Khóa luận Khảo sát sự sinh trưởng của saccharomyces sp. trên môi trường cám gạo, rỉ đường và một số yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của chúng trong chế phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003-2007 Sinh viên thực hiện: VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT SỰ SINH TRƢỞNG CỦA SACCHAROMYCES SP. TRÊN MÔI TRƢỜNG CÁM GẠO, RỈ ĐƢỜNG VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SỨC SỐNG CỦA CHÚNG TRONG CHẾ PHẨM Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI VƢƠNG THỊ HỒNG VI Thành Phố Hồ Chí Minh -09/2007- LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng kính trọng, em xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn dạy dỗ, động viên, quan tâm, ủng hộ em hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Ts. Lê Anh Phụng, BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình hoàn thành khoá luận. Em xin chân thành cảm ơn Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y đã cho phép và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu tại phòng. Tôi xin cảm ơn các bạn lớp CNSH 29, Thú Y 28 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Sinh viên thực hiện Vƣơng Thị Hồng Vi TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm” đƣợc tiến hành tại phòng Thực Tập Vi Sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM, thời gian từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Đề tài đƣợc thực hiện với mục đích tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối của nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. Kết quả chúng tôi ghi nhận đƣợc: Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Tuy nhiên, môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Và thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày sản xuất). Việc nuôi cấy chung vi khuẩn sB. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae. ABSTRACT The study on the growth of Saccharomyces sp. on rice bran medium, sugar cane molasses medium and some factors influence on their vitality power for the purpose of producing probiotic. Our topic is done from March to August, 2007 at Microbiology - Infectious Diseases Department, Husbandry and Veterinary Faculty, Nong Lam University, Ho Chi Minh city. S. boulardii was isolated from probiotic and S. cerevisiae was isolated from grapes. They grew well both on rice bran medium and sugar cane molasses medium. Experimental results showed S. boulardii grew better on rice bran than on sugar cane molasses medium. The best time for harvesting S. boulardii biomass was 60 hours after culturing. But, S. cerevisiae grew better on sugar cane molasses medium and the best time for harvesting their biomass was 36 hours after culturing. The rate acid ascorbic and background substance (wheat flour or rice bran) didn’t show the influence to yeast vitality. No considerable oscillations of S. cerevisiae biomass occurred in co-culture with Bacillus subtilis. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Abstract v Mục lục vi Danh sách các hình ix Danh sách các bảng x Chƣơng 1. PHẦN MỞ ĐẦU ....................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích đề tài .................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu đề tài ...................................................................................................... 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN ........................................................................................... 3 2.1. Đặc điểm chung của nấm men ............................................................................. 3 2.2. Vai trò của nấm men ............................................................................................ 4 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men .................................................................. 5 2.3.1. Sinh sản vô tính ......................................................................................... 5 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi .......................................... 5 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào .............................. 5 2.3.2. Sinh sản hữu tính ....................................................................................... 6 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) ................................... 6 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) ............................. 6 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men ............................................................ 7 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces ................................................................... 9 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 10 2.5.2. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 10 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men ........................................................ 11 2.6.1. Giai đoạn thích nghi ................................................................................ 11 2.6.2. Giai đoạn logarit ...................................................................................... 11 2.6.3. Giai đoạn ổn định .................................................................................... 12 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa ................................................................................. 12 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào .................................................................................... 12 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 12 2.7.2. Nhiệt độ ................................................................................................... 14 2.7.3. pH của môi trƣờng .................................................................................. 14 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn .................................................................. 14 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn .............. 15 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi .............................. 18 2.9.1. Ở nƣớc ngoài ........................................................................................... 18 2.9.2. Ở trong nƣớc ........................................................................................... 19 Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 21 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .............................................................. 21 3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 21 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 21 3.2. Vật liệu thí nghiệm ............................................................................................ 21 3.2.1. Mẫu khảo sát ........................................................................................... 21 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 21 3.2.3. Hóa chất .................................................................................................. 21 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy ................................................................................ 21 3.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................... 22 3.4.1. Phân lập nấm men ................................................................................... 22 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì ......................................... 22 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho ............................................................................. 22 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B .......................................................................... 23 3.4.2.1. Mục đích ........................................................................................... 23 3.4.2.2. Thông số cố định .............................................................................. 23 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 23 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 23 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces ............. 24 3.4.3.1. Mục đích ........................................................................................... 24 3.4.3.2. Thông số cố định .............................................................................. 24 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 24 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 25 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm .......................... 25 3.4.4.1. Mục đích ........................................................................................... 25 3.4.4.2. Thông số cố định .............................................................................. 25 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 26 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ... 26 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .................................................................................................. 26 3.4.6.1. Mục đích ........................................................................................... 26 3.4.6.2. Thông số cố định .............................................................................. 26 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi ............................................................................... 27 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm .............................................................................. 27 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu ......... 27 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) ............ 28 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 30 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B ........................................................................................... 30 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces .................................... 33 4.2.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 33 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 35 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm ................................................ 37 4.3.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 38 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 38 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm .............................. 39 4.4.1. Saccharomyces boulardii ........................................................................ 39 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae ....................................................................... 42 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung .......................................................................................................... 43 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 47 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 47 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 49 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 51 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure 31 Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 31 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii 32 Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 32 Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men 51 Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng Sabouraud 51 Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces 51 DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Thành phần hoá học của nấm men 17 Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men 17 Bảng 2.3: Thành phần khoáng của nấm men 18 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men 18 Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 30 Bảng 4.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 33 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 34 Bảng 4.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 35 Bảng 4.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 36 Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 38 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 41 Bảng 4.10: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 43 Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 44 Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy 48 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 48 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 49 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 49 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 50 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy 51 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm 51 Bảng ANOVA 7.1 51 Bảng ANOVA 7.2 51 Bảng ANOVA 7.3 52 Bảng ANOVA 7.4 52 Bảng ANOVA 7.5 52 Bảng ANOVA 7.6 52 Bảng ANOVA 7.7 52 Bảng ANOVA 7.8 53 Bảng ANOVA 7.9 53 Bảng ANOVA 7.10 53 Bảng ANOVA 7.11 53 1 Chƣơng 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong giới vi sinh vật, khi nhắc đến những ứng dụng của nấm men trong chế biến thực phẩm thì Saccharomyces đƣợc xem là một trong những ứng cử viên sáng giá nhất. Từ rất lâu, chúng đã đƣợc sử dụng trong chế biến thực phẩm cho ngƣời nhƣ lên men rƣợu, bia, sản xuất men bánh mì, nƣớc giải khát có cồn… Và trong vài thập kỷ gần đây nó đã đƣợc sử dụng nhiều cho chăn nuôi nhƣ chế biến thức ăn giàu tinh bột từ các phế phụ phẩm công nông nghiệp, sản xuất sinh khối giàu protein và vitamin từ các nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền hoặc sử dụng trong sản xuất các chế phẩm sinh học dùng làm thức ăn bổ sung cho vật nuôi. Việc nghiên cứu sản xuất ở qui mô nhỏ và vừa các chế phẩm sinh học từ nấm men giúp phòng bệnh và kích thích sinh trƣởng cho gia súc, gia cầm phù hợp với thực tiễn nƣớc ta đã và đang đƣợc triển khai nghiên cứu ứng dụng. Với xu hƣớng đó, việc nghiên cứu khả năng sinh trƣởng và phát triển giống nấm men Saccharomyces trên các loại môi trƣờng khác nhau nhằm thu đƣợc lƣợng sinh khối cao với chi phí nuôi cấy thấp là công việc quan trọng và cần thiết. Tuy nhiên, chúng ta cũng cần quan tâm đến thời gian thu hoạch và phƣơng pháp bảo quản khả năng sống của chúng trong chế phẩm. Sở dĩ Saccharomyces đƣợc sử dụng phổ biến để bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi vì chúng thuộc loại nấm đơn bào, chứa nguồn protein phong phú, hàm lƣợng vitamin cao (đặc biệt là vitamin nhóm B) mà thời gian chúng sinh sản nhanh lại dễ nuôi cấy và thu hoạch. Đƣợc sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và sự giúp đỡ của Khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh cùng với sự hƣớng dẫn tận tình của Ts. Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài 2 “Khảo sát sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo, rỉ đƣờng và một số yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sống của chúng trong chế phẩm”. 1.2. Mục đích đề tài Tìm hiểu một số điều kiện trong quy trình sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces sp. nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng cho gia súc, gia cầm. 1.3. Yêu cầu đề tài Phân lập các chủng nấm men từ 4 nguồn mẫu chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ và nho. Đánh giá khả năng sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces sp. trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. Khảo sát, tìm hiểu thời gian thích hợp để thu hoạch nấm men. Đánh giá ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền (cám gạo, bột mì) lên sức sống của Saccharomyces sp. trong chế phẩm. Đánh giá ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm chung của nấm men Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên nhƣ trong đất, nƣớc, lƣơng thực thực phẩm…, đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt. Hình dạng và kích thƣớc nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dƣỡng và nhiều yếu tố khác. Nấm men thƣờng có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình quả dƣa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác. Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium). Ở khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ nhƣ ở khuẩn ty. Khuẩn ty và khuẩn ty giả thƣờng quan sát thấy ở các giống Endomycopsis, Candida, Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi không đƣợc cung cấp đủ oxy. Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh. Ví dụ, Saccharomyces thƣờng có hình bầu dục trong môi trƣờng nuôi cấy giàu dinh dƣỡng. Trong điều kiện yếm khí thƣờng có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn. Kích thƣớc tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giai đoạn phát triển. Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách 4 rõ rệt, kích thƣớc trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm. Kích thƣớc chiều ngang tế bào nấm men giống Torulopsis là 5 – 8 µm, ở một số loại men rƣợu là 10 – 11 µm, men bia là 6 – 8 µm, nấm men gia súc thƣờng nhỏ hơn. Để quan sát hình thái và đo kích thƣớc tế bào nấm men, ngƣời ta thƣờng sử dụng môi trƣờng mạch nha dịch thể với nồng độ đƣờng khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vị thƣờng sử dụng để tính hàm lƣợng đƣờng) hoặc môi trƣờng thạch mạch nha, thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300C. Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…). 2.2. Vai trò của nấm men Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối của chúng rất giàu protein, lipid và vitamin (đặc biệt là vitamin B). Chúng có khả năng lên men các loại đƣờng để tạo thành rƣợu trong điều kiện yếm khí, còn trong điều kiện hiếu khí thì chúng có khả năng tăng nhanh lƣợng sinh khối tế bào. Trong quá trình trao đổi chất của hầu hết giống nấm men đều không sinh ra chất độc gây hại cho sức khoẻ của ngƣời và vật nuôi nên chúng đƣợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm nhƣ sản xuất rƣợu, bia, nƣớc giải khát có cồn, làm men bánh mì, chế biến các thực phẩm sữa lên men kefir, johur … cho ngƣời và thức ăn gia súc. Ngƣời ta còn sử dụng nấm men để sản xuất protein đơn bào, sản xuất vitamin, enzyme… và đặc biệt loài Saccharomyces cerevisiae đang đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm thế hệ mới của ngành công nghệ sinh học hiện đại. Tuy nhiên, cũng có một số nấm men gây bệnh cho ngƣời và gia súc nhƣ Candida albican, Cryptoccocus neoforman… và gây hƣ hỏng thực phẩm nhƣ Endomycopsis fiibuligera, Saccharomyces bisporus… 5 2.3. Các hình thức sinh sản của nấm men Nấm men sinh sản dƣới 2 hình thức sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. 2.3.1. Sinh sản vô tính 2.3.1.1. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi Ở một giai đoạn nhất định nào đó, trên tế bào mẹ xuất hiện chồi và sau đó phát triển thành tế bào con. Tế bào con lớn dần, khi đã đạt đến kích thƣớc của tế bào mẹ thì nhờ sự chuyển động của chất lỏng trong môi trƣờng, nó tách khỏi tế bào mẹ. Trƣớc lúc tách ra, giữa 2 tế bào này có mối liên kết bên trong rất khắng khít. Tế bào mẹ và tế bào con khác nhau về phẩm chất, chức năng nên tốc độ sinh sản của chúng cũng không giống nhau. Nhƣng cũng có trƣờng hợp tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tạo thành những chồi nhỏ liên kết với nhau ngay cả khi chúng trƣởng thành, do đó tạo thành chuỗi tế bào, gọi là khuẩn ty giả. Hình thức nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất ở nấm men, thƣờng gặp ở giống Saccharomyces, Candida, Torulopsis. 2.3.1.2. Sinh sản vô tính bằng hình thức phân chia tế bào Một số loài phân đôi tế bào tạo thành 2 tế bào con bằng nhau, giống nhƣ ở đa số các vi khuẩn. Lúc đầu chất nhân chia làm 2 phần, sau đó ở phần giữa tế bào xuất hiện vách tế bào, vách này lớn dần lên và chia tế bào mẹ thành 2 tế bào con. Mỗi tế bào con chứa nửa chất nhân và dần dần 2 tế bào tách khỏi nhau thành 2 tế bào độc lập. Hình thức sinh sản này thƣờng gặp ở nấm men có dạng sợi dài nhƣ giống Schizosaccharomyces, Endomyces. 6 2.3.2. Sinh sản hữu tính 2.3.2.1. Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospore) Trong quá trình nuôi cấy nấm men chuyển đột ngột từ môi trƣờng giàu sang môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng, trong khi đó vẫn giữ nguyên độ ẩm, tích tụ các hợp chất trung gian, đủ oxy của không khí thì tế bào sẽ sinh bào tử nằm trong các túi, đƣợc gọi là bào tử túi. Bào tử túi bền với tác nhân bên ngoài nhƣ nhiệt độ cao, khô hạn, nhƣng kém bền nhiệt hơn so với bào tử vi khuẩn. Chúng thƣờng chết ở 600C, còn bào tử vi khuẩn chết ở 1200C. Bào tử túi thƣờng đƣợc sinh ra trong những cái túi nhỏ gọi là nang hay túi (ascus) mỗi túi chứa 1 – 8 bào tử túi (ascospore), thƣờng là 1 – 4. Bào tử túi có kích thƣớc và hình dạng khác nhau tùy từng loại nấm men; có thể hình bầu dục, bán cầu, hình thoi… Túi có thể đƣợc sinh ra theo 1 trong 3 phƣơng thức sau: Tiếp hợp đẳng giao (conjugation isogamic): do 2 tế bào nấm men có hình dạng và kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở nhiều loài trong giống Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, Debaryomyces. Tiếp hợp dị giao (conjugation heterogamic): do 2 tế bào có hình dạng và kích thƣớc không giống nhau tiếp hợp với nhau tạo thành. Gặp ở 1 số loài trong giống Zygopichia, Nadsodia. Sinh sản đơn tính (pathenogenesis): đó là quá trình hình thành bào tử trực tiếp từ 1 tế bào riêng lẻ không thông qua tiếp hợp. Gặp ở nhiều loài trong giống Schiwanniomyces, Pichia. Các bào tử túi sau khi ra khỏi túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men mới. Tế bào này lại sinh sản theo lối nảy chồi. 2.3.2.2. Sinh sản hữu tính bằng bào tử bắn (ballistospore) Là loại bào tử chỉ thấy ở các loài trong giống Brullera, Spodiobolus, Sporoliomyces, Aessaspora. Sau khi hình thành, bào tử này có thể bắn mạnh ra phía đối diện. 7 2.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm men Nấm men là vi sinh vật hiếu khí tùy nghi, chúng hô hấp nhƣ một cơ thể hiếu khí bậc cao, khi môi trƣờng hết oxy phân tử chúng chuyển sang hô hấp kỵ khí, gọi là quá trình lên men. Khi phản ứng lên men bắt đầu phát triển, tốc độ sinh sản của tế bào nấm men bị kìm hãm và đến một giai đoạn nhất định hầu nhƣ không còn nữa. Về cơ chế sinh học, đây là một quá trình sử dụng không hết năng lƣợng những chất dinh dƣỡng của môi trƣờng. Vì quá trình phân hủy 1 phân tử gam đƣờng bằng cách lên men chỉ tiết ra khoảng 28 kcal, trong khi đó nếu oxy hóa hoàn toàn 1 phân tử gam đƣờng ta sẽ có 674 kcal. Quá trình lên men tạm gọi là quá trình phosphoryl hóa. Vì trong khi lên men, các hợp chất ATP, ADP tham gia vào 1 cách tích cực. Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đƣờng hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khuếch tán vào bên trong. Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của tế bào đóng vai trò màng bán thấm ngăn cách, điều hoà các chất dinh dƣỡng vào tế bào và thải các sản phẩm trao đổi chất ra ngoài. Các chất dinh dƣỡng sau khi đƣợc hấp thụ vào trong tế bào sẽ xảy ra những phản ứng hóa học để chuyển hóa thành các hợp chất nhƣ protein, glucid, lipid… Dinh dƣỡng cacbon: Trƣớc hết phải kể đến các loại đƣờng, đƣờng glucose đƣợc tất cả các loài nấm men sử dụng. Các loài nấm men dùng sản xuất men gia súc thuộc giống Candida, Torulopsis có thể đồng hóa đƣợc đƣờng pentose. Vì vậy, các men này có thể nuôi cấy ở dịch thủy phân từ gỗ hoặc các nguồn giàu hemicellulose. Những disacarit (maltose và saccarose) trƣớc khi đƣợc nấm men sử dụng phải qua thủy phân sơ bộ thành đƣờng đơn nhờ enzyme tƣơng ứng của nấm men. Nhƣ là một qui luật, trong môi trƣờng có một hỗn hợp các nguồn cacbon dinh dƣỡng thì nguồn nào cung cấp cho nấm men sinh trƣởng tốt sẽ đƣợc sử dụng trƣớc. Đƣờng glucose và fructose đƣợc sử dụng trƣớc hết, kế tiếp là các acid béo (phụ thuộc vào chủng loài nấm men và thành phần của acid này), những hợp chất có nhiều C trong phân tử đƣợc sử dụng sau cùng. 8 Các acid hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng có thể kích thích hoặc ức chế sinh trƣởng nấm men. Chúng có thể là nguồn dinh dƣỡng cacbon và năng lƣợng duy nhất. Sử dụng hydrocacbon từ dầu mỏ và khí đốt làm nguồn cacbon nuôi cấy nấm men rất đƣợc quan tâm trong vài thập kỷ gần đây. Trong đó, parafin có thể là nguồn cacbon dinh dƣỡng dễ dàng đối với một số chủng của giống Candida và Torulopsis. Dinh dƣỡng nitơ: Nấm men có khả năng tổng hợp đƣợc tất cả các acid amin, thành phần protein trực tiếp từ các hợp chất đạm vô cơ và cacbon hữu cơ. Đa số nấm men không đồng hóa đƣợc nitrate (trừ giống Hasenula và Pichia). Nguồn nitơ vô cơ đƣợc nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ cũng nhƣ hữu cơ. Đó là amoni sulfate, phosphate rồi đến các muối acetate, lactate, malate… Trong môi trƣờng có muối amoni, đặc biệt là sulfate, thì nấm men sử dụng gốc amoni trƣớc, gốc acid còn lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng và sẽ làm môi trƣờng acid hóa, giảm pH. Các nguồn nitơ hữu cơ thƣờng là hỗn hợp các acid amin, peptit, nucleotit… Trong thực tế, ngƣời ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân đậu tƣơng làm nguồn nitơ hữu cơ. nấm men tiêu hóa rất tốt các acid amin, còn peptone kém hơn và hoàn toàn không sử dụng đƣợc protein. Các muối amon đƣợc nấm men sử dụng tốt hơn các acid amin. Trong quá trình nuôi cấy nấm men, các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dƣỡng. Tuy nhiên, nấm men chỉ sử dụng đƣợc acid amin ở dạng L-acid amin. Để thu sinh khối Saccharomyces đƣợc tốt, trong môi trƣờng nuôi cấy nên có mặt cả nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ. Dinh dƣỡng các nguyên tố vô cơ: Trong các nguyên tố vô cơ sử dụng nuôi cấy nấm men, phospho đƣợc quan tâm trƣớc hết, sau đó là kali, magiê, lƣu huỳnh… Phospho tham gia vào thành phần quan trọng của tế bào (nucleoproteit, acid nucleic, phospholipit…). Các hợp chất phospho đóng vai trò xác định trong các 9 phản ứng sinh hóa, đặc biệt là trong trao đổi chất hydrocacbon và vận chuyển năng lƣợng. Trong phòng thí nghiệm vi sinh, ngƣời ta thƣờng dùng muối KH2PO4 và K2HPO4 làm nguồn P và K. còn trong sản xuất, thƣờng dùng dịch chiết từ supephosphat làm nguồn P. Dinh dƣỡng các chất kích thích sinh trƣởng: Để cho nấm men phát triển và lên men đƣợc bình thƣờng cần phải có các vitamin làm cofacto trong nhiều enzyme của tế bào nấm men. Nấm men có thể tổng hợp đƣợc tất cả các vitamin trong chừng mực nào đó, ngoại trừ biotin. Vì vậy, trong môi trƣờng nuôi cấy cần phải bổ sung vitamin này. Những nhân tố sinh trƣởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm B: inozit (vit B8), biotin (vit B7), acid pantotenic (vit B3), tiamin (vit B1), pyridoxyn (vit B6), acid nicotinic (vit B5). Trong công nghiệp, thƣờng dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nƣớc chiết cám, dịch thủy phân đậu tƣơng, rỉ đƣờng. Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở qui mô nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, rau cải, cà chua, cà rốt, khoai tây… làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trƣờng. 2.5. Đặc điểm của giống Saccharomyces Một số loài nấm men có khả năng lên men rƣợu và bia lần đầu tiên đã đƣợc Meyen gộp thành 1 giống gọi là Saccharomyces vào năm 1939. Đây là giống có bào tử túi, thƣờng có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử. Tế bào của chúng có hình cầu, dài, elip..., nảy chồi nhiều phía, không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng. Đây là một trong số những giống nấm men đƣợc ứng dụng rộng rãi, phổ biến nhất. 10 2.5.1. Saccharomyces cerevisiae Đƣợc Meyen mô tả vào năm 1938, tế bào có dạng hình trứng, bầu dục…, kích thƣớc trung bình 3 – 6 * 5 – 12 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một chuỗi. Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đƣờng kính 1 – 2 mm vào ngày thứ ba. Phát triển tối ƣu ở 33 – 350C trong môi trƣờng chứa 10 – 30% glucose. Nhiệt độ tối thiểu là 40C trong 10% glucose và 130C trong 50% glucose, nhiệt độ tối đa là 38 – 390C (Jermini and Schmidt-Lorenz, 1987, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Có khả năng phát triển ở pH = 1,6 trong HCl; pH = 1,7 trong H3PO4 và pH = 1,8 – 2 trong acid hữu cơ, có sức chịu đựng lớn nhất đối với acid benzoic 100 mg/kg ở pH = 2,5 – 4 và acid sorbic 200 mg/kg ở pH = 4 (Juven et al, 1978, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Có khả năng lên men đƣờng glucose, galactose, maltose, saccharose, rafinose và các dextrin đơn giản, không lên men lactose, manitol, không đồng hóa nitrate, không phân giải tinh bột. Là loài nấm men hay đƣợc sử dụng làm men bánh mì, lên men rƣợu, bia và hiện còn đƣợc sử dụng làm probiotic phục vụ cho chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản nhờ có khả năng chịu đƣợc acid dạ dày và muối mật tốt, đề kháng tự nhiên với kháng sinh. 2.5.2. Saccharomyces boulardii Đƣợc Herry Boulard phát hiện vào năm 1923 trong vỏ trái cây chín, tế bào có dạng hình tròn, bầu dục, kích thƣớc 4 – 6 * 6 – 9 µm, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và tạo bào tử túi, hô hấp hiếu khí tùy nghi. Có khả năng lên men đƣờng glucose, saccharose, rafinose, xylose; không lên men lactose, manitol, maltose…, không hình thành hợp chất phân giải tinh bột. 11 Là loài nấm men không mang mầm bệnh, đƣợc sử dụng nhƣ một chất biotherapeutic để ngăn cản bệnh tiêu chảy (Surawicz et al.,1989 and 2000, trích từ Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005). Ngoài khả năng giúp cân bằng hệ vi khuẩn đƣờng ruột tƣơng tự vi khuẩn lactic, Saccharomyces boulardii còn có một ƣu điểm vƣợt trội là khả năng đề kháng với kháng sinh và sulfamide (trừ kháng sinh kháng nấm). Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi khuẩn gây viêm ruột kết tràng giả cũng nhƣ trung hoà đƣợc nội độc tố của E. coli và Vibrio cholera nên có thể dùng trong dự phòng tiêu chảy cấp tính. 2.6. Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men diễn biến qua 4 giai đoạn. 2.6.1. Giai đoạn thích nghi Là giai đoạn từ lúc cấy nấm men vào môi trƣờng đến lúc chúng bắt đầu sinh sản. Ở giai đoạn này, chúng còn phải thích nghi với điều kiện môi trƣờng mới. Trong giai đoạn này, tế bào nấm men trải qua những biến đổi lớn về hình thái và sinh lý, kích thƣớc tăng lên đáng kể và chúng trở nên nhạy cảm với những tác động bên ngoài. Số lƣợng tế bào nấm men ở giai đoạn này là không tăng hoặc tăng không đáng kể. 2.6.2. Giai đoạn logarit Số lƣợng và sinh khối tế bào trong giai đoạn này tăng theo cấp số nhân. Khả năng thích ứng với những điều kiện không thuận lợi của môi trƣờng ngoài tăng lên rõ rệt, đồng thời xuất hiện chức năng lên men rƣợu. Giai đoạn này thuận tiện để xác định năng lƣợng sinh sản, thời gian nảy chồi, nhƣng không nên đánh giá kích thƣớc của tế bào cũng nhƣ những dấu hiệu khác của khuẩn lạc. Do trong thời kỳ đầu của giai đoạn này, tốc độ sinh sản của tế bào thƣờng nhanh hơn tốc độ tạo thành tế bào chất nên kích thƣớc của tế bào có phần nhỏ đi. 12 2.6.3. Giai đoạn ổn định Số lƣợng tế bào trong giai đoạn này không tăng nữa, có thể là do sự cân bằng giữa số sinh ra và chết đi. Song kích thƣớc tế bào tăng lên rõ rệt. Quá trình lên men rƣợu cũng bắt đầu. 2.6.4. Giai đoạn thoái hóa Số lƣợng tế bào giảm xuống do có hiện tƣợng tiêu hủy. Lƣợng protein và acid nucleic giảm xuống, glycogen và treganose hoàn toàn tiêu biến. Nhƣ vậy có thể thấy số lƣợng tế bào nấm men đạt cao nhất ở giai đoạn logarit, song sinh khối tế bào lại đạt cao nhất ở giai đoạn ổn định vì khối lƣợng tế bào ở giai đoạn này lớn. 2.7. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của nấm men trong điều kiện nuôi cấy thu sinh khối tế bào 2.7.1. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydratcarbon, nguồn nitơ, phospho, một số nguyên tố vi lƣợng nhƣ K, Na, Mg, Ca và vitamin. Dùng ngũ cốc làm nguồn nguyên liệu sản xuất sinh khối nấm men rất tốt. Bột hoặc tinh bột các loại dùng vào mục đích này trƣớc tiên phải thủy phân bằng acid hoặc enzyme của mầm mạ, của vi sinh vật để biến các polysacarit thành các dạng đƣờng mà nấm men đồng hóa đƣợc. Saccharomyces cerevisiae có khả năng phát triển trên môi trƣờng mà nguồn carbon duy nhất là tinh bột, phát triển dễ hơn trên môi trƣờng đƣờng với nguồn nguyên liệu đƣợc nấu chín thì tốt hơn. Một số giống nấm men phân lập từ men thuốc bắc có khả năng sử dụng cả môi trƣờng đƣờng và môi trƣờng tinh bột hoặc cấy trực tiếp vào thức ăn sống mà vẫn phát triển tốt. Sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng cám, số lƣợng nấm men có thể đạt hàng chục triệu tế bào/ml dịch nuôi cấy (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). 13 Môi trƣờng rỉ đƣờng hoặc dung dịch đƣờng đƣợc acid hóa với pH = 4, bổ sung thành phần dinh dƣỡng và duy trì nhiệt độ 25 – 300C, lƣợng sinh khối thu đƣợc khoảng 25 – 50 g/l (Trần Minh Tâm, 2002, trích từ Nguyễn Thị Hồng Phƣơng, 2006). Theo phòng vi sinh thuộc Viện Công Nghiệp Thực Phẩm, từ 1 m3 nƣớc bã rƣợu nuôi nấm men có thể thu đƣợc 10 – 15 kg men khô. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu cũng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men do trong đậu chứa hàm lƣợng protein cao, là nguồn thức ăn tốt cho nấm men. Ngoài ra, còn có các vitamin A1, B1, B2, C, E, K và các chất kích thích tố tăng trƣởng khác. Tuy nhiên, vitamin C trong nƣớc chiết giá đậu có thể làm hạn chế sự phát triển của nấm men. Ngoài ra, môi trƣờng thủy phân từ cellulose thực vật (gỗ, vỏ bào, rơm rạ, lõi ngô, bã mía…), hay parafin từ dầu mỏ cũng có thể sử dụng để nuôi cấy nấm men. Đặc biệt, nấm men có khả năng sử dụng đƣợc môi trƣờng dịch kiềm sulfit (chất thải của nhà máy giấy), thành phần chủ yếu là đƣờng pentose. Ngƣời ta tính đƣợc rằng, khoảng 5 tấn bột cellulose dùng sản xuất giấy sẽ thải một lƣợng dịch kiềm sulfit chứa khoảng 180 kg đƣờng. Dịch này hấp thụ nhiều oxy nên khi nuôi cấy nấm men có thể giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với bình thƣờng (Lƣơng Đức Phẩm, 2006). Hiện nay, môi trƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy nấm men phổ biến nhất vẫn là môi trƣờng rỉ đƣờng. 90% lƣợng sinh khối nấm men dùng bổ sung vào thức ăn chăn nuôi trên thế giới đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng mía và củ cải đƣờng. Thành phần chính của loại nguyên liệu này là saccharose, khoảng 35 – 40%. Trong đƣờng mía chứa các chất sinh trƣởng (biotin, acid pantotenic, inozit) với hàm lƣợng lớn, nhƣng lại nghèo chất khoáng và các acid amin. Vì vậy, khi sử dụng đƣờng mía làm nguồn carbon nuôi cấy nấm men cần phải loại bỏ một phần các chất sinh trƣởng, đồng thời bổ sung các muối khoáng cần thiết và có thể phải thêm hỗn hợp các acid amin dạng protein thủy phân vào giai đoạn nhân giống. Lƣợng đƣờng trong môi trƣờng khoảng 2 – 3%, không nên nhiều hơn hay ít hơn. Nếu lƣợng đƣờng cao sẽ vừa lãng phí và 14 vừa tạo ra những sản phẩm trao đổi chất khác, gây ức chế ngƣợc đến quá trình tạo sinh khối. Nếu lƣợng đƣờng quá nhỏ sẽ không đủ nguồn carbon cần thiết cho sự tạo sinh khối. Một điểm đáng lƣu ý là hệ keo và các chất màu có trong mật rỉ. Hệ keo có trong mật rỉ đƣợc hình thành bởi protein và pectin, nó thƣờng có độ nhớt cao và làm cản trở quá trình trao đổi chất của tế bào, gây ra hiện tƣợng thoái hóa, tế bào sẽ phát triển và sinh sản kém, dẫn đến hiệu suất sinh khối thu đƣợc thấp. Các chất màu có trong rỉ đƣờng nhƣ hợp chất caramen, melanin…sẽ làm sinh khối nấm men có màu sẫm, ảnh hƣởng đến cảm quan. Vì thế, đặc biệt trong sản xuất men bánh mì ngƣời ta phải xử lý rỉ đƣờng trƣớc khi nuôi cấy. 2.7.2. Nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ƣu cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ƣu là 28 – 300C, trên 43 0C và dƣới 280C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn. Ở 300C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 – 380C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 230C, hạn chế đƣợc mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn. 2.7.3. pH của môi trƣờng pH tối ƣu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại. Mức độ hấp thụ chất dinh dƣỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hƣởng bởi pH nên chất lƣợng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trƣờng nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6. 2.7.4. Tốc độ sục khí và khuấy trộn Trong quá trình nuôi cấy, cần giữ cho dịch men liên tục bão hoà oxy hoà tan. Ngừng cung cấp oxy trong 15 giây sẽ gây nên tác động âm trên hoạt động sống của 15 tế bào nấm men. Oxy không khí di chuyển vào tế bào nấm men qua 2 giai đoạn: đầu tiên oxy đƣợc hoà tan vào môi trƣờng nuôi cấy sau đó nấm men mới hấp thụ oxy vào trong tế bào. Về lý thuyết, cần 1,066 kg (0,764 m3) oxy để oxy hóa 1 kg đƣờng, nhƣng thực tế chỉ 1 phần nhỏ oxy bơm vào là đƣợc nấm men sử dụng, phần còn lại bị mất đi do các quá trình tiếp xúc, nhiệt độ, nồng độ, độ nhớt của môi trƣờng (Lao Thị Nga, 1987). Khi nuôi cấy nấm men ở qui mô công nghiệp, kích thƣớc của thiết bị nuôi cấy nấm men là tiền đề cần thiết, ảnh hƣởng gián tiếp lên sự tăng trƣởng của nấm men. 2.8. Cơ sở của việc sử dụng nấm men trong sản xuất và chế biến thức ăn Nấm men có rất nhiều chủng loại khác nhau, đa dạng trong chuyển hóa và tổng hợp các chất hữu cơ, phạm vi phân bố và điều kiện sống nhƣ nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, không khí… rộng nên dễ dàng chọn đƣợc các chủng có khả năng thích hợp với qui trình sản xuất và đáp ứng đƣợc yêu cầu đòi hỏi của thị trƣờng. Có tốc độ phát triển nhanh, để tăng gấp đôi khối lƣợng cơ thể thì nấm men cần 1 – 2 giờ, vi khuẩn từ 20 – 60 phút, tảo từ 2 – 6 giờ, nấm sợi từ 4 – 12 giờ trong khi đó gà con cần 200 giờ, heo con cần 600 giờ, bê, nghé cần 1500 giờ (Nguyễn Lân Dũng, 1992). Có khả năng phát triển trên nhiều nguồn dinh dƣỡng khác nhau cho phép ngƣời ta sử dụng các nguồn dinh dƣỡng sẵn có, rẻ tiền để sản xuất nhằm tăng sản lƣợng và giảm giá thành sản phẩm (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Không nhƣ nấm mốc, hầu hết nấm men không sinh độc tố trong môi trƣờng tự nhiên và môi trƣờng nhân tạo, trừ 1 số loài gây bệnh nhƣ Candida albican (Nguyễn Văn Hƣng, 1990). Ngoài ra, khi lên men nấm men còn tạo mùi thơm đặc trƣng cho rƣợu, bia. 16 Nấm men cũng nhƣ vi sinh vật dễ gây đột biến bằng các tác nhân vật lý, hóa học, do đó có thể dùng kỹ thuật di truyền để biến đổi đặc điểm sinh học của nấm men theo hƣớng có lợi. Giá trị dinh dƣỡng của nấm men rất lớn, đặc biệt là hàm lƣợng protein, acid amin và vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ Với đặc điểm sinh lý của nấm men dễ dàng thiết lập dây chuyền công nghệ cao để khai thác các sản phẩm từ nấm men nhằm phục vụ nhu cầu thực tiễn. Trong 24 giờ 1 con bò nặng 300 kg đƣợc chăm sóc tốt cũng chỉ tăng trung bình khoảng 1,1 – 1,2 kg, trong đó có khoảng 120 g protein. Nếu lấy 300 kg nấm men giống nuôi trong hệ thống lên men trong 24 giờ thì tạo 25.000 – 30.000 kg sinh khối, trong đó có khoảng 11.000 – 13.000 kg protein. Rõ ràng ta thấy sự tích luỹ protein ở nấm men cao hơn nhiều so với ở heo, bò, gà vài nghìn lần và tƣơng tự gấp vài trăm lần ở cây đậu, ngũ cốc (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970). Trong nấm men có 1 số men tiêu hóa (amylase, protease…) và vitamin (đặc biệt là vitamin B) xúc tiến nhanh quá trình trao đổi chất, kích thích sự thèm ăn của gia súc. Nhờ đó, công tác chăn nuôi thu đƣợc lợi nhuận cao. Tuy nhiên, sinh khối tế bào nấm men có nhƣợc điểm là mặc dù hàm lƣợng protein cao khoảng 55 – 60%, nhƣng đồng thời nó cũng chứa lƣợng acid nucleic quá cao (10%), điều này ảnh hƣởng tới sức khoẻ con ngƣời. Do đó, cần có các biện pháp làm giảm lƣợng acid nucleic này. Ngoài ra, màng tế bào nấm men khá vững chắc nên cần có biện pháp thích hợp để phá vỡ màng khi thu protein. 17 Bảng 2.1: Thành phần hóa học của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Bảng 2.2: Thành phần acid amin của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Acid amin Tỷ lệ % Acid amin Tỷ lệ % Cystin 0,54 Tryptophan 0,68 Histidin 1,19 Frolin 1,59 Phenylalanin 2,01 Glycin 2,10 Serin 2,20 Arginin 2,33 Threonin 2,50 Tyrosin 2,77 Lysin 3,11 Valin 3,30 Isoleucin 3,70 Leucin 3,80 Acid asparaginic 3,97 Alanin 5,78 Acid glutamic 6,74 Methionin 0,60 Thành phần Tỷ lệ % Protid 44 – 45% Glucid 25 – 35% Lipid 1,5 – 5% Các chất chiết xuất vô đạm 22 – 40% Các chất khóang 6 – 12% 18 Bảng 2.3: Thành phần khóang của nấm men (“Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn”, 1970) Thành phần Tỷ lệ % Thành phần Tỷ lệ % K2O 28 – 48 Fe2O3 0,1 – 7,3 Na2O 0,06 – 1,9 P2O5 41 – 59 CaO 1 – 5,5 SO3 0,4 – 6 MgO 4 – 8,1 SiO2 1,6 Bảng 2.4: Thành phần vitamin của nấm men (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) Vitamin Hàm lƣợng (mg/kg) D2 (calciferol) 250 B6 (pyridoxyn) 60 B1 (thiamin) 40 B9 (acid folic) 4,2 B2 (riboflavin) 50 H (biotin) 2,0 B5 (nicotinic) 21 – 100 2.9. Những nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi 2.9.1. Ở nƣớc ngoài Đã có nhiều công trình nghiên cứu trƣớc hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của 1 số giống nấm men đƣợc sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào nhƣ Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth G et al, 1962, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rƣợu ở nƣớc ta đƣợc thực hiện vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmette và học trò của ông vào 1948. Các nhà khoa học trên thế giới đang hƣớng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trƣờng xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột nhƣ sắn và các phụ phẩm nông nghiệp nhƣ bã dừa, vỏ chuối, bã mía…(Schoch JJ, 1982, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trƣớc đây, ngƣời ta đã sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố 19 mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và 1 số vi khuẩn lên men truyền thống nhƣ vi khuẩn lactic (Rose A.H, 1981, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Chế phẩm ezyme vi sinh vật ngày nay đƣợc sản xuất ở qui mô công nghiệp. các chế phẩm này ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi, trong chăn nuôi ezyme đƣợc dùng để sơ chế thức ăn, phân hủy các hợp chất phức tạp, làm tăng khả năng tiêu hóa cho gia súc. Gần đây, hãng dƣợc Biocodex-Montronge (Pháp) cho ra sản phẩm men tiêu hóa có tên Bioflor 250 có chứa 250mg tế bào nấm men S. boulardii dùng để phòng trị tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa. 2.9.2. Ở trong nƣớc Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nƣớc ta có thể nói đƣợc bắt đầu từ 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh vực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đƣờng và sản xuất chế phẩm sinh học. Năm 1975, Trần Đức Trân và Nguyễn Công Xuân đã sử dụng sinh khối nấm men đƣợc sản xuất từ rỉ đƣờng của nhà máy đƣờng Vạn Điểm để chăn nuôi heo với tỷ lệ bổ sung 3 – 4% trong khẩu phần của heo 2 – 5 tháng tuổi đạt kết quả tốt (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đƣờng hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹ Thuật Sinh Học thuộc Trung Tâm Khoa Học và Công Nghệ Quốc Gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase đƣợc tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae làm cho nó có 2 đặc tính đƣờng hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn (Trƣơng Nam Hải, 1994, trích từ Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Hiện nay, các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phẩm sinh học bổ sung vào khẩu phần thức ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trƣng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ích nhƣ 20 Bacillus. spp, Lactobacillus. spp, Saccharomyces. spp, các enzyme amylase, protease… 21 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 3.1.1. Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03 đến tháng 08 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng thực tập vi sinh khoa Chăn Nuôi Thú Y Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Mẫu khảo sát Chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị: tủ sấy, nồi hấp khử trùng autoclave, tủ lạnh, kính hiển vi, buồng đếm hồng cầu, máy li tâm, máy sục khí, micropipette… Dụng cụ: ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, đũa khuấy, bình tam giác, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm, lame, lamelle, giấy đo pH… 3.2.3. Hóa chất Hóa chất dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm men nhƣ cồn 960, nƣớc cất, agar, KH2PO4, MgSO4, K2HPO4, (NH4)2PO4. 3.2.4. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng phân lập và giữ giống nấm men là môi trƣờng Sabouraud. 22 Môi trƣờng khảo sát nuôi cấy là môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng mía, môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu. 3.3. Nội dung nghiên cứu Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học, men bánh mì, đu đủ, nho. Khảo sát sự phát triển của các chủng đƣợc phân lập từ 4 mẫu trên trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Khảo sát sự phát triển của nấm men trong các loại môi trƣờng nuôi cấy khác nhau. Khảo sát thời gian thu nhận sinh khối nấm men trong các loại môi trƣờng trên. Khảo sát sự phối hợp nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae và vi khuẩn Bacillus subtilis trên môi trƣờng cám gạo và môi trƣờng rỉ đƣờng mía. 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Phân lập nấm men 3.4.1.1. Mẫu chế phẩm sinh học và men bánh mì Pha mẫu với 1 ít nƣớc muối sinh lý 90/00 rồi đem cấy ria trên mặt thạch Sabouraud. Để ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, đƣờng kính khoảng 2 – 3 mm, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 3.4.1.2. Mẫu đu đủ và nho Chọn những chỗ bị dập, hơi có mùi rƣợu rồi cấy ria trên mặt thạch Sabourand. Để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ. Chọn những khuẩn lạc nghi ngờ có màu trắng đục, nhẵn bóng, bề mặt hơi lồi, rìa tròn, mọc rời đem nhuộm đơn để xem hình thái. 23 Sau khi xác định đƣợc đó là chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces thì đem cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng Sabouraud để tăng sinh. 3.4.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B 3.4.2.1. Mục đích Từ các chủng của 4 nguồn mẫu trên, chọn chủng có khả năng sinh trƣởng và phát triển mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.4.2.2. Thông số cố định Môi trƣờng nuôi cấy: môi trƣờng mật rỉ đƣờng mía 60B. Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 100ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 36 giờ. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.2.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. 3.4.2.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí 1 yếu tố, lặp lại 2 lần với 4 nghiệm thức. Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 Lần 2 24 3.4.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces Từ kết quả thí nghiệm 1, chúng tôi chọn 2 chủng có khả năng sinh trƣởng tốt nhất làm đối tƣợng nghiên cứu cho thí nghiệm 2. 3.4.3.1. Mục đích Tìm ra môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch thích hợp cho số lƣợng tế bào nấm men lớn nhất. 3.4.3.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 300ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.3.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu, đơn vị tính tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud, đơn vị tính là cfu/g. Phƣơng pháp đếm tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chỉ cho biết tổng số tế bào trong dịch nuôi cấy (bao gồm cả số tế bào sống và tế bào chết). Với mục đích nuôi cấy nấm men dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm phải cao. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa cho phép xác định số lƣợng tế bào nấm men sống trong chế phẩm, từ đó ta có thể đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm. 25 3.4.3.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch, lặp lại 3 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: T1:200 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. T2: 200 ml môi trƣờng cám gạo + 100 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố thời gian thu hoạch có 3 mức độ: 36 giờ, 48 giờ và 60 giờ. 3.4.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên thời gian sống của nấm men trong chế phẩm Sau khi tiến hành xong thí nghiệm 2,chúng tôi thu hoạch sinh khối tế bào nấm men và sản xuất thành chế phẩm. Thử nghiệm trộn sinh khối nấm men với chất nền là cám gạo và bột mì, trong đó chia thành 3 phần: Phần 1: không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung 50/000 vitamin C. Phần 3: bổ sung 10/00 vitamin C. Sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng, tiến hành đếm số lƣợng tế bào nấm men còn sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. 3.4.4.1. Mục đích Xác định đƣợc thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản thích hợp để nấm men có khả năng sống lâu nhất trong chế phẩm. 3.4.4.2. Thông số cố định Thời gian bảo quản: 22 ngày. Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ phòng. Số lƣợng tế bào nấm men ở mỗi mẫu: 109 tb/g. 26 3.4.4.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, đơn vị tính là cfu/g. 3.4.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm Các mẫu lấy từ thí nghiệm 3 và chỉ tiêu theo dõi cũng là số lƣợng tế bào sống trong 1 g chế phẩm (đơn vị tính là cfu/g), nhƣng lúc này không xét đến ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C). 3.4.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung S. cerevisiae từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng Sabouraud lỏng trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng, B. subtilis từ ống giống đƣợc tăng sinh trên môi trƣờng TSB (Tryptone Soya Broth) trong 24 giờ ở 370C rồi cấy vào các bình nuôi cấy theo tỷ lệ sau: Bình 1: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0B). Bình 2: 1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+1B). Bình 3: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,1 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,1B). Bình 4: 1 ml dịch S. cerevisiae + 0,01 ml dịch B. subtilis (ký hiệu 1S+0,01B). 3.4.6.1. Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của B. subtilis lên sự phát triển của S. cerevisiae. 3.4.6.2. Thông số cố định Thể tích môi trƣờng nuôi cấy: 200 ml. Nhiệt độ nuôi cấy: nhiệt độ phòng. Thời gian nuôi cấy: 48 giờ. 27 Số lƣợng mẫu ban đầu. Có sục khí. 3.4.6.3. Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu. Đơn vị tính: tb/ml. Số lƣợng tế bào nấm men sống trong 1 g chế phẩm sau 22 ngày bảo quản ở nhiệt độ phòng bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch Sabouraud. Đơn vị tính: cfu/g. 3.4.6.4. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố, lặp lại 2 lần. Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy có 2 mức độ: Môi trƣờng rỉ đƣờng: 150 ml môi trƣờng rỉ đƣờng 60B + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Môi trƣờng cám gạo: 150 ml môi trƣờng cám gạo + 50 ml nƣớc chiết giá đậu. Yếu tố nồng độ B. subtilis có 4 mức độ: 0, 100, 10-1, 10-2. 3.4.7. Phƣơng pháp đếm số tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu Lấy 1ml dịch nấm men nuôi cấy pha loãng với 9ml nƣớc muối sinh lý 90/00, ta đƣợc nồng độ 10-1, rồi pha tiếp đến 10-2, 10-3… chọn nồng độ thích hợp cho việc đếm đƣợc dễ dàng và có độ chính xác cao. Sau đó nhỏ lên buồng đếm hồng cầu và đếm dƣới kính hiển vi ở vật kính 40X. Kết quả đƣợc tính theo công thức: Số tế bào nấm men/1 ml = a*4000*1000*H Trong đó: A: số tế bào trong 1 ô nhỏ H: hệ số pha loãng = 1/độ pha loãng 4000 = hệ số chuyển thành 1 mm3 = 1/thể tích ô nhỏ = 1/4000 mm 1000 = hệ số chuyển mm3 thành ml (1 ml = 1000 m3) 28 3.4.8. Phƣơng pháp đếm số tế bào sống ( số khuẩn lạc trên đĩa thạch) Tế bào vi sinh vật sống là tế bào có khả năng sinh trƣởng để tạo thành một quần thể. Trên bề mặt môi trƣờng đặc, quần thể này tạo những đám có hình dạng, màu sắc riêng biệt đƣợc gọi là khuẩn lạc. Từ số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch suy ra số tế bào sống có trong mẫu đã cấy trên mặt thạch. Ở đây đơn vị tính là cfu/ml, nghĩa là số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 ml đơn vị thể tích. Cách tiến hành Pha loãng mẫu: lấy 1 g chế phẩm pha loãng với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1, tiếp tục hút 1 ml dịch thể trên pha với 9 ml nƣớc muối sinh lý 90/00 ta đƣợc nồng độ pha loãng 10 -2 và làm nhƣ thế khi có đƣợc nồng độ pha loãng thích hợp. Để tách rời các tế bào, cần pha loãng mẫu kèm theo lắc mạnh dịch đã pha loãng. Cấy trải dịch pha loãng trên đĩa thạch Sabouraud: ta sẽ cấy mỗi mẫu ở 3 nồng độ pha loãng và ứng với mỗi độ pha loãng chuẩn bị 2 đĩa thạch. Sau khi lắc lại dịch pha loãng, dùng pipette vô trùng hút 0,1ml dịch mẫu nhỏ lên giữa đĩa thạch. Dùng que cấy trang vô trùng gạt giọt dịch trải đều khắp cho tới khi mặt thạch khô ráo. Sau đó đem để ở nhiệt độ phòng trong 24 – 48 giờ và đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa. Chú ý cần phân biệt các khuẩn lạc lạ hình thành do tạp nhiễm và không tính chúng. Tính kết quả cfu/ml(g) = a*1/K*1/V A: số khuẩn lạc trung bình xuất hiện trên các đĩa cấy có cùng độ pha loãng. V: thể tích dịch pha loãng đƣợc cấy trên mặt đĩa thạch. K: độ pha loãng của dịch cấy. Lƣu ý: xem xét số khuẩn lạc ở 3 nồng độ pha loãng kế tiếp nhau(ví dụ 10-5, 10 -6 , 10 -7). Khi nồng độ pha loãng giảm 10 lần, số khuẩn lạc trên đĩa cũng giảm xấp xỉ 10 lần và trên 2 đĩa có cùng nồng độ pha loãng chỉ chênh lệch nhau khoảng 10%. 29 điều đó chứng tỏ việc tách rời các tế bào, pha loãng cũng nhƣ dàn đều chúng trên mặt thạch diễn ra hoàn hảo và số liệu thu đƣợc là đáng tin cậy. 30 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự sinh trƣởng của các chủng đã phân lập trong môi trƣờng rỉ đƣờng 6 0 B Chúng tôi đem 4 chủng nấm men phân lập đƣợc từ 4 nguồn mẫu khác nhau nuôi trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B với thời gian nuôi cấy là 36 giờ nhằm tìm chủng có khả năng phát triển tốt nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo đƣợc thuận lợi hơn. Số liệu thu đƣợc ban đầu có đơn vị tính là tb/ml (phụ lục Bảng 7.1) sẽ chuyển đổi về giá trị logarit để xử lý thống kê. Bảng 4.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 8,450 8,204 8,459 8,566 Lần 2 8,332 8,061 8,130 8,415 Trung bình 8,391 8,133 8,295 8,491 Qua Bảng 4.1 cho thấy số lƣợng tế bào nấm men thuộc các chủng phân lập giảm dần theo thứ tự sau: Nho: 8,491 Chế phẩm: 8,391 Đu đủ: 8,295 Men bánh mì: 8,133 Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.1). Các loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cũng đồng hóa vật chất nhƣ nhau. Có thể nói, các loài khác nhau (dù là một giống) đồng hóa các nguồn 31 dinh dƣỡng là khác nhau nên tốc độ sinh trƣởng của chúng trên cùng một điều kiện nuôi cấy là khác nhau. Do đó, tuy các chủng phân lập từ 4 nguồn mẫu trên đều thuộc giống Saccharomyces nhƣng khi nuôi cấy trong cùng điều kiện môi trƣờng rỉ đƣờng 60B thì số lƣợng tế bào của chúng khác nhau là hợp lý. Dựa theo số liệu ở Bảng 4.1, chúng tôi chọn 2 chủng đƣợc phân lập từ nho và chế phẩm làm đối tƣợng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Sau khi nhuộm xem hình thái và thử nghiệm các phản ứng lên men đƣờng, chúng tôi xác định đƣợc chủng nấm men phân lập từ dịch quả nho thuộc loài S. cerevisiae, chủng phân lập từ chế phẩm sinh học (tên thƣơng mại là Ultra Levure) thuộc loài S. boulardii. Hình 4.1: Phân lập nấm men từ chế phẩm sinh học Ultra Levure Hình 4.2: Phân lập nấm men từ dịch quả nho 32 Hình 4.3: Hình thái S. boulardii Hình 4.4: Hình thái S. cerevisiae 33 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces Sau khi khảo sát nuôi cấy 2 loài S. boulardii và S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B, môi trƣờng cám gạo ở 3 mức độ thời gian 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, chúng tôi thu nhận số liệu về số lƣợng tế bào nấm men trong mỗi nghiệm thức (phụ lục Bảng 7.2, 7.3, 7.4 và 7.5). Tiếp theo, chúng tôi xử lý thống kê trên số liệu logarit đƣợc chuyển đổi từ dạng số liệu nguyên ban đầu (đơn vị tính là tb/ml, cfu/g). 4.2.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.2a: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit). Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,427 8,505 8,394 8,453 8,536 8,385 Lần 2 8,443 8,491 8,533 8,362 8,398 8,293 Lần 3 8,282 8,411 8,445 8,394 8,447 8,470 Bảng 4.2b: giá trị trung bình của bảng 4.2a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,384 8,469 8,457 8,437 Cám gạo 8,403 8,460 8,383 8,415 Chung 8,394 8,465 8,420 Qua Bảng 4.2 cho thấy tổng số tế bào S. boulardii trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. boulardii trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,437>8,415). Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii ở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 giờ và 36 giờ (8,465>8,420>8,394). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan cả hai yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào nấm men không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.2). 34 Bảng 4.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 7,537 8,546 8,834 8,175 9,041 8,537 Lần 2 8,361 8,189 8,474 9,442 8,525 8,516 Lần 3 8,975 8,406 8,569 9,389 8,331 9,316 Bảng 4.3b: giá trị trung bình của bảng 4.3a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,291 8,380 8,626 8,432 Cám gạo 9,002 8,632 8,790 8,808 Chung 8,647 8,506 8,708 Qua Bảng 4.3b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trên môi trƣờng cám gạo cao hơn môi trƣờng rỉ đƣờng (8,808>8,432). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii sống ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,708>8,647>8,506). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan giữa yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.3). Với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa, chúng tôi không tiến hành đếm liền ngay khi thu hoạch mà chế phẩm đƣợc bảo quản sau 22 ngày mới đếm. Qua Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm khi nuôi cấy trên môi trƣờng cám gạo cao hơn trên môi trƣờng rỉ đƣờng. Có khả năng là môi trƣờng cám gạo có thành phần dinh dƣỡng đầy đủ hơn môi trƣờng rỉ đƣờng, đặc biệt có chứa nhiều vitamin B, đáp ứng đƣợc nhu cầu hoạt động sinh lý của tế bào nấm men và làm tăng sức sống của chúng trong chế phẩm. Chúng tôi nghiên cứu nuôi cấy nấm men với mục đích dùng làm chế phẩm sinh học nên yêu cầu số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm phải cao. Do đó, có 35 thể kết luận môi trƣờng cám gạo là môi trƣờng thích hợp để nuôi cấy S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng. 4.2.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.4a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,359 8,617 8,486 8,543 8,539 8,606 Lần 2 8,459 8,453 8,486 8,539 8,558 8,468 Lần 3 8,287 8,509 8,517 8,380 8,519 8,350 Bảng 4.4b: giá trị trung bình của bảng 4.4a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 8,368 8,526 8,496 8,463 Cám gạo 8,487 8,539 8,475 8,500 Chung 8,428 8,533 8,486 Qua Bảng 4.4b cho thấy tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae trên môi trƣờng cám gạo cao hơn môi trƣờng rỉ đƣờng (8,5>8,463). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. cerevisiae ở thời điểm 48 giờ cao hơn 60 giờ và 36 giờ (8,533>8,486>8,428). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và thời gian thu hoạch ảnh hƣởng lên tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.4). Từ kết quả số lƣợng tế bào S. cerevisiae thu hoạch vào thời điểm 48 giờ cao hơn thời điểm 60 giờ và 36 giờ ở Bảng 4.4 cho phép ta có thể kết luận thời gian thích hợp nhất để thu hoạch sinh khối tế bào nấm men là 48 giờ sau khi nuôi cấy. 36 Điều này cũng phù hợp với kết quả thí nghiệm của nhiều tác giả trƣớc (Nguyễn Khắc Tuấn, 1996 và Lƣơng Thị Phƣơng Thảo, 2005). Số lƣợng tế bào nấm men tăng giảm theo qui luật, phù hợp với các giai đoạn sinh trƣởng của chúng. Trƣớc thời điểm 36 giờ nuôi cấy, nấm men trong giai đoạn thích nghi với môi trƣờng nên số lƣợng tế bào tăng không đáng kể. Từ 36 – 48 giờ là giai đoạn logarit, thời điểm số lƣợng tế bào nấm men tăng theo cấp số nhân và đạt giá trị cực đại ở khoảng 48 giờ. Trong khoảng thời gian số tế bào phát triển ào ạt, khi đó các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng không phải là vô tận, mà ngƣợc lại ngày một giảm đi, hơn nữa trong môi trƣờng xuất hiện và tích tụ các sản phẩm trao đổi chất không cần thiết đối với tế bào. Do đó, làm mất đi điều kiện thuận lợi cho sinh trƣởng của tế bào, chúng sẽ già cỗi, thoái hóa, cuối cùng xảy ra hiện tƣợng tự phân nên số lƣợng tế bào sẽ giảm. Bảng 4.5a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,686 8,567 9,475 7,808 7,665 8,929 Lần 2 8,737 8,625 8,290 9,006 8,125 8,130 Lần 3 10,012 8,829 9,620 8,581 8,438 8,818 Bảng 4.5b: giá trị trung bình của bảng 4.5a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Rỉ đƣờng 9,145 8,674 9,128 8,982 Cám gạo 8,465 8,076 8,626 8,389 Chung 8,805 8,375 8,877 Qua Bảng 4.5b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,982>8,389). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,877>8,805>8,375). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. 37 Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa yếu tố môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm không có ý nghĩa thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.5). Chủng nấm men S. cerevisiae mà chúng tôi đem khảo sát đƣợc phân lập từ dịch quả nho nên có thể nó thích nghi và sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng tốt hơn trên môi trƣờng cám gạo, môi trƣờng rỉ đƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo. Do đó, chúng tôi có thể kết luận nuôi cấy S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng thích hợp hơn môi trƣờng cám gạo. 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm Việc thu hoạch và bảo quản chế phẩm ảnh hƣởng nhiều đến sức sống của nấm men trong chế phẩm. Đến thời điểm thu hoạch sinh khối tế bào nấm men, chúng tôi tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy để lấy sinh khối và đem trộn sinh khối với 2 loại chất nền là cám gạo và bột mì. Chất nền đƣợc xử lý trƣớc bằng việc sấy khô ở 110 0C/45 phút, sau đó chia làm 3 phần: Phần 1: để nguyên, không bổ sung vitamin C. Phần 2: bổ sung vitamin C với hàm lƣợng là 50/000. Phần 3: bổ sung vitamin C với hàm lƣợng là 10/00. Sau khi trộn sinh khối nấm men với chất nền, chúng tôi làm khô chế phẩm bằng cách sấy ở 380C/10 giờ. Đóng gói và để ở nhiệt độ phòng trong 22 ngày rồi tiến hành kiểm tra số lƣợng tế bào nấm men sống theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa. Số liệu thu đƣợc ban đầu tính bằng đơn vị cfu/g (phụ lục Bảng 7.6, 7.7) sẽ đƣợc qui về giá trị logarit để xử lý thống kê. 38 4.3.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Chất nền Cám Mì Hàm lƣợng vitamin 0 50/000 1 0 /00 0 5 0 /000 1 0 /00 Lần 1 8,081 8,212 8,311 8,885 8,338 8,716 Lần 2 8,503 8,388 8,420 9,022 8,339 8,853 Lần 3 8,535 8,610 8,350 9,245 9,141 9,812 Bảng 4.6b: giá trị trung bình của bảng 4.6a 0 5 0 /000 1 0 /00 Chung Cám gạo 8,373 8,403 8,360 8,379 Bột mì 9,051 8,606 9,127 8,928 Chung 8,712 8,505 8,744 Qua Bảng 4.6b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về chất nền, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong bột mì nhiều hơn trong cám (8,928>8,379). Về hàm lƣợng vitamin C, số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chất nền bổ sung vitamin C với hàm lƣợng 10/00 nhiều hơn so với hàm lƣợng 50/000 và không bổ sung vitamin C (8,744>8,712>8,505). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.6). 4.3.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Chất nền Cám Mì Hàm lƣợng vitamin 0 50/000 1 0 /00 0 5 0 /000 1 0 /00 Lần 1 8,269 8,684 8,359 9,150 8,423 8,558 Lần 2 8,352 9,999 9,019 8,771 8,635 8,370 Lần 3 9,572 8,919 9,325 9,242 9,719 10,155 Bảng 4.7b: giá trị trung bình của bảng 4.7a 0 5 0 /000 1 0 /00 Chung Cám gạo 8,731 9,201 8,901 8,944 Bột mì 9,054 8,926 9,028 9,003 Chung 8,893 9,064 8,965 39 Qua Bảng 4.7b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về chất nền, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong bột mì nhiều hơn trong cám (9,003>8,944). Về hàm lƣợng vitamin C, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chất nền có bổ sung vitamin C với hàm lƣợng 50/000 nhiều hơn so với hàm lƣợng 10/00 và không bổ sung vitamin C (9,064>8,965>8,893). Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.7). Về cơ sở lý thuyết, việc bổ sung vitamin C vào chất nền có ảnh hƣởng lên sức sống của tế bào nấm men trong chế phẩm hay không thì vẫn chƣa đƣợc nghiên cứu rõ. Có khả năng do thời gian khảo sát chƣa đủ lâu (sau 22 ngày bảo quản) nên kết quả trên cũng chƣa phản ánh rõ bản chất vấn đề. 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 4.4.1. Saccharomyces boulardii Bảng 4.8b: giá trị trung bình của bảng 4.8a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Đƣờng-cám 8,264 8,096 8,341 8,234 Cám-cám 8,407 8,341 8,500 8,416 Đƣờng-mì 7,897 8,206 8,761 8,288 Cám-mì 9,345 8,653 9,020 9,006 Chung 8,478 8,324 8,656 Qua Bảng 4.8b cho thấy số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy và chất nền, số lƣợng tế bào S. boulardii sống giảm dần theo thứ tự sau: Môi trƣờng cám gạo và chất nền bột mì: 9,006 Môi trƣờng cám gạo và chất nền cám gạo: 8,416 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền bột mì: 8,288 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền cám gạo: 8,234 Xét về thời gian thu hoạch, số lƣợng tế bào S. boulardii sống thu hoạch ở thời điểm 60 giờ cao hơn 36 giờ và 48 giờ (8,656>8,478>8,324). 40 Xét về mặt thống kê, sự khác biệt của 2 yếu tố môi trƣờng nuôi cấy - chất nền và thời gian thu hoạch đều có ý nghĩa với P<0,05. Nhìn chung, mối tƣơng quan giữa 2 yếu tố này lên số lƣợng tế bào S. boulardii sống trong chế phẩm thì sự khác biệt là có ý nghĩa về mặt thống kê với P<0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.8). Về môi trƣờng nuôi cấy, thí nghiệm này cho kết quả phù hợp với thí nghiệm 2, môi trƣờng cám gạo thích hợp để nuôi cấy S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng. Về thời gian thu hoạch, qua Bảng 4.8 chúng tôi có thể kết luận thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả là số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. 41 Bảng 4.8: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) MT – CN Đƣờng – Cám Cám – Cám Đƣờng – Mì Cám – Mì Thời gian 36 Giờ 48 Giờ 60 Giờ 36 Giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 7,619 7,403 8,209 8,302 7,834 8,681 6,380 8,380 8,887 8,491 8,920 8,932 Lần 2 8,412 8,397 8,328 8,505 8,567 8,381 8,380 7,674 8,048 9,445 8,508 8,660 Lần 3 8,762 8,488 8,485 8,414 8,623 8,437 8,930 8,564 9,349 10,098 8,532 9,468 Trung bình 8,264 8,096 8,341 8,407 8,341 8,500 7,897 8,206 8,761 9,345 8,653 9,020 Bảng 4.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) MT – CN Đƣờng – Cám Cám – Cám Đƣờng – Mì Cám – Mì Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 8,902 8,097 8,868 7,732 7,487 7,689 8,606 8,628 9,302 7,626 8,242 9,014 Lần 2 9,538 8,720 8,470 10,255 7,993 7,989 8,903 8,508 8,447 8,850 7,486 8,569 Lần 3 10,014 8,909 9,120 8,605 8,393 8,408 10,340 9,729 9,929 9,785 8,428 9,362 Trung bình 9,485 8,575 8,819 8,864 7,958 8,029 9,283 8,955 9,226 8,754 8,052 8,982 42 4.4.2. Saccharomyces cerevisiae Bảng 4.9b: giá trị trung bình của bảng 4.9a 36 giờ 48 giờ 60 giờ Chung Đƣờng-cám 9,485 8,575 8,819 8,960 Cám-cám 8,864 7,958 8,029 8,284 Đƣờng-mì 9,283 8,955 9,226 9,155 Cám-mì 8,754 8,052 8,982 8,596 Chung 9,097 8,385 8,764 Qua Bảng 4.9b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy và chất nền, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống giảm dần theo thứ tự sau: Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền bột mì: 9,155 Môi trƣờng rỉ đƣờng và chất nền cám gạo: 8,960 Môi trƣờng cám gạo và chất nền bột mì: 8,596 Môi trƣờng cám gạo và chất nền cám gạo: 8,284 Xét về thời gian, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống thu hoạch ở thời điểm 36 giờ cao hơn 60 giờ và 48 giờ (9,097>8,764>8,385). Xét về mặt thống kê, sự khác biệt của từng yếu tố môi trƣờng nuôi cấy - chất nền và thời gian thu hoạch lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae đều có ý nghĩa với P<0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian lên sức sống của tế bào nấm men không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.9). Ở thí nghiệm 2, theo phƣơng pháp đếm số tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chúng tôi nhận đƣợc kết quả vào thời điểm 48 giờ sau khi nuôi cấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae cao hơn 60 giờ và 36 giờ. Nhƣng ở thí nghiệm này, chúng tôi kiểm tra số lƣợng tế bào sống trong chế phẩm (sau 22 ngày bảo quản) theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae thu hoạch vào thời điểm 36 giờ sau khi nuôi cấy nhiều hơn 60 giờ và 48 giờ. 43 Nhƣ chúng tôi đã nói yêu cầu đặt ra khi nuôi cấy nấm men làm chế phẩm sinh học là số tế bào sống trong chế phẩm phải cao nên chúng tôi có thể kết luận thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Về môi trƣờng nuôi cấy, kết quả thí nghiệm này phù hợp với thí nghiệm 2, môi trƣờng rỉ đƣờng thích hợp nuôi cấy S. cerevisiae hơn môi trƣờng cám gạo. 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung Theo thông tin chúng tôi đƣợc biết, khi sản xuất chế phẩm sinh học ngƣời ta thƣờng nuôi cấy riêng từng loại vi sinh vật, sau đó mới phối trộn để cho ra thành phẩm. Việc đó mất khá nhiều công sức, thời gian, chi phí cũng cao nên chúng tôi quyết định khảo sát việc nuôi cấy chung vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Thí nghiệm bố trí gồm 2 yếu tố (môi trƣờng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn B. subtilis), thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Số liệu ban đầu thu đƣợc tính theo đơn vị tb/ml, cfu/g (phụ lục Bảng 7.8 và 7.9) sẽ chuyển đổi theo giá trị logarit để xử lý thống kê. Bảng 4.10a: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,583 8,439 8,599 8,667 8,435 8,011 8,342 8,470 Lần 2 8,466 8,550 8,376 8,322 8,357 8,366 8,477 8,455 Bảng 4.10b: giá trị trung bình của bảng 4.10a 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Chung Rỉ đƣờng 8,525 8,495 8,488 8,495 8,493 Cám gạo 8,396 8,189 8,410 8,463 8,354 Chung 8,461 8,342 8,449 8,479 Qua Bảng 4.10b cho thấy tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng nuôi cấy, số lƣợng tế bào S. cerevisiae 44 trong môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (8,493>8,354). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về nồng độ vi khuẩn B. subtilis, số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy có bổ sung B. subtilis giảm dần theo thứ tự sau: Nồng độ 10-2 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,479. Nồng độ 10-1 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,449. Nồng độ 100 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,342. Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và nồng độ B. subtilis lên tổng số tế bào S. cerevisiae trong dịch nuôi cấy không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.10). Bảng 4.11: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (qui về giá trị logarit) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,942 9,705 9,027 9,108 8,081 8,883 8,685 8,723 Lần 2 9,224 9,820 9,151 8,932 8,633 9,219 8,552 8,874 Bảng 4.11b: giá trị trung bình của bảng 4.11a 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Chung Rỉ đƣờng 9,083 9,763 9,089 9,020 9,291 Cám gạo 8,357 9,051 8,619 8,799 8,823 Chung 8,720 9,407 8,854 8,910 Qua Bảng 4.11b cho thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm ở các nghiệm thức đều cao. Xét về môi trƣờng, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo (9,291>8,823). Sự khác biệt này có ý nghĩa về thống kê với P<0,05. Về nồng độ vi khuẩn B. subtilis, số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm có bổ sung B. subtilis giảm dần theo thứ tự sau: Nồng độ 100 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 9,407 Nồng độ 10-2 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,910 Nồng độ 10-1 dịch B.subtilis nuôi ở 370C/24 giờ: 8,854 45 Thế nhƣng, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05. Nhìn chung, sự khác biệt về mối tƣơng quan giữa môi trƣờng và nồng độ B. subtilis lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae sống trong chế phẩm không có ý nghĩa về mặt thống kê với P>0,05 (phụ lục Bảng ANOVA 7.11). Yếu tố môi trƣờng nuôi cấy ảnh hƣởng lên số lƣợng tế bào S. cerevisiae đã đƣợc giải thích ở thí nghiệm 2 và trong thí nghiệm này cũng cho kết quả tƣơng tự. Cụ thể là số lƣợng tế bào S. cerevisiae trên môi trƣờng rỉ đƣờng cao hơn môi trƣờng cám gạo. Ở Bảng 4.10, sự chênh lệch số lƣợng tế bào S. cerevisiae giữa 2 trƣờng hợp 1S+0B (1ml dịch S. cerevisiae + 0 ml dịch B. subtilis) và 1S+1B (1 ml dịch S. cerevisiae + 1 ml dịch B. subtilis) trong môi trƣờng rỉ đƣờng là 0,18%, trong môi trƣờng cám gạo là 1,25%. Có thể nói, trong môi trƣờng rỉ đƣờng sự có mặt của B. subtilis ảnh hƣởng không đáng kể đến số lƣợng S. cerevisiae. Ngƣợc lại, trong môi trƣờng cám gạo (môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy sinh khối B. subtilis) sự có mặt của B. subtilis ảnh hƣởng đáng kể đến số lƣợng S. cerevisiae. Chúng tôi có thể kết luận khi nuôi cấy chung B. subtilis và S. cerevisiae với tỉ lệ 1:1 trong môi trƣờng cám gạo thì số lƣợng tế bào S. cerevisiae giảm đáng kể. Một điểm đáng lƣu ý khác, tuy về mặt thống kê học thì khi nuôi cấy chung nồng độ của B. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào S. cerevisiae nhƣng theo chúng tôi nhận thấy thì vẫn có sự ảnh hƣởng về mặt sinh học. Dựa vào một số lý do sau: Khi thu hoạch tế bào S. cerevisiae, bằng phƣơng pháp đếm số tế bào trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu chúng tôi thu đƣợc kết quả số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy riêng cao hơn khi nuôi cấy chung với B. subtilis (8,461>8,423) (Bảng 4.10). Sau 22 ngày bảo quản chế phẩm, chúng tôi kiểm tra số tế bào sống trong chế phẩm bằng phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa thì nhận thấy số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy chung với B. subtilis cao hơn khi nuôi cấy riêng (9,057>8,720), (Bảng 4.11). 46 Ta nhận thấy ban đầu số lƣợng tế bào S. cerevisiae nuôi cấy riêng cao hơn khi nuôi cấy chung với B. subtilis (8,461>8,423), nhƣng sau 22 ngày bảo quản số lƣợng tế bào S. cerevisiae khi nuôi cấy riêng chết nhiều hơn khi nuôi cấy chung (8,720<9,057). Nghĩa là, khi nuôi cấy chung B. subtilis có ảnh hƣởng đến S. cerevisiae theo hƣớng có lợi làm tăng sức sống của S. cerevisiae trong chế phẩm. 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Chúng tôi phân lập đƣợc từ dịch quả nho chủng nấm men thuộc loài S. cerevisiae và từ chế phẩm sinh học chủng nấm men thuộc loài S. boulardii. Cả 2 chủng đều có khả năng sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B và môi trƣờng cám gạo. Môi trƣờng cám gạo thích hợp cho sự sinh trƣởng của loài S. boulardii hơn môi trƣờng rỉ đƣờng 60B. Ngƣợc lại, loài S. cerevisiae sinh trƣởng trên môi trƣờng rỉ đƣờng 60B mạnh hơn trên môi trƣờng cám gạo. Thời điểm thu hoạch sinh khối tế bào nấm men thích hợp nhất là sau 48 giờ nuôi cấy. Vitamin C và chất nền (cám gạo, bột mì) không ảnh hƣởng đến sức sống của nấm men trong chế phẩm (sau 22 ngày bảo quản). Thu hoạch S. boulardii vào thời điểm 60 giờ sau khi nuôi cấy sẽ cho kết quả số lƣợng tế bào còn sống trong chế phẩm nhiều hơn ở 36 giờ và 48 giờ. Còn thời điểm thu hoạch S. cerevisiae thích hợp nhất là 36 giờ sau khi nuôi cấy. Trong nuôi cấy chung, nồng độ vi khuẩn B. subtilis không ảnh hƣởng đến số lƣợng tế bào nấm men S. cerevisiae. 5.2. Đề nghị Tiến hành thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của vitamin C lên sức sống tế bào nấm men trong chế phẩm với thời gian bảo quản dài hơn 22 ngày. Đếm đồng thời số lƣợng tế bào B. subtilis và S. cerevisiae trong thí nghiệm nuôi cấy chung 2 loài. 48 Khảo sát nuôi cấy chung vi khuẩn lactic thuộc loài Lactobacillus acidophilus với nấm men Saccharomyces cerevisiae trong môi trƣờng rỉ đƣờng. 49 Chƣơng 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ban Nông – Lâm Nghiệp, Uỷ ban Khoa Học - Kỹ Thuật Nhà Nƣớc, 1970. Nấm men dùng trong chăn nuôi lợn. Nhà xuất bản Khoa Học - Kỹ Thuật Hà Nội. 2. Lao Thị Nga, 1987. Kỹ thuật sản xuất nấm men bánh mì và một số loài nấm ăn. Nhà xuất bản TP.HCM. 3. Lâm Thanh Hiền, 1996. Vi sinh vật đại cương. Tủ sách Đại học Nông Lâm TP.HCM. 4. Lƣơng Đức Phẩm, 2006. Nấm men công nghiệp. Nhà xuất bản Khoa Học - Kỹ Thuật. 5. Lƣơng Thị Phƣơng Thảo, 2005. Khảo sát sự phát triển của nấm men Saccharomyces sp. trên hai loại môi trường rỉ đường và nước chiết giá đậu. Khóa luận tốt nghiệp Bác Sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm TP.HCM. 6. Lê Nguyễn Bảo Trân, 2005. Khảo sát nuôi cấy nấm men Saccharomyces dùng làm chế phẩm bổ sung selen. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Mở - Bán Công TP.HCM 7. Lê Thanh Lâm, 1996. Nghiên cứu di truyền học một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế của Saccharomyces spp. Luận án Phó Tiến Sĩ Khoa Học Sinh Học, Đại học Quốc Gia Hà Nội – Khoa Học Tự Nhiên. 8. Nguyễn Đức Lƣợng, 2002. Công nghệ vi sinh tập 2. 9. Nguyễn Khắc Tuấn, 1996. Tuyển chọn một số chủng nấm men từ bánh men rượu cổ truyền để sản xuất một số chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi lợn. Luận án Phó Tiến Sĩ Khoa Học Nông Nghiệp, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. 10. Nguyễn Thị Hồng Phƣơng, 2006. Khảo sát sự phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trường rỉ đường ở các điều kiện khác nhau. Khóa luận tốt nghiệp Bác Sĩ Thú Y, Đại học Nông Lâm TP.HCM. 50 11. Nguyễn Văn Hƣng, 1990. Nghiên cứu đặc điểm di truyền học của một số tính trạng chống chịu và lai tạo các nòi Saccharomyces có ý nghĩa kinh tế. Luận án Phó Tiến Sĩ Sinh Vật Học, Đại học Tổng Hợp Hà Nội. 12. Phạm Thị Thẳm, 2004. Phân lập và định danh một số loài nấm men thuộc giống Saccharomyces trong sản phẩm probiotic. Khóa luận tốt nghiệp Cử nhân Công nghệ sinh học, Đại học Mở - Bán Công TP.HCM. 13. Vũ Thị Minh Đức. Thực tập vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 51 Chƣơng 7 PHỤ LỤC Hình 7.1: Bình nuôi cấy nấm men Hình 7.2: Khuẩn lạc Saccharomyces sp. trên môi trƣờng thạch Sabouraud Hình 7.3: Chế phẩm sinh học chứa nấm men Saccharomyces sp. 52 7.1. Các bảng số liệu thô về số lƣợng tế bào nấm men Bảng 7.1: Số lƣợng tế bào nấm men trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml). Mẫu Chế phẩm Men bánh mì Đu đủ Nho Lần 1 2,816 1,600 2,880 3,680 Lần 2 2,150 1,150 1,350 2,600 Bảng 7.2: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 2,675 3,200 2,475 2,838 3,438 2,425 Lần 2 2,775 3,100 3,413 2,300 2,500 1,963 Lần 3 1,913 2,575 2,788 2,475 2,800 2,950 Bảng 7.3: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 0,344 3,517 6,820 1,496 10,999 3,443 Lần 2 2,297 1,544 2,979 27,68 3,353 3,283 Lần 3 9,447 2,544 3,704 24,463 2,144 20,722 53 Bảng 7.4: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 2,288 4,138 3,063 3,488 3,463 4,038 Lần 2 2,875 2,838 3,063 3,463 3,613 2,938 Lần 3 1,938 3,225 3,288 2,400 3,300 2,238 Bảng 7.5: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g ) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Thời gian 36 giờ 48 giờ 60 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ Lần 1 4,849 3,689 29,857 0,643 0,462 8,497 Lần 2 5,457 4,219 1,949 10,129 1,335 1,350 Lần 3 102,835 6,738 41,710 3,812 2,743 6,576 54 Bảng 7.6: Số lƣợng tế bào S. boulardii trong 1 g chế phẩm (*108 cfu/g) mẫu 36 giờ 48 giờ 60 giờ lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 đường 0 cám 0,665 4,443 4,715 0,209 2,590 2,560 2,050 3,683 2,810 đường 5 cám 0,168 0,701 6,008 0,311 4,323 3,303 0,955 0,642 2,833 đường 1 cám 0,414 2,610 6,603 0,240 0,577 3,368 1,845 2,065 3,520 cám 0 cám 2,680 4,560 2,300 0,647 3,363 2,953 0,975 0,468 5,218 cám 5 cám 2,233 2,430 3,750 0,745 4,080 6,120 5,370 2,473 2,435 cám 1 cám 1,105 2,615 1,725 0,655 3,618 3,530 8,030 4,280 0,552 đường 0 mì 0,022 0,151 14,178 6,825 0,498 2,528 11,590 2,275 4,598 đường 5 mì 0,022 6,868 4,648 0,205 0,322 2,475 4,845 0,437 57,150 đường 1 mì 0,027 0,178 6,695 0,162 0,596 5,998 6,695 0,638 5,280 cám 0 mì 0,311 50,800 46,625 21,350 3,343 1,335 5,910 6,098 36,225 cám 5 mì 1,745 0,542 10,458 3,180 2,978 1,988 3,070 1,948 6,283 cám 1 mì 7,233 32,325 318,775 0,417 3,348 6,885 16,660 5,673 45,650 Bảng 7.7: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm (*108 cfu/g) mẫu 36 giờ 48 giờ 60 giờ lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 lần 1 lần 2 lần 3 đường 0 cám 6,118 3,945 198,500 0,503 5,928 6,353 3,213 0,612 8,745 đường 5 cám 14,810 47,900 12,473 2,040 6,115 7,283 10,528 4,553 21,350 đường 1 cám 3,020 51,725 98,500 1,205 3,695 10,708 8,415 3,685 9,435 cám 0 cám 0,562 0,230 3,918 0,401 2,228 2,580 0,348 0,545 3,863 cám 5 cám 0,580 538,500 4,848 0,228 0,435 2,258 0,815 0,646 1,585 cám 1 cám 0,475 1,545 3,303 0,292 0,287 2,578 0,305 1,735 2,228 đường 0 mì 3,580 6,968 7,170 6,875 2,510 7,123 56,500 3,285 74,675 đường 5 mì 4,373 9,380 9,583 3,255 4,650 1,800 3,085 2,613 125,250 đường 1 mì 4,148 7,628 640 2,613 2,503 151,750 0,489 2,503 55,025 cám 0 mì 0,724 20,028 3,705 0,522 0,441 2,905 16,645 2,155 9,288 cám 5 mì 0,192 0,621 118,225 0,426 0,192 4,398 4,550 8,423 55,025 cám 1 mì 0,353 0,604 6,030 4,290 0,286 0,730 9,783 0,537 4,723 55 Bảng 7.8: Số lƣợng tế bào trong S. cerevisiae trong 1 ml dịch nuôi cấy theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu (*108 tb/ml) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,583 8,439 8,599 8,667 8,435 8,011 8,342 8,470 Lần 2 8,466 8,550 8,376 8,322 8,357 8,366 8,477 8,455 Trung bình 8,525 8,495 8,488 8,495 8,396 8,189 8,410 8,463 Bảng 7.9: Số lƣợng tế bào S. cerevisiae trong 1 g chế phẩm theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa (*108 cfu/g) Môi trƣờng Rỉ đƣờng Cám gạo Mẫu 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B 1S+0B 1S+1B 1S+0,1B 1S+0,01B Lần 1 8,942 9,705 9,027 9,108 8,081 8,883 8,685 8,723 Lần 2 9,224 9,820 9,151 8,932 8,633 9,219 8,552 8,874 Trung bình 9,083 9,763 9,089 9,020 8,357 9,051 8,619 8,799 7.2. Xử lý thống kê 7.2.1. Thí nghiệm 1:Khảo sát sự phát triển của các chủng phân lập đƣợc trong môi trƣờng rỉ đƣờng 60B Bảng ANOVA 7.1 Analysis of Variance for SL Source DF SS MS F P CHUNG 3 0.2745 0.0915 5.34 0.014 Error 12 0.2055 0.0171 Total 15 0.4800 7.2.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy và thời gian thu hoạch đến số lƣợng tế bào nấm men 7.2.2.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.2 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.00845 0.00845 0.00845 0.81 0.371 TG 2 0.05401 0.05401 0.02700 2.59 0.082 MT*TG 2 0.02871 0.02871 0.01436 1.38 0.259 Error 66 0.68721 0.68721 0.01041 Total 71 0.77838 56 Bảng ANOVA 7.3 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 2.2476 2.2476 2.2476 4.57 0.036 TG 2 0.9455 0.9455 0.4727 0.96 0.387 MT*TG 2 2.2789 2.2789 1.1394 2.32 0.106 Error 66 32.4310 32.4310 0.4914 Total 71 37.9029 7.2.2.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.4 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.02202 0.02202 0.02202 2.12 0.150 TG 2 0.13097 0.13097 0.06549 6.30 0.003 MT*TG 2 0.05414 0.05414 0.02707 2.61 0.081 Error 66 0.68556 0.68556 0.01039 Total 71 0.89269 Bảng ANOVA 7.5 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 8.0829 8.0829 8.0829 16.79 0.000 TG 2 2.1961 2.1961 1.0981 2.28 0.110 MT*TG 2 0.1044 0.1044 0.0522 0.11 0.897 Error 66 31.7654 31.7654 0.4813 Total 71 42.1488 7.2.3. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của acid ascorbic (vitamin C) và chất nền lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 7.2.3.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.6 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P CN 1 1.3000 1.3000 1.3000 2.49 0.116 VIT 2 0.5586 0.5586 0.2793 0.54 0.586 CN*VIT 2 0.4381 0.4381 0.2191 0.42 0.657 Error 210 109.4760 109.4760 0.5213 Total 215 111.7727 7.2.3.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.7 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P CN 1 1.4787 1.4787 1.4787 2.30 0.130 VIT 2 0.7640 0.7640 0.3820 0.60 0.552 CN*VIT 2 1.5843 1.5843 0.7921 1.23 0.293 Error 210 134.7244 134.7244 0.6415 Total 215 138.5515 57 7.2.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy, chất nền và thời gian thu hoạch lên sức sống của nấm men trong chế phẩm 7.2.4.1. Số lƣợng tế bào S. boulardii Bảng ANOVA 7.8 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT-CN 3 15.2168 15.2168 5.0723 12.26 0.000 TG 2 4.3018 4.3018 2.1509 5.20 0.006 MT-CN*TG 6 7.8697 7.8697 1.3116 3.17 0.005 Error 204 84.3844 84.3844 0.4136 Total 215 111.7727 7.2.4.2. Số lƣợng tế bào S. cerevisiae Bảng ANOVA 7.9 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT-CN 3 27.5532 27.5532 9.1844 19.64 0.000 TG 2 9.8236 9.8236 4.9118 10.50 0.000 MT-CN*TG 6 5.7882 5.7882 0.9647 2.06 0.059 Error 204 95.3864 95.3864 0.4676 Total 215 138.5515 7.2.5. Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của vi khuẩn Bacillus subtilis lên sự sinh trƣởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae trong điều kiện nuôi cấy chung 7.2.5.1. Theo phƣơng pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu Bảng ANOVA 7.10 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 0.10600 0.10600 0.10600 4.60 0.046 BA 2 0.07939 0.07939 0.03970 1.72 0.207 MT*BA 2 0.09024 0.09024 0.04512 1.96 0.170 Error 18 0.41482 0.41482 0.02305 Total 23 0.69045 7.2.5.2. Theo phƣơng pháp đếm số khuẩn lạc trên đĩa Bảng ANOVA 7.11 Analysis of Variance for SL, using Adjusted SS for Tests Source DF Seq SS Adj SS Adj MS F P MT 1 1.9471 1.9471 1.9471 10.55 0.004 BA 2 0.9100 0.9100 0.4550 2.47 0.113 MT*BA 2 0.4997 0.4997 0.2498 1.35 0.283 Error 18 3.3221 3.3221 0.1846 Total 23 6.6789 58 7.3. Thành phần các loại môi trƣờng 7.3.1. Môi trƣờng Sabouraud Glucose 40 g Pepton 20 g Agar 20 g Nƣớc cất 1000 g Ph = 5,6 7.3.2. Môi trƣờng rỉ đƣờng mía 60B KH2PO4 20 g MgSO4 5 g K2HPO4 20 g (NH4)2SO4 40 g Rỉ đƣờng mía 60B 1000 ml pH = 5 – 6. 7.3.3. Môi trƣờng cám gạo 100 g cám hoà trong 500 ml nƣớc, đun sôi, lọc qua vải màn, pha thêm nƣớc cho đủ 1000 ml, bổ sung thêm 5 g MgSO4, 3g KH2PO4. 7.3.4. Môi trƣờng nƣớc chiết giá đậu Đun sôi hỗn hợp 200 g giá với 1000 ml nƣớc rồi ép lấy nƣớc. Tất cả các loại môi trƣờng đều đƣợc hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210C/10 phút. 7.4. Phƣơng pháp nhuộm đơn Bƣớc 1: làm vết bôi Đặt 1 giọt nƣớc vô trùng lên phiến kính. Dùng que cấy lấy 1 ít nấm men từ khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch, hoà đều vào giọt nƣớc và trải mỏng trên mặt lame. Để khô. 59 Bƣớc 2: cố định mẫu Hơ nhẹ phía dƣới phiến kính qua ngọn lửa đèn cồn 3 – 4 lần hoặc nhỏ vài giọt cồn ngay vết trải và đốt. Mục đích: giết chết tế bào sống, gắn chặt tế bào sống vào phiến kính khi rửa không bị trôi và làm cho tế bào dễ bắt màu. Bƣớc 3: nhuộm màu Nhỏ vài giọt thuốc nhuộm đơn xanh methylen 0,1%. Rửa nƣớc và làm khô. Bƣớc 4: quan sát Quan sát hình thái nấm men bằng kính hiển vi dƣới vật kính dầu 100X.