Khóa luận Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn pseudomonas aeruginosa trong nước uống

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** 000 ****** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas aeruginosa TRONG NƢỚC UỐNG Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HOÀNG THU TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****** 000 ****** KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM KHUẨN VÀ TÍNH ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Pseudomonas aeruginosa TRONG NƢỚC UỐNG Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. PHẨM MINH THU NGUYỄN HOÀNG THU TRANG TS. NGUYỄN TRỌNG HIỆP Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY ****** 000 ****** SERVEY OF THE MICROBIOLOGICAL QUALITY AND ANTIBIOTIC - RESISTANCE OF Pseudomonas aeruginosa ISOLATED FROM DRINKING WATER GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student MSc. PHAM MINH THU NGUYEN HOANG THU TRANG PhD. NGUYEN TRONG HIEP TERM: 2003 - 2007 HCMC, 08/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP. HCM đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy đã tận tình truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt bốn năm qua. Ban Giám đốc Viện PASTEUR TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: ThS. Phẩm Minh Thu, Trưởng phòng Vi Sinh Thực Phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP. HCM đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức quý báo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. TS. Nguyễn Trọng Hiệp, Bộ môn Vi Sinh – Ký Sinh, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. HCM là người thầy khơi dậy trong tôi niềm đam mê trong công việc. Thầy đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Ngọc Hải, Đại Học Nông Lâm TP. HCM đã đóng góp những ý kiến chân thành cho tôi trong bước đầu thực hiện khóa luận. Các cô trong Phòng vi sinh thực phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP. HCM đã nhiệt tình chỉ dẫn cho tôi trong quá trình thực tập.  Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã luôn ở bên tôi, chia sẽ và động viên tôi trong suốt thời gian qua.  Con thành kính ghi ơn ba mẹ và tất cả những người thân trong gia đình luôn là nguồn động viên và khích lệ to lớn cho con trong suốt thời gian học tập. Sinh viên Nguyễn Hoàng Thu Trang iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN HOÀNG THU TRANG, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh “Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống” thực hiện tại Phòng vi sinh thực phẩm, Khoa LAM, Viện PASTEUR TP HCM từ 03/2007 đến 07/02007. GVHD: ThS. PHẨM MINH THU TS. NGUYỄN TRỌNG HIỆP Vật liệu dùng để nghiên cứu là nước uống được phân thành 2 nhóm: nhóm 1 là nước uống đóng chai (50 mẫu), nhóm 2 là nước uống xử lý (350 mẫu) gồm có nước uống công ty (200 mẫu), gia đình (50 mẫu), trường học (50 mẫu), bệnh viện (50 mẫu). Chúng tôi sử dụng phương pháp màng lọc để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh trong nước uống dựa theo TCVN 6096:2004, làm kháng sinh đồ để kiểm tra tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch theo tiêu chuẩn NCCLS 2007 và tham khảo thêm tiêu chuẩn CA-SFM 2004. Kết quả chúng tôi ghi nhận được như sau: Về các chỉ tiêu vi sinh Nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất chiếm 52% mẫu kiểm tra. Tiếp theo là nước uống công ty 28%, nước uống đóng chai 20% , nước uống trường học 6% và hầu hết nước uống bệnh viện đều đạt chỉ tiêu vi sinh. Trong các chỉ tiêu vi sinh, P. aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm nhiều nhất chiếm đến 62% (59 trong 95 mẫu không đạt chỉ tiêu vi sinh), kế đến là Coliform 56%, Coliform fecal 43%, vi khuẩn kỵ khí sinh H2S 21% và Streptococcus fecalis 13%. Về tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa Trong 16 loại kháng sinh thử nghiệm, vi khuẩn đề kháng tỉ lệ cao với fosfomycin từ 33% đến 50% các chủng thu được. Một số kháng sinh khác như ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin cũng bị kháng với tỉ lệ thấp (≤ 5%). Ngoài ra, các chủng vi khuẩn tìm thấy không có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. v SUMMARY This is Nguyen Hoang Thu Trang studying at Nong Lam University and finishing the thesis in August 2007. The thesis entitles “Survey of the microbiological quality and antibiotic-resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from drinking water”. A total of 400 samples of drinking water are divided into 2 groups (drinking bottled water and drinking treated water). Group one consists of 50 samples of bottled water; group two consists of 200 samples of drinking water from companies, 50 from families, 50 from schools, 50 from hopitals. We use the TCVN 6096:2004 membrane filtration method to isolate microbiology in samples of drinking water. We also use the NCCLS 2007 and CA-SFM 2004 diffusion disk method to test the antibiotic susceptibility of P. aeruginosa isolated from samples above. The results of this research are as follows: Microbiology standards: Family drinking water which is affected most by microbiology contaminations occupies 52% of 50 samples,water from companies occupies 28% of 200 samples, bottled water occupies 20% of 50 samples, water from school only occupies 6% of 50 samples and 100% of samples from hopital is not affected by microbiology contaminations. According to microbiology standards, P. aeruginosa is found to be contaminated most, occupying 62% of 95 samples which do not meet the microbiology standards, next is Coliform 56%, Coliform fecal 43%, the spores of sulfite-reducing anaerobes (Clostidium) 21% and Streptococcus fecalis 13%. Antibiotic-resistance of P. aeruginosa: High resistance level to fosfomycin observed occupies from 33% to 50% of the isolated samples. The strains show resistance at low levels (≤ 5%) to ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin. Overall of P. aeruginosa strains isolated from drinking water are not multiresistant. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ...................................................................................... iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. viii DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH ................................................ ix Chƣơng 1: MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu ................................................................................................. 2 1.2.1. Mục tiêu chung ................................................................................ 2 1.2.2. Mục tiêu chuyên biệt ....................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ....................................................................................... 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống ....................................................... 3 2.1.1. Trong nước ...................................................................................... 3 2.1.2. Thế giới ........................................................................................... 4 2.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa .................................... 5 2.2.1. Trong nước ...................................................................................... 5 2.2.2. Thế giới ........................................................................................... 6 2.3. Tổng quan các vi sinh vật. ..................................................................... 8 2.3.1. Coliforms và Coliform fecal ............................................................ 8 2.3.2. Liên cầu khuẩn nguồn gốc từ phân (Streptococcus fecalis) ............ 9 2.3.3. Vi khuẩn kỵ khí khử sunphite (Clostridium) ................................ 10 2.3.4. Pseudomonas aeruginosa .............................................................. 13 2.4. Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn .................................... 16 2.4.1. Thuốc kháng sinh .......................................................................... 16 2.4.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn ........................................... 18 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ...................................................... 20 vii 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .......................................................... 20 3.2. Vật liệu ................................................................................................ 20 3.3. Thiết bị, hóa chất và môi trường ......................................................... 20 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 20 3.3.2. Hóa chất ......................................................................................... 21 3.3.3. Môi trường ..................................................................................... 21 3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 23 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu .................................................................... 23 3.4.2. Xử lý số liệu .................................................................................. 23 3.4.3. Đánh giá kết quả ............................................................................ 24 3.4.4. Phương pháp thử nghiệm vi sinh vật ............................................. 25 3.4.5. Phương pháp làm kháng sinh đồ ................................................... 32 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 36 4.1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nước uống .......................................... 36 4.1.1. So sánh giữa 2 nhóm nước uống (đóng chai và xử lý) .................. 36 4.1.2. Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nước ....................................... 38 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nước uống ..................... 40 4.2. Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nước uống ..................................................................................................... 41 4.3. Một số hình ảnh các vi sinh vật trong quá trình thử nghiệm............... 44 4.3.1. Tình hình nhiễm khuẩn nước uống ............................................... 48 4.3.2. Tính đề kháng kháng sinh của P . aeruginosa .............................. 50 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 52 5.1. Kết luận ............................................................................................... 52 5.2. Đề nghị ................................................................................................ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 54 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg microgam cm centimet g gam ml mililit mm milimet nm nanomet BEA Bile Esculine Agar BHI Brain Heart Infusion CA-SFM Comité de L’Antibiogramme de la Societe Francaise de Microbiologie. (Hội đồng kháng sinh - Hiệp hội vi sinh của Pháp) CN Cetrimide Agar DNA Deoxyribonucleic Acid ICU Intensive Care Unit ISO International Standard Orgnazation LAM Laboratory Analysis Medicine MH Mueller Hinton MT Môi Trường NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) RNA Ribonucleic Acid TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam TP. HCM Thành Phố Hồ Chí Minh TTC Triphenyl Tetrazolium Chloride UV Ultra Violet ix DANH SÁCH BẢNG, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ, HÌNH Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ ..................................... 33 Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước ................ 36 Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nước .................. 37 Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống đóng chai theo từng chỉ tiêu .............. 38 Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống công ty theo từng chỉ tiêu .................. 38 Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống gia đình theo từng chỉ tiêu ................. 39 Bảng 4-6: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống trường học theo từng chỉ tiêu ............ 39 Bảng 4-7: Tỉ lệ nhiễm P.aeruginosa giữa các loại nước uống ................................. 40 Bảng 4-8: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P . aeruginosa trong các loại nước uống ..... 41 Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước ......................................... 36 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước ....................... 37 Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nước ....................... 37 Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nước uống............................. 40 Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống đóng chai ............................................................................................. 42 Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống công ty ... 42 Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nước uống gia đình .. 43 Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E. coli giả định ................................................................................. 26 Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis ................ 28 Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) ............... 29 Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa .............................................. 31 x Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng ............................................. 22 Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh ................. 22 Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí ............................................................................................. 22 Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm ....................................................................... 32 Hình 4.1: Khuẩn lạc coliform trên môi trường lactose TTC tergitol 7 ..................... 44 Hình 4.2: Thử nghiệm khả năng lên men đường lactose của coliform, faecal coliform .......................................................................................... 44 Hình 4.3: Khuẩn lạc Streptococcus fecalis trên môi trường Slanetz và Bartley ....... 45 Hình 4.4: Khuẩn lạc Steptococcus fecalis trên thạch mật asculin-nitrua .................. 45 Hình 4.5: Khuẩn lạc các bào tử Clostridium trên thạch sunphit triptoza .................. 46 Hình 4.6: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường thạch CN ................................ 46 Hình 4.7: P. aeruginosa trên môi trường King’s B ................................................. 47 Hình 4.8: Thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn P. aeruginosa ................................. 47 1 Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nước là một thành phần quan trọng của cơ thể sinh vật nói chung trong đó có con người. Cơ thể chúng ta có đến 60 – 80% là nước. Chỉ cần mất 10% số lượng nước (khoảng 3,5 lít đối với một người nặng 50kg) là cơ thể đã có nguy cơ đưa đến tử vong. Trong điều kiện bình thường, mỗi ngày một người lớn trung bình cần khoảng 2 – 2,5 lít nước và nhu cầu này thay đổi tùy theo nhiệt độ môi trường, mức độ hoạt động thể lực, tình trạng bệnh lý của cơ thể...Loại nước cơ thể thường dùng nhất là nước lọc, nước nấu chín. Đời sống công nghiệp ngày càng phát triển nên nhu cầu sử dụng nước đóng chai rất lớn. Do đó trên thị trường xuất hiện các mặt hàng nước khoáng, nước tinh khiết đóng chai, đóng thùng lớn đang ngày càng trở nên phổ biến và thông dụng, đa dạng mẫu mã và rất nhiều chủng loại khác nhau, vì thế chất lượng cũng khó mà kiểm soát. Chính vì vậy vấn đề vệ sinh an toàn về nước uống ngày càng được chú trọng. Nước uống không đạt tiêu chuẩn vi sinh không chỉ ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người sử dụng mà còn là tác nhân truyền các bệnh nhiễm khuẩn qua đường ăn uống một cách nhanh chóng trên diện rộng [38]. Theo TCVN 6096 : 2004 về nước uống yêu cầu kiểm tra chỉ tiêu vi sinh vật bao gồm: Coliforms tổng số, Coliform fecal, Streptococcus fecalis, Pseudomonas aeruginosa, vi khuẩn kỵ khí khử sunphite [1]. Trong đó, P. aeruginosa là một chỉ tiêu mới được đưa vào. Ngày nay, người ta càng quan tâm nhiều hơn về sự xuất hiện của P. aeruginosa trong nước uống vì nó có vai trò quan trọng trong nhiễm trùng cơ hội và hiện diện phổ biến trong tự nhiên. Do đó, P. aeruginosa là một trong 3 tác nhân hàng đầu gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện [38]. Thêm vào đó, trong những điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ cao, thiếu dinh dưỡng , chúng vẫn có thể sinh sôi và phát triển tốt. 2 Trước đây, P. aeruginosa được biết đến với vai trò gây bệnh trong bệnh phẩm nhiều hơn thực phẩm, nó được xem là vi khuẩn gây bệnh cơ hội, tác động đến người có sức đề kháng kém. Hiện nay, vi khuẩn này chiếm một tỉ lệ không nhỏ trên các bệnh nhiễm trùng đường tiểu, máu, phổi, vết thương,… và tỉ lệ tử vong khá cao, có thể lên đến 50% so với các loại vi khuẩn khác [23]. Gần đây, nhiều khảo sát cho thấy tính kháng kháng sinh của vi khuẩn này ngày một gia tăng. P. aeruginosa đã đề kháng cao với các kháng sinh thường dùng ở Việt Nam [5]. Tuy nhiên, ở nước ta tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn này trên nước uống chưa được khảo sát. Từ những cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát tình hình nhiễm khuẩn và tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trong nƣớc uống”. 1.2. Mục tiêu 1.2.1. Mục tiêu chung Đánh giá tình hình vệ sinh nước uống và tìm hiểu khả năng đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa. 1.2.2. Mục tiêu chuyên biệt  Xác định tỉ lệ nhiễm khuẩn của nước uống theo TCVN 6096: 2004. Coliforms tổng số Coliform fecal Streptococcus fecalis P. aeruginosa Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit (Clostridium)  Xác định tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa trong các mẫu khảo sát.  Khảo sát tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa tìm được. 1.3. Giới hạn đề tài Do thời gian có hạn nên đề tài chỉ thực hiện kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của nước uống đóng chai và nước xử lý dùng để uống theo tiêu chuẩn nước uống đóng chai. Trong đó, đặc biệt lưu ý đến chỉ tiêu P. aeruginosa và làm kháng sinh đồ của vi khuẩn này, bởi vì đây là một loại vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng cơ hội nguy hiểm và mới được đưa vào Tiêu Chuẩn Việt Nam về nước uống đóng chai từ năm 2004 đến nay. 3 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nhiễm khuẩn nƣớc uống 2.1.1. Trong nƣớc Theo kết quả kiểm tra 152 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai quy mô nhỏ trên địa bàn TP. HCM của Trung tâm Y tế dự phòng thành phố (2004), chỉ có 4 cơ sở (2,5%) đảm bảo điều kiện vệ sinh. Trong số các cơ sở còn lại, 70% cơ sở rửa bình (loại bình tái sử dụng) bằng phương pháp thủ công không đảm bảo vệ sinh, 60% có quy trình sản xuất và thực hiện dán nhãn mác không đúng với công bố trước đó, 40% không khám sức khỏe cho công nhân - những người trực tiếp sản xuất [42]. Trần Thị Mai (2005), điều tra nghiên cứu cắt ngang 20 cơ sở sản xuất nước uống đóng chai tại thành phố Buôn Ma Thuộc cho thấy có 11,8% số mẫu không đạt chỉ tiêu về vi sinh vật, chủ yếu là do sự có mặt của Coliform, Coliform fecal và E. coli trong sản phẩm nước uống đóng chai. Bên cạnh đó, chỉ có 75% cơ sở được bố trí dây chuyền sản xuất theo nguyên tắc một chiều, 25% cơ sở có phân xưởng rót và đóng nắp chai kín, 100% cơ sở chưa thực hiện kiểm nghiệm nguồn nước sản xuất và 95% cơ sở chưa kiểm định sản phẩm nước đóng chai theo định kỳ 6 tháng/ lần. Trách nhiệm của chủ cơ sở về tổ chức tập huấn và khám sức khoẻ cho công nhân còn hạn chế và ý thức về vệ sinh an toàn thực phẩm của người trực tiếp sản xuất còn thấp[9]. Trung tâm Y tế dự phòng TP. HCM (2006) đã xác định vi khuẩn Coliform, Coliform fecal, E. coli – là những tác nhân dẫn đến bệnh đường tiêu hóa – có mặt trong rất nhiều mẫu nước của các trường học thuộc nhiều quận huyện, trong đó nhiều trường có mật độ vi khuẩn khá cao. Mẫu nước của Trường Mầm non tư thục S.C. (huyện Bình Chánh) có các loại vi khuẩn E. coli (5/100 ml), Coliform và Coliform fecal (60/100 ml); mẫu nước của trường tiểu học Đ.S. (quận 11) có đến 4 1300 Coliform, 1200 Coliform fecal trong 250 ml nước; mẫu nước của trường Mầm non bán công Y (quận Gò Vấp) có chỉ tiêu 2 loại vi khuẩn nói trên là 600 và 400/250 ml… Thống kê chưa đầy đủ của Trung Tâm Y Tế Dự Phòng Thành Phố, cho đến cuối tháng 10-2005, đã có trên 90 trường trên địa bàn TP. HCM có mẫu nước bị nhiễm vi sinh [44]. 2.1.2. Thế giới Benoit Lévesque (1994), so sánh chất lượng vi sinh nước máy và nước từ máy làm lạnh nước uống tại khu dân cư và khu văn phòng, cho kết quả 36% và 28% các mẫu nước từ khu dân cư và khu làm việc đều bị nhiễm ít nhất một Coliform hoặc một chỉ tiêu vi sinh (Coliform fecal và Streptococcus fecalis) hoặc/và một chỉ tiêu vi khuẩn gây bệnh (Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, Aeromonas spp). Tỷ lệ nhiễm khuẩn của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ máy làm lạnh nước uống. Điều này có thể do các bình làm lạnh nước uống không được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú các vi sinh vật gây bệnh [21]. Tamagnini L.M. và González R.D. (1997) nghiên cứu tính ổn định của vi sinh vật trong nước đóng chai và sự phát triển của P. aeruginosa cho kết quả: nước uống đóng chai vô trùng trong các chai nhựa tái sử dụng hay sử dụng một lần đều không bị nhiễm Coliforms và Coliform fecal nhưng lại tìm thấy P. aeruginosa trong các chai nhựa tái sử dụng. Điều này có thể do vệ sinh kém các chai đựng và vi khuẩn sinh sôi nhờ sử dụng lượng dinh dưỡng thừa còn sót lại trên bề mặt chai [40]. Theo Vess et al. (1993), P. aeruginosa có khả năng sống sót trên bề mặt PVC [41]. Theo Hunter (1993), 29% Pseudomonas sp. được phân lập từ nước uống đóng chai là P. aeruginosa [25]. Rusin PA (1997), giám sát bệnh lây lan qua đường uống và sự bùng phát bệnh liên quan đến nước uống và nước không dùng để uống thì vi sinh vật gây bệnh trong nước uống chủ yếu gồm 3 loại vi khuẩn Gram âm đó là P. aeruginosa, Acinetobacte, Xanthomonas maltophilia với tỉ lệ như sau: P. aeruginosa, < 1%- 24%; Acinetobacter, 5%-38%; X. maltophilia, < 1%-2%; Aeromonas, 1%-27. Theo đó, nước uống cũng là nguồn lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh cơ hội ảnh 5 hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ cộng đồng [38]. Một khảo sát từ 2003-2004 tại Mỹ có 2760 người mắc các bệnh qua đường uống, có 4 trường hợp bị tử vong [27]. Bharath J. (2003), khảo sát chất lượng nước uống đóng chai nội và ngoại nhập ở Trinidad nhận thấy sự hiện diện của Coliforms tổng số trong các sản phẩm nội địa là 6,9% so với sản phẩm nhập khẩu là 0%. Tương tự như vậy, vi khuẩn hiếu khí trong nước uống đóng chai nội địa cao hơn nhiều so với hàng nhập khẩu (33,6% so với 14,8%). Đối với Pseudomonas species tỉ lệ nhiễm là 7,6% nhưng tất cả đều âm tính với Coliform fecal và Salmonella spp.. Như vậy trên cơ sở không có sự hiện diện của Coliform fecal và Salmonella trong nước uống thì 5% nước uống đóng chai (nội và ngoại nhập) bán trên thị trường không đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng [22]. Aulicino FA. (2004), khảo sát các vi sinh vật tồn tại trong nước uống cho biết, nước uống bị đục là nơi ẩn náu cho mầm bệnh và vi sinh vật gây bệnh khác. Dịch bệnh lây lan qua đường uống làm ảnh hưởng đến sức khỏe nhiều người thông qua các hệ thống phân phối nước uống, nhất là các khu vực gần bệnh viện [19]. Baumgartner A. (2006), đánh giá tình trạng vệ sinh của các loại nước uống: đối với nước uống đóng chai bao gồm nước tinh khiết và nước khoáng từ các máy làm lạnh thì tổng số vi sinh vật hiếu khí ở nước nguồn cao hơn từ các máy làm lạnh. Tuy vậy, P. aeruginosa được tìm thấy trong nước nguồn với tỷ lệ 25% và tần số xuất hiện tương tự như trong các máy làm lạnh , tỉ lệ là 24,1%. Kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh các chủng P. aeruginosa tìm thấy trên cả nước nguồn và nước từ máy làm lạnh là như nhau, chứng tỏ một chủng đơn bắt nguồn từ nước uống đóng chai hơn là xung quanh máy làm lạnh. Cho thấy sự nhiễm này bắt nguồn từ nhà sản xuất [20]. 2.2. Tình hình kháng kháng sinh của P. aeruginosa 2.2.1. Trong nƣớc Các nghiên cứu trong nước về tình hình nhiễm P. aeruginosa trong nước uống chưa được nghiên cứu. Hầu hết khả năng gậy bệnh và tính đề kháng kháng sinh của loại vi khuẩn này chủ yếu được phân lập trên bệnh phẩm. Quá trình theo dõi mức độ đề kháng trong năm 1997 của Võ Thị Chi Mai và cộng sự [7] trên các 6 tác nhân trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu thì P. aeruginosa là nguyên nhân chính. Hơn thế nữa, hầu hết 374 dòng trực khuẩn mủ xanh phân lập từ máu (16), nước tiểu (47) và đàm (311) kháng nhiều loại kháng sinh. Ðối với cephalosporins thế hệ 3, đến 62,5% kháng cefotaxime và 38,9% kháng ceftazidime. Các vi khuẩn này kháng amikacin 10,8% và tobramycin 59%. Trên fluoroquinolones, tỉ lệ kháng ofloxacin là 58,3%, kháng norfloxacin 55,2% và kháng ciprofloxacin 43,8%. Nghiên cứu về tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện tại bệnh viện đa khoa (BVĐK) tỉnh Quảng Ngãi và bệnh viện đa khoa khu vực Bồng Sơn từ năm 2003- 2004 cho thấy P. aeruginosa đứng hàng thứ 3 với tỷ lệ 18,8%, gặp chủ yếu ở bệnh phẩm mủ, chỉ nhạy với amikacin, axepim, ceftazidin, ceftriaxon. Kết quả kiểm tra mẫu nước y tế tại 2 bệnh viện cho thấy: năm 2003 mẫu nước tại BVĐK khu vực Bồng Sơn không có vi khuẩn gây bệnh, năm 2004 các mẫu nước ngâm dây máy hút, rửa tay, nước tắm bé lấy từ sô đựng nước của cả 2 bệnh viện (nước cất dùng làm ẩm bình ôxy, ngâm dây thở, hút đàm) đều bị nhiễm P. aeruginosa và Pseudomonas sp. Hai loại vi khuẩn gây bệnh trong mẫu nước chủ yếu là P. aeruginosa (71,4%) và trực khuẩn đường ruột gram âm (28,6%) [4]. Trong một nghiên cứu của Lê Bảo Huy và cộng sự [5], tác nhân gây bệnh viêm phổi bệnh viện chủ yếu là vi khuẩn Gram âm chiếm 86,15% trong đó P. aeruginosa chiếm 41,15%. Vi khuẩn này đã đề kháng cao đối với những kháng sinh chuyên trị và hay dùng ở Việt Nam (nhất là các khoa ICU: khoa điều trị tích cực): imipenem (66,7%), ticarcillin/a.clavulanic (45%), ceftazidime (74,1%), cefepime (77,8%), ciprofloxacin (96,3%). 2.2.2. Thế giới A. Lateef (2005), khảo sát tính kháng thuốc của vi khuẩn trên các mẫu bệnh phẩm, thực phẩm, nước uống cho thấy: P. aeruginosa được tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm, dược phẩm, đất bị nhiễm dầu, nước (nước sông, nước giếng và nước máy). Kết quả: 3,46% P. aeruginosa phân lập từ đất đề kháng với 5 loại kháng sinh. Trong bệnh phẩm, 7,69% đề kháng 6 loại kháng sinh, 30,77% đề kháng 7 loại 7 kháng sinh, 23,1% đề kháng với 8 loại kháng sinh (ampicillin, chloramphenicol, cloxacillin, erythromycin, penicillin, tetracycline, streptomycin, gentamicin). Trong dược phẩm, loại vi khuẩn này cũng có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh từ 2, 4 đến 8 loại kháng sinh khác nhau (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cotrimoxazole, nalidixic acid, ofloxacin, nitrofurantoin). Trong nước, 6,7% P. aeruginosa kháng lại 4 loại kháng sinh, 8,5% kháng với 5 loại kháng sinh (augmentin, amoxycillin, tetracycline, cloxacillin, cotrimoxazole) [26]. Ngoài ra, một số nghiên cứu khác trên bệnh phẩm cũng cho thấy khả năng đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa khá cao. Gales A. C. (1997-1999), 6631 P. aeruginosa được phân lập chủ yếu trên bệnh nhân viêm đường hô hấp tại 3 vùng khác nhau (Châu Âu, Cannada, Châu Mỹ Latin). Trong đó 218 mẫu P. aeruginosa đa kháng thuốc – đề kháng với nhiều loại kháng sinh thông dụng (piperacillin, ceftazidime, imipenem, and gentamicin), với tỉ lệ 8,2% ở Châu Mỹ Latin, 0,9% ở Cannada [24]. Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2 (2004), nghiên cứu P. aeruginosa trên những bệnh nhân bị nhiễm trùng vết thương thấy rằng: tỉ lệ P. aeruginosa xâm nhiễm vào phụ nữ cao hơn đàn ông (tỉ lệ 3 : 2) và tìm thấy nhiều hơn trên các bệnh nhân là trẻ em và người già. Khảo sát tính nhạy cảm kháng sinh của 20 chủng P. aeruginosa phân lập được cho thấy tính nhạy cảm của vi khuẩn này với một số kháng sinh, tỉ lệ là colistin (100%), gentamicin (75%), streptomycin (30%), và tetracycline (10%) [34]. Theo nhiều tác giả, fosfomycin là một kháng sinh rất hữu hiệu trong điều trị các nhiễm trùng do P. aeruginosa gây ra. Đặc biệt, fosfomycin có hiệu quả khi kết hợp với các kháng sinh như oxfloxacin [31][32]. 8 2.3. Tổng quan các vi sinh vật. 2.3.1. Coliforms và Coliform fecal  Định nghĩa Đối với các mục đích kiểm tra nước hằng ngày, nhóm vi khuẩn Coliform có thể được mô tả bằng các thuật ngữ vi sinh chung, không mang tính phân loại học, như sau: Các vi khuẩn Coliforms là các vi khuẩn hình que (dạng thẳng), Gram âm, không có bào tử, oxidase âm tính. Chúng có khả năng sinh trưởng hiếu khí và kỵ khí không bắt buộc trong sự có mặt của muối mật (hoặc các yếu tố tác động bề mặt khác có đặc tính ức chế sinh trưởng tương tự). Chúng có thể lên men lactoza kèm theo sự tạo thành acid, gas và andehyd trong vòng 48 giờ khi nuôi cấy ở nhiệt độ từ 35 0C đến 370C. [12], [15] Các vi khuẩn Coliform fecal là các vi khuẩn Coliform cho thấy có cùng khả năng lên men và các đặc tính sinh hóa khi nuôi cấy ở nhiệt độ từ 440C đến 44,50C. E.coli là Coliform fecal cho kết quả thử nghiệm IMViC là (+ + - -) dùng để phân biệt với Aerobacter.  Sự phân bố và khả năng gây bệnh Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Coliforms được xem là vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng khi số Coliforms của nước cao thì khả năng hiện diện của vi sinh vật gây bệnh khác cũng cao. Coliform fecal là thành phần của hệ vi sinh vật đường ruột ở người và động vật máu nóng khác dùng để chỉ sự ô nhiễm phân trong mẫu môi trường hoăc trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước uống. E. coli là loại vi khuẩn thường trú trong đường ruột động vật và người. Bình thường, chúng là vi khuẩn thuộc hệ sinh thái ruột không gây bệnh, chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của người và động vật yếu. Chúng gây ngộ độc cho người khi ăn phải thức ăn hoặc thức uống bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn, vi khuẩn theo thức ăn vào ruột và tiết ra độc tố thấm vào máu và gây ngộ độc. Biểu hiện thường là tiêu chảy, 9 sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, nặng hơn là viêm dạ dày. Đặc biệt là gây tiêu chảy ở trẻ em < 5 tuổi. Ngoài ra, E. coli còn gây nhiễm bộ phận niệu sinh dục, viêm màng bụng, nhiễm trùng huyết ở người. 2.3.2. Liên cầu khuẩn nguồn gốc từ phân (Streptococcus fecalis)  Đặc điểm vi sinh vật học [15] Steptococcus fecalis là các liên cầu khuẩn, có hình cầu hay hình oval kéo dài, thường tụ tập thành từng đôi hay từng chuỗi, không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhày, bắt màu Gram dương. Những đặc tính bẩm sinh cho phép chúng sinh trưởng và sống sót trong những môi trường khắc nghiệt và tồn tại lâu dài trong môi trường tự nhiên. S. fecalis được tìm thấy ở khắp nơi trong đất, nước, thực phẩm, thực vật và động vật bao gồm các loài thú, chim và côn trùng. Ở người, chúng cư ngụ chủ yếu trong đường tiêu hóa và rất ít hiện diện ở các vị trí khác như đường sinh dục, khoang miệng. Hầu hết các loài này sống hiếu khí tuỳ ý, nhưng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí, tiết bacteriocin trong quá trình tăng trưởng và có thể ức chế sự tăng trưởng của các vi sinh vật khác. S. fecalis được xem như là vi khuẩn chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm.  Tính chất sinh hóa [15] Các loài này không có catalase, không có các cytochrome c (nên thử nghiệm oxidase âm tính). Có thể phát triển được trong môi trường có chứa muối mật, muối azide natri, pH 9,6 ở nhiệt độ 450C. Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh acid từ mannitol và sucrose, nhưng không lên men được sorbose và arabinose, có khả năng chuyển hóa một số acid amin thành dạng pyruvate và phân giải được arginine. 10  Tính chất nuôi cấy Khi được nuôi cấy trong môi trường azide natri chứa triphenyl tetrazolium chloride (TTC), khuẩn lạc S. fecalis có màu hồng đến màu đỏ đậm do sự khử triphenyl tetrazolium chloride. S. fecalis có khả năng sinh trưởng trong môi trường azide natri, lên men glucose sinh acid làm biến đổi màu của chất chỉ thị pH trong môi trường. Môi trường khẳng định được sử dụng là Bile Esculine Agar, S. fecalis thủy phân esculine trong môi trường tạo ra sản phẩm cuối cùng là 6,7-hydroxycourmarin, chất này kết hợp với Fe3+ tạo thành hợp chất có màu nâu đen khuếch tán vào môi trường [18].  Khả năng gây bệnh Mặc dù S. fecalis có thể gây ra nhiễm trùng trong cộng đồng và bệnh viện, nhưng phải đến sau những năm 1970 vi khuẩn này mới được biết đến như một tác nhân nhiễm trùng bệnh viện mắc phải, cùng với nó là sự gia tăng tính đề kháng với các kháng sinh đương thời được sử dụng. Vi khuẩn trên trở thành tác nhân phổ biến đứng hàng thứ hai gây ra nhiễm khuẩn đường tiết niệu và nhiễm trùng vết thương. Một số nghiên cứu cho thấy loại vi khuẩn này cũng là nguyên nhân của viêm màng trong tim. Nhiễm trùng hô hấp hay hệ thần thần kinh trung ương cũng như viêm khớp, hạch, viêm xoang có thể do S. fecalis gây ra nhưng rất hiếm gặp [28]. 2.3.3. Vi khuẩn kỵ khí khử sunphite (Clostridium)  Đặc điểm vi sinh vật học Giống Clostridium là các vi khuẩn Gram dương, hình que, kỵ khí, sinh bào tử, phần lớn di động. Clostridium thuộc nhóm ưa nhiệt vừa, tuy nhiên có một số ưa nhiệt và một số ưa lạnh. Clostridium có thể thuỷ giải saccharide và protein trong các hoạt động thu nhận năng lượng. Những loài thủy giải saccharide có thể lên men các loại đường polysaccharide tạo thành acetic acid, butyric và rượu. Nhiều loài có thể thủy giải protein và chuyển hóa không hoàn toàn các acid amin tạo thành mùi rất khó chịu trong sản phẩm [2][15]. 11  Khả năng gây bệnh Người ta nhận biết được hơn 60 chủng loại Clostridium, trong đó nhiều loại nói chung được coi là khuẩn hoại sinh. Một số loài trong nhóm này gây bệnh cho người và động vật đặc biệt trong điều kiện thế năng khử oxy bị giảm sút, một số khác gây hư hỏng thực phẩm, khử sulphite thành sulphur tạo màu đen và gây mùi khó chịu. Các loại khuẩn này gây ra những nhiễm khuẩn kể từ những ô nhiễm vết thương khu trú đến bệnh lan tràn toàn thân. Các loài gây ngộ độc thực phẩm quan trọng là: C. botulinum và C. perfringens. C. botulinum Đây là vi sinh vật phân bố khắp nơi trong đất, nước, gia súc và các loại thủy sản. Loài này sinh độc tố gây bệnh ngộ độc thịt cho người (botulism). Bệnh gây ra do độc tố được hình thành bởi C. botulinum nhiễm trong thực phẩm. Các loại thực phẩm như thịt, rau quả không được bảo quản đúng quy định hay lây nhiễm từ đất, phân động vật hay do chế biến không đủ nhiệt độ trước khi dùng, các sản phẩm đóng hộp không đúng quy cách cũng có nguy cơ nhiễm vi sinh vật này. Độc tố botuline do C. botulinum tiết ra gồm 8 typ độc tố khác nhau A, B,C1, C2, D, E, F và G. Tất cả chúng đều là độc tố thần kinh rất mạnh (trừ C2 là loại độc tố tế bào), là những protein có trọng lượng phân tử lớn khoảng 1 triệu dalton. Trong những năm gần đây, các vụ ngộ độc botulism gây ra do C. botulinum dòng E thường được phát hiện khi tiêu thụ cá và các sản phẩm thủy sản. Một số biểu hiện do ngộ độc C. botulinum: - Ngộ độc C. botulinum do thức ăn: Sau khi tiêu hóa thực phẩm nhiễm độc tố, bệnh phát sinh rất khác biệt từ mức nhẹ không cần can thiệp y tế đến mức rất nặng gây tử vong trong vòng 24 giờ. Triệu chứng lâm sàng của bệnh là ói mửa, buồn nôn, sau đó có những biểu hiện rối loạn thần kinh như choáng váng, rối loạn thị giác, rối loạn các cơ ở cổ và miệng, đau ở vùng ngực, khó thở và tê liệt, có thể dẫn đến tử vong. - Ngộ độc C. botulinum qua vết thương: Khi vết thương bị nhiễm nha bào C. botulinum thì các bào tử đó có thể kết đôi và sinh trưởng tạo ra độc tố. 12 - Ngộ độc C. botulinum ở trẻ em và người lớn: Độc tố tạo ra và hấp thụ trong ruột của trẻ sau khi các bào tử đã bị tiêu hóa. Mức độ nghiêm trọng có thể gây liệt nặng kèm suy hô hấp và có thể gây chết đột ngột cho trẻ nhỏ. C. perfringens Nhưng trong những năm gần đây không chỉ các dòng C. perfringens kháng nhiệt, tạo bào tử và không làm tan máu mới có thể gây ngộ độc thực phẩm mà các dòng nhạy cảm với nhiệt, không làm tan máu cũng được tìm thấy trong các vụ ngộ độc do vi sinh vật này gây nên. Khi đun nấu thức ăn ở nhiệt độ thấp và thời gian ngắn có thể làm cho các dòng kháng nhiệt tồn tại vì thế chúng sẽ gây tái nhiễm sau khi bảo quản. Các nguồn thực phẩm có thể gây ngộ độc với các vi sinh vật này thường là thịt gia cầm, nhất là các loại gia cầm lớn đông lạnh sâu, thịt trong các hầm chứa. C. perfringens cũng được tìm thấy trong đất, trong phân người và trong các loại thực phẩm khác. Một số biểu hiện do ngộ độc C. perfringens: - Những bệnh đường ruột: + Nhiễm độc thức ăn: Thông thường bệnh phát sinh do có vấn đề trong việc giữ thức ăn nguội và lưu trữ cả khối lượng lớn thức ăn nấu chín. Nguồn thực phẩm hay bị dính phải là thịt, các sản phẩm từ thịt và gia cầm. Những triệu chứng chủ yếu là đau vùng thượng vị, buồn nôn và tiêu chảy trong khoảng thời gian 12 đến 24 giờ. + Viêm tiểu tràng hoại tử: do những chủng typ C của C. perfringens gây ra. Biểu hiện của bệnh thường là đau bụng cấp, tiêu chảy có lẫn máu, nôn, choáng và viêm phúc mạc. - Nhiễm khuẩn mô sâu làm mủ. - Nhiễm khuẩn da và mô mềm . - Vi khuẩn huyết gồm có vi khuẩn huyết nhất thời và nhiễm trùng huyết. 13 C. tetani Là loài kỵ khí bắt buộc, bị chết ngay khi tiếp xúc với không khí. Thường được tìm thấy trong đất, trong phân các loài động vật và người. Là loài gây bệnh uốn ván rất nguy hiểm. Sự sản sinh vi khuẩn và độc tố chỉ diễn ra nơi các vết thương có các quá trình oxy hóa khử ở mức thấp, chẳn hạn như những vết thương có chứa các mô tế bào đã mất sức sống, các dị vật hoặc nhiễm trùng đang hoạt động. C. tetani bản thân nó không gây ra viêm. Tuy nhiên, các bào tử của nó có thể tồn tại hàng năm trong một số môi trường với đủ loại thuốc khử trùng và không bị diệt khi đun sôi 20 phút. 2.3.4. Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa trước đây là Bacterium aeruginosa do Schroeter mô tả vào năm 1872, đến năm 1900 Migula chuyển chúng sang giống Pseudomonas, từ đó vi khuẩn mang tên Pseudomonas aeruginosa (Psedes: tiếng Hy Lạp: giả; monas: tiếng Hy Lạp: đơn vị; aeruginosa: gỉ đồng) thường được gọi là trực khuẩn mủ xanh [43].  Sự phân bố P. aeruginosa phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, trên bề mặt động thực vật, đặc biệt là những nơi môi trường ẩm ướt chúng sinh sôi và phát triển rất mạnh. Trong tự nhiên người ta tìm thấy chúng trên bề mặt nhiều loại rau quả, trên cơ thể và phân một số động vật. Trong cơ thể người, P. aeruginosa hiện diện thường xuyên trong đường tiêu hóa và một số nơi ẩm ướt trong cơ thể như da, niêm mạc, vùng dưới cánh tay, … Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh trưởng trong các môi trường hạn chế sự có mặt của các vi sinh vật khác như chất khử trùng, thuốc mỡ, xà phòng, nước cất, …  Hình thái P. aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí Gram âm, hình dạng thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, 2 đầu tròn, kích thước 0,5-1 µm x 1,5-5 µm. Có một lông duy nhất ở 1 cực, các pili của chúng dài khoảng 6 nm, là nơi tiếp nhận nhiều loại 14 phage và giúp vi khuẩn gắn vào bề mặt của tế bào vật chủ. P. aeruginosa là loài không sinh bào tử.  Đặc điểm nuôi cấy Vi khuẩn mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí tuyệt đối. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 370C, phát triển được ở nhiệt độ 50C- 42 0C, pH thích hợp là 7,2-7,5 (có thể chịu được pH từ 4,5-9). Trên môi trường đặc thường có 2 loại khuẩn lạc: một loại to, dẹt, nhẵn, trung tâm hơi lồi; một loại nhỏ, xù xì, lồi.  Sắc tố Tính chất đặc trưng của loại vi khuẩn này là sinh sắc tố và chất thơm. Có 2 loại sắc tố chính: pyocyanin có màu xanh lam tan trong nước và chlorofoc làm cho môi trường nuôi cấy và khuẩn lạc có màu xanh, pyoverdin là sắc tố phát huỳnh quang tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc. Chất thơm do trực khuẩn sinh ra là Kimetylamin [18]. Có khoảng 10% P. aeruginosa không sinh sắc tố. Trong những trường hợp này chẩn đoán vi khuẩn học gặp nhiều khó khăn. Người ta phải dùng các môi trường tăng sinh sắc tố: môi trường King A (tăng sinh pyocianin) và môi trường King B (tăng sinh pyoverdins).  Đặc điểm sinh hóa P. aeruginosa có đủ các cytochrom (b, c, a và oxidase) trong hệ thống vận chuyển điện tử. Trong thực hành người ta thường dùng “oxidase test” để tìm sự có mặt của cytochrom oxidase. Các tính chất sinh hóa thường sử dụng trong lâm sàng gồm: urease (-), indol (-), H2S (-); citrat Simmon, agrinin dihydrolase và gelatinase (+); khử NO3 - thành N2. Trên môi trường OF (Oxidation-Fermentation) nhiều loại carbohydrat bị thoái hóa theo lối oxy hóa có sinh acid: glucose, mannitol, glycerol, ethalnol, arabinose, fructose và galactose. 15  Khả năng đề kháng Chết nhanh chóng ở 1000C; trong môi trường ẩm, thoáng và không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu; 50C, chúng sống được hơn 6 tháng.  Kháng nguyên Kháng nguyên O chịu nhiệt, bản chất hóa học là lipopolysaccharid (LPS), dựa vào kháng nguyên này người ta chia P. aeruginosa thành 12 nhóm. Kháng nguyên H không chịu nhiệt, là kháng nguyên lông. Vì khó khăn trong việc điều chế, nên việc định týp huyết thanh dựa trên kháng nguyên này chưa được áp dụng rộng rãi.  Khả năng gây bệnh P. aeruginosa là loại vi khuẩn gây bệnh có điều kiện như khi cơ thể bị suy giảm miễn dịch, bị bệnh ác tính hoặc mạn tính, khi dùng corticoid lâu dài, việc sử dụng kháng sinh tùy tiện, việc sử dụng các dụng cụ thăm khám hoặc các vết bỏng, vết thương hở,…. Chúng có thể gây ra nhiêu bệnh khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đường hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng đường máu, đường tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xương, viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mô mềm, … [15]. P. aeruginosa xâm nhiễm vào trong mắt thường gây ra những tổn thương giác mạc, sự nhiễm này thường liên quan đến việc sử dụng kính sát tròng [23]. Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu tại Viện Mắt trong vòng khoảng 20 nǎm trở lại đây, P. aeruginosa đã vượt lên với trên 70% các trường hợp xét nghiệm vi khuẩn dương tính trong viêm loét giác mạc do vi khuẩn. Hiện nay, vi khuẩn này là nguyên nhân hàng đầu gây viêm loét giác mạc sau chấn thương nông nghiệp[15]. Các bệnh nhân nằm viện bị mắc các chứng bệnh về tim mạch, tiểu đường hay bị các u ác tính bị sốc do nhiễm trùng máu thường có tỉ lệ tử vong khá cao. Tác nhân thường gặp là P. aeruginosa chiếm từ 5% đến 50% so với các tác nhân vi khuẩn khác. 16 P. aeruginosa dẫn đầu trong các tác nhân nhiễm trùng hô hấp bệnh viện, đặc biệt đối với những bệnh nhân có hỗ trợ các máy thông khí, khả năng bị viêm phổi cao gấp 20 lần và tỉ lệ tử vong cao. Một số nghiên cứu còn cho thấy P. aeruginosa giữ vai trò gây bệnh trong giai đoạn đầu và cuối của bệnh đái tháo đường [23]. Loài này còn là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Tính kháng thuốc thường được quy định bởi các plasmid và các yếu tố di truyền này có thể được lan truyền trong quần thể thông qua hiện tượng biến nạp và tải nạp tạo ra những dạng đột biến kháng thuốc mới. P. aeruginosa hiện kháng với rất nhiều loại kháng sinh nên việc làm kháng sinh đồ trước khi điều trị là cần thiết [15]. 2.4. Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn 2.4.1. Thuốc kháng sinh 2.4.1.1. Định nghĩa Kỷ nguyên hiện đại của hóa trị liệu kháng khuẩn được bắt đầu từ việc tìm ra sulfonamid (Domagk, 1936) “Thời kỳ vàng son” của kháng sinh bắt đầu từ khi sản xuất penicillin để dùng trong lâm sàng (1941). Khi đó, “kháng sinh được xem là những chất do vi sinh vật tiết ra (vi khuẩn, vi nấm), có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn khác”[3][4]. Về sau, với sự phát triển của khoa học, người ta đã có thể: Tổng hợp, bán tổng hợp các kháng sinh tự nhiên (cloramphenicol). Tổng hợp nhân tạo các chất có tính kháng sinh: sulfamid, quinolon. Chiết xuất từ vi sinh vật những chất diệt được tế bào ung thư (actinomycin). Vì thế định nghĩa kháng sinh đã được thay đổi: “Kháng sinh là những chất do vi sinh vật tiết ra hoặc những chất hóa học bán tổng hợp, tổng hợp, với nồng độ rất thấp, có khả năng đặc hiệu kìm hãm sự phát triển hoặc diệt được vi khuẩn”. 2.4.1.2. Phân loại Một số thuốc kháng sinh có cấu trúc hóa học giống nhau, do đó chúng có chung cơ chế tác động và hoạt phổ tương tự nhau. Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như sau: 17 Nhóm -lactam: penicillin, ampicillin, cephalosporin, … Nhóm tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, … Nhóm phenicol: chloramphenicol, thamphenicol, … Nhóm aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, amikacin , … Nhóm macrolides: tylosin, spiramycin, … Nhóm kháng sinh gần gũi với macrolides: lycomycin, virginiamycin, … Nhóm polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin,… Nhóm sulfamides: sulfamethoxazol, sulfadimidin, … Nhóm quinolones: oxfloxacin, ciprofloxacin, … Ngoài ra còn có một số nhóm khác như glycopeptid, nitrofuran, … Bên cạnh việc phân loại theo cấu trúc hóa học, ta cũng có thể phân loại kháng sinh theo tác động kháng khuẩn: Nhóm kháng sinh kiềm khuẩn: tetracylin, macrolid, phenicol, sulfamid, … Nhóm kháng sinh diệt khuẩn: -lactam, amynosid, quynolones, polypeptid,… 2.4.1.3. Cơ chế tác động Ức chế tổng hợp vách tế bào: gồm các kháng sinh: penicillin, cephalosporins, bacitracin, vancomycin, … Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào. Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của thuốc kháng sinh, các vi khuẩn Gram dương biến thành dạng hình cầu không có vách và vi khuẩn Gram âm có vách không hoàn chỉnh. Những hình thức này làm cho tế bào bị vỡ trong điều kiện có trương lực bình thường. Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào: gồm nhóm thuốc chống nấm: colistin, imidazol, polymycin, nistatin, amphotericin B, … Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất. Màng này được xem như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, thực hiện chức năng vận chuyển chủ động và như vậy kiểm soát các thành phần ở bên 18 trong tế bào. Nếu sự toàn vẹn chức năng của màng tế bào chất bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát ra khỏi tế bào làm tế bào chết. Ức chế tổng hợp protein: gồm các họ chloramphenicol, tetracyclines, lincomycins, … Vi khuẩn có ribosom 70 S, gồm 2 đơn vị là 30 S và 50 S. Kháng sinh có thể gắn lên các đơn vị này để ngăn cản sự tạo thành polysom trong dịch mã. Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép DNA (nhóm quinolones), ức chế sao mã RNA (nhóm rifampicin) và ức chế tổng hợp các nucleotid (nhóm sulfamid và trimethoprim). 2.4.2. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Trong cuộc cạnh tranh giữa sự phát triển kháng sinh mới với sự đề kháng mới của vi sinh vật, thì cho đến nay vi sinh vật vẫn chiếm ưu thế. Quá trình này được thúc đẩy mạnh, nếu thiếu sự hiểu biết và sử dụng thuốc sai trong điều trị. Có hai dạng đề kháng: đề kháng giả và đề kháng thật. 2.4.2.1. Đề kháng giả Khi hệ thống miễn dịch của cơ thể suy giảm (do dùng corticoid, tia xạ, …) hoặc chức năng của đại thực bào bị hạn chế (ví dụ ở ổ mủ), thì cơ thể không đủ khả năng loại trừ được những vi khuẩn đã bị kháng sinh ức chế ra khỏi cơ thể. Khi vi khuẩn tự đề kháng: Ở trạng thái nghỉ (không nhân lên, không chuyển hóa do thiếu oxy, pH thay đổi …), vi khuẩn không chịu tác dụng của kháng sinh. Khi có vật cản, tuần hoàn ứ trệ, kháng sinh không thấm tới ổ viêm thì vi khuẩn cũng tỏ ra đề kháng. 2.4.2.2. Đề kháng thật  Đề kháng tự nhiên: Một số loại vi khuẩn luôn luôn không chịu tác dụng của một số kháng sinh. Ví dụ P. aeruginosa kháng với penicillin G, tụ cầu không chịu tác dụng của colistin. Một số vi sinh vật không có vách như Mycoplasma không chịu tác dụng của các kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách như penicillin, cephalosporin, vancomycin. 19  Đề kháng thu được: Do biến cố di truyền mà vi khuẩn từ chỗ không có trở thành có gen đề kháng. Đột biến gen: Biến cố này có thể xảy ra trước hoặc sau khi tiếp xúc với kháng sinh. − Đột biến một bước: Mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao. − Đột biến nhiều bước: Mức độ đề kháng có liên quan đến mức độ kháng sinh. Trong trường hợp này, kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) sẽ cao hơn lần trước. Gen đề kháng sau khi xuất hiện sẽ lan truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Nhận gen đề kháng: Gen đề kháng có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức vận chuyển chất liệu di truyền như sau: − Tiếp hợp: Hai vi khuẩn tiếp xúc nhau và truyền cho nhau gen đề kháng. − Biến nạp: Khi vi khuẩn đề kháng bị ly giải, giải phóng các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào tế bào vi khuẩn khác. − Tải nạp: Phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. 20 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2007 đến tháng 07 năm 2007 tại Phòng vi sinh thực phẩm – Khoa LAM – Viện Pasteur Tp. HCM. 3.2. Vật liệu Nhóm 1: nước uống đóng chai Nhóm này gồm 2 loại: nước uống tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nhóm 2: nước uống xử lý: nước uống được xử lý không theo quy trình công nghiệp khép kín, nước nguồn có thể là nước giếng hoặc nước máy được lọc bằng các máy lọc nước thông thường hoặc bằng cách đun sôi. Nhóm này gồm các loại: nước uống trường học, nước uống gia đình, nước uống công ty được khách hàng mang đến viện Pasteur phân tích. Ngoài ra, được xếp vào nhóm này còn có các mẫu nước được chúng tôi lấy từ các bình lọc nước uống trong các bệnh viện trong thành phố. 3.3. Thiết bị, hóa chất và môi trƣờng 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ Tủ sấy để khử trùng khô và một nồi hấp áp lực. Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 350C ± 0,50C hoặc ở 37 0C ± 0,50C. Tủ ấm hoặc nồi cách thủy kiểm tra được nhiệt độ 440C ± 0,250C hoặc ở 44,50C ± 0,250C. Bình ủ kỵ khí. pH mét, nhiệt kế. Dụng cụ lọc màng. Đèn UV. Kẹp để giữ màng lọc, găng tay. 21 Màng lọc thông thường có đường kính 47mm hoặc 50mm, có đặc tính lọc tương đương với lỗ có đường kính định danh là 0,45µm, nếu chưa được khử trùng thì phải khử trùng theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phiến kính và lá kính. Pipette Pasteur, pipette 2ml, 5ml. Đĩa petri. 3.3.2. Hóa chất Cồn Nước cất, nước nuối sinh l ý Thuốc thử oxidase, Kovac’s, Nessler, oxy già (H2O2) 3.3.3. Môi trƣờng Sử dụng các môi trường, thuốc thử và hóa chất của hãng Biorad, thành phần môi trường xem thêm chi tiết ở phụ lục B. Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Nước pepton lactoza Nước trypton Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Thạch mật asculin-nitrua Thạch sunphit triptoza Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường King’s B Thạch dinh dưỡng Canh thang acetamide Thạch Mueller-Hinton 22 Hình 3.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với 3 vị trí đặt màng Hình 3.2: Thiết bị hỗ trợ việc đếm khuẩn lạc và đọc kết quả kháng sinh Hình 3.3: Bình ủ kỵ khí 23 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Áp dụng theo TCVN 5992-1995 (ISO 5669-2:1991) [11]  Nguồn gốc mẫu thí nghiệm: Nước uống đóng chai: nước tinh khiết và nước khoáng thiên nhiên. Nước uống xử lý: nước uống công ty, nước uống trường học, nước uống bệnh viện, nước uống gia đình.  Quá trình lấy mẫu: Sát trùng bên ngoài vòi nước, mở vòi cho nước chảy một lúc rồi hứng vào các chai đựng. Dụng cụ chứa nước là các chai thủy tinh có thể tích 1,25 ml được vô trùng trước khi lấy mẫu. Lấy mẫu xong phải đậy kín bình chứa rồi nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm và lọc ngay trong ngày. Nếu để sang ngày hôm sau phải được trữ trong tủ mát ở nhiệt độ 40C. 3.4.2. Xử lý số liệu Từ các kết quả phân lập vi khuẩn của nước uống đóng chai và nước uống xử lý, chúng tôi xử lý số liệu theo thống kê mô tả. Tiếp theo các kết quả về tỉ lệ phần trăm khác biệt được phân tích về mặt ý nghĩa thống kê với P < 0,05 bằng phép kiểm 2 test. Tính đề kháng kháng sinh của P. aeruginosa cũng được phân tích sự khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê theo nhóm (nước uống đóng chai hoặc nước uống xử lý). Trong trường hợp mẫu nhỏ, phép kiểm sẽ được xử lý hiệu chỉnh Yates. 24 3.4.3. Đánh giá kết quả Chỉ tiêu vi sinh vật kiểm tra áp dụng theo TCVN 6096:2004 [1] + Đọc kết quả: Trong một chỉ tiêu, nếu số vi khuẩn hiện diện ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai. Nếu số vi khuẩn ≥ 2 thì coi như chỉ tiêu đó không đạt tiêu chuẩn. + Biện giải kết quả: Nếu một mẫu bị vi phạm bất cứ chỉ tiêu nào trong các chỉ tiêu trên thì đều không đạt tiêu chuẩn vi sinh. Kiểm tra lần đầu Giới hạn Coliforms tổng số 1x250 ml Không được phát hiện trong bất kỳ mẫu nào Nếu ≥ 1 hoặc ≤ 2 thì tiến hành kiểm tra lần thứ hai Nếu ≥ 2 thì loại bỏ Coliform fecal hoặc E. coli 1x250 ml Streptococcus fecalis 1x250 ml Pseudomonas aeruginosa 1x250 ml Bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphite 1x50 ml 25 3.4.4. Phƣơng pháp thử nghiệm vi sinh vật 3.4.4.1. Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và Escherichia coli giả định Áp dụng theo TCVN 6187-1:1996; ISO 7899-2:1990(E) [12].  Nguyên tắc Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc trên môi trường nuôi cấy thạch lactoza chọn lọc hoặc một miếng đệm hấp thụ bão hòa bằng môi trường lỏng chọn lọc chứa lactoza. Nuôi cấy màng lọc trong 24 giờ ở nhiệt độ 350C hoặc 370C để phát hiện vi khuẩn Coliform, hoặc ở 440C để phát hiện Coliform fecal. Đếm trực tiếp các khuẩn lạc đặc trưng được hình thành trên màng; cấy chuyển các khuẩn lạc đặc trưng để thử nghiệm xác định khả năng sinh khí và sinh indol. Tính toán số vi khuẩn Coliform, Coliform fecal và E. coli giả định có trong 250 ml mẫu.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch lactoza TTC với Tegitol 7 Môi trường khẳng định: Môi trường để kiểm tra sự sinh khí: Nước pepton lactoza Môi trường để kiểm tra sự sinh indol: Nước trypton Môi trường ống đơn để kiểm tra sự sinh khí và indol: Canh thang manitol lauryl trypto với tryptophan Thuốc thử: Thuốc thử Kovac’s để thử indol Thuốc thử oxidase dùng cho phép thử oxidase 26  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.1: Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform fecal và E. coli giả định Lactose TTC + Tergitol 7 - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Lactose TTC + Tergitol 7 Ủ (37 ± 0,5)0C/18-24 giờ - Nước pepton lactoza (sinh gas) - Thạch dinh dưỡng(thử oxidase) - Nước trypton (sinh indol) Ủ 370C/ 48 giờ Ủ 440C/ 24 giờ - Pepton lactoza sinh gas (+) - Thử oxidase (-) Coliforms tổng số - Thử indol (+) E.coli giả định Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliforms Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (vàng, da cam hoặc đỏ gạch) Chọn khuẩn lạc điển hình/mỗi loại khuẩn lạc cấy sang một môi trường xác định Coliform fecal và E.coli Ủ(44 ± 0,25)0C/18-24 giờ Coliform fecal 27 3.4.4.2. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân (Streptococcus fecalis) Áp dụng theo TCVN 6189-2:1996; ISO 7899-2:1984(E) [13].  Nguyên tắc Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc chứa natri nitrua (để ngăn sự sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm) và 2,3,5- triphenyltetrazoli chlorua liên cầu phân sẽ khử thuốc nhuộm không màu thành focmazan màu đỏ. Sau khi nuôi cấy, tất cả khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hạt dẻ hoặc màu hồng toàn bộ khuẩn lạc hoặc từ trung tâm, toàn bộ các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định. Môi trường khẳng định, thạch mật asculin-nitrua, được nuôi trong 48 giờ ở nhiệt độ 440C. Liên cầu phân phát triển trong môi trường này và thủy phân asculin, sản phẩm cuối cùng, 6,7-dihydroxycourmarin sẽ kết hợp với ion Fe3+ cho hợp chất màu nâu vàng tới đen và khuếch tán vào môi trường. Ngoài ra, tiến hành một phép thử catalase đối với các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường khẳng định. Những khuẩn lạc cho phản ứng asculin dương tính và catalase âm tính thì có thể xem là liên cầu phân.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Môi trường m-enterococcus (Slanetz và Bartley) Môi trường khẳng định: Thạch mật asculin-nitrua Thuốc thử catalase: Hydropeoxit dung dịch 30g/l 28  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.2: Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân Streptococcus fecalis Ủ 370C/ 24h SLANTZ & BARTLEY Ủ (37 ± 1)0C/ (44 ± 4)h Đếm các khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và cấy chuyển các khuẩn lạc điển hình sang môi trường Thạch dinh dưỡng Thạch mật asculin – nitrua (BEA) Ủ(44 ± 0,5) 0 C / 48h Thử catalaza (-) Xuất hiện khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hoặc đen Liên cầu phân 29 3.4.4.3. Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clostridium) Áp dụng theo TCVN 6191-2:1996; ISO 6461-2:1986(E) [14].  Nguyên tắc Lựa chọn các bào tử Chọn lọc các bào tử có trong mẫu bằng cách đun nóng trong một khoảng thời gian (80 0C trong 10 phút) đủ để tiêu diệt các vi khuẩn dinh dưỡng. Lọc qua màng và nuôi cấy Lọc mẫu nước qua màng lọc có kích thước lỗ sao cho các bào tử vi khuẩn (0,2 m) được giữ lại trên màng lọc. Đặt màng lọc vào môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định (thạch sắt sunphit), tiếp theo ủ ở 370C ± 10C trong 20 ± 4 giờ và 44 ± 4 giờ và đếm các khuẩn lạc có màu đen.  Môi trường nuôi cấy Thạch sunphit triptoza  Cách tiến hành Lọc thể tích nhất định (50 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,2 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.3: Phát hiện và đếm số bào tử kỵ khí khử sunphite (Clotridium) Thạch - sunphit - tryptoza Ủ (37 ± 1)0C/(20 ± 4)h và (44 ± 4)h (Ủ trong điều kiện kỵ khí) Đếm các khuẩn lạc màu đen Bào tử vi khuẩn kỵ khí sunphit (Clostridium) 30 3.4.4.4. Phát hiện và đếm vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Áp dụng theo ISO 16266:2006(E) [15].  Nguyên tắc Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ (0,45 µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn. Màng lọc được đặt trên môi trường chọn lọc và nuôi cấy trong điều kiện thích hợp. Sau khi ủ đếm các khuẩn lạc P. aeruginosa giả định trên màng lọc. Các khuẩn lạc tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là P. aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc khác không tạo màu xanh mà lại phát huỳnh quang dưới đèn UV hoặc có màu nâu đỏ cũng yêu cầu khẳng định. Cấy chuyển các khuẩn lạc cần khẳng định trên màng lọc sang môi trường thạch dinh dưỡng. Sau khi ủ, các khuẩn lạc ban đầu không phát huỳnh quang được thử phản ứng oxidase và các khuẩn lạc có oxidase dương tính được thử khả năng tạo sắc tố và tạo amoniac từ acetamide, các khuẩn lạc ban đầu phát huỳnh quang được thử khả năng tạo amoniac từ acetamide.  Môi trường nuôi cấy Môi trường phân lập: Thạch Pseudomonas / thạch CN Môi trường khẳng định: Môi trường King’s B Canh thang acetamide Thạch dinh dưỡng Thuốc thử: Thuốc thử oxidase Thuốc thử Nessler 31  Cách tiến hành Lọc một lượng xác định (250 ml) mẫu thử qua màng lọc (0,45 µm) Đặt màng lọc lên đĩa thạch. Sơ đồ 3.4: Phát hiện và đếm vi khuẩn P. aeruginosa Nhỏ 1-2 giọt thuốc thử Nessler (mt chuyển màu vàng  đỏ gạch) Khuẩn lạc tạo màu xanh da trời/ xanh lá cây (pyocyanin) Đếm tất cả Thạch CN Khuẩn lạc không tạo màu xanh Kiểm tra dưới đèn UV Khuẩn lạc màu nâu đỏ, không phát huỳnh quang Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocianin, phát huỳnh quang - Thạch dinh dưỡng - Canh thang acetamide - King’ B Canh thang acetamide Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h Ủ (36 ± 2)0C / (22 ± 2)h - Oxidase (+) - Sinh amoniac - Phát huỳnh quang dưới UV Sinh amoniac P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa 32 3.4.5. Phƣơng pháp làm kháng sinh đồ Trong nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng, phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch được sử dụng để kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh của các vi khuẩn. Kết quả kháng sinh đồ giúp cho việc điều trị được chính xác và hạn chế việc sử dụng kháng sinh bừa bãi [17][33] [28]. 3.4.5.1. Các kháng sinh thử nghiệm Chọn lựa các kháng sinh thích hợp nhất để thử nghiệm và phúc trình kết quả là một quyết định hay nhất của phòng thí nghiệm lâm sàng để có thể tham vấn được việc trị liệu kháng sinh. Tuy nhiên phòng thí nghiệm có thể tuỳ điều kiện thực tế có thể thêm hay bớt một hay một số kháng sinh. Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn P. aeruginosa với 16 loại kháng sinh theo tiêu chuẩn NCCLS-2007 (Ủy ban quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm lâm sàng) và CA-SFM-2004 (Hội đồng kháng sinh – Hiệp hội vi sinh của Pháp). Bảo quản kháng sinh: Các đĩa kháng sinh được đóng gói đảm bảo điều kiện không hút ẩm và được giữ ở nhiệt độ 80C hoặc thấp hơn. Nên lấy các lọ chứa đĩa kháng sinh còn đóng kín ra khỏi tủ lạnh 1 đến 2 giờ để nhiệt độ trong lọ bằng với nhiệt độ phòng thí nghiệm trước khi mở nắp. Chỉ sử dụng các đĩa còn hạn dùng, loại bỏ các đĩa kháng sinh quá hạn. Hình 3.4: Các kháng sinh thử nghiệm 33 Bảng 3-1: Các kháng sinh thử nghiệm trong kháng sinh đồ (*) National Committee for Clinical Laboratory Standards (2007), Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement. (**)Société Française de microbiologie, COMITÉ DE L’ANTIBIOGRAMME DE LA SOCIETE FRANCAISE DE MICROBIOLOGIE, Communiqué 2004. Họ kháng sinh Tên kháng sinh Viết tắt Hàm lƣợng Kháng Trung gian Nhạy Beta- lactamin Penicillin Piperacillin PIP** 75µg ≤17 - ≥18 Ticarcillin/a.clavulanic TCC* 75/10µg ≤14 - ≥15 Cephalosporin Cephem Cefoperazone CFP* 75µg ≤15 16-20 ≥21 Cefsulodin CFS** 30 µg ≤14 15-21 ≥22 Ceftazidime CAZ* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Cefepime FEP* 30µg ≤14 15-17 ≥18 Carbapenem Imipenem IPM* 10µg ≤13 14-15 ≥16 Mono-lactamin Aztreonam ATM* 30µg ≤15 16-21 ≥22 Aminoglycosid Gentamicin GM* 10µg ≤12 13-14 ≥15 Tobramycin TM* 10µg ≤12 13-14 ≥15 Amikacin AN* 30µg ≤14 15-16 ≥17 Polypeptide Colistin CS* 10µg ≤10 - ≥11 Fluoroquinolon Ofloxacin OFX* 5µg ≤12 13-15 ≥16 Ciprofloxacin CIP* 5µg ≤15 16-20 ≥21 Sulfamid Sulfamides SSS** 200µg ≤12 13-16 ≥17 Fosfomycin Fosfomycin FOS** 50µg ≤14 - ≥14 34 3.4.5.2. Vi khuẩn thử nghiệm Để chuẩn hóa độ đục của vi khuẩn thử nghiệm, dùng huyền dịch BaSO4 tương đương độ đục chuẩn 0,5 McFarland. Pha độ đục chuẩn BaSO4 0,5 McFarland như sau: Lấy 0,5 ml dung dịch BaCl2 0,048 M cho vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M, vừa cho vào vừa khuấy đều. Đậm độ chính xác của độ đục chuẩn nên được xác định bằng quang phổ kế đo độ hấp thu với ống đo 1 cm. Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải có độ hấp thu ở bước sóng 625 nm đạt 0,08 đến 0,1. 3.4.5.3. Qui trình thực hiện thử nghiệm kháng sinh đồ  Chuẩn bị vi khuẩn Chọn một khuẩn lạc riêng rẽ trên mặt thạch phân lập cấy truyền vào môi trường BHI. Ủ canh khuẩn ở 370C trong 24 giờ, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch dinh dưỡng ủ ở 370C trong 24 giờ. Lấy một vài khuẩn lạc trên mặt thạch hòa vào nước muối sinh l ý và điều chỉnh độ đục đến khi đạt độ đục chuẩn 0,5 McFarland.  Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: Thạch Mueller Hinton  Trải vi khuẩn lên mặt thạch Đặt đĩa thạch vào tủ ấm 15 phút cho khô mặt thạch. Dùng pipette vô trùng hút khoảng 1 ml (106 vi khuẩn/ml) dịch khuẩn vừa mới pha láng đều trên mặt thạch. Để 3 đến 5 phút hút bỏ dịch vi khuẩn thừa và để khoảng 15 phút cho khô mặt thạch.  Đặt đĩa kháng sinh lên mặt thạch đã trải vi khuẩn Dùng kẹp vô trùng gắp các đĩa kháng sinh và ép nhẹ lên mặt thạch để đảm bảo chúng tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Số lượng các đĩa kháng sinh không quá 7 đĩa trên hộp thạch có đường kính 90 mm. Các kháng sinh sẽ khuếch tán ngay sau khi đĩa kháng sinh chạm mặt thạch, vì vậy không nên dời chỗ các đĩa kháng sinh sau khi đã đặt lên mặt thạch. 35 Trong vòng 15 phút sau khi đặt đĩa kháng sinh phải ủ sấp hộp thạch (đáy trên nắp dưới) trong tủ ấm 370C.  Đọc và biện luận kết quả: Đo vòng khuyếch tán trên đĩa thạch Sau khi ủ 18 đến 24 giờ đọc kết quả các hộp thạch. Nếu mặt thạch được trải vi khuẩn đúng cách và mầm cấy đúng độ đục chuẩn, vi khuẩn sẽ mọc thành một lớp mịn và vòng vô khuẩn là một vòng tròn đồng nhất. Đo đường kính vòng vô khuẩn là một vòng, kể cả đường kính đĩa kháng sinh, hoàn toàn không có vi khuẩn mọc thấy được bằng mắt thường. Đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước kẽ hay thước dành riêng cho mục đích này, bằng cách áp thước lên mặt sau của đáy hộp. Khi đọc kết quả tốt nhất là dung ánh sáng xuyên (tức là giữ hộp thạch trên một nguồn sáng). Biện luận đường kính vòng vô khuẩn dựa theo biện luận đường kính và ghi nhận kết quả vi khuẩn nhạy hay trung gian hay kháng đối với kháng sinh thử nghiệm. 36 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn của các loại nƣớc uống 4.1.1. So sánh giữa 2 nhóm nƣớc uống (đóng chai và xử lý) Bảng 4-1: So sánh tỉ lệ không đạt về chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc Nước uống đóng chai (nhóm 1) Nước uống xử lý (nhóm 2) Số mẫu % Số mẫu % Đạt 40 80 265 75,7 Không đạt 10 20 85 24,3 Tổng số mẫu 50 350 80 75,7 20 24,3 0 20 40 60 80 100 1 2 Nhóm % Đạt Không đạt Biểu đồ 4.1: So sánh sự nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nƣớc Nhận xét: Nhìn chung mức độ nhiễm khuẩn giữa 2 nhóm nước là như nhau, không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P = 0,4 > 0,05; xem them chi tiết ở phụ lục A1) 37 Bảng 4-2: Tỉ lệ không đạt theo từng chỉ tiêu vi sinh giữa 2 nhóm nƣớc Nhóm 1 Nhóm 2 Số mẫu không đạt % Số mẫu không đạt % Tổng số mẫu 50 350 Coliform 5 10 48 13,7 Coliform fecal 4 8 37 10,6 Streptococcus fecalis 1 2 11 3,1 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 18 5,1 P. aeruginosa 8 16 51 14,6 13,7 10,6 3,1 5,1 14,6 0 5 10 15 20 CLs C.F S.F KK P.A % Nhóm 1 Nhóm 2 Biểu đồ 4.2: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc CLs: Coliforms C.F: Coliform fecal S.F: Streptococcus fecalis KK: vi khuẩn kỵ khí sinh H2S P.A: P. aeruginosa Biểu đồ 4.3: Tỉ lệ nhiễm từng loại chỉ tiêu vi sinh của 2 nhóm nƣớc Nhận xét: Nếu xét theo từng chỉ tiêu vi sinh thì nhóm nước uống đóng chai (nhóm 1) bị nhiễm ít hơn nhóm nước uống xử lý (nhóm 2) ngoại trừ chỉ tiêu về P. aeruginosa, tuy nhiên giữa 2 nhóm nước sự khác biệt chưa có ý nghĩa về mặt thống kê (P > 0,05; xem thêm chi tiết ở phụ lục A2). 38 4.1.2. Giữa các chỉ tiêu trong từng nhóm nƣớc 4.1.2.1. Nƣớc uống đóng chai Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 40 mẫu, 80% Số mẫu không đạt: 10 mẫu, 20% Bảng 4-3: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống đóng chai theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 5 10 Coliform fecal 4 8 Streptococcus fecalis 1 2 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 P. aeruginosa 8 16 Nhận xét: Các mẫu nước uống đóng chai đa phần bị nhiễm P. aeruginosa tiếp đến là chỉ tiêu Coliform. Streptococcus fecalis và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit tìm thấy không đáng kể. 4.1.2.2. Nƣớc uống công ty Số mẫu khảo sát: 200 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 144 mẫu , 72% Số mẫu không đạt: 56 mẫu, 28% Bảng 4-4: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống công ty theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 32 16 Coliform fecal 25 12,5 Streptococcus fecalis 5 2,5 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 10 5 P. aeruginosa 32 16 Nhận xét: Tỷ lệ nhiễm Coliform và P. aeruginosa cao nhất trong các chỉ tiêu, kế đến là Coliform fecal . Cũng giống như nước uống đóng chai Streptococcus fecalis và vi khuẩn kỵ khí khử sunphit chiếm tỷ lệ thấp hơn trong các mẫu thử. 4.1.2.3. Nƣớc uống gia đình Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 24 mẫu , 48% Số mẫu không đạt: 26 mẫu, 52% 39 Bảng 4-5: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống gia đình theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 13 26 Coliform fecal 11 22 Streptococcus fecalis 4 8 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 6 12 P. aeruginosa 18 36 Nhận xét: Nhìn chung nước uống gia đình bị nhiễm khuẩn nặng hơn các loại nước khác, số mẫu không đạt các chỉ tiêu vi sinh chiếm tới 52%. Trong đó chiếm tỉ lệ cao nhất là P. aeruginosa, kế đến là Coliform và Coliform fecal. 4.1.2.4. Nƣớc uống trƣờng học Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 47 mẫu , 94% Số mẫu không đạt: 3 mẫu, 6% Bảng 4-6: Tỉ lệ nhiễm khuẩn của nƣớc uống trƣờng học theo từng chỉ tiêu Chỉ tiêu vi sinh Số mẫu không đạt % không đạt Coliform 3 6 Coliform fecal 1 2 Streptococcus fecalis 2 4 Bào tử vi khuẩn kỵ khí 2 4 P. aeruginosa 1 2 Nhận xét: Nước uống trường học có tỉ lệ không đạt thấp nhất, trong đó cao nhất vẫn là Coliform. 4.1.2.5. Nƣớc uống bệnh viện Số mẫu khảo sát: 50 mẫu Số mẫu đạt các chỉ tiêu vi sinh: 50 mẫu , 100% Số mẫu không đạt: 0 mẫu, 0% 40 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nƣớc uống Bảng 4-7: Tỉ lệ nhiễm P.aeruginosa giữa các loại nƣớc uống Loại nước uống Tổng số mẫu Số mẫu nhiễm P. aeruginosa % nhiễm P. aeruginosa NUĐC 50 8 16 NUCT 200 32 16 NUGĐ 50 18 36 NUTH 50 1 2 NUBV 50 0 0 16 16 36 2 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 NUĐC NUCT NUGĐ NUTH NUBV % Biểu đồ 4.4: Tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa giữa các loại nƣớc uống NUĐC: nước uống đóng chai NUCT: nước uống công ty NUGĐ: nước uống gia đình NUTH: nước uống trường học NUBV: nước uống bệnh viện Nhận xét: Nước uống gia đình bị nhiễm P. aeruginosa cao nhất trong các loại nước, tiếp đến là nước uống đóng chai và nước uống công ty. Nước uống bệnh viện không tìm thấy loại vi khuẩn này. 41 4.2. Tỉ lệ đề kháng với kháng sinh của P. aeruginosa trong các loại nƣớc uống Tổng số P. aeruginosa: 59 chủng Trong đó: Nước uống đóng chai: 8 chủng Nước uống công ty: 32 chủng Nước uống gia đình: 18 chủng Nước uống trường học: 1 chủng Nước uống bệnh viện: 0 chủng Bảng 4-8: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P . aeruginosa trong các loại nƣớc uống Tỉ lệ % Kháng sinh NUĐC NUCT NUGĐ S I R S I R S I R Piperacillin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ticarcillin/a.clavulanic 100 0 0 97 0 3 100 0 0 Cefoperazone 100 0 0 93,8 6,3 0 100 0 0 Cefsulodin 75 12,5 12,5 87,5 9,4 3 83 17 0 Ceftazidime 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Cefepime 100 0 0 97 3 0 100 0 0 Imipenem 100 0 0 94 0 6 100 0 0 Aztreonam 62,5 12,5 25 97 0 3 100 0 0 Gentamicin 100 0 0 97 3 0 89 11 0 Tobramycin 87,5 0 12,5 100 0 0 94,4 5,6 0 Amikacin 87,5 0 12,5 97 3 0 100 0 0 Colistin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ofloxacin 100 0 0 100 0 0 100 0 0 Ciprofloxacin 87,5 12,5 0 100 0 0 100 0 0 Sulfamides 100 0 0 94 3 3 89 11 0 Fosfomycin 50 0 50 56 0 44 67 0 33 Nước uống trường học chỉ có 1 mẫu tìm thấy P. aeruginosa và kết quả kháng sinh đồ cho thấy chủng này nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nghiệm. Nước uống bệnh viện không tìm thấy P. aeruginosa trong các mẫu khảo sát. 42 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.5: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống đóng chai Nhận xét: Đa số vi khuẩn nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Tuy nhiên, một số kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ thấp (cefsulodin, tobramycin, amikacin, aztreonam), riêng fosfomycin tỉ lệ đề kháng lên đến 50%. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60 70% 80% 90 100 PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.6: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống công ty Nhận xét: Vi khuẩn phân lập từ nước uống công ty nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Nhưng vẫn có một số kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ thấp (ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, sulfamides, aztreonam, imipenem), riêng fosfomycin bị đề kháng đến 44%. 43 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% PIP TC C CF P CF S CA Z FE P IPM AT M GM TM AN C S OF X CI P SS S FO S Kháng sinh % R I S Biểu đồ 4.7: Tỉ lệ kháng kháng sinh của P. aeruginosa trong nƣớc uống gia đình Nhận xét: Ngoại trừ fosfomycine bị đề kháng với tỉ lệ khá cao đến 33%, các vi khuẩn còn lại trong nước uống gia đình đều nhạy cảm với kháng sinh thử nghiệm. Trong nước uống trường học, tỉ lệ nhiễm không cao, chỉ có 1 trường hợp bị nhiễm P. aeruginosa. Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn này nhạy cảm với tất cả các kháng sinh thử nghiệm. 44 4.3. Một số hình ảnh các vi sinh vật trong quá trình thử nghiệm Hình 4.1: Khuẩn lạc coliform trên môi trƣờng lactose TTC tergitol 7 (khuẩn lạc đặc trưng có màu vàng, da cam hoặc đỏ gạch). Hình 4.2: Thử nghiệm khả năng lên men đƣờng lactose của coliform, faecal coliform 45 Hình 4.3: Khuẩn lạc Streptococcus fecalis trên môi trƣờng Slanetz và Bartley (Các khuẩn lạc đặc trưng có màu nâu đỏ hoặc màu hồng từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc) Hình 4.4: Khuẩn lạc Steptococcus fecalis trên thạch mật asculin-nitrua (khuẩn lạc có màu nâu đến đen và/hoặc môi trường bao quanh có màu nâu hoặc đen) 46 Hình 4.5: Khuẩn lạc các bào tử Clostridium trên thạch sunphit triptoza Hình 4.6: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trƣờng thạch CN A. P. aeruginosa trên môi trường thạch CN. B. P. aeruginosa phát huỳnh quang dưới tia UV. A B 47 Hình 4.7: P. aeruginosa trên môi trƣờng King’s B Hình 4.8: Thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn P. aeruginosa (Đường kính vòng vô khuẩn nhỏ và nằm trong giới hạn đề kháng theo Bảng 3-1 các kháng sinh thử nghiệm thì vi khuẩn được kết luận là đề kháng với kháng sinh đó – trong hình này dấu mũi tên chỉ vi khuẩn đề kháng với fosfomycin) 48 4.3.1. Tình hình nhiễm khuẩn nƣớc uống  So sánh tỉ lệ không đạt chỉ tiêu vi sinh giữa các nhóm và loại nƣớc Mức độ nhiễm các chỉ tiêu vi sinh giữa nhóm nước uống đóng chai và nước uống xử lý khảo sát là như nhau, không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P = 0,4 > 0,05). Nhưng giữa các loại nước thì lại có sự khác biệt rõ rệt. Trong nhóm nước uống xử lý, nước uống bệnh viện (NUBV) hầu hết đạt chỉ tiêu vi sinh và nước uống trường học (NUTH) tỉ lệ nhiễm khuẩn thấp. Nhìn chung trong các loại nước uống, nước uống gia đình (NUGĐ) dẫn đầu mức độ ô nhiễm với tất cả 5 chỉ tiêu vi sinh. Theo Tamagnini L.M. và González R.D. (1997), nước uống đóng chai được vô trùng trong các chai nhựa tái sử dụng hay sử dụng một lần đều không bị nhiễm Coliforms và Coliform fecal nhưng lại tìm thấy P. aeruginosa trong các chai nhựa tái sử dụng [40]. Theo Vess et al. (1993), P. aeruginosa có khả năng sống sót trên bề mặt PVC [41]. Theo chúng tôi, NUGĐ vi phạm cao có thể là do việc không chú ý đến vệ sinh các chai đựng và dụng cụ chứa nước. Việc tái sử dụng các chai nhựa chứa nước, đun nấu nước uống chưa kỹ hay bảo quản không tốt là những nguyên nhân làm cho tiến trình nhiễm khuẩn trở nên dễ dàng và nhanh chóng hơn. Trái lại, NUBV là loại nước uống ở trong môi trường có nguy cơ lây nhiễm các loại vi khuẩn gây bệnh rất cao nhưng trong các mẫu khảo sát lại không tìm thấy bất cứ một vi khuẩn nào trong tiêu chuẩn. Theo chúng tôi điều này có thể là nước uống trong bệnh viện được xử lý thêm để hạn chế sự lây nhiễm. Đây là một thông tin đáng mừng cho thấy vấn đề vệ sinh môi trường cũng như vệ sinh nước uống trong các bệnh viện được kiểm soát tốt. NUTH chỉ có 6% không đạt tiêu chuẩn vi sinh, chứng tỏ vấn đề vệ sinh nước uống trong các trường học cũng rất được quan tâm. Điều này làm an lòng các bậc phụ huynh vì đa số các mẫu khảo sát đều lấy từ các trường mầm non và tiểu học. Theo kết quả nghiên cứu của Benoit Lévesque (1994) so sánh chất lượng vi sinh nước máy và nước từ máy làm lạnh nước uống tại khu dân cư và khu văn phòng cho thấy tỷ lệ nhiễm khuẩn của nước máy thấp hơn rất nhiều so với nước lấy từ các máy làm lạnh nước uống. Điều này theo tác giả các bình làm lạnh nước uống không 49 được vệ sinh sạch sẽ là nơi ẩn trú cho vi sinh vật gây bệnh. Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự nhiễm khuẩn không phải từ các bình lọc nước uống mà bắt nguồn từ nhà sản xuất (Baumgartner A., 2006). Nước uống đóng chai rất dễ bị nhiễm khuẩn nếu như quy trình súc rửa, đóng bình, vô trùng không đạt tiêu chuẩn. Và uống nguồn nước bị nhiễm khuẩn như vậy là không an toàn cho sức khỏe, nhất là những đối tượng có hệ miễn dịch kém như là người bệnh, người già và trẻ em.  So sánh giữa các chỉ tiêu vi phạm giữa các nhóm và loại nƣớc Nhìn chung, trong tất cả các chỉ tiêu vi phạm, P . aeruginosa (chiếm 62% trong 95 mẫu không đạt tiêu chuẩn) là chỉ tiêu bị vi phạm nhiều nhất. Tiếp đến là Coliform (56%) và fecal Coliform (43%). Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và streptococcus fecalis là chỉ tiêu ít bị vi phạm nhất trong các loại nước uống khảo sát (chỉ chiếm 21% và 13%). P. aeruginosa Đây là chỉ tiêu bị nhiễm nhiều nhất trong tất cả các loại nước uống. Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm khuẩn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P = 0,8 > 0,05). Giữa các loại nước uống, tỉ lệ nhiễm P. aeruginosa trong NUGĐ là 36% rất cao so với NUBV là 0% và NUTH chỉ chiếm 2%. Sự chênh lệch quá lớn giữa NUGĐ và NUBV, NUTH dẫn đến những khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê (P= 10-7 >0,001; xem thêm chi tiết ở phụ lục A3). So sánh 3 loại nước uống có tỉ lệ nhiễm cao là NUĐC, NUCT và NUGĐ vẫn có sự khác biệt có ý nghĩa (P= 0,048 < 0,05). Điều này cho thấy NUGĐ có tỉ lệ nhiễm cao hơn rõ rệt so với các loại nước uống còn lại. Coliform Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm Coliform vẫn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P= 0,468 > 0,05). Giữa các loại nước uống thì tỉ lệ này lại có khác biệt rất có ý nghĩa (P = 0,0009 < 0,01). Trong đó, NUGĐ tỉ lệ nhiễm cao nhất (26%), theo sau là NUCT (16%) và NUĐC (10%), NUBV và NUTH có tỉ lệ nhiễm thấp nhất lần lượt là 0% và 6%. Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học thì không có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm Coliform giữa 3 loại nước uống còn lại (P = 0,09 > 0,05), chứng tỏ nước uống bệnh viện và trường học tỷ lệ nhiễm Coliform không đáng kể. 50 Coliform fecal Giữa 2 nhóm nước tỉ lệ nhiễm fecal Coliform vẫn không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P= 0,57 > 0,05). Giữa các loại nước uống thì tỉ lệ này lại có sự khác biệt rất có ý nghĩa (P = 0,001 < 0,05). Trong đó, NUGĐ có tỉ lệ nhiễm cao nhất (22%), theo sau là NUCT (13%) và NUĐC (8%), NUBV và NUTH có tỉ lệ nhiễm thấp nhất lần lượt là 0% và 2%. Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và trường học thì vẫn có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm giữa 3 loại nước uống còn lại (P = 0,001 < 0,05). Yếu tố còn lại ảnh hưởng đến sự khác biệt đó là nước uống gia đình bị nhiễm khuẩn cao hơn rất nhiều so với các loại nước uống còn lại. Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và Streptococcus fecalis Đây là 2 chỉ tiêu ít bị nhiễm nhất trong 5 chỉ tiêu khảo sát. So sánh các tỉ lệ nhiễm của từng chỉ tiêu giữa các nhóm và loại nước uống không thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. 4.3.2. Tính đề kháng kháng sinh của P . aeruginosa Nhìn chung, với số mẫu xét nghiệm còn hạn chế (400 mẫu) và số vi khuẩn P . aeruginosa tìm được còn ít (59 mẫu). Các vi khuẩn tìm được còn khá nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Tuy nhiên, fosfomycin là kháng sinh bị đề kháng nhiều nhất chiếm từ 33% đến 50% (24 mẫu). Theo một số tác giả nước ngoài thì P. aeruginosa trong nước uống vẫn còn khá nhạy cảm với các kháng sinh sử dụng. Thật vậy, nghiên cứu của Papapetropoulou M (1994) cho thấy P. aeruginosa trong nước máy và nước đóng chai không gas, các chủng đều nhạy cảm với tất cả beta-lactams, amynoglycosides, cephalosporins thế hệ III và quinolones [36]. Một nghiên cứu khác của Papandreous S và cộng sự về tính đề kháng đa kháng sinh của các vi khuẩn Gram âm trong nước uống ở Greece (2000), cho thấy các vi khuẩn Gram âm trong đó có Pseudomonas (145/239 vi khuẩn Gram âm) tất cả đều nhạy cảm 100% với quinolones, amynoglycoside, imipenem, aztreonam, cefoperazon [35]. Theo Pilar Arca và cộng sự (1997), tính đề kháng đối với fosfomycin của vi khuẩn được mã hóa bởi gen fosA và fosB trên plasmid của vi khuẩn [37]. Plasmid này 51 có thể truyền từ vi khuẩn này qua vi khuẩn khác thông qua hiện tượng biến nạp, tải nạp, tiếp hợp…. Một nghiên cứu khác cho thấy, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc giúp tăng trưởng nhanh, phòng và trị bệnh tuy nhiên hậu quả là tỉ lệ các vi khuẩn kháng thuốc ngày càng cao [23]. Trong lâm sàng, fosfomycin rất hữu hiệu và tác dụng hợp lực khi được phối hợp với các kháng sinh khác để điều trị P. aeruginosa đã đề kháng các kháng sinh thông dụng [31], [32]. Như vậy có khả năng sự đề kháng fosfomycin này là kết quả nhận gen đề kháng từ các vi khuẩn khác trong tự nhiên sau quá trình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi. Tuy nhiên để có cơ sở kết luận thì cần có những nghiên cứu sâu hơn, cụ thể hơn. Đối với loại NUĐC, có 3 kháng sinh đều bị đề kháng với tỉ lệ 12,5% (cefsulodin, tobramycin, amikacin). Đối với NUCT, có 4 kháng sinh bị đề kháng với tỉ lệ 3,1% (ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, sulfamides, aztreonam), riêng imipenem là 6,3%. Đối với NUGĐ ngoài fosfomycin thì các chủng tìm thấy đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Mặt khác, kết quả kháng sinh đồ cho thấy các vi khuẩn thử nghiệm chưa có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. Nếu không có biện pháp kiểm soát thường quy tính nhạy cảm kháng sinh của các vi sinh vật trong chỉ tiêu nước uống tại Việt Nam, chúng tôi nghĩ tính đề kháng kháng sinh của các vi sinh vật trong nước uống sẽ gia tăng đáng kể và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng. 52 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đề tài chúng tôi đã hoàn thành các mục tiêu đề ra: xác định tỉ lệ nhiễm khuẩn nước uống theo TCVN 6096:2004 và làm kháng sinh đồ đối với P. aeruginosa theo tiêu chuẩn NCCLS và CA-SFM thu được kết quả như sau: Nước uống gia đình không đạt chỉ tiêu vi sinh nhiều nhất trong tất cả các loại nước uống khảo sát chiếm 52% mẫu kiểm tra. Tiếp theo là nước uống công ty với tỉ lệ 28%, nước uống đóng chai 20%, nước uống trường học 6% và hầu hết nước uống bệnh viện đều đạt chỉ tiêu vi sinh. Trong các chỉ tiêu vi sinh, P. aeruginosa là chỉ tiêu nhiễm nhiều nhất chiếm đến 62% trong 95 mẫu không đạt tiêu chuẩn, kế đến là chỉ tiêu Coliform 56% và Coliform fecal 43%. Hai chỉ tiêu còn lại là vi khuẩn kỵ khí sinh H2S và Streptococcus fecalis chiếm tỉ lệ thấp lần lượt là 21% và 13%. Hầu hết các chủng P. aeruginosa phân lập được từ các loại nước uống này đều nhạy cảm với các kháng sinh thử nghiệm. Ngoại trừ, fosfomycin bị kháng khá nhiều (từ 33% đến 50% các chủng thu được, 24 chủng đề kháng trong 59 chủng thử nghiệm). Một số kháng sinh khác như ticarcillin/a.clavulanic, cefsulodin, imipenem, aztreonam, sulfamides, tobramycin, amikacin cũng bị kháng nhưng tỉ lệ tương đối thấp (≤ 5%). Ngoài ra, các chủng vi khuẩn tìm thấy không có hiện tượng đề kháng đa kháng sinh. Kết quả này tuy chỉ đánh giá riêng về chỉ tiêu vi sinh chưa tính đến các chỉ tiêu Lý-Hóa nhưng đã góp phần phản ánh tình hình nhiễm khuẩn trong một số loại nước uống nhất định đến mức báo động. Qua đó mọi người có cái nhìn ý thức hơn trong việc sử dụng cũng như trong kinh doanh các loại nước uống đóng chai nhằm đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng. Cần có nhiều biện pháp tăng cường kiểm soát chất lượng không những riêng cho nước mà còn cho các thực phẩm nói chung. 53 5.2. Đề nghị Tìm gen kháng fosfomycin trong các chủng P. aeruginosa trong mẫu nước thử nghiệm. Mở rộng thu thập thêm các mẫu nước uống bệnh viện để tìm hiểu về tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn P. aeruginosa trong nước uống bệnh viện. Nghiên cứu so sánh cụ thể hơn về mối liên quan tính kháng kháng sinh của vi khuẩn trong bệnh phẩm và thực phẩm để có cái nhìn toàn diện hơn về chiến lược sử dụng kháng sinh cũng như các hậu quả do việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong chăn nuôi, bảo quản thủy sản mà công luận đang lên tiếng. Khảo sát tính đề kháng kháng sinh với các vi khuẩn còn lại trong chỉ tiêu. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phần tiếng Việt [1]. Nguyễn Thị Kim Chi. Tình hình nhiễm khuẩn các nguồn nước dùng tại TP. Hồ Chí Minh. Luận án Thạc sĩ khoa học Y Dược, 1997. [2]. Harison. Các nguyên lý y học nội khoa – Tập II. Nhà xuất bản Y học, 1999, tr 313-323. [3]. Dược lực học lâm sàng. Kháng sinh. Nhà xuất bản Y học, 2001. [4]. Hồ Việt Mỹ và cộng sự. Nghiên cứu tình trạng nhiễm khuẩn bệnh viện; đề xuất, áp dụng và đánh giá các biện pháp phòng chống tại bệnh viện đa khoa tỉnh và BVĐK khu vực Bồng Sơn từ năm 2003-2004. Sở y tế Bình Định. [5]. Lê Bảo Huy, Lê Đức Thắng. Khảo sát tác nhân gây viêm phổi bệnh viện và tình hình kháng kháng sinh tại khoa ICU bệnh viện Thống Nhất 2004-2005. Tập thể khoa hồi sức cấp cứu – Khoa vi sinh bệnh viện Thống Nhất. Tài liệu hội thảo khoa học. [6]. Hướng dẫn sử dụng kháng sinh. Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Nhà xuất bản Y Học, 2001, tr 21-30. [7]. ISO 16266:2006 (E). Water quality – Detection and enumaration of Pseudomonas aeruginosa – Method by membrane filtration. International Satndard Organization, 2006. [8]. Võ Thị Chi Mai. Nhận xét về tính kháng thuốc in vitro ở bệnh viện Chợ Rẫy năm 1997. Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược – Khoa Vi Sinh, Bệnh viện Chợ Rẫy, 1997. Tài liệu hội thảo khoa học. [9]. Trần Thị Mai và cs. Điều kiện vệ sinh cơ sở sản xuất và chất lượng vệ sinh an toàn nước uống đóng chai tại thành phố Buôn Ma Thuột năm 2005. Trung tâm Y tế dự phòng Dak Lak 2005. [10]. TCVN 6096:2004. Nước uống đóng chai. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 2005. [11]. TCVN 2652-78. Nước uống-Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và vận chuyển mẫu. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1978. [12]. TCVN 6187-1:1996 (ISO 9308-1:1990(E)). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm vi khuẩn Coliform, vi khuẩn Coliform chịu nhiệt và Escherichia coli giả định. Phần 1: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. [13]. TCVN 6189-2:1996 (ISO 7899-2:1984(E)). Chất lượng nước. Phát hiện và đếm khuẩn liên cầu phân. Phần 2: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. [14]. TCVN 6191-2:1996 (ISO 6461-2:1986(E)). Chất lượng nước - Phát hiện và đếm số bào tử vi khuẩn kỵ khí khử sunphit (Clostridia). Phần 2: Phương pháp màng lọc. Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường, 1996. 55 [15]. Trần linh Thước. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. Nhà xuất bản Giáo Dục, 2006. [16]. Hoàng Nǎng Trọng, Hoàng Thị Phúc, Hoàng Minh Châu. Bệnh viêm loét giác mạc do vi khuẩn tại khoa Mắt hột - Giác mạc Viện Mắt nǎm 1996. Kỷ yếu hội nghị KHKT ngành mắt, Viện Mắt, 1997. [17]. Phạm Hùng Vân. Cẩm nang các kỹ thuật vi sinh lâm sàng, 1999. [18]. Vi sinh vật y học. Nhà xuất bản Y Học, 2007, tr 218-221. Phần tiếng Anh: [19]. Aulicino F.A., Pastoni F. Microorganisms surviving in drinking water systems and related problems. Ann Ig. , 2004 Jan-Apr;16(1-2):265-72. [20]. Baumgartner A, Grand M. Bacteriological quality of drinking water from dispensers (coolers) and possible control measures. J Food Prot., 2006, Dec; 69(12):3043-6. [21]. Benoit Lévesque. Comparision of the Microbological Quality of Water Coolers and That of Municipal Water Systems. Applíed and Environmental Microbiology, Apr 1994, p. 1174- 1178. [22]. Bharath J, Mosodeen M, Motilal S, Sandy S, Sharma S, Tessaro T, Thomas K, Umamaheswaran M, Simeon D, Adesiyun AA. Microbial quality of domestic and imported brands of bottled water in Trinidad. School of Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of the West Indies, St. Augustine, Trinidad and Tobago. Int J Food Microbiol., 2003 Feb 25;81(1):53-62. [23]. Deanna, L., Kiska, Peter, H., Gilligan. Pseudomonas aeruginosa. In Manual of clinical microbiology. Patrick R. Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003. [24]. Gales, A. C., 1 R. N. Jones,1 J. Turnidge,2 R. Rennie,3 and R. Ramphal Characterization of Pseudomonas aeruginosa Isolates: Occurrence rates, antimicrobial susceptibility patterns, and molecular typing in the global SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997–1999. Clinical Infectious Diseases, 2001, 32(Suppl 2): S146–55. [25]. Hunter, P.R. The microbiology of bottled natural mineral waters. Journal of Applied Bacteriology, 1993, 74: 345-352. [26]. Lateef A∗, Oloke J. K., Gueguimkana E. B. The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria. Environmental Monitoring and Assessment, 2005, 100: 59–69. [27]. Liang J.L., Dziuban E.J., Craun G.F., Hill V., Moore M.R., Gelting R.J., Calderon R.L., Beach M.J., Roy S.L. Surveillance for waterborne disease and outbreaks associated with drinking water and water not intended for drinking-- United States, 2003-2004. MMWR Surveill Summ., 2006 Dec 22;55(12):31-65. 56 [28]. Lucia Martins Teixeira, Richard R. Facklan. Enterococcus. In Manual of clinical microbiology. Patrick R. Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003. [29]. Martha Oliveira Cardoso, Aldemir Reginato Ribeiro, Luciana Ruschel dos Santos*, Fernando Pilotto. Antibiotic resistance in samonella enteritidis isolated from broiler carcasses. Brazilian Journal of Microbiology, 2006, 37:368-371 [30]. Maschemeyer, G., and I. Braveny. Review of the incidence of prognosis of Pseudomonas aeruginosa infections in cancer patients in the 1990s. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2000.19:915-925. [31]. Mirakhur A., Gallagher M.J., Ledson M.J., Hart C.A., Walshaw M.J.. Fosfomycin therapy for multiresistant Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis. J. Cyst. Fibros., 2003 Mar, 2(1):19-24. [32]. Monden K., Ando E., Iida M., Kumon H. Role of fosfomycin in a synergistic combination with ofloxacin against Pseudomonas aeruginosa growing in a biofilm. J Infect Chemother., 2002 Sep, 8(3):218-26. [33]. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Performance standards for anmicrobial susceptibility testing, Seventeenth informational supplement, 2007. [34]. Oguntibeju OO1 & Nwobu RAU2, Occurrence of Pseudomonas aeruginosa in post-operative wound infection, Pak J Med Sci July-September 2004, Vol. 20 No. 3: 187-191. [35]. Papandreou S, Pagonopoulou O, Vantarakis A, Papapetropoulou M. Multiantibiotic resistance of gram-negative bacteria isolated from drinking water samples in southwest Greece. J Chemother, 2000 Aug;12(4):267-73. [36]. Papapetropoulou M, Iliopoulou J, Rodopoulou G, Detorakis J, Paniara. OOccurrence and antibiotic-resistance of Pseudomonas species isolated from drinking water in southern Greece. J Chemother., 1994, Apr; 6(2):111-6. [37]. Pilar Arca, Gemma Reguera, Carols Hardisson*. Plasmid-encoded fosfomycin resistance in bacteria isolated from the urinary tract in a multicentre survey. Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1997, 40, 393–399. [38]. Rusin PA, Rose JB, Haas CN, Gerba CP. Risk assessment of opportunistic bacterial pathogens in drinking water. Rev Environ Contam Toxicol., 1997, 152:57-83. [39]. Société Française de microbiologie- Comité de l’antibiogramme de la societe francaise de microbiologie, Communiqué 2004. [40]. Tamagnini, L.M., Gonzalez, R.D. Bacteriological stability and growth kinetics of Pseudomonas aeruginosa in bottled watter. Journal of Applied Microbiology 1997, 83: 91-94. [41]. Vess, R. W., Anderson, R.L., Carr, J.H., Bond, W. W. and Favero, M.S. The colonization of solid PVC surfaces and the acquisition of risistance to 57 germicides by water microorganisms. Journal of Applied Bacteriology, 1993, 74: 215-221. Internet: [42]. www.moi.gov.vn [43]. [44]. - Báo động! Nước ăn uống ở các trường học. Báo Sài Gòn Giải Phóng . Số ra ngày 06/03/07 Phụ lục A: Xử lý số liệu thống kê A1. Tỉ lệ nhiễm khuẩn giữa nƣớc uống đóng chai và xử lý nhóm 1 nhóm 2 Tổng Actual Số mẫu đạt 40 265 305 Số mẫu không đạt 10 85 95 50 350 400 Expected 38,13 266,88 11,88 83,13 P = 0,5 > 0,05 Khác biệt không có ý nghĩa thống kê A2. Tỉ lệ nhiễm khuẩn giữa các loại nƣớc uống Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 NUGĐ 24 26 50 NUTH 47 3 50 NUBV 50 0 50 305 95 400 Expected NUĐC 304,9 11,9 NUCT 304,5 47,5 NUGĐ 304,9 11,9 NUTH 304,9 11,9 NUBV 304,9 11,9 P = 3,1E-224 < 0,01 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 NUGĐ 24 26 50 208 92 300 Expected NUĐC 34,7 15,3 NUCT 138,7 61,3 NUGĐ 34,7 15,3 P = 0,0009 < 0,05 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống gia đình Actual Đạt Không đạt Tổng số mẫu NUĐC 40 10 50 NUCT 144 56 200 184 66 250 Expected NUĐC 36,8 13,2 NUCT 147,2 52,8 P = 0,25 > 0,05 Khác biệt không có ý nghĩa thống kê A.3. So sánh các chỉ tiêu vi phạm giữa các nhóm và loại nƣớc  P. aeruginosa: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 18 32 50 NUTH 1 49 50 NUBV 0 50 50 59 341 400 Expected NUĐC 7,4 42,6 NUCY 29,5 170,5 NUGĐ 7,4 42,6 NUTH 7,4 42,6 NUBV 7,4 42,6 P = 0,0 < 0,001 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê học Loại trừ ảnh hưởng của nước uống nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 18 32 50 58 242 300 Expected NUĐC 9,7 40,3 NUCY 38,7 161,3 NUGĐ 9,7 40,3 P = 0,0048 < 0,05 Khác biệt có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống gia đình Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 8 42 50 NUCY 32 168 200 40 210 250 Expected NUĐC 8 42 NUCT 32 168 P = 1 > 0,05  Coliforms: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 5 45 50 Nhóm 2 48 302 350 53 347 400 Expected Nhóm 1 6,6 43,4 Nhóm 2 46,4 303,6 P = 0,47 > 0,05 Không khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước uống: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 5 45 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 13 37 50 NUTH 3 47 50 NUBV 0 50 50 53 347 400 Expected NUĐC 6,6 43,4 NUCY 26,5 173,5 NUGĐ 6,6 43,4 NUTH 6,6 43,4 NUBV 6,6 43,4 P = 0,00087 < 0,05 Khác biệt rất có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 5 45 50 NUCY 32 168 200 NUGĐ 13 37 50 50 250 300 Expected NUĐC 8,3 41,7 NUCY 33,3 166,7 NUGĐ 8,3 41,7 P = 0,09 > 0,05 Không có sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm Coliforms giữa 3 loại nước uống  Coliform fecal: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 4 46 50 Nhóm 2 37 313 350 41 359 400 Expected Nhóm 1 5,125 44,875 Nhóm 2 35,875 314,125 P = 0,57 > 0,05 Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 4 46 50 NUCY 25 175 200 NUGĐ 11 39 50 NUTH 1 49 50 NUBV 0 50 50 41 359 400 Expected NUĐC 5,1 44,9 NUCY 20,5 179,5 NUGĐ 5,1 44,9 NUTH 5,1 44,9 NUBV 5,1 44,9 P = 0,0 < 0,05 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê Loại trừ ảnh hưởng của nước uống bệnh viện và nước uống trường học Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 4 46 50 NUCY 25 175 200 NUGĐ 11 39 50 40 260 250 Expected NUĐC 8 52 NUCT 32 208 NUGĐ 8 52 P = 0,001 < 0,05 Khác biệt có ý nghĩa thống kê  Streptococcus fecalis: So sánh giữa 2 nhóm nước: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Nhóm 1 1 49 50 Nhóm 2 11 339 350 12 388 400 Expected Nhóm 1 2 49 Nhóm 2 12 339,5 P = 0,5 > 0,05 Không có khác biệt có ý nghĩa So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 1 49 50 NUCY 5 195 200 NUGĐ 4 46 50 NUTH 2 48 50 NUBV 0 50 50 12 388 400 Expected NUĐC 1,5 48,5 NUCY 6 194 NUGĐ 1,5 48,5 NUTH 1,5 48,5 NUBV 1,5 48,5 P = 0,17 > 0,05 Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê  Vi khuẩn kỵ khí sinh H2S: So sánh giữa 2 nhóm nước: Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu Actual Nhóm 1 2 48 50 Nhóm 2 18 332 350 20 380 400 Expected Nhóm 1 2,5 47,5 Nhóm 2 17,5 332,5 P = 0,73 > 0,05 Không khác biệt có ý nghĩa thống kê So sánh giữa các loại nước với nhau: Actual Số mẫu nhiễm Số mẫu không nhiễm Tổng số mẫu NUĐC 2 48 50 NUCY 10 190 200 NUGĐ 6 44 50 NUTH 2 48 50 NUBV 0 50 50 20 380 400 Expected NUĐC 2,5 47,5 NUCY 10 190 NUGĐ 2,5 47,5 NUTH 2,5 47,5 NUBV 2,5 47,5 P = 0,092 > 0,05 Khô