Khóa luận Khảo sát sự tác động của auxin lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây trường xuân hoa (catharanthus roseus) in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: CAO THỊ THANH LOAN Thành phố Hồ Chí Minh 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. TRẦN THỊ LỆ MINH CAO THỊ THANH LOAN ThS. NGUYỄN VĂN CƢỜNG Thành phố Hồ Chí Minh 2007 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Trần Thị Lệ Minh và Th.S Nguyễn Văn Cƣờng đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Phan Phƣớc Hiền và các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm phân tích thí nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - KS. Trần Ngọc Hùng cùng các anh chị thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học Đại học Nông Lâm Tp.HCM. - Bạn Hoàng Thị Thu cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tháng 08 năm 2007 Cao Thị Thanh Loan iv TÓM TẮT CAO THỊ THANH LOAN, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT SỰ TÁC ĐỘNG CỦA HORMONE TĂNG TRƢỞNG AUXIN LÊN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP ALKALOID CỦA CÂY TRƢỜNG XUÂN HOA (Catharanthus roseus) IN VITRO” Hội đồng hướng dẫn: TS. Trần Thị Lệ Minh Th.S Nguyễn Văn Cường Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm phân tích thí nghiệm trường Đại học Nông lâm Tp.HCM trên đối tượng cây Trường xuân hoa. Tiến hành tạo cây Trường xuân hoa in vitro từ chồi cây Trường xuân hoa trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ Sinh học. Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA được theo dõi ở các giai đoạn 7, 14, 21, 28, 35 ngày. Bên cạnh đó thay đổi nồng độ NAA, IAA sử dụng nhằm chọn loại chất kích thích tăng trưởng thích hợp thông qua các chỉ tiêu theo dõi như chiều cao cây, số rễ và chiều dài rễ; xác định sự tạo thành indol alkaloid trong cây in vitro bằng thuốc thử Wagner qua hiện tượng tạo kết tủa với thuốc thử. Bằng hệ thống điện di mao quản, thực hiện phân tích và định lượng các alkaloid đặc trưng của cây Trường xuân hoa in vitro như catharanthine, vindoline… Những kết quả thu được: Khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro: sử dụng NAA 0,5 mg/l và IAA 1 mg/l có tác động tốt lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Định tính indol alkaloid bằng thuốc thử Wagner: các kết quả định tính cho thấy có sự hiện diện của indol alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân v hoa in vitro. Và lượng kết tủa quan sát được nhiều nhất là ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l. Phân tích và định lượng indol alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro bằng hệ thống điện di mao quản: Hàm luợng catharanthine và vindoline của cây Trường xuân hoa in vitro cao hơn so với hàm luợng catharanthine và vindoline của cây in vivo, và hàm lượng catharanthine đạt được cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy và vindoline là sau 7 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l. vi SUMMARY “STUDY ON IMPACT OF AUXIN ON THE GROWTH AND THE SYNTHEIS ALKALOID IN Catharanthus roseus IN VITRO” The effect of different growth regulator on growth and production of indol alkaloid were studied in Catharanthus roseus. Shoots were grown in MS solid medium containing different concentrations of growth regulators. Extracted alkaloids were qualitative with Wagner reagent and analyzed by CE for determination of indol alkaloid quantities. The growth regulators on the experiment were NAA, IAA and the data were viewed for 7, 14, 21, 28, 35 days. The experiment result showed that NAA at concentration of 0,5 mg/l and IAA 1 mg/l resulted in elongation of roots and higher number of roots. The qualitative results of all in vitro plants have appeared precipitates which the 28 - day plant sample on the medium containing NAA 0,5 mg/l had the most. Analyses by CE showed that the concentration of indol alkaloid (catharanthine and vindoline) in the in vitro plant is more than in vivo plant, and these plants produce the highest catharanthine after 28 days and vindoline after 7 days cultured in MS medium adding NAA 0,5 mg/l. vii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Summary .............................................................................................................. vi Mục lục ................................................................................................................. vii Danh sách các bảng ............................................................................................. xi Danh sách các hình và sơ đồ............................................................................... xiii Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. xv CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ....................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây ....................................................................... 3 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp ......................................................... 3 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp ..................................................................... 4 2.2. Alkaloid ......................................................................................................... 4 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus ............ 7 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trường xuân hoa ......................................................... 7 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trường xuân hoa ................... 8 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trường xuân hoa .......................................... 9 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................. 13 2.3.5. Tính chất dược lý của cây Trường xuân hoa............................................... 13 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trường xuân hoa trong điều trị bệnh .............. 14 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp ............................. 15 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trưởng ..................................................................... 15 viii 2.4.2. Nguồn đạm .................................................................................................. 16 2.4.3. Nguồn cacbon .............................................................................................. 16 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen .............................................................. 16 2.4.5. Các chất khác .............................................................................................. 16 2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid ........................................................ 17 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất ...................................................................... 17 2.5.2. Phương pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ .............................................. 17 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nước ..................... 18 2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid ............................ 18 2.6.1. Phản ứng tạo tủa .......................................................................................... 19 2.6.2. Phản ứng tạo màu ........................................................................................ 19 2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid....................................................... 20 2.7.1. Phương pháp cân ......................................................................................... 20 2.7.2. Phương pháp trung hòa .............................................................................. 20 2.7.3. Định lượng alkaloid trong môi trường khan ............................................... 21 2.7.4. Phương pháp so màu ................................................................................... 21 2.7.5. Các phương pháp định lượng alkaloid hiện đại .......................................... 22 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp ..................................................................... 22 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản ...................................................................... 22 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp ............... 23 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao .................................................. 24 2.8.2. Xử lý với Elicitor ........................................................................................ 24 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học .............................................. 24 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất .................................................................................. 24 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học ................................................................................. 25 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu .................................................................................... 26 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .............................................................. 26 ix 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro ................................................. 26 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 26 3.3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 26 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................... 26 3.3.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy ............................................................... 26 3.3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 27 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ......................... 27 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .......................................... 27 3.3.4. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 29 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA .......................................................... 29 3.4.1. Vật liệu ....................................................................................................... 29 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra ............................................................................................ 29 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 29 3.4.1.3. Hóa chất ................................................................................................... 30 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ................................................ 30 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trường xuân hoa .................................................................................................. 31 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lượng alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro và cây Trường xuân hoa in vivo ................................... 31 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lượng alkaloid trong cây Trường xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE ......................................... 32 3.4.3. Phương pháp tiến hành ................................................................................ 32 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa ................................ 32 x 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trường xuân hoa ........................................ 32 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lượng alkaloid bằng CE ................................ 34 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 35 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................... 56 5.1. Kết luận ......................................................................................................... 56 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 58 PHỤ LỤC xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây .................. 13 Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 27 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro .............................................................. 28 Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro ...................................................... 28 Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l..................................... 35 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l .................................... 36 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 37 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy ............................................. 38 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner ............................................................................ 41 Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 43 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau .................................... 46 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE ................................... 50 N2 N3 N1 I2 xii Bảng 4.10. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE .................. 53 Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy ........................................... 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid .................... 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa ............................................................................................ 7 Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa ........................................................................... 8 Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine ................................................... 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline .......................................................... 10 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine ................................. 11 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất ................................................................................ 12 Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy ....................................... 39 Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày .............................................. 42 Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA ..................................... 42 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ............................. 44 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .................................. 45 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa NAA ........................................................ 46 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có chứa IAA .......................................................... 47 Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l, vindoline 20 mg/l ............................ 48 Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo tươi ................................................................................ 49 Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo khô ................................................................................ 50 xiv Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. ................................................................... 52 Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi ..................................................................... 52 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi ................................ 33 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô ................................ 34 Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2 ......................................................... 51 Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo ......................................................... 53 xv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TDC : Tryptophan decarboxylase STR : Strictosidine synthase TIA : Terpenoid indole alkaloid EOF : electroosmosis flow CE : Capillary electrophoresis HPLC : High – performance liquid chromatography DNA : Deoxy nucleic acid MS : Murashiga & Skoog IAA : Indole-3-acetic acid NAA : 1-Naphthalene acetic acid BA : Benzyladenine CRD : Completely Randomized Design 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá để cung cấp các hợp chất thứ cấp đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan trọng đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất ra các loại thuốc mới, có giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Hiện nay, trên toàn cầu có khoảng 25 triệu người đang phải sống chung với căn bệnh này và mỗi năm có thêm khoảng 11 triệu trường hợp mắc bệnh mới. Trong khi đó các loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của thế giới hiện nay là nghiên cứu nhằm tìm phương pháp gia tăng lượng alkaloid ở các cây thảo dược để làm hạ giá thành của thuốc. Cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus) là một trong các loại thực vật có khả năng sản xuất các indol alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo thuốc chống ung thư như vinblastine và vincristine. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật và không thể tổng hợp được bằng con đường hóa học, do có cấu trúc phức tạp. Vì vậy, phương pháp bán tổng hợp vinblastine từ sự kết hợp tiền chất vindoline với catharanthine là hết sức hữu hiệu, vì vindoline là một nguồn dồi dào trong cây Trường xuân hoa và catharanthine có thể đạt nồng độ cao trong cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô. Điều này có thể thực hiện được thông qua việc sử dụng các tác nhân kích thích như nấm và chất hóa học. Hiện nay, việc sản xuất catharanthine nhờ nuôi cấy mô vẫn còn quá thấp để tiến tới sản xuất công nghiệp. Bên cạnh đó, các alkaloid chỉ được tổng hợp trong những loại tế bào đặc trưng và vào những giai đoạn phát triển đặc biệt, điều này làm cho việc chiết xuất chúng gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc chọn lọc các phương pháp và thời gian nuôi cấy hiệu quả là một trong những con đường quan trọng và thiết thực để gia tăng sức sản xuất các tiền chất như catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro. 2 Chính vì tầm quan trọng của các indol alkaloid trong việc điều trị bệnh và tính cấp thiết của việc gia tăng các hợp chất thứ cấp có giá trị này nên chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát sự tác động của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa (Catharanthus roseus) in vitro” nhằm kích thích khả năng sản xuất các indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro nhờ chất kích thích sinh trưởng (IAA. NAA). 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Xác định giai đoạn nuôi cấy mô cây Trường xuân hoa sinh tổng hợp nhiều alkaloid nhất, từ đó chọn quy trình nuôi cấy cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất được nhiều catharanthine và vindoline thông qua việc sử dụng chất kích thích sinh trưởng IAA (indole - 3 - acetic acid) hay NAA (1- Naphthalene acetic acid). 1.3. Yêu cầu - Tạo được cây Trường xuân hoa in vitro có hàm lượng alkaloid cao . - Định tính sự hiện diện của alkaloid trong cây Trường xuân hoa bằng thốc thử Wagner. - Phân tích định lượng được lượng alkaloid trong từng giai đoạn nuôi cấy mô bằng hệ thống điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE). 3 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hợp chất tự nhiên trong cây [7, 9] Sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển luôn tiến hành quá trình trao đổi chất, kết quả là tạo nên các sản phẩm của trao đổi chất. Trong thực vật các sản phẩm này được chia làm hai nhóm: - Chất trao đổi bậc một hay hợp chất sơ cấp: là các chất cơ bản cần cho sự sống của cây và có ở tất cả các loại cây trồng, bao gồm các hydrat cacbon, lipit và acid amin. Đó là những thành phần không thể thiếu trong cây. - Chất trao đổi bậc hai hay hợp chất thứ cấp: là những hợp chất đặc trưng cho loài cây trồng và chúng đóng vai trò quan trọng trong sự sống và sinh sản của thực vật. Các hợp chất thứ cấp là những hợp chất được sinh tổng hợp từ chất trao đổi sơ cấp nhưng có sự phân bố giới hạn trong thực vật [7]. 2.1.1. Tầm quan trọng của hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp không có chức năng rõ ràng như các hợp chất sơ cấp nhưng thường có vai trò sinh thái học: góp phần tạo màu sắc, quyến rũ ong bướm giúp cho quá trình thụ phấn của cây, giúp cho cây thích nghi được với những điều kiện khắc nghiệt của môi trường hay bảo vệ cây trồng chống lại côn trùng, các loại vi sinh vật và những động vật ăn mồi khác, như là cỏ ba lá hay cỏ đinh lăng có tác dụng như estrogen làm ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của động vật ăn cỏ [17]. Thậm chí là chúng còn ức chế sự phát triển của các thực vật khác bởi vì nhiều hợp chất thứ cấp có độc tính đối với thực vật. Vì vậy so với các chất sơ cấp, hợp chất thứ cấp được xem là nguồn nguyên liệu đặc biệt quý giá từ thực vật [14]. Các hợp chất thứ cấp đã được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: chúng có vai trò quan trọng trong việc tạo hương vị và màu sắc cho các món ăn, đặc biệt hiện nay vấn đề sức khỏe rất được quan tâm do đó ngày càng nhiều các chất có nguồn gốc tự nhiên đang có xu hướng thay thế các chất tổng hợp làm 4 phụ gia trong thực phẩm. Bên cạnh đó các tinh dầu thơm của thực vật còn tham gia vào thành phần quan trọng của nước hoa. Ngoài ra chúng còn được ứng dụng trong lĩnh vực thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng do các chất chiết từ một số loài thực vật có đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virút…, vì có nguồn gốc từ tự nhiên nên không làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người và môi trường sinh thái. Bởi vì có hoạt tính sinh học dồi dào, nên các hợp chất thứ cấp từ lâu đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, và ngày nay chúng vẫn là nguồn nguyên liệu có giá trị trong bào chế dược phẩm. Một số chất thứ cấp như glucosinolate, alkaloid gây độc có chọn lọc đối với tế bào tiền ung thư được dùng để bào chế thuốc chống ung thư, hoặc một số chất có tác dụng trên tim như ajmalin, quinidin được dùng làm thuốc chữa loạn nhịp tim… Hiện nay trên thế giới nhiều loại thuốc tổng hợp đã được sử dụng nhưng chúng vẫn không thay thế được các loại thuốc có nguồn gốc từ thực vật. Vì có một số hoạt chất thứ cấp chưa tổng hợp được bằng con đường hóa học hoặc nếu tổng hợp được thì giá thành của các loại thuốc sản xuất tổng hợp không rẻ hơn mà tác dụng lại không bằng các chất chiết xuất từ cây. Ví dụ như ajmalin, morphin, scopolamin, quinin, strychmin…. [5] 2.1.2. Sự phân loại hợp chất thứ cấp Các hợp chất thứ cấp ở thực vật được phân loại theo con đường sinh tổng hợp của chúng. Gồm có ba nhóm chủ yếu: phenolic, terpene và steroid, alkaloid. Phenolic là nhóm hợp chất phổ biến ở thực vật bậc cao vì những phân tử này liên quan đến quá trình tổng hợp lignin, còn các hợp chất khác như alkaloid thì phân bố rải rác, nó đặc trưng cho giống, loài thực vật [17]. 2.2. Alkaloid [27] Alkaloid là nhóm hợp chất tự nhiên với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng * Đặc điểm chung: Trên 10.000 loại alkaloid đã được biết, khoảng 10 – 15 % alkaloid ở trong mạch nhựa cây có hoa, loại hai lá mầm nhưng đôi khi cũng được tìm thấy ở nấm, sinh vật biển, ở một số loài động vật và côn trùng… 5 * Thuật ngữ: Alkaloid thường có tên tận cùng bằng “ine”. Chúng được đặt tên theo một phần tên La tinh của loài sinh vật tạo ra nó. Ví dụ atropine từ Atropa belladonna (cây cà dược). Một vài hợp chất được đặt tên dựa trên hoạt tính sinh học của chúng ví dụ như emetine (thuốc gây nôn - emetic). * Tính chất vật lý: hầu hết alkaloid là không màu ở dạng tinh thể rắn và độ nóng chảy cao. Tuy nhiên một vài alkaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alkaloid ở dạng lỏng như nicotine hay có màu như berberine. * Tính tan: phần lớn alkaloid là ở dạng bazơ tự do nên tan được trong dung môi hữu cơ và không tan được trong nước ở pH cao, các muối của alkaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ. Ở pH thấp alkaloid sẽ thêm vào một proton và trở nên tan trong nước, không tan trong dung môi hữu cơ. Tính tan của alkaloid rất quan trọng trong việc ly trích các alkaloid ra khỏi cây, trong phân tích các loại alkaloid, và trong việc bào chế các alkaloid thành các dạng thuốc phù hợp. * Tính chất hóa học: alkaloid với những nhóm chức liền kề chủ yếu là cho điện tử. Những hợp chất thu điện tử (như nhóm amide carbonyl) là trung tính hay mang tính acid yếu. Những alkaloid ở dạng bazơ tự do không ổn định như ở dạng muối. Các alkaloid cho một số phản ứng chung thường dùng để xác định chúng: alkaloid tạo tủa với kim loại nặng hay acid hữu cơ. Có nhiều loại thuốc thử tạo tủa với alkaloid như thuốc thử Mayer, thuốc thử Dragendoff (potassium bismuth iodide solution). Nói chung, alkaloid là hợp chất tương đối bền; tuy vậy, một số hợp chất thuộc loại dẫn xuất của indol sẽ dễ bị phân hủy hoặc biến chất khi gặp ánh sáng và các tác nhân oxi hóa [27]. * Phân loại: do cách phân loại dựa vào cấu trúc nhân cơ bản không thể đáp ứng được cho số lượng alkaloid rất nhiều và đa dạng, nên để tiện lợi các alkaloid được chia thành 3 loại: alkaloid thật, protoalkaloid và giả alkaloid (pseudoalkaloid). Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính bazơ, thường chứa nguyên tử nitơ trong vòng dị hoàn, thường được sinh tổng hợp từ 6 amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ, ngoại trừ: colchicine, acid aristolochic, alkaloid tứ cấp. Các alkaloid loại này thường được chia thành nhóm theo nguồn gốc sinh tổng hợp của chúng (ornithine, lysin, phenilalanine, tryptophan, histidine, acid antranilic…) hơn là theo vòng dị hoàn. Các protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescaline và N,N - dimetiltryptamine. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn. Các giả - alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid. Bao gồm hai hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid (như conesine) và purine (cafeine) [8]. Vài họ thực vật rất giàu alkaloid, ví dụ như họ Apocynaceae Lindl., Juss. Họ này phân bố trên toàn thế giới đặc biệt là ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong số đó các terpenoid indol alkaloid nổi lên với vai trò là các chất có hoạt tính sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học. Terpenoid indole alkaloid (TIA) bao gồm hơn 3000 hợp chất trong đó có các chất chống ung thư như vinblastine, vincristine từ loài Catharanthus roseus và Vinca spp., camptothecin từ Camptotheca acuminata, chống sốt rét như quinine từ Cinchona officinalis [15]. Xét về vai trò sinh thái học các terpenoid indole alkaloid đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh. Trường hợp các chất indol alkaloid trong cây Trường xuân hoa là một ví dụ: năm 1989, Chockalingam và các cộng sự tìm thấy cao chiết Trường xuân hoa có hoạt tính chống lại sự ăn của ấu trùng Spodoptera. Theo Frischknecht (1987) sau khi gây vết thương vừa phải trên cây Trường xuân hoa, thì có sự gia tăng tổng hợp các alkaloid này như một cơ chế phòng vệ. Ngoài ra các alkaloid từ cây Trường xuân hoa còn có khả năng chống lại các loài vi sinh vật, ví dụ như ajmalicine, catharanthine và vindoline được tạo ra để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm (Hemandez, 1979) [16]. Hiện nay ngƣời ta đang dựa trên những đặc tính này của thực vật 7 Hình 2.2: Hoa Trường xuân hoa để tìm ra phƣơng thức tăng cƣờng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. TIA gồm có hai thành phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc từ iridoid glucoside secologanin [10]. Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp của Terpenoid indole alkaloid với sự tham gia của các enzym TDC: tryptophan decarboxylase, STR: strictosidine synthase [32]. 2.3. Sơ lƣợc đặc điểm về cây Trƣờng xuân hoa Catharanthus roseus 2.3.1. Nguồn gốc của cây Trƣờng xuân hoa [23, 33] Nguồn gốc phân loại [33] Giới : Thực vật Giới phụ : Tracheobionta Ngành : Magnoliophyta Ngành phụ : Spermatophyta Lớp : Magnoliopsida Lớp phụ : Asteridae Bộ : Gentianales Họ : Apocynaceae Tên khoa học : Catharanthus roseus 8 Tên thông thường: Bông dừa, hoa hải đằng, phjắc pót đông (Tày), dừa cạn, trường xuân hoa, Madagascar periwinkle… Chi Catharanthus G.Don có nguồn gốc ở Madagasca, cây Trường xuân hoa được du nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á trong đó có Việt nam và đảo Hải Nam Trung Quốc. Vào đầu khoảng giữa thế kỷ 18, Trường xuân hoa được trồng ở Paris, sau đó có mặt tại nhiều vườn thực vật khác ở Châu Âu. 2.3.2. Đặc điểm thực vật học và sinh thái của cây Trƣờng xuân hoa [23] Cây Trường xuân hoa là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 – 60 cm, phân nhiều cành. Thân mọc thẳng, hình trụ nhẵn, màu xanh lục nhạt hay nâu đỏ. Lá mọc đối, hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 4 – 6 cm, rộng 2 – 3 cm, hai mặt nhẳn, mặt trên sẩm bóng, mặt dưới nhạt (Hình 2.3). Hoa màu hồng hoặc trắng (trắng hiếm hơn). Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn, dài 5 thùy, hình ống ngắn, tràng có 5 cánh, ống tràng hẹp phình ra ở dưới các cánh hoa, nhị 5 đính vào họng của ống tràng (Hình 2.2). Quả dài 2,5 – 3 cm, mọc thẳng hơi choãi ra, hạt nhỏ, hình trứng màu nâu nhạt hoặc nâu đen. Mùa hoa quả, tháng 4 – 5 và tháng 9 – 10. Ở Việt Nam, Trường xuân hoa là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, Hình 2.3: Cây Trường xuân hoa 9 tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, Trường xuân hoa có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Trường xuân hoa còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc. Nơi tập trung nhiều nhất thuộc các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Nam, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên và Khánh Hòa. Ngoài ra còn có ở Côn Đảo và Phú Quốc. Môi trường ven biển cũng là nơi mọc tập trung của Trường xuân hoa ở Madagasca, Srilanca, Ấn Độ, Philippin, Malaysia, Thái Lan. Ở Madagasca, cây còn mọc cả ở những vùng đồi, savan, cây bụi trên đất pha cát hoặc sỏi đá, độ cao tới 1.500m. Trường xuân hoa là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu được hạn. Trong điều kiện trồng trọt (ở Hà Nội - vườn hoa, nông trường Đồng Gia - Ninh Bình, 1972) và ở Tuy Hòa hiện nay. Cây sinh trưởng phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu được có thể cao gấp đôi cây mọc từ thiên nhiên. Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, cây trồng từ hạt ra hoa quả sau 4 - 5 tháng. Trong thời kỳ sinh trưởng mạnh, nếu bị cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Nguồn Trường xuân hoa mọc tự nhiên ở Việt Nam tương đối dồi dào. Trước năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1 - 3 tấn/năm. Những năm gần đây, lượng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm) thường xuyên hơn, nhưng chủ yếu là từ cây trồng tại tỉnh Phú Yên [23]. 2.3.3. Thành phần hoá học của cây Trƣờng xuân hoa [22] Nghiên cứu của các nhà khoa học cho thấy, Trường xuân hoa có chứa một số alkaloid có tác dụng hạ huyết áp như trong cây ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentiana Benth). Ngoài ra còn có resecpin, secpentin, ajmalixin, vinxein, vindolixin, digitalin và hoạt chất giống insulin, nhưng đáng chú ý nhất là những alkaloid có nhân indol có trong tất cả các bộ phận của cây, nhiều nhất là ở rễ và rất thấp ở lá. Năm 1958, Noble và cộng sự đã chiết được một alkaloid từ lá Trường xuân hoa vincaleucoblastine (còn gọi là Vinblastine) [29]. Sau đó 4 năm, Svoboda và cộng sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincaleucocristin (còn gọi là vincristine) [30]. 10 Hình 2.5: Công thức cấu tạo của vindoline Hàm lượng các alkaloid này trong Trường xuân hoa rất nhỏ khoảng 1 phần vạn trong lá Trường xuân hoa khô đối với Vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa. Tùy theo nơi thu hái hàm lượng các alkaloid này thay đổi từ 0,2% đến 1% và khi dùng cũng dùng với liều rất thấp. Căn cứ vào cấu tạo hóa học người ta chia alkaloid trong cây Trường xuân hoa làm ba nhóm chính: Nhóm alkaloid có nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine, cavicine, ajmalicine… Hình 2.4: Công thức cấu tạo của catharanthine Nhóm alkaloid có nhân indoline: lochnericine, lochneridin, lochrovine, vindoline, ajmaline … Nhóm alkaloid có hai vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indoline như leurosine và leurosidine đặc biệt trong nhóm này có những alkaloid có tác dụng chữa bệnh ung thư như vinblastine nhưng có hàm lượng rất thấp: 0,005% - 0,015% trong lá và vincristine: 0,003 - 0,005% trong lá. 11 Hình 2.6: Công thức cấu tạo của vincristine và vinblastine Về mặt tính chất hóa học, các alkaloid có thể tham gia phản ứng cộng, oxi hóa khử… Dưới tác dụng xúc tác của enzyme, một số monomer có thể kết hợp tạo thành các dimer, ví dụ như sự kết hợp của hai tiền chất catharanthine với vindoline tạo thành vinblastine và vincristine như hình 2.7. 12 Hình 2.7: Con đường sinh tổng hợp các indol alkaloid ở cây Trường xuân hoa từ tiền chất [20] Đơn phản ứng Đa phản ứng 13 2.3.4. Sự phân bố các alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của Trường xuân hoa tùy thuộc nhiều vào các yếu tố liên quan đến quá trình sinh tổng hợp của cây. Sự hình thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá trình tạo alkaloid trong rễ cây không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên mặt đất của cây nên các alkaloid trong rễ cây là indol alkaloid không chứa nhóm methoxy như ajmalicin, cathidine, serpentine, perivin, alstonin, tertrahydroalstonin, còn các alkaloid ở lá có chứa nhóm methoxy như anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine, leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin, vincedine, còn ở hoa chỉ có có vinblastine dạng vết [4]. Ngoài ra, hàm lượng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất lượng đất, giống cây và cũng rất khác nhau tùy vào các bộ phận thu hái: Bảng 2.1. Hàm lượng alkaloid toàn phần trong các bộ phận của cây [5] Các bộ phận của cây Hàm lượng (%) Lá 0,37 - 1,15 Thân 0,46 Rễ chính 0,7 - 2,4 Rễ phụ 0,9 - 3,7 Hoa 0,14 - 0,84 Vỏ quả 1,14 Hạt 0,18 2.3.5. Tính chất dƣợc lý của cây Trƣờng xuân hoa [23, 24, 25] Theo tài liệu cổ, Trường xuân hoa vị hơi đắng, tính hàn, có tác dụng kháng nham (chống ung thư), an thần, trấn tĩnh, bình can, thanh nhiệt, lương huyết, giải 14 độc... thường được áp dụng chữa huyết áp cao, bệnh bạch huyết, u lim-phô [25]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ, ít và làm thuốc điều kinh. Ở nam châu Phi, người dân dùng trị bệnh đái tháo đường. Có nơi dùng chữa tiêu hóa kém và lỵ [23]. Nói đến Trường xuân hoa trong cây thuốc của Việt Nam như là một cây thuốc rất quý dùng nhiều trong các bệnh về nội khoa mà đặc trưng ở 3 nhóm bệnh: bệnh lý về nội tiết, bệnh lý về tim mạch và bệnh lý về máu. Cao lỏng Trường xuân hoa có tác dụng hạ huyết áp, an thần gây ngủ và có độc tính nhẹ. Khi cho chuột cống trắng cái đã thụ tinh uống cao Trường xuân hoa, thấy liều cao không gây tai biến cho chuột mẹ nhưng có dấu hiệu ngăn cản sự phát triển của thai. Cao Trường xuân hoa dùng để trị bệnh cao huyết áp trên lâm sàng có tác dụng giảm huyết áp trên bệnh nhân thấy rõ rệt. Việc điều trị đơn giản, dễ áp dụng, không thấy biến chứng ngộ độc. Hai loại thuốc chế từ Trường xuân hoa chữa ung thư được dùng là Vinblastine và Vincristine. Các nhà khoa học đã nghiên cứu chiết xuất từ cây Trường xuân hoa 2 alkaloid vinblastine và vincristine, là những chất ức chế mạnh sự phân bào. Các alkaloid này liên kết đặc hiệu với tubulin, là protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Ở nồng độ cao, thuốc diệt được tế bào, còn ở nồng độ thấp làm ngừng phân chia tế bào [24]. Vinblastine có tác dụng chống ung thư còn do tác động đối với chuyển hoá của glutamat và aspartat, và vincristine ngăn cản sự tổng hợp RNA và các protein. Ngoài ra cao Trường xuân hoa còn có tác dụng kháng một số chủng nấm gây bệnh [23]. 2.3.6. Ứng dụng của các alakloid Trƣờng xuân hoa trong điều trị bệnh  Vinblastin sulfat: Là thuốc dùng trong liệu pháp phối hợp, được lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn và được lựa chọn hàng thứ hai trong liệu pháp trị bệnh ung thư lá lách, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư 15 biểu mô thận. Lựa chọn hàng thứ ba để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da [24].  Vincristin sulfat: Là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Nó được dùng trong liệu pháp phối hợp thuốc, là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh ung thư biểu mô phổi, ung thư Hodgkin (ung thư hạch ở hệ bạch huyết), u bạch huyết không - Hodgkin, bạch cầu tủy bào mạn (đợt cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân [18]. Phối hợp thuốc chứa Vincristin là lựa chọn hàng thứ hai cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Hiện nay, Trường xuân hoa đang được ta xuất khẩu sang Pháp, chủ yếu để bào chế thuốc chữa bệnh bạch cầu.  Vindoline và catharanthine: vindoline và catharanthine được dùng trong việc điều trị bệnh bí tiểu và làm hạ lượng đường trong máu. Từ vindoline và catharanthine người ta tổng hợp được những alkaloid chứa nhóm dimer như vinblastine, vincristine có tác dụng trị ung thư.  Ajmalicine: là chất có biệt tính dược học mạnh, dùng để điều trị cao huyết áp, dùng làm thuốc giảm đau và điều trị các bệnh về hệ thần kinh và các triệu chứng lâm sàng khác.  Serpentine: dùng để điều trị bệnh cao huyết áp và thuốc an thần. 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy mô 2.4.1. Các chất điều hòa sinh trƣởng [6] Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy: - Chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy tế bào - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi, thân , lá, rễ. - Chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp và cấu trúc tế bào: auxin cần thiết cho nuôi cấy tế bào như IAA, NAA, 2,4- 16 Dichlorophenoxy acetic acid và cytokinin như Kinetin và BA (Benzyladenine). Chất sinh trưởng tác động riêng lẽ hay phối hợp trong cùng nhóm hay cả hai nhóm đến sự sinh trưởng tế bào và tổng hợp các chất thứ cấp. Nồng độ chất sinh trưởng được sử dụng từ 1 đến 10 mg/l. 2.4.2. Nguồn đạm Chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrat hay hỗn hợp đạm nitrat và amonium. Đôi khi sử dụng casein hydrolysate hay nguồn đạm tự nhiên. 2.4.3. Nguồn cacbon Sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụng trong nuôi cấy mô. Trong nhiều trường hợp hàm lượng cacbon cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào và sản lượng của các chất trao đổi thứ cấp... Đôi khi phụ thuộc vào các loại cây trồng mà sử dụng mannose, galactose hay glucose. Loại đường và nồng độ đường được sử dụng cũng ảnh hưởng đến nồng độ các chất thứ cấp được thu nhận. 2.4.4. Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen [26] Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen là tất cả những thông số cần được kiểm tra trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp. - Nhiệt độ từ 17 - 25oC thường được dùng trong nuôi cấy tạo callus và phát triển tế bào nuôi cấy. Nhưng mỗi loại cây sẽ thích hợp với một nhiệt độ cụ thể. - pH của môi trường thường dao động từ 5 - 6 trước khi hấp khử trùng, không nên để pH quá cao, trong nuôi cấy bioreactor quy mô nhỏ hay fermentor thì pH tối ưu cần được đảm bảo bằng cách dùng thiết bị kiểm soát pH. - Ánh sáng: Các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tối hay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng Mỗi loại thực vật có những điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản xuất các chất hữu dụng, vì thế tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp. 2.4.5. Các chất khác [4] Trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chất trong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp. Điều này cho 17 phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấp mới mà bản thân tế bào thực vật không có. Như vậy việc sản xuất các chất thứ cấp có trong tự nhiên hay các chất mới bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật và có sự tham gia của các cơ chất là có thể thực hiện. 2.5. Các phƣơng pháp chiết xuất alkaloid [2, 3] 2.5.1. Nguyên tắc của sự chiết xuất Dược liệu được cấu tạo bởi các tế bào thực vật. Khi cho dung môi chiết vào, dung môi sẽ đi qua các thành tế bào của dược liệu, các hoạt chất bên trong tế bào sẽ hòa tan vào dung môi, khi đó xuất hiện một quá trình thẩm thấu giữa dịch chiết trong thành tế bào và dung môi bên ngoài. Quá trình thẩm thấu này kết thúc khi có sự cân bằng về nồng độ hoạt chất của dung dịch bên trong và bên ngoài thành tế bào [2]. Có hai phương pháp cơ bản để ly trích các alkaloid ra khỏi bột cây khô, dựa vào tính bazơ đặc trưng của các alkaloid: - Alkaloid nói chung là những chất kềm yếu, thường tồn tại trong cây dưới dạng muối của acid hữu cơ hoặc vô cơ, đôi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ để dược liệu dễ thấm với dịch chiết và giải phóng alkaloid khỏi muối của nó bằng những kiềm trung tính hay kiềm mạnh. - Hầu hết các alkaloid kiềm không tan trong nước nhưng lại dễ tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực, các muối alkaloid thường tan trong nước cồn. Mặt khác còn tùy theo tính chất của alkaloid như loại hay bay hơi hoặc không bay hơi mà dùng phương pháp chiết xuất cho thích hợp [3]. 2.5.2. Phƣơng pháp ly trích bằng dung môi hữu cơ [1, 5, 8] * Nguyên tắc: Tán nhỏ dược liệu rồi tẩm bột dược liệu với dung dịch kiềm để chuyển đổi các alkaloid ở dạng muối thành dạng bazơ tự do, kế tiếp bột cây tẩm này được trích với dung môi hữu cơ như: benzen, eter etil, chloroform, acetat etil, nhưng chloroform là dung môi thích hợp nhất cho việc chiết hầu hết các alkaloid kiềm, dung môi này hòa tan các alkaloid bazơ vừa được giải phóng. Cất thu hồi dung môi hữu cơ dưới áp lực hơi nước giảm rồi lắc dịch chiết cô đặc với dung dịch acid loãng (2 - 5%) thường dùng acid HCl, H2SO4…Các alkaloid 18 chuyển sang dạng muối tan trong nước, còn mỡ, sắc tố, sterol… ở lại dung môi hữu cơ. Gộp các dịch chiết muối lại rồi kiềm hóa để chuyển alkalod sang dạng bazơ, lắc với dung môi hữu cơ thích hợp nhiều lần để lấy kiệt alkaloid bazơ. Việc chiết bằng dung môi hữu cơ có thể dùng bình gạn hay các dụng cụ chiết chất lỏng. Sau khi lấy riêng lớp dung môi hữu cơ chứa alkaloid bazơ người ta thường loại nước bằng muối trung tính khan nước (Na2SO4 khan) rồi cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi sẽ thu được cắn alkaloid thô. 2.5.3. Chiết bằng dung dịch acid loãng trong cồn hoặc trong nƣớc [5] Thấm ẩm bột dược liệu bằng dung môi chiết xuất. Các alkaloid trong dược liệu sẽ chuyển sang dạng muối và tan trong dung môi trên. Cất thu hồi dung môi hoặc bốc hơi dung môi dưới áp lực giảm, dùng ether rửa dịch chiết đậm đặc còn lại. Ở môi trường acid, ether thường hòa tan một số tạp chất chứ không hòa tan các alkaloid. Sau khi tách lớp ether, kiềm hóa dung dịch nước rồi lấy alkaloid bazơ được giải phóng ra bằng một dung môi hữu cơ thích hợp, cất thu hồi dung môi hữu cơ rồi bốc hơi tới khô sẽ thu được cặn alkaloid thô. Phương pháp này còn gọi là STAS- OTTO. Ngoài hai phương pháp trên người ta còn sử dụng phương pháp chiết bằng cồn đối với các alkaloid trong dược liệu tồn tại dưới dạng muối tan tốt trong cồn ở môi trường trung tính. Sau khi tán nhỏ dược liệu được đem thấm ẩm và chiết bằng cồn etylic cho tới kiệt alkaloid, quá trình tiếp theo được thực hiện tương tự như trên. 2.6. Các phƣơng pháp định tính sự hiện diện của alkaloid  Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung Các alkaloid cho phản ứng với một số thuốc thử gọi là thuốc thử chung của alkaloid. Những phản ứng chung này chia làm hai loại: phản ứng tạo tủa và phản ứng tạo màu. Có rất nhiều thuốc thử cho phản ứng tạo màu hoặc tạo kết tủa với alkaloid. Có 3 loại thuốc thử thông dụng là: Mayer, Dragendorff, Wagner, ngoài ra còn một số thuốc thử khác để phát hiện các loại alkaloid đặc thù. 19 2.6.1. Phản ứng tạo tủa [8] Thuốc thử Mayer (K2HgI4): hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml nước cất và hòa tan 5 g KI trong 10ml nước cất, trộn hai dung dịch này lại và thêm nước cất đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt, nhưng tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi AcOH, etanol có sẵn trong dung dịch thử. Thuốc thử Dragendorff (KBiI4): hòa tan 8,0 g Nitrat bismuth trong 25 ml HNO3 30%, và hòa tan 28 g KI, 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Trộn hỗn hợp hai dung dịch này lại, thêm đủ 100 ml nước cất thu được dung dịch có màu đỏ cam, dùng để thử nghiệm trong ống nghiệm hay để pha thuốc phun xịt bản mỏng. + Định tính bằng ống nghiệm: Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendoff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam - nâu. + Để phun xịt lên tấm bảng mỏng: Pha dung dịch phun xịt trong bình phun xịt, nếu có akaloid sẽ cho vết màu cam - đỏ trên bản mỏng. Thuốc thử Wagner: hòa tan 1,27 g iod và 2 g KI trong 20ml nước cất, thêm nước cất đủ 100 ml. Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch acid pha loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. 2.6.2. Phản ứng tạo màu [5] Có một số thuốc thử cho tác dụng với alkaloid cho những màu đặc biệt khác nhau do đó người ta cũng dùng phản ứng tạo màu để xác định alkaloid. Phản ứng tạo tủa cho ta biết có alkaloid hay không, còn phản ứng tạo màu cho biết có alkaloid gì trong đó. Thuốc thử tạo màu thường là những hợp chất hữu cơ hoặc vô cơ hòa trong acid H2SO4 đậm đặc. Những thuốc thử tạo màu quan trọng là: acid sulfuric đậm đặc, acid Nitric đậm đặc, thuốc thử Frohde (acid sulfomolybdic), thuốc thử Marquis (sulfofocmol), thuốc thử Mandelin (acid sulfovanadic)… Trong dịch chiết có nhiều alkaloid và còn lẫn tạp chất khác thì phản ứng lên màu không thật rõ bằng những alkaloid đã được chiết và phân lập ở dạng tinh khiết. 20 Do đó để kết luận được chắc chắn người ta thường dùng phản ứng màu kết hợp với phương pháp sắc kí lớp mỏng có alkaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh. 2.7. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid [5] Người ta có thể định lượng toàn bộ alkaloid hay chỉ một hay vài alkaloid là hoạt chất trong một dược liệu. Có nhiều phương pháp định lượng như phương pháp cân, phương pháp đo acid, phương pháp so màu, phương pháp trung hòa, phương pháp đo bằng quang phổ tử ngoại, phương pháp cực phổ, phương pháp sinh vật… Các phương pháp định lượng alkaloid gồm hai giai đoạn chính: + Lấy riêng alkaloid ra khỏi dược liệu; + Định lượng: tùy theo tính chất của alkaloid mà lựa chọn phương pháp cho thích hợp. 2.7.1. Phƣơng pháp cân Để định lượng alkaloid bằng phương pháp cân, cần phải chiết được alkaloid tinh khiết không lẫn tạp. Do đó phương pháp này tương đối lâu và người ta chỉ sử dụng khi những phương pháp không thuận tiện bằng. Phạm vi sử dụng nó là những alkaloid có tính kiềm yếu. Ngoài ra, phương pháp cân còn được dùng trong trường hợp những alkaloid chưa xác định rõ cấu trúc hóa học hoặc hỗn hợp nhiều alkaloid có phân tử lượng rất khác nhau. Khi định lượng, người ta phải chiết alkaloid tinh khiết bằng một dung môi hữu cơ, sấy tới khối lượng không đổi rồi đem cân. Nếu hàm lượng alkaloid trong dược liệu rất thấp thì định lượng bằng phương pháp cân trực tiếp khó chính xác nên phương pháp này không được sử dụng. 2.7.2. Phƣơng pháp trung hòa Mặc dù alkaloid chiết xuất ra được tinh chế nhưng định lượng bằng phương pháp cân thường cho sai số thừa vì các tạp chất còn bị lôi cuốn theo lẫn với cắn alkaloid. Do đó định lượng alkaloid bằng phương pháp trung hòa được dùng nhiều hơn. Muốn định lượng bằng phương pháp này thì alkaloid phải chiết ra ở dạng kiềm. Dung dịch alkaloid kiềm phải trong vì có vẫn đục hay lẫn phần nhỏ nhũ dịch 21 sẽ gây ra hiện tượng hấp phụ các chất kiềm làm cho kết quả định lượng có sai số thừa. Ngoài ra, nếu có lẫn các chất kiềm như amoniac, các amin cũng như chất màu và chất béo cũng ảnh hưởng tới kết quả định lượng. Sau khi đã có dịch chiết alkaloid kiềm tinh khiết có thể tiến hành định lượng bằng cách: lắc alkaloid trong dung môi hữu cơ có lượng acid chuẩn độ dư, sau đó định lượng alkaloid thừa bằng kiềm tương ứng, hoặc làm bốc hơi dung môi hữu cơ, cắn alkaloid còn lại được định lượng trực tiếp hay gián tiếp bằng acid chuẩn độ. Người ta thường dùng HCl hay H2SO4 có nồng độ 0,01 - 0,1N để chuẩn độ, chỉ thị màu dùng trong định lượng phần lớn là methyl đỏ vì hầu hết muối alkaloid đều làm chuyển màu chỉ thị này trong khoảng pH = 4,2 - 6,3. 2.7.3. Định lƣợng alkaloid trong môi trƣờng khan Những alkaloid có tính kiềm yếu thì chuẩn độ trong môi trường dung dịch nước không chính xác vì muối tạo ra khi trung hòa sẽ thủy phân mạnh nên khó quan sát vùng chuyển màu của chỉ thị. Tuy vậy nếu hòa tan alkaloid vào trong dung môi không phải là nước (gọi là môi trường khan) thì người ta có thể định lượng được những alkaloid có tính kiềm yếu này. Thường dùng acid percloric 0,1N để định lượng và chỉ thị màu là gentian tím. 2.7.4. Phƣơng pháp so màu Phương pháp so màu chỉ cần một lượng nhỏ alkaloid, lại có độ nhạy và có kết quả nhanh do đó cũng là phương pháp hay dùng để định lượng alkaloid. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào phản ứng tạo màu của alkaloid, dùng dung dịch có màu để định lượng. Những alkaloid không thể tạo thành dung dịch có màu để định lượng trực tiếp người ta cho alkaloid tác dụng với thuốc thử tạo tủa có màu, sau đó tách riêng tủa và hòa tan trong dung môi thích hợp sẽ được dung dịch có màu để định lượng alkaloid. 22 2.7.5. Các phƣơng pháp định lƣợng alkaloid hiện đại 2.7.5.1. Hệ thống sắc kí lỏng cao áp (HPLC)  Nguyên lí hoạt động: phương pháp này dựa theo tính chất hấp thụ, sự phân bố hay trao đổi ion của chất tan (chất phân tích) với pha tĩnh ở trong cột để tách các chất. Vì dùng hạt pha tĩnh kích thước rất nhỏ (3 - 10 µm) để tăng số đĩa lí thuyết cho cột và để cân bằng giữa pha tĩnh và pha động được thiết lập nhanh, nên phải dùng bơm hoặc khí ép có áp suất cao để đẩy pha động đi được nhanh. Cột tách phải bằng thép không gỉ để chịu được áp suất cao (400 - 600 atm) và có đường kính 1 - 4 mm. Thể tích dung dịch mẫu khoảng vài đến vài chục µl (được tiêm vào phía trên cột). Nếu dùng máy tự ghi sẽ thu được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất [31].  Ƣu điểm - Kĩ thuật phân tích hiện đại, hiện nay được sử dụng khá phổ biến trong các lĩnh vực nghiên cứu, kiểm nghiệm, tách các chế phẩm đa thành phần. - Cho kết quả nhanh, tốt cả về mặt định tính lẫn định lượng. 2.7.5.2. Hệ thống điện di mao quản (CE) [13]  Nguyên lý hoạt động: Phương pháp phân tích này dựa theo nguyên tắc di chuyển của những chất tích điện trong một điện trường nhờ vào hai nguyên tắc cơ bản sau: quá trình điện di (electromigration) và quá trình điện thẩm (electroosmose). + Sự dịch chuyển điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về điện cực ngược dấu. + Dòng điện thẩm biểu diễn một dòng chất điện ly lớn gây nên bởi thành mao quản bên trong được tích điện và thế áp đặt. Khi đặt điện thế các cation trong dung dịch điện ly gần thành mao quản di chuyển về phía catod, kéo dung dịch điện ly đi theo chúng. Điều này tạo thành một dòng điện thẩm thấu hướng về phía catod Mẫu có thể được bơm vào trong hệ thống nhờ áp suất hoặc điện áp. Dưới tác dụng của điện áp cao, các cấu tử đi qua một cửa sổ của mao quản, một detector UV – DAD chọn lọc – bước sóng phát hiện chúng và truyền một tín hiệu điện tỉ lệ với độ hấp thu của mẫu đến máy ghi, tích phân kế hay máy tính. Các tín hiệu này sẽ 23 được vẽ dưới dạng được sắc kí đồ với một dãy các pic; mỗi pic ứng với một chất. Kĩ thuật điện di mao quản được sử dụng để phân tích nhiều loại mẫu : acid amin, protein, đoạn DNA, acid nucleic và đặc biệt thích hợp cho việc phân tích các chất quý giá có hoạt tính sinh học.  Ƣu điểm Lượng mẫu đòi hỏi rất bé 5 - 30 µl, với thể tích bơm mẫu thực sự chỉ 10 - 50 nl, ngưỡng phát hiện thấp. Thời gian phân tích mẫu ít hơn so với các phương pháp truyền thống khác, thời gian phân tích cơ bản chỉ cần vài phút, trường hợp đặc biệt lên đến 30 phút. Xác định được danh tính và nồng độ các phân tử trong hỗn hợp dựa vào chất chuẩn.  Các yếu tố có khả năng ảnh hƣởng đến kết quả phân tích trên CE - Khi sử dụng dung dịch đệm có pH quá cao hay quá thấp gây ra tính không đồng nhất của điện tích bề mặt thành cột làm ảnh hưởng đến sự phân tách các cấu tử mẫu. - Nhiệt độ thay đổi dẫn đến thay đổi độ nhớt và dòng điện thẩm (EOF) cũng ảnh hưởng đến quá trình tách chất. - Điện thế sử dụng bị thay đổi làm thay đổi tương ứng thời gian lưu. Kĩ thuật sắc kí lỏng cao áp (HPLC) và kĩ thuật điện di mao quản (CE) đều là những phương pháp có độ chính xác cao. Tuy nhiên CE có nhiều ưu điểm hơn về mặt thời gian phân tích, dung môi hóa chất sử dụng và giá thành cho một lần thử nghiệm. 2.8. Các nghiên cứu về việc tăng cƣờng sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật [26] Zenk và cộng sự (1977) đã kiểm tra sự sản xuất serpentine, một loại indole alkaloid trên những môi trường cơ bản khác nhau, kết quả cho thấy lượng serpentine tạo ra phụ thuộc vào thành phần môi trường đã sử dụng. Trong tất cả môi trường đã sử dụng, môi trường MS là thích hợp nhất cho sự tạo thành alkaloid này thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào Catharanthus roseus [21]. Trong các thành phần của môi trường chứa chất kích thích sinh trưởng, auxin và kinetin có ảnh hưởng rõ rệt lên sự phát triển và trao đổi chất ở thực vật. Ví dụ như auxin được thêm vào môi trường để kích thích tạo ra mô sẹo nhưng thêm một lượng ít. 24 2.8.1. Chọn lọc dòng tế bào có sức sản xuất cao Những đặc tính sinh lý học của mỗi loại tế bào thực vật không phải lúc nào cũng giống nhau, Zenk cùng cộng sự ở Đức đã thu được dòng tế bào Trường xuân hoa chứa hàm lượng ajmalicine và serpentine cao [21]. Điều này cũng tương tự như việc phân lập đơn khuẩn lạc. Tiếp sau những kết quả của họ, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng phương pháp tạo dòng như là một con đường hứa hẹn để gia tăng các chất chuyển hóa. 2.8.2. Xử lý với Elicitor Mẫu cấy thực vật nhiễm vi sinh vật có thể tạo ra sự tổng hợp các chất thứ cấp đặc trưng. Nấm là tác nhân gây bệnh được hiểu rõ nhất, nó có các phân tử điều hòa như glucan polymer, glycoprotein và các acid hữu cơ trọng lượng phân tử thấp. DiCosmo và Towers [26] đã xét về sự tương quan giữa stress và sự trao đổi chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy. Các yếu tố gây stress được ứng dụng thông qua chu trình nuôi cấy hoặc như là một yếu tố gây sốc chính tại một vài điểm của chu trình nuôi cấy để làm tăng lượng alkaloid tích lũy. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng những phân tử hữu cơ và vô cơ có thể tác động đến sự tích lũy các sản phẩm thứ cấp như vanadyl sulphate tác động đến sự tích tụ indole alkaloid trong nuôi cấy Catharanthus roseus. Những chất khác có thể kích thích sự tích lũy alkaloid trong cây Trường xuân hoa gồm có sodium chloride, potassium chloride, abscisic acid và sorbitol. Những quy trình này với việc tận dụng những elicitor đơn giản và rẻ tiền hứa hẹn cho sản xuất tế bào thực vật quy mô công nghiệp. 2.8.3. Sự bổ sung tiền chất và sự biến đổi sinh học 2.8.3.1 Sự bổ sung tiền chất Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp hay những hợp chất liên quan đôi khi cũng làm kích thích sự sản xuất các chất thứ cấp. Phương pháp này rất có lợi nếu giá thành của các tiền chất không đắt. Từ khi Chan và Staba [26] thử nghiệm sản xuất alkaloid bằng cách này vào thập niên 60, nhiều thí nghiệm 25 tương tự cũng đã được thực hiện. Ví dụ như, amino acid đã được thêm vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào để sản xuất tropane alkaloid, indole alkaloid, ephedorin và vài hiệu quả kích thích đã được quan sát. Thật sự thì amino acid là tiền chất của những alkaloid khác nhau, nhưng các bước sinh tổng hợp từ amino acid thành alkaloid rất phức tạp đến nỗi người ta nghi ngờ rằng có hay không việc các amino acid được kết hợp trực tiếp để tạo thành alkaloid trong nuôi cấy tế bào. Có lẽ, các amino acid không chỉ tác động lên sự sinh tổng hợp trực tiếp các alkaloid với vai trò như một tiền chất mà còn tác động gián tiếp thông qua những con đường trao đổi chất khác trong tế bào [26]. 2.8.3.2. Sự biến đổi sinh học Thay vì bổ sung những tiền chất vào môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, thì người ta còn có thể sử dụng các cơ chất thích hợp để chuyển hóa thành sản phẩm mong muốn trong tế bào thực vật. Phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trong lên men công nghiệp bằng việc sử dụng vi sinh vật và các enzym của chúng. Công ty Allelix Inc. ở Canada (Misawa và cộng sự, 1988) đã thiết lập quy trình sản xuất một loại thuốc chống u bướu rất đắt tiền là vinblastine từ catharanthine và vindoline. Cũng quan tâm đến việc sản xuất những hợp chất liên quan đến vinblastine, Bede và DiCosmo (1992) cho rằng sự chuyển hóa catharanthine và vindoline thành anhydrovinblastine là nhờ sử dụng enzyme peroxidase và glucose oxidase để kết hợp vindoline và catharanthine [6]. Tóm lại, tiến trình chuyển hóa liên quan đến sự bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy là một trong những phương án thiết thực nhất xét về phương diện thương mại trong nuôi cấy mô thực vật. Tuy nhiên việc kiếm được những tiền chất không đắt vẫn là vấn đề chính. Do đó việc nuôi cấy mô thực vật tạo ra nhiều tiền chất như catharanthine và vindoline là rất đáng quan tâm. 26 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Nội dung nghiên cứu Nội dụng 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của IAA, NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trường nuôi cấy. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện từ 29/1/2007 đến 13/08/2007 tại Bộ môn Công nghệ Sinh học và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM. 3.3. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hƣởng của IAA, NAA lên sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro 3.3.1. Vật liệu 3.3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là cây Trường xuân hoa (Catharanthus roseus). Nguồn mẫu để tiến hành thí nghiệm trong đề tài này được thu từ cây trồng trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Các cây Trường xuân hoa có độ tuổi từ 1 năm đến 1 năm rưỡi, cây khỏe và cho hoa đẹp. 3.3.1.2. Thiết bị và dụng cụ Các thiết bị phục vụ nuôi cấy mô như tủ cấy vô trùng, autoclave, bình tam giác, đĩa petri, bình nuôi cấy 500 ml, dao cấy, đèn cồn, máy đo pH, cân phân tích… 3.3.2. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashiga & Skoog, 1962) có bổ sung các hormone tăng trưởng BA, NAA, IAA tùy thí nghiệm. Điều kiện phòng nuôi in vitro: nhiệt độ: 24 ± 2oC, ẩm độ: 55 % - 60 %, chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng là 1000 - 2000 lux. 27 3.3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Thí nghiệm được tiến hành để xác định giai đoạn cây sinh trưởng tạo rễ tốt nhất khi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA. Vì NAA thường được sử dụng ở nồng độ 0,5 mg/l cho nhiều loại cây nuôi cấy mô nên nồng độ này được chọn để thực hiện trong thí nghiệm. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, gồm 9 cây in vitro. Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Hormone NAA 0,5 mg/l 1 2 - + (-) không có NAA trong môi trường nuôi cấy (+) có NAA trong môi trường nuôi cấy Số nghiệm thức: 2 Tổng số mẫu: 270 mẫu Để đánh giá tác động của NAA lên sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro, tiến hành đo chiều cao của cây - được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây, ghi nhận sự thay đổi về chiều dài rễ và số rễ được tạo thành trên cây. Đơn vị tính là mm. Các chỉ tiêu theo dõi được ghi nhận sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy. 3.3.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA, IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Thí nghiệm được tiến hành với mục tiêu xác định nồng độ và loại chất kích thích sinh trưởng thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây tạo rễ. Thí nghiệm thực hiện trên môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (NAA, IAA) với các nồng độ 0,1 mg/l, 0,5 mg/l, 1 mg/l, 5 mg/l, 10 mg/l tùy từng nghiệm thức. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, một yếu tố, 6 nghiệm thức cho mỗi loại chất kích thích sinh trưởng với nghiệm thức 1 là đối chứng. Mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 9 cây in vitro. 28 Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.2. Bố trí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l) 1(Đ/C) 0 2 0,1 3 0,5 4 1 5 5 6 10 Số nghiệm thức: 6 Tổng số mẫu: 162 mẫu 29 Các chỉ tiêu theo dõi - Chiều cao cây (mm): được tính từ chóp lá cao nhất đến gốc của cây. - Chiều dài rễ (mm): được tính từ gốc cho đến phần tận cùng của rễ và tính theo chiều dài của rễ dài nhất. - Số rễ/cây: chỉ tính số rễ chính trên một cây. 3.3.4. Phƣơng pháp tiến hành Tạo nguyên liệu ban đầu Mẫu cấy: mẫu chồi nách được cắt từ cây Trường xuân hoa ngoài thiên nhiên và được khử trùng bề mặt với javel có nồng độ chlor là 38 g/lít được pha loãng với nước theo tỉ lệ 1/4 trong 20 phút, rửa sạch 3 – 5 lần với nước vô trùng, sau đó mẫu được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS. Nhân chồi từ đoạn thân mang chồi bên và chuẩn bị mẫu thí nghiệm Sau 2 tuần vô mẫu, tách chồi và cấy chuyền trong tủ cấy vô trùng. Chồi được tái nuôi cấy thường xuyên để tăng số lượng chồi cho mô cấy. Cắt mỗi đoạn thân dài khoảng 2 cm từ cây con in vitro, trên môi trường MS có mang một nách lá cắm vào môi trường có NAA, IAA để kích thích cho cây ra rễ. 3.4. Nội dung 2: Xác định sự tạo alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro khi bổ sung IAA, NAA trên môi trƣờng nuôi cấy 3.4.1. Vật liệu 3.4.1.1. Mẫu kiểm tra Cây Trường xuân hoa in vitro đã qua nuôi cấy ở nội dung 1. 3.4.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm Cân phân tích chính xác đến 0,1 mg Bình lóng 100 ml Bình tam giác Dụng cụ thủy tinh Máy đông khô Tủ âm 20oC, tủ mát 4 oC Pipet, máy xay sinh tố 30 3.4.1.3. Hóa chất Hoá chất chiết alkaloid HCl 1 N Chloroform CH3Cl NH4OH 25% Methanol Cyclohexan Isopropyl alcohol Acid acetic 0,01 M Hóa chất định tính alkaloid Thuốc thử Wagner: Hòa tan 1,27 g I2 và 2 g KI trong 100 ml nước cất. Hoá chất sử dụng cho máy CE Amonium acetate 0,2 M NaOH 0,1 M Nước khử ion Các chất chuẩn để chạy máy CE Vinblastine sulfate, vincristine sulfate, catharanthine, vindoline 3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.2.1. Thí nghiệm 1: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm 1a: Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có NAA bằng thuốc thử Wagner Mục tiêu của thí nghiệm là kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong cây nuôi cấy mô sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có và không có bổ sung NAA và xác định giai đoạn cây Trường xuân hoa in vitro sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi: quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid khi có mặt của thuốc thử. Phản ứng dương tính khi có vòng nhẫn màu nâu đỏ, nếu alkaloid nhiều có thể quan sát thấy kết tủa. 31 Thí nghiệm 1b: Định tính alkaloid trong thân lá và rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có chứa IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Thí nghiệm được tiến hành để xác định chất kích thích sinh trưởng với nồng độ thích hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Chỉ tiêu theo dõi Quan sát phản ứng của dịch chiết alkaloid trong từng bộ phận cây nuôi cấy mô trên môi trường MS có bổ sung IAA, NAA ở nồng độ khác nhau khi có mặt của thuốc thử. 3.4.2.2. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm ly trích alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định quy trình ly trích tốt nhất các alkaloid trong cây Trường xuân hoa. Các mẫu ly trích thu thập từ cây Trường xuân hoa trong vườn thực nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học. Dịch chiết alkaloid sẽ được xác định hàm lượng bằng CE. Quy trình ly trích được chọn sẽ sử dụng cho các thí nghiệm sau. Chỉ tiêu theo dõi Để đánh giá hiệu quả của hai quy trình ly trích, so sánh hàm lượng alkaloid thu được từ dịch chiết cây Trường xuân hoa in vivo sau khi phân tích bằng CE, dựa vào alkaloid chuẩn. Công thức tính hàm lượng alkaloid dựa vào chất chuẩn C alkaloid (mg/l) = x* Cc* S alkaloid /Sc x: độ pha loãng của mẫu Cc: nồng độ của chất chuẩn (ppm) Sc: diện tích của píc chuẩn 3.4.2.3. Thí nghiệm 3: Xác định hàm lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Thí nghiệm được thực hiện để so sánh hàm lượng alkaloid có trong mẫu thu được từ cây nuôi cấy mô - in vitro và cây ngoài tự nhiên - in vivo. Từ đó đánh giá hiệu quả của việc sử dụng cây Trường xuân hoa nuôi cấy mô sản xuất các hợp chất 32 mong muốn. Mẫu cây Trường xuân hoa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS và mẫu cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi kể từ khi hạt nảy mầm trong vườn ươm được dùng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro được xác định bằng CE sau quá trình ly trích. 3.4.2.4. Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng CE Mục tiêu của thí nghiệm là xác định được hàm lượng catharanthine, vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng ở nồng độ thích hợp (đã xác định ở thí nghiệm 1b) qua các giai đoạn. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lượng alkaloid thu được từ cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trưởng (7, 14, 21, 28, 35 ngày). 3.4.3. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.3.1. Định tính alkaloid trong mẫu cây Trƣờng xuân hoa Phương pháp định tính qua 2 bước sau: - Chiết alkaloid ra khỏi tế bào thực vật bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm: mẫu vật liệu khô được xay nhuyễn và cân khoảng 2 gram bột tẩm kỹ với dung dịch NH4OH, để khô ngoài không khí, dùng 15 ml chloroform cho vào nguyên liệu, đậy nút ngâm trong 24 giờ. Sau đó mang đi lọc, dịch lọc được cô đặc và trích lại bằng dung dịch H2SO4 loãng (Nguyễn Ngọc Hồng, 2004). - Định tính bằng thuốc thử: nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết alkaloid, sẽ xuất hiện lượng kết tủa khác nhau tùy thuộc vào hàm lượng alkalod trong mẫu phân tích. 3.4.3.2. Ly trích alkaloid từ mẫu cây Trƣờng xuân hoa  Quy trình 1: Ly trích alkaloid từ vật liệu tƣơi Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Thu mẫu cây Trường xuân hoa, rửa sạch, để ráo nước. 33 Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.1) Sơ đồ 3.1: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu tươi [11].  Quy trình 2: Ly trích alkaloid từ vật liệu khô Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu cây Trường xuân hoa Mẫu cây được rửa sạch, để ráo nước và mẫu được trữ trong tủ âm 20oC ít nhất 30 phút trước khi đem đông khô. Sau khi đông khô mẫu được bảo quản trong tủ hút ẩm để tránh làm ảnh hưởng đến quá trình phân tích mẫu sau này. Bƣớc 2: Ly trích alkaloid (xem sơ đồ 3.2) Dịch chiết isopropanol Nguyên liệu tươi (0,6 g) Dịch chiết nước acid Dịch chiết nước acid Nghiền với 4 ml isopropanol Lắc 15 phút, lọc bỏ bã Thổi khô bằng khí nitơ Thêm 1 ml acid acetic 0,01M Thêm 1 ml cyclohexan, votex Loại lớp cyclohexan ( lặp lại 2 lần) Thổi khô bằng khí Nitơ Thêm 0,2 ml acid acetic 0,01M 34 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ quy trình ly trích alkaloid từ vât liệu khô [19]. 3.4.3.3. Phân tích và xác định hàm lƣợng alkaloid bằng CE Dịch chiết alkaloid sau quá trình ly trích được sử dụng trong phân tích bằng CE với các thông số sau [11]: - Cột mao quản silica 72 cm với đường kính 50 µm. - Dung dịch đệm ammonium acetat 0,2 M, pH 6,2. - Điện thế sử dụng để phân tích mẫu là 10 Kv. - Thời gian bơm mẫu là 3 giây ở 25 mbar, 25oC. Bột nguyên liệu (100 mg) Dịch chiết HCl Dịch chiết CHCl3 Cắn alkaloid Dịch chiết alkaloid 1 ml chloroform + 80 µl NH4OH đậm đặc  pH = 9 Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Votex 3 lần Ly tâm 13.000 vòng, 10 phút ở 5oC 2 ml methanol Bốc hơi tới khô Chiết bằng 1,5 ml HCl 0,1N Votex 30s Lắc trên máy lắc 30 phút (250 vòng/phút) Ly tâm 6000 vòng, 10 phút ở 5oC 35 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro theo thời gian trên môi trƣờng MS có bổ sung NAA Mẫu được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường MS có và không có bổ sung NAA (0,5 mg/l). Sau mỗi thời gian nuôi cấy, cây được đo chiều cao, chiều dài rễ và đếm số rễ. Kết quả được trình bày trong bảng 4.1, 4.2 và 4.3. Bảng 4.1. Chiều cao cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 27,4a 40,0a 45,2a 47,1a 49,7a 2 0,5 26,3 a 37,0 a 44,7 a 47,1 a 51,1 a P 0,36 0,09 0,72 0,98 0,40 CV (%) 16,1 16,9 11,9 14,2 12,7 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P > 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy chiều cao trung bình của các nghiệm thức trên môi trường có và không có bổ sung NAA không có sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). Chiều cao trung bình của cây Trường xuân hoa sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy lần lượt là 26,9; 38,5; 44,9; 47,1; 50,4 mm (phụ lục 2). Như vậy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy không ảnh hưởng lên chiều cao cây. 36 Bảng 4.2. Chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều dài rễ trung bình (mm) 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 5,22a 5,63a 7,59a 2 0,5 0,00 a 7,59 b 5,77 b 10,07 b 12,44 b P 0,00 0,01 0,00 0,00 CV (%) 11 13,2 14,1 14,2 * Đ/C: đối chứng, môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Bảng 4.3. Số rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Số rễ trung bình 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày 1 (Đ/C) 0 0,00a 2,22a 3,00a 4,74a 8,33b 2 0,5 0,00 a 3,19 b 4,22 b 6,11 b 6,04 a P 0,00 0,00 0,00 0,00 CV (%) 19,6 9,2 13,5 11,4 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có NAA * Trong cùng một cột và các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Kết quả phân tích thống kê cho thấy sự tác động của NAA là rất có ý nghĩa lên chiều dài rễ cây Trường xuân hoa in vitro. Cây được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo rễ dài hơn so với cây đối chứng và chiều dài rễ tỉ lệ thuận so với thời gian nuôi cấy. Tuy nhiên sự tác động của NAA lên số rễ của cây có sự khác biệt 37 giữa các giai đoạn nuôi cấy (Bảng 4.3), trên môi trường có bổ sung NAA cây có số rễ cao nhất là sau 28 ngày nuôi cấy. Ở giai đoạn này cây có số rễ và chiều dài rễ dài gấp 1,5 lần so với cây sau 21 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên, sau 35 ngày nuôi cấy số rễ của cây trên môi trường có NAA giảm dần. Điều này chứng tỏ khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy cây tạo rễ tốt nhất ở giai đoạn 28 ngày tuổi. Vì các tiền chất alkaloid được sản xuất nhiều ở rễ nên giả thiết đặt ra là hàm lượng alkaloid đạt được cao nhất ở cây 28 ngày tuổi nên thí nghiệm tiếp theo được theo dõi ở giai đoạn này. 4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 4.4. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,9ab 2,93c 4,19c 2 0,1 51,8 ab 3,00 c 5,22 d 3 0,5 55,7 b 4,19 e 5,48 de 4 1 55,9 b 3,67 d 5,63 e 5 5 49,5 a 1,93 b 2,44 b 6 10 49,3 a 0,67 a 1,11 a P 0,02 0,00 0,00 CV (%) 17,1 19,8 17,5 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone * Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) Trong các nghiệm thức thí nghiệm thì sự bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l tác động tốt lên chiều cao trung bình của cây nhưng khi nồng độ này quá 38 cao (5 – 10 mg/l) sẽ làm giảm khả năng phát triển của cây. Kết quả này cũng phù hợp với sự tác động của NAA lên sự hình thành rễ. Nồng độ tạo rễ tốt nhất trong thí nghiệm này là NAA 0,5 mg/l với số rễ trung bình là 4,19 trong khi ở nghiệm thức 6 (NAA = 10 mg/l) số rễ tạo thành là thấp nhất 0,67 (Bảng 4.4). Bên cạnh đó quan sát thấy ở nồng độ NAA cao (5 mg/l, 10 mg/l) có sự phát sinh mô sẹo ở phần gốc cây (Hình 4.1) bởi vì nồng độ auxin trong môi trường cao sẽ ngăn cản sự phát sinh hình thái nhưng lại cảm ứng sự tạo sẹo (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Như vậy tác động của NAA phụ thuộc vào nồng độ sử dụng, việc thay đổi nồng độ NAA trong môi trường nuôi cấy dẫn đến sự khác biệt về khả năng tạo rễ ở cây nuôi cấy mô. Ở thí nghiệm này nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ của cây là 0,5 mg/l. 4.3. Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ IAA đến sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa in vitro Bảng 4.5. Ảnh hưởng của nồng độ IAA đến sự sinh trưởng của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ IAA (mg/l) Chiều cao cây trung bình (mm) Số rễ trung bình Chiều dài rễ trung bình (mm) 1 (Đ/C) 0 51,8b 2,93b 4,19b 2 0,1 51,5 b 4,30 c 4,81 c 3 0,5 50,4 b 4,04 c 5,67 d 4 1 49,4 ab 5,63 d 5,85 d 5 5 48,7 ab 2,67 ab 4,67 c 6 10 46,3 a 2,59 a 3,78 a P 0,03 0,00 0,00 CV (%) 13,1 16,4 13,5 * Đ/C: đối chứng môi trường MS không có hormone * Trong cùng một cột và cùng một yếu tố ảnh hưởng, các giá trị trung bình có kí tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (P> 0,05) 39 N2 N3 N1 I2 I3 1 Sẹo Sẹo Rễ NAA = 0,5 mg/l N3 = 1 mg/l NAA = 0,1 mg/l NAA = 5 mg/l NAA = 10 mg/l IAA = 0,5 mg/l IAA = 1 mg/l IAA = 5 mg/l IAA = 10 mg/l IAA = 0,1 mg/l Hình 4.1: Rễ cây Trường xuân hoa trên các môi trường MS có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy. 40 Kết quả phân tích thống kê cho thấy các cây nuôi cấy mô trên môi trường có bổ sung IAA đều bị ảnh hưởng nhưng ở mức độ khác nhau. Khi bổ sung IAA ở nồng độ thấp 0 – 0,5 mg/l tác động khác biệt không có ý nghĩa lên chiều cao cây, nhưng khi tăng nồng độ IAA lên (1 - 10 mg/l) thì chiều cao trung bình của cây giảm dần và ở nghiệm thức 6 (IAA = 10 mg/l) cây có chiều cao thấp nhất (Bảng 4.5). Cây đối chứng và cây trên môi trường chứa IAA có sự khác biệt về số rễ và chiều dài rễ trên phương diện thống kê (P< 0,05). Nồng độ IAA 1 mg/l cho thấy cây tạo được nhiều rễ nhất với chiều dài trung bình là 5,85 mm nhưng khi tăng nồng độ IAA sử dụng lên 10 mg/l thì chiều dài rễ là 3,78 mm và số rễ của cây giảm xuống còn 2,59. Ngoài ra ở nghiệm thức 5 và 6 còn có hiện tượng tạo sẹo và rễ bị biến dạng về hình thái (Hình 4.1) bởi vì khi sử dụng IAA liều cao sẽ kích thích cảm ứng sự tạo mô sẹo làm giảm khả năng tạo rễ.  Kết quả bảng 4.4 và 4.5 cho thấy việc sử dụng NAA 0,5 mg/l hoặc IAA 1mg/l đều tác động tốt lên sự sinh trưởng của cây. Tuy nhiên số rễ được tạo thành khi sử dụng IAA vẫn cao hơn so với khi sử dụng NAA (đặc biệt ở nghiệm thức 6, nồng độ 10mg/l). Điều này có thể là do IAA là loại auxin tự nhiên nên khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cao không gây kích ứng như khi sử dụng auxin nhân tạo NAA. 4.4. Xác định sự hiện diện của alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner  Định tính alkaloid từ cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng của cây (7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi) bằng thuốc thử Wagner 41 Bảng 4.6. Kết quả định tính alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro bằng thuốc thử Wagner Môi trƣờng Ngày nuôi cấy Phản ứng màu với thuốc thử Wagner MS 7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít 21 dung dịch tạo tủa ít 28 dung dịch tạo tủa nhiều 35 dung dịch đục, tạo tủa vừa MS + NAA 0,5 mg/l 7 dung dịch đục mờ, không lắng 14 dung dịch tạo tủa ít 21 dung dịch tạo tủa ít 28 dung dịch tạo tủa nhiều 35 dung dịch đục, tạo tủa vừa Tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa nuôi cấy in vitro phản ứng với thuốc thử cho lượng kết tủa khác nhau (Hình 4.2, 4.3), điều này có nghĩa là alkaloid hiện diện trong tất cả các mẫu cây nuôi cấy in vitro nhưng với lượng khác nhau. Quan sát sự tạo kết tủa của alkaloid sau khi cho phản ứng với thuốc thử nhận thấy mẫu cây được nuôi trên môi trường có NAA cho kết tủa nhiều hơn so với mẫu cây nuôi trên môi trường MS ở cùng một thời điểm. Việc thay đổi môi trường sống của cây có thể đã tác động đến chu trình hình thành các alkaloid vì alkaloid được sản xuất ở thực vật nhằm giúp cho cây thích nghi với môi trường, dẫn đễn lượng alkaloid cao ở mẫu cây trên môi trường có NAA. Đặc biệt ở mẫu cây sau 28 ngày nuôi cấy xuất hiện kết tủa nhiều nhất, chứng tỏ hàm lượng alkaloid ở giai đoạn này là cao nhất. Điều này phù hợp với giả thiết đã đặt ra. Ở các giai đoạn còn lại cũng thu được kết tủa nhưng với lượng ít hơn, trong số đó mẫu cây sau 7 ngày nuôi cấy cho kết tủa ít nhất (dung dịch đục và có vòng nhẫn). 42 Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy, cây sản xuất lượng alkaloid cao nhất sau 28 ngày.  Định tính alkaloid trong thân lá cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày Hình 4.2: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên). 7 ngày 14 ngày 21 ngày 28 ngày 35 ngày Hình 4.3: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong cây Trường xuân hoa in vitro ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Phản ứng dương tính: xuất hiện kết tủa (mũi tên). 43 Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết alkaloid từ mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro 28 ngày tuổi trên các môi trường có bổ sung NAA, IAA với các nồng độ khác nhau, để chọn nồng độ phù hợp kích thích cây sản xuất nhiều alkaloid nhất. Kết quả trình bày ở bảng 4.7. Bảng 4.7. Kết quả định tính alkaloid trong thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau sau 28 ngày nuôi cấy Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 dung dịch đục, tạo tủa vừa 0,1 dung dịch đục mờ, không lắng 0,5 dung dịch tạo tủa nhiều 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch tạo tủa ít 10 dung dịch tạo tủa ít IAA 0,1 dung dịch tạo tủa ít 0,5 dung dịch đục mờ, không lắng 1 dung dịch đục, tạo tủa vừa 5 dung dịch đục mờ, không lắng 10 dung dịch tạo tủa ít Khi cho phản ứng với thuốc thử,ở các mẫu trên môi trường có bổ sung NAA cho kết tủa nhiều hơn so với các mẫu trên môi trường chứa IAA. Có nghĩa là lượng alkaloid được tạo ra nhiều trong cây nuôi cấy trên môi trường bổ sung NAA. Điều này có thể giải thích là do IAA là chất kích thích tăng trưởng có nguồn gốc từ thực vật nên việc sử dụng IAA như chất cảm ứng để kích thích khả năng tổng hợp alkaloid không có hiệu quả như khi sử dụng chất có nguồn gốc hóa học như NAA. 44 Trong số các nồng độ NAA sử dụng thì thấy mẫu cây trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l tạo kết tủa nhiều nhất khi phản ứng với thuốc thử. Ở nồng độ 1 mg/l, 5 mg/l và 10 mg/l cho phản ứng tạo tủa vừa, dung dịch đục còn ở 0,1 mg/l thì dung dịch đục và tạo kết tủa rất ít. Như vậy, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 mg/l cây sản xuất được nhiều alkaloid nhất (Hình 4.4). Các mẫu cây nuôi trên môi trường chứa IAA khi cho phản ứng với thuốc thử thì thấy dung dịch đục mờ ít lắng, điều này có thể là do lượng alkaloid toàn phần trong cây trên môi trường này được tạo ra ít. Trong các nồng độ thí nghiệm thì khi dùng IAA 1mg/l cho hiện tượng tạo kết tủa rõ ràng nhất, ở các nồng độ còn lại có thể do lượng alkaloid trong mẫu ít nên không quan sát thấy kết tủa, chỉ thấy dung dịch vẫn đục (Hình 4.5). 1 2 3 4 5 6 Hình 4.4: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau,1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. 45 . Qua thí nghiệm này cho thấy khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy một lượng auxin thích hợp (NAA 0,5 mg/l hay IAA 1 mg/l) thì kích thích khả năng tạo alkaloid ở cây Trường xuân hoa. Tuy nhiên, xét về mặt kinh tế, sử dụng NAA 0,5 mg/l có hiệu quả hơn.  Định tính alkaloid trong rễ cây Trƣờng xuân hoa in vitro trên môi trƣờng có bổ sung IAA hoặc NAA bằng thuốc thử Wagner Tiến hành ly trích alkaloid của rễ cây Trường xuân hoa 28 ngày tuổi trên các môi trường khác nhau trong acid H2SO4 loãng sau đó nhận diện alkaloid bằng thuốc thử Wagner. 1 2 3 4 5 Hình 4.5: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l. 46 Bảng 4.8. Kết quả định tính alkaloid trong rễ cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung auxin khác nhau Chất kích thích sinh trƣởng Nồng độ (mg/l) Phản ứng màu với thuốc thử Wagner NAA 0 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++++) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) IAA 0,1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 0,5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+) 1 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 5 Vòng nhẫn đỏ nâu(+++) 10 Vòng nhẫn đỏ nâu(++) +: nhạt màu, ++ : đậm vừa, +++ : đậm, ++++ : đậm màu nhất 1 2 3 4 5 6 Hình 4.6: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 47 Kết quả ở hình 4.6 và 4.7 cho thấy tất cả các mẫu thí nghiệm đều phản ứng với thuốc thử tạo vòng nhẫn màu nâu đỏ (giống mẫu đối chứng), điều này chứng tỏ tất cả các mẫu rễ đều có chứa alkaloid. Vì alkaloid phân bố khác nhau ở thân, lá và rễ (2.3.3) nên khi nhận biết bằng thuốc thử ở các mẫu rễ ta không thấy sự xuất hiện kết tủa như ở mẫu thân lá. Khi cho cùng lượng thuốc thử vào các mẫu, quan sát thấy mẫu được nuôi trên môi trường có bổ sung NAA tạo vòng nhẫn đậm màu hơn so với các mẫu cây được nuôi trên môi trường có chứa IAA. Trong tất cả các nồng độ NAA đã thí nghiệm, mẫu cây được nuôi trên môi trường chứa NAA 0,5 mg/l cho kết quả tạo màu đậm nhất. Việc sử dụng NAA ở nồng độ cao (5 mg/l, 10 mg/l) tạo vòng nhẫn mờ và dễ bị hòa tan có thể là do ở nồng độ này cây thích hợp cho việc tạo mô sẹo chứ không kích thích lên sự phát triển của rễ. Ngược lại các mẫu trên môi trường có bổ sung IAA vòng nhẫn đậm màu ở mẫu 3, 4, đậm vừa ở mẫu 5 và nhạt màu ở mẫu 1 và 2, điều này có nghĩa là việc sử 1 2 3 4 5 Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa NAA với các nồng độ khác nhau. 1) 0 mg/l, 2) 0,1 mg/l, 3) 0,5 mg/l, 4) 1 mg/l, 5) 5 mg/l, 6)10 mg/l. ường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau. Hình 4.7: Phản ứng với thuốc thử Wagner của alkaloid trong mẫu rễ của cây Trường xuân hoa in vitro sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường có chứa IAA với các nồng độ khác nhau, 1) 0,1 mg/l, 2) 0,5 mg/l, 3) 1 mg/l, 4) 5 mg/l, 5)10 mg/l, phản ứng tạo vòng nhẫn (mũi tên). 48 dụng IAA ở nồng độ 1 mg/l và 5 mg/l có thể kích thích lên sự sản sinh alkaloid của cây Trường xuân hoa in vitro. Như vậy việc sử dụng auxin ở nồng độ thích hợp (NAA 0,5 mg/l; IAA 1 mg/l) có thể tác động đến sự tích lũy alkaloid ở rễ. Tóm lại khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung NAA 0,5 mg/l cây Trường xuân hoa in vitro có thể đạt được hàm lượng alkaloid cao. Trong đó lượng alkaloid tập trung nhiều ở thân lá. 4.5. Thí nghiệm 2: Thử nghiệm quy trình ly trích alkaloid Trƣờng xuân hoa Tiến hành ly trích mẫu theo hai quy trình khác nhau: + Quy trình 1: ly trích alkaloid từ vật liệu tươi (trang 33) + Quy trình 2: ly trích alkaloid từ vật liệu khô (trang 34) Dịch chiết alkaloid sau khi ly trích được phân tích bằng CE Hình 4.8: Kết quả CE chuẩn catharanthine 20 mg/l (A), vindoline 20 mg/l (B), Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10 kV; bơm 3 s ở 25 mbar; nhiệt độ 25oC 49 Khi phân tích dịch chiết alkaloid trong mẫu cây Trường xuân hoa tươi và khô bằng CE đều nhận thấy có sự hiện diện của catharanthine và vindoline trong mẫu. Khi tiến hành ly trích từ mẫu tươi, kết quả trên hình 4.9 cho thấy nhiều hợp chất trong cây được nhận diện (mỗi pic đại diện cho một chất) nhưng theo kết quả tính toán các dịch alkaloid ly trích từ mẫu tươi (quy trình 1) có hàm lượng cathẩnthine và vindoline thấp hơn so với các dịch alkaloid ly trích bằng mẫu khô (quy trình 2) ( xem bảng 4.9). 2 a b Hình 4.9: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng tươi. a) Catharanthine, b) vindoline. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2 và điện thế áp 10. kV; nhiệt độ 25oC 50 Bảng 4.9. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong mẫu tươi và mẫu khô cây Trường xuân hoa in vivo khi phân tính bằng CE Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Quy trình 1 0,00348 0,02704 Quy trình 2 0,02087 0,05216 b a Hình 4.10. Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong mẫu Trường xuân hoa in vivo, mẫu ly trích ở dạng khô, a) Catharanthine, b) vindoline.. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC 51 Kết quả phân tích ở hình 4.9 và 4.10 cho thấy sự phân tách alkaloid ở mẫu khô tốt hơn so với mẫu tươi, vì khi ly trích bằng vật liệu tươi, mẫu có độ nhớt cao hơn sẽ làm cản trở quá trình phân tách các chất dẫn đến có píc đôi. Hơn nữa, theo quy trình ly trích 1 thì mẫu phải trải qua nhiều giai đoạn tiếp xúc với dung môi nên lượng alkaloid bị hao hụt và thời gian để chuẩn bị mẫu lâu hơn so với quy trình 2, có thể lượng alkaloid đã bị ảnh hưởng một phần bởi ánh sáng do mẫu để lâu ngoài môi trường. Hàm lượng catharanthine ly trích theo quy trình 2 cao 4 lần so với lượng catharanthine thu được sau khi ly trích theo quy trình 1, còn lượng vindoline thì cao gấp 2 lần (Biểu đồ 4.1). Như vậy việc sử dụng quy trình ly trích từ mẫu khô cho kết quả tốt hơn. 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 QT1 QT 2 Quy trình ly trích in do l a lk al oi d (% ch ất k hô ) Catharanthine vindoline Biểu đồ 4.1: Hàm lượng catharanthine và vindoline khi ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo theo quy trình 1 và 2. Qua thí nghiệm này cho thấy quy trình ly trích bằng mẫu khô cho kết quả phân tích alkaloid tốt hơn, vì quy trình ly trích mẫu tươi khá phức tạp và tốn nhiều thời gian, mẫu phải được ly trích ngay khi thu hoạch, không bảo quản được lâu như 52 mẫu khô nên không thuận lợi khi thực hiện nghiên cứu. Trong khi đó, mẫu vật liệu được bảo quản dễ dàng, chỉ cần trữ mẫu nơi khô ráo, tránh hút ẩm. 4.6. Thí nghiệm 4: Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây Trƣờng xuân hoa in vivo Trước khi tiến hành phân tích một mẫu, máy CE được luyện cột với dung dịch đệm và chạy chuẩn alkaloid của Trường xuân hoa. Ly trích mẫu cây Trường xuân hoa in vivo và cây in vitro theo quy trình 2, sau đó đem phân tích alkaloid bằng CE, kết quả thu được như sau: Catharanthin e Catharanthine Vindolin e Vindolin e Hình 4.11: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vitro 2 tuần tuổi. Cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC Hình 4.12: Kết quả phân tích CE các alkaloid có trong cây Trường xuân hoa in vivo 2 tuần tuổi, cột mao quản silica 50 μm i.d x 75 cm; buffer, 0,2 M ammonium acetate, pH 6,2; điện thế áp 10 kV; nhiệt độ 25oC. 53 Kết quả trình bày ở hình 4.11 và 4.12 cho thấy trong mẫu Trường xuân hoa in vitro và in vivo đều có chứa catharanthine và vindoline khi so với catharanthine và vindolin chuẩn. Nhưng hàm lượng các chất này trong cây in vitro cao hơn so với cây in vivo (Bảng 4.10). Bảng 4.10. Hàm lượng Catharanthine và Vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro và in vivo 2 tuần tuổi khi phân tính bằng CE Biểu đồ 4.2: So sánh hàm lượng catharanthine và vindoline giữa cây Trường xuân hoa in vitro và cây in vivo Quan sát biểu đồ 4.2 nhận thấy ở cùng một thời điểm thu hoạch nhưng các cây Trường xuân hoa in vitro có thể sản xuất lượng catharanthine và vindoline cao Hàm lượng Catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng Vindoline (mg/100mg vật liệu khô) Cây in vitro 0,02149 0,03642 Cây in vivo 0,01969 0,01744 54 hơn so với cây in vi vo, như vậy việc sử dụng các cây Trường xuân hoa in vitro làm nguồn sản xuất các indol alkaloid là có thể thực hiện được. Điều này rất có ích cho việc sản xuất các indol alkaloid trên quy mô công nghiệp vì có thể kiểm soát được quá trình nuôi cấy và kích thích cây sản xuất các hợp chất mong muốn. Hơn nữa ngoài việc nhân nhanh các cây Trường xuân hoa có khả năng sản xuất alkaloid với hàm lượng cao, nuôi cấy in vitro còn có lợi điểm là giảm không gian sử dụng và giảm chi phí so với nhân giống in vivo. Việc này có thể góp phần làm giảm giá thành các alkaloid. 4.2.4 Thí nghiệm 4: Kiểm tra hàm lƣợng alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa ở từng giai đoạn phát triển bằng hệ thống điện di mao quản Xác định hàm lượng của catharanthine và vindoline trong mẫu cây Trường xuân hoa ở 7, 14, 21, 28, 35 ngày tuổi trên môi trường có NAA 0,5 mg/l thu được kết quả như sau: Bảng 4.11. Hàm lượng catharanthine và vindoline trong cây Trường xuân hoa in vitro qua các giai đoạn nuôi cấy Trong các mẫu phân tích, hàm lượng catharanthine cao nhất thu được từ cây nuôi cấy mô ở giai đoạn 28 ngày (0,0394 %). Điều này có thể giải thích là do catharanthine được sản xuất ở rễ và khi so sánh với kết quả nuôi cấy mô nhận thấy cây có khả năng phát triển rễ mạnh nhất sau 28 ngày trên môi trường bổ sung NAA. Trong khi đó, hàm lượng vindoline cao nhất là ở 7 ngày tuổi và giảm dần sau 35 Ngày Hàm lượng catharanthine (mg/100mg vật liệu khô) Hàm lượng vindoline (mg/100mg vật liệu khô) 7 0,0326 0,0371 14 0,0342 0,0112 21 0,0141 0 28 0,0394 0,0274 35 0,0291 0,0224 55 ngày tuổi. Riêng ở giai đoạn 21 ngày không phát hiện được vindoline trong cây, có thể vì ở giai đoạn này vindoline không cần thiết cho cây nên không được tổng hợp hoặc được tổng hợp với hàm lượng thấp và bị loại bỏ trong bớt trong quá trình ly trích nên không phát hiện được khi phân tích bằng CE. Điều này chứng tỏ mỗi loại alkaloid đạt được hàm lượng cao ở những giai đoạn khác nhau. Do đó việc xác định được thời điểm cây sản xuất các hợp chất quan tâm là rất quan trọng. Thí nghiệm này xác định được giai đoạn nuôi cấy thích hợp của cây Trường xuân hoa, trên môi trường bổ sung NAA để thu nhận vindoline là 7 ngày tuổi và catharanthine là 28 ngày tuổi 56 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả thu được có thể đưa ra một số kết luận sau  Sự sinh trƣởng của cây Trƣờng xuân hoa Việc bổ sung NAA vào môi trường nuôi cấy chỉ ảnh hưởng lên sự tăng trưởng về chiều dài rễ và số rễ của cây. Nồng độ thích hợp cho sự phát triển rễ của cây là 0,5 mg/l khi sử dụng NAA và 1mg/l đối với IAA.  Định tính alkaloid trong cây Trƣờng xuân hoa in vitro qua các giai đoạn sinh trƣởng bằng thuốc thử Wagner: Có sự hiện diện của alkaloid trong tất cả các mẫu cây Trường xuân hoa. Lượng alkaloid khác nhau tùy theo thời gian nuôi cấy. Giai đoạn cây in vitro tạo nhiều alkaloid nhất là sau 28 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l. Lượng alkaloid được phát hiện nhiều nhất ở mẫu thân lá của cây Trường xuân hoa in vitro trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l.  Thử nghiệm ly trích alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa Quy trình ly trích alkaloid từ mẫu khô cho kết quả phân tích trên máy CE tốt hơn so với quy trình ly trích alkaloid từ mẫu tươi, hơn nữa mẫu được bảo quản dễ dàng với phương pháp ly trích bằng vật liệu khô và phương pháp này có thể định danh được alkaloid nếu dựa vào píc alkaloid chuẩn.  Định lƣợng alkaloid của cây Trƣờng xuân hoa in vitro và cây in vivo Hàm lượng alkaloid ở mẫu cây ngoài đồng thu được thấp hơn so với mẫu