Khóa luận Khảo sát, phân tích và so sánh chất lượng mùi thơm của một số giống lúa thơm trồng ở đồng bằng sông Cửu Long bằng phương pháp spme - Gc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT, PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THƠM TRỒNG Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME - GC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : PHẠM MAI THÙY TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT, PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THƠM TRỒNG Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME - GC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 - 2007 Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) PHẠM MAI THÙY TRANG TS. FRÉDERÍC GAY (CIRAD) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô khác đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi. - TS. Phan Phƣớc Hiền (NLU), TS. Frédéric Gay (CIRAD) đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Cô Phùng Võ Cẩm Hồng cùng các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm. - Chị Nguyễn Thị Thu Hƣơng cùng toàn thể các bạn trong lớp CNSH29 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 08 năm 2007 Phạm Mai Thùy Trang iv TÓM TẮT PHẠM MAI THÙY TRANG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT, PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA THƠM TRỒNG Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME – GC” Hội đồng hƣớng dẫn: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) TS. FRÉDÉRIC GAY (CIRAD) Hiện nay, các kết quả nghiên cứu về mô tả bản chất của các hợp chất thơm cũng nhƣ so sánh chất lƣợng mùi thơm của các giống lúa thơm ở Việt Nam hiện nay hầu nhƣ không có. Vì vậy, việc nghiên cứu bản chất các hợp chất thơm, sự hình thành các hợp chất thơm, so sánh chất lƣợng mùi thơm của một số giống lúa thơm sẽ hữu ích cho các nhà tạo giống trong việc phát triển các giống lúa thơm mới cũng nhƣ thiết lập nên những đặc điểm đặc trƣng cho các giống lúa thơm, chứng minh đƣợc chất lƣợng cao là công việc rất có ý nghĩa thiết thực. Với những lí do trên, chúng tôi tiến hành khảo sát, phân tích và so sánh chất lƣợng mùi thơm của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20. Đây là những giống đã đƣợc trồng phổ biến ở Đồng bằng sông Cửu Long. Những kết quả đạt đƣợc: Xác định đƣợc hệ số phản hồi của hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline là 7834. Xác định đƣợc hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline xuất hiện ở thời điểm 9,8 phút trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nồng độ 2 – AP có trong lá lúa tăng theo các giai đoạn phát triển của cây lúa và đạt cao nhất khi lúa ở giai đoạn nở hoa, sau đó giảm khi lúa bắt đầu tạo hạt nhƣng vẫn cao hơn so với các giai đoạn tăng trƣởng ban đầu. v Nồng độ 2 – AP có trong hạt lúa tăng theo các giai đoạn hình thành hạt, cao nhất khi hạt lúa ở giai đoạn chín. Giống lúa OM3536 có nồng độ 2 – AP trong lá cao nhất so với 3 giống lúa còn lại, kế đến lần lƣợt theo thứ tự là giống lúa VD20 và Jasmine, ST3 là giống lúa có nồng độ 2 – AP trong lá thấp nhất trong nhóm 4 giống lúa đƣợc phân tích. Jasmine có nồng độ 2 – AP trong hạt cao nhất, OM3536 và ST3 có nồng độ 2 – AP trong hạt xấp xỉ bằng nhau, VD20 có nồng độ 2 – AP trong hạt thấp nhất trong 4 giống lúa thử nghiệm. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp hơn rất nhiều (0,014%) so với trong lá dứa. vi ABSTRACT PHAM MAI THUY TRANG, Nong Lam University, HCMC, August, 2007. “STUDYING, ANALYZING AND COMPARING THE AROMATIC QUALITY OF 4 VARIETIES OF RICE: JASMINE, OM3536, ST3 AND VD20, WHICH ARE CULTURED IN CUU LONG RIVER DELTA, WITH EACH OTHER UTILIZING THE SOLID PHASE MICRO EXTRACTION (SPME) AND GAS CHROMATOGRAPHY (GC) METHODS ” Board of research advisers: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) TS. FRÉDÉRIC GAY (CIRAD) Recently, there are no many studies about the characteristics of aromatic compounds of scented varieties of rice in Viet Nam, as well as compare theirs aromatic quality with each other. So that, studying the characteristics and the generation of aromatic compounds of some aromatic varieties of rice and comparing theirs with each other will be helpful for culturists in developing new aromatic varieties of rice as well as resetting the characteristics and demonstrating the high quality of theirs. For reasons, we studied, analyzed and compared the aromatic quality of 4 varieties of rice: Jasmine, OM3536, ST3 and VD20, which are cultured commonly in Cuu Long River Delta. Results obtained from the study: Identifying the response factor of 2 – acetyl – 1 – pyrroline compound is 7834. Identifying the aromatic compound of 2 – acetyl – 1 – pyrroline appears at 9,8 th minute in laboratory’s condition. vii The concentration of 2 – AP in leaves of rice increase as well as the development of rice and highest in the flowering stage of rice, then descends when grain is generate, but it is higher than the concentration of 2 – AP in the first development stage of rice. The increasing of 2 – AP in grain follows the grain’s generation stages, and is highest when grain is mature. OM3536 variety has the concentration of 2 – AP in leaves highest, comparing with 3 varieties others. ST3 is the variety of rice which has the concentration of 2 – AP in leaves smallest in 4 varieties of rice analyzed. The concentration of 2 – AP in grain is highest in Jasmine, comparing with 3 varieties others. OM3536 and ST3 varieties have 2 – AP concentration in grain is approximately. VD20 variety has 2 – AP concentration in grain is smallest in 4 varieties studied. 2 – AP concentration in leaves of rice is lower many times (0,014%) than 2 – AP concentration in leaves of pandanus. viii MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ....................................................................................................................... iv Mục lục ..................................................................................................................... viii Danh sách các chữ viết tắt ......................................................................................... xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Danh sách các hình .................................................................................................. xiv Danh sách các biểu đồ .............................................................................................. xvi Danh sách các sơ đồ ................................................................................................ xvii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU ............................................................................. 2 1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN ........................................................................................................ 3 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA ............................................................ 3 2.1.1. Hệ thống phân loại cây lúa ...................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm sinh thái – sinh học cây lúa ..................................................... 3 2.1.2.1. Hạt lúa và sự nảy mầm ............................................................... 3 2.1.2.2. Lá lúa .......................................................................................... 5 2.1.2.3. Bông lúa ...................................................................................... 6 2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển cây lúa ............................................. 8 2.1.3.1. Ba thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa .............................. 8 2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của cây lúa ............................................ 8 2.2. LÚA THƠM ĐẶC SẢN VIỆT NAM .............................................................. 9 2.2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC GIỐNG LÚA JASMINE, OM3536, ST3, VD20 ix ........................................................................................................................... 10 2.2.1.1. Giống lúa OM3536......................................................................... 10 2.2.1.2. Giống lúa Jasmine .......................................................................... 11 2.2.1.3. Giống lúa VD20 ............................................................................. 12 2.2.1.4. Giống lúa ST3 ................................................................................ 12 2.2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HÓA SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO ... ........................................................................................................................... 13 2.2.2.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm ................................... 13 2.2.2.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline...................................... 16 2.3. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME) ................... 19 2.4. SẮC KÝ KHÍ .................................................................................................. 20 2.5. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ ................................................................... 21 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 22 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH .................................................... 22 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ........................................................ 22 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ........................................................................... 23 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 23 3.4.1. Phƣơng pháp trồng lúa ........................................................................... 23 3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME .......................................................................................................................... 24 3.4.2.1. Dụng cụ sử dụng cho kĩ thuật SPME ............................................. 24 3.4.2.2. Các bƣớc thực hiện trong kĩ thuật vi chiết xuất trên pha rắn ......... 26 3.4.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline ............................................................................................. 27 3.4.3. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP có trong lá và hạt lúa bằng GC và GC/MS ......................................................................................... 29 3.4.3.1. Sơ đồ thiết bị sắc kí khí .................................................................. 30 3.4.3.2. Detector .......................................................................................... 31 3.4.3.3. Cột mao quản ................................................................................. 32 3.4.4. Xác định hệ số phản hồi của 2 - AP ...................................................... 34 x 3.4.5. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong lá lúa và trong hạt lúa ................................................................................................. 34 3.4.6. Phƣơng pháp xử lý thống kê .................................................................. 34 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 35 4.1. XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHẢN HỒI CỦA 2 - AP ................................................ 35 4.2. ĐỊNH TÍNH HỢP CHẤT 2- ACETYL – 1 – PYRROLINE .......................... 40 4.3. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 – AP CÓ TRONG CÂY LÚA QUA CÁC THỜI KÌ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LÚA Ở 4 GIỐNG LÚA: JASMINE, OM3536, ST3, VD20 .......................................................................... 47 4.3.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lƣợng 2 – AP ở cây lúa qua các thời kì tăng trƣởng ................................................................................................................ 47 4.3.2. So sánh hàm lƣợng 2 – AP qua các thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa ở 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20 .................................................. 50 4.4. SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 – AP CÓ TRONG LÁ LÚA VÀ LÁ DỨA ...... 51 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 54 5.1 KẾT LUẬN ...................................................................................................... 54 5.1.1. Định tính 2 - AP ..................................................................................... 54 5.1.2. Phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá và trong hạt của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ........................................................................ 54 5.2 ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................... 55 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 56 7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 64 Phụ lục 1. Các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm ................................................. 64 Phụ lục 2. Khống chế các yếu tố ảnh hƣởng ............................................................. 65 Phụ lục 3. Sắc ký đồ phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa Jasmine ................................................................................................................................... 68 Phụ lục 4. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa OM3536 .................................................................................................................... 68 Phụ lục 5. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong lá của giống lúa ST3 ................................................................................................................................... 69 xi Phụ lục 6. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP có trong lá của giống lúa VD20 ......................................................................................................................... 69 Phụ lục 7. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP có trong hạt của giống lúa Jasmine ..................................................................................................................... 70 Phụ lục 8. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong hạt của giống lúa OM3536 ................................................................................................................... 70 Phụ lục 9. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất 2 – AP có trong hạt của giống lúa ST3 ................................................................................................................................... 71 Phụ lục 10. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong hạt của giống lúa VD20 ......................................................................................................................... 71 Phụ lục 11. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa .................. 72 Phụ lục 12. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane .................................... 72 Phụ lục 13. Sắc ký đồ GC phân tích pentanol và hexanal ........................................ 73 Phụ lục 14. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn collidine, octanol, nonanal, decanal, hexanol ...................................................................................................................... 73 Phụ lục 15. Sắc ký đồ GC/MS phân tích mẫu gạo Jasmine ...................................... 74 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT SPME (Solid Phase Microextraction): vi chiết xuất trên pha rắn FID (Flame ionization detector): đầu dò ion hóa ngọn lửa. GC (Gas chromatography): sắc ký khí. GC/MS (Gas chromatography/mass spectrum): sắc ký khí ghép khối phổ. Ctv: cộng tác viên CS: cộng sự 2 – AP, AcPy: 2 – acetyl – 1 – pyrroline HPLC (High pressure liquid chromarography): sắc ký lỏng cao áp LC/MS (liquid chromarography/mass spectrum): sắc ký lỏng ghép khối phổ RF (response factor): hệ số phản hồi OM: Ô Môn ST: Sóc Trăng IRRI (International Rice Research Institute): Viện nghiên cứu lúa gạo quốc tế FAO (Food and Agriculture Organization): Tổ chức lƣơng thực và nông nghiệp quốc tế TCD (Thermal Conductivity Detector): đầu dò dẫn nhiệt ECD (Electron Capture Detector): đầu dò cộng kết điện tử PDMS: Polydimethylsiloxane DVB: Divinylbenzene DI (Direct immersion): Nhúng trực tiếp xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm có trong gạo thơm (nguồn Singh và ctv, 2000) ....................................................................... 19 Bảng 4.1. Hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn .............................................................. 35 Bảng 4.2. Thời gian lƣu (phút) của 8 chất chuẩn khi phân tích trên máy GC thực hiện năm 2007 và năm 2006 (Nguyễn Thị Thu Hƣơng) .......................................... 40 Bảng 4.3. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên GC/MS do Nguyễn Thị Thu Hƣơng thực hiện ............................................................................ 42 Bảng 4.4. Thời gian lƣu của hexanal và nonanal khi phân tích trên máy GC/MS và GC ............................................................................................................................. 44 Bảng 4.5. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC/MS và GC ........................................................................................................... 47 Bảng 4.6. Nồng độ 2 – AP theo các thời kỳ tăng trƣởng của lúa ở 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ............................................................................................... 47 Bảng 4.7. Nồng độ 2 – AP trong hạt lúa qua các giai đoạn phát triển của hạt ......... 48 Bảng 4.8. Nồng độ 2 – AP có trong lá dứa và trong lá của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ................................................................................................ 52 xiv DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hạt lúa ......................................................................................................... 4 Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của 2 – AP ..................................................................... 16 Hình 2.3. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline ............................................... 16 Hình 3.1. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME ............................................ 24 Hình 3.2. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME ............................................................ 25 Hình 3.3. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME .................................. 26 Hình 3.4. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) .......................... 29 Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID........................... 30 Hình 3.6. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa.............................. 31 Hình 3.7. Cột mao quản ............................................................................................ 32 Hình 3.8. Máy sắc ký khí .......................................................................................... 33 Hình 3.9. Máy sắc ký khí ghép khối phổ .................................................................. 33 Hình 4.1. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn collidine (nồng độ 0,01mg/ml) ....... 36 Hình 4.2. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn decanane (nồng độ 0,01 mg/ml) ....... 36 Hình 4.3. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanal (nồng độ 0,01 mg/ml).......... 37 Hình 4.4. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanol (nồng độ 0,01 mg/ml) ......... 37 Hình 4.5. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn nonanal (nồng độ 0,01 mg/ml) ......... 38 Hình 4.6. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn octanol (nồng độ 0,01 mg/ml) .......... 38 Hình 4.7. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn pentanol (nồng độ 0,01 mg/ml) ........ 39 Hình 4.8. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane (nồng độ 0,01 mg/ml) .... 39 Hình 4.9. Sắc ký đồ GC – MS phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm .......................................................................................... 41 Hình 4.10. Kết quả tra cứu thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal trong thƣ viện của máy GC/MS .......................................................................................... 42 Hình 4.11. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,184 phút của mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm .................................................................................................... 43 xv Hình 4.12. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline ............................................. 44 Hình 4.13. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC/MS ................................ 45 Hình 4.14. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC ....................................... 45 Hình 4.15. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC ....................................... 46 Hình 4.16. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong lá lúa (mẫu OM3536) ... ................................................................................................................................... 48 Hình 4.17. Sắc ký đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong hạt lúa ở giai đoạn chín (mẫu Jasmine) ........................................................................................................... 49 Hình 4.18. Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣơng 2 – AP có trong lá dứa .................... 52 xvi DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1. So sánh nồng độ 2 – AP có trong lá qua các thời kì tăng trƣởng của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ................................................................. 50 Biểu đồ 4.2. So sánh nồng độ 2 – AP có trong hạt qua các giai đoạn phát triển hạt của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ....................................................... 51 Biểu đồ 4.3. So sánh hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa và trong lá của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ................................................................................. 53 xvii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME ........................................................................................................................ 28 1 1 Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê nông nghiệp của FAO, các loại lƣơng thực truyền thống chủ yếu đƣợc sản xuất và tiêu thụ trên thế giới bao gồm 5 loại cụ thể: lúa gạo, lúa mì, ngô, kê, lúa mạch. Trong số các loại kể trên, lúa mì và lúa gạo (Oryza sativa L.) là hai loại lƣơng thực cơ bản dùng cho con ngƣời. Theo tính toán của FAO, đến năm 2001, sản lƣợng lúa gạo sản xuất ra trên toàn thế giới có thể duy trì sự sống cho 3.260 triệu ngƣời, chiếm trên 53% dân số thế giới [10]. Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Năm 2003, các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (8,0), Việt Nam (4,0), Mỹ (3,0) (FAO, 2005) [31]. Tuy sản xuất với số lƣợng nhiều, nhƣng chất lƣợng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thƣờng thấp hơn so với một số nƣớc nhƣ Thái Lan, Mỹ, đặc biệt có sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp. Từ cái nôi của nền văn minh lúa nƣớc xa xƣa, gạo đặc sản Việt Nam đã có những loại nổi tiếng nhƣ Tám thơm, Tám xoan, Dự hƣơng, Nếp cái hoa vàng…từng một thời phục vụ chủ yếu cho vua quan quí tộc. Nét nổi bật của gạo đặc sản quí hiếm là hạt cơm dẻo, mềm, vị đậm và ngon, tinh bột cao cấp amilopectin chiếm tới 80%, giá trị dinh dƣỡng cao, dễ hấp thụ, đặc biệt khi nấu, dƣới tác dụng của nhiệt độ, hơi bốc từ nồi cơm tỏa mùi thơm ngào ngạt, ngon lành khiến ngƣời ở xa 20 – 30 mét cũng dễ nhận biết đƣợc thứ hƣơng thơm độc đáo, gợi cảm này [10]. Hiện nay, hầu hết các giống đã bị lẫn tạp nhiều, chất lƣợng cơm gạo, đặc biệt là độ thơm dẻo và năng suất bị giảm. Thƣơng hiệu gạo đặc sản của nƣớc ta trên thị 2 trƣờng quốc tế chƣa có, đây cũng là trở ngại lớn trên con đƣờng nâng cao sức cạnh tranh của lúa gạo Việt Nam. Mùi thơm là một trong những yếu tố rất quan trọng quyết định chất lƣợng và thị hiếu của ngƣời tiêu dùng nhƣng các nghiên cứu về bản chất của các hợp chất thơm cũng nhƣ so sánh chất lƣợng mùi thơm của các giống lúa thơm khác nhau ở Việt Nam hiện nay chỉ mới bắt đầu trong thời gian rất gần đây và gần nhƣ chƣa có kết qủa đáng kể. Vì vậy, việc nghiên cứu bản chất các hợp chất thơm, sự hình thành các hợp chất thơm, so sánh chất lƣợng mùi thơm của một số giống lúa thơm sẽ hữu ích cho các nhà tạo giống trong việc phát triển các giống lúa thơm mới cũng nhƣ thiết lập nên những đặc điểm đặc trƣng cho các giống lúa thơm, chứng minh đƣợc chất lƣợng cao là công việc rất có ý nghĩa thiết thực. Với những lí do trên, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ sinh học dƣới sự hƣớng dẫn của thầy TS. Phan Phƣớc Hiền (NLU), TS. Frédéric Gay (CIRAD), chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát, phân tích và so sánh chất lƣợng mùi thơm của một số giống lúa thơm trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long”. 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục đích - Nghiên cứu sự biến đổi của một số hợp chất bay hơi ở một vài loại lúa thơm. - So sánh sự tạo thành và hàm lƣợng của các hợp chất thơm ở một vài loại lúa thơm. 1.2.2. Yêu cầu - Khảo sát các điều kiện sinh trƣởng và phát triển của một số giống lúa thơm. - Sử dụng phƣơng pháp vi chiết xuất trên pha rắn (SPME) kết hợp với sắc kí khí (Gas Chromatography – GC) để đánh giá và so sánh hàm lƣợng chất thơm trong một số giống lúa thơm đƣợc trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long. 3 3 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA 2.1.1. Hệ thống phân loại cây lúa Lúa [7] thuộc: Ngành thực vật có hoa: Angiospermae Lớp một lá mầm: Monocotyledons Bộ Hoà thảo có hoa: Poales (Graminales) Họ Hoà Thảo: Poaceae (Gramineae) Họ phụ Hoà Thảo ƣa nƣớc: Pryzoideae Chi lúa: Oryza Loài lúa trồng: Oryza sativa Loài phụ:  Subsp: japonica: Loài phụ Nhật Bản  Subsp: indica: Loài phụ Ấn Độ  Subsp: javanica: Loài phụ Java 2.1.2. Đặc điểm sinh thái-sinh học cây lúa 2.1.2.1. Hạt lúa và sự nảy mầm  Hạt lúa Hạt lúa là một bộ phận quan trọng nhất của cây lúa. Là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài). Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ. Bản chất hạt lúa là quả dĩnh nhỏ, phần hạt thực thụ là hạt gạo lứt (gạo lật) [7], gồm có (hình 2.1): Vỏ trấu: gồm trấu trên và trấu dƣới, có các màu khác nhau tuỳ theo giống. 4 Râu: Hạt thóc có thể có râu hoặc không có râu, màu sắc của mỏ hạt và của râu thƣờng giống nhau. Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp chủng bì. Phôi nhũ gồm có lớp aleurone và phôi nhũ tích tụ tinh bột. Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dƣới của hạt. Hình 2.1. Hạt lúa [78]  Sự nảy mầm của hạt Hạt giống hút nƣớc trƣơng lên, gặp nhiệt độ thích hợp và đầy đủ không khí thì nảy mầm. Đầu tiên là một khối trắng (tiền thân của mầm và rễ phôi) xuất hiện phá vỏ trấu ra ngoài, tiếp đến là rễ phôi xuất hiện và dài ra nhanh chóng, cuối cùng đến bao mầm có dạng mũi chông đâm ra [7].  Điều kiện cần thiết để hạt lúa nảy mầm [7] Một hạt lúa nảy mầm bình thƣờng cần 3 điều kiện: nƣớc, nhiệt độ và không khí đủ O2 . ● Nƣớc: Để hạt nảy mầm cần ngâm cho hạt hút no nƣớc. Ngâm hạt với thể tích nƣớc gấp 3 lần thể tích thóc và sau khi ngâm 24 giờ phải thay bằng nƣớc 5 5 sạch để tránh hiện tƣợng gây chua do một phần tinh bột hoà tan vào nƣớc, ảnh hƣởng đến sự nảy mầm của hạt. Thời gian ngâm hạt tùy thuộc vào nhiệt độ không khí, nhiệt độ nƣớc khi ngâm và độ khép kín của vỏ trấu. ● Nhiệt độ: Hạt lúa muốn nảy mầm cần nhiệt độ thích hợp. Nhiệt độ giới hạn thấp nhất để hạt lúa có thể nảy mầm tốt nhất là 12oC, nhiệt độ tối thiểu là 30-35 o C, nhiệt độ tối cao là 40oC. Ở khoảng nhiệt độ 30-35oC hạt lúa nảy mầm tốt nhất, nhanh và tập trung. ● Không khí: Hạt lúa nảy mầm cần có oxy của không khí lấy từ môi trƣờng xung quanh. Ít oxy hạt lúa nảy mầm không đồng bộ, rễ ngắn, mầm dài hoặc chỉ có mầm không có rễ. Để hạt nảy mầm tốt cần cung cấp đầy đủ không khí. 2.1.2.2. Lá lúa  Hình thái lá lúa [7] Một lá lúa hoàn chỉnh gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá, cổ lá, tai lá và lƣỡi lá (thìa lìa). ● Ở thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng, bẹ lá ôm lấy nhau và tạo thành thân của của nhánh lúa (thân giả). ● Phiến lá là phần quan trọng nhất của lá, nơi diễn ra quá trình quang hợp để tạo ra carbon hydrate (các chất đƣờng bột). Phiến lá gồm các gân chạy song song, tùy thuộc vào giống mà phiến lá có hình dạng khác nhau. ● Lá lúa có màu sắc khác nhau tùy giống. Đa số giống lúa có lá màu xanh và ở các mức độ khác nhau. Theo mức độ xanh của lá mà ngƣời ta chia ra: lá lúa xanh đậm, lá lúa xanh, lá lúa xanh sáng, lá lúa xanh vàng...  Quá trình phát triển của lá lúa [7] Lá lúa mọc từ mầm lá trên mắt đốt thân. Mỗi mắt đốt thân tƣơng ứng với một lá nên cây lúa có bao nhiêu mắt đốt thân thì có bấy nhiêu lá. Lá lúa đƣợc hình thành qua 4 giai đoạn: đầu tiên là giai đoạn mầm lá bắt đầu phân hóa, tiếp đến là giai đoạn hình thành phiến lá, rồi đến giai đoạn hình thành bẹ lá và cuối cùng là một lá mới xuất hiện. Lá phát triển hoàn chỉnh và chuyển sang thời kì sống và hoạt động. Bốn giai đoạn kế tục của thời kì này là: 6 ● Hoàn thiện về hình thái: lá tiếp tục dài ra, chuyển từ màu xanh vàng sang xanh và đạt hình thái ổn định. ● Giai đoạn lá hoạt động mạnh: hoạt động quang hợp xảy ra mạnh mẽ, các chất dinh dƣỡng đƣợc tích lũy phục vụ cho hoạt động sống của cây. ● Giai đoạn hoạt động giảm: khi khối lƣợng của lá đạt cao nhất thì hoạt động của lá bắt đầu giảm. Sự giảm này gia tăng cùng với độ già của lá, các chất tích lũy trong lá cũng giảm. ● Giai đoạn ngừng hoạt động: lá già, vàng úa, héo dần và chết. Tuổi thọ của lá kéo dài từ 20-40 ngày tùy theo vị trí của lá trên cây. Thông thƣờng các lá lúa ra sau có tuổi thọ cao hơn lá ra trƣớc. 2.1.2.3. Bông lúa Bông lúa là bộ phận quan trọng nhất của cây lúa, là kết quả của mọi hoạt động trong đời sống cây lúa. Bông lúa cũng là bộ phận tạo ra hạt lúa-sản phẩm quan trọng nhất của cây lúa [7].  Hình thái bông lúa Một bông lúa gồm phần cơ bản là trục bông, gié cấp I xuất phát từ trục bông, gié cấp II xuất phát từ gié cấp I, các hoa lúa (sau này là hạt lúa) đƣợc đính trên gié cấp II, phần đầu bông trên gié cấp I. Bông lúa có nhiều dạng khác nhau nhƣ: ● Bông thẳng: trục bông không cong, thuộc loại hình bông bé. ● Bông cong đầu: phần gần đầu bông cong. ● Bông cong tròn: bông cong xuống từ phần giữa bông...  Cấu tạo hoa lúa Hoa lúa thuộc dạng điển hình của cây hòa thảo gồm vỏ trấu trong, vỏ trấu ngoài, 2 mày trấu, nhị đực có 6 bao phấn và nhụy gồm bầu nhụy và 2 vòi nhụy.  Trổ bông, nở hoa, thụ phấn và thụ tinh Thời kì lúa chƣa trổ thì lúa nằm trong đòng, khi đã phát triển hoàn chỉnh thì bông lúa thoát ra khỏi đòng, ta gọi là lúa trổ bông hay lúa trổ. Thời gian kể từ khi bông lúa nhú ra khỏi đòng đến khi toàn bộ bông lúa thoát ra gọi là thời gian trổ. Các 7 7 giống trổ nhanh, tập trung thì thời gian trổ chỉ kéo dài 2-3 ngày, các giống trổ chậm thì phải 5-7 ngày mới trổ xong. Sau khi trổ thì bông lúa nở hoa (phơi màu). Trong cùng một ngày khi nhiệt độ không khí tăng cao thì hoa lúa bắt đầu nở. Hoa nở rộ nhất lúc 9-10 giờ sáng. Trời mƣa lạnh lúa không nở; trời âm u, mát, hoa lúa nở muộn hơn. Khi hoa lúa nở thì vỏ trấu mở ra, 6 bao phấn vƣơn ra ngoài, tung phấn lên vòi nhụy, hạt phấn ngay sau đó nảy mầm lên vòi nhụy, đó là quá trình thụ phấn. Ở cây lúa xảy ra quá trình thụ tinh kép: hạt phấn sinh ra 2 tinh tử, một tinh tử kết hợp với tế bào trứng để tạo ra phôi, còn một tinh tử khác thì kết hợp với cực nhân để tạo ra nội nhũ. Sau khi lúa phơi màu khoảng 8 giờ thì quá trình thụ tinh hoàn thành, hoa lúa phát triển thành hạt lúa.  Sự phát triển của hạt lúa Hạt lúa (chính là một quả) còn gọi là hạt thóc, là một hoa lúa sau khi thụ phấn, thụ tinh phát triển mà thành. Sau khi thụ tinh phôi hình thành rất nhanh, 24 giờ sau khi thụ tinh thì đã bắt đầu phân hóa, 7 ngày sau mầm và bao mầm nguyên thủy đã đƣợc hình thành. Sau 8- 10 ngày, các bộ phận của phôi đã có thể phân biệt rõ nhƣ trục phôi, mầm phôi và rễ phôi. Sau 15 ngày phôi đã phát triển hoàn chỉnh, nằm ở phía cuống của hạt thóc, phía bụng và phần cuối của hạt gạo. Cùng với phôi, nội nhũ cũng phát triển nhanh chóng để trở thành hạt gạo. Hạt gạo phát triển theo chiều dài trƣớc, 4 ngày sau khi thụ tinh, hạt gạo non đã dài đến đỉnh của vỏ trấu và bắt đầu quá trình tích lũy tinh bột. Tinh bột lúc đầu còn ít và hòa tan trong dịch nhƣ một dạng sữa (giai đoạn chín sữa), sau đó lƣợng tinh bột tăng và hạt gạo trở thành một khối mềm (giai đoạn chín sáp) rồi chuyển sang cứng, vỏ trấu chuyển thành màu vốn có của giống, 6-7 ngày sau đó thì hạt lúa đã chín hoàn toàn. Từ khi lúa trổ, hoàn thành thụ phấn, thụ tinh đén khi hạt lúa hình thành và chín hoàn toàn trải qua 30-35 ngày. 8 2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng, phát triển cây lúa 2.1.3.1. Ba thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa Trong suốt quá trình sinh trƣởng, phát triển, cây lúa trải qua 3 thời kì lớn. Ở mỗi thời kì, cây lúa biến đổi cả về lƣợng và chất để hoàn thành chu kì phát triển. Ngƣời ta phân biệt 3 thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa là: thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng, thời kì sinh trƣởng sinh thực và thời kì hình thành hạt và chín [7]. ● Thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng (115-125 ngày): là thời kì cây lúa hình thành nhánh, lá và một phần thân. ● Thời kì sinh trƣởng sinh thực (kéo dài khoảng 35 ngày): là thời kì cây lúa hình thành hoa, tập hợp nhiều hoa thành bông lúa. ● Thời kì chín (kéo dài khoảng 30 ngày): ở các hoa lúa đƣợc thụ tinh xảy ra quá trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi, phát triển thành hạt, sản phẩm chủ yếu của cây lúa. 2.1.3.2. Các giai đoạn phát triển của cây lúa Ba thời kì sinh trƣởng của cây lúa trải qua 10 giai đoạn phát triển [7]: ● Giai đoạn nảy mầm: từ nứt nanh đến nảy mầm, hạt lúa hình thành rễ và mầm. ● Giai đoạn mọc: giai đọan mạ, bắt đầu từ lá thật đầu tiên đến trƣớc khi nhìn thấy nhánh thứ nhất, từ khi cây mạ có một lá đến khi có 4-5 lá. ● Giai đoạn đẻ nhánh: bắt đầu từ khi cây lúa có nhánh đầu tiên đến khi cây lúa có nhánh tối đa. ● Giai đoạn làm đốt (giai đoạn vƣơn lóng): bắt đầu từ cuối giai đoạn đẻ nhánh hoặc ngay trƣớc giai đoạn hình thành đòng, lóng đƣợc hình thành và vƣơn dài. Các giai đoạn trên thuộc thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng của cây lúa. ● Giai đoạn làm đòng: phân hoá từ đòng đến đòng già, khi trên đỉnh sinh trƣởng hình thành bông nguyên thuỷ (khối trắng dài khoảng 1mm, có lông trắng mịn). Giai đoạn này kết thúc khi cây lúa có đòng già, chuẩn bị trổ bông. 9 9 ● Giai đoạn trổ bông: bắt đầu từ khi các hoa đầu tiên của bông nhô ra khỏi đòng đến khi lóng trên cùng không dài thêm đƣợc nữa. ● Giai đoạn nở hoa (giai đoạn phơi màu): hoa lúa nở ra, tung phấn, quá trình thụ phấn, thụ tinh xảy ra. Đây là 3 giai đoạn thuộc thời ki sinh trƣởng sinh thực của cây lúa. ● Giai đoạn chín sữa: trong hạt lúa tích luỹ dạng vật chất giống nhƣ sữa. ● Giai đọan chín sáp: hạt gạo đã hình thành rõ nhƣng vẫn mềm, vật chất tích luỹ giống nhƣ sáp. ● Giai đoạn chín hoàn toàn: hạt gạo hoàn chỉnh với nội nhũ và phôi, vỏ trấu có màu vốn có của giống. Đây là thời kì chín của cây lúa. 2.2. LÚA THƠM ĐẶC SẢN VIỆT NAM Là một quốc gia nông nghiệp, với cái nôi là nền văn minh lúa nƣớc, lúa gạo Việt Nam từ ngàn xƣa đã có những giống nổi tiếng nhƣ Tám Thơm, Tám Xoan, Dự Hƣơng, Nàng Thơm Chợ Đào... Những chủng loại đó hiện nay vẫn đƣợc sự ƣa chuộng của thị trƣờng trong nƣớc và đã chiếm lĩnh đƣợc một phần thị trƣờng thế giới. Bên cạnh đó, cũng có nhiều giống lúa thơm đƣợc du nhập vào Việt Nam nhƣ Basmati 370, Basmati mutant (Ấn Độ), Khao Dawk Mali (Thái Lan), Jasmine 85 (Mỹ)…góp phần làm đa dạng thị trƣờng lúa gạo Việt Nam (Trần Văn Đạt, 2002) [4]. Các giống lúa thơm địa phƣơng có những đặc điểm chung là thời gian sinh trƣởng dài, phản ứng chặt chẽ với ánh sáng ngày ngắn, chỉ cấy đƣợc một vụ trong năm, mức thâm canh trung bình hoặc thấp, dễ nhiễm một số loại sâu bệnh và dễ đổ ngã. Các giống này có tính thích nghi cao trong những điều kiện nhất định, đặc biệt là điều kiện khó khăn: hạn, úng, mặn, phèn. Nhóm giống đặc sản có đặc tính quí là có phẩm chất tốt, gạo trắng, hạt thon dài, cơm dẻo, ngọt, thơm. Nhiều giống lúa mùa có tỉ lệ gạo trắng, cũng nhƣ tỉ lệ gạo nguyên cao hơn các giống lúa cao sản [9]. Mùi thơm của các giống lúa thơm thƣờng tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng nhƣ đất đai, khí hậu [4]. 10 Hiện nay hầu hết các giống đã bị lẫn tạp nhiều, chất lƣợng cơm gạo, đặc biệt là độ thơm dẻo và năng suất bị giảm. Thƣơng hiệu gạo đặc sản của nƣớc ta trên thị trƣờng quốc tế chƣa có. Lâu nay, ngƣời dân sản xuất lúa thơm chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, vì chƣa có những qui trình kỹ thuật sản xuất lúa thơm đặc sản chính thức đƣợc phổ biến đến ngƣời nông dân [9]. 2.2.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC GIỐNG LÚA VD20, ST3, OM3536, JASMINE 2.2.1.1. Giống lúa OM3536 [2]  Đặc tính nông học Giống lúa OM3536 đƣợc phát triển từ tổ hợp lai TD8 với OM1738 tại Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long. Giống đƣợc tạo ra bằng phƣơng pháp lai cổ điển và chọn phả hệ. TD8 làm giống mẹ là giống lúa có mùi thơm, hạt gạo rất dài và rất trong nhƣng cứng cơm. Giống lúa này đƣợc sản xuất thử từ 1995. Giống bố OM1738 có dạng hạt thon dài, gạo trong suốt, thời gian sinh trƣởng ngắn, năng suất cao, cao cây, kháng sâu bệnh. Kế thừa đƣợc đặc tính tốt từ bố mẹ, giống OM3536 có những đặc tính nhƣ sau: - Thời gian sinh trƣởng 85 - 90 ngày. - Chiều cao 95 - 100cm. - Khả năng đẻ nhánh trung bình - Số hạt chắc / bông cao và tỉ lệ hạt lép thấp. - Trọng lƣợng 1000 hạt 26,6g. - Hạt gạo dài 7,3mm, dạng hạt thon dài, gạo rất trong, ít bạc bụng. - Độ trở hồ cấp 6, độ bền thể gel 54mm, hàm lƣợng amylose 22%. - Giống OM3536 có mùi thơm nhẹ. - Năng suất 4 - 7 tấn /ha (không thuộc nhóm năng suất cao), nhƣng thích nghi tốt ở vùng đất phèn, kém dinh dƣỡng, phẩm chất gạo rất tốt. - Ở đất phù sa, cần lƣu ý bón phân cân đối NPK, vì lúa sẽ bị đổ ngã nếu bón nhiều N. Công thức khuyên cáo 80:40:30 kg NPK/ha 11 11  Phẩm chất gạo Tỉ lệ gạo lứt biến thiên 79 - 80% cho cả hai vụ Đông Xuân và Hè Thu. Riêng tỉ lệ gạo nguyên biến động tùy theo vùng sinh thái và ảnh hƣởng môi trƣờng, từ 39 đến 45% trong cả Đông Xuân và Hè Thu, theo thứ tự. Tỉ lệ bạc bụng biến động 2 - 5% (tính theo tỉ lệ phần trăm của cấp 9). Đây là giống có hàm lƣợng amylose trung bình (22 - 23,5%) cả trong hai vụ Đông Xuân và Hè Thu. Độ bền thể gel đƣợc đánh giá 40 - 47mm. Gạo dẻo và ngon cơm, giá lúa trên thị trƣờng khá cao so với các giống khác. Hàm lƣợng protein: 10,5 - 10,8% trong cả hai vụ Đông Xuân và Hè Thu. Giống này đƣợc tặng giải thƣởng bông lúa vàng 2003 và đƣợc công nhận giống Quốc gia năm 2004. 2.2.1.2. Giống lúa Jasmine [2] Giống lúa Jasmine là giống lúa thơm có nguồn gốc từ giống IR841 của Viện Lúa Quốc tế do Bộ Nông Nghiệp Mỹ chọn lọc. Giống này đƣợc du nhập vào Việt Nam trong những năm đầu của thập niên 1990, trồng nhiều ở các tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Long An, và một số vùng khác, diện tích trồng rộng ở tỉnh An Giang. - Giống Jasmine có thời gian sinh trƣởng 105 - 110 ngày. - Chiều cao cây 110 - 115cm và độ dài bông 26,2cm. - Số hạt chắc trên bông là 106 hạt .Trọng lƣợng 1000 hạt 26 gram thuộc nhóm hạt to. - Chiều dài hạt 6,9cm, tỉ lệ dài/rộng là 3,05. - Tán lá đứng, đẻ nhánh trung bình mùi thơm nhẹ ở cấp 5, mềm cơm, ngon, ngọt cơm, không bạc bụng. - Hàm lƣợng amylose 18 - 22%. - Năng suất 4 - 6 tấn /ha. - Tuy nhiên, Jasmine nhiễm rất nặng với các loại sâu hại chính ở Đồng bằng sông Cửu Long nhƣ rầy nâu, bệnh bạc lá, bệnh đạo ôn, một số các bệnh siêu vi trùng lúa cỏ, lùn xoắn lá. 12 Đây là thành tựu khá nổi bật của các nhà chọn giống, bởi vì trên 20 năm lai tạo và chọn lọc, ngƣời ta đã thất bại trong phát triển giống lúa thơm có dạng hình cải tiến, ngắn ngày, năng suất cao. Có thể Jasmine là giống đầu tiên có đƣợc các tiêu chuẩn ấy. Rất tiếc nó bị nhiễm nhiều sâu bệnh hại quan trọng, cần thận trọng trong sản xuất giống này. 2.2.1.3. Giống lúa VD20 [2] VD20 là giống lúa đƣợc du nhập từ Đài Loan và đƣợc Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long tiến hành khảo nghiệm trên diện rộng. VD20 có các đặc tính nhƣ sau: - Thời gian sinh trƣởng 100 ngày (Đông Xuân) và 105 ngày (Hè Thu). - Chiều cao cây 100 - 105 cm. - Cứng cây, nở bụi khá, phiến lá có màu xanh hơi nhạt, gốc thân và bìa lá có màu tím. Trung bình có 7 bông / bụi. - Bông to, dài 25 - 26 cm, hạt chắc trên bông 180 – 190 hạt, tỉ lệ lép thấp (dƣới 10%). Giai đoạn vào chắc nhanh. - Hạt nhỏ, trọng lƣợng 1000 hạt từ 20 – 21gram, gạo rất trong, chiều dài hạt gạo lức 6,16mm, tỉ lệ gạo nguyên cao (88%), trọng lƣợng vỏ trấu 20,8% - Đặc biệt có mùi thơm từ giai đoạn mạ đến chín giống nhƣ lúa thơm Jasmine. - Mức độ nhiễm rầy nâu và vàng lá nhẹ. - Thích hợp vụ Đông Xuân hơn Hè Thu. Năng suất thực tế vụ Đông Xuân là 6,16 tấn / ha (trên diện tích 650 m2). - Hàm lƣợng amylose thấp (18 – 20%), cơm dẻo, mềm và có mùi thơm nhẹ. 2.2.1.4. Giống lúa ST3 [2] Giống lúa ST3 do kỹ sƣ Hồ Quang Cua thanh lọc từ những dòng biến dị của giống lúa VD20 bằng phƣơng pháp chọn lọc cá thể theo hƣớng tiến gần tới tiêu chuẩn gạo thơm cao cấp của Thái Lan (dài hạt gạo 7 mm). ST3 có các đặc tính sau: 13 13 - Thời gian sinh trƣởng 112 – 117 ngày (vụ Hè Thu), 100 – 105 ngày (vụ Đông Xuân). - Chiều cao cây 110 – 115 cm, đẻ nhánh mạnh, gốc nâu, bản lá to, dài, có màu tím dọc theo mép lá. - Giống cao cây, chịu phân kém, dễ đổ ngã. - Nhiễm rầy nâu, nhiễm cháy lá nặng. - Hạt gạo rất dài (7,5 – 8 mm), gạo trong, rất ít bạc bụng, thơm đậm, bền mùi, cơm mềm, dẻo. - Năng suất bình quân: 3 – 4 tấn / ha (vụ Hè Thu), 6 – 7 tấn (vụ Đông Xuân). 2.2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ HOÁ SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO 2.2.2.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm Nghiên cứu đầu tiên về gạo thơm đã đƣợc thực hiện bởi Yajima và ctv (1979) [73]. Họ đã xác định đƣợc 114 thành phần có trong gạo thơm, trong đó có 21 acid, 14 ester của các acid béo, 15 alcohol, 18 aldehyde, 17 ketone, 18 hydrocarbon và một vài hợp chất vòng khác nhƣ pyridine và furan. Khi so sánh gạo thông thƣờng với gạo thơm, Yajima đã rút ra kết luận: trong gạo thông thƣờng hàm lƣợng 4 – vinylphenol, 1 – hexanol và 1 – hexanal cao hơn so với gạo thơm, nhƣng lại có hàm lƣợng indole thấp hơn. Hơn nữa, gạo thơm còn có 1 thành phần chƣa xác định đƣợc và α – pyrrolidone là những chất không đƣợc tìm thấy trong gạo thông thƣờng [73]. Những hợp chất bay hơi trong gạo đƣợc xác định bằng cách thu thập những chất bay hơi, phân tách bằng sắc ký và sau đó xác định những thành phần này bằng sắc ký khối phổ (GC/MS) [58]. Tsuzuki và ctv (1981) [67] và Buttery và ctv (1983b) [20] đã phân tích những thành phần bay hơi có trong cơm nấu từ gạo thơm. Kết quả là họ đã nhận biết đƣợc 114 chất (phụ lục 1). Tuy nhiên, theo đánh giá, không có thành phần bay hơi riêng lẻ nào đặc trƣng cho gạo thơm chƣa chế biến [17]. Năm 1988, Buttery và ctv [22] đã xác định đƣợc những thành phần chính tạo nên mùi thơm của gạo thơm hạt dài California là 2 – acetyl – 1 – pyrroline; (E,E) – deca – 2,4 – dienal; nonanal; 14 hexanal; (E) –– non – 2 – enal; octanal; decanal; 4 – vinyl – guaiacol và 4 – vinylphenol. Buttery và ctv (1983a) [19] đã phân tích 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở điều kiện áp suất hơi nƣớc đối với những giống gạo khác nhau. Thí nghiệm này chỉ thực hiện trên gạo đã chế biến chứ không thí nghiệm trên gạo thô, vì thế, Tsugita (1985 - 1986) [66] đã tỏ ý hoài nghi rằng có thể chất này đƣợc hình thành trong quá trình nấu nƣớng. Suvarnalatha và ctv (1994) [61] đã nuôi cấy mô sẹo giống lúa Basmati và so sánh những thành phần bay hơi từ những cây lúa đó với những thành phần bay hơi trong những cây lúa Basmati thông thƣờng và rút ra kết luận rằng những chất này là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, họ đã không tìm thấy 2 – AP trong mô sẹo hay trong cơm gạo. Có thể là do phƣơng pháp sử dụng chƣa đủ nhạy. Tiến hành so sánh những chất bay hơi có trong gạo thông thƣờng và gạo thơm, Widjaja và ctv (1996) [69] đã xác định đƣợc 70 chất và mô tả mùi thơm hầu hết những chất đó. Những chất bay hơi chính trong gạo thơm là các alkanal; alk – 2 – enal; alka(E) – 2,4 – dienal; 2 – pentylfuran; 2 – acetyl – 1 – pyrroline và 2 – phenylethanol. Những giống gạo thông thƣờng chứa nhiều n-hexanal, (E) – 2 – heptanal, 1 – octen – 3 – ol, n – nonanal, (E) – 2 – octenal, (E) – 2 - (E) – 4 – decadienal, 2 – pentylfuran, 4 – vinylguaiacol và 4 – vinylphenol hơn so với gạo thơm. Kim (1991) [41] đã xác định trong gạo thơm có 16 loại hydrocarbon, 15 loại alcohol. Lorieux và ctv (1996) [43] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và IR64 (không thơm), phân tích định lƣợng của 15 hợp chất chính liên quan đến 2 giống trên. Kết quả không tìm thấy chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong giống IR64. Xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt giữa giống lúa thơm và không thơm: pentanol; 2 – acetyl – 1 – pyrroline; benzaldehyde; octanol; pentadecan – 2 – one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexanol. Khi so sánh nồng độ các cấu tử bay hơi thu đƣợc trong quá trình chiết xuất gạo thơm, Petrov và ctv (1996) [47] đã xác định đƣợc 9 thành phần có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ giữa loại gạo thơm và gạo thông thƣờng: pentanol; hexanol; 2 – 15 15 acetyl – 1 – pyrroline; (E) – hept – 2 – enal; benzaldehyde; octanal; pentadecan – 2 – one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexadecanol. Trong số 9 hợp chất trên, pentadecan – 2 – one thể hiện mối tƣơng quan nghịch với những hợp chất khác, và là thành phần đặc trƣng trong giống gạo thông thƣờng (IR64) còn 6 hợp chất góp phần tạo mùi thơm trong gạo thơm: hexanal, octanal, nonanal, (E) – non – 2 – enal, (E,E) – deca – 2,4 – dienal và 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Theo Paule C. M. và Powers J. J. (1989) [46], hàm lƣợng hexanol tƣơng quan nghịch với chất lƣợng mùi thơm trong gạo, trong khi đó, 2 – acetyl – 1 – pyrroline lại tƣơng quan thuận. Kết quả nghiên cứu này một lần nữa chứng minh kết luận của Buttery và ctv (1983a) [19] rằng 2 – acetyl – 1 – pyrroline là thành phần chính chịu trách nhiệm cho mùi thơm đặc trƣng trong gạo thơm là đúng đắn. Theo Widjaja và ctv (1996) [69], thành phần chính trong tất cả các loại gạo là hexanal. Khác biệt cơ bản giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng là gạo thông thƣờng chứa hàm lƣợng hexanal, heptanal; 6 – methyl – 5 – hepten – 2 – one; (E) – 2 – heptenal; 1 – octen – 3 – ol; nonanal; (E) – 2 – octenal và (E) – 2, (E) – 4 – decadienal nhiều hơn so với gạo thơm. Các thành phần hóa sinh góp phần tạo phát triển mùi thơm, nhƣng khả năng hình thành mùi thơm của cây còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền, môi trƣờng, dinh dƣỡng và điều kiện bảo quản (Simon và ctv, 1980; Paillard, 1981) [55, 45]. Do đó, sự khác biệt giữa mùi thơm trong gạo thơm và gạo thông thƣờng không thể chỉ dựa trên các thành phần hóa sinh (nhƣ acid béo, amino acid, đƣờng hay sắc tố) của mỗi giống [47]. Hiện nay có 2 quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo. Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm đƣợc tạo ra từ các hợp chất aldehyde (CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lƣu huỳnh (Ayano và Tsuzuki, 1976) [13]. Quan điểm thứ 2 cho rằng chất thơm lúa gạo, do vòng pyrrol kiểm soát tính thơm của chất 2- acetyl-1-pyrroline (Buttery và ctv, 1983a) [19]. 16 2.2.2.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline 3 Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của 2 – AP 2 – acetyl – 1 – pyrroline, một hợp chất thơm có mùi tƣơng tự nhƣ mùi bắp nổ, đƣợc đánh giá là một thành phần chất thơm quan trọng trong các giống gạo thơm do đặc tính giữ mùi lâu hơn so với các thành phần bay hơi khác trong gạo [19, 22]. Buttery và ctv (1983a) [19] đã chiết xuất 2 – AP và những hợp chất bay hơi khác từ gạo bằng cách sử dụng hệ thống chiết xuất Likens – Nickerson (SDE). Sản phẩm thu đƣợc đƣợc phân tích bằng GC/MS. Sau đó, họ đã định lƣợng 2 – AP bằng máy sắc ký khí với đầu dò FID [21]. Hình 2.3. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline (A: Tanchotikul and Hsieh, 1991; B: Varaporn và Sarath, 1993) [64, 68] Năm 1983, Buttery và ctv [19] đã nghiên cứu 7 giống lúa thơm. Trong số các thành phần xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí, hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline đã tìm thấy và có mùi tƣơng tự nhƣ mùi thơm của cơm. Ngƣỡng mùi thơm của chất này trong nƣớc là 0,1μg/l và mùi thơm tích lũy tƣơng tự nhƣ loại bắp nổ 17 17 (pop corn). Theo Buttery và ctv (1982, 1983a) [18, 19], 2 – acetyl – 1 – pyrroline là thành phần chính trong hỗn hợp các chất thơm có trong gạo thơm, góp phần cấu thành nên hƣơng thơm của gạo. Do đó, có thể cho rằng thành phần chính dùng để nhận biết sự khác biệt về mùi giữa gạo thông thƣờng và gạo thơm là 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Buttery và ctv (1983a) [19] nhận thấy rằng, các giống gạo thơm chứa 0,04 – 0,09 ppm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong khi các giống gạo thông thƣờng chứa lƣợng thấp hơn khoảng 10 lần (< 0,006 đến < 0,008 ppm). Họ đã công bố những chất thơm này chỉ đƣợc tìm thấy trong quá trình nấu nƣớng mà không đƣơc phát hiện trong gạo thô. Nhƣng theo Yoshihashi (2002) [75], hợp chất thơm 2 – AP không phải đƣợc hình thành trong quá trình nấu nƣớng hay do điều kiện bảo quản sau thu hoạch mà chúng đƣợc hình thành từ phần khí sinh của cây trong suốt thời gian gieo trồng. Năm 2003, Wornpongchai và ctv [70] đã tìm thấy 2 – AP trong gạo thô và các bộ phận khác của cây bằng phƣơng pháp chiết xuất không sử dụng nhiệt. Họ cho rằng, 2 – AP chính là một hợp chất thứ cấp hiện diện trong cây lúa đặc sản. Hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc xác định là thành phần chính trong tinh dầu lá dứa. Theo Buttery và ctv (1983a) [19], trong lá dứa chứa khoảng 1 ppm 2 – acetyl – 1 – pyrroline, hàm lƣợng này cao gấp 100 lần so với những loại gạo thông thƣờng. Vì thế, ở một vài nƣớc châu Á, ngƣời dân thƣờng cho lá dứa vào trong quá trình nấu cơm đối với những loại gạo thông thƣờng để có đƣợc mùi thơm nhƣ gạo thơm [68]. Thí nghiệm phân tích của Trung tâm Nghiên cứu vùng của Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ và IRRI (1982) (trích dẫn bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [9] cũng cho kết quả về hàm lƣợng chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline của 8 giống lúa thơm và 2 giống lúa không thơm. Hàm lƣợng chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline của Khao Dawk Mali 105 và Basmati 370 là 0,07 và 0,06 ppm theo thứ tự, giống đối chứng Calrose là 0,006 ppm. Hussain và ctv (1987) [35] thực hiện so sánh mùi thơm giữa lúa thơm (Basmati) và lúa không thơm. Xác định hợp chất thơm dựa trên các peak 18 pentadecan-2-one, hexanol, 2-pentylfurane với nồng độ cao ở lúa Basmati. Chất 2- acetyl-1-pyrroline không tìm thấy. Tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu thực hiện sau năm 1983 (Buttery và ctv, 1983b, 1986, 1988; Paule và Powers, 1989; Lin và ctv, 1990; Tanchotikul và Hsieh, 1991) đã chứng tỏ tầm quan trọng của thành phần 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Hàm lƣợng của hợp chất này trong gạo dao động từ 6 – 90 µg/kg tùy theo chất lƣợng mùi thơm trong gạo thơm (Buttery và ctv 1983b) [20]. 2 – AP không chỉ đóng vai trò quan trọng trong gạo thơm mà còn đƣợc xem là thành phần chính trong vỏ và ruột bánh mì (Schieberle và Grosch, 1991 và 1991a), bắp nổ (Schieberle, 1991a), hạt kê (Seitz và ctv, 1993), bánh ngô (Karahadian và Johnson, 1993), lá dứa (Buttery và ctv, 1983a; Laksanalamai và Ilangantileke, 1993), mật cây đoan (Blank và ctv, 1989) và bia Đức (Schieberle, 1991b) (trích dẫn bởi Petrov, 1996) [47]. 2 – AP còn là thành phần chính đƣợc tổng hợp từ một vài dòng Bacillus cereus phân lập đƣợc từ việc lên men quả ca cao (Romanczyk và ctv, 1995) [51]. Theo Buttery và ctv (1983a) [19], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có cùng nguồn gốc với 2 – acetyl – 1,4,5,6 – tetrahydropyridine là 1 thành phần chất thơm đã đƣợc Hunter và ctv (1969) tìm thấy trong bánh mì hay bánh nƣớng. Proline hay hydroxyproline cũng là tiền thân của 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Khi thay thế nhóm – COOH của hydroxyproline thành nhóm methyl keton bằng cách khử nƣớc và chuyển nối đôi sang vị trí số 1 sẽ tạo ra đƣợc 2 – AP. Còn theo Petrov và ctv (1996) [47], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có nguồn gốc từ proline và ornithine. Sản phẩm của quá trình phân hủy Strecker là proline và 1- pyrroline (Yoshikawa và ctv, 1965) [77] sẽ phản ứng với những sản phẩm của quá trình phân hủy đƣờng tạo ra AcPy (Schieberle, 1989, 1990; Tressl và ctv, 1985) [53, 54, 65]. Mũi của ngƣời có thể phát hiện đƣợc chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở nồng độ 0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan, trong điều kiện nhất định và với những ngƣời có khứu giác bình thƣờng, kết quả có thể tin cậy đƣợc [9]. 19 19 Theo Varaporn và Sarath (1993) [68], nồng độ 2 – AP trong gạo sẽ giảm đối với những gạo đƣợc lƣu trữ trong thời gian dài. Bảng 2.1. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm trong gạo thơm (nguồn Singh và ctv, 2000) [58] Các yêu tố góp phần gia tăng chất lƣợng mùi thơm Các yếu tố làm suy giảm chất lƣợng mùi thơm Thời tiết mát mẻ trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Bón phân với liều lƣợng thích hợp Đất màu mỡ Gieo hạt trực tiếp Đất nhẹ, chân ruộng cao Nhiệt độ tăng cao trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Phân bón chứa lƣợng urê quá cao Đất nghèo dinh dƣỡng Trồng lúa theo hình thức gieo xạ Đất nặng Độ ẩm trong đất thấp trong giai đoạn hạt chín Xay xát thủ công Thu hoạch muộn Sử dụng máy móc trong giai đoạn xay xát lúa 2.3. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME)  Nguyên tắc SPME là 1 phƣơng pháp chiết xuất không cần sử dụng dung môi, đƣợc phát minh bởi Pawliszyn và cộng sự từ năm 1989 [34]. Phƣơng pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxan (PDMS), PDMS/DVB (divinyl benzen), polyacrylat…thông qua tác động phân chia giữa những chất đƣợc hấp phụ và hỗn hợp mẫu. Quá trình hấp phụ diễn ra khi nhúng sợi chiết vào mẫu lỏng hay khi phơi sợi chiết ra môi trƣờng phía trên mẫu lỏng hay rắn. Các hợp chất bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp phụ trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí. 20  Đặc điểm Kỹ thuật này kết hợp các giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết xuất, cô cạn mẫu thành 1 bƣớc đơn giản, không cần sử dụng dung môi. Các chất cần phân tích sẽ đƣợc chiết xuất và làm giàu trực tiếp vào sợi chiết. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm thời gian chuẩn bị mẫu và lƣợng dung môi sử dụng, và có thể cải thiện đƣợc giới hạn dò. Thuận lợi chính của phƣơng pháp là khả năng phân tích tốt, đơn giản, giá thành thấp. Sản phẩm thu đƣợc từ phƣơng pháp SPME tƣơng đối sạch và cô đặc, khả năng ứng dụng MS cao. Kỹ thuật SPME thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với GC và GC/MS. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng thành công trong việc phân tích nhiều thành phần khác nhau, đặc biệt, trong quá trình chiết xuất những thành phần hữu cơ bay hơi có trong những mẫu phân tích môi trƣờng, sinh học, thực phẩm, dƣợc phẩm. Sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME có thể đƣợc đƣa trực tiếp vào hệ thống HPLC và LC/MS để phân tích những thành phần bay hơi kém hay không bền nhiệt không thể thực hiện trên thiết bị GC hay GC/MS. Thời gian chiết xuất phụ thuộc vào các yếu tố: loại sợi chiết sử dụng, kích thƣớc mẫu, bề dày lớp polymer. Sử dụng sợi chiết có lớp polymer càng dày thì thời gian chiết xuất càng dài, nhƣng hệ số lặp lại càng cao. Thời gian chiết xuất không phụ thuộc nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu. Thông thƣờng, lớp film có bề dày mỏng nhất ở mức độ có thể chấp nhận đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để giảm thời gian chiết xuất. 2.4. SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC)  Nguyên tắc Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở khác nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử cần nghiên cứu [11]. 21 21 2.5. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng có tính quyết định rất lớn đến độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ nhạy cao, khoảng 10-6 – 10-9 g, do đó có thể xác định đƣợc những cấu phần có hàm lƣợng thấp mà các phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít [11]. 22 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH - Địa điểm: Trung tâm phân tích thí nghiệm hóa sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM, nhà lƣới thuộc trƣờng Đại học Nông Lâm. - Thời gian: tháng 3/2007 đến tháng 7/2007. 3.2. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ - Vật liệu: 4 giống lúa thơm Jasmine, VD20, ST3, OM3536. - Hoá chất sử dụng: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6- collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Merck), nonanal (Merck), hexanal (Merck), hexanol (Merck), tetradecane (Merck), octanol (Merck), decanal (Merck), pentanol (Merck), KOH (Merck). - Dụng cụ và thiết bị: Tủ mát, Darling (Việt Nam). Tủ lạnh, Hitachi (Japan). Máy bóc vỏ trấu TR200 (Nhật) Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức). Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Tủ sấy, Memmert (Đức). 23 23 Kìm đóng nắp, Mỹ. Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi 10ml, Agilent (Mỹ). Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc). Kéo, đĩa petri, khay nhựa, xô nhựa (loại 10 lít), giấy lọc Walkman, bao plastic, bình định mức 25 ml, 10ml, 50ml. 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Khảo sát sự biến đổi các hợp chất thơm ở cây lúa qua các thời kì sinh trƣởng. So sánh hàm lƣợng các hợp chất thơm giữa 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20. Xác định lại hệ số phản hồi của 2 – acetyl – 1 - pyrroline theo nồng độ 8 chất chuẩn: 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine), nonanal, hexanal, hexanol, tetradecane, octanol, decanal, pentanol. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp trồng lúa - Xử lí hạt: Ngâm hạt giống 24 giờ, để qua đêm ở nhiệt độ phòng. - Chuyển hạt sang đĩa petri có lót giấy lọc, giữ ẩm. - Sau 3 ngày, khi hạt đã nhú rễ và mầm, chuyển hạt sang cát, giữ ẩm. - Khi cây có 2-3 lá mầm, chuyển sang chậu đất (5cây/xô) và đặt trong nhà lƣới, tƣới nƣớc thƣờng xuyên (giữ lớp nƣớc khoảng 2cm). - Sau 45 ngày, tiến hành bón phân cho cây theo tỉ lệ N/P/chậu là 0.5g/0.25g/xô. 24 3.4.2. Chiết xuất hợp chất bay hơi có trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME 3.4.2.1. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME Hình 3.1. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polymer mỏng (ví dụ polydimethylsiloxane) (hình 3.1). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 3.2). 25 25 Hình 3.2. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc phải có ái lực với chất phân tích mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu. 26 3.4.2.2. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích [34]. Hình 3.3. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu (headspace) (hình 3.3). Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các 27 27 quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu. 3.4.2.3. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm [33]. Theo họ, lƣợng 2 – AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó, 80 °C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất. Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết suất là 200 µl. Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo. 28  Cách tiến hành: - Tiến hành thu mẫu lá (3 tuần/lần, 3cây/giống). - Lấy toàn bộ cả phần rễ cây, rửa sạch đất, cho vào bao plastic với một ít nƣớc ngập rễ. Bảo quản ở nhiệt độ mát. - Phân tích hàm lƣợng 2AP trong lá, hạt theo phƣơng pháp vi chiết xuất trên pha rắn SPME (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [50, 48]: + Chuẩn bị mẫu: cắt bỏ rễ, thân, cắt nhỏ 0,5g ± 0,01g lá (hoặc 1,0g ± 0,01g hạt) cho vào vial, thêm 200µl KOH 0,1N, đậy nắp. Bảo quản mẫu ở nhiệt độ mát, khi phân tích phải rã đông trƣớc 30 phút. + Thực hiện qui trình phân tích SPME-GC với chu trình nhiệt nhƣ sau: Qui trình SPME-GC Cân 0,5g lá/ 1g hạt Ủ ở 80oC trong 5phút Nhúng sợi chiết vào lọ bi trong 15phút ở 80oC Bơm mẫu vào máy GC Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME 29 29  Thuyết minh qui trình: Cân 0,5 ± 0,01g lá (hoặc 1,0g ± 0,01g hạt) cho vào lọ bi 10 ml, thêm 200 μl KOH 0,1N vào lọ, đậy nắp. Cho vào bộ giữ nhiệt của máy khuấy từ đã đƣợc thiết lập ở nhiệt độ 80 0C, 250 vòng/phút trong 5 phút. Đây là giai đoạn ủ để các chất bay hơi trong lá/ hạt và phần không khí có trong lọ đạt đƣợc pha cân bằng trƣớc khi tiến hành chiết xuất. Sau 5 phút, nhúng sợi chiết vào lọ bi. Đây chính là giai đoạn chiết xuất các chất bay hơi có trong lá/ hạt. Giai đoạn hấp phụ này kéo dài trong 15 phút ở 800C. Trong giai đoạn này các chất bay hơi trong lá/ hạt sẽ đƣợc hấp phụ vào sợi chiết. Sau khi kết thúc giai đoạn chiết xuất, bơm mẫu vào máy GC để bắt đầu giai đoạn phân tích các cấu tử bay hơi có trong lá/ hạt. Hình 3.4. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) 3.4.3. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP trong lá và hạt lúa bằng GC và GC/MS 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc định danh bằng hệ thống máy GC/MS và định lƣợng trên GC. Chƣơng trình nhiệt và các thông số thực nghiệm đƣợc điều chỉnh trên GC, các thông số này đƣợc tối ƣu hóa và áp dụng trên GC/MS. 30 3.4.3.1. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí Hình 3.5. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả . Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích của peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu. 31 31 3.4.3.2. Detector Hình 3.6. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau. Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD). Detector FID (hình 3.6) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa. Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108 – 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lƣợng ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau: Cấu trúc hình học của detector Tỉ lệ thành phần hydro/không khí Nhiệt độ của ngọn lửa 32 Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định Các hợp chất hữu cơ đƣợc đốt cháy bằng ngọn lửa hydro – không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ đƣợc trộn trƣớc với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đƣợc đặt cách vài milimet phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ đƣợc đo bằng cách đặt một hiệu điện thế giữa đầu phun của ngọn lửa và điện cực hình trụ. Để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bão hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion). Các tín hiệu tạo thành sẽ đƣợc khuếch đại bằng bộ khuếch điện tử rồi qua bộ xử lý và ghi tín hiệu. Detector FID sử dụng thích hợp nhất đối với các hợp chất chứa cacbon. 3.4.3.3. Cột mao quản Sắc ký khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phƣơng pháp sắc ký khí, đƣợc đặc trƣng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Sở dĩ nhƣ vậy là nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m,...). Cột mao quản (hình 3.7) là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh lƣu giữ lại với mức độ khác nhau,… Hình 3.7. Cột mao quản 33 33  Điều kiện chạy máy GC-FID: Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng Cột Model No: Agilent 19091J – 113 HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane, 30m x 320 μm x 0,5 μm Tốc độ dòng: 2,4ml/phút Nhiệt độ lò: 40oC Detector FID: 2500C Dòng H2: 30ml/phút Dòng không khí: 300ml/phút Dòng N2: 30ml/phút Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây.  Điều kiện chạy máy GC-MS: Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng Cột Agilent 19091J – 413 HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 m. Nhiệt độ lò: 40oC Đầu dò MS: 250oC Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. Hình 3.3 Máy sắc ký khí ghép khối ph Hình 3.9. Máy sắc ký khí ghép khối phổ HP6890N (G1540N) Hình 3.8. Máy sắc ký khí HP6890N (G1540N) 34 3.4.4. Xác định hệ số phản hồi của 2 – AP Hệ số phản hồi là thông số cần thiết để qui đổi từ diện tích peak (pA/s) sang nồng độ (µg/kg) khi định lƣợng một chất thông qua máy GC. Do hợp chất 2 – AP tồn tại ở nồng độ thấp, rất khó tổng hợp, lại không bền nên không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng. Nếu muốn sử dụng hợp chất 2 – AP để dựng đƣờng chuẩn thì phải tự tổng hợp. Do điều kiện phòng thí nghiệm chƣa đủ để tổng hợp tại chỗ hợp chất 2 – AP nên chúng tôi đã sử dụng 8 chất collidine, nonanal, hexanal, hexanol, tetradecane, octanol, decanal, pentanol (những hợp chất thơm chính có trong gạo thơm) nhƣ chất chuẩn thay thế (Ringuet, 2005). Chuẩn bị 6 dung dịch của mỗi chất chuẩn có nồng độ 0,01 mg/ml. Bơm lần lƣợt 2,0 μl mỗi dung dịch vào máy GC theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm (mục 3.4.2). Xác định hệ số phản hồi (RF) theo công thức: RF [2 – AP] (pA*s/μg) = Trung bình cộng RF [8 chất ngoại chuẩn] 3.4.5. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong lá lúa và trong hạt lúa Từ kết quả thu nhận khi phân tích sản phẩm chiết xuất trên GC, xác định hàm lƣợng 2 – AP thu đƣợc khi chiết xuất bằng phƣơng pháp SPME theo công thức (Buttery và ctv, 1986) [19]: 3.4.6. Phƣơng pháp xử lí số liệu Các số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic 7.0 và Excel. Diện tích peak chất chuẩn (pA*s) RF theo chất chuẩn (pA*s/μg) = [dd chất chuẩn] (μg/μl) * thể tích bơm (μl) Diện tích peak (pA*s) [2-AP] SPME (μg/kg) = Khối lƣợng gạo (kg) * hệ số phản hồi (pA*s/ μg) 35 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. XÁC ĐỊNH HỆ SỐ PHẢN HỒI CỦA 2 - AP THEO 8 CHẤT NGOẠI CHUẨN Phân tích 8 chất ngoại chuẩn (đƣợc pha loảng ở nồng độ 0,01 mg/ml) bằng phƣơng pháp SPME - GC. Mỗi mẫu chuẩn đều đƣợc phân tích lặp lại 6 lần, kết quả phân tích đƣợc nhận trong bảng 4.1 sau đây: Bảng 4.1. Hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn Dung dịch chất chuẩn Hệ số phản hồi (pA/μg) Collidine 8533 Nonanal 10963 Hexanal 8451 Hexanol 5141 Tetradecane 9335 Octanol 7056 Decanal 6653 Pentanol 6540 Trung bình 7834 36 collidine Hình 4.1. Sắc ký đồ GC phân tích chất chuẩn collidine (nồng độ 0,01 mg/ml) decanal Hình 4.2. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn decanal (nồng độ 0,01 mg/ml) 37 37 hexanal Hình 4.3. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanal (nồng độ 0,01 mg/ml) hexanol Hình 4.4. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn hexanol (nồng độ 0,01 mg/ml) 38 nonanal Hình 4.5. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn nonanal (nồng độ 0,01 mg/ml) octanol Hình 4.6. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn octanol (nồng độ 0,01 mg/ml) 39 39 pentanol Hình 4.7. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn pentanol (nồng độ 0,01 mg/ml) tetradecane Hình 4.8. Sắc kí đồ GC phân tích chất chuẩn tetradecane (nồng độ 0,01 mg/ml) 40 Bảng 4.2. Thời gian lƣu của 8 chất chuẩn khi phân tích trên máy GC thực hiện năm 2007 và năm 2006 (Nguyễn Thị Thu Hƣơng) Chất chuẩn Thời gian lƣu (phút) Năm 2007 Năm 2006 Collidine 13,531 13,828 Tetradecane 34,405 33,928 Octanol 18,155 18,111 Nonanal 19,878 19,693 Decanal 25,123 24,845 Hexanol 7,855 7,871 Pentanol 4,321 4,391 Hexanal 5,233 5,403  Nhận xét: Theo bảng 4.1, trung bình cộng hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn là 7834. Vì 2 – AP là chất khó tổng hợp, không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng nên chúng tôi sử dụng trung bình cộng hệ số phản hồi của 8 chất chuẩn nhƣ là hệ số phản hồi của 2 – AP (Ringuet, 2005). Trong quá trình xác định hệ số phản hồi theo 8 chất ngoại chuẩn, thời gian lƣu của các chất chuẩn ổn định và có sự sai lệch so kết quả của các nhà nghiên cứu của viện nghiên cứu CIRAD (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [50, 48], đồng thời cũng khác với kết quả của Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) thực hiện tại RIBET (Viện Công Nghệ Sinh Học và Tài Nguyên Môi Trƣờng – Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM) [1]. Nguyên nhân là do các điều kiện phân tích: loại cột sử dụng, chiều dài cột, độ tinh sạch của cột, độ tinh khiết của khí mang,...giữa 2 phòng thí nghiệm khác nhau. 4.2. ĐỊNH TÍNH HỢP CHẤT 2 – ACETYL – 1 – PYRROLINE Sau khi tiến hành kiểm tra và loại trừ đƣợc tất cả các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phân tích (phụ lục 2), chúng tôi thực hiện phân tích mẫu gạo thơm để xác 41 41 định lại thời gian lƣu của hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong điều kiện phòng thí nghiệm. Tiến hành chiết xuất mẫu gạo thơm sử dụng làm thí nghiệm theo qui trình 3.4.2. Bơm mẫu vào máy GC/MS theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME (phần 3.4.2) để xác định peak đại diện cho hợp chất 2 – AP. Hình 4.9. Sắc kí đồ GC – MS phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo thơm sử dụng làm thí nghiệm Dựa vào kết quả hình 4.9, tiến hành xác định thời gian lƣu của 3 hợp chất đặc trƣng cho các giống gạo thơm: hexanal, nonanal, 2 – AP bằng thƣ viện có trong máy GC/MS. 42 Hình 4.10. Kết quả tra cứu thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal trong thƣ viện máy GC/MS  Nhận xét: Dựa vào các kết quả hình 4.10 chúng tôi xác định đƣợc thời gian lƣu của hexanal là 4,16 phút (độ tƣơng hợp: 86%); thời gian lƣu của nonanal là 18,40 (độ tƣơng hợp: 76%). Kết quả này có sự sai lệch so với kết quả của Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) [1]. Bảng 4.3. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên máy GC/MS do Nguyễn Thị Thu Hƣơng (2006) [1] thực hiện Hợp chất Thời gian lƣu (phút) Hexanal 4,16 2 – AP 9,2 Nonanal 18,45 Tuy nhiên, không xác định đƣợc 2 – AP, nguyên nhân là do sau khi qua buồng MS, hợp chất 2 – AP bị bắn phá thành nhiều mảnh có khối lƣợng khác nhau. Dựa vào nguyên tắc hoạt động của máy GC/MS, một hợp chất sẽ đƣợc chuyển thành trạng thái hơi sau đó chuyển thành những mảnh ion phân tử. Do đó, 43 43 chúng tôi tiến hành kiểm tra những mảnh ion phân tử này từ phút thứ 4,17 đến phút thứ 18,4 (do thời gian lƣu của 2 – AP là 9,2 phút - Bảng 4.3) nhằm xác định các mảnh ion phân tử của 2 – AP. Theo Bergman và CS. (2000), hợp chất 2 – AP có mảnh ion phân tử tại m/z 111 và với sự mất đi HCN sẽ tạo ra mảnh ion tại m/z 83. Theo Yoshihashi và CS. (2001), mảnh ion phân tử tại m/z 111 là hợp chất 2 – AP. Theo Buttery và CS. (1982), hợp chất 2 – AP tồn tại với sự hiện diện của mảnh ion phân tử tại m/z 111 và các mảnh ion phân tử khác tại m/z 43, 55, 67, 69. Hình 4.11. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,184 phút của mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm 44 Hình 4.12. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline (A: Tanchotikul and Hsieh, 1991; B: Varaporn và Sarath, 1993) [64, 68]  Nhận xét: Dựa vào phổ đồ phân tích mẫu gạo thơm, tra cứu trên thƣ viện máy GC/MS, chúng tôi xác định đƣợc hợp chất phân tách ở thời điểm 9,184 phút của mẫu gạo thơm sử dụng thí nghiệm có phổ tƣơng tự nhƣ phổ của hợp chất 2-AP đã đƣợc Tanchotikul và Hsieh (1991), Varaporn và Sarath (1993) đã phát hiện [64, 68] (hình 4.12). Do đó, có thể kết luận hợp chất 2 – AP xuất hiện ở thời điểm 9,184 phút khi phân tích trên hệ thống GC/MS. Bảng 4.4. Thời gian lƣu (phút) của hexanal, nonanal có trong mẫu gạo thơm khi phân tích trên máy GC/MS và GC Hợp chất GC/MS GC Hexanal 4,16 4,56 Nonanal 18,4 19,8  Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích trên hệ thống GC (hình 4.14) và GC/MS (hình 4.13) của mẫu gạo thơm sử dụng, chúng tôi xác định đƣợc thời điểm xuất hiện của 2 hợp chất hexanal và nonanal trên hệ thống GC lần lƣợt là 4,56 và 19,8 phút. Kết quả 45 45 nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal, nonanal trong mẫu gạo khi phân tích tại Pháp và tại Việt Nam. Nguyên nhân là do có sự khác biệt về kích thƣớc cột và loại khí mang sử dụng trong phân tích. nonanal hexanal Hình 4.13. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC/MS hexanal nonanal Hình 4.14. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC 46  Xác định thời gian lưu của 2 – AP trên máy GC Dựa trên kết quả xác định ở phần 4.1, peak của collidine xuất hiện ở thời điểm 13,5 phút khi phân tích trên máy GC. Theo kết quả nghiên cứu của C. J. Bergman (2000), Casey C. Grimm và CS. (2000), hợp chất thơm 2 - AP sẽ xuất hiện trƣớc peak của chuẩn collidine từ 2 – 3 phút, nên có thể dự đoán rằng hợp chất 2 – AP sẽ xuất hiện vào thời điểm khoảng từ 9 đến 11 phút. So sánh sự chênh lệch về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC và GC/MS, chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian chênh lệch là 0,4 đến 1,4 phút. Nhƣ vậy, có thể nhận định peak của hợp chất thơm 2-AP sẽ xuất hiện trong khoảng thời điểm từ 9,5 đến 10,5 phút. Dựa vào sắc ký đồ GC phân tích mẫu gạo thơm sử dụng (phụ lục 3 – 10), so sánh với sắc kí đồ phân tích trên GC/MS và GC chúng tôi kết luận đƣợc thời gian lƣu của hợp chất 2 – AP khi phân tách bằng GC là 9,8 phút ở điều kiện phòng thí nghiệm. hexanal nonanal 2 – AP Hình 4.15. Kết quả phân tích mẫu gạo thơm trên máy GC 47 47 Bảng 4.5. Thời gian lƣu của hexanal, 2 – AP, nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC/MS và GC Hợp chất GC/MS GC Hexanal 4,16 4,56 2 – AP 9,18 9,8 Nonanal 18,40 19,8 4.3. KHẢO SÁT VÀ SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 – AP CÓ TRONG CÂY LÚA QUA CÁC THỜI KÌ PHÁT TRIỂN CỦA CÂY LÚA Ở 4 GIỐNG: JASMINE, OM3536, ST3 VÀ VD20 4.3.1. Khảo sát sự biến đổi hàm lƣợng 2 - AP ở cây lúa qua các thời kì tăng trƣởng Bảng 4.6. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa theo các thời kì tăng trƣởng của lúa ở 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Giai đoạn tăng trƣởng Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Giai đoạn mọc 0.574 12.583 9.121 12.052 Giai đoạn làm đốt 9.963 15.767 9.387 12.095 Giai đoạn làm đòng 13.085 21.785 14.297 14.974 Giai đoạn nở hoa 13.414 23.573 18.512 16.869 Giai đoạn chín sáp 10.592 18.173 9.750 14.685 48 2-AP Hình 4.16. Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong lá lúa (mẫu OM3536)  Nhận xét: Dựa vào bảng 4.6, nồng độ 2 – AP trong lá lúa tăng qua các giai đoạn tăng trƣởng, cao nhất là ở giai đoạn nở hoa (thuộc thời kì sinh trƣởng sinh thực của cây lúa), sau đó giảm ở giai đoạn chín sáp (thời kì lúa chín) nhƣng vẫn cao hơn so với nồng độ 2 – AP trong lá lúa ở thời kì sinh trƣởng sinh dƣỡng. Bảng 4.7. Nồng độ 2 – AP trong hạt lúa qua các giai đoạn phát triển từ bông lúa thành hạt lúa Giai đoạn phát triển Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Giai đoạn làm đòng 0.772 0.437 0.992 1.473 Giai đoạn nở hoa 0.801 1.369 1.531 1.613 Giai đoạn chín sữa 1.356 2.243 1.690 1.646 Giai đoạn chín sáp 2.516 3.475 1.975 2.244 Giai đoạn chín hoàn toàn 6.928 4.303 4.388 3.674 49 49 2-AP Hình 4.17.Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP trong hạt lúa ở giai đoạn chín (mẫu Jasmine)  Nhận xét: Bảng 4.7 cho thấy nồng độ 2 – AP trong hạt lúa tăng dần qua các giai đoạn phát triển và cao nhất là ở giai đoạn chín hoàn toàn. Ở giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng và giai đoạn sinh trƣởng sinh thực, các chất dinh dƣỡng có trong cây lúa đều tập trung nuôi dƣỡng, phát triển thân và lá lúa nên hàm lƣợng 2 – AP trong lá cao (cao nhất là ở giai đoạn sinh trƣởng sinh thực). Sau đó, đến giai đoạn chín, bông lúa bắt đầu nở hoa và hình thành hạt, tất cả các dƣỡng chất có trong cây lúa đều đƣợc sử dụng để nuôi hạt nên hàm lƣợng 2 – AP trong hạt lúa sẽ tăng dần theo sự phát triển của hạt. 50 4.3.2. So sánh hàm lƣợng 2 - AP qua các thời kì sinh trƣởng, phát triển của cây lúa ở 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 0 5 10 15 20 25 mọc làm đốt làm đòng nở hoa chín sáp Giai đoạn sinh trƣởng Nồ ng độ 2 - AP (µ g/ kg ) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Biểu đồ 4.1. So sánh nồng độ 2 – AP trong lá qua các thời kì tăng trƣởng ở 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 4.6 và biểu đồ 4.1 cho thấy giống OM3536 có nồng độ 2 – AP trong lá lúa cao nhất so với 3 giống còn lại, kế đến là ST3 và VD20, Jasmine có nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp nhất trong 4 giống phân tích. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa ở cả 4 giống đều tăng qua các thời kì tăng trƣởng và cao nhất là ở giai đọan nở hoa (thời kì sinh trƣởng sinh thực) và giảm ở giai đọan chín sáp (thời kì chín), trong đó ST3 có mức giảm nồng độ 2 – AP trong lá lúa cao nhất so với 3 giống Jasmine, VD20 và OM3536, VD20 có mức giảm nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp nhất trong 4 giống, kế đến theo thứ tự lần lƣợt là Jasmine và OM3536. 51 51 0 1 2 3 4 5 6 7 8 làm đòng nở hoa chín sữa chín sáp chín hoàn toàn Giai đoạn phát triển Nồ ng độ 2 - A P (µ g/ kg ) Jasmine OM3536 ST3 VD20 Biểu đồ 4.2. So sánh nồng độ 2 – AP trong hạt qua các giai đoạn phát triển hạt của giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Bảng 4.7 và biểu đồ 4.2 cho thấy giống lúa Jasmine có nồng độ 2 – AP trong hạt cao nhất so với 3 giống còn lại, OM3536 và ST3 có nồng độ 2 – AP trong hạt lúa xấp xỉ bằng nhau, VD20 có nồng độ 2 – AP trong hạt thấp nhất. Nhìn chung, các giống lúa đều có nồng độ 2 – AP trong hạt tăng dần qua các giai đoạn phát triển. 4.4. SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 - AP CÓ TRONG LÁ LÚA VÀ LÁ DỨA Dựa trên kết quả phân tích hàm lƣợng 2 - AP có trong lá dứa do Nguyễn Thị Thu Hƣơng thực hiện (2006) tiến hành so sánh hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa với hàm lƣợng 2 - AP có trong lá lúa 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 ở giai đoạn lúa nở hoa (giai đoạn hàm lƣợng các hợp chất thơm có trong lá lúa cao nhất). 52 2 – AP Hình 4.18. Sắc kí đồ GC phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa (Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2006) Bảng 4.8. Hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa và trong lá của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Lá Nồng độ 2 – AP (µg/kg) Dứa 1270,9 Jasmine 13,414 OM3536 23,573 ST3 18,512 VD20 16,869 53 53 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Dứa Jasmine OM3536 ST3 VD20 nồ ng độ 2 - AP (µ g/ kg ) Biểu đồ 4.3. So sánh hàm lƣợng 2 – AP có trong lá dứa và trong lá lúa của 4 giống Jasmine, OM3536, ST3, VD20  Nhận xét: Dựa vào bảng 4.8 và biểu đồ 4.3, nồng độ 2 – AP trong lá dứa cao hơn rất nhiều lần so với nồng độ 2 – AP có trong lá lúa. Điều này giải thích đƣợc cho thói quen bỏ lá dứa vào khi nấu cơm, nhằm làm tăng hƣơng thơm của gạo sau khi nấu. 54 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1.1. Định tính 2 – AP Xác định đƣợc hệ số phản hồi của 2 – AP theo 8 chất ngoại chuẩn là 7834. Xác định lại thời gian lƣu của 2 – AP khi phân tích trên máy GC theo điều kiện phòng thí nghiệm là 9,8 phút. 5.1.2. Phân tích hàm lƣợng 2 – AP có trong lá và trong hạt của 4 giống lúa Jasmine, OM3536, ST3, VD20 Nồng độ 2 – AP có trong lá lúa tăng theo các giai đoạn phát triển của cây lúa và đạt cao nhất khi lúa ở giai đoạn nở hoa, sau đó giảm khi lúa bắt đầu tạo hạt nhƣng vẫn cao hơn so với các giai đoạn tăng trƣởng ban đầu. Nồng độ 2 – AP có trong hạt lúa tăng theo các giai đoạn hình thành hạt, cao nhất khi hạt lúa ở giai đoạn chín. Giống lúa OM3536 có nồng độ 2 – AP trong lá cao nhất so với 3 giống lúa còn lại, kế đến lần lƣợt theo thứ tự là giống lúa VD20 và Jasmine, ST3 là giống lúa có nồng độ 2 – AP trong lá thấp nhất trong nhóm 4 giống lúa đƣợc phân tích. Jasmine có nồng độ 2 – AP trong hạt cao nhất, OM3536 và ST3 có nồng độ 2 – AP trong hạt xấp xỉ bằng nhau, VD20 có nồng độ 2 – AP trong hạt thấp nhất trong 4 giống lúa thử nghiệm. Nồng độ 2 – AP trong lá lúa thấp hơn rất nhiều (0,014%) so với trong lá dứa. Vì vậy, có thể nghiên cứu sử dụng lá dứa để chiết xuất 2 – AP. 55 55 5.2. ĐỀ NGHỊ Thử nghiệm việc tổng hợp chuẩn 2 – AP nhằm đánh giá khách quan và chính xác hơn hợp các hợp chất thơm có trong gạo thơm. Tiếp tục xây dựng và thực hiện phƣơng pháp SDE (Simultaneous steam Distillation and solvent Extraction) để so sánh với phƣơng pháp SPME. Khảo sát các đặc điểm hóa sinh quan trọng khác nhƣ: hàm lƣợng amylose, nhiệt độ hóa hồ, độ bền thể gel để có đƣợc đánh giá tốt hơn về chất lƣợng gạo thơm. Thử nghiệm sử dụng phƣơng pháp SPME để tiến hành chọn lọc các giống lúa thơm chất lƣợng cao. Xác định nguồn gốc sinh tổng hợp 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở lúa. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, 2006. Khảo sát đặc điểm hoá lý - hóa sinh và phân tích chất lượng mùi thơm của gạo Nàng thơm Chợ Đào bằng phương pháp SPME – GC. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. PGS. TS. Nguyễn Thị Lang, GS. TS. Bùi Chí Bửu, 2005. Cây giống và sản xuất hạt giống tốt. Nhà xuất bản Nông nghiệp. tr. 18 – 25. 3. Lê Doãn Diên, 1990. Vấn đề chất lượng lúa gạo. Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật và Quản Lý Kinh Tế, NN – CNTP 2/90. tr. 96 – 98. 4. Trần Văn Đạt, 2002. Tiến trình phát triển sản xuất lúa gạo tại Việt Nam từ thời nguyên thủy đến hiện đại. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh. 5. PTS. Trƣơng Đích, ThS Đỗ Khắc Thịnh, KS Nguyễn Quốc Lý, 1994. Giống lúa thơm đặc sản, giống lúa xuất khẩu và chất lượng cao. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. tr. 21 – 22. 6. Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thị Thƣ, 2000. Hóa sinh học nông nghiệp. Nhà xuất bản Giáo Dục. tr. 168 – 172. 7. Nguyễn Văn Hoan, 2003. Cây lúa và kỹ thuật thâm canh. Nhà xuất bản Nghệ An. tr. 10. 8. Đỗ Khắc Thịnh, 2001. Tình hình sản xuất các giống lúa thơm đặc sản Việt Nam và một số nƣớc trên thế giới. Báo cáo Hội nghị giống lúa ĐBSCL lần VII, 2/2001. 9. Đỗ Khắc Thịnh, 2003. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố môi trường đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sông Cửu Long. Luận án Tiến Sĩ Nông Nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 175 trang. 10. Nguyễn Trung Vãn, 2001. Lúa gạo việt nam trước thiên niên kỷ mới – hướng xuất khẩu. Nhà xuất bản Chính trị quốc gia, Hà Nội. 57 57 11. Phạm Hùng Việt, 2004. Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 264 trang. 12. Federic GAY, Phan Phuoc Hien, Christian Mestres, M. Languerre, J. Ringuet. Nghiên cứu phát triển các phƣơng pháp kết hợp phân tích mùi thơm của gạo. Tuyển Tập các công trình Hội nghị Khoa học và Công nghệ Hóa Hửu cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà nội 11-2005 (tr. 450-455). TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13. Adair C. R., Beachell H. M., Jodon N. E., Johnston T. H., Thysell J. R., Green V. E. Jr., Webb B. D. and Atkins J. G., 1996. Rice breeding and testing methods in the U.S. In: U.S. dept. of Agric. Rice in the U.S.: Varieties and production. USDA Agr. Res. Serv. Handbook 289. p. 19 – 64. 14. Ayano K. and Tsuzuki E., 1976. Components of aroma, in chapter 3 Inher. Physio. Ch. 437 – 440. Science of the rice plant. Vol 3. Genetics, Food and Agri. Policy Res. Center, 1997. Tokyo, Japan. 15. Bangwaek C., Vergara B. S. and Robles R. P., 1994. Effect of temperature regime on grain chalkiness in rice. IRRI 19 (4). p. 8. 16. Bergman C. J., Delgado J. T., Bryant R., Grimm C.; Cadwallader K. R., and Webb B. D., 2000. Rapid gas chromatographic technique for quantifying 2 – acetyl – 1 – pyrroline and hexanal in rice (Oryza sativa, L.). Cereal Chemistry 77 (4). p. 454 - 458. 17. Bhattacharya K. R., 1980. Breakage of rice during milling: A review. Trop. Sci. 22. p. 255 – 276. 18. Bullard R.W. and Holguin G., 1977. Volatile components of unprocessed rice (Oryza sativa). J. Agric. Food Chem. 25. p. 99. 19. Buttery R. G. and Ling L. C., 1982. 2- acetyl – 1 – pyrroline: an important aroma component of cooked rice. Chemistry and Industry. p 958. 20. Buttery R. G., Ling L. C., Juliano B. O., and Turnbaugh J. G.; 1983a. Cooked rice aroma and 2 – acetyl – 1 – pyrroline. J. Agric. Food Chem 31. p 823 – 826. 21. Buttery R. G., Juliano B. O., and Ling L. C., 1983b. Identification of rice aroma compound 2 – acetyl – 1 – pyrroline in pandan leaves. Chem. Ind. (Lond.) 23. p. 478 – 479. 22. Buttery R. G., Ling L. C., and Mon T. R., 1986. Quantitative analysis of 2 – acetyl – 1 – pyrroline in rice. J. Agric. Food Chem. 34. p. 112 – 114. 58 23. Buttery R. G., Turnbaugh J. G. and Ling L. C., 1988. Contributions of volatiles to rice aroma. J. Agric. Food Chem. 36. p. 1006 – 1009. 24. Canellas L. P., Santos G., and Merchezan E., 1997. Effect of management practices on yield and commercial quality of grains of irrigated rice. Ciencia Rural 27. p. 375 – 379. 25. Central Food Technological Research Institute (CFTRI), 1985. Annual Report for 1984 – 1985, Mysore, India. 26. Chang T. T. and Somrith B., 1979. Genetic studies on the grain quality of rice. Proceeding of the workshop on chemical aspects of rice grain quality,.IRRI, Los Banos, Philippines. p. 49 – 58. 27. Daniels M. J., Marks P. P., Meullenet J. F., and Siebenmorgen T. J., 1997. Effects of rice storage history on the end use quality of long grain rice. Research Series – Arkansas Agricultural Experimental Station 456. p. 152 – 157. 28. De Datta S. K., Obeemea W. N, and Jana R. H, 1972. Protein content of rice grain as affected by nitrogen fertilizer and triazines and substituted ureas. J. Agron 64. p. 785 – 788. 29. Del Rosario A. R., Briones V. P., Vidal A. J. and Juliano B. O., 1968. Composition and endosperm structure of developing and mature rice kernel. Ceral Chem. 45. p. 225 – 235. 30. Do Thu Hien, Michel Jacobs, Geert Angenon, Christian Hermans, Tran Thanh Thu, Le Van Son, Nancy Helene Roosens, 2003. Proline accumulation and Δ1- pyrroline-5-carboxylate synthetase gene properties in three rice cultivars differing in salinity and drought tolerance. Plant science 165. p. 1059 – 1068. 31. Ericksson J. R., 1968. Annual report, Rice Genet. Invest., Rice Expt. Sta. Biggs, California. 32. Food Agriculture Organization, 2005. Summary of world food and agriculture statistics 2003. Food Agriculture Organization, Rome. p. 101 33. Gay F., Mestres C., Phan Phuoc Hien, Laguerre M. and Ringuet J. Development of semi-quantative methods to analyse rice aroma. International Workshop on Biotechnology in Agriculture, hosted by University of Agriculture and Forestry October 20 th 2006 HCMC Viet nam (p. 178-181) 59 59 34. Gomez K. A. and De Datta S. K., 1975. Influence of environment on protein content of rice. J. Agron. 67. p. 565 – 568. 35. Grimm Casey C., Christine Bergman, Janis T. Delgado, and Rolfe Bryant, 2001. Screening for 2 – acetyl – 1 – pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC – MS. J. Agric. Food Chem 49. p. 245 – 249. 36. Gyorgy Vas and Karoly Vekey, 2004. Solid-phase microextraction: a powerful sample preparation tool prior to mass spectrometric analysis. Journal of mass spectrometry 39. p. 233 – 254. 37. Hussain A., Naqvi S., Hammerschmidt F.J., 1987. Isolation and identification of volatile flavor components from Basmati rice. In: Martens M., Dalen G.A., Russwurm H. (ed.). Flavour science and technology. p. 95 – 100. John Wiley and sons, NewYork. 38. Huysmans A. C., 1965. Milling quality of paddy rices as influenced by timing of the harvest. Inst. Rice Comm. Newsl. 14(3). p. 4. 39. Juliano B. O, 1972. Physicochemical properties of starch and protein in relation to grain quality and nutrition value of rice. In: Rice breeding, IRRI, Manila, Philippines. p. 389 – 404. 40. Juliano B. O., 1985. Rice: chemistry and technology. 2nd ed. Am. Associ. Cereal chemists. St. Pant, MN. p. 774. 41. Kaul A. K., 1970. Early generation testing for quality characteristics. Rice Indian J. Genet. Plant breed. 30 (2). P. 237 – 243. 42. Khush G. S., Paule C. M and Dela Crus N. M, 1979. Rice grain quality evaluation and improvement at IRRI. Proceeding of the workshop on chemical aspects of rice grain quality, IRRI, Los Banos, Philippines. p. 21 – 31. 43. Kim C. Y., 1999. A study on the Growth Characteristics and Analysis of Chemical Compounds of Grains as Affected by Cultivation Method in Coloured and Aromatic Rice Varieties. Ph.D. Thesis submitted to Chungnam National University, Taejeon Korea. p. 112. 44. Krupp H. K., Abilay W. P, and Alvarez E. I, 1972. Some water stress effects on rice. p. 663 – 675 in International Rice Research Institute. Rice Breeding, Los Banos, Philippines. 60 45. Lorieux M., Petrov M., Huang N., Guiderdou E., Ghesquiere A., 1996. Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor. Appl. Genet. 93. p. 1145 – 1151. 46. Mann R. F., 1987. Basmati rice: wonder of Pakistan’s agriculture. IRRC Newslt. 36. p. 23 – 28. 47. Paillard N., 1981. Factors influencing flavor formation in fruits. In: Schreier P. (ed.), Flavour 81. p. 478 – 493, de Gruyter W., Co., Berlin. 48. Paule C. M. and Powers J. J., 1989. Sensory and chemical examination of aromatic and nonaromatic rices. Journal of food science 54 (2). p. 343 – 346. 49. Petrov M., Marc Danzart, Pierre Giampaolo, Jacques Faure, Hubert Richard, 1996. Rice aroma analysis: discrimination between a scented and a non – scented rice. Sciences Des Aliments 16. p. 347 – 360. 50. Phan Phuoc Hien, 2005. Methodes d’analysis des arômes du riz.. CIRAD, Montpeller, France. 39 pages. 51. Rahim M. A, Sultan M. K., and Siddique A. K., 1995. Study on rice grain quality affected by time of harvest. Bangladesh J. Sci. Indust. Res 30. p. 111 – 119. 52. Ringuet J., 2005. Optimisation d’une méthode de dosage de l’arôme du riz par SPME. Research Msc report. Montpeller University, France. 38 pages. 53. Romanczyk L. J., McClelland C. A., Post L. S., Aitken M., 1995. Formation of 2 – acetyl 1 – pyrroline by several Bacillus cereus strains isolated from cocoa fermentation boxes. J. Agric. Food Chem. 43. p. 469 – 475. 54. Sarkarung S., Somrith B., and Chitrakorn S., 2000. Aromatic rices of Thailand, Aromatic rices (Singh R. K., Singh, U. S., Khush G. S.). Oxford and Publishing Co. Pvt. Ltd., Chaman Enterprises, 1603, Pataudi House, darya Ganj, new Delhi- 110 002. p. 180 – 183. 55. Schieberle P., 1989. Formation of 2 – acetyl 1 – pyrroline and other important flavor compounds in wheat bread crust. In: Parliment T. H., McGorrin R. J., Ho C. T. (ed), Thermal generation of aromas. p. 269 – 275, ACS Symposium series 409, Washington. 56. Schieberle P., 1990. The role of free amino acids present in yeast as precursors of the odorants 2 – acetyl – 1 – pyrroline and 2 – acetyltetrahydropyridine in wheat bread crust. Z