Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đường ruột của cây xuân hoa (pseuderanthemum palatiferum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ********* KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƢỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM ƠN Thành kính khắc ghi cơng ơn cha mẹ sinh thành, đã nuơi dưỡng và giáo dục con nên người. Em xin gửi lịng biết ơn đến: - Ban giám hiệu Trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hĩa Sinh - Trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban chủ nhiệm, Thầy và Cơ bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học. đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập và hồn thành đề tài. Em xin trân trọng biết ơn: - TS. Phan Phước Hiền. - ThS. Mai Đình Trị. đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều thời gian và cơng sức để truyền đạt cho em những kinh nghiệm, kiến thức quí báu, tạo mọi điều kiện tốt cho em hồn thành khĩa luận này. Em xin gửi lời cám ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu, Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ và đĩng gĩp những ý kiến quí báu cho luận văn. - Cơ Nguyễn Thị Huyên, phịng Cơng Nghệ Sinh Học Mơi Trường – Khoa Cơng Nghệ Mơi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành luận văn này. - Ths. Lê Tiến Dũng, Phân Viện Hĩa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian làm luận văn. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Cơng Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ tơi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp. Hồ Chí Minh Trần Kim Hùng Nguyên iv TĨM TẮT TRẦN KIM HÙNG NGUYÊN, Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2005. "KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum)". Đề tài được tiến hành tại - Phịng Hĩa Lý - Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hĩa Sinh ĐH Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh và Phịng Hĩa Lý-Phân Viện Hĩa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. - Phịng Cơng Nghệ Sinh Học Mơi Trường - Khoa Cơng Nghệ Mơi Trường Đại Học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Giáo viên hướng dẫn: TS. PHAN PHƯỚC HIỀN ThS. MAI ĐÌNH TRỊ Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ơ rơ (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thơng dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa… Nhằm khẳng định một phần những cơng dụng dân gian trên một cách cĩ khoa học và tìm kiếm những cây thuốc cĩ thể thay thế kháng sinh trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hĩa học và khả năng kháng họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) của cây Xuân Hoa với hai chủng vi sinh vật đại diện là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Những kết quả đạt được: - Tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật cho thấy trong lá cây Xuân Hoa chứa chủ yếu các chất hữu cơ: phytosterol, polyphenol, đường khử, hợp chất uronic và saponin… - Lá Xuân Hoa được chiết tách bằng 4 loại dung mơi: etthanol, chloroform, ete dầu hỏa và n-butanol. Sau khi chiết tách tiến hành loại dung mơi, thu được 4 loại cao tương ứng với bốn loại dung mơi. - Sau khi thu được các loại cao, tiến hành thử nghiệm khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Kết quả thu cho thấy chỉ cĩ cao chloroform cĩ khả năng kháng hai chủng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là MICSalmonella = 340 μg/ml MICE. coli = 330 μg/ml - Cao ete dầu hỏa sau khi tiến hành chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng thu được hợp chất S là hỗn hợp của hai chất β-Sitosterol và Stigmasterol. v MỤC LỤC Nội dung Trang Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii Tĩm tắt ...................................................................................................................... iv Mục lục ...................................................................................................................... v Danh sách các từ viết tắt ............................................................................................ ix Danh sách các bảng .................................................................................................... x Danh sách các hình .................................................................................................... xi Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Phần I. MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) ................................................ 3 2.1.1.Đặc điểm thực vật học ................................................................................ 3 2.1.2 Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 3 2.1.3.Thành phần hố học ................................................................................... 4 2.1.4.Tính chất dược lý ....................................................................................... 4 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian ........................................................... 4 2.1.4.2. Tác dụng sinh học ......................................................................... 5 2.2. Vi khuẩn đường ruột ............................................................................................ 9 2.2.1.Đại cương về họ vi khuẩn đường ruột ....................................................... 9 2.2.1.1. Định nghĩa ..................................................................................... 9 2.2.1.2. Hình thể ......................................................................................... 9 2.2.1.3.Tính chất nuơi cấy .......................................................................... 9 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hố học ............................................................. 9 2.2.1.5. Sức đề kháng ............................................................................... 10 vi 2.2.1.6. Độc tố .......................................................................................... 10 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên ............................................................... 11 2.2.1.8. Phân loại...................................................................................... 12 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 13 2.3. Salmonella ......................................................................................................... 13 2.3.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 14 2.3.1.1. Hình thái...................................................................................... 14 2.3.1.2. Tính chất nuối cấy ....................................................................... 14 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hố học .......................................................... 15 2.3.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 15 2.3.1.5. Độc tố .......................................................................................... 15 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 15 2.3.1.7. Phân loại...................................................................................... 16 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 16 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh ..................................................................... 16 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thương hàn ...................................................... 17 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn ........................................... 18 2.3.3. Miễn dịch ................................................................................................ 18 2.3.4. Chuẩn đốn vi sinh vật bệnh thương hàn ................................................ 18 2.3.4.1 Cấy máu ....................................................................................... 18 2.3.4.2. Cấy phân ..................................................................................... 19 2.3.4.3. Chuẩn đốn gián tiếp .................................................................. 19 2.3.5. Phịng bệnh .............................................................................................. 20 2.3.5.1. Phương pháp phịng bệnh chung khơng đặc hiệu ....................... 20 2.3.5.2. Phương pháp phịng bệnh đặc hiệu ............................................. 20 2.3.6. Điều trị .................................................................................................... 20 2.4. Escherichia coli ................................................................................................ 21 2.4.1. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 21 2.4.1.1. Hình thái...................................................................................... 21 2.4.1.2. Tính chất nuơi cấy ....................................................................... 21 2.4.1.3. Tính chất hố sinh ....................................................................... 22 vii 2.4.1.4. Sức đề kháng ............................................................................... 22 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên ................................................................. 22 2.4.1.6. Phân loại...................................................................................... 23 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh ................................................................. 23 2.4.3. Chuẩn đốn vi sinh vật ............................................................................ 24 2.4.3.1. Chuẩn đốn trực tiếp ................................................................... 24 2.4.3.2. Chuẩn đốn gián tiếp .................................................................. 24 2.4.4. Phịng bệnh .............................................................................................. 24 2.4.5. Chữa bệnh ............................................................................................... 24 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 26 3.1. Vật liệu .............................................................................................................. 26 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu ...................................... 26 3.1.1.1. Nguyên liệu ................................................................................. 26 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................... 26 3.1.1.3. Hĩa chất cần thiết ....................................................................... 26 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm ........................................ 27 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 28 3.2.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................... 28 3.2.2. Xác định độ ẩm ...................................................................................... 28 3.2.3. Xác định tro tồn phần ............................................................................ 28 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa học thực vật .................................................... 28 3.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................. 28 3.3.2. Cách tiến hành ......................................................................................... 28 3.4. Phương pháp cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa ........................ 34 3.4.1. Điều chế các loại cao ............................................................................. 34 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa ........................................................... 34 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 34 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol ............................................................... 34 3.4.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 34 3.4.2. Cơ lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa ........................................ 36 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cơ lập được ...................................... 36 viii 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ................................................................... 36 3.5.1. Chuẩn bị mơi trường .............................................................................. 36 3.5.2. Pha lỗng cao Xuân Hoa ......................................................................... 36 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục ........................................................... 38 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy ................................................................................... 38 3.5.5. Thử nghiệm ............................................................................................ 39 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 41 4.1. Nguyên liệu........................................................................................................ 41 4.1.1. Xác định độ ẩm ....................................................................................... 41 4.1.2. Xác định độ tro ........................................................................................ 41 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật ........................................................... 41 4.3. Cơ lập một số hợp chất từ cây Xuân Hoa .......................................................... 43 4.3.1. Điều chế các loại cao............................................................................... 43 4.3.1.1.Điều chế cao ete dầu hỏa ............................................................. 43 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 ................................................................... 43 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol ............................................................... 43 4.3.1.4. Điều chế cao nước....................................................................... 43 4.3.2. Cơ lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa ............................................. 44 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hĩa học của hợp chất S ............................................... 47 4.4. Thử nghiệm vi sinh ............................................................................................ 48 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...................................................................... 51 I. Kết luận ................................................................................................................ 51 5.1. Khảo sát thành phần hĩa học ............................................................................. 51 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn .................................................................. 51 II. Đề nghị ......................................................................................................................... 51 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S ...................................................................... 52 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S........................................................................ 53 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S ............................................................. 54 Phụ lục 4: Phổ 13C của hợp chất S ...................................................................... 55 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với β-sitosterol và stigmasterol .......... 56 ix CÁC TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonnance, cộng hưởng từ hạt nhân. DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Tranfer. IR : Infrared, hồng ngoại. MS : Mass Spectrometry, khối phổ. J : Hằng số ghép cặp. s : Singlet, mũi đơn. d : Doublet, mũi đơi. t : Triplet, mũi ba. q : Quartet, mũi bốn. m : Multiplet, mũi đa. SGOT : Glutamic oxalacetic transaminase. SGPT : Glutamic pyruvic transaminase. LD50 : Lethal dose - 50, liều gây chết 50% số cá thể. x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa ....................... 4 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa ........................................................................ 6 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng .................................................................................. 7 Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng .............................................................................. 7 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng ................................................................................ 7 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với hai loại kháng sinh Coli-norgen và Cotrimxazol .................................... 8 Bảng 4.1: Tĩm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học lá cây Xuân Hoa ........................................................................................... 43 Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi .................................................. 43 Bảng 4.3: Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) ................................. 45 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml .............................................................................................. 49 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao CHCl3 trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml ............................................................................................. 50 Bảng 4.6: Kết luận ........................................................................................................ 50 xi DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1: Cây Xuân Hoa ................................................................................................ 3 Hình 2.2: Salmonella typhimurium............................................................................... 14 Hình 2.3: Escherichia coli ............................................................................................ 21 Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn .................................................................................. 38 Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào ........................................ 40 Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S ................................................ 47 Hình 4.2: Cấu trúc hĩa học của β-Sitosterol và Stigmasterol ...................................... 48 Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ ............................................................................................ 49 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli ................................................................... 50 Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella ............................................................ 50 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ Sơ đồ và biểu đồ Trang Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột ......................................................... 13 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật ............... 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thơ từ lá Xuân Hoa ................................... 35 Sơ đồ 4.1: Tĩm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa .................................. 46 Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi ........................................ 44 1 Phần I. MỞ ĐẦU 1.1 . Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) thuộc họ Ơ rơ (Acanthaceae) là một cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam và đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo kinh nghiệm dân gian, cây được sử dụng chữa nhiều bệnh như: trĩ nội, chảy máu, suy nhược thần kinh và thơng dụng nhất là dùng để chữa những rối loạn do nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa… Ở Trung Quốc người ta sử dụng rễ của cây này để chữa vết thương. Nguyễn Thị Lan Oanh và cơng sự đã thử nghiệm dịch chiết lá Xuân Hoa cho thấy lá Xuân Hoa khơng độc với cá chọi. Trần Cơng Khánh và cộng sự đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy trên độc tính cấp, cao tồn phần lá Xuân Hoa khơng thể hiện độc tính, khơng cĩ LD50. Hiện nay nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa diễn ra rất phổ biến. Phương pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh dẫn đến nhiều rủi ro do hiện tượng kháng thuốc ở vi sinh vật gây ra. Do đĩ tìm ra một nguồn vật liệu tự nhiên cĩ khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phương pháp điều trị các bệnh nhiễm khuẩn nĩi chung và nhiễm khuẩn đường tiêu hố nĩi riêng an tồn và hiệu quả hơn. Xuất phát từ yêu cầu trên chúng tơi thực hiện đề tài: "Khảo sát thành phần hĩa học và khả năng kháng một số chủng vi sinh vật đƣờng ruột của cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum)". 1.2 . Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích - Phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật các cấu tử hữu cơ cĩ trong lá Xuân Hoa. - Chiết tách hợp chất hữu cơ từ lá Xuân Hoa bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký bản mỏng. - Khảo sát khả năng kháng hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium của lá cây Xuân Hoa. 2 1.2.1. Yêu cầu - Định tính sơ bộ một số cấu tử hữu cơ cĩ trong lá cây Xuân Hoa theo phương pháp phân tích của trường Đại Học Dược Khoa Rumani. - Cơ lập các loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol và cao nước. Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory concentration) của các loại cao đã cơ lập đối với hai chủng vi sinh vật đường ruột E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. - Chiết tách và tinh sạch được các hợp chất từ lá xuân Hoa và xác định cấu trúc hĩa học của chúng. 3 Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) 2.1.1.Đặc điểm thực vật học [2],[7] -Tên khoa học: Pseuderanthemum palatiferum. - Họ: Ơ rơ (Acanthaceae). - Tên thơng thường: Xuân Hoa, Hồn Ngọc, Nhật Nguyệt, Tù Linh, Trạc Mã. - Phân bố: Việt Nam, Lào. 2.1.2 Đặc điểm hình thái [8],[11] Đây là một lồi cây bụi, sống đa niên, thân non màu xanh lục, phần già hĩa gỗ màu nâu, phân nhiều cành mảnh. Lá mọc đối, cĩ cuống, phiến lá hình lưỡi mác, hai đầu nhọn, dài 12-17 cm, rộng 3,5 - 5 cm, gốc lá hơi men xuống. Cụm hoa dài 10 - 16 cm, ở kẽ lá hoặc đàu cành, gồm các xim ngắn ở các mấu. Hoa lưỡng tính, khơng đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, cĩ 5 thùy chia làm hai mơi, mơi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nữa chiều dài của thuỳ, mơi dướigồm 3 thùy to, thùy giữa của mơi dưới cĩ các chấm màu tím. Hai nhị sinh sản với chỉ nghị ngắn đính trên họng tràng, bao phấn đính gốc, mầu tím, hai nhị lép. Hai chỉ nhị bầu trên nhẵn dài khoảng 1,5 cm, hai lá nỗn liền nhau tạo thành bầu hai ơ; vịi nhị dài khoảng 2,5 – 2,7 cm, nửa dưới của vịi cĩ lơng, 2/3 của vịi trên cĩ màu tím nhạt. Quả nang, hai ơ, mỗi ơ chứa hai hạt. Cây ra hoa từ tháng 4 – 5. Cây mọc hoang ra hoa gần như quanh năm. Cây được trồng nhiêu nơi như một cây thuốc gia đình. Hình 2.1: Cây Xuân Hoa 4 2.1.3.Thành phần hố học [1],[9],[13],[17],[19] Bằng các phản ứng định tính hố học, đã sơ bộ xác định trong lá cây Xuân Hoa cĩ chứa: acid hữu cơ, carotenoid, coumarin, đường tự do, phytosterol, flavonoid, saponin. Ngồi ra lá Xuân Hoa cịn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lượng tổng số khá cao (751 – 1365 mg%). Đặc biệt hàm lượng isoleucin và leucin rất cao (25 – 150 mg% và 46 – 85 mg%). Đĩ là các acid amin giữ vai trị quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi mệt cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa cịn giàu valin (29 – 1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin cịn ảnh hưởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hĩa quan trọng. Các nguyên tố đa lượng và vi lượng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Khơng phát hiện các nguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lượng vanađi khá cao (3,75 mg/100 g lá tươi) Bảng 2.1: Hàm lượng một số nguyên tố đa vi lượng trong lá Xuân Hoa Chất khống đa lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Chất khống vi lượng Hàm lượng (mg/100 g lá tươi) Ca 875,5 Fe 38,75 Mg 837,6 Al 37,5 K 587,5 V 3,75 Na 162,7 Cu 0,43 Mn 0,34 Ni 0,19 Những nghiên cứu gần đây của Trần Cơng Khánh và cộng sự về thành phần hĩa học trong lá cây Xuân Hoa đã phân lập được nhiều chất hữu cơ như: Phytol, poriferasterol, beta-D-glucoperanosyl-3-O-sitosterol… 2.1.4.Tính chất dƣợc lý 2.1.4.1.Theo kinh nghiệm dân gian [8],[10] Ở Trung Quốc người ta dùng rễ của cây Xuân Hoa để chữa vết thương, đau loét dạ dày, suy nhược thần kinh. Ở Việt Nam cây Xuân Hoa đã được dùng trong dân gian từ những năm 80. Theo tài liệu truyền tay thì cây Xuân Hoa cĩ một số tác dụng sau: - Khơi phục sức khoẻ cho người ốm yếu, suy nhược thần kinh, làm việc quá sức. 5 - Chữa rối loạn tiêu hố, tiêu chảy, lỵ, táo bĩn, đau bụng khơng rõ nguyên nhân. - Chấn thương chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thương sọ não. - Chữa đau dạ dày, loét thành tá tràng, chảy máu đường ruột, viêm loét đại tràng, trĩ nội. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trướng, làm giảm đau khi bị ung thư gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp cho người bị huyết áp cao hoặc thấp. Lá Xuân Hoa khơng cĩ mùi, khơng vị, hơi nhớt. Người ta thường dùng lá tươi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nước, giã nát lấy nước uống hoặc nấu ăn. Liều lượng phụ thuộc vào từng bệnh, từng người; thơng thường ăn từ 3 – 7 lá một ngày chia làm hai lần. Thời gian điều trị tùy thuộc vào bệnh, như khi bị rối loạn tiêu hĩa, tiêu chảy, lỵ chỉ ăn 7 – 14 lá là khỏi; đái rắt, đái buốt, đái ra máu thì ăn 14 – 20 lá; viêm đại tràng co thắt thì ăn kết hợp với lá mơ lơng trong bữa ăn, từ 1 – 2 tháng. Ngồi ra, lá Xuân Hoa cịn được dùng để chữa bệnh cho gia súc như chữa bệnh cho gà rù, chĩ cảnh sau khi đẻ cho ăn 1 – 2 lá, gà chọi sau khi chọi cho ăn 1 – 3 lá là hồi phục ngay. 2.1.4.2. Tác dụng sinh học [3],[4],[18] Năm 1999, Trần Cơng Khánh và cộng sự ở ĐH Dược Hà Nội thử nghiệm độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa trên chuột.  Thử độc tính cấp Cho chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa với các nồng độ khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột. Đưa thuốc trực tiếp vào dạ dày chuột bằng bơm tiêm 1 ml cĩ kim đầu tù. Quan sát đại thể các phủ tạng sau khi mổ chuột và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc: tim, gan, thận, dạ dày, ruột. + Kết quả: Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg trọng lượng chuột, sau khi uống thuốc và suốt qua trình thí nghiệm chuột thuốc khơng thay đổi trạng thái hoạt động. Chuột vẫn bị tới, bị lui, leo trèo, chùi râu, liếm đuơi, rữa mặt… 6 Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng, chuột sau khi uống thuốc chuột cĩ giảm hoạt động, nhưng sau 1 giờ trở lại bình thường, chuột nằm rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. Qua đêm, rải rác chuột cĩ đi phân nát. Tất cả chuột ở các liều trên đều khơng chết. Chuột sống hồn tồn khỏe mạnh sau 24 giờ. Sau 24 giờ giết ngẫu nhiên 3 chuột ở các liều: 0,83 g/kg; 9,19 g/kg và 11,5 g/kg thể trọng chuột, quan sát đại thể cho thấy các phủ tạng hồn tồn bình thường. Quan sát vi thể cho kết quả trình bày ở bảng II.2 Bảng 2.2: Kết quả xét nghiệm sinh thiết của chuột được cho uống cao Xuân Hoa Cơ quan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 0,83 g/kg Cơ tim bình thường Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Quản cầu và các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Khơng cĩ tổn thương thực thể ở các tạng. 9,19 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất cĩ thối hố nhẹ. Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thường. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Cĩ thối hố nhẹ ở gan. 11,5 g/kg Cơ tim bình thường Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất cĩ thối hố nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ. Niêm mạc dạ dày và các tuyến bình thường. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thường. Cĩ tổn thương nhẹ ở gan và thận + Kết luận: Cao tồn phần lá Xuân Hoa khơng gây chết chuột ở tất cả các liều. Chuột sống hồn tồn qua 48 giờ. Như vậy trên độc tính cấp, cao tồn phần lá Xuân Hoa khơng thể hiện độc tính, khơng cĩ LD50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan Tiến hành gây ngộ độc gan chuột nhắc bằng carbon tetrachloride (CCl4) với liều: 1 ml CCl4/kg thể trọng và 0,5 ml CCl4/kg thể trọng. Sau đĩ tiến hành xác định khả năng ức chế peroxy hĩa lipid thơng qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyde (MDA), một sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào theo phương pháp của E.A.Makarova, 1989; J.Robak và cộng sự. 7 Sản phẩm MDA cĩ khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine cĩ màu hồng và cĩ đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm. Cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lượng MDA tính theo cơng thức: X = E x 30,8 Trong đĩ: X = hàm lượng MDA; E = độ hấp thu ở 532 nm; 30,8 = hệ số tắt phân tử. Kết quả: Kết quả đo MDA trong gan chuột được trình bày ở bảng II.3 Bảng 2.3: Hàm lượng MDA của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 1 ml/kg thể trọng Lơ Thí nghiệm n (số chuột) ETB MDATB 1 Đối chứng 8 0,163 5,0296 2 Gây mơ hình viêm gan, khơng dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,458 14,1156 3 Gây mơ hình viêm gan, cĩ dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,348 10,7091 Như vậy ở lơ uống cao tồn phần Xuân Hoa hàm lượng MDA cĩ giảm so với mơ gây mơ hình (giảm từ 14,1156 xuống cịn 10,7091) + Hàm lượng men gan quá cao (AST, ALT), khơng đo được trên máy. + Xét nghiệm vi thể: chưa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do tác dụng điều trị của thuốc. Bảng 2.4: Hàm lượng MDA của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng Lơ Thí nghiệm n (số chuột) ETB MDATB 1 Đối chứng 8 0,1915 5,8982 2 Gây mơ hình viêm gan, khơng dùng thuốc Xuân Hoa. 12 0,385 11,547 3 Gây mơ hình viêm gan, cĩ dùng thuốc Xuân Hoa. 8 0,203 6,2463 Kết quả cho thấy lơ cĩ uống cao tồn phần lá Xuân Hoa hàm lượng MDA cĩ giảm so với lơ gây mơ hình (giảm từ 11,547 xuống cịn 6,2463). Xác định hàm lượng men gan của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 0,5ml/kg thể trọng: 8 Bảng 2.5: Hàm lượng men gan của nhĩm chuột bị gây độc ở liều 0,5 ml/kg thể trọng: Lơ n (số chuột) AST (U/I) ALT (U/I) 1 8 270 432 2 12 9668 10878 3 8 8740 10533 Hàm lượng men gan cĩ giảm nhưng chưa đáng kể. Xét nghiệm vi thể: lơ chuột được uống cao tồn phần lá Xuân Hoa và gây mơ hình, nhận thấy vùng hoại tử xung quanh tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ vẫn tồn tại, các tế bào ở các vùng thối hĩa đã bắt đầu thu nhỏ và cĩ xu hướng hồi phục. Kết luận: ở liều gây ngộ độc gan 1 ml CCl4/kg thể trọng, gan chuột bị hoại tử nặng, các giá trị AST, ALT tăng lên quá cao, khơng đọc được trên máy, nhưng hàm lượng MDA cĩ giảm rõ rệt từ 14,1156 xuống cịn 10,7091 và chưa thấy cĩ dấu hiệu bình phục của tế bào gan. Với liều gây độc 0,5 ml/kg thể trọng, hàm lượng MDA cũng giảm rất rõ rệt, từ 11,574 xuống cịn 6,2463, hàm lượng men gan cũng giảm nhưng khơng đáng kể, cĩ dấu hiệu bình phục của gan. Như vậy cĩ thể sơ bộ kết luận: cao đặc tồn phần lá cây Xuân Hoa cĩ tác dung ức chế quá trình peroxy hĩa lipid màng tế bào, nghĩa là cĩ xu hướng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm. Năm 2004, Huỳnh Kim Diệu và Trần Văn Hịa đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang được sử dụng trị bệnh tiêu chảy heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lượt: Bột Xuân Hoa 92,86 %; Coli- norgen 90,48 %; Cotrimxazol 83,33 %. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14 %; 9,52 %; 14,29 %. Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chửa trị bệnh tiêu chảy của bột Xuân Hoa với 2 loại kháng sinh Coli-nogen và Cotrimxazol Loại thuốc Số heo thử nghiệm Số luợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Số con % Số con % Số con % Bột Xuân Hoa 42 10 23,81 29 69,05 39 92,86 Coli- norgen 42 10 23,81 25 59,52 38 90,48 Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33 9 Kết quả phân lập vi khuẩn từ phân heo bệnh sau khi điều trị cho thấy tác nhân gây bệnh là E. coli, khơng tìm thấy tác nhân gây bệnh khác như: Salmonella, Proteus và Pseudomonas. Ngồi ra Huỳnh Kim Diệu và cộng sự cịn tiến hành thử nghiệm độc tính của cây Xuân Hoa trên chuột cho thấy: Khơng xác định được LD50: kết luận lá Xuân Hoa khơng cĩ độc tính cấp diễn. Thử độc tính bán trường diễn: Sau 60 ngày tác động thuốc các chỉ tiêu sinh lý máu: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu bình thường. Và các chỉ số sinh hố của gan và thận: SGOT, SGPT, Bilirubin tồn phần, Creatinin khơng khác biệt so với lơ đối chứng. Tiến hành giải phẩu bệnh lý chức năng gan và thận: khảo sát vi thể nhận thấy mơ gan và thận bình thường, khơng cĩ hiện tượng hủy hoại tế bào gan và thận. Như vậy lá Xuân Hoa khơng gây độc tính bán cấp. 2.2. Vi khuẩn đƣờng ruột [3],[12] 2.2.1.Đại cƣơng về họ vi khuẩn đƣờng ruột 2.2.1.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đường ruột (Enterobacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi; khơng cĩ men oxidase; len men đường glucose cĩ kèm theo sinh hơi hoặc khơng; khử nitrat thành nitrit; cĩ thể di động hoặc khơng, nhưng nếu di động thì cĩ nhiều lơng ở xung quanh thân; khơng sinh nha bào. 2.2.1.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thước trung bình 2 - 4 μm x 0,4 - 0,6 μm. Một số lồi hình thể khơng ổn định,cĩ thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì cĩ nhiều lơng phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột khơng bao giờ sinh nha bào. Một số cĩ vỏ, cĩ thể quan sát được bằng kính hiển vi thơng thường. 2.2.1.3.Tính chất nuơi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột cĩ thể mọc được trên mơi trường nuơi cấy thơng thường. Trong mơi trường lỏng, cĩ thể lắng cặn hoặc làm đục mơi trường; cĩ thể phát triển thành váng trên bề mặt; nhưng cũng cĩ thể vừa làm đục mơi trường vừa cĩ cặn ở dưới đáy ống. 10 Trên mơi trường đặc cĩ 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: khuẩn lạc trịn, bờ đều, nhẵn bĩng. - Dạng R: mặt khuẩn lạc khơ, xù xì. Thường gặp khi nuơi cấy giữ chủng. - Dạng M: hình thức phát triển này thường gặp ở những vi khuẩn cĩ khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thước lớn hơn khuẩn lac dạng S và các khuẩn lạc cĩ xu hướng hịa vào nhau. 2.2.1.4.Tính chất sinh vật hố học Những tính chất sau đây thường được xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đường ruột: - Di động hoặc khơng di động. - Lên men hoặc khơng lên men một số loại đường. Hai loại thường được xác đinh nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay khơng sinh hơi khi lên men đường. - Cĩ hay khơng cĩ một số enzym. Hai enzym thường được xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hố protein, acid amin hoặc các dẫn chất cĩ lưu huỳnh. - Phát triển được hay khơng phát triển được trên một số mơi trường tổng hợp, ví dụ khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất cĩ trong mơi trường Simmons. Dựa vào tính chất chung của họ vi khuẩn đường ruột, ta cĩ thể loại trừ hoặc xếp một vi khuẩn nào đĩ vào họ này. Ngồi các tính chất đĩ, nhiều tính chất sinh vật hĩa học khác cũng được dùng để phân loại Enterobateriaceae 2.2.1.5. Sức đề kháng Vì khơng cĩ khả năng sinh nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột khơng cĩ sức đề kháng cao với những điều kiện hố lý đặc biệt của mơi trường. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sơi 1000C và bởi các hĩa chất sát khuẩn thơng thường. Tuy nhiên nhiều lồi vi khuẩn đường ruột cĩ khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngồi mơi trường. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 11 2.2.1.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đường ruột đều cĩ nội độc tố. Bản chất hĩa học của nội độc tố là lipopolysaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ được giải phĩng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố cĩ khối lượng phân tử từ 100.000 đến 500.000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc khơng cao bằng ngoại độc tố nhưng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố cĩ thể gây ra tình trạng sốc, nếu khơng được điều trị tích cực kịp thời, dể chuyển thành sốc khơng hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố khơng bị mất tính độc ở 1000C trong 30 phút. Nội độc tố là chất cĩ khả năng gây sốt. Một số thành viên của họ vi khuẩn đường ruột cĩ khả năng sinh ngọai độc tố như S.shiga, E.coli loại ETEC (enterotoxigenic E.coli). Ngoại độc tố của S.shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều; ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.2.1.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đường ruột cĩ 3 nhĩm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Kháng nguyên O là kháng nguyên thân của vi khuẩn. Đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Kháng nguyên O là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đĩ protein làm cho phức hợp cĩ tính kháng nguyên; poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên cịn lipid quyết định tính độc. Kháng nguyên O khơng bị phá hủy ở 1000C trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhưng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn khơng cĩ vỏ hoặc màng bọc (khơng cĩ kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngồi cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẻ xãy ra phản ứng ngưng kết, gọi là “hiện tượng ngưng kết O” với các hạt ngưng kết nhỏ, lắc khĩ tan. Ở những vi khuẩn cĩ kháng nguyên K, hiện tượng ngưng kết O cĩ thể bị che lấp bởi kháng nguyên này. Kháng nguyên O cĩ tính đặc hiệu cao, nĩ thường được dùng để 12 phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O người ta cĩ thể chia một lồi vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Kháng nguyên H là kháng nguyên lơng của tế bào vi khuẩn, chỉ cĩ ở những vi khuẩn cĩ lơng. Kháng nguyên H cĩ bản chất là protein, dể bị phá huỷ ở 1000C hoặc trong cồn 50% nhưng khơng bị phân hủy trong formol 0,5% Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xãy ra “hiện tượng ngưng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tượng ngưng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn cĩ khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tương ứng sẽ trở thàng khơng di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H cĩ thể được sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tương ứng. Để cĩ kháng nguyên O, người ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để cĩ kháng nguyên H người ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá hủy, kháng nguyên H vẫn cịn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Kháng nguyên K là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt. kháng nguyên K nằm bên ngồi kháng nguyên thân. Nĩ cĩ thể dưới dạng một lớp vỏ dày, quan sát được bằng kính hiển vi quang học thơng thường (như ở Klebsiella) hoặc dưới dạng một lớp rất mỏng chỉ cĩ thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (như ở S.typhy). Kháng nguyên K, nếu che phủ hồn tồn kháng nguyên O sẽ ngăn cách khơng cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngưng kết khơng xảy ra. Trong trường hợp này cần phải phá hủy kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải được nuơi cấy trong điều kiện khơng sinh ra được khang nguyên này. 2.2.1.8. Phân loại Vấn đề phân loại của Enterobacteriaceae đã từng được tranh luận rất nhiều. ngồi cách phân loại của Bergey cĩ ba cách phân loại khác: Cách phân loại của tiểu ban về Enterobacteriaceae thuộc Hội Vi sinh học quốc tế, năm 1958, chia họ này thành 12 giống. 13 Cách phân loại của Kauffmann, năm 1966, chia Enterobateriaceae thành 3 tộc và 12 giống. Cách phân loại của Ewing, năm 1986, chia Enterobacteriaceae thành 8 tộc và 14 giống.Nhiều tác giả cho rằng cách phân loại của Ewing là hợp lý hơn vì nĩ giúp ích nhiều trong chuẩn đốn vi sinh vật và trong nghiên cứu dịch tể học. Dưới đây là sơ đồ phân loại họ Enterobacteriaceae của Ewing. Sơ đồ 2.1: Phân loại họ vi khuẩn đường ruột Tộc I: Escherichieae Giống I: Escherichia. Giống II: Shigella. Tộc IV: Citrobactereae Giống I: Citrobacter Tộc VII: Yersinieae Giống I: Yersinia Tộc II: Edwardsielleae Giống I: Edwardsiella Tộc V: klebsielleae Giống I: Klebsiella Giống II: Enterobacter Giống III: Hafnia Giống IV: Serratia Tộc VIII: Erwinieae Giống I: Erwinia Tộc III: Salmonelleae Giống I: Samonella Tộc VI: Proteeae Giống I: Proteus Giống II: Morganella Giống III: Providencia 2.2.1.9. Khả năng gây bệnh Nĩi về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đường ruột, trước hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa. Họ vi khuẩn đường ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thương ở bộ máy tiêu hĩa rất khác nhau tùy theo từng giống, từng lồi. Ngồi đường tiêu hĩa, các vi khuẩn đường ruột cịn cĩ khả năng gây bệnh ở nhiểu cơ quan khác như tiết niệu, thần kinh, hơ hấp… Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đường tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Cĩ thể nĩi khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng cĩ thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đường ruột. Bệnh lý ở các mơ, các cơ quan khác nhau cĩ thể là hậu quả của bệnh lý đường tiêu hố, cĩ thể song hành với bệnh lý ở đường tiêu hĩa, nhưng cũng cĩ thể chỉ biểu 14 hiện bệnh lý ở một cơ quan nào đĩ trong khi đường tiêu hĩa vẫn hồn tồn bình thường. 2.3. Salmonella [3],[12],[27] Mặc dù hiện nay người ta đã biết đến mấy chục lồi đến hàng nghìn typ huyết thanh khác nhau thuộc giống Salmonella, S.typhi vẫn là lồi được quan tâm nhiều nhất khơng những bởi vai trị gây bệnh của nĩ mà vì nĩ gắn liền với những mốc lịch sử quan trọng trong quá trình nghiên cứu về Salmonella nĩi chung và bệnh thương hàn nĩi riêng. Bệnh thương hàn đã được biết đến từ rất lâu. Y văn thế giới ghi nhận sự mơ tả về bệnh này lần đầu tiên vào năm 1820 của Bretoneau. Năm 1880, Grafky đã mơ tả hình ảnh vi khuẩn quan sát được trên tiêu bản làm từ hạch của bệnh nhân bị chết vì bệnh thương hàn và ơng cũng là người đầu tiên phân lập được S.typhi vào năm 1884. Năm 1896, Widal chứng minh rằng huyết thanh của bệnh nhân thương hàn cĩ khả năng ngưng kết S.typi. Đây là cơ sở cho phương pháp chuẩn đốn huyết thanh học. Năm 1917, Felix đã mơ tả kháng nguyên thân và kháng nguyên lơng của Salmonella, đặt cơ sở cho phương pháp phân tích kháng nguyên của vi khuẩn. Năm 1935, Reilly đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của bệnh thương hàn. Ơng chứng minh rằng hệ thần kinh thực vật cĩ vai trị trong việc gây ra những tổn thương ở ruột. 2.3.1. Đặc điểm sinh học 2.3.1.1. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 μm. Cĩ nhiều lơng xung quanh thân (trừ S.gallinarum và S.pullorum), rất di động, khơng cĩ vỏ, khơng sinh bào tử. 15 Hình 2.2: Salmonella typhimurium 2.3.1.2. Tính chất nuơi cấy Cĩ khả năng phát triển trong điều kiện nuơi cấy hiếu khí hay kỵ khí tùy ý. Rất dễ nuơi cấy, mọc dễ dàng trên các mơi trường nuơi cấy thơng thường, nhiệt độ thích hợp là 370C nhưng cĩ thể phát triển được trong khoảng nhiệt độ 60C – 420C, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9. Trên mơi trường lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuơi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ mơi trường, sau 18 giờ mơi trường đục đều. Trên mơi trường thạch thường: Khuẩn lạc trịn, lồi, bĩng, thường khơng màu hoăc màu trắng sáng. Trên mơi trường phân lập SS: khuẩn lạc cĩ màu hồng; trên mơi trường Istrati khuẩn lạc cĩ màu xanh. 2.3.1.3. Tính chất sinh vật hố học Khơng lên men lactose (lồi S.arizona lên men lactose chậm). Lên men đường glucose thường sinh hơi (trừ S. typhi). Sử dụng được citrat ở mơi trường Simmons (trừ S. typhi và S. paratyphiA). Catalase (+), oxidase (-), urease (-). Lysin decarboboxylase (+) (trừ S. paratyphi A). ONPG (-), RM (+), VP (-). H2S (-) (một số chủng trong lồi S. paratyphi A cĩ khả năng sinh H2S). 2.3.1.4. Sức đề kháng Cĩ thể tồn tại trong nước 2 – 3 tuần, trong phân 2 – 3 tháng. Trong nước đá cĩ thể sống được 2 – 3 tháng. 16 Bị chết ở nhiệt độ 500C trong vịng 1 giờ hoặc 1000C trong vịng 5 phút. Với các thuốc sát khuẩn thơng thường, trực khuẩn Salmonella dễ bị tiêu diệt. 2.3.1.5. Độc tố - Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoăc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Peyer bị phù nề, đơi khi hoại tử. Nội độc tố cĩ vai trị quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella. - Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện nuơi cấy invivo và nuơi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố cĩ thể điều chế thành giải độc tố. 2.3.1.6. Cấu tạo kháng nguyên Kháng nguyên O: Hiện nay đã tìm thấy gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Dựa trên kháng nguyên O người ta chia Salmonella thành các nhĩm A.B,C,D… Mỗi nhĩm mang một yếu tố kháng nguyên đặc hiệu nhĩm. Mỗi lồi mang một yếu tố khác nhau, những yếu tố đĩ cấu tạo thành cơng thức O của từng lồi. Kháng nguyên H: Hầu hết Salmonella đều cĩ kháng nguyên H trừ S. gallinarum và S. pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella cĩ thể cĩ tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những lồi Salmonella cĩ kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Những lồi cĩ kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép khi nuơi cấy chúng trong mơi trường cĩ kháng huyết thanh tương ứng với kháng nguyên H thì chúng vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Dựa vào kháng nguyên H người ta chia Salmonella thành các serotyp (typ huyết thanh). Kháng nguyên H lai được chia thành hai phase: phase 1 đặc hiệu và phase 2 khơng đặc hiệu. Thường các chủng Salmonella đều cĩ cả hai phase này (trừ S. typhi và S. paratyphi). Kháng nguyên K: Kháng nguyên K chỉ cĩ ở S. typhy và S. paratyphi C và cịn được gọi là kháng nguyên Vi (Virulence). Kháng nguyên Vi dưới dạng một lớp rất mỏng khơng quan sát được bằng kính hiển vi quang học thơng thường. Tuy nhiên kháng nguyên Vi cĩ thể bao phủ kín kháng nguyên O, trong trường hợp này vi khuẩn sẽ khơng ngưng kết mặc 17 dù trộn với kháng huyết thanh O đặc hiệu. Muốn cho hiện tượng ngưng kết O xuất hiện, cần phải làm nĩng huyền dịch vi khuẩn (1000C trong 20 phút) để tách kháng nguyên K ra khỏi tế bào. Kháng nguyên Vi khơng tham gia trong việc gây bệnh. 2.3.1.7. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, Salmonella được chia thành các nhĩm, các lồi và các typ huyết thanh. Lúc đầu, các lồi Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. typhy và các S. paratyphi A,B,C (typhoid = bệnh thương hàn), hoặc theo vật chủ như S. typhimurium gây bệnh ở chuột (murine = chuột). Về sau, người ta thấy rằng, một lồi Salmonella cĩ thể gây ra một số hội chứng và cĩ thể phân lập ở nhiều lồi động vật khác nhau. Vì những lý do đĩ, cuối cùng người ta gọi các lồi mới phát hiện đuợc theo tên địa phương ở đĩ nĩ được phân lập như S. teheran, S. congo, S. london. Đến nay người ta đã phát hiện được trên 1500 typ huyết thanh Salmonella. 2.3.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh 2.3.2.1. Khả năng gây bệnh Tùy theo từng lồi, Salmonella cĩ thể chỉ gây bệnh cho người, chỉ gây bệnh cho động vật, nhưng cũng cĩ thể vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho động vật. Những lồi Salmonella cĩ khả năng gây bệnh cho người được quan tâm nhiều hơn cả là: S. typhi: Lồi này chỉ gây bệnh cho người, nĩ là vi khuẩn quan trong nhất trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn. S. paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người. Là căn nguyên gây bệnh thương hàn, ở nước ta, tỷ lệ phân lập được chỉ đứng sau S. typhi. S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh ở người, nhưng cĩ thể gây bệnh cho động vật. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập được vi khuẩn này cao hơn ở nước ta. S. paratyphi C: Vừa cĩ khả năng gây bệnh thương hàn vừa cĩ khả năng gây viêm dạ dày, ruột và nhiễm khuẩn huyết. Thường gặp ở các nước Đơng Nam Á. S. typhimurium và S. enteritidis: vừa cĩ khả năng gây bệnh cho người vừa cĩ khả năng gây bệnh cho động vật. Cĩ thể gặp ở nhiều nước khác nhau trên thế giới. Chúng là nguyên nhân chủ yếu của nhiểm độc thức ăn do Salmonella. 18 S. choleraesuis: là căn nguyên thường gặp trong các nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. 2.3.2.2. Cơ chế gây bệnh thƣơng hàn Bệnh thương hàn do S. typhi và S. paratyphi A, B, C gây ra. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hĩa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn. Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 105 – 107. Sau khi vào ống tiêu hố, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột rồi vào các hạch mạc treo ruột. Ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàn bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác. Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân. Một số vi khuẩn đi đến thận và được đào thải qua nước tiểu. Tới mảng payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên. Vi khuẩn thương hàn gây bện bằng nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và cĩ thể gây ra thủng ruột, vị trí tồn thương thường ở các mảng payer. Đây là biến chứng thường găp do bệnh nhân ăn sớm khi chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu đi lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn tồn thân nhiệt tăng cao, sốt. Thân nhiệt tăng nhưng nhịp tim khơng tăng. Bệnh nhân thường cĩ dấu hiệu li bì, cĩ thể hơn mê, trụy tim mạch, cĩ thể dẫn đến tử vong. Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng lâm sàng, khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại ở túi mật. Tình trạng này cĩ thể kéo dài nhiêu năm. Họ trở thành nguồn truyền bệnh rất nguy hiểm. 2.3.2.3. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn Bệnh xãy ra do ăn phải thực phẩm nhiễm Salmonella, thường do ăn thức ăn khơng được bảo quản tốt. Thời gian ủ bệnh thường vào khoảng 10 đến 48 giờ (đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ khoảng vài ba giờ). Sau thời gian ủ bệnh bệnh nhân sốt, nơn và tiêu chảy. Ở người lớn rối loạn tiêu hĩa thường kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi tự khỏi. Một số ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài trong nhiều tháng. 19 Một số lồi Salmonella chỉ gây nhiễm độc thức ăn ở người lớn lại cĩ thể gây ra tình trạng bệnh lý rất nặng ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh. Bệnh nhi cĩ thể nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm xương. Cĩ thể gây ra các vụ dich ở các khoa nhi. 2.3.3. Miễn dịch Sau khi mắc bệnh thương hàn, trong huyết thanh bệnh nhân cĩ các kháng thể chống lại kháng nguyên O, H (và cả kháng nguyên Vi đối với những bệnh do S. typhy và S. paratyphy C). Tuy nhiên ngày nay người ta nhận thấy vai trị bảo vệ của kháng thể trong huyết thanh khơng đầy đủ. Kháng thể lớp IgA trong dich tiết tại chỗ cĩ vai trị rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ. Người ta cũng cĩ những bằng chứng về miễn dịch qua trung gian tế bào chống Salmonella. Tế bào lympho ở tổ chức bạch huyết tại ruột cĩ khả năng đề kháng tự nhiên đối với Salmonella. 2.3.4. Chuẩn đốn vi sinh vật bệnh thƣơng hàn 2.3.4.1 Cấy máu Cấy máu được tiến hành lúc bệnh nhân đang sốt cao, cần lấy máu trước khi điều trị kháng sinh. Lấy 5 – 10 ml máu tĩnh mạch ngay vào tuần đầu của bệnh cấy vào bình canh thang (thường dùng canh thang cĩ mật bị), ủ ở 370C, theo dõi hàng ngày. Vi khuẩn thương hàn thường mọc sau 24 đến 48 giờ, nếu chưa mọc thì tiếp tục theo dõi tiếp 2 tuần lễ, nếu khơng mọc thì mới kết luận âm tính.. Khi vi khuẩn mọc, mơi trường đục và cĩ váng thì nhuộm Gram, kiểm tra hình thể và tính chất bắt màu. Nếu là Gram (-) thì cấy chuyển sang mơi trường chọn lọc và xác định tính chất sinh vật hố học. Cuối cùng xác định cơng thức kháng nguyên bằng kháng huyết thanh mẫu. Nếu chưa điều trị bằng kháng sinh, ở tuần lễ đầu, tỉ lệ cấy máu dương tính tới 90%; tuần thứ 2 khoảng 70 – 80%; tuần thứ 3 khoảng 40 – 60%. Cấy máu cĩ giá trị nhất trong chuẩn đốn. Nếu cấy máu dương tính cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn. 2.3.4.2. Cấy phân Nên cấy phân vào mơi trường tăng sinh để Salmonella phát triển nhiều và kìm hãm các vi khuẩn khác. Sau đĩ cấy chuyển vào mơi trường cĩ tinh ức chế chọn lọc. 20 Mơi trường phân lập thích hợp nhất là SS (Salmonella – Shigella), ở nước ta các phịng xét nghiệm thường dùng mơi trường Endo hoặc mơi trường Istrati vì nĩ dễ sản xuất trong điều kiện phịng thí nghiệm và cho kết quả tốt. Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập được vi khuẩn cũng khơng cho phép ta xác định chắc chắn bệnh nhân mắc bệnh vì người lành cũng cĩ thể mang vi khuẩn thương hàn. Cấy phân ngồi mục đích chuẩn đốn cĩn cĩ giá trị kiểm tra sau khi bệnh nhân đã hết các dấu hiệu lâm sàn cĩ cịn tiếp tục đào thải vi khuẩn nữa hay khơng. Cấy phân cịn là phương pháp để phát hiện người lành mang vi khuẩn. 2.3.4.3. Chuẩn đốn gián tiếp Tiến hành phản ứng Widal để xác định kháng thể trong huyết thanh. Sau khi nhiễm Salmonella 7 – 10 ngày, trong máu sẽ xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên O, sau 12 – 14 ngày xuất hiện kháng thể kháng kháng nguyên H. Kháng thể tồn tại trong máu trung bình là 3 tháng đối với kháng thể O và 1 - 2 năm đối với kháng thể H. Phản ứng Widal là phản ứng ngưng kết. Huyết thanh bệnh nhân được pha lỗng dần thành nhiều độ đậm khác nhau, trộn riêng biệt với kháng nguyên O và kháng nguyên H để xác định hiệu giá kháng thể O. Trong giai đoạn đầu cĩ thể chỉ thấy kháng thể O. Đến giai đoạn tồn phát sẽ thấy cả kháng thể O và H. Việc phân tích kết quả xét nghiệm ở lần thứ nhất nhiều khi rất khĩ và thường khơng cho phép ta kết luận chắc chắn. Phản ứng cần được làm hai lần để xác định động lực kháng thể: lần đầu làm ở tuần thứ nhất, lần hai làm ở tuần thứ hai của bệnh. Nếu động lực kháng thể cao thì mới cho phép chuẩn đốn chắc chắn. Nhược điểm của phương pháp chuẩn đốn gián tiếp là cho kết quả chậm. 2.3.5. Phịng bệnh 2.3.5.1. Phƣơng pháp phịng bệnh chung khơng đặc hiệu Những biện pháp chủ yếu là: Thực hiện vệ sinh ăn uống: Ăn chín, uống nước đã được đun sơi, rửa tay trước khi ăn, diệt ruồi. Cung cấp và sử dụng nước sạch. Quản lý, xử lý phân 21 Phát hiện người lành mang vi khuẩn, đặc biệt lưu ý những người liên quan trực tiếp với ăn uống tập thể, như những người cấp dưỡng ở các cơ quan, những người chế biến thức ăn, phục vụ ở các cửa hàng ăn uống. Chuẩn đốn sớm và cách ly bệnh nhân kịp thời, xử lý chất thải của bệnh nhân. Đối với xúc vật bị bệnh: chữa triệt để hoặc giết. 2.3.5.2. Phƣơng pháp phịng bệnh đặc hiệu Trước đây người ta xử dụng rộng rãi vacxin TAB. Đây là loại vacxin chết, 1 ml chứa khoảng 1 tỉ S. typhi, 250 triệu S. paratyphi A và 250 triệu S. paratyphi B. Vacxin TAB được đưa vào cơ thể qua đường tiêm, hiệu lực khơng cao và chỉ duy trì được 6 tháng. Sau đĩ người ta sản xuất loại vacxin chứa kháng nguyên Vi của S. typhi, đưa vào cơ thể bằng đường tiêm, cĩ hiệu lực bảo vệ trên 70 % với liều 25 μg. Ngày nay, nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới đang nghiên cứu loại vacxin sống, giảm độc lực, đưa vào cơ thể bằng đường uống để kích thích miễn dịch tiết tại ruột. Loại vacxin này đã được thử nghiệm ở một số nước nhưng kết quả đã được cơng bố khác nhau khá nhiều. 2.3.6. Điều trị Những kháng sinh thường được dùng để điều trị Salmonella là chloramphenicol và ampicillin. Trước đây chloramphenicol là loại kháng sinh cĩ hiệu lực gần như tuyệt đối trong điều trị các Salmonella nĩi chung và các Salmonella gây bệnh thương hàn nĩi riêng. Tuy nhiên hiện nay tỷ lệ Salmonella kháng thuốc ngày càng tăng. Ở nước ta, những năm gần đây đã xuất hiện nhiều vụ dịch thương hàn do vi khuẩn kháng thuốc gây nên. Theo kết quả của Chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh cơng bố năm 1999, đã cĩ tới 40 % S. typhi (phân lập năm 1998) kháng lại ampicillin và 62 % kháng lại chloramphenicol. 2.4. Escherichia coli [3],[12],[29] Escherichia do Escherich phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Giống Escherichia được chọn là đại biểu điển hình của họ vi khuẩn đường ruột. Giống này gồm nhiều lồi như E. coli, E. adecarbonxylase, E. blattae, E. fergusonii, E. hermanii và E. vulneris; 22 trong số đĩ, E. coli cĩ vai trị quan trọng nhất và được chọn làm đại biểu điển hình của giống Escherichia. 2.4.1. Đặc điểm sinh học 2.4.1.1. Hình thái E. coli là trực khuẩn Gram (-), hình que thẳng. Kích thước dài, ngắn khác nhau, trung bình từ 2 – 3 x 0,5 μm; trong những điều kiện khơng thích hợp (ví dụ trong mơi trường cĩ kháng sinh) vi khuẩn cĩ thể rất dài (6 – 8 μm). Rất ít chủng E. coli cĩ vỏ, khơng sinh bào tử, hầu hết cĩ lơng và cĩ khả năng di động. Hình 2.3: Escherichia coli 2.4.1.2. Tính chất nuơi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi. Phát triển dễ dàng trên mơi trường nuơi cấy thơng thường. Một số cĩ thể phát triển trên mơi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng. Phát triển được ở nhiệt độ từ 5 – 400C, phát triển tốt nhất ở 37 0 C, pH 7 – 7,2. Trong những điều kiện thích hợp E. coli phát triển rất nhanh, thời gian thế hệ chỉ khoảng 20 – 30 phút. Cấy vào mơi trường lỏng sau 3 – 4 giờ đã làm đục nhẹ mơi trường, sau 24 giờ làm đục đều; sau 2 ngày trên mặt mơi trường cĩ váng mỏng. Những ngày sau dưới đáy ống cĩ thể thấy cặn. Trên mơi trường thạch thường, sau khoảng 8 – 10 giờ, dùng kính lúp cĩ thể quan sát được khuẩn lạc. Sau 24 giờ đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5 mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, nhưng cũng cĩ thể gặp dạng R, hoặc M. 23 2.4.1.3. Tính chất hố sinh Lên men và sinh hơi một số loại đường thơng thường như lactose (trừ E. coli loại EIEC), glucose, manitol, ramnose…Người ta dựa vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt E. coli với các lồi vi khuẩn đường ruột khác ONPG (+), urease (-), H2S (-), LDC (+).ff Nghiệm pháp IMVIC: I+ M+ V- I- C-, indol (+), methyl red (+), Vosges Proskauer (-), lên men đường inositol (-), citrat simmons (-). 2.4.1.4. Sức đề kháng E. coli cĩ sức đề kháng yếu. Các chất sát khuẩn thơng thường như nước Javel 1/200; phenol 1/200 giết chết vi khuẩn sau 2 – 4 phút. Nhiệt độ 550C giết chết vi khuẩn sau 1 giờ và nhiệt độ 600C giết chết vi khuẩn sau 30 phút. 2.4.1.5. Cấu tạo kháng nguyên Cấu tạo kháng nguyên của E. coli rất phức tạp. E.coli cĩ đủ ba loại kháng nguyên O, H, K. Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân. Hiện nay người ta đã biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O của E. coli. Kháng nguyên K: Là kháng nguyên bề mặt. Khoảng 100 loại yếu tố kháng nguyên K đã được xác định và chia làm 3 loại dựa vào độ nhạy cảm của của kháng nguyên này với nhiệt độ: A, B và L, trong đĩ A dưới dạng vỏ quan sát được bằng kính hiển vi quang học thơng thường, B và L dưới dạng màng rất mỏng chỉ cĩ thể quan sát được nhờ kính hiển vi điện tử. Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lơng. Hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định. 2.4.1.6. Phân loại Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các typ huyết thanh. Với sự tổng hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ cĩ rất nhiều typ huyết thanh 24 khác nhau. Mỗi typ huyết thanh được ký hiệu bằng kháng nguyên O và K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số 7 loại B). Dựa vào tính chất gây bệnh, người ta chia E. coli thành các loại: - EPEC (Enteropathogenic E. coli): E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli): E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli ): E. coli xâm nhập đường ruột. - EAEC (Enteroadherent E. coli): E. coli bám dính đường ruột. - EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli): E. coli gây chảy máu đường ruột. 2.4.2. Khả năng và cơ chế gây bệnh Trong đường tiêu hĩa E. coli chiếm tỉ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80 %). Tuy nhiên, E. coli cũng là một vi khuẩn gây bệnh quan trọng, nĩ đứng đầu trong số các vi khuẩn gây ỉa chảy, viêm đường tiết niệu, viêm đường mật; đứng hàng đầu trong các căn nguyên gây nhiễm khuẩn huyết. E. coli cĩ thể gây nhiều bệnh khác như viêm phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương. Theo báo cáo của chương trình quốc gia giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp (1988 – 1994) thì E. coli đứng hàng thứ hai (sau S. aureus) về tỷ lệ phân lập được từ các loại bệnh phẩm ở nước ta. Những typ huyết thanh thường găp trên lâm sàn là: O111B4, O86B57, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O26B6, O25B15, O128B12. Cơ chế gây bệnh của E.coli khác nhau tuỳ lồi: ETEC: Gây bệnh do ngoại độc tố LT, là loại độc tố ruột giống độc tố ruột của V. cholerae. Độc tố này bám vào thụ thể ở ruột, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết nước và ion Cl-. EIEC: Gây bệnh do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng. Cơ chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ. EAEC: Gây bệnh do bám vào niêm mạc và làm tổn thương chức năng ruột. Cơ chế của hiện tượng này chưa được sáng tỏ. EHEC: Cơ chế cũng chưa hồn tồn rõ ràng, nhưng người ta đã xác định được một loại độc tố cĩ cấu trúc kháng nguyên và cơ chế tác động giống S. shiga. Trong quá trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương xuất huyết ở ruột. EPEC: Cơ chế gây bệnh chưa được biết rõ. 25 2.4.3. Chuẩn đốn vi sinh vật 2.4.3.1. Chuẩn đốn trực tiếp Bệnh phẩm khác nhau tùy từng bệnh: - Phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hố. - Nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu. - Máu nếu là nhiễm khuẩn máu… Cĩ thể làm tiêu bản soi trực tiếp với một số loại bệnh phẩm như cặn ly tâm nước tiểu hoặc nước não tủy. Phương pháp chủ yếu nhất là nuơi cấy phân lập. Bệnh phẩm được nhân lên trên mơi trường cĩ chất ức chế chọn lọc như DCL, Endo. Nước tiểu giữa dịng được tiến hành cấy đếm trên thạch thường. Máu được cấy vào canh thang. Sau khi đã phân lập được vi khuẩn thuần nhất thì xác định tính chất sinh vật hĩa học và định loại bằng kháng huyết thanh mẫu. Đối với viêm màng não, hiện nay người ta cịn tiến hành phương pháp chuẩn đốn nhanh và đặc hiệu bằng kỹ thuật ngưng kết lactex để xác định kháng nguyên trong dịch não tủy. 2.4.3.2. Chuẩn đốn gián tiếp Trên thực tế chuẩn đốn gián tiếp khơng được sử dụng trong chuẩn đốn các nhiễm khuẩn do E. coli. 2.4.4. Phịng bệnh Hiện nay chưa cĩ phương pháp phịng bệnh đặc hiệu. Để đề phịng nhiễm khuẩn đường tiêu hĩa do E. coli, thực hiện các biện pháp phịng bệnh chung khơng đặc hiệu giống như đối với các vi khuẩn đường ruột khác. 2.4.5. Chữa bệnh E. coli thuộc vào các vi khuẩn cĩ tỷ lệ kháng thuốc cao, nhất là chủng phân lập được từ nước tiểu, vì vậy cần làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp. Ngồi việc sử dụng kháng sinh, một số việc khác rất cĩ giá trị như bồi phụ nước, điện giải trong trường hợp tiêu chảy (việc này nhiều khi cĩ vai trị quyết định để cứu sống bệnh nhân), giải quyết những cản trở trên đường tiết niệu, rút ống thơng sớm nếu cĩ thể được… 26 Phần III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum). Bộ phận dùng : lá. Thu hái tại vườn thực vật ĐH Cần Thơ. 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Tiến hành thí nghiệm phân tích thành phần hĩa học trong lá cây Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 7/2004, tại Phịng Hĩa Lý- Trung Tâm Phân Tích ĐHNL và Phân Viện Hĩa Học Các Hợp Chất Thiên Nhiên. Giai đoạn 2: Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao được điều chế từ lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 4/8/2005 đến 26/8/2005. Thực hiện tại phịng Cơng Nghệ Sinh Học Mơi Trường, Khoa Cơng Nghệ Mơi Trường. 3.1.1.3. Hĩa chất cần thiết  Hĩa chất dùng cho phân tích thành phần hĩa học - Ete dầu hỏa: chưng cất phân đọan < 900C. - Etylacetat: chưng cất phân đoạn ở 64 - 65oC, làm khan bằng Na2SO4. - Chloroform: chưng cất phân đoạn ở 60 - 61oC, làm khan bằng Na2SO4. - Ethanol : chưng cất phân đoạn ở 78oC, làm khan bằng Na2SO4. - Nước cất hai lần. - Thuốc thử hiện hình: H2SO410 % / C2H5OH, đèn UV 254nm. - Hạt silicagel dùng cho sắc ký cột: kích thước hạt 0,04 – 0,063 mm, dùng lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao, hoạt hĩa ở 1100C trong 30 phút trước khi sử dụng. - Bản mỏng silicagel loại 25 DC - alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254 , Merck. - Na2SO4, Na2CO3, FeCl3. 27 - Mg kim loại. - Natri acetat. - H2SO4 10%, H2SO4 1%, H2SO4 đđ, HCl đđ. - Thuốc thử: Liebermann, Fehling, Mayer, Bouchardat, Bertrand, Bouchardat, Dragendorff...  Hĩa chất dùng cho thử nghiệm vi sinh - H2SO4 1 %, BaCl2.2H2O. - Dung mơi DMSO (dimethysulfoside). - Nước cất. - Mơi trường lỏng BHI. - Agar. - Cồn 960, cồn 700. 3.1.1.4. Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm  Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm sử dụng cho thí nghiệm phân tích thành phần hĩa học lá Xuân Hoa - Bộ soxhlet 6 chỗ (Đức). - Bộ chưng cất dung mơi (Việt nam). - Máy cơ quay hiệu Buchi (Đức) - Tủ sấy (Memmert). - Bếp hồng ngoại (Scott, Đức). - Bình lắng (Duran, Đức). - Ống chạy sắc ký cột kích thước 5 x 100 cm và 2,5 x 40 cm. - Điểm nĩng chảy xác định trên máy BUCHI melting point - B545. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER - IFS48 - Carlo Erba - GC 6130. - Phổ 1H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 500 MHz tại Viện Hĩa học, Hà Nội. - Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân AV - 500, tần số cộng hưởng 125 MHz tại Viện Hĩa học, Hà Nội.  Thiết bị và dụng cụ phịng thí nghiệm cần cho thử nghiệm vi sinh - Tủ cấy vơ khuẩn (Nuaire). 28 - Autoclave (Tomy SS – 325). - Tủ ấm (Memmert). - Cân điện tử (Sartorius). - Bếp điện (Airlux). - Pipette loại 100 – 1000 μl. - Đầu tipe loại 1000 μl. - Ống nghiệm. - Que cấy trang, que cấy vịng. - Đèn cồn... 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Xử lý nguyên liệu [19],[20] Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khơ, sấy khơ đến trọng lượng khơng đổi sau đĩ xay thành bột. 3.2.2. Xác định độ ẩm -Nguyên tắc : Mẫu được sấy ở 1050C nước sẽ bốc hơi và làm giảm khối lượng. Cân rồi suy ra độ ẩm. -Tiến hành : sấy trong chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu sấy ở 1050C trong 2 giờ, sau đĩ lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đĩ cân thu khối lượng cịn lại (a g) và tính độ ẩm mẫu theo cơng thức:. Độ ẩm mẫu = (10 - a ) x 100 % 3.2.3. Xác định tro tồn phần Tro tồn phần là lượng hợp chất vơ cơ cịn lại khi nung cháy hồn tồn mẫu nguyên liệu, các ion cịn lại ở dạng carbonat hay oxit. - Tiến hành : Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lị nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro cịn lại (b g) và tính hàm lượng tro theo cơng thức: Hàm lượng tro = b/10 x 100 % 29 3.3. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa học thực vật [6],[16],[20],[22] 3.3.1. Nguyên tắc Dựa vào độ hịa tan trong các dung mơi khác nhau của các hợp chất trong nguyên liệu mà phân tích, dùng các dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần: ether, ethanol và nước. Sau đĩ xác định các nhĩm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. 3.3.2. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch chiết: - Dịch chiết ether: Chiết 25 g mẫu bằng diethyl ether trong bể siêu âm cho đến khi dịch ether nhạt màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml. - Dịch chiết cồn: Bã sau khi chiết bằng ether được chiết nĩng bằng cồn 960 trong bể siêu âm đến khi dịch gần khơng màu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50 ml. - Dịch chiết nƣớc: Bã sau khi chiết bằng cồn 960, đem chiết nĩng trong bể siêu âm 5 phút (3 lần) với thể tích nước vừa đủ ngập mẫu. Gộp dịch chiết, lọc và cơ lại cịn khoảng 50ml. Xác định các nhĩm hợp chất: Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch ether: Chất béo Anthraglycosid Triterpenoid tự do Alkaloid Flavonoid Coumarin Tinh dầu Carotenoid Acid hữu cơ Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch cồn: Alkaloid Antraglycosid Tanin Đường khử Flavonoid Saponin 30 Xác định các nhĩm hợp chất trong dịch nƣớc: Alkaloid Antraglycosid Saponin Flavonoid Tanin Polyuronic Đường khử Phương pháp định tính: Acid hữu cơ: Lấy 2 ml dịch thử cho vào ống nghiệm. Pha lỗng với 1 ml nước cất, thêm một ít tinh thể NaCO3. Nếu cĩ bọt khí sủi lên từ các tinh thể NaCO3 - Cĩ acid hữu cơ. Alkaloid: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml HCl 1%. Chia đều trong 4 ống nghiệm, nhỏ lần lượt vào đĩ các thuốc thử sau cùng với kết quả nhận định là cĩ alkaloid: Thuốc thử Valse-Mayer: Tủa trắng – vàng nhạt Bertrand : Tủa trắng Bouchardat : Tủa đỏ nâu Dragendorff : Tủa đỏ cam Antraglycosid: Phản ứng Bortrager: Cho 5 ml dịch thử vào một ống nghiệm nhỏ, thêm vào đĩ NaOH 10 %, lắc kỹ. Nếu lớp kiềm cĩ màu từ hồng tới đỏ - Cĩ anthraglycosid. Carotenoid: Phản ứng 1: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ, nhỏ vào đĩ vài giọt thuốc thử Carr-Price (SbCl3 bão hịa trong CHCl3). Dung dịch cĩ màu đỏ - Cĩ carotenoid. Phản ứng 2: Thêm vào cắn vài giọt H2SO4 đậm đặc. Dung dịch cĩ màu xanh dương - Cĩ carotenoid. Chất béo: Nhỏ vài giọt dịch ether lên cùng một chỗ trên giấy xác định chất béo, sấy nhẹ cho hết dung mơi, hết mùi tinh dầu (nếu cĩ). Chỗ nhỏ để lại vết mờ - Cĩ chất béo. 31 Đƣờng khử: Bốc hơi 5 ml dịch thử đến cắn. Hịa cắn với 3 ml nước cất trên bếp cách thủy. Để nguội và lọc qua giấy lọc. Thêm vào dịch lọc 0,5 ml dung dịch Fehling A và 0,5 Fehling B. Đun cách thủy 5 phút. Nếu cĩ tủa đỏ gạch dưới đáy ống nghiệm - Cĩ các hợp chất khử (chủ yếu là đường khử). Coumarin: Phản ứng 1: Nhỏ vài giọt dịch thử lên một miếng giấy lọc, sấy nhẹ. Nhỏ lên đĩ hai giọt KOH 10 % trong cồn, tiếp tục sấy nhẹ cho khơ. Che một nửa vết chấm bằng một miếng kim loại, soi UV365 nm. Sau vài phút lấy miếng kim loại ra; nhận xét sự thay đổi cường độ phát quang của nửa mặt bị che: sáng dần lên đến khi sáng tương đương với nửa khơng bị che – cĩ coumarin. Phản ứng 2: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử. Hịa cắn với 2 ml cồn 700, chia đều vào hai ống nghiệm nhỏ, thêm vào ống thứ nhất 0,5 ml KOH 10 % và ống thứ hai một lượng nước cất tương đương. Đun cách thuỷ cả hai ống nghiệm trong 2 phút, để nguội soi UV365 nm. Dung dịch trong ống một cĩ huỳnh quang mạnh hơn dung dịch trong ống thứ hai - cĩ coumarin. Flavonoid: Phản ứng Cyanidin: Lấy khoảng 10 ml dịch thử cho vào chén sứ, bốc hơi đến cắn khơ. Hịa cắn với 2 ml cồn 250 gạn dịch cồn cho vào một ống nghiệm nhỏ. Thêm vào đĩ một ít bột Mg kim loại và thêm từ từ 0,5 ml HCl đậm đặc. Sau phản ứng dung dịch cĩ màu từ hồng tới đỏ - cĩ flavonoid. Anthocyanosid: Lấy 1 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm nhỏ, thêm 3 giọt HCl 10 %, nếu dung dịch cĩ màu từ hồng đỏ tới đỏ và chuyển sang màu xanh khi kiềm hĩa bằng dung dịch NaOH 10 % - Cĩ anthocyanosid. Proanthocyanidin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào một ống nghiệm, thêm 2 ml HCl 10 %, đun cách thủy 10 phút. Nếu dung dịch cĩ màu hồng tới đỏ - cĩ proanthocyanidin. Polyuronic: Nhỏ từng giọt một 2 ml dịch thử vào một ống nghiệm cĩ chứa 10 ml cồn 950. Nếu cĩ nhiều tủa bơng được tạo thành - cĩ polyuronid. 32 Saponin: Lấy 5 ml dịch thử cho vào chén sứ bốc hơi tới cắn. Hịa cắn với 5 ml cồn 250 trên bếp cách thủy. Lọc, cho dịch lọc vào ống nghiệm. Thêm 5 ml nước, lắc mạnh theo chiều dọc ống. Nếu cĩ bọt bền - cĩ saponin. Tanin: Bốc hơi tới cắn dịch thử trong chén sứ, hịa cắn với 4 ml nước cất trên bếp cách thủy. Lọc, chia dịch chiết vào hai ống nghiệm: Ống 1: Pha lỗng với nước cất theo tỉ lệ 1:2, thêm hai giọt thuốc thử FeCl3 5 %, lắc đều. Nếu dung dịch cĩ màu xanh rêu hay xanh đen - cĩ polyphenol. Ống 2: Thêm 5 giọt dung dịch gelatin mặn, lắc đều so sánh với ống chứng. Nếu cĩ tủa bơng trắng - cĩ tanin. Tinh dầu: Bốc hơi tới cắn 5 ml dịch ether trong chén sứ; nếu cắn cĩ mùi thơm nhẹ cho vào đĩ một ít cồn cao độ, bốc hơi tới cắn. Cắn cĩ mùi thơm nhẹ đặc trưng – cĩ tinh dầu. Triterpenoid: Phản ứng Libermann-Burchard: bốc hơi tới cắn 5 ml dịch thử, hịa cắn với 0,5 ml anhydrid acetic và 0,5 ml CHCl3, chuyển dung dịch vào ống nghiệm, nhỏ từ từ 1 ml H2SO4 đậm đặc theo thành ống đặt nghiêng. Nếu vịng ngăn cách cĩ màu đỏ nâu hay đỏ đến tím; lớp dung dịch phía trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím - cĩ triterpennoid tự do (phytosterol). 33 Sơ đồ 3.1: Qui trình tổng quát phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật FeCl3 TT Fehling A, B Nguyên liệu Mg/HClđđ Chiết bằng ether Bã nguyên liệu Dịch Ether KOH 10% Chiết bằng cồn Lớp kiềm Lớp ether Dịch chiết cồn Bã nguyên liệu Dịch cồn Dịch ether Dịch acid Bã nguyên liệu Dịch acid H2SO4 10% vết trên giấy lọc KOH 10% Flavonoid Acid béo Anthraglycosid Cắn cĩ mùi thơm Liebermann H2SO4đđ Tinh dầu Phytosterol Carotenoid TT Mayer, Bouchardat, Dragendoft Alkaloid KOH, HCl TT Fehling A, B TT Mayer, Bouchardat Na2CO3 Na Acetat + FeCl3 3% Mg/HClđđ KOH 10% Liebermann Anthraglycosid Sterolic Flavonoid Tanin Acid hữu cơ Alkaloid Đường khử Anthocyan Saponin Tạo bọt Cồn cao độ TT Mayer, Bouchardat H2SO4 1% H/c uronic Đường khử Tanin Alkaloid Saponin 34 3.4. Phƣơng pháp cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc. 3.4.1. Điều chế các loại cao 3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa. 3.4.1.2 Điều chế cao CHCl3 Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3. 3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol. 3.4.1.4. Điều chế cao nƣớc Phần nước cái cịn lại tiến hành cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao thơ H2O. 35 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thơ từ lá Xuân Hoa Lá khơ 500 g - Xay nhỏ, đun Soxhlet 72h với EtOH 70 %; 4lít, lọc Bã Dịch trích EtOH - Cơ dưới áp suất thấp cịn 1 lít, thêm 1 lit nước cất - Tận trích với ete dầu hỏa 1,5 lít. Pha nước Dịch trích CHCl3 Cao ete dầu hỏa Pha nước Dịch trích Ete dầu hỏa Cao CHCl3 Dịch trích n - Butanol Cao n - Butanol Pha nước Cao nước Tận trích với CHCl3; 2 lít - Làm khan với Na2SO4, Lọc - Cơ cạn dưới áp suất thấp - Lọ c - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p - Làm khan với Na2SO4 - Lọc - Cơ cạn dưới áp suất thấ p - Lọ c - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p Tận trích với n-Butanol - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p -Làm khan với Na2SO4, lọc - Cơ cạn dưới áp suất thấp - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p Cơ cạn dưới áp suất thấp - Cơ cạ n dư ớ i áp suấ t thấ p 36 3.4.2. Cơ lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa Thực hiện sắc ký cột trên cao ete dầu hỏa, chất hấp phụ silicagel, dung mơi giải ly là ete dầu hỏa, EtOAc và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dần. Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi giải ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là dung dịch H2SO4 10 %/EtOH. Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký cột tiếp theo các phân đoạn giống nhau, kết tinh thu được hợp chất sạch. 3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cơ lập đƣợc Sử dụng phương pháp phổ nghiệm IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR…để xác định cấu trúc. 3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn [12],[23],[24],[25]26],[28] Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha lỗng liên tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa đã cơ lập được cĩ khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn. Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ cơng ty Nam Khoa. Mơi trường nuơi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là mơi trường BHI. Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước. Dung mơi sử dụng để hịa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO) 3.5.1. Chuẩn bị mơi trƣờng Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để mơi trường tan đều. Cho vào 2 bình tam giác, làm nút bơng đậy lại. Sau đĩ tiến hành hấp vơ trùng mơi trường ở điều kiện 1210C trong vịng 20 phút bằng Autoclave. 3.5.2. Pha lỗng cao Xuân Hoa Pha lỗng cao chloroform Cân 0,04 g cao chloroform bằng cân điện tử cho vào 1 ống nghiệm chứa 2ml dung mơi DMSO. Đun nhẹ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để cao hịa tan hồn 37 tồn vào dung mơi. Lúc này nồng độ của cao chloroform trong ống nghiệm là 0,02 g/ml. Tiến hành pha lỗng dung dịch cao với mơi trường dinh dưỡng theo tỉ lệ 1 ml dung dịch cao : 9 ml mơi trường dinh dưỡng lỏng BHI. Lúc này ta thu được dung dịch cao hịa tan trong mơi trường dinh dưỡng với nồng độ 0,002 g/ml (2000 μg/ml) Lấy 12 ống nghiệm, chia làm 2 nhĩm, đánh số thứ tự từ 1C đến 6C mỗi nhĩm. Cho vào các ống nghiệm dung dịch cao chloroform đã pha lỗng trên lần lượt: - Ống nghiệm 1C, 100 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 2C, 200 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 3C, 300 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 4C, 400 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 5C, 500 μl mỗi ống. - Ống nghiệm 6C, 600 μl mỗi ống. Dùng pipette hút hút mơi trường dinh dưỡng BHI đã chuẩn bị ở trên cho vào 6 ống nghiệm ở trên theo thứ tự: - Ống số 6C 400 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1200 μg/ml. - Ống số 5C 500 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 1000 μg/ml. - Ống số 4C 600 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 800 μg/ml. - Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 600 μg/ml. - Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 400 μg/ml. -Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm lúc này là 200 μg/ml. Pha lỗng các loại cao cịn lại Tiến hành tương tự như qui trình pha lỗng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao nước. 38 3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối BaSO4.2H2O. a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M) BaCl2.2H2O 11,75 g Nước cất vừa đủ 1000 ml b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N) H2SO4 1% c. Dung dịch chuẩn độ đục: Dung dịch A 0,5 ml Dung dịch B 99,5 ml Chia vào các tube nút vặn cĩ cùng kích cỡ với tube nuơi cấy hay pha cấy mầm mỗi ống 4 – 6 ml, vặn chặt nút. Giữ trong tối ở nhiệt độ phịng. Trước khi dùng lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn trên máy rung. Hằng tháng phải thay các tube độ đục chuẩn. 3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy Tiêu chuẩn cần đạt được là 5x105 CFU/ml. Hai chủng vi sinh vật: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium được cấy sang ống nghiệm chứa mơi trường thạch TSA, ủ ở 370C qua đêm. Sau khi vi khuẩn mọc đều trên mặt thạch, tiến hành cấy chuyền vào mơi trường lỏng đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 370C trong vịng 16-24 giờ. Điều chỉnh độ đục của canh vi khuẩn cấy ngang với độ đục của ống chuẩn Mc Farland 0.5 (tương đương 108 CFU/ml) bằng nước muối sinh lí 0,85 %. Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn BHI Đ/C Huyền dịch Salmonella Dung dịch Mc Farland 0,5 Huyền dịch E. coli 39 Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml mơi trường lỏng BHI. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và mơi trường BHI. Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha lỗng ở trên cho vào 3 ống nghiệm chứa 9 ml mơi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào mơi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn và mơi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là 10 6 CFU/ml. Tiến hành pha lỗng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha lỗng ta thu được 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 106 CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella 106 CFU/ml. 3.5.5. Thử nghiệm Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung mơi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 0,06 ml dung mơi DMSO và 0,94 ml mơi trường BHI. Sau đĩ cho vào ống thứ nhất 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, cho vào ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella. Dùng 2 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1ml mơi trường BHI. Cho vào ống thứ nhất 1ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella. Chia các ống nghiệm đã pha lỗng các loại cao trên thành 2 nhĩm giống nhau, mỗi nhĩm dùng để thử nghiệm một chủng vi khuẩn. Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ nhất, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli đã pha lỗng 106 CFU/ml. Cho vào các ống nghiệm của nhĩm thứ hai, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn Salmonella đã pha lỗng 106 CFU/ml. Như vậy trong mỗi ống nghiệm mật độ vi khuẩn là 5 x 105 CFU/ml. Nồng độ của các loại cao trong ống nghiệm lần lượt là 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml, 200 μg/ml, 100 μg/ml đối với mỗi nhĩm.. 40 Cao nước Cao ete dầu hỏa Cao n-butanol Cao CHCl3 Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào Sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào, ủ các ống nghiệm của hai nhĩm, 2 ống nghiệm đối chứng và 2 ống nghiệm thử dung mơi ở nhiệt độ 370C . Sau 16-20 giờ tiến hành đọc kết quả. Quan sát sự thay đổi độ đục của mơi trường, sự tạo thành cặn ở đáy của ống nghiệm và sự tạo thành váng ở bề mặt mơi trường. Sau khi ủ, xác định hai nồng độ kế cận nhau mà vi khuẩn làm đục và khơng làm đục mơi trường. Chia nhỏ hai nồng độ trên thành nhiều khoảng nồng độ và tiến hành thử nghiệm như trên. Sau quá trình thử nghiệm ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của các loại cao đối với vi khuẩn thử nghiệm. 41 Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Nguyên liệu Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khơ, sấy ở 500C đến trọng lượng khơng đổi, sau đĩ xay thành bột. 4.1.1. Xác định độ ẩm Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào chén sứ, sấy ở 1050C trong 2 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đĩ cân thu được 1,1 g. Như vậy độ ẩm của mẫu là: Độ ẩm mẫu = (10 - 1,1 ) x 100 % = 89 % 4.1.2. Xác định tro tồn phần Nung chén sứ đến khối lượng khơng đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành một lớp mỏng. Đặt vào lị nung ở nhiệt độ 6000C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro cịn lại được 1,2 g. Như vậy hàm lượng tro của mẫu là: Hàm lượng tro = 1,2/10 x 100 % = 12% 4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa thực vật của lá cây Xuân Hoa được thu nhận ở bảng 4.1. 42 Bảng 4.1: Tĩm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hĩa học lá cây Xuân Hoa: Tên hợp chất Thuốc thử Kết quả Loại dung dịch Ete Cồn Nước Antraglycosid KOH 10% Dung dịch màu đỏ - + - Flavonoid HClđđ+Mg kim loại Màu đỏ - + - Acd béo Nhỏ dd lên giấy lọc Để vết mờ + Alkaloid Mayer Tủa - + - Dragendorf Tủa - + - Bouchardat Tủa - + - Carotenoid H2SO4 Màu xanh nhạt + Phytosterol Anhydric acetic+H2SO4 Chỗ tiếp xúc cĩ màu nhạt ++ Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Mùi thơm nhẹ + Coumarin Soi UV Phát huỳnh quang + Polyphenol FeCl3 2% Màu xanh đen ++ + Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt + Đường khử Thuốc thử Fehling Đỏ gạch ++ + Antracyanosid HCl, NaOH Khơng màu + Saponin Lắc mạnh Tạo bọt Bền Bền Liebermann Cĩ vịng tím nâu chuyển sang đỏ ++ + Hợp chất uronic Pha lỗng EtOH 90% Tủa bơng nhiều ++ Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: khơng cĩ Nhận xét: - Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu, coumarin, acid hữu cơ. - Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid, alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin. - Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử, saponin và hợp chất uronic. 43 4.3. Cơ lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa Lấy 500 g mẫu khơ, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đĩ lọc, dịch lọc được cơ cạn dưới áp suất thấp cịn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc. 4.3.1. Điều chế các loại cao 4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa Cho 1500 ml dung mơi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành 2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao ete dầu hỏa 5,6 g. 4.3.1.2. Điều chế cao CHCl3 Phần dịch nước cịn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung mơi CHCl3 vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm khan với Na2SO4 và cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl3 9,8 g. 4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol Phần dịch cịn lại sau khi đã trích với CHCl3, được tiếp tục cho 1500 ml n- butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm khan với Na2SO4, cơ cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol 15,2 g. 4.3.1.4. Điều chế cao nƣớc Phần nước cịn lại tiến hành cơ cạn dưới áp suất thấp thu được cao H2O 25,7 g. Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi được tính theo cơng thức: H = 500 A x 100 % Trong đĩ: - H : hiệu suất chiết suất. - A : Khối lượng cao thu được. - 500 : khối lượng mẫu ban đầu. Bảng 4.2: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi Loại dung mơi Khối lượng cao thu được (g) Hiệu suất (%) Ete dầu hỏa 5,6 1,12 Chloroform 9,8 1,98 n-butanol 15,2 3,04 Nước 25,7 5,14 44 0 1 2 3 4 5 6 Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước % Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung mơi 4.3.2. Cơ lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp phụ là silicagel, dung mơi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực tăng dần. Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn Ở phân đoạn 9 với dung mơi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cơ cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g). Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho hai vết màu nâu đen, một vết đậm Rf = 0,23 và một vệt mờ Rf= 0,17. Kết quả sắc ký cột silicagel trên 3g cao ete dầu hỏa được tĩm tắt ở bảng 4.3 Hiệu suất chiết suất (%) Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước 1,12 5,14 3,04 1,98 45 Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g) Phân đoạn Dung ly Thể tích (ml) Trọng lượng cặn (mg) Sắc ký lớp mỏng Ghi chú 1 E(100%) 100 2 E:EtOAc 99:1 200 75 Vệt dài 3 E:EtOAc 98:2 200 86 Vệt dài 4 E:EtOAc 97:3 200 98 Vệt dài 5 E:EtOAc 96:4 200 112 Nhiều vết 6 E:EtOAc 95:5 200 153 Nhiều vết 7 E:EtOAc 94:6 200 256 Nhiều vết 8 E:EtOAc 93:7 200 190 Nhiều vết 9 E:EtOAc 92:8 400 116 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 10 E:EtOAc 90:10 400 119 2vết,Rf=0,23;Rf=0,17 Khảo sát 11 E:EtOAc 85:15 600 142 Nhiều vết 12 E:EtOAc 80:20 600 155 Nhiều vết 13 E:EtOAc 70:30 200 120 Nhiều vết 14 E:EtOAc 60:40 600 114 Nhiều vết 15 E:EtOAc 50:50 400 250 Nhiều vết Ghi chú: E = Ete dầu hỏa; EtOAc = ethylacetate; EtOH = ethyl alcol Ở phân đọan 9,10 tiếp tục quá trình sắc ký cột lần 2 với hệ dung mơi giải ly E : EtOAc 90 : 10 tới 85 : 15 thu được 5 phân đọan sau khi cơ cạn dung mơi phân đoạn 2 và 3 và kết tinh lại trong MeOH cho tinh thể hình kim màu trắng (64mg) đặt tên S. Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl3 : E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là H2SO4 10 %/EtOH cho một vết màu nâu Rf = 0,23. 46 Sơ đồ 4.1: Tĩm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa Hình 4.1: Sắc ký bản mỏng cao ete dầu và hợp chất S Cao ete dầu hỏa Hợp chất S Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 90 : 10 → 85 : 15 Cao ete dầu hỏa (3 g) Sắc ký cột silicagel E : EtOAc 100 % → 50 : 50 Thu đđược 15 phân đoạn Phân đoạn 9, 10 (0,235 g) Thu được 5 phân đoạn 1 – 5 Bay hơi dung mơi và rữa sạch phân đoạn 2 và 3, kết tinh thu được hợp chất sạch S (64 mg) 47 4.3.3. Khảo sát cấu trúc hĩa học của hợp chất S * Sắc ký lớp mỏng: giải ly bằng hệ dung mơi cloroform:ete dầu 9:1, thuốc thử hiện hình là acid sulfuric 10%/EtOH, sấy bản ở 1100C cho một vết duy nhất màu nâu cĩ giá trị Rf = 0,23. * Nhiệt độ nĩng chảy 154-156 0 C (MeOH). * Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1) m/z: 414 (M + ); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69. * Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2) ν, cm-1:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hịa);1662,98 (dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O). * Phổ 1H-NMR, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 3) 5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhĩm –CH3. * Phổ 13C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl3, δ, ppm (phụ lục số 4) 140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –) Biện luận cấu trúc S: S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller. Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm-1); 1H-NMR (3,52ppm); 13C-NMR (71,83 ppm) chứng tỏ S cĩ nhĩm – OH. Phổ 13C-NMR và 1H-NMR cho thấy S cĩ hai nối đơi, trong đĩ 1 liên kết kiểu >C=CH và liên kết cịn lại kiểu – CH = CH – . Phổ 13C-NMR kết hợp kỹ thuật DEPT cho biết S cĩ 3 carbon bậc bốn (>CCH –), 9 carbon bậc hai (– CH2 –) và 6 carbon bậc 1 (– CH3), từ đĩ cơng thức phân tử của S là C29H48O, điều này được khẳng định lại dựa trên phổ khối lượng (M+= 414). Độ bất bão hồ của S là 6, như vậy cấu trúc S cĩ 4 vịng. Kết hợp với số nguyên tử carbon giúp ta khẳng định S là một hợp chất steroid. Phổ 1H-NMR cho biết nối đơi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz). Các nhận định ban đầu cho thấy S cĩ thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ 13C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng 48 hưởng) chúng tơi dự đốn S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1, điều này dựa vào phổ 1H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03. Các số liệu phổ 13C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ 13C-NMR của hợp chất S với stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol. β-Sitosterol Stigmasterol Hình 4.2: Cấu trúc hĩa học của β-Sitosterol và Stigmasterol 4.4. Thử nghiệm vi sinh Hai ống nghiệm thử dung mơi vi khuẩn mọc làm đục mơi trường, cĩ tạo váng màu trắng trên bề mặt và cĩ cặn trắng bên dưới ống nghiệm. Kết luận dung mơi DMSO khơng ức chế sự phát triển của hai chủng vi khuẩn E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium ở tỉ lệ 0,06 ml/ 2 ml mơi trường Đối với các loại cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước các ống nghiệm thử nghiệm ở các nồng độ từ 100 đến 600μg/ml vi khuẩn làm đục mơi trường cĩ lắng cặn trắng ở dưới đáy. Kết luận: Cao ete dầu hỏa, cao n-butanol và cao nước khơng cĩ khả năng ức chế hai chủng vi khuẩn E. coli và Salmonella tới nồng độ 600 μg/ml Đối với cao chloroform, với các nồng độ 400 – 600 μg/ml quan sát thấy mơi trường khơng bị đục. HO CH3 C2H5 H CH3 H3C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28, 29 H5C2 CH3 CH3 CH3 CH3H3C HO H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28,29 49 Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml Loại cao Ete dầu hỏa CHCl3 n-butanol H2O Nồng dộ (μg/ml) E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal E.coli Sal 100 + + + + + + + + 200 + + + + + + + + 300 + + + + + + + + 400 + + – – + + + + 500 + + – – + + + + 600 + + – – + + + + Ghi chú: +:Mơi trường bị đục –: Mơi trường khơng bị đục. Tiến hành thử nghiệm tiếp tục ở các nồng độ với khoảng cách nhỏ hơn trong khoảng từ 300 – 400 μg/ml. Hình 4.3: Các ống nghiệm nồng độ trong khoảng 300 - 400 μg/ml trước khi đem ủ. Sau khi ủ, ở nồng độ 330 μg/ml E. coli khơng làm đục mơi trường nuơi cấy. Cịn đối với Salmnella thì khơng làm đục mơi trường ở nồng độ 340 μg/ml. 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 50 Bảng 4.5: Kết quả thử nghiệm cao chloroform trong khoảng nồng độ 300-400 μg/ml Nồng độ (μg/ml) E. coli Salmonella 310 + + 320 + + 330 – + 340 – – 350 – – 360 – – 370 – – 380 – – 390 – – Ghi chú: +: Mơi trường nuơi cấy bị đục –: Mơi trường nuơi cấy khơng bị đục Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli. Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella.. Bảng 4.6: Kết luận Vi khuẩn MIC (μg/ml) E. coli ATCC 25922 330 Salmonella typhimurium 340 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml). 310 320 330 340 350 360 370 380 390 (μ g/ml) 51 Phần V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I. Kết luận 5.1. Khảo sát thành phần hĩa học Đã sơ bộ phân tích thành phần hĩa học các hợp chất cĩ trong lá Xuân Hoa. Đã xác định được sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ: flavonoid, tanin, terpenoid, saponin... Từ 500g bột lá khơ cây Xuân Hoa đã điều chế được cao ete dầu hỏa là 5,6g (hiệu suất 1,12%), cao chloroform 9,8g (hiệu suất 1,98%), cao n-butanol 15,2g (hiệu suất 3,04%) và cao nước 25,7g (hiệu suất 5,14%). Từ cao ete dầu hỏa đã tiến hành phân lập và thu được 64 mg hợp chất S (hiệu suất 2,13 % tính trên trọng lượng cao ete dầu hỏa). Cấu trúc của hợp chất được xác định dựa trên các phương pháp phổ nghiệm như khối phổ, phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1. 5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n- butanol và cao nước. Kết quả cho thấy chỉ cĩ cao chloroform cĩ khả năng ức chế sự phát triển của hai chủng vi sinh vật trên. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340 μg/ml. II. Đề nghị Trong khoảng thời gian ngắn làm khĩa luận tốt nghiệp những kết quả thu được chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu cĩ thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để cĩ thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hĩa học của cây Xuân Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hĩa học các hợp chất hữu cơ trên cao chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dịng vi khuẩn đường ruột khác. Từ đĩ làm cơ sở cho việc chuẩn hĩa và tạo ra chế phẩm cĩ khả năng thay thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hĩa. 52 Phụ lục 1: Phổ MS của hợp chất S 53 Phụ lục 2: Phổ IR của hợp chất S 54 Phụ lục 3: Phổ 1H-NMR của hợp chất S 55 Phụ lục số 4: Phổ 13C của hợp chất S 56 Phụ lục 5: So sánh phổ 13C-NMR của S với -Sitosterol và Stigmasterol STT Hợp chất S -Sitosterol Stigmasterol 13 C-NMR DEPT Vị trí carbon 13 C-NMR Loại carbon Vị trí car bon 13 C-NMR Loại carbon 1 140,77 Biến mất 5 140,10 >C= 5’ 140,67 >C= 2 138,32 Mũi dương - - - 22’ 138,25 -CH= 3 129,31 Mũi dương - - - 23’ 129,19 - 4 121,73 Mũi dương 6 121,60 =CH- 6’ 121,62 -CH= 5 71,83 Mũi dương 3 71,00 -CH-OH 3’ 71,72 -CH-OH 6 56,89 Mũi dương - - - 14’ 56,83 >CH- 7 56,79 Mũi dương 14 56,70 >CH- - - - 8 56,09 Mũi dương 17 55,80 >CH- - - - 9 255,99 Mũi dương - - - 17’ 55,91 >CH- 10 51,25 Mũi dương - - - 24’ 51,21 >C