hiện diện trong thực phẩm chế biến 2.3.1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí 2.3.1.1 Định nghĩa Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy (O2) phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm. Nguyên tắc Tổng số vi sinh vật hiếu khí được đếm bằng cách đổ đĩa và ủ trong điều kiện hiếu khí ở 300C/72 giờ ± 6 giờ hoặc 370C/48 giờ ± 6 giờ. Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu và được biểu diễn dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc (colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng thực phẩm 2.3.2 Coliforms 2.3.2.1 Giới thiệu Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm. Được xem là vi sinh vật chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống hay trong các loại mẫu môi trường dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. 2.3.2.2 Nguồn gốc Vào cuối những năm 1800 khi Von Fritsch được mô tả Klebsiella pneumoniae và Klebsiella rhinoscleromatis như là vi sinh vật đặc trưng được tìm thấy trong phân người. (Gedreich 978). Năm 1885 Percy và Grace Frankland đầu tiên thường xuyên xét nghiệm vi khuẩn trong nước ở London. Robert Koch sử dụng chất keo rắn nấu bằng phương tiện truyền thống để đếm vi khuẩn (Hutchison và Ridgway 1977). Đầu thập niên 1900 ( Cabelli, 1977), ông cho rằng sự vắng mặt của Coliforms như là dấu hiệu cho thấy không xuất hiện bệnh do vi khuẩn gây nên, và sau khi sản xuất khí đốt với việc giới thiệu ống Durham ( Durham năm 1983) thì khái niệm về vi khuẩn Coliforms và các vi khuẩn khác dạng coli được sử dụng ở nước Anh năm 1901. Năm 1908 Bergey và Deehan xác định có 256 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Năm 1909 Macconkey công nhận 128 loài khác nhau của vi khuẩn Coliforms. Đến đầu thập niên 1920, sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coli được đem ra sản xuất indole, hóa lỏng gelatin, lên men đường sucrose và Voges – Proskauer nhằm xác định sự ô nhiễm faecal (Hendricks 1978). Năm 1938 Parr có những phát minh lên đến đỉnh điểm trong thử nghiệm IMViC (Indole, Methyl đỏ, Voges-Proskauer và muối của acid Citric). Việc thử nghiệm cho thấy sự khác biệt của các dạng vi khuẩn Coliform phân, các dạng vi khuẩn trong đất và trung gian, và nó được sử dụng cho đến ngày hôm nay. Đặc điểm Coliforms là những trực khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có phản ứng oxidase âm tính và thể hiện hoạt tính của β – galactosidase. Vi khuẩn này có khả năng phát triển trên môi trường có muối mật, hoặc các chất hoạt tính bề mặt khác có tính ức chế tương tự, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24 – 48 giờ. Coliforms gồm bốn chi trong họ Enterrobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter (Metcalf và Eddy,1991). Chúng thường có mặt trong đường ruột động vật có vú. ( ví dụ: Escherichia coli phổ biến trong đất trên cơ thể người). Chúng bao gồm vi khuẩn lên men lactose như Escherichia cloacae, Citrobacter freundii ( hình 2.1) có thể tìm thấy trong phân và ngoài môi trường ( nước giàu chất dinh dưỡng, đất và động vật) cũng như trơn nước uống có nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối cao. Citrobacter freundii Escherichia cloacae Hình 2.1: Vi khuẩn lên men lactose [9] Coliforms chịu nhiệt có khả năng lên men đường lactose ở 44 – 45oC , nó bao gồm Escherichia và loài Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter ( hình 2.2). Enterobacter Citrobacter Klebsiella Hình 2.2 : Coliforms chịu nhiệt lên men đường lactose [9] Hiện diện Vi khuẩn Coliforms hiện diện khắp nơi, kể cả trong đất, da, thực phẩm, nước sông, ao hồ, rau cải... Sự có mặt của chúng trong nước và rau củ được xem là một chỉ số về sự tinh khiết của nước hay rau (bảng 2.2). Tuy nhiên chỉ số này cũng không đáng tin cậy. Vì vi khuẩn Coliforms vẫn có khả năng sống sót trong nước uống. Sự hiện diện của Coliforms trong nước không hẳn là nước bị nhiễm phân. Coliforms chịu nhiệt từ nơi có nguồn nước giàu chất hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất. Bảng 2.2: Tỷ lệ phần trăm vi khuẩn giảm trước và sau khi rửa của rau ngổ và lá mơ [10] Loại rau và vi khuẩn Trước khi rửa Sau khi rửa Giảm Rau ngổ Tổng số vi khuẩn Coliforms 3.300.000 89.000 37.000 2.300 99% 97% Lá mơ Tổng số vi khuẩn Coliforms 190.000 24.000 160.000 4.800 16% 80% Sự có mặt của Coliforms trong môi trường chứng tỏ môi trường đó nhiễm bẩn có nguồn gốc từ phân. Ở Việt Nam đã có một số chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm (bảng 2.3) và giới hạn của chúng có trong thực phẩm ( bảng 2.4) Bảng 2.3 : Chỉ tiêu Coliforms trong thực phẩm[10] Tiêu chuẩn Thực phẩm Coliforms TCVN5289/92 Cá fillet, tôm , mực 102 cfu/g TCVN4381/92 Tôm vỏ đông lạnh TCVN5835/94 Tôm thịt IQF TCVN2644/93 Mực đông lạnh TCVN5649/92 Hàng khô TCVN5526/91 Mực cá khô tẩm vị 10 cfu/g TCVN6175/9 Nước mắm 10 cfu/ml Bảng 2.4 : Giới hạn cho phép Coliforms trong thực phẩm[10] Thực phẩm Giới hạn cho phép CFU/g hay CFU/ml thực phẩm Sản phẩm từ thịt: pate, xúc xích… 50 Sản phẩm chế biến: tôm, cá, mực… 10 Thủy sản khô sơ chế: cá khô 102 Trứng 102 Sản phẩm từ trứng 10 Sữa 10 Sản phẩm từ ngũ cốc, xử lý nhiệt trước khi dùng ( bột, miếng, mì), dùng trực 103 Nước giải khát không cồn 10 Nước khoáng đóng chai 0 Hình 2.3 : Escherichia coli [8] Escherichia coli Định nghĩa Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli) là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của E.coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. E.coli thuộc họ vi khuẩn Enterrobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn( hình 2.3) Nguồn gốc Năm 1885 Escherichia coli được Bucher tìm ra và đến năm 1886 tại Munchen, một bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich nghiên cứu đầy đủ. E.coli thường sống trong ruột già, trong tiếng LaTinh ruột già là colum. Vì tôn trọng nhà khoa học nên người ta lấy tên ông ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu cách tiếng La Tinh nên vi khuẩn này có tên Escherichia coli. Vi khuẩn do Escherich phát hiện trong tả lót của trẻ em được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Bốn năm sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khai phá. Năm 1895 người ta gọi bằng tên Bacillus coli. Năm 1896 gọi thành Bacterium coli. Năm 1991 vi khuẩn được thống nhất toàn cầu là Escherichia coli. Hình thái, cấu trúc Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có capsul. Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili). Phân loại Hiện nay các nhà khoa học tìm ra được 5 nhóm E.coli khác nhau. Enteroaggregative (EAggE.C) Enterohemorrhagic (E HEC) Enteroinrasire (EIEC) Enteropathogenic (EPEC) Enterotoxigenic (ETEC) Đặc điểm nuôi cấy E.coli là trực khuẩn hiếu khí tùy nghi, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5-400C, nhiệt độ thích hợp là 370C trong 24 giờ, pH thích hợp là 7,3 - 7,4 nhưng có thể phát triển ở pH từ 5,5 – 8. Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. - Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi hôi - Trên môi trường thạch thường: ủ ở 370C trong 24 giờ vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi đường khính 2-3mm. nếu nuối lâu hơn, khuẩn lạc chuyển màu gần như màu nâu nhạt và mọc mộng ra. Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng M (Mucoid) và dạng R (Rough). - Trên môi trường thạch máu : sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn E.coli hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sang, kích thước từ 1-2 mm, có thể có hoặc không có dung huyết tùy thuộc vào chủng. - Trên môi trường thạch peptone: sau 18 – 24 giờ ủ trong tủ ấm 370C, vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng. - Trên môi trường thạch MacConkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ ở tủ ấm 370C, hình thành khuẩn lạc màu hồng, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. - Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chính, có hoặc không có màu ánh kim. - Trên môi trường EMB: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim. - Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S ( Smooth), màu vàng chanh. Đặc tính sinh hóa Nhiệt độ thích hợp là 37 - 380C, pH: 7,2 – 7,4. Khuẩn lạc thay đổi theo môi trường nuôi cấy: trong môi trường NA: khuẩn lạc tròn, ẩm ướt, mặt láng, có nếp nhăn. Trong môi trường EMB: khuẩn lạc có màu thâm tím hoặc đen. Môi trường MacConkey: khuẩn lạc màu đỏ mận chín. Đặc tính lên men các loại đường. E.coli gồm những trực khuẩn di động hoặc không di động, có khả năng lên men sinh hơi các loại đường Glucoza, Fructoza, Galactoza, Lactoza, Maniton, Mannit, Levuloza, Xyloza. Lên men không chắc chắn với các loại đường Dulciton, Sacaroza, Lactose trong khi đó vi khuẩn Salmonella thì không có đặc tính này, đây là đặc tính quan trọng để phân biệt vi khuẩn E.coli và Salmonella. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố E.coli gồm 4 loại kháng nguyên : O (kháng nguyên thân), H (kháng nguyên tiêu mao),K ( kháng nguyên màng tế bào), F . - Kháng nguyên O ( kháng nguyên thân) là kháng nguyên của thành tế bào. Cấu tạo bởi lipopoly saccharit. Đặt tính kháng nguyên O như sau: Chịu được nhiệt không bị hủy khi đun nóng 1000C trong 2 giờ. Kháng cồn không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. Bị hủy bởi focmol 5%. Có tính độc, chỉ cần 1/20mg đủ giết chết chuột trong 24 giờ. Kháng nguyên H (kháng nguyên tiên mao). Được cấu tạo bởi protein và có các tính chất sau: Không chịu nhiệt. Bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50%. Bị hủy bởi các protease. Không bị hủy bởi focmol 5%. Kháng nguyên K( kháng nguyên màng tế bào). Loại này chỉ có ở một số loại vi khuẩn đường ruột. được cấu tạo bởi Polysaccharit và Protein. Kháng nguyên F ( kháng nguyên ) chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể ( màng nhày của đường tiêu hóa) hay còn gọi là bám dính. Đây là khả năng đặc biệt quan trọng, giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh. Độc tố của E.coli gồm: nội độc tố gây tiêu chảy và ngoại độc tố gây tan huyết và phù thủng. Độc tố của E.coli: loại E.coli có giáp mô gây ngộ độ mạnh hơn loại không có giáp mô. Nội độc tố đường ruột gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt. cả hai loại này đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST ( Thermostable): gồm các lại STa, STa. Loại không chịu nhiệt LT (Thermolabiles): gồm các loại LT1,LT2. Những dòng E.coli sản sinh độc tố (ETEC) gồm nhiều type huyết thanh khác nhau thường gặp nhất là các type O6H16, O8H9, O78H2, O157. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm vi khuẩn với số lượng nhiều kèm theo độc tố của chúng. Ngoại độc tố: phá huỷ thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh. Nội độc tố: phá huỷ thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác. E.coli bám dính nhờ các yếu tố bám dính được ký hiệu là F4, F5, F6 và F41.Yếu tố bám dính thay đổi theo điều kiện môi trường và khả năng biến dị của từng serotyp. Chính yếu tố bám dính và độc tố tạo nên quá trình sinh bệnh của E.coli.   E.coli là vi khuẩn môi trường, nơi nào cũng có. Bình thường, vi khuẩn không gây tác hại trên ký chủ (103 CFU/g phân). Khi mật số tăng lên cao (106- 109CFU/g phân) thì nó sẽ trở nên gây bệnh. Tính bám dính: Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể heo chủ yếu qua đường miệng. Ở dạ dày, nếu pH không quá acid, E.coli sẽ sinh sôi phát triển thuận lợi hơn. Khi đến ruột, E.coli sẽ chống lại cơ chế rửa trôi bằng tính bám dính vào niêm mạc ruột và tác động lên nhung mao ruột. Nhiễm trùng huyết: bằng tính xuyên mạch, E.coli xâm nhập vào máu, đi đến các cơ quan nội tạng khác, tiết độc tố gây độc cho cơ thể, quan trọng nhất là làm viêm não, bại não. Triệu chứng Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại. Tuy nhiên, một số E.coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E.coli có hại này là E.coli O157:H7.  Ở vài bệnh nhân, vi khuẩn này có thể gây rối loạn máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli. Người bị nhiễm cũng có thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói. Triệu chứng thường bắt đầu 3 hay 4 ngày sau khi bị phơi nhiễm vi khuẩn E.coli.  Phần lớn bệnh nhân hồi phục sau vài ngày hay một tuần sau khi mắc bệnh.  Phần lớn bệnh nhân cũng chẳng cần đến bác sĩ vì họ không biết mình bị nhiễm E.coli. Ngoài ra, nhiều người bị nhiễm mà không có triệu chứng và cũng không mắc bệnh. Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu và suy thận), một số triệu chứng sau đây thường được ghi nhận: Da trở nên xanh xao Cảm lạnh Có những vết thâm tím trên người Đi tiểu rất ít nước tiểu. Biện pháp phòng ngừa ngộ độc E.coli E.coli gây tiêu chảy thường theo phân ra ngoài do đó dễ gây thành dịch. Do đó cần phải nấu chín kỹ thức ăn và kiểm tra nghiêm ngặt quy trình chế biến thực phẩm. Tổng nấm men, nấm mốc Nấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400.000 loài nấm men và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vở chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. Vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Có thể phân biệt được nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau: nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty; nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuổi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty. Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20 – 280C, một ít trong số này ưa lạnh hay ưa nóng. Nước hoạt tính cũng là nhân tố ảnh hưởng tất quan trọng đến tăng trưởng. Hầu hết các loại nấm men và nấm mốc phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85% hay lơn hơn, một số ít loài có thể tăng trưởng trong cơ chất có nước hoạt tính thấp hơn khoảng 60 – 70%. Nấm mốc và nấm men tăng trưởng ở vùng pH từ 2-9, trong pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 -6,5. Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Một số có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng nhưng dù ở dạng nào oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của nấm men và nấm mốc. Tất cả các loài nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng chỉ có khả năng nhận các chất dinh dưỡng ở dạng hòa tan. Trong quá trình trao đổi chất xảy ra ở tế bào chúng lại có khả năng chuyển hóa các chất hào tan thành các chất không hòa tan thành lignocellulose... Ngoài ra, chúng còn có thể tạo ra các chất độc, các chất độc của chúng được gọi chung là độc tố vi nấm ( mycotoxins). Tiêu biểu có Aspegillus flavus, Aspegillus parasiticus, Aspegillus moninus, Penicillium italicum, Penicillium roquefortii, Penicillium cammenbertii, Penicillium digitatum. Trong thực phẩm nấm men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Một số loại nấm men như: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces liquefacien. Nấm men sinh sản bằng cách nẩy chồi, nguồn chất có đường. Hình dạng của chúng rất đa dạng như hình cầu, hình trứng, hình oval. (hình 2.4) Hình 2.4: Khuẩn lạc và tế bào nấm men [11] Nấm mốc sinh sản bằng bào tử hay đoạn sợi, có hệ sợi là sợi khí sinh ( sợi sinh sản), nhiệt độ thích hợp từ 28-320C, ẩm độ cơ chất là 60%, có nguồn chất là bội đường ( hình 2.5) Hình 2.5: Khuẩn lạc và hệ sợi nấm mốc [11] Cách phân biệt nấm men, nấm mốc Nấm men là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty Nấm mốc là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nẩy chồi. Thỉnh thoảng có thể nhìn thấy các tế bào kết nối thành chuỗi. Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn khuẩn ty. Trong thực phẩm, nấm mốc và nấm men hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, làm phát sinh mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. CHƯƠNG 3 : PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN SẴN. Thời gian thực hiện khóa luận Ngày 09 tháng 05 năm 2011 đến ngày 26 tháng 06 năm 2011 Vật liệu Mẫu thực phẩm chế biến sẵn. Hóa chất – môi trường Buffer Pepton Water (BPW) Plate Count Agar (PCA) Tryptone Soya Agar (TSA) Violet Red Bile Agar ( VRB) Brilliant Green Bile Lactose broth (BGBL) Eosine Methylene Blue Agar(EMB) Canh trypton Canh MR-VP Thạch Simmon citrate Agar Thuốc khử Kovac’s Thuốc khử Methyl Red Thuốc khử α- naphtol 5% KOH 40% Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC) Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar ( DRBC) Môi trường canh LSB Dụng cụ Ống nghiệm không nắp Ống nghiệm có nắp Đĩa Petri vô trùng Cân điện tử Bình tam giác Bình định mức Cốc thủy tinh Kéo Đũa thủy tinh Túi nilon vô khuẩn Đèn cồn Que cấy thẳng Que cấy vòng Bình chứa môi trường Khăn giấy Bông y tế Bông không thấm nước Pipetman Thiết bị Autoclave Tủ lạnh Bếp từ Tủ ấm 44oC Tủ ấm 30oC Tủ ấm 37oC Tủ sấy 180oC Tủ cấy Bếp đun Bể ổn nhiệt Phương pháp thu, bảo quản và chuẩn bị mẫu thực phẩm Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu thực phẩm Thu và chứa mẫu Kết quả thí nghiệm phụ thuộc rất nhiều vào phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp dụng cho từng trường hợp cụ thể và được mang về phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng mẫu cần phân tích Dụng cụ thu mẫu thay đổi tùy loại sản phẩm. Trường hợp thực phẩm đông lạnh, có thể sử dụng các ống khoan tay vô trùng, dao đã được sát trùng để tách thành lượng mẫu cần thiết, sau đó dùng thìa, kéo… để cho mẫu vào trong dụng cụ chứa. Lưu ý tránh thu các mảng băng. Trường hợp thực phẩm đã đóng gói thành nhiều mức, thực hiện thu mẫu bằng cách chọn lấy các gói lớn từ đó lấy ra các bao nhỏ hơn. Khối lượng tổng cần thu của mỗi mẫu thay đổi tùy thuộc số lượng các chỉ tiêu cần phân tích nhưng ít nhất là khoảng 100 – 250g. Mẫu cần đảm bảo tính đại diện để có được khối lượng mẫu cần thiết, cần thu gộp mẫu tại nhiều vị trí trên nguyên liệu hay thành phẩm. Trường hợp mẫu phân tích là bán thành phẩm đang được chế biến, cần thực hiện thu mẫu tại nhiều vị trí trong cùng một công đoạn. Đối với các loại mẫu như thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh vật chủ yếu là bề mặt. Do vậy, có thể sử dụng que bông vô trùng quét một diện tích bề mặt nhất định hay cắt lát với bề dày 2 - 3mm để thu mẫu. Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. Tránh sử dụng các bình bằng thủy tinh để chứa mẫu vì dễ vỡ. Vận chuyển và bảo quản mẫu Mẫu sau khi thu được bảo quản một cách độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu được làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông và được phân tích ngay khi có thể. Nếu không phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở -20oC cho đến khi phân tích. Trường hợp mẫu không thể bảo quản đông thì có thể được bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 4oC nhưng không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể được bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích. Chuẩn bị mẫu Rã đông mẫu trước khi phân tích Mẫu đông lạnh phải được giải đông trong điều kiện vô trùng trước khi được phân tích. Trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được giải đông bên trong các dụng chứa đã được sử dụng để thu mẫu và chuyển mẫu về phòng thí nghiệm, không chuyển mẫu sang dụng cụ chứa khác. Việc giải đông được thực hiện ở nhiệt độ 2 – 5oC trong khoảng 18 giờ. Khi cần thiết, có thể giải đông nhanh ở 45oC trong 15 phút. Trường hợp này, cần liên tục lắc bình chứa mẫu để làm tăng tốc độ giải đông và làm đồng nhất nhiệt độ bên trong mẫu. Cân mẫu Cân chính xác một lượng mẫu xác định để tiến hành phân tích tùy theo yêu cầu của chỉ tiêu phân tích với sai số cho phép là ±0,1g. Lượng mẫu này được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng. Với kỹ thuật đếm khuẩn lạc các mẫu cần phân tích được pha loãng liên tiếp và được xác định một vài nồng độ pha loãng nhất định để cấy vào các môi trường thích hợp. kỹ thuật pha loãng thường qua các bước như sau: Dung dịch pha loãng mẫu: một số dung dịch dùng pha loãng có thể làm chết tế bào như nước muối nước cất.các dung dịch pha loãng sau khi lấy ra từ tủ lạnh không được dùng ngay vì có thể gây sóc cho vi sinh vật làm cho vi sinh vật không thể phát triển được Chuẩn bị các chuỗi pha loãng: bơm chính xác 9ml dung dịch pha loãng vào ống nghiệm có nắp. Mẫu cần phân tích là mẫu thực phẩm thao tác tiến hành pha loãng như sau: cân 25g mẫu thực phẩm cần phân tích cho vào túi dựng thêm vào túi 225ml dung dịch pha loãng ta được độ pha loãng 10 -1, hút 1ml mẫu 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng lắc đều ta có 10-2 tương tự ta lấy 1ml 10-2 cho vào 9ml dung dịch pha loãng đã chuẩn bị sẵn ta có mẫu 10-3. Theo cách này ta làm cho đến khi có nồng độ pha loãng như mong muốn ( hình 3.1). Hình 3.1 : Pha loãng mẫu [8] Đồng nhất mẫu Do sự phân bố không đều của vi sinh vật bên trong mẫu nên mẫu cần được làm đồng nhất trước khi phân tích. Việc đồng nhất các mẫu lỏng được thực hiện bằng cách lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đảo trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng, ví dụ như: thiết bị dập mẫu (Stomacher), trong điều kiện vô trùng. Sau khi mẫu được đồng nhất, tùy yêu cầu của chi tiêu phân tích, thực hiện thu một lượng xác định của mẫu để tiến hành phân tích. Ví dụ, đối với các chỉ tiêu định lượng, lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính, lượng mẫu trích ra để phân tích là 25g. Định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí 3.4.1 Phương pháp đổ đĩa 3.4.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như chúng hình thành từ một tế bào riêng lẻ. Theo yêu cầu của tiêu chuẩn Việt Nam chỉ tiêu này được ủ 30oC trong 72 giờ ± 6 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ ± 6 giờ. 3.4.1.3 Môi trường sử dụng - Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water ( SPW) hoặc Buffer Pepton Water (BPW). - Môi trường nuôi cấy : Plate Count Agar (PCA) 3.4.1.4 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất được độ pha loãng 10-1 Pha loãng mẫu trong nước muối sinh lý để được các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4. Lật ngược đĩa ủ ở 30oC trong 72 giờ hoặc 37oC trong 48 giờ Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri đã vô trùng, đổ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng và làm nguội đến 45oC. Mỗi độ pha loãng làm 2 đĩa. Chọn các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 25-250 để đếm Tính toán kết quả tổng vi sinh vật hiếu khí trong mẫu 3.4.1.5 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu (stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Cấy mẫu Chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-4, dùng pipetman hút 1ml mỗi độ pha loãng cho vào 2 đĩa petri đã khử trùng. Tiếp tục đỗ khoảng 15ml môi trường PCA đã hấp khử trùng để nguội khoảng 45oC, lắc đều bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần. Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang và chờ môi trường đặc lại, lật ngược đĩa ủ 30oC sau 72 giờ hoặc37oC trong 48 giờ (hình 3.2). Chọn tất cả đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 khuẩn lạc để đếm Hình 3.2 Phương pháp thực hiện đổ đĩa phân tích tổng vi sinh hiếu khí [10] Hình 3.3 : Tổng số vi sinh vật hiếu khí [10] - Nếu ở nồng độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa lớn hơn 250. Ví dụ: ở nồng độ 10-5 số đếm được lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2,5x107 CFU/ml - Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa nhỏ hơn 25. Ví dụ: ở nồng độ 10-1 số đếm được nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2,5x102 CFU/ml - Khuẩn lạc mọc loang tính là 1 khuẩn lạc Công thức tính kết quả Đếm tất cả các số khuẩn lạc xuất hiện trên các khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25- 250 để tính kết quả. Mật độ tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1g hay 1ml mẫu được tính theo cong thức sau Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn (khuẩn lạc ) trong 1g mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường fi: Độ pha loãng tương ứng Ví dụ: Trong 1 trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau: Kết quả: Nồng độ pha loãng 10-3 10-4 10-5 Đĩa 1 235 26 16 Đĩa 2 246 21 10 Định lượng tổng số Coliforms 3.5.1 Phương pháp đổ đĩa 3.5.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá chất lượng thực phẩm (khả năng hư hỏng, thời gian bảo quản), đánh giá mức độ vệ sinh trong chế biến, bảo quản. Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất hoá được cấy 1 lượng nhất định trên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose. Đếm số khuẩn lạc lên men lactose và sinh acid sau khi ủ ở 37 10C trong 24 – 48 giờ. Ngoài lactose, môi trường chọn lọc cho Coliforms còn chứa muối mật ức chế vi khuẩn gram dương và chất chỉ thị pH như Neutral red, crystal. Trên môi trường này khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm, đường kính > 0,5mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật. Việc khẳng định được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường canh chọn lọc như BGBL. Mật độ Coliforms được tính dựa trên số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, tỷ lệ khẳng định và độ pha loãng trước khi cấy vào đĩa. Để phát hiện được bộ phận tế bào Coliforms bị tổn thương hay bị giảm sức sống do quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, bộ phận này có thể không tăng trưởng được trong môi trường chọn lọc, trước khi mẫu được cấy vào một môi trường không chọn lọc như TSA, trước khi bổ sung môi trường chọn lọc. Quy trình phân tích Đếm các khuẩn lạc có màu đỏ đếm đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, có đường kính > 5mm Xác định tỷ lệ R. Tính kết quả. ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc của 2 đĩa cấy vào 5 ống BGBL Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 2 đĩa Petri trống đã vô trùng Lật ngược đĩa và ủ ở nhiệt độ 37oC, trong 24 giờ Đỗ khoảng 15ml môi trường VRB đã đun tan và làm nguội 45oC Đỗ khoảng 5ml TSA tan chảy và làm nguội đến 45oC, lắc đều Ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ Thuyết minh quy trình Chuẩn bị mẫu. Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu. Hình 3.4: Khuẩn lạc Coliforms [8] Dùng pipetman hút 1ml mẫu cho vào đĩa petri trống. Đỗ khoảng 5ml môi trường TSA đã hấp khử trùng để nguôị 45oC, lắc đều để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ. Gai đoạn này nhầm khôi phục các tế bào bị tổn thương hay bị suy yếu. Làm trên 2 đĩa. Đỗ thêm 15ml môi trường VRB (môi trường VRB dùng nước cất đã hấp khử trùng, đun sôi sau đó cho môi trường vào, không hấp khử trùng môi trường này) để nguôị 45oC, lắc đều để đặc môi trường. Giai đoạn này nhằm chọn lọc vi khuẩn Coliforms. Lật ngược đĩa ủ ở 37oC trong 24 giờ ( hình 3.5) Đếm tất cả các khuẩn lạc trên cả hai đĩa. Khuẩn lạc đặc trưng của Coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm ( hình 3.4) Hình 3.5 Phương pháp đổ đĩa phân tích tổng số Coliforms [11] Thử nghiệm khẳng định. Chọn 5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào 5 ống môi trường BGBL, có ống Durham. Ủ 24 giờ, đếm các ống có sinh hơi tính tỉ lệ R ( hình 3.6) Hình 2.6 Khẳng định Coliforms Ghi kết quả Ghi kết quả: Số khuẩn lạc trên cả 2 đĩa. Số ống sinh hơi. Công thức tính Tổng số Coliforms (cfu/g). Trong đó C: Tổng cố khuẩn lạc đặc trưng trên tổng số đĩa chọn đếm. N: lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ. V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa. f: độ pha loãng tương ứng. R = (Số khuẩn lạc sinh hơi trong BGBL) / (Số khuẩn lạc đã cấy). Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu 3.5.2 Phương pháp MPN 3.5.2.1 Nguyên tắc Số lượng Coliforms trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Quy trình thưc hiện Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi Ủ ở 370C ± 10C trong 48 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) sang các ống chứa canh BGBL 3.5.2.3 Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng Coliforms trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ± 10C trong 24-48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng ( hình 3.7) Hình 3.7 : Khẳng định Coliform[11] Hình 3.8: Kết quả khẳng định Coliforms trên môi trường BGBL[11] Ghi nhận kết quả: Tổng số Coliforms phát hiện trong 25g mẫu ( hình 3.8) Xác định Escherichia coli trong thực phẩm Định tính E.coli trong thực phẩm 3.6.1.1 Ý nghĩa Là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm trong chế biến, bảo quản, đặc biệt là khả năng nhiễm phân của thực phẩm. 3.6.1.2 Nguyên tắc Đây là phương pháp dùng để định tính và kết luận phát hiện hay không phát hiện E.coli trong một lượng mẫu xác định. Cấy mẫu vào môi trường tăng sinh BGBL, phân lập trên môi trường EMB và khẳng định bằng các thử nghiệm sinh hoá (nghiệm pháp IMViC). Quy trình phân tích Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-) Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli Cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hóa:Canh trypton, MR-VP, Simmon Citrate, để thử nghiệm IMViC Cân 25g mẫu + 225 môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên vào 10ml môi trường BGBL Chọn khuẩn lạc dẹt, có ánh kim, đường kính khoảng 1mm để cấy sang TSA Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ Ủ ở 44 ± 0,5oC trong 24 – 48 giờ Chọn các ống sinh hơi cấy sang EMB. Mẫu không sinh hơi được xem là âm tính với E.coli Thuyết mình quy trình Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu được độ pha loãng 10-1. Cấy mẫu Hình 3.9 : Khuẩn lạc E.coli trên môi trường EMB[12] Tăng sinh: Cấy 1ml dịch mẫu có nồng độ 10-1 vào ống nghiệm có chứa 10ml môi trường tăng sinh BGBL. Ủ trong 24 giờ ở 44oC Phân lập: Chọn ống nghiệm có phản ứng dương tính làm đục môi trường và có sinh hơi trong ống durham. Cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa EMB, ủ trong 24 giờ ở 37oC. Nhận dạng khuẩn lạc đặc trưng E.coli: Khuẩn lạc tròn, dẹp,ánh kim tím, đường kính khoảng 0.5mm ( hình 3.9). Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường thạch đĩa TSA, tăng sinh không chọn lọc. Thử nghiệm khẳng định Lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA cấy sang các môi trường thử nghiệm IMViC. Thực hiện như sau. Thử nghiệm khả năng sinh indol: Cấy vi sinh vật qua môi trường canh Trypton ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s. Phản ứng dương (+) tính khi trên bề mặt có vòng đỏ cánh sen xuất hiện, âm tính (-) khi không có vòng đỏ xuất hiện. Thử nghiệm methyl red: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 24 giờ ở 37oC . Thêm vào vài giọt thuốc thử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. Thử nghiệm Voges-Proskauer: Nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose photphate ủ trong khoảng 2-5 ngày. thêm vào vài giọt dung dịch KOH 40 % sau đó thêm dung dịch 1-αnapthol 5% tỷ lệ 1:3. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges-Proskauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sáng, phản ứng âm tính khi không có sự chuyển màu. Thử nghiệm citrate : Cấy vi sinh vật vào môi trường thạch nghiên Simmon Citrate có màu xanh lục, ủ khoảng 24 giờ ở 37oC. Phản ứng dương (+) tính khi môi trường đổ sang màu xanh dương, âm tính (-) khi môi trường không đổi màu. Kết quả thử nghiệm phát hiện E.coli (bảng 3.1) Bảng 3.1: Ghi nhận kết quả thử nghiệm sinh hoá TT Thử nghiệm sinh hoá Kết quả 1 Indol + 2 Methyl red + 3 Voges Prokauer - 4 Khả năng sử dung citrate - Hình 3.10: Nghiệm pháp IMViC [12] A: Indol (+) , B: Methyl red(+) C: Voges Prokauer (-), D: khả năng sinh citrate (-) Ghi kết quả Phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC có kết quả (+ + - - ) ( hình 3.10) Không phát hiện E.coli khi thử nghiệm IMViC không có kết quả (+ + - - ) Phát hiện hay không phát hiện E.coli trong 25g mẫu Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp dếm khuẩn lạc Nguyên tắc Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạch chọn lọc thích hợp chứa lactose, ủ ở 440C trong 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình đặc trưng của Coliforms. Khẳng định các khuẩn lạc đã đếm là E.coli bằng các thử nghiệm IMViC. Môi trường hóa chất Môi trường canh Trypton Soya Agar (VRB) Môi trường canh Escherichia coli Broth (EC Broth) Môi trường canh Lactose Trypton Laurl Sulphate Broth (LST Broth) Môi trường canh Trypton Broth. Môi trường canh MR-VR Broth Môi trường thạch Simmon Citrate Thuốc khử Kovac’s. Quy trình phân tích Chuẩn bị dịch đồng nhất hoặc pha loãng để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3… Cấy 1ml dung dịch mẫu vào đĩa Petri, bổ sung 5ml môi trường TSA, lắc đều, để yên 1-2 giờ Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB, để đông, ủ ở 370C trong 24 - 48 giờ Chọn 3-5 khuẩn lạc đặc trưng cấy vào ống canh EC, ủ ở 440C, 24-48 giờ Cấy vào các môi trường Trypton, Methyl Red, Voges- Prokauer, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC , ủ ở 440C, 24 giờ Chọn ống canh (+) ( sinh hơi) IMViC ++--, tính tỷ lệ khẳng định E.coli Tính toán mật độ E.coli Đếm các khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ đậm, có vòng tủa muối mật, đường kính ≥ 0,5mm Thử nghiệm IMViC Thuyết minh quy trình Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Thêm vào 225ml môi trường BPW đã hấp khử trùng để nguội. Tiến hành đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu(stomacher). Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫu nhưng không quá 150 giây. Tất cả các thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vô trùng. Khi đó, ta sẽ được dung dịch pha loãng 10-1. Dịch được pha loãng sẽ được pha loãng đồng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipetman hút 1ml từ độ pha loãng 10-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, đồng nhất ta đươc 10-2. Hút 1ml từ độ pha loãng 10-2 cho tiếp vào 9ml nước muối sinh lý, đồng nhất ta được 10-3. Tiếp tục thực hiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết. Chuyển 1ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa Petri. Bổ sung vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trường TSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 450C. Lắc tròn đĩa Petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều khoảng 3-5 lần để trộn đều dịch mẫu với môi trường. bổ sung vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường thạch VRB ở nhiệt độ 450C lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 370C ±10C trong 24-48 giờ. Thực hiện trên 2 mẫu nồng độ pha loãng lien tiếp sao cho mỗi đĩa sẽ xuất hiện từ 10-100 khuẩn lạc và lặp lại ít nhất 2 đĩa ứng với nồng độ pha loãng. Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ, dùng que cấy vòng cấy chuyền sang môi trường EC, ủ ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Chọn các ống cho kết quả (+) ( sinh hơi) và dùng que cấy vòng cấy chuyền sang các môi trường sau: canh trypton, canh MR-VR, thạch Simmon Citrate. Ủ các môi trường trên ở 44 ±0,50C trong 24 giờ. Thực hiện thử nghiệm Indol, Merthy Red, Voges Proskauer, Citrate. Ghi nhận số khuẩn lạc cho thử nghiệm khẳng định E.coli (+) ( nghiệm pháp IMViC là ++--). Cách tính kết quả Tính tỷ lệ khẳng định và tính mật độ E.coli ( CFU/ml hay CFU/mg) theo công thức: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại mỗi độ pha loãng V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng R: Tỷ lệ khẳng định Định lượng E.coli trong thực phẩm bằng phương pháp MPN Nguyên tắc Số lượng E.coli trong mẫu thực phẩm chứa mật độ thấp của nhóm vi khuẩn này có thể được xác định bằng phương pháp MPN (Most Probable Number). Phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành 1 dãy thập phân (2 nồng độ nối tiếp nhau nhưng khác nhau 10 lần); 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có 1 ống dẫn khí Durham. Mỗi nồng độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định tính sự hiện diện trong từng ống thử nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống nghiệm cho phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g (hoặc 1ml) mẫu ban đầu. Môi trường và hóa chất - Môi trường lỏng Lauryl Sulphate Broth LSB (canh Lauryl Sulphate). - Môi trường lỏng Brilliant Green Lactose Bile Salt (canh BGBL). - Môi trường lỏng E. coli (E. coli medium, canh EC). Các môi trường lỏng trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm chứa ống Durham úp ngược. Sau khi khử trùng, chỉ sử dụng các ống nghiệm không có bọt khí bên trong ống Durham. - Canh tryptone. - Môi trường rắn Simmon Citrate Agar (thạch Simmon Citrate). - Dịch nước muối pepton SPW (Saline pepton Water). - Thuốc khử Kovac's. - Canh MR- VP. - Thuốc khử Methyl Red. - Thuốc khử α - napthol. 3.6.3.3 Quy trình phân tích Cân 25g mẫu và 225ml môi trường BPW đồng nhất 30 giây Lấy 1ml mẫu trên cho vào 3 ống chứa 10ml canh LSB Ủ 38oC trong 48 giờ, ghi nhận số ống có hơi Ủ ở 44,50C ± 0,20C trong 24 giờ, ghi nhận các ống sinh hơi (+) Cấy chuyển dịch mẫu từ ống LSB (+) môi trường canh EC Cấy chuyền dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB Chọn khuẩn lạc tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MDVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC Ủ ở 370C trong 24 giờ Kết luận: phát hiện (hay không phát hiện) E.coli trong 25g mẫu. Indol (+), MR (+), VP (-), Citratase (-) Một trong những phản ứng trên sai thì không phải là E.coli 3.6.3.4 Thuyết minh quy trình Chuẩn bị dịch đồng nhất mẫu pha loãng mẫu đề có dịch mẫu có độ pha loãng 10-1 Tuần tự cấy 1ml dịch mẫu đã pha loãng 10-1 vào 3 ống nghiệm giống nhau, mỗi ống chứa 10ml canh LSB. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 10-2 và 10-3. Đây là trường hợp xác định MPN bằng hệ 3 dãy nồng độ và 3 ống nghiệm lặp lại (hệ 3 x 3 hay 9 ống nghiệm). Nếu nghi ngờ số lượng E.coli trong mẫu quá cao, phải sử dụng các mẫu có bậc pha loãng cao hơn. Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng que cấy vòng (khuyên cấy) cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB (+) sang các ống có chứa canh BGBL và ủ ở 370C ±10C trong 48 giờ. Ghi nhận số ống cho kết qủa (+) (có sinh hơi) ứng với mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng chuyển một vòng dịch mẫu từ các ống canh LSB (+) sang môi trường canh EC, ủ ở 44,5oC ±0,20C trong 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả (+) (sinh hơi) ở mỗi độ pha loãng. Dùng que cấy vòng ria dịch mẫu từ các ống (+) trên môi trường canh EC sang môi trường thạch đĩa EMB ủ các đĩa này ở 370C trong 24 giờ để tìm các khuẩn lạc E. coli giả định (tròn, dẹt hình đĩa và có ánh kim tím). Chọn khuẩn lạc đường kính lớn hơn 1mm và cấy vào các môi trường MDVP, Simmon Citrate Agar để thực hiện các thử nghiệm IMViC. Khuẩn lạc E. coli. giả định cho kết quả thử nghiệm IMViC tuần tự là ++ - - chính là E.coli. Ống nghiệm cho các kết quả (+) trong môi trường EC vào khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E. coli (+). Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E. coli giả định trên môi trường EMB. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E. coli (+) ở mỗi bộ pha loãng của mẫu. Xác đinh E.coli trong thực phẩm bằng Phương pháp ELISA Định nghĩa, nguyên tắc Phương pháp ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay) hay phương pháp thử miễn dịch dùng men ( Enzyme Immuno Assay, EIA) dựa cơ sở sử dụng một thể tiếp hợp chứa kháng thể đặc hiệu với một kháng nguyên và được gắn với một loại enzyme nhất định. Tiền đề cho phương pháp này là hoạt tính của cả kháng nguyên (hoặc kháng thể) lẫn của enzyme khi liên kết với nhau trong thể tiếp hợp đều không chịu sự thay đổi nào đáng kể. Enzyme liên kết trong thể tiếp hợp xúc tác cho một phản ứng hóa học, phản ứng này sinh ra một chất có màu từ cơ chất không màu. Sản phẩm có màu này có thể tan hoặc không tan tùy thuộc vào tác nhân phản ứng được lựa chọn dùng cho enzyme nói trên và phương thức miễn dịch. Sản phẩm có màu này có thể phát hiện bằng mắt thường khi cần kết quả định tính hoặc có thể đo bằng quang phổ kế khi cần kết quả định lượng. Các enzyme tiêu biểu thường dùng là peroxidase, phosphatase kiềm... Chủng bị bề mặt ( microtiter) có gắn kháng thể Rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Phủ mẫu chứa kháng nguyên cần xác định Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzyme Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chuẩn đoán Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi Thêm cơ chất Đo cường độ sáng, qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng kháng thể Quy trình phân tích Thuyết minh quy trình Mẫu hoặc dịch chiết mẫu được tiếp xúc với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm có gắn kháng thể. Sau đó được ủ ở370C trong 20 – 24 giờ để kháng nguyên ( nếu có) kết hợp với kháng thể bắt ( capture antibody). Sau đó người ta rửa đĩa, kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Sau đó, ta thêm các kháng thể đặc hiệu cho Hình 3.11: Dạng bánh kẹp gồm kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể [13] kháng nguyên cần chuẩn đoán. Tiếp theo ta thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn kết với enzyme và đem ủ ở 250C trong 2 giờ. Kế tiếp, người ta đổ dịch thế tiếp hợp đi, lại rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi. Và cho dung dịch chứa cơ chất của enzyme vào. Sau 30 phút ở nhiệt độ phòng, thì dừng phản ứng lại và màu sắc hiện ra được quan sát bằng mắt thường hoặc được đo bằng quảng phổ kế ở bước sóng 450nm. Nếu kháng nguyên có trong mẫu, một dạng bánh kẹp gồm: kháng thể bắt – kháng nguyên – thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện được hình thành trên bề mặt chất mang, trong ống nghiệm hoặc khuôn lõm. Enzyme của thể tiếp hợp sẽ tạo ra một sản phẩm có màu từ cơ chất được đưa vào. Trong trường hợp không có kháng nguyên, thể tiếp hợp chứa kháng thể phát hiện sẽ không gắn với chất mang, đáy ống nghiệm hoặc khuôn lõm, như vậy màu sẽ không hiện ra khi cho cơ chất của enzyme vào ( hình 3.11 và hình 3.12) Hình 3.12: Tổng quát quá trình phát hiện E.coli bằng phương pháp ELISA [13] Xác định tổng nấm men, nấm mốc trong thực phẩm 3.7.1 Nguyên tắc Trong thực phẩm, nấm men và nấm mốc hiện diện có thể tăng trưởng làm thay đổi màu của thực phẩm, một số có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Mật độ nấm men và nấm mốc trong mẫu được xác định chung dưới dạng tổng nấm men nấm mốc bằng kỹ thuật pha loãng, trải và để khuẩn lạc trên môi trường Dichloran Glycerol Agar ( DG18) hay Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar (DRBC). Môi trường DG18 được sử dụng cho các loại mẫu thực phẩm có hàm lượng nước thấp như các loại thực phẩm khô, gạo, ngũ cốc, tiêu, các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao. Môi trường DRBC được sử dụng cho các mẫu có hàm lượng nước cao như sữa và các sản phẩm từ sữa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp... Đối với mẫu có mật độ nấm mốc thấp, ví dụ như mỹ phẩm, môi trường được sử dụng là môi trường Malt Extract Agar (MEA) hay Potato Dextrose Agar (PDA) chứa 40ppm Chloramphenicol hay cholotetracyline. Ý nghĩa Tổng vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu thực phẩm chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm, đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật, nguy cơ hư hỏng, thời hạn bảo quản của sản phẩm, mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm. Sự tăng trưởng của vi sinh vật trong thực phẩm đẫn đến biến đổi chất lượng: 106 tế bào/g (ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không. Một vài trường hợp vi sinh vật bằng 106 tế bào/g (ml) thực phẩm chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học. Môi trường và hóa chất - Dung dịch pha loãng ( nước pepton 1%) - Môi trường thạch DBRC. - Môi trường thạch MEA. - Môi trường thạch PDA. - Môi trường thạch SDA - Môi trường thạch SDB Các loại môi trường thạch được chuẩn bị trong đĩa petri, làm khô bề mặt trong đều kiện vô trùng, tránh ánh sáng trước khi sử dụng. Môi trường thạch Sabouraud Dextrose Agar còn được chuẩn bị dưới dạng các ống thạch nghiêng. Quy trình phân tích định tính nấm mốc Quy trình phân tích Đồng nhất mẫu trong SDB thành độ pha loãng 10-1, ủ ở 300C, 1-7 ngày Cấy tranh trường có mốc mọc lên đĩa SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày Kết luận: có hay không có nấm mốc Thuyết minh quy trình Đối với mẫu có nguy cơ nhiễm và mật độ nhiễm mốc quá thấp, việc phân tích thường được thực hiện một cách định tính theo trình tự sau: mẫu được pha loãng 10-1 và đồng nhất trong môi trường SDB. Dịch đồng nhất được ủ 300C, theo dõi từng ngày đến 7 ngày. Nếu trong canh trường có sự xuất hiện của nấm mốc, tiến hành chuyển lên các đĩa thạch SDA, MEA hay PDA, ủ ở 300C trong 7 ngày. Các khuẩn lạc nấm mốc xuất hiện trên các đĩa môi trường này được cấy chuyền lên bề mặt ống thạch nghiêng SDA để định danh khi cần thiết. 3.7.5 Quy trình định lượng tổng nấm men nấm mốc 3.7.5.1 Quy trình phân tích Đồng nhất pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18 ủ ngửa đĩa ở 250C, 5-7 ngày Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CPU/g) Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ ở 300C, 7 ngày Định danh 3.7.5.2 Thuyết minh quy trình Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 90ml dung dịch pha loãng. Trường hợp mẫu dạng khô, ngâm mẫu trong dung dịch khoảng 30 phút trước khi đồng nhất mẫu. Mẫu được đồng nhất bằng máy dập mẫu trong 2 phút và được pha loãng thành các dãy nồng độ thập phân liên tiếp thích hợp. Hút vô trùng 0,1ml dịch mẫu lên các đĩa môi trường DBRC hoặc DG18. Nếu mật độ nấm men và nám mốc có thể cấy 1ml mẫu. Dùng que gạt thủy tinh trải dịch mẫu đều trên bề mặt đĩa môi trường cho đến khi khô. Đặt ngửa đĩa trong bao nylon, để hở miệng bao, ủ ở nhiệt độ 250C trong 5-7 ngày. Đĩa đã được đặt ngửa để tạo độ ẩm cho sự phát triển cuẩ nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch. Thực hiện 3 đĩa cho mỗi độ pha loãng. Đếm và số lượng khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy. Khi cần thiết quan sát bằng kính hiển vi soi nổi hay kính lúp để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay mốc. Kết quả được ghi bằng đơn vị CPU/g. Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loại nghi ngờ sinh độc tố, các khuẩn lạc nấm mốc được cấy chuyền vào trong các ống thạch nghiêng SDA để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm Cần lưu ý rằng tổng thời gian ủ nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thời gian ủ không được chạm tay hoặc di chuyển các đĩa cho đến khi đếm kết quả. Mặt khác, khi tiến hành đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa để hạn chế sự phát tán của bào tử vào trong không khí, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác. Công thức tính: Trong đó: A: số tế bào ( đơn vị hình thành khuẩn lạc ) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i V: Thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa fi: Độ pha loãng tương ứng Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên một đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x 102 CFU/g. CHƯƠNG 4 : ĐÁNH GIÁ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm tổng vi sinh vật hiếu khí Nhận xét: phương pháp đổ đĩa cho kết quả chính xác. Phương pháp đổ đĩa cho kết quả nhanh hơn và phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta hơn. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu hực phẩm chế biến sẵn đều bắt gặp vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên vi sinh vật hiếu khí chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hư hỏng. Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Coliforms Phương pháp thử: Phương pháp Đổ đĩa MPN Môi trường nuôi cấy VRB LSB Tiến hành thử Pha loãng TSA VRB Ủ 37oC/24 giờ, Khuẩn lạc đặc trưng của coliforms có màu đỏ đến đỏ sậm, có quầng tủa muối mật, đường kính > 0.5mm Pha loãng LSB Ủ 38oC trong 48 giờ Nhận xét: Cả hai phương pháp đổ đĩa và phương pháp MPN đều có ưu điểm là: chi phí thấp, không cần máy móc hiện đại. Nhưng cũng đồng thời có một số nhược điểm như: thời gian cho kết quả lâu, kết quả không chính xác tuyệt đối. Tuy nhiên phương pháp đổ đĩa thời gian cho kết quả nhanh hơn và phù hợp với điều kiện ở nước ta đồng thời đây cũng là phương pháp tối ưu. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: Hầu hết qua quá trình kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều không bắt gặp Coliforms. Cần lưu ý là các vi sinh vật gram (+) như Staphylococcus aureus, Streptococcus, Lactobacillus, trực khuẩn sinh bào tử dạng hiếu khí lẫn kỵ khí đều mọc rất chậm nên môi trường VRB và rất khó phát triển thành khuẩn lạc nhìn thấy được trong vòng 24 giờ. Coliforms là một chỉ tiêu thông dụng được dùng để đánh giá mức an toàn thực phẩm. sự có mặt một lượng lớn Coliforms và E.coli trong thực phẩm là điều không mong muốn nhưng cũng không dễ dàng loại bỏ chúng hoàn toàn khỏi thực phẩm chế biến. Vấn đề ở chỗ số lượng chúng đến mức nào là chỉ thị cho tính không an toàn của thực phẩm. Test Coliforms được dùng rộng rãi trong việc kiểm soát vệ sinh môi trường của nhuyễn thể hai mảnh song không phải luôn là chỉ thị tốt về chất lượng vệ sinh. Nói chung các nhuyễn thể hai mảnh khai thác từ vùng nước đạt chỉ tiêu về Coliforms thương có chỉ tiêu về chất lượng vệ sinh đạt, song một số vi sinh vật gây bệnh vẫn hiện diện ở chúng. Chỉ tiêu Coliforms cũng có giá trị nhất định như một chỉ thị vệ sinh đối với thự phẩm và tỏ ra khá hữu hiệu trong chương trình an toàn chất lượng thực phẩm. 4.3 Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm E.coli 4.3.1 Kiểm nghiệm theo phương pháp định tính, phương pháp MPN và phương pháp đếm khuẩn lạc Phương pháp Định tính MPN Đếm khuẩn lạc Tiến hành thử Pha loãng BGBL , ủ 44oC trong 24 giờ chọn các ống sinh hơi EMB , ủ ở 37 oC trong 24 giờ, khuẩn lạc E.coli dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm. TSA, ủ ở 37 oC trong 24 giờ , thử các test sinh hóa để xác định có hay không có E.coli trong mẫu. Pha loãng LSB ủ 38oC trong 48 giờ, cấy chuyển những ống (+) sang EC ủ 44,50C trong 24 giờ. EMB ủ ở 37 oC trong 24 giờ, khuẩn lạc E.coli dẹt, có ánh kim tím, đường kính khoảng 1mm Thử các test sinh hóa để xác định có phải là E.coli trong mẫu hay không. Pha loãng cấy 1ml mẫu vào đĩa petri + 5ml môi trường TSA, để yên 1-2 giờ thêm 10-15ml môi trường VRB, ủ 370C trong 24 – 48 giờ Đếm khuẩn lạc màu đỏ đến đổ đậm, có vòng tủa muối mật cấy vào canh EC, ủ 440C, 24-48 giờ chọn ống sinh hơi cấy vào ống canh trypton, MR-VR, thạch Simmon Citrate ủ 440C trong 24 giờ,thử nghiệm IMViC sau đó tính tỷ lệ khẳng định E.coli , tính toán mật độ E.coli. Nhận xét: Ba phương pháp trên là ba phương pháp cổ điển thường dùng nhất cho việc xác định E.coli. Nếu nghi ngờ có E.coli sẽ thử phản ứng sinh hóa. Tuy nhiên, thay vì thử phản ứng sinh hóa mất 24 giờ ta sẽ chuyển sang cấy vào môi trường Rapid E.coli. Ba phương pháp này có ưu điểm là không tốn nhiều chi phí. Tuy nhiên có một số nhược điểm như kết quả không được chính xác hoàn toàn, tốn nhiều thời gian… Trong ba phương pháp trên, phương pháp định tính là tối ưu nhất và được dùng để khẳng định E.coli trong thực phẩm nhiều nhất. Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận, chính xác. 4.3.2 Kiểm nghiệm theo phương pháp ELISA Một số bước quan trọng trong phương pháp ELISA để phá hiện E.coli Phủ đãi bằng kháng thể. Thêm mẫu xác định kháng nguyên. Kháng nguyên ( nếu có) sẽ gắn với kháng thể. Kháng thể dùng để phát hiện được thêm vò và kết hợp với kháng nguyên. Thêm kháng thể thứ cấp lien kết với enzyme. Kháng thể thứ cấp sẽ gắn với kháng thể dùng để phát hiện. Thêm cơ chất. enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được. Nhận xét: Phương pháp ELISA có ưu điểm là cho kết quả chính xác, nhanh chóng, tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên chi phí để mua thiết bị quá lớn. Ngoài phương pháp ELISA còn có các phương pháp hiện đại khác như kỹ thuật Petrifilm, Polymerase Chain Reaction (PCR)… Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều không bắt gặp vi khuẩn E.coli Thảo luận về khả năng sinh Indol trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: phát hiện khả năng của vi khuẩn có thể tạo indol trong môi trường canh trypton. Cơ sở sinh hóa: Tryptophan là một aminoacid có thể bị oxy hóa bởi một số vi sinh vật nhất định tạo nên các hợp chất indol hay các dẫn xuất của chúng như: indol, skatol (methyl indol) và indolacetic. Một số enzyme nội bào được goị chung là trytophanase tham gia quá trình tạo thành sản phẩm indol trong hoạt động thủy giải tryptophane. Các hợp chất trung gian trong quá trình thủy giải tryptophan là acid indolepyruvic, từ đó indol được hình thành trong quá trình khử amin, hình thành skatol là quá trình khử carboxyl của acid indol acetic. Quá trình thủy giải trytophan có thể được mô tả qua quá trình: Enzyme trytophanase xúc tác phản ứng khử amin bởi sự tấn công vào phân tử tryptophan ở vị trí mạch nhánh và tách nhân thơm ra khỏi phân tử tryptophan hình thành indol. Sự tách amin từ trytophanane là một dạng phản ứng khử. Qua quá trình này nhóm amin được tách ra và chuyển thành NH3, quá trình khử giải phóng một phần năng lượng được sử dụng cho hoạt động tăng trưởng của vi sinh vật. Đồng thời quá trình này còn tạo thành acid pyruvic, cơ chất tham gia vào chu trình Krebs’ để tiếp tục thu năng lượng. Phát hiện indol và các dẫn xuất cảu chúng trong môi trường nuôi cấy bằng thuốc khử Kovac’s hay Ehrlich’s. Cơ chất chính tham gia phát hiện indol trong môi trường nuooicaays là p-dimethylaminbenzaldehyde. Chất này phản ứng với indol tạo thành một phức hợp màu đỏ. Phản ứng này là do nhân pyrrol của indol hản ứng với nhóm aldehyde của p-dimethylaminbenzaldehyde qua hai giai đoạn để tạo thành nhân quinine có màu đỏ, phản ứng như sau: Hình 4.1: Indol + và Indol - [11] Phương pháp thử: vi sinh vật thử nghiệm được nuôi trong môi trường canh trypton khoản 24-48 giờ. Nhỏ vài giọt ether vào canh khuẩn nhằm kéo indol lên bề mặt môi trường, thêm vài giọt thuốc khử Kovac’s hay Erhlich. Quan sát sau vài phút, phản ứng dương tính nếu trên bề mặt môi trường có vòng tròn màu đỏ xuất hiện. ngược lại nếu không có sự xuất hiện của màu đỏ hồng được coi là phản ứng âm tính ( hình 4.1) Thảo luận về thử nghiệm methyl red (MR) trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: thử nghiệm Methyl red nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid bề trong môi trường từ trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: thử nghiệm Methyl red trên cơ sử sử dụng chất chỉ thị pH là methyl red để nhận biết lượng ion H+ trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men gluco. Hàm lượng ion H+ có trong môi trường phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 và H2, hàm lượng các chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hóa của tường loài vi sinh vật. Đối với các vi sinh vật đường ruột, thời gian nuôi cấy để thử nghiệm phản ứng MR thường được xác định trong khoảng 18- 24 giờ, tuy nhiên các vi sinh vật này đều tạo acid trong môi trường ngay từ khi chúng bắt đầu phát triển. Khi kéo dài thời gian nuôi cấy vi sinh vật có phản ứng MR dương tính sẽ tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều hơn, độ pH trong môi trường ngày càng giảm. Đối với các vi sinh vật cho phản ứng MR âm tính, ngay ban đầu một lượng acid được hình thành trong môi trường, nhưng kéo dài thời gian nuoi cấy vi sinh vật này tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm acid bằng các phản ứng như decarboxyl tạo nên các sản phẩm trung tính như acetoin ( acetyl methylcarbinol) và kết quả là làm cho pH trong môi trường chuyển dần về trung tính. Trong một số trường hợp khác vi sinh vật cũng sản sinh acid tỏng môi trường nhưng các acid này cho hàm lượng ion H+ thấp như acid lactic, acid acetic, acid formic… Bởi vid các acid này có xu hướng chuyển về trung tính do hiện tượng tạo thành các carbonate và tạo thành các sản phẩm như CO2 và các hợp chất ammonium trong môi trường các sản phẩm này làm tăng pH trong môi trường. Thử nghiêm MR phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự khác nhau trong các con đường chuyển hóa Glucose. Thử nghiệm này thường được tiến hành trong khoảng 2-5 ngày ở 370C. Phương pháp tiến hành: nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường glucose phosphate (MR-VP broth) ủ trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào vài giọt thuốc khử methyl red được pha theo tỉ lệ 0,1g trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml. Phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang đỏ. Phản ứng âm tính khi môi trường giữ nguyên màu vàng. ( hình 4.2) Chủng VSV ủ 2 – 5 ngày 37oC Pứ âm tính Pứ dương tính Đối chứng MR broth Hình 4.2 : Thử nghiệm MR [7] Thảo luận về thử nghiệm Voges – Proskauer trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: phát hiện khả năng vi sinh vật tạo thành một số sản phẩm trung tính acetylmethylcarbimol trong quá trình lên men glucose. Cơ sở sinh hóa: thử nghiệm Voges – Proskauer nhằm mục đích phát hiện acetylmethylcarbimol, mọt sản phẩm trung tính trong quá trình trao đổi glucose trong tế bào vi sinh vật. Quá trình phân hủy glucose trong tế bào vi sinh vật tạo ra sản phẩm trung gian là acid pyruvic, từ đây có thể chia vi sinh vật thành hai nhóm theo hai con đường chuyển hóa pyruvic khác nhau như: Nhóm trao đổi không tạo thành 2,3-butanediol; nhóm thứ hai quá trình này tạo thành sản phẩm trung gian là 2,3-butanediol, được gọi là nhóm Voges- Prokauer dương. Tuy nhiên thử nghiệm Voges- Prokauer nhằm mục đích phát hiện acetylmethylcarbimol, một tiền chất của 2,3-butanediol. Phân tử acetylmethylcarbimol được tạo thành do quá trình khử nhóm carboxyl của acid pyruvic, phản ứng như sau: 2 Pyruvate acetoin + 2 CO2 Vì acetylmethylcarbimol là một sản phẩm trung gian trong bước tạo thành 2,3-butanediol nên trong moi trường nuôi cấy tích lũy một lượng rất ít tiền chất này. Để acetylmethylcarbimol tích lũy nhiều, dễ dàng cho việc phát hiện, vi sinh vật phải nuôi trong điều kiện hiếu khí. Quá trình chuyển hóa giữa acetylmethylcarbimol và 2,3-butanediol là một quá trình thuận nghịch, có thể biểu diễn quá trình này như sau: Để phát hiện acetylmethylcarbimol trong môi trường nuôi cấy 1-napthol được sử dụng như mooyj thuốc khử phát hiện trong môi trường kiềm mạnh được tạo ra do KOH 40% hay NaOH 40% được cho vào môi trường thử nghiệm. Cơ chế phản ứng nhận biết acetylmethylcarbimol được biểu diễn như sau: Phức hợp màu đỏ hồng Trong các thành phần tham gia phản ứng để tạo phức chất có màu đổ hòng có hợp chất guanidine, ví dụ arginine NH:C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-CÔH, chất này hiện diện trong peptone được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp tiến hành: cấy vi sinh vật vào trong môi trường canh glucose phosphate, ủ ở nhiệt độ 370C trong khoảng 2-5 ngày. Thêm vào canh khuẩn sau nuôi cấy 3ml dung dịch 1-napthol 5% trong cồn, bổ sung thêm 3ml dung dịch KOH hay NaOH 40%, lắc mạnh. Quan sát phản ứng trong khoảng 5 phút. Phản ứng Voges- Prokauer dương tính khi môi trường chuyển sang màu đỏ hay hồng sang, phản ứng Voges- Prokauer âm tính khi không có sự chuyển màu này. Thảo luận về thử nghiệm citrate trong nghiệm pháp IMViC phát hiện E.coli Nguyên tắc: nhằm xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrate như nguồn carbon duy nhất. Cơ sở sinh hóa: năng lượng cung cấp cho vi sinh vật khi trong môi trường không có nguồn nguyên liệu sử dụng cho quá trình lên men hay tạo các sản phẩm lactic bằng cách sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất. Thông thường, sự trao đổi chất citrate bao gồm các bước kết hợp acetyl – CoA để tạo thành oxalacacetate để cho chúng đi vào chu trình Kreb. Con đường đồng hóa citrate ở các vi khuẩn rất nhanh qua chu trình tricarboxylic acid hay con đường lên men citrate. ở vi khuẩn sự tách citrate bao gồm một hệ thống enzyme không có sự tham gia của enzyme acetyl – CoA, enzyme này được gọi là citratase ( citrate axaloacetat – lyase) hay citate demolase. Enzyme này đòi hỏi một cation có hóa trị 2 cho hoạt động của chúng, thông thường các cation này là magie (Mg2+) hay mangan (Mn2+). Bước đầu tiên vi sinh vật tách citrate thành oxaloacetate và acetate. Đây là hai sản phẩm trung gian trong quá trình đồng hó citrate, còn sản phẩm nhận được từ quá trình này phụ thuộc vào pH của mooi trường. nếu pH kiềm thì trong môi trường sẽ nhận được nhiều acetate và formate, nếu pH acid thì sản phẩm tạo ra là lactate và CO2. pH trên 7,0 không có sản phẩm lactate trong môi trường và sản phẩm nhận được như sau: Citrate CO2 + Formic acid +2 Acetic acide ở pH acid acetyl methylcarbinol (acetoin) và latate là sản phẩm chính của quá trình sử dụng citate. Môi trường sử dụng cho quá trình lên men citrate còn chứa muối vô cơ ammonium. Một vi sinh vật có khả năng sử dụng citrate là nguồn carbon duy nhất cũng có thể sử dụng ammonium như nguồn nitơ duy nhất, ammonium bị phân hủy để tạo thành ammonia, chất này sẽ làm kiềm môi trường nuôi cấy. Deffner và Franke thành lập công thức cho môi trường citrate cho các vi sinh vật đường ruột, sản phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy như sau: 4 Citrate 7 Acetate + 5CO2 + formate + Succinate Sự sử dụng các acid hữu cơ ở dạng muối của chúng như là nguồn carbon tạo nên các carbonate hay bicarbonate kiềm tính. Để sử dụng cho việc thử nghiệm citrate, có thể sử dụng môi trường Simmon citrate agar hay môi trường lỏng Koser. Nên cấy một lượng vi sinh vật vừa phải, nếu cấy với mật độ quá dày có thể gây nên hiện tượng dương tính giả. Sau khi cấy, ử ở nhiệt độ 30-370C, quan sát sự phát triển của vi sinh vật và sự di chuyển sang kìm của môi trường. Các chủng vi sinh vật đối chứng: đối chứng dương: P.rettgeri; đối chứng âm: S. epidermidis. Đánh giá và thảo luận về kiểm nghiệm Tổng nấm men, nấm mốc 4.4.1 Quy trình phân tích định tính nấm mốc - Phương pháp thử : Đổ đĩa - Môi trường nuôi cấy: SDA, MEA hay PDA - Ủ ở 30oC trong 7 ngày Nhận xét: Phương pháp này cho kết quả chính xác, tốn ít chi phí. Phương pháp này phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là mất nhiều thời gian Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. 4.4.2 Quy trình phân tích định lượng tổng nấm men, nấm mốc Phương pháp thử: đổ đĩa Môi trường nuôi cấy:DRBC hoặc DG18 Ủ ở 25oC từ 5-7 ngày Nhận xét: phương pháp này cho kết quả chính xác, tốn ít chi phí. Phương pháp này phù hợp với điều kiện khí hậu nhiệt độ ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp này mất nhiều thời gian Mọi thao tác trong quá trình thí nghiệm cần thiết phải tiến hành cẩn thận và chính xác. Kết quả: hầu hết qua kiểm nghiệm các mẫu thực phẩm chế biến sẵn đều bắt gặp tổng nấm men, nấm mốc. Tuy nhiên tổng nấm men, nấm mốc chỉ có giá trị chỉ thị về hiện trạng của sản phẩm hơn là dự báo về thời hạn sử dụng của sản phẩm bởi khó xác định tỷ lệ vi khuẩn gây hư hỏng. CHƯƠNG 5 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau quá trình nghiên cứu, tôi nhận thấy rằng Coliform và E.coli là loài vi khuẩn khá nguy hiểm, chúng gây ra bệnh thương hàn, nhiễm trùng huyết, một só bệnh khác và có thể dẫn đến tử vong. Ngoài ra còn có nấm men, nấm mốc và một số loài vi khuẩn hiếu khí khác cũng có khả năng gây bệnh nhưng không nặng như E.coli. Hầu như thực phẩm chế biến sẵn không có các vi khuẩn gây bệnh nên không gây hại cho cơ thể con người. Tuy nhiên, một số loại thực phẩm được bán ở một số các tiệm ăn , vỉa hè mất vệ sinh, không an toàn vệ sinh thực phẩm dẫn đến một số trường hợp bị ngộ độc thực phẩm và có thể dẫn đến tử vong. Mạng lưới kiểm tra an toàn vệ sinh thực phẩm của nước ta tuy đã trải rộng khắp đất nước nhưng nguồn nhân lực quá mỏng cộng với năng lực của cán bộ kiểm dịch còn thấp ở các địa phương, nhất là Thành phố Hồ Chí Minh và Thủ Đô Hà Nội. Kiến nghị Trong việc kiểm tra các chỉ tiêu trên, có một số phần do thời gian quá gấp mà tôi chưa thể thực hiện được: + Khảo sát trực tiếp các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm chế biến sẵn. + Khảo sát tình trạng vệ sinh của các khu buôn bán. + Khảo sát quá trình giết mổ gia súc, gia cầm trên một số địa bàn. Đặc biệt là địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh. Thành lập các trung tâm kiểm dịch trên các địa bàn và yêu cầu trước khi bán các thực phẩm chế biến sẵn phải qua kiểm dịch và sử dụng các dụng cụ phân phối hợp vệ sinh. Nên thành lập các địa điểm bán thực phẩm chế biến sẵn tập trung để dễ dàng kiểm tra vệ sinh khu buôn bán. Thường xuyên tổ chức các đợt kiểm tra khu chăn nuôi và giết mổ để đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.