Khóa luận Khảo sát khả năng ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhận hợp chất Anthraquinone

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003-2007 Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ THU Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SEỌ TAỌ DIC̣H HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHÂṆ HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI VĂN LỆ HOÀNG THỊ THU TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ThS. QUÁCH NGÔ DIỄM PHƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc hoàn thành với s ự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn . Em xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành đến: PGS.TS Bùi Văn Lê ̣ , ngƣời đa ̃tâṇ tình hƣớng dâñ và taọ moị điều kiêṇ để em thƣc̣ hiêṇ khóa luâṇ này. Thạc sĩ Quách Ngô Diễm Phƣơng, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ dạy và luôn động viên em trong những hoàn cảnh khó khăn nhất. Đề tài này đƣợc hoàn thành với rất nhiều nhiệt tình và tâm huyết của chị. Cảm ơn chị vì tất cả. Em cảm ơn Tiến sĩ Phan Phƣớc Hiền, những chỉ dạy và giúp đỡ của thầy đã giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Thạc sĩ Kiều Phƣơng Nam, ngƣời luôn gợi ý và cho em những lời khuyên bổ ích. Em cảm ơn anh Điền , anh Hoàng , anh Cƣờng và các anh chi ̣ phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sin h hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , ĐH Nông Lâm TP . HCM. Cảm ơn vì những giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong suốt thời gian chúng em thƣc̣ tâp̣. Cảm ơn anh Bình cùng toàn thể các bạn sinh viên năm tƣ trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên , ĐH Mở luôn sẵn sàng giúp đỡ và đôṇg viên tôi nhƣ̃ng lúc găp̣ khó khăn trong đề tài. Cảm ơn lớp CNSH 29 thân yêu và các baṇ thân đa ̃cùng tôi chia sẻ tất cả nhƣ̃ng nỗi buồn vui suốt bốn năm đaị hoc̣. Và trên hết , con cảm ơn bố m ẹ, chị gái và em trai yêu quý đã luôn chăm lo , ủng hộ, tin tƣởng con , cảm ơn cả nhà vì đã cho con chỗ dựa vững chắc nhất trong cuôc̣ sống. Tháng 9/2007 Hoàng Thị Thu iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cƣ́u “Khảo sát khả năng ƣ́ng duṇg ky ̃thuâṭ nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù cây Drosera burmanni Vahl trong thu nhâṇ hơp̣ chất anthraquinone” đƣơc̣ tiến hành taị trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên , Đaị hoc̣ Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh và phòng sắc ký , Viêṇ Công nghê ̣Sinh hoc̣ và Công nghê ̣Môi trƣờng , Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh tƣ̀ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Kết quả thu đƣơc̣: - Mô seọ tƣ̀ mâũ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni Vahl đƣơc̣ hình thành trên môi trƣờng khoáng cơ bản Gamborg’s B5 bổ sung: NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l), đƣờng 20 g/l, PVP (1,25 mg/l) ở pH 5,8, trong điều kiêṇ ủ tối. - Các kỹ thuật sắc ký cột , sắc ký bản mỏng đƣơc̣ sƣ̉ duṇg nhằm cô lâp̣ và ly trích hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni in vitro. Hơp̣ chất này đ ƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu để định lƣợng anthraquinone trong các thành phần khác nhau của cây Drosera burmanni Vahl. - Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinone bằng kỹ thuâṭ HPLC cho thấy : hàm lƣơṇg anthraquinone trong rê ̃là 3,03% so với troṇg lƣơṇg khô, nhiều hơn trong thân lá (2,78%); ở cây không có sắc tố đỏ là 2,8% trong khi ở cây có sắc tố đỏ là 0,78%; trong sinh khối huyền phù tế bào là 0,02% ( so với troṇg lƣơṇg tƣơi ), trong khi không thấy có sƣ ̣hiêṇ diêṇ của anthraquinone trong dic̣h môi trƣờng . v SUMMARY The thesis “Study on application of callus and suspension cultures in Drosera burmanni Vahl to produce anthraquinone compound” was carried out at Plant Biotechnology lab, University of Natural Sciences; and Chromatography room, Research Institute for Biotechnology and Enviromental Technology, University of Agriculture and Forestry, HCM city from March to August, 2007. Results: - Callus of D. burmanni Vahl was cultured successfully by using Gamborg’s B5 medium (modified) supplemented with NAA (0,2 mg/l), 2,4-D (0,2 mg/l), succrose (20g/l), PVP (1,25 mg/l), pH was adjusted to 5,8 before autoclaving. - Column Chromatography and Thin Layer Chromatography were used to purify anthraquinone compound in D. burmanni. This compound was used as authentic sample for HPLC technique. - Roots of D. burmanni contained 3,01% dry weight (DW) of anthraquinone, larger than 2,78% in leaves. - Anthraquinone content of red-leaf D. burmanni Vahl took 0,78% of DW, compared with 2,78% DW in green-leaf trees. - Biomass of D. burmanni’s suspension contained 0,02% of fresh weight of anthraquinone, while no quantifiable amounts of anthraquinone has been found in spent medium. Ho Chi Minh city, September, 2007. Hoang Thi Thu vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tƣạ ..................................................................................................................... .i Lời cảm ơn ................................................................................................................. iii Tóm tắt ..................................................................................................................... iv Summary ..................................................................................................................... v Mục luc̣ ..................................................................................................................... vi Danh sách các chƣ̃ viết tắt .......................................................................................... ix Danh sách các hình ..................................................................................................... x Danh sách các sơ đồ và biểu đồ ................................................................................ xii Danh sách các bảng .................................................................................................. xiii Chƣơng1: MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .......................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................ 2 1.4. Ý nghĩa đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl .......................................................... 3 2.1.1. Vị trí phân loại................................................................................................ 3 2.1.2. Phân bố ........................................................................................................... 3 2.1.3. Mô tả hình thái ............................................................................................... 4 2.1.4. Đặc tính sinh học ............................................................................................ 6 2.1.5. Đặc điểm sinh thái .......................................................................................... 7 2.1.6. Thành phần hóa học ....................................................................................... 8 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống .............................................................................. 11 2.1.8. Tầm quan trọng ............................................................................................ 12 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái ...................................................................................... 12 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật ................................................. 12 2.1.8.3. Gía trị dƣợc tính ........................................................................................... 12 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp ........................................................................ 14 2.1.8.5. Gía trị kinh tế................................................................................................ 15 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc ............................................................ 16 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp ........................................................................................................ 17 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp ......................................................................... 17 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo ........................................................................................... 18 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo ......................................................................................... 18 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo .................................................................... 19 2.2.3. Nuôi cấy dịch huyền phù .............................................................................. 19 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào ......................................................................... 19 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù ............................................................................ 19 vii 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào ............................... 20 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay ......................................... 20 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp .................................................................................................. 22 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù ........................................................................................................... 22 2.2.4.1. Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy ..................................................................... 22 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao ......................................... 22 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất ......................................................................................... 22 2.2.4.4. Cố định tế bào ............................................................................................. 23 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hóa mô ............................................................................ 23 2.2.4.6. Nhân tố cảm ứng (elicitor) .......................................................................... 23 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn .................................................... 24 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích – thu nhận hợp chất .................................................. 24 2.3.1.1. Sắc ký cột .................................................................................................... 24 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry Column Flash Chromatography) ..................... 26 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế ........................................................................... 27 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp ..... 28 Chƣơng 3: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 31 Thời gian và địa điểm thực hiện ................................................................................ 31 3.1. Nuôi cấy mô sẹo, tạo dịch huyền phù ......................................................... 31 3.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 31 3.1.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 33 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 33 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 34 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 35 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 36 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 37 3.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 38 3.2.1. Vật liệu ........................................................................................................ 38 3.2.2. Phƣơng pháp ................................................................................................ 39 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC .............. 40 3.3.1. Vật liệu ........................................................................................................ 40 3.3.2. Phƣơng pháp ............................................................................................... 40 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp......................................... 40 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 41 viii 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone ........................................................................... 41 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 43 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ............................................... 44 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................ 45 3.4. Xử lý thống kê ............................................................................................. 45 Chƣơng 4: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN .................................................................. 46 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù ........................................................... 46 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng .......................................... 46 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ........................................................................................... 48 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ............................................................. 49 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù ........................................................... 54 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo................................................................................ 56 4.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni ............ 58 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC ............................. 59 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn ............................................................................... 59 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơṇg hợp chất anthraquinone ................................................................................... 61 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro .................................................................... 62 4.3.4. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ ...................................................... 64 4.3.5. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 ............................................................. 66 Chƣơng 5: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ ................................................................... 68 5.1. Kết luận ....................................................................................................... 68 5.1.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù .......................................................... 68 5.1.2. Định lƣợng hợp chất anthraquinone bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC ......... 68 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 70 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHƢ̃ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-benzylaminopurine CRD : Completely Randomized Design (Hoàn toàn ngẫu nhiên) ctv : cộng tác viên HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng ao áp) IAA : 3-indolyl-acetic acid IBA : 3-indolebutyric acid MS : Murashige & Skoog, 1962 NAA : naphthalene acetic acid PVP : poly vinyl pyrrolidone TCL : Thin Cell Layer (Lớp mỏng tế bào) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký bản mỏng) x DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới .................. 4 Hình 2.2. Hình thái của Drosera burmanni Vahl .................................................... 4 Hình 2.3. Lá D. burmanni ........................................................................................ 5 Hình 2.4. D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên. ........................................................... 7 Hình 2.5. Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside ............ 10 Hình 2.6. Môṭ số loaị Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới ......................... 15 Hình 2.7. Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc ................... 21 Hình 2.8. Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm ........................................... 21 Hình 2.9. Sắc ký côṭ ............................................................................................... 24 Hình 2.10. Mô hình sắc ký nhanh côṭ khô ............................................................. 26 Hình 2.11. Sắc ký lớp mỏng ................................................................................... 27 Hình 2.12. Sơ đồ hoaṭ đôṇg các bô ̣phâṇ của máy HPLC ...................................... 29 Hình 3.1. Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro ................................................ 31 Hình 4.1. Mô seọ đƣơc̣ hình thành tƣ̀ mâũ lớp mỏng cây D.burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣thay đổi ..................................................................................................... 52 Hình 4.2. Mô seọ đƣơc̣ hình thành tƣ̀ mâũ lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni trên môi trƣờng Gamborg’s B5 bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D với nồng đô ̣thay đổi ............................................................................................... 53 Hình 4.3.A. Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc .............................................. 55 Hình 4.3.B. Cụm tế bào quan dƣới kính hiển vi 40X. ........................................... 55 Hình 4.3.C. Tế bào đơn quan dƣới kính hiển vi 40X .............................................. 55 Hình 4.4. Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô seọ cây D. burmanni ........................................................................................ 57 Hình 4.5. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm ................... 60 Hình 4.6. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ................... 60 xi Hình 4.7. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm ................... 60 Hình 4.8. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm ................... 60 Hình 4.9. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở ở 70 ppm ................ 60 Hình 4.10. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A. ............................................................................................................ 61 Hình 4.11. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B .............................................................................................................. 61 Hình 4.12. Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl ........................... 63 Hình 4.13. Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl .................... 63 Hình 4.14. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl có sắc tố đỏ. .......... 65 Hình 4.15. Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni Vahl không có sắc tố đỏ. ............................................................................................................ 65 Hình 4.16. Sắc ký đồ HPLC của mẫu dịch môi trƣờng sau khi lọc sinh khối tế bào ...................................................................................................... 66 Hình 4.17. Sắc ký đồ HPLC của sinh khối tế bào từ dịch huyền phù. ................... 66 xii DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BIỂU ĐỒ TRANG SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Con đƣờng tổng hơp̣ các hơp̣ chất thƣ́ cấp ở thƣc̣ vâṭ ........................ 18 Sơ đồ 3.1. Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone .......................... 39 Sơ đồ 3.2. Quy trình xƣ̉ lý mâũ ............................................................................ 42 Sơ đồ 3.3. Quy trình xƣ̉ lý dic̣h huyền phù .......................................................... 45 Sơ đồ 3.4. Quy trình ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone (kết quả) ........... 58 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy ................................................................................... 46 Biểu đồ 4.2. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy .... 54 ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1. Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak ..................................................................... 59 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone ..................................................................................................... 8 Bảng 2.2. Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera ................... 9 Bảng 2.3. Dƣợc tính và một số hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera ............................................................................................... .13 Bảng 3.1. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng ....................................... 33 Bảng 3.2. Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo ............................................................... 34 Bảng 3.3. Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo ..................................... 35 Bảng 3.4. Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo ................................................................................ 36 Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo ................................................................... 37 Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................... 43 Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ ................................................................ 44 Bảng 4.1. Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy ................... 46 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ................................................................................................ 47 Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng ............................................................................................................. 48 Bảng 4.4. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên các môi trƣờng sử dụng kết hợp 2 loại hormone khác nhau ....................................................................................... 48 xiv Bảng 4.5. Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy ....................................................................................................... 49 Bảng 4.6. Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau ......................................................... 54 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo .... 56 Bảng 4.8. Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak ............. 59 Bảng 4.9. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro ............................................................................................ 62 Bảng 4.10. Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các mâũ có và không có sắc tố đỏ ................................................................................................ 64 Bảng 4.11. Kết quả điṇh lƣơṇg anthraquinnone trong mẫu dịch huyền phù ....... 66 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngay từ buổi sơ khai, con ngƣời đã biết sử dụng thực vật không chỉ làm nguồn thực phẩm mà còn cho nhiều mục đích khác, đặc biệt là trong y học. Ngƣời ta sử dụng một số loại thực vật tƣơi để đắp lên vết thƣơng hoặc thực vật khô để sắc thuốc trị bệnh. Cách đây hơn một thế kỷ, dựa vào y học cổ truyền các nhà khoa học đã phát triển các quy trình cho phép tạo ra nhiều loại thuốc từ các hợp chất thứ cấp chiết xuất từ cây trồng. Với tiến bộ khoa học, các phân tử hoá học trong cây đã đƣợc tổng hợp nhân tạo để sản xuất dƣợc phẩm. Tuy nhiên việc tổng hợp nhân tạo còn gặp nhiều khó khăn do con đƣờng tổng hợp các chất này vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ. Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỷ XX đến nay, các nhà khoa học đã công bố hàng loạt các công trình nghiên cứu về nuôi cấy tế bào đơn của nhiều loài thực vật nhằm thu nhận sản phẩm thứ cấp. Nhƣ vậy việc áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các phƣơng pháp nuôi cấy mô, nuôi cấy tế bào in vitro không những góp phần vào việc sản xuất và thu nhận mà còn giúp ta đảm bảo đƣợc một cách chủ động số lƣợng các hợp chất có giá trị trị liệu. Ở Việt Nam, ngƣời ta đã thu thập đƣợc 3 loài Drosera trong đó Drosera burmanni Vahl gần đây đã đƣợc nghiên cứu về việc thu nhận hợp chất quinone từ nuôi cấy in vitro, khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất này cũng nhƣ nhân giống thành công bằng tạo chồi trực tiếp. 2 Do đó để hƣớng tới tự động hóa việc thu nhận và chủ động tăng sinh lƣợng chất quinone đã đƣợc nghiên cứu thành công, đề tài: “KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ SẸO TẠO DỊCH HUYỀN PHÙ CÂY Drosera burmanni Vahl TRONG THU NHẬN HỢP CHẤT ANTHRAQUINONE ” đã ra đời. 1.2. Mục tiêu  Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát khả năng tạo dịch huyền phù tế bào cây Drosera burmanni Vahl.  Khảo sát hàm lƣợng hợp chất quinone thu đƣợc từ nuôi cấy dịch huyền phù. 1.3. Yêu cầu  Tạo đƣợc mô sẹo và khởi đầu tạo dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl.  Phân tích định tính và định lƣợng đƣợc hàm lƣợng anthraquinone trong từng thành phần khác nhau và trong dịch huyền phù cây D. burmanni bằng máy HPLC. 1.4. Ý nghĩa của đề tài:  Ý nghĩa khoa học: đây là một bƣớc tiến quan trọng và cần thiết trong qui trình ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào D. burmanni Vahl để thu nhận hợp chất quinone.  Ý nghĩa thực tiễn: cung cấp quy trình tạo mô sẹo, dịch huyền phù D. burmanni Vahl cho mục tiêu thu nhận quinone 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIÊỤ 2. 2.1. Tổng quan về Drosera burmanni Vahl 2.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan [14]: Giới: Plantae (Thực vật). Ngành: Magnoliophyta (Ngọc lan). Lớp: Magnoliopsida (Ngọc lan). Phân lớp: Rosidae (Hoa hồng). Bộ: Nepenthales. Họ: Droseraceae. Giống: Drosera. Loài: Drosera burmanni Vahl. Tên tiếng Anh: burmese sundew. Tên thông thƣờng: cây bắt ruồi, cỏ trói gà, bèo đất, trƣờng lệ burman. 2.1.2. Phân bố Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở đông bắc nƣớc Úc, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật, Sri Lanka và Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Myanmar, Thái Lan,Việt Nam . . .(Hình 2.1) [33], [34]. Ở Việt Nam, Drosera burmanni Vahl đƣợc tìm thấy ở Thái Nguyên, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu [1] và ở khu du lịch sinh thái Bắc Bình, Bình Thuận. 4 h Hình 2.1: Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl trên thế giới [30]. 2.1.3. Mô tả hình thái Drosera burmanni Vahl là loài cây cỏ, cao 5 - 30 cm, có nhiều màu sắc khác nhau: xanh lá, xanh đậm, xanh có ánh vàng với lông tuyến màu đỏ hay toàn cây màu đỏ [6], [15], [33], [35]. Hình 2.2: Hình thái của Drosera burmanni Vahl [33], [35].  Thân (Hình 2.2 A, B, C) Thân không phân nhánh, rất ngắn, có khi chỉ cao 1 cm khi tăng trƣởng trong bóng râm, không hình thành thân củ dƣới đất. Thân mang nhiều phát hoa [31]. Ghi chú Khu vực phân bố của Drosera burmanni Vahl Khu vực không có sự hiện diện của Drosera burmanni Vahl A F E D C B 5  Lá (Hình 2.3) Lá hình muỗng, xếp thành hình hoa thị quanh thân, phiến lá dài khoảng 1,2 cm, rộng khoảng 0,4 cm, mặt lá phủ đầy lông tuyến. Lá có tua cuốn với những giọt keo ở đầu gọi là dịch nhầy, côn trùng dính vào và bị bẫy trong dịch này. Sau đó chất này sẽ tiêu hóa côn trùng mắc bẫy. Tua cuốn trên lá uốn cong về phía con mồi bằng tính hƣớng tiếp xúc của nó. Drosera burmanii Vahl là một trong những loài có chuyển động tua cuốn nhanh nhất [37]. Hình 2.3: Lá D. burmanni [42]. A: Lá; B: Các tua cuốn. C, D: Cấu trúc một tua cuốn. Tua cuốn là lông tiết đƣợc tạo bởi một cuống dài, nhỏ, có cấu trúc đa bào và đầu mút tua cuốn đƣợc tạo bởi 2 lớp tế bào tuyến. Chất keo dính đƣợc tiết ra từ các tuyến xuyên qua lớp biểu bì gián đoạn.  Rễ Hệ thống rễ tƣơng đối đơn giản: rễ chùm nhƣng chỉ có một vài nhánh. Chúng đƣợc gọi là rễ giả vì chỉ có cơ quan hút nƣớc, cung cấp nƣớc cho cây.  Hoa (Hình 2.2 D, E) Cây ra hoa tháng 3 - 4. Hoa đều, lƣỡng tính, nhỏ, có nhiều màu sắc từ tím nhạt tới vàng nhạt, màu đỏ, hồng và trắng. Hoa nằm trên một cuống chung dài, mọc A D C B 6 thẳng góc từ chồi nách hay chồi đỉnh gọi là phát hoa. Phát hoa cao 5 - 6 cm, mỗi phát hoa có từ 5 đến 25 hoa, họp thành chùm hình bò cạp. Hoa đối xứng tròn, lá đài 5, cánh hoa 5, tiểu nhụy 5, noãn sào một buồng, đính phôi trắc mô, bầu 5 lá noãn hàn liền nhau bởi mép bên [9], [14]. Hoa nở nhiều thời điểm khác nhau, tùy thuộc vào từng giai đoạn phát triển của cây. Hoa thƣờng nở vào buổi sáng. Mỗi ngày nở một bông bắt đầu từ nụ thấp nhất (nụ đƣợc hình thành sớm nhất). Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng. Nếu sự thụ phấn không diễn ra, hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh.  Hạt (Hình 2.2 F) Hạt thu đƣợc sau một tuần từ khi hoa nở. Hạt nằm trong nang hạt. Nang hạt tròn, gồm 5 mảnh, chứa nhiều hạt. Nang hạt còn non có màu xanh, nang hạt chín có màu đen. Hạt màu đen, đƣờng kính 0,1 mm. 2.1.4. Đặc tính sinh học  Hình thức sinh sản Cây sinh sản bằng hai hình thức hữu tính và vô tính. Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi con từ chồi bên hay từ đỉnh sinh trƣởng. Sinh sản hữu tính bằng hạt.  Phƣơng thức bắt mồi Hình thức: Sử dụng dịch nhầy để bắt dính con mồi (flypaper traps). Cơ chế: Các lông tuyến bao phủ khắp bề mặt lá có vai trò nhƣ một cái bẫy nhỏ. Các keo dính tiết ra từ lông tuyến nhìn nhƣ những giọt sƣơng và không bị khô đi trong ánh mặt trời (vì vậy mà loài cây này còn đƣợc gọi là “sundew”). Giọt keo dính này tác động nhƣ những giấy bắt mồi (flypaper). Các giọt keo thƣờng không độc và có hƣơng thơm, nhờ vậy nó thu hút con mồi đậu xuống bề mặt lá và bắt dính chúng. Khi đó những lông tuyến nhạy cảm với protein sẽ uốn cong, từ từ cuộn con mồi lại và đẩy nó vào giữa lá. Tuyến tiết trên bề mặt lá lúc này sẽ ngừng tiết keo dính mà tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi. Lá sẽ hấp thu chất dinh dƣỡng mà cây không thể lấy từ môi trƣờng nghèo dinh dƣỡng [25], [34], [35]. 7 2.1.5. Đặc điểm sinh thái Hình 2.4: D. burmanni Vahl ngoài tự nhiên [3], [40].  Đất đai Cây có thể sống đƣợc ở hầu hết các điều kiện: đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid [37]. Đất trồng Drosera: hỗn hợp ¾ đất mùn + ¼ cát, cát sạch hoặc cát trộn bột than gỗ.  Độ ẩm Độ ẩm từ trung bình đến cao (50 - 80%). Độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt keo dính đầu lông tiết.  Nhiệt độ Cây sống đƣợc ở nhiệt độ 5 - 35OC, nhiệt độ thích hợp nhất 18 - 25OC. Dƣới 5 OC cây ngừng phát triển.  Ánh sáng Cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một ngày. Khi cây sống ở nơi có cƣờng độ ánh sáng cao thì toàn bộ cây sẽ chuyển sang màu đỏ. Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh. 8 2.1.6. Thành phần hóa học Nhiều hợp chất naphthoquinone và các flavonoid đã đƣợc cô lập, xác định cấu trúc và định lƣợng trong cây Drosera ngoài thiên nhiên cũng nhƣ in vitro.  Naphthoquinone Các loại Drosera thƣờng sản sinh 2 loại naphthoquinone chính là plumbagin và 7-methyljuglone (Bảng 2.1) [21]. Ngoài ra còn có các naphthoquinone vi lƣợng khác nhƣ droserone, hydroxydroserone và nhiều naphthoquinone glucoside (Bảng 2.2) mà không thể tìm thấy trong các loài cây khác [29]. Bảng 2.1: Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [21] Plumbagin 7 Methyljuglone D. andersoniana D. auriculata D. binata D. bulbosa D. capensis D. capillaris D. cistiflora D. dichotoma D. erythrorhiza D. intermedia D. longifolia D. lunata D. macrophylla D. madagascariensis D. microphylla D. modesta D. natalensis D. peltata D. adelae D. aliciae D. aliciae x capensis D. anglica D. auriculata D. burkeana D. burmanii D. capensis D. cistiflora D. cuneifolia D. dielsiana D. filiformis D. hamiltonii D. hilaris D. indica D. intermedia D. longifolia D. longifolia x rotundifolia 9 D. platypoda D. prolifera D. pygmaea D. regia D. rotundifolia D. slackii D. stolonifera, spp. Rupicola D. venusta D. villosa D. madagascariensis D. ramentacea D. regia D. rotundifolia D. spathulata D. stolonifera, spp. Stolonifera D. tracii D. trinervia D. villosa Bảng 2.2: Các Naphthoquinone vi lƣợng đƣợc tách chiết từ Drosera [21] Naphthoquinone Loài Kiểu nuôi cấy Droserone Hydroxydroserone Biramentaceone a Droserone-5-glucoside Rossoliside Hydroxydroserone-5-glucoside 2-Methylnaphtazarin-5-O- glucoside b D. whittakeri D. rotundifolia D. whittakeri D. rotundifolia D. ramentaceae D. rotundifolia D. rotundifolia D.spatulata D.rotundifolia D.rotundifolia D.spatulata In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vivo In vitro In vitro In vivo In vitro In vitro a: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi hữu cơ. b: Chất nhân tạo được sản xuất từ dịch chiết với dung môi methanol. 10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách chiết từ các loài Drosera [21]. R1 R2 R3 R4 R5 [1] CH3 H H H OH 7-Methyljuglone [2] H H CH3 H OH Plumbagin [3] H H CH3 OH OH Droserone [4] OH H CH3 OH OH Hydroxydroserone [5] H H CH3 OH OGlc Droserone-5-glucoside [6] OH H CH3 OH OGlc Hydroxydroserone-5-gluside R6 R7 [7] CH3 H Rossoliside [8] H CH3 2-Methyl-hydrojuglone-4-glucoside  Flavonoid Drosera chứa phổ rất rộng các flavonoid, flavonoid glucoside nhƣ quercetin, isoquercetin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin và gossypitrin [20]. Quercetin Kaempferol Myricetin Hyperin Hình 2.5: Cấu trúc hóa học của một số flavonoid và flavonoid glucoside [29]. R4 O O R2 R3 R5 R1 OH OGlc R7 OH R6 11 2.1.7. Phƣơng pháp nhân giống  Nhân giống tự nhiên [3] Nhân giống bằng cách gieo hạt Thời gian gieo hạt tốt nhất là cuối mùa đông. Hạt đƣợc gieo trên hỗn hợp đất trồng thích hợp. Tốt nhất nên giữ hạt trong điều kiện mát và ẩm khoảng 6 tuần. Sau đó cho hạt vào chậu đất có bọc túi nhựa và để trong điều kiện sáng. Đến khi hạt nảy mầm thì bỏ túi nhựa ra và trồng các cây con vào chậu lớn. Nhân giống bằng cách cắt rễ Cây bắt ruồi có thể đƣợc nhân giống từ các rễ dày. Lấy những rễ khỏe từ cây mẹ, cắt thành đoạn dài 5 cm và đặt nằm ngang trên hỗn hợp đất dày 6 cm, phủ chúng với l lớp đất dày 1 cm. Bọc những chậu đất này lại và đặt trong điều kiện sáng. Khi cây mới bắt đầu mọc lên thì không bọc nữa. Nhân giống bằng phƣơng pháp cắt rễ tốt nhất vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Nhân giống bằng cách cắt lá Thời gian nhân giống tốt nhất là vào đầu mùa tăng trƣởng của cây. Lá đƣợc cắt ở cuống lá rồi đặt lên trên hỗn hợp đất và cát sao cho lông tuyến hƣớng lên. Giữ cuống lá ngập trong đất nhƣng không phủ lên các lông tuyến. Bọc chậu đất lại và giữ trong điều kiện sáng. Sự phát triển của cây xảy ra trong vài tuần. Nhân giống bằng cây mầm Vào mùa thu, cây sẽ sản sinh ra những cây bé xíu (cây mầm). Thu thập những cây mầm này và trồng thành những cây mới. Một cách để thu thập cây mầm là giữ những chậu chứa cây trút ngƣợc xuống 1 tờ giấy và dùng tăm gạt cây mầm ra khỏi cây mẹ. Gieo chúng trên hỗn hợp đất. Cây sẽ mọc rễ và phát triển thành cây trƣởng thành.  Nhân giống in vitro Hầu hết những nghiên cứu trên thế giới về nuôi cấy mô Drosera đều cho thấy nhiều loài Drosera có tiềm năng nhân giống rất cao khi đƣợc nuôi cấy trong điều kiện in vitro thích hợp. Cho đến nay, rất nhiều loài Drosera đã đƣợc nuôi cấy 12 in vitro thành công. Hầu hết hạt, lá kết cụm nhƣ hoa, lá tách biệt, đôi khi cả rễ, hoa và mầm cũng đƣợc sử dụng làm mẫu cấy để thiết lập quy trình nuôi cấy mô. Trong nƣớc và trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D. burmanni Vahl. Cây sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng MS 1/2 (Murashige Skoog, với lƣợng khoáng cơ bản giảm một nửa), bổ sung than hoạt tính và casein hydrosylate 100 mg/l [3]. 2.1.8. Tầm quan trọng 2.1.8.1. Ý nghĩa về sinh thái Drosera burmanni Vahl thƣờng mọc ở đất chua, vùng bạc màu nên là loài chỉ thị cho vùng đất chua, bạc màu [14], [37]. 2.1.8.2. Ý nghĩa trong nghiên cứu tiến hóa thực vật Họ Droseraceae là một đối tƣợng điển hình cho các nghiên cứu về quá trình tiến hóa ở thực vật, bao gồm những thí nghiệm về phát triển và sinh lý học nhằm nghiên cứu vai trò chuyên biệt của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong tiến hóa hình thái ở mức vĩ mô. Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài thích nghi với từng điều kiện môi trƣờng khác nhau nên rất thích hợp cho những nghiên cứu về sự thích nghi cấu trúc và chức năng (bao gồm dinh dƣỡng từ côn trùng và sự sản sinh mầm) trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Ngoài ra, hạt phấn của giống cây này đƣợc tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp từ hình thức giao phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ phấn ở thực vật. 2.1.8.3. Giá trị dƣợc tính Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu chứng minh tiềm năng về giá trị dƣợc tính của Drosera (Bảng 2.3). Trong đó quan trọng nhất là các quinone, đặc biệt là plumbagin, 7-methyljuglone và các flavonoid. Các hợp chất quinone đƣợc tìm thấy có khả năng chữa các căn bệnh hô hấp ở ngƣời nhƣ: hen suyễn, viêm phổi, ho gà và lao. Chúng cũng có khả năng chống lại các virus, nấm, khuẩn và chống ung thƣ. Tiêu biểu trong nhóm này là plumbagin và 7-methyljuglone [29]. 13 Ngoài quinone, các flavonoid ly trích từ Drosera cũng có giá trị dƣợc tính cao nhƣ khả năng ức chế enzyme và chống oxi hóa. Một số flavonoid có ảnh hƣởng lớn đến chức năng của hệ miễn dịch. Tiêu biểu nhóm này có thể kể đến quercetin và myricetin. Chúng là những chất ức chế hiệu quả các enzyme glyoxylase mà những enzyme này giữ vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự phân chia tế bào bằng cách giải độc -ketoaldehyde. Trong y dƣợc, quercetin đƣợc sử dụng để ngăn ngừa và điều trị ung thƣ, nó cũng có khả năng ức chế hoạt tính gây đột biến gen của benzopyrene, một hydrocacbon nhiều nhân thơm gây ung thƣ tiêu biểu. Bảng 2.3: Dƣợc tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [29] HOẠT TÍNH TÀI LIỆU THAM KHẢO Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959) Ức chế độc tố Harborne (1982) Chống hen suyễn Frenzer (1980) Chống ung thƣ Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992) Ngừa thai, phá thai Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985) Chống nhiễm nấm Békésiová (1997) Ngừa hủi, phong Bokemo (1984) Chống vi khuẩn Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992) Chống đột biến Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992) Ngừa giun lãi Fetterer và ctv (1991) Chống co thắt Juniper và ctv (1989) Chống virut Walt (1972) Tim mạch Itoigawa và ctv (1991) Dùng làm mỹ phẩm Slack (1980) Miễn nhiễm Kreher và ctv (1990) Diệt côn trùng Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989) Chống vi trùng lao Gundidza và ctv (1990) Chống ho gà Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993) 14 Ở Vân Nam (Trung Quốc) Drosera burmanni Vahl (tên thông thƣờng là cẩm địa la) đƣợc dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sƣng, đau họng, ho do phổi nóng, khạc ra máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích. Ở Quảng Tây, cây dùng để trị đòn ngã, tổn thƣơng và bệnh mề đay [15]. Năm 1958 - 1959, bệnh viện Vinh dùng D. burmanni Vahl dƣới nhiều dạng khác nhau (rƣợu thuốc, xi-rô, thuốc hãm, thuốc cao) để chữa bệnh ho gà [2]. Drosera burmanni Vahl cũng đƣợc công nhận là có giá trị trong việc chữa các bệnh kiết lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dƣỡng nhƣng bụng chƣớng to ở trẻ em) [9], [10]. 2.1.8.4. Ứng dụng trong công nghiệp Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera đƣợc dùng làm đông tụ sữa do giàu hàm lƣợng acid hữu cơ và enzyme. Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera còn đƣợc dùng để nhuộm vải [39]. 15 2.1.8.5. Giá trị kinh tế Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị kinh tế rất cao trong thị trƣờng hoa cảnh thế giới (Hình 2.6) [42]. Hình 2.6: Môṭ số loaị Drosera có giá trị kinh tế cao trên thế giới [42]. D. brevicornis D. aliciae D. capensis D. capensis D. paleacea D. sewelliae D. pulchella D. pulchella D. villosa D. villosa D. fimbriata D. fimbriata D. binata D. binata D. falconeri D. erythrorhiza 16 2.1.9. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc  Trong nƣớc Đỗ Đăng Giá p (2003) đã khảo sát, thu thập, thuần dƣỡng và thử nghiệm in vitro những loài cây bắt mồi ở khu bảo tồn thiên nhiên Bình Châu - Phƣớc Bửu [1]. Trần Thị Bích Chiêu (2004) khảo sát vòng đời và tái tạo chồi từ phát hoa cây Drosera burmanni Vahl [13]. Quách Ngô Diễm Phƣơng (2006) hoàn thiện qui trình nuôi cấy in vitro cây Drosera indica L và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất naphthoquinone có hoạt tính sinh học đƣợc tách chiết từ cây [12]. Hồ Thụy Bích Tuyền (2006) ly trích và khảo sát hoạt tính sinh học của hợp chất quinone từ cây Drosera burmanni Vahl nuôi cấy in vitro [3]. Nguyêñ Đaị Hải (2006) đa ̃n uôi cấy mô cây bắt ruồi (Drosera burmanni Vahl) và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất chiết thô plumbagin [5].  Thế giới K. Javaram và M. N .V Prasad (2005) đã công bố nhân nhanh chồi cây Drosera burmanni Vahl trong môi trƣờng MS có bổ sung 2 mg/l Kn và 1 mg/l BA. Sự tái sinh cây hoàn chỉnh từ phát hoa cũng đƣợc quan sát trên môi trƣờng với nồng độ Kinetin thấp hơn (1 mg/l). Sự ra rễ cũng đƣợc thực hiện thành công trên môi trƣờng MS cơ bản [24]. Mejia Hersikorpi và các cộng sự (2002) đã nhân giống thành công cây Drosera rotundifolia từ lá của nó và tạo ra đƣợc cụm chồi đạt 20 - 30 chồi trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,45 mg/l BA và 0,37 mg/l NAA [5]. Kawiak A., Królika A. và Lojokowska E. tái sinh D. anglica, D. binata đạt số chồi lớn nhất trên môi trƣờng Vacin và Went không có chất điều hòa sinh trƣởng, đối với D. anglica là môi trƣờng Fast bổ sung 0,05 M 6-benzyladenine (BA) và 0,005 M -napthaleneacetic acid (NAA), còn môi trƣờng nhân chồi tối ƣu cho D. cuneifolia MS 1/2 bổ sung 0,2 M BA và 0,2 M NAA. Môi trƣờng lỏng làm gia tăng đáng kể khả năng nhân chồi của mẫu cấy D. anglica và D. binata [25]. 17 Ingrid L. I. Hook (2001) đã nuôi cấy D. binata, D. rotundifolia, D. capensis trong cả môi trƣờng MS lỏng và có agar; nuôi cấy dịch huyền phù D. rotundifolia trên môi trƣờng Gamborg’s B5; nuôi dịch huyền phù D. capensis trong môi trƣờng MS và McCowns Woody Plant (McC) [23]. Jozep Nahálka và cộng sự đã tạo mô sẹo và nuôi cấy thành công dịch huyền phù để thu nhận plumbagin từ cây Drosophyllum lusitanicum trên môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l IBA và 0,5 mg/l NAA [28]. 2.2. Tổng quan về kỹ thuật nuôi cấy huyền phù tế bào để thu nhận hợp chất thứ cấp 2.2.1. Khái niệm hợp chất thứ cấp Hợp chất thứ cấp hay sản phẩm trao đổi bậc hai là những sản phẩm đƣợc tạo ra trong tế bào nhờ các quá trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thoát ra khỏi tế bào đi ra môi trƣờng ngoài. Phần lớn các sản phẩm bậc hai thƣờng không có nhiều ý nghĩa sinh lý đối với bản thân tế bào . Quá trình tạo ra các sản phẩm bậc hai chỉ thông qua những cơ chế chuyển hóa rất tự nhiên của tế bào, cũng có thể do sự sai lệch về thông tin di truyền trong tế bào dẫn đến hiện tƣợng sinh tổng hợp thừa [7]. Các loại hợp chất thứ cấp bao gồm những nhóm chính sau: Các hợp chất trao đổi thứ cấp chứa nitrogen gồm: alkaloid, các độc chất chứa nitơ đã đƣợc glycosyl hóa, các amino acid không phải protein,… Các chất trao đổi có phenol, isoprenoid, các polyketide. Con đƣờng tổng hợp ra chúng đƣợc trình bày trong sơ đồ 2.1 [43]. 18 Hình các nhóm hợp chất thứ cấp chính trong thực vật Sơ đồ 2.1: Con đƣờng tổng hợp các nhóm hợp chất thứ cấp chính ở thực vật [43]. 2.2.2. Nuôi cấy mô sẹo 2.2.2.1. Khái niệm mô sẹo Mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới điều kiện đặc biệt (vết thƣơng, xử lý với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật…). Mô sẹo có thể đƣợc kích thích tạo ra trong ống nghiệm bằng cách đƣa một mẫu nhỏ của cây lên môi trƣờng vô trùng có bổ sung hormone. Dƣới tác dụng của các hormone kích thích nội sinh hoặc các hormone nhân tạo, quá trình trao đổi chất 19 của tế bào sẽ thay đổi và bắt đầu hoạt động phân bào. Vì vậy khi có sự mất cân bằng về các nồng độ hormone sinh trƣởng trong thực vật thì mô sẹo hình thành. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trƣờng không có chất kích thích tạo mô sẹo [7]. 2.2.2.2. Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo - Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phƣơng pháp nhân giống đỉnh sinh trƣởng ít hiệu quả hay khó thực hiện. - Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan. - Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào. - Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao. - Nuôi cấy huyền phù tế bào. 2.2.3. Nuôi cấy dic̣h huyền phù 2.2.3.1. Khái niệm huyền phù tế bào Huyền phù tế bào là một môi trƣờng lỏng đƣợc lắc liên tục, trong đó có sự hiện diện của các tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ các tế bào có khả năng sinh phôi có thể tái sinh thành một thực vật nguyên vẹn [7]. 2.2.3.2. Nguyên tắc tạo huyền phù Huyền phù đƣợc tạo ra từ những mảnh mô sẹo trong một môi trƣờng lỏng đƣợc lắc liên tục. Muốn cho huyền phù đƣợc tốt thì phải tạo đƣợc mô sẹo tốt tức là mô sẹo phải bao gồm các tế bào có khả năng sinh phôi. Trong quá trình tạo huyền phù, những điều kiện sinh trƣởng nhƣ môi trƣờng dinh dƣỡng, ánh sáng, nhiệt độ hay thành phần các chất kích thích cũng tƣơng tự nhƣ lúc tạo mô sẹo hoặc nếu có thay đổi thì chỉ thay đổi rất ít. Trong môi trƣờng lỏng, từ mô sẹo có thể phóng thích ra những tế bào riêng lẻ hay những cụm tế bào từ vài chục đến cả trăm tế bào giúp tăng diện tích hấp thu các chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy. Ngoài ra hoạt động của máy lắc cũng giúp cho sự trao đổi khí giữa môi trƣờng và tế bào đƣợc thuận lợi hơn. Một huyền phù tế bào đƣợc cho là lý tƣởng khi nó là một dịch mịn, hầu nhƣ gồm những yếu tố có khả năng sinh phôi, nói cách khác là những tế bào cô lập hay 20 hợp thành từng nhóm nhỏ từ vài đến khoảng 20 tế bào có khả năng duy trì tính toàn năng và tiến hóa thành phôi soma trên môi trƣờng tái sinh trong điều kiện thích hợp. 2.2.3.3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo huyền phù tế bào [7] - Hệ thống nuôi cấy. - Ánh sáng, nhiệt độ. - Mật độ tế bào khởi đầu. - Môi trƣờng nuôi cấy. - Vai trò của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật - Sự tăng trƣởng và cấy chuyền huyền phù tế bào. - Điều kiện môi trƣờng. - Cụm tế bào trong dịch huyền phù. 2.2.3.4. Các phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù hiện nay [6], [20] Có nhiều phƣơng pháp nuôi cấy huyền phù tế bào khác nhau đã đƣợc phát triển, nhƣng có hai phƣơng pháp chính :  Nuôi cấy gián đoạn Tế bào thực vật đƣợc nuôi trong một thể tích (100 ml - 10 lít) hỗn hợp môi trƣờng. Trong giai đoạn phát triển của tế bào, số lƣợng tế bào ban đầu gia tăng cho đến khi dinh dƣỡng trong môi trƣờng cạn kiệt hoặc có sự tích lũy chất trao đổi đến mức kìm hãm. Các môi trƣờng nuôi cấy quy mô nhỏ đƣợc chuyển động liên tục trên máy lắc hay trong bình phản ứng đƣợc phối trộn đều. Môi trƣờng trong bình chứa thƣờng chiếm 1/5 thể tích. Máy lắc đƣợc điều chỉnh ở vận tốc 30 - 180 vòng/phút biên độ 3 cm. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp là không sử dụng trong nghiên cứu dài hạn về sự phát triển tế bào và sự trao đổi chất, khó nhận đƣợc sự ổn định trong sản xuất. Các tế bào nuôi cấy gián đoạn không đồng nhất về kích thƣớc và cấu tạo. Để đảm bảo yêu cầu nuôi cấy phải cấy chuyền thƣờng xuyên quần thể tế bào vào môi trƣờng mới sau những khoảng thời gian bằng nhau. 21 Hình 2.7: Hệ thống nuôi cấy gián đoạn qui mô nhỏ trên các máy lắc [44].  Nuôi cấy liên tục Đây là một phƣơng pháp quan trọng đƣợc dùng để sản xuất hợp chất sơ cấp hay thứ cấp trên quy mô lớn. Kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống thiết bị phức tạp. Sự chuyển động của môi trƣờng nuôi cấy lớn trong các bồn phản ứng sinh học đƣợc thực hiện bằng cách khuấy với một turbin và (hoặc) sục không khí vô trùng vào môi trƣờng từ dƣới đáy. Phƣơng pháp nuôi cấy này cho phép giữ vô trùng cả hệ thống trong một thời gian dài. Hình 2.8: Một bioreactor ở qui mô phòng thí nghiệm [45]. 22 2.2.3.5. Các điều kiện nuôi cấy dịch tế bào ảnh hƣởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp - Chất điều hòa sinh trƣởng (hormone thực vật) bao gồm các auxin nhƣ: IAA, NAA, 2,4-D ; các cytokinin nhƣ: BAP, kinetin… - Nguồn đạm. - Nguồn carbon. - Ánh sáng. - Các yếu tố khác: pH môi trƣờng, nồng độ phosphate, các loại khí (O2, CO2, …) 2.2.4. Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù [22] Các phƣơng pháp gia tăng sự sản xuất hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy huyền phù có thể kể đến: 2.2.4.1. Tối ƣu hoá điều kiện nuôi cấy Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hƣởng bởi nhiều yếu tố vật lý (nhƣ nhiệt độ, độ thông khí, tốc độ lắc, ánh sáng, pH…) và hoá học (nhƣ chất điều hoà tăng trƣởng thực vật), thành phần các chất trong môi trƣờng nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau. Khi xác định đƣợc điều kiện nuôi cấy tối ƣu thì sự sản xuất và tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong tế bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên. Phƣơng pháp này đã đạt đƣợc thành công lớn trong trƣờng hợp của shikonin và berberine [31]. 2.2.4.2. Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau, do đó các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau. Phƣơng pháp chọn lọc dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lƣợng các hợp chất thứ cấp. 2.2.4.3. Bổ sung tiền chất Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợp chất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đƣờng sinh tổng hợp các sản phẩm thứ cấp nào đó. Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh 23 tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trƣờng nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quả sản xuất của tế bào trong một số trƣờng hợp xác định. Phƣơng pháp này sẽ có giá trị khi giá thành của các tiền chất không quá đắt. 2.2.4.4. Cố định tế bào Trong li ̃nh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứng sinh học. Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trƣờng hơn so với tế bào tự do. Tế bào cố định thƣờng là những tế bào có khả năng tiết các sản phẩm thứ cấp ra môi trƣờng ngoài. Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra đƣợc các hợp chất thứ cấp có sản lƣợng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự do. Các chất đƣợc sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen,… Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhƣng cũng không loại trừ khả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. 2.2.4.5. Cảm ứng sự phân hoá mô Dịch treo tế bào thƣờng đƣợc sử dụng để thu nhận các sản phẩm thứ cấp. Tuy nhiên, gần đây, nhiều nghiên cứu đã thành công trong việc nuôi cấy những mô đã phân hoá nhƣ nuôi cấy thân, chồi, hay rễ tơ,…nhằm thu nhận hợp chất thứ cấp. Các nghiên cứu chứng minh rằng có mối quan hệ mật thiết giữa sự sản xuất các hợp chất thứ cấp với sự phân hoá tế bào và sự phát sinh hình thái của thực vật. 2.2.4.6. Nhân tố cảm ƣ́ng (elicitor) Theo Rhoberts và Shuler (1999), tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các enzyme xúc tác tổng hợp các chất biến dƣỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật đƣợc biết đến nhƣ là sự cảm ứng (elicitation) [26]. Elicitation trong sản suất hợp chất thứ cấp của tế bào thực vật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các biotic và abiotic elicitor. Thuật ngữ “elicitor” đƣợc sử dụng đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứng phòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng. Thực vật có thể sản xuất ra các chất kháng sinh biến dƣỡng thứ cấp nhƣ các phytoalexin trong các phản ứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn. 24 Hình 2.9: Sắc ký côṭ [47]. Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và các thành phần của chúng) đã đƣợc sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật [18]. 2.3. Các kỹ thuật sử dụng trong bài luận văn 2.3.1. Phƣơng pháp ly trích - thu nhận hợp chất [8] 2.3.1.1. Sắc ký cột Luận văn sử dụng hệ thống sắc ký cột hở với chất hấp thụ là silica gel trong qui trình ly trích và thu nhận hợp chất anthraquinone (Hình 2.9).  Khái niệm Sắc ký cột hở là một hệ thống vật lý trong đó có một cột đƣợc nạp chặt chẽ bởi một chất hấp thụ và có một pha lỏng di động chảy xuyên ngang qua. Tùy thuộc và loại chất hấp thu để nạp cột và pha động, ngƣời ta phân biệt một số cơ chế tách: sắc ký hấp thu, sắc ký phân chia, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực…  Nguyên tắc của sắc ký cột Sắc ký cột căn cứ trên khả năng mà phân tử chất tan có thể tƣơng tác với pha tĩnh. Những tƣơng tác này sẽ lần lƣợt làm chậm sự di chuyển của những chất tan khác nhau, khi chúng di chuyển xuyên qua chất hấp thụ để ra khỏi cột. Các 25 tƣơng tác giữa chất tan với pha động và pha tĩnh có thể là nối hydrogen, nối Val der Waal, tƣơng tác lƣỡng cực - lƣỡng cực, tƣơng tác acid - bazơ, sự tạo phức. . .  Chất hấp thụ silica gel Silica gel là polimer ba chiều của những tứ diện oxid silicon SiO2.H2O. Đây là những nguyên liệu có lỗ rỗng. Hạt silica gel sử dụng cho sắc ký cột có diện tích bề mặt khoảng 100 - 800 m2/g, đƣờng kính hạt trung bình là 40 - 200 m và các lỗ rỗng trên bề mặt có đƣờng kính trung bình 40 - 300 A0. Trên bề mặt các hạt silica gel có mang những nhóm silanol-OH. Đây là trung tâm hoạt động có thể tạo nên những nối hydrogen mạnh với những hợp chất đƣợc sắc ký. Vì thế, những hợp chất nào có khả năng tạo nối hydrogen mạnh hợp chất đó sẽ bị silica gel giữ mạnh lại trong cột. Nhƣ vậy những hợp chất phân cực mạnh có chứa nhóm chức acid carboxilic, amin, amid sẽ hấp thụ mạnh vào silica gel trong khi những hợp chất kém phân cực nhƣ alkan, terpen (những hợp chất không chứa các nhóm chức có thể tạo nối hydrogen) sẽ ít bị giữ. Ngoài ra một hợp chất có thể bị silica gel giữ lại mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi ly giải.  Nguyên tắc cơ bản khi sử dụng sắc ký cột Lựa chọn dung môi giải ly: trong loại sắc ký cột hấp thu, hợp chất không phân cực sẽ đƣợc ly giải khỏi cột trƣớc, hợp chất phân cực đƣợc giải ly sau. Thông thƣờng ngƣời ta bắt đầu bằng dung môi không phân cực để loại tƣơng đối các hợp chất không phân cực ra khỏi cột và tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly để đuổi các hợp chất có tính phân cực mạnh hơn. Nhƣng nếu thay đổi dung môi phân cực hơn một cách đột ngột sẽ làm gãy cột. Kích thƣớc cột và lƣợng mẫu chất: Kích cỡ của cột tùy thuộc vào số lƣợng mẫu chất cần phân tách. Kích thƣớc cột cần đạt tỷ lệ về chiều cao – đƣờng kính là 8:1. Trọng lƣợng chất hấp thụ và trọng lƣợng mẫu phải tuân theo một tỷ lệ tƣơng ứng. Trung bình thì trọng lƣợng chất hấp thụ phải lớn hơn 25 - 50 lần trọng lƣợng của mẫu cần sắc ký (tính theo trọng lƣợng). Tuy nhiên, với những hỗn hợp mà các hợp chất không dễ dàng tách riêng thì cần sử dụng cột lớn hơn với số lƣợng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100 - 500 lần). 26 Hình 2.10: Mô hình sắc ký nhanh côṭ khô [8]. 2.3.1.2. Sắc ký nhanh cột khô (Dry – Column Flash Chromatography) [8]  Khái niệm Sắc ký nhanh cột khô là một biến đổi của sắc ký cột nhanh, sử dụng áp suất kém để gia tăng vận tốc ly giải của pha động. Kỹ thuật này khác với sắc ký nhanh là cột sắc ký đƣợc rút khô sau mỗi phân đoạn thu đƣợc.  Chất hấp thụ Sử dụng silica gel loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (Merk 60H hoặc 60 G; tức 40 - 15 m hoặc alumina loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (10 m, diện tích bề mặt riêng lớn: 500 m2.g-1).  Mô tả hệ thống - Phễu lọc xốp bằng thủy tinh. Độ xốp của lỗ thuộc loại 3 hoặc loại D. Phễu có đủ kích cỡ lớn nhỏ (loại 100; 150; 250; 500 ml…) thích hợp với lƣợng mẫu cần sắc ký (Bảng 1.4). - Bình tam giác. - Hệ thống tạo áp suất bằng vòi nƣớc (20 - 70 mmHg; chỉ cần áp suất vừa phải). 27 2.3.1.3. Sắc ký lớp mỏng điều chế [8]  Khái niệm Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng, trong đó pha động là chất lỏng đƣợc cho đi ngang qua một lớp chất hấp thụ trơ (ví dụ silica gel hay alumina) chất hấp thu này đƣợc tráng thành một bản mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thụ đƣợc tráng thành một lớp mỏng nên phƣơng pháp này gọi là sắc ký bản mỏng. Một hợp chất tinh chất khi sắc ký bản mỏng sẽ cho một vết, với giá trị Rf không đổi trong một hệ dung môi ly giải xác định, bởi bảng sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Với: Khoảng cách di chuyển của hợp chất Rf = Khoảng đƣờng di chuyển của dung môi Giá trị Rf không bao giờ lớn hơn 1 và thay đổi tùy theo: loại chất hấp thu dùng để tráng bản mỏng, thành phần dung môi giải ly, độ bão hòa dung môi, kỹ thuật ly giải. Hình 2.11: Sắc ký lớp mỏng [46]. 28  Ƣu điểm Ƣu điểm của sắc ký bản mỏng điều chế với sắc ký cột là: nhanh, dễ tìm đƣợc dung môi thích hợp để giải ly tách tốt các chất; các vùng có chứa chất cần thiết sẽ tụ lại thành lớp mỏng dễ dàng phát hiện, dễ dàng cô lập chất. Sở dĩ sắc ký lớp mỏng tách tốt là nhờ tỷ lệ lớn giữa “chất tách : chất hấp thụ silica gel” (1:1000 đến 1: 10.000) trong khi tỷ lệ này ở sắc ký cột là 1:50.  Nhƣợc điểm Chỉ sử dụng đƣợc sắc ký điều chế khi hỗn hợp chất cần tách chỉ chứa khoảng 4 thành phần chính và có trọng lƣợng nhỏ vài trăm miligram; còn nếu có một mẫu chất vài gram thì nên sử dụng sắc ký cột vì các bảng sắc ký điều chế rất đắt tiền. 2.3.2. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC trong định lƣợng hợp chất thứ cấp  Nguyên tắc Nguyên tắc của kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua một chất lỏng đứng yên (pha tĩnh). Pha tĩnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thƣờng pha tĩnh là dung môi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung môi hữu cơ. Đôi khi pha tĩnh là các chất lỏng ít phân cực lúc đó pha động phải là dung môi ít phân cực hơn. 29  Các bộ phận chính của máy HPLC  Ứng dụng của sắc ký lỏng cao áp Phƣơng pháp HPLC có khả năng tách các chất đặc thù nhƣ: - Các hợp chất cao phân tử, ion thuộc đối tƣợng nghiên cứu y học, sinh học. - Các hợp chất tự nhiên không bền, các chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ. - Tách các acid nucleic, dƣợc phẩm, steroit, vitamine, chất bảo quản thực phẩm, chất bảo vệ thực vật, các phenol, các hydrocacbon trong dầu mỏ… Sơ đồ 2.2: Sơ đồ hoạt động các bộ phận của máy HPLC 30  Ƣu điểm Ngoài những ứng dụng rộng rãi đã nêu ở trên, HPLC còn có những ƣu điểm hơn sắc ký lỏng cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector không phá hủy mẫu.  Nhƣợc điểm Xét về đầu tƣ trang thiết bị lẫn phí tổn vận hành, HPLC là một kỹ thuật đắt tiền. 31 Chƣơng 3 3. VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP  Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ tháng 3/2007 đến hết tháng 8/2007. Địa điểm: các thí nghiệm nuôi cấy mô đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đaị hoc̣ Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Các thí nghiệm định lƣợng hợp chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl đƣợc thực hiện tại phòng sắc ký, Viêṇ Công nghê ̣Sinh học và Công nghệ môi trƣờng, Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. 3.1. Nuôi cấy mô seọ, tạo dịch huyền phù 3.1.1. Vật liệu  Nguồn giống Nguyên liệu dùng cho thí nghiệm là cây Drosera burmanni Vahl, do phòng công nghệ sinh học thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. Các mẫu thí nghiệm đồng nhất về mặt di truyền (Hình 3.1). Hình 3.1: Cây D. burmanni Vahl nuôi cấy in vitro. 32  Môi trƣờng - Môi trƣờng muối khoáng MS (Murashige Skoog, 1962) (Phụ lục 1) với thành phần khoáng đa lƣợng giảm 1/2 (ký hiệu là MS 1/2) bổ sung: - Đƣờng: 30 g/l. - Agar: 7 g/l. - Than hoạt tính: 1 g/l. - Casein hydrosylate: 100 mg/l. - pH = 5,8 ± 0,1 (trƣớc khi hấp khử trùng). - Hấp khử trùng bằng autoclave ở 1210 C, 1 atm, 20 phút. - Môi trƣờng muối khoáng Gamborg’s B5 (phụ lục) bổ sung : - Vitamin B1= 0,4 mg/l. - Vitamin B6 = 0,5 mg/l. - Vitamin PP = 0,5 mg/l. - PVP = 1,25 mg/l. - Casein hydrosylate: 100 mg/l. - Hormone tăng trƣởng thực vật: NAA, 2,4-D, BA, IBA có nồng độ thay đổi.  Điều kiện nuôi cấy - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. - Cƣờng độ chiếu sáng: 3000 lux. - Nhiệt độ phòng nuôi cấy: 22 – 250 C. - Độ ẩm trung bình: 70 %.  Trang thiết bị và dụng cụ - Trang thiết bị: tủ cấy vô trùng, nồi hấp vô trùng, máy đo pH, cân phân tích. - Dụng cụ: chai nƣớc biển, đĩa petri, dao, kẹp cấy,… 33 3.1.2. Phƣơng pháp 3.1.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Mục đích thí nghiệm Xác định thành phần khoáng và nồng độ đƣờng thích hợp để duy trì sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng TCL. Bố trí nghiệm thức Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 20 mẫu và đƣợc lập lại ba lần. Kết quả là trị số trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.1: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển mẫu cấy lớp mỏng Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l) 5 10 20 30 MS A1 A2 A3 A4 MS 1/2 A5 A6 A7 A8 Gamborg’s B5 A9 A10 A11 A12 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi kết quả sau 14 ngày dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ (%) số mẫu còn sống. Chỉ tiêu này đƣợc xác định theo công thức: Số mẫu còn sống Tỷ lệ mẫu sống (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Các bộ phận gồm thân, lá non (lớp lá thứ nhất hay thứ hai) và phát hoa của cây Drosera burmanni Vahl in vitro đƣợc cắt thành các lớp mỏng (từ 0,2 - 0,5 mm), cấy vào các nghiệm thức nhƣ đã bố trí. 34 3.1.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Mục đích thí nghiệm Tìm sự kết hợp của các loại hormone thích hợp nhất cho việc tạo mô sẹo. Bố trí nghiệm thức Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 45 mẫu và đƣợc lập lại 3 lần, kết quả là trị số của 3 lần lập lại. Bảng 3.2: Bố trí nghiệm thức khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Các loại hormone kết hợp (mg/l) NAA (0,2) 2,4-D (0,1) [12], [23] NAA (0,5) IBA (1) [28] NAA (1) BA (0,2) [5] Nghiệm thức B1 B2 B3 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi kết quả sau 14 ngày nuôi cấy dựa trên chỉ tiêu là tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo, với: Tỷ lệ mẫu cấy tạo mô sẹo Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Cách thực hiện - Mẫu cắt lớp mỏng cây D. burmanni Vahl đƣợc đƣa vào các nghiệm thức trong đó môi trƣờng có thành phần khoáng và nồng độ đƣờng tối ƣu với mẫu cấy lớp mỏng đã tìm đƣợc từ thí nghiệm 1. - Ủ tối trong các thùng carton. 35 3.1.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Mục đích thí nghiệm Tìm nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo bằng phƣơng pháp lớp mỏng tế bào TCL. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố, gồm 6 nghiệm thức trên mỗi loại vật liệu, mỗi nghiệm thức thực hiện trên 12 mẫu và đƣợc lập lại 3 lần. Kết quả là trị số của 3 lần lặp lại. Bảng 3.3: Bố trí nghiệm thức khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Vật liệu đầu Nồng độ 2,4-D (mg/l) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Phát hoa TCL C1 C2 C3 C4 C5 C6 Thân TCL C1’ C2’ C3’ C4’ C5’ C6’ Lá TCL C1” C2” C3” C4” C5” C6” Chỉ tiêu theo dõi Ghi nhận kết quả sau 21 ngày nuôi cấy với các chỉ tiêu sau: - Tỷ lệ mô sẹo tạo thành - Hình thái mô sẹo Với Số mẫu tạo sẹo Tỷ lệ mẫu tạo sẹo (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Mẫu cắt lớp mỏng của phát hoa, thân, lá non đƣợc đƣa vào môi trƣờng có nồng độ 2,4-D thay đổi và ủ tối 21 ngày trong các thùng carton. 36 3.1.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo Mục đích Tìm kiểu nuôi cấy thích hợp cho việc tăng sinh khối mô sẹo. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố và gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 1 bình, 3 lần lập lại. Kết quả là giá trị trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.4: Bố trí nghiệm thức khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo Kiểu nuôi cấy Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc Nghiệm thức D1 D2 D3 D4 Chỉ tiêu theo dõi Chỉ tiêu theo dõi là khối lƣợng mô sẹo gia tăng sau 21 ngày nuôi cấy quy về 1 mg. Chỉ tiêu này đƣợc tính bằng công thức: Δm = [(m21 - m0)/m0] (mg) Trong đó : Δm: khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1mg ban đầu. m0: khối lƣợng mô sẹo ban đầu. m21: khối lƣợng mô sẹo sau 21 ngày nuôi cấy. Phƣơng pháp tiến hành Mô sẹo đƣợc cấy vào môi trƣờng với các kiểu nuôi cấy khác nhau, bổ sung hormone tăng trƣởng là 2,4-D và NAA với sự kết hợp hai nồng độ tối ƣu ở thí nghiệm 3. Các mô sẹo này đều đƣợc cân khối lƣợng trƣớc khi cấy. Sau 21 ngày nuôi cấy cân lại khối lƣợng mô sẹo và ghi nhận kết quả. Các kiểu nuôi cấy gồm: - Kiểu nuôi cấy dạng rắn: môi trƣờng có bổ sung agar (7 g/l). 37 - Kiểu nuôi cấy bán rắn: môi trƣờng lỏng, có bông gòn làm giá thể, không lắc. - Kiểu nuôi cấy lỏng tĩnh: môi trƣờng lỏng, không lắc. - Kiểu nuôi cấy lỏng lắc: môi trƣờng lỏng, lắc với tốc độ 150 vòng/phút. 3.1.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hiǹh thành sắc tố đỏ của mô sẹo Mục đích: Bƣớc đầu ghi nhận ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên CRD, đơn yếu tố gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức thực hiện trên 10 mẫu mô sẹo, lập lại 3 lần. Kết quả là trị số trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3.5: Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn Nghiệm thức E1 E2 Chỉ tiêu theo dõi: Ghi nhận tỷ lệ hình thành sắc tố đỏ ở mô se ̣ o sau 21 ngày nuôi cấy. Số mô sẹo hình thành sắc tố đỏ Tỷ lệ mô sẹo hình thành sắc tố đỏ (%) = x 100 Tổng số mẫu cấy Phƣơng pháp tiến hành Các mô sẹo đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung hormone NAA và 2,4-D ở nồng độ kết hợp tối ƣu (Thí nghiệm 3) trong hai điều kiện ủ tối hoàn toàn và chiếu sáng 16 giờ/ ngày. 38 3.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl 3.2.1. Vật liệu  Nguồn mẫu - Cây D. burmanni Vahl in vitro.  Hóa chất - Silica gel (Merck) - Benzene (Trung Quốc) - Chloroform (Trung Quốc) - Ether dầu hỏa (Trung Quốc) - Diethyl ether (Trung Quốc) - Methanol (Trung Quốc) - Thuốc thử Borntraeger ( KOH 5% trong methanol).  Trang thiết bị và dụng cụ - Thiết bi:̣ máy cô quay chân không , tủ hút hóa chất, tủ sấy, côṭ sắc ký, sắc ký bản mỏng (Merck) … - Dụng cụ: giấy lọc, ống vi quản, chai bi, đũa thủy tinh, bao tay, khẩu trang,.. 39 3.2.2. Phƣơng pháp tiến hành Hợp chất anthraquinone đƣợc ly trích và cô lập theo quy trình của Hồ Thị Bích Tuyền (2006) [3]. Sơ đồ 3.1: Quy trình ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone. Hơp̣ chất anthraquinone sau khi ly trích và tinh chế đƣơc̣ sƣ̉ duṇg làm chất tham chiếu trong các thí nghiêṃ điṇh lƣơṇg bằng HPLC . Cây tƣơi Cây khô Bột cây Cao thô ethanol Sấy ở 500C Nghiền Ngâm dầm trong ethanol ít nhất 24 giờ, Lọc, cô quay chân không. Sắc ký nhanh cột khô với đơn dung môi benzene Sắc ký cột ƣớt với hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5) Phân đoạn cao benzene Phân đoạn chứa hợp chất anthraquinone Sắc ký bản mỏng điều chế nhiều lần Hệ dung môi benzene:chloroform (3:7) Hợp chất anthraquinone tinh khiết tƣơng đối 40 3.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinone trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 3.3.1. Vâṭ liêụ  Nguồn mẫu - Cây D. burmanni Vahl các loaị. - Dịch huyền phù cây D. burmanni Vahl taọ đƣơc̣ từ thí nghiệm 4.  Hóa chất - Methanol (Prolabo) - Acid acetic (Merck) - Triethylamine (Merck) - Anthraquinone (đa ̃đƣơc̣ ly trích và tinh chế trong phần 3.2.)  Trang thiết bi ̣ và duṇg cu ̣ - Thiết bi :̣ máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), máy đánh sóng siêu âm, máy nghiền mẫu khô, tủ sấy, máy ly tâm , cân phân tích,… - Dụng cụ: giấy lọc, đầu lọc 0,2 m, cối sứ, bao tay, khẩu trang,… 3.3.2. Phƣơng pháp So sánh trực tiếp diện tích peak của mẫu thử với diện tích peak của mẫu anthraquinone tham chiếu tƣơng ứng có nồng độ xác định. Yêu cầu của phƣơng pháp này là việc tiến hành sắc ký HPLC mẫu tham chiếu và mẫu thử phải tiến hành trong cùng điều kiện sắc ký và về nguyên tắc thời gian thực hiện hai mẫu không cách xa nhau. 3.3.2.1. Xác định điều kiện, thông số kỹ thuật thích hợp Dựa trên các thông số , điều kiện mà Quá ch Ngô Diễm Phƣơng (2006) [12] đã sử dụng để khảo sát hàm lƣợng plumbagin trong cây D. indica L bằng HPLC, chúng tôi đã chọn các điều kiện thông số thích hợp để chạy HPLC nhƣ sau: - Cột C18 ODS-Hypersil (25 cm x 4 mm). - Pha động: 55% methanol, 45% acid acetic (0,02 M) đƣợc điều chỉnh đến pH 6 bằng triethylamine [17]. - Tốc độ dòng 0,4 ml/l. 41 - Nhiệt độ cột bằng nhiệt độ phòng. - Detector phát hiện ở bƣớc sóng ở 254 nm. 3.3.2.2. Xây dựng đƣờng chuẩn Cân chính xác khối lƣợng anthraquinone và pha loãng trong methanol tuyệt đối thành các nồng độ sau 14 ppm, 28 ppm, 42 ppm, 56 ppm, 70 ppm. Tiến hành sắc ký để thu đƣợc các peak chuẩn ở các nồng độ trên. Xây dựng đƣờng chuẩn tuyến tính biểu hiện sự biến thiên của nồng độ anthraquinone theo diện tích peak. 3.3.2.3. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣợng hợp chất anthraquinone Mục đích - Tìm cách xử lý mẫu thích hợp cho qui trình chạy HPLC. Bố trí nghiệm thức - Hai mẫu đƣợc xử lý theo hai cách A và B (Sơ đồ 3.2) đƣợc đem định lƣợng bằng HPLC. Chỉ tiêu theo dõi - Theo dõi khả năng tạo tín hiệu trong sắc ký đồ của 2 mẫu đƣợc xử lý theo quy trình A và B. Phƣơng pháp tiến hành - Cây D. Burmanni Vahl in vitro đƣợc chia thành hai nhóm. - Một nhóm đƣợc xử lý theo quy trình A, một nhóm xử lý theo qui trình B trƣớc khi chạy HPLC (Sơ đồ 3.2). 42 u Sơ đồ 3.2. Quy trình xử lý mẫu [32]. 43 3.3.2.4. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Mục đích - Xác định bộ phận cho lƣợng anthraquinone nhiều nhất. Bố trí thí nghiệm Bảng 3.6: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Chỉ tiêu theo dõi - Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh hàm lƣợng anthraquinone (% so với troṇg lƣơṇg khô) trong mẫu thân lá và mẫu rễ, theo công thƣ́c: m1 Hàm lƣợng anthraquinone (%) = x 100 m2 Với: m1: trọng lƣợng hợp chất anthraquinone trong dung dịch mẫu đem đo (mg). m2: trọng lƣợng khô mẫu đem đo (mg). Phƣơng pháp tiến hành - Cây in vitro đƣợc chia thành hai phần: phần thân lá và phần rễ. - Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6. - Tiến hành định lƣợng bằng HPLC. Mẫu định lƣợng Mẫu thân lá Mẫu rễ Nghiêṃ thƣ́c X1 X2 44 3.3.2.5. Thí nghiệm 8: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các mẫu cây có sắc tố đỏ và mẫu không có sắc tố đỏ Mục đích - Bƣớc đầu tìm hiểu mối liên hệ giữa sắc tố đỏ của cây và hàm lƣợng hợp chất quinone. Bố trí nghiệm thức Bảng 3.7: Bố trí thí nghiệm so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu cây có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ Mẫu phân tích Mẫu có sắc tố đỏ Mẫu không có sắc tố đỏ Nghiêṃ thƣ́c Y1 Y2 Chỉ tiêu theo dõi - Ghi nhận sắc ký đồ và so sánh diện tích peak, hàm lƣợng anthraquinone của hai mẫu cây có và không có sắc tố đỏ. Phƣơng pháp tiến hành - Cây D. burmanni đƣợc chia làm 2 loại: loại có sắc tố đỏ và không có sắc tố đỏ. - Cây tƣơi mỗi loại đƣợc xử lý theo quy trình xử lý mẫu thích hợp tìm đƣợc từ thí nghiệm 6. - Tiến hành định lƣợng bằng HPLC 45 3.3.2.6. Thí nghiệm 9. Xác định hàm lƣợng anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù đã tạo đƣợc từ thí nghiệm 4 Mục đích. - Định lƣợng sơ bộ anthraquinone trong mẫu dịch huyền phù. Cách xử lý mẫu Sơ đồ 3.3: Quy trình xử lý dịch huyền phù. 3.4. Xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ tất cả các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 7.0. Dịch huyền phù Sinh khối tế bào và mô sẹo Dịch môi trƣờng Xác tế bào và mô sẹo Dịch chiết Định lƣợng bằng HPLC Lọc qua đầu lọc 0,2 m Định lƣợng bằng HPLC Lọc qua đầu lọc 0,2 m Đánh sóng siêu âm 30 phút Nghiền trong methanol tuyệt đối 3 lần Ly tâm 46 Chƣơng 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4. 4.1. Nuôi cấy mô sẹo tạo dịch huyền phù 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của thành phần khoáng và nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Tỷ lệ sống của các mẫu lớp mỏng từ cây D. burmanni trên các môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy đƣợc ghi nhận ở bảng 4.1, và biểu đồ 4.1. Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu sống ở các nghiệm thức sau 14 ngày nuôi cấy Loại môi trƣờng Nồng độ đƣờng (g/l) 5 10 20 30 MS 16,67 11,67 11,67 10 MS 1/2 8,33 18,33 11,67 18,33 Gamborg’s B5 13,33 20 36,67 13,33 Kết quả trích từ phu ̣luc 2.1 Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu lớp mỏng sống trên các loại môi trƣờng khác nhau sau 14 ngày nuôi cấy. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 Nghiệm thức Tỷ lệ m ẫu s ốn g (% ) 47 Nhận xét Từ kết quả ở bảng 4.1, chúng tôi tiến hành phân tích thống kê cho từng yếu tố nhƣ sau: Về thành phần khoáng Thống kê bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa giữa việc sử dụng môi trƣờng Gamborg’s B5 với 2 loại môi trƣờng MS và MS 1/2. Môi trƣờng Gamborg’s B5 cho tỷ lệ mẫu sống trung bình cao nhất (20,83%) và thấp nhất là môi trƣờng MS, với tỷ lệ mẫu sống trung bình là 12,5%. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu trên thế giới chọn môi trƣờng Gamborg’s B5 là môi trƣờng cơ bản để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera [12], [23]. Bảng 4.2: Ảnh hƣởng thành phần khoáng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Loại môi trƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng MS MS 1/2 Gamborg’s B5 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 8 9,10,11, 12 12,50 a 14,17 a 20,83 b Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Về nồng độ đƣờng Qua bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ đƣờng 20 g/l mẫu lớp mỏng sống và phát triển đƣợc (20% mẫu sống) trong khi ở nồng độ đƣờng quá cao và quá thấp mẫu mô đều chết. Một đặc điểm thƣờng gặp ở phƣơng pháp lớp mỏng tế bào là mẫu mô khá nhạy cảm với áp suất thẩm thấu. Ghi nhận thực tế cho thấy, khi sử dụng nồng độ đƣờng cao các mẫu mô sẽ bị chết đen và có xu hƣớng hơi co lại do mất nƣớc. Bên cạnh đó, kết quả bảng 4.1 và biểu đồ 4.1 cũng cho thấy tỷ lệ mẫu sống thấp nhất ở nghiệm thức A5 (8,33%) (khi kết hợp sử dụng loại môi trƣờng MS 1/2 với nồng độ đƣờng 5 g/l); trong khi tỷ lệ mẫu sống cao nhất ở nghiệm thức A11 (36,67 %) (Môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l). 48 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng lên sự phát triển của mẫu cấy lớp mỏng Nồng đồ đƣờng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu sổng 5 10 20 30 1, 5, 9 2, 6, 10 3, 7, 11 4, 8, 12 12,78 a 16,67 b 20,00 c 13,89 ab Trong cùng một yếu tố ảnh hưởng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Nhƣ vậy khi kết hợp cả hai yếu tố ảnh hƣởng đến mẫu mô chúng tôi chọn đƣợc môi trƣờng tốt nhất cho mẫu cấy lớp mỏng cây bắt ruồi là môi trƣờng Gamborg’s B5 với nồng độ đƣờng 20 g/l. 4.1.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự kết hợp 2 loại hormone thích hợp cho việc kích ứng tạo mô sẹo Sau 2 tuần nuôi cấy, kết quả sự hình thành mô sẹo từ lớp mỏng tế bào cây D. burmanni vahl trên môi trƣờng có nồng độ đƣờng và thành phần khoáng chọn từ thí nghiệm 1, bổ sung các loại hormone khác nhau đƣợc ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4: Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trƣờng có kết hợp 2 loại hormone khác nhau Các loại hormone kết hợp (mg/l) NAA (0,2) 2,4-D (0,1) NAA (0,5) IBA (1) NAA (1) BA (0,2) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo 25,17 c 2,93 b 0 a Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0,05). Nhận xét Kết quả từ bảng 4.4 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê giữa các nghiệm thức sử dụng hormone NAA/2,4-D; NAA/IBA; NAA/BA. Trong đó sự kết hợp 2 loại NAA/BA cho kết quả thấp nhất (không có sự tạo thành mô sẹo mà chỉ có sự hình thành chồi trực tiếp từ các mẫu thân) và sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho kết quả tạo mô sẹo tốt nhất (25,56%). 49 Sự kết hợp cùng lúc 2 loại auxin để tạo mô sẹo ở một số loài Drosera đã đƣợc ghi nhận trong một số nghiên cứu cả trong và ngoài nƣớc [12], [23], [28]. Thông thƣờng mô sẹo đƣợc tạo thành khi có sự tác động đồng thời của cả 2 loại hormone auxin và cytokinin, trong đó hàm lƣợng auxin nhiều hơn. Tuy nhiên ở một số đối tƣợng, lƣợng auxin nội sinh thấp, mẫu mô cần lƣợng lớn hơn auxin để cảm ứng hình thành mô sẹo. Tổng hợp các ghi nhận và phân tích, chúng tôi chọn sự kết hợp 2 loại hormone NAA/2,4-D cho việc cảm ứng hình thành mô sẹo từ lớp mỏng các bộ phân cây D. burmanni Vahl. 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát nồng độ thích hơp̣ của 2,4-D khi kết hợp với NAA (0,2 mg/l) để cảm ứng tạo mô sẹo Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu tạo sẹo trên các môi trƣờng khác nhau sau 21 ngày nuôi cấy Loại vật liệu đầu Nghiệm thức Nồng độ 2,4-D (mg/l) Tỷ lệ mẫu tạo sẹo Hình thái mô sẹo Phát hoa C1 0 5,53 Mô sẹo hơi phình, đặc. (Hình 4.1A) C2 0,1 22,23 Mô sẹo xốp, đỏ, ít. (Hình 4.1B) C3 0,2 52,77 Mô sẹo xốp, vàng xanh, phình to (Hình 4.1C). C4 0,3 36,10 Mô sẹo xốp, vàng xanh. C5 0,4 19,47 Mô sẹo hơi chai. C6 0,5 22,23 Mô sẹo chai cứng (Hình 4.1D). Thân C1’ 0 0 Mẫu cấy hóa nâu. C2’ 0,1 38,90 Mô sẹo vàng xanh, phần mẫu cảm ứng ít (Hình 4.2A). 50 C3’ 0,2 72,23 Mô sẹo xốp , vàng trắng có ít đốm đỏ, phình to (Hình 4.2 B, E). C4’ 0,3 55,53 Mô sẹo xốp, vàng xanh vài mẫu có đốm đỏ C5’ 0,4 50 Mô sẹo vàng trắng, có đốm đỏ hơi đặc . (Hình 4.2C). C6’ 0,5 22,23 Mô sẹo vàng xanh, hơi chai cứng (Hình 4.2D). Lá C1” 0 8,30 Mô sẹo đỏ, phần mâũ cảm ƣ́ng ít (Hình 4.1E) C2” 0,1 16,70 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh nhƣng ít. C3” 0,2 27,77 Mô sẹo xốp, màu vàng xanh, phình to (Hình 4.1F). C4” 0,3 22,23 Mô sẹo đăc̣, màu vàng xanh xen đốm đỏ (Hình 4.1G) C5” 0,4 13,90 Mô sẹo vàng xanh có đốm đỏ , hơi chai cứng. C6” 0,5 13,90 Mô sẹo đỏ, chai cứng. (Hình 4.1H) Kết quả được trích từ phụ lục 2.3 Nhận xét Kết quả bảng 4.5 cho thấy, đối với cả 3 loại vật liệu đầu tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo đều thấp nhất ở nghiệm thức có môi trƣờng chỉ bổ sung NAA (0,2 mg/l). Trong khi ở nghiệm thức bổ sung NAA (0,2 mg/l)/2,4-D (0,2 mg/l) tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất ở cả 3 loại mẫu: 52,77% ở mẫu phát hoa TCL, 72,23% ở mẫu thân TCL, 27,77% ở mẫu lá TCL. 51 Các auxin đƣợc biết đến là có khả năng kích thích mạnh sự phân chia tế bào, nên chúng thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ loại hormone sơ cấp để sản xuất mô sẹo. Các auxin thông dụng hiện nay bao gồm IAA, IBA, NAA, 2,4-D có mức độ ảnh hƣởng tăng dần, trong đó 2,4-D là chất sử sụng hiệu quả nhất trong trong việc hình thành mô sẹo [16]. Các kết quả thực nghiệm cũng cho thấy 2,4-D thƣờng cảm ứng tạo mô sẹo xốp hơn là NAA. Điều này có lẽ là do 2,4-D cảm ứng sự phân chia tế bào mạnh, các tế bào phân chia liên tục trong thời gian ngắn không kịp để tổng hợp vật chất nên nó thƣờng lỏng lẻo. Vì mục đích thí nghiệm là tạo mô sẹo để nuôi dịch huyền phù về sau (cần mô sẹo xốp) và do không đủ thời gian để dò nồng độ của cả hai loại hormone, chúng tôi chọn 2,4-D là loại hormone chính để tạo mô sẹo. Bên cạnh đó bảng kết quả 4.5 cũng cho thấy, các mẫu lớp mỏng từ lóng thân cho tỷ lệ tạo sẹo lớn nhất trong khi các mẫu lá thấp nhất. Kết quả này có lẽ là do đặc điểm hình thái của cây D. burmanni Vahl: bề mặt lá của chúng mang nhiều tua cuốn khiến chúng khó tiếp xúc với môi trƣờng; các tua cuốn này lại chứa chất nhầy và nhiều loại enzyme thƣờng gây ảnh hƣởng không tốt đến các mẫu mô. Với những nhận xét trên, chúng tôi chọn nồng độ kết hợp tối ƣu cho việc tạo mô sẹo là NAA 0,2 mg/l và 2,4-D 0,2 mg/l cho mọi loại vật liệu đầu từ lớp mỏng cây D. burmanni Vahl. 52 Phát hoa TCL A: 2,4-D (0 mg/l) B: 2,4-D (0,1 mg/l) C: 2,4-D (0,2 mg/l) D: 2,4-D (0,5 mg/l) Lá TCL E: 2,4-D (0 mg/l) F: 2,4-D (0,2 mg/l) G: 2,4-D (0,3 mg/l) H: 2,4-D (0,5 mg/l) Hình 4.1: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi: 53 Hình 4.2: Mô sẹo đƣợc hình thành từ mẫu lớp mỏng lóng thân cây D. burmanni Vahl trên môi trƣờng Gamborg’s B5, bổ sung NAA (0,2 mg/l) và 2,4-D nồng độ thay đổi: A: 0,1 mg/l B: 0,2 mg/l C: 0,4 mg/l D: 0,5 mg/l E: 0,2 mg/l (quan sát dƣới KHV 10 X) 54 4.1.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của các kiểu nuôi cấy lên sự tăng sinh khối mô sẹo và tạo dịch huyền phù Bảng 4.6: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg mô sẹo ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy trên các kiểu nuôi cấy khác nhau Kiểu nuôi cấy Rắn Bán rắn Lỏng tĩnh Lỏng lắc Độ tăng khối lƣợng mô sẹo (mg) 2,01 a 2,35 b 1,97 a 2,91 c Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau giống nhau không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0.05) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 D1 D2 D3 D4 Kiểu nuôi cấy Độ tă ng k hố i l ượ ng m ô sẹ o (m g) Nhận xét Bảng 4.6 và biểu đồ 4.2 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tăng khối lƣợng mô sẹo trên 4 kiểu nuôi cấy khác nhau. Độ tăng khối lƣợng mô sẹo ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc là tốt nhất 291% khối lƣợng ban đầu, kế đến là kiểu nuôi cấy bán rắn 235%, môi trƣờng rắn 201%, cuối cùng là môi trƣờng lỏng tĩnh 197%. Biểu đồ 4.2: Khối lƣợng mô sẹo tăng từ 1 mg ban đầu sau 21 ngày nuôi cấy. 55 Hình 4.3. A: Mô sẹo nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc. B: Cụm tế bào quan sát dƣới kính hiển vi 40X. C: Tế bào đơn quan sát dƣới kính hiển vi 40X. Nhƣ vậy, ở các môi trƣờng dạng lỏng mô sẹo dễ hấp thụ chất dinh dƣỡng hơn môi trƣờng dạng rắn. Tuy nhiên môi trƣờng ở dạng lỏng tĩnh do các mẫu mô sẹo hoàn toàn ngập trong dịch môi trƣờng, thiếu oxi nên sau một thời gian chúng ngừng tăng trƣởng và có dấu hiệu bị hóa đen. Trái lại, ở kiểu nuôi cấy lỏng lắc, mô sẹo vừa hấp thu chất dinh dƣỡng dễ dàng vừa có sự trao đổi khí tốt hơn nên trọng lƣợng mô sẹo tăng lớn nhất. Bên cạnh đó, nhận thấy rằng khi mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng mà có thêm chuyển động lắc liên tục, các mô sẹo xốp sẽ bị tách rời, tạo các cụm tế bào và tế bào đơn trong dịch nuôi cấy. Đây chính là dạng khởi đầu của dịch huyền phù tế bào (Hình 4.3). Tuy nhiên do giới hạn về thời gian thực hiện chúng tôi chƣa nghiên cứu đƣợc những yếu tố khác để tối ƣu hóa dịch huyền phù này mà mới chỉ ở bƣớc đầu tạo đƣợc dịch huyền phù. Tóm lại qua thí nghiệm trên chúng tôi chọn kiểu nuôi cấy lỏng lắc là kiểu nuôi cấy tốt nhất để tăng sinh khối mô sẹo cũng nhƣ tạo dịch huyền phù tế bào. . A C B 56 4.1.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hiǹh thành sắc tố đỏ của mô sẹo Bảng 4.7: Kết quả ảnh hƣởng ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ ở mô sẹo Điều kiện nuôi cấy Chiếu sáng 16h/ngày Ủ tối hoàn toàn Tỷ lệ mẫu mô sẹo có sắc tố đỏ 100 a 0 b Trong cùng một hàng các giá trị trung bình có ký tự theo sau khác nhau có sự khác biệt về mặt thống kê (p < 0.05). Nhận xét Kết quả ở bảng 4.7 và hình 4.4 cho thấy 100% các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng đều có sắc tố đỏ trong khi nuôi hoàn toàn trong tối thì không thấy có sự hình thành sắc tố đỏ. Kết quả này bƣớc đầu cho thấy mối liên hệ giữa ánh sáng với sắc tố đỏ ở cây bắt ruồi và giải thích đƣợc một phần lý do ngoài tự nhiên cây D. burmanni thƣờng có màu đỏ hơn so với cây nuôi cấy mô. Các loại sắc tố ở thực vật ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp nhuộm, màu thực phẩm và cả dƣợc phẩm. Do vậy, việc tìm ra điều kiện hình thành sắc tố đỏ trên mô sẹo cây bắt ruồi sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu sau trong việc điều khiển sắc tố đỏ ở cây bắt ruồi với nhiều ứng dụng hữu ích. 57 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của ánh sáng lên sự hình thành sắc tố đỏ của mô sẹo cây D. burmanni. A, C, E: Mô sẹo đƣợc nuôi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày. B, D, F: Mô sẹo nuôi trong điều kiện ủ tối hoàn toàn. A B C D E F B 58 Sắc ký cột ƣớt Hệ dung môi ether dầu hỏa:chloroform (95:5) 4.2. Ly trích và cô lâp̣ hơp̣ chất anthraquinone trong cây D. burmanni Vahl Sơ đồ 4.1: Quy trình ly trích và cô lập hợp chất anthraquinone. Thuốc thử Borntraeger Sắc ký cột khô với dung môi benzene Định tính anthraquinone trong các phân đoạn bằng sắc ký bản mỏng -Sấy ở 500C, xay thành bột mịn -Ngầm dầm trong ethanol -Cô quay Cây D. burmanni in vitro Cao thô ethanol Phân đoaṇ cao benzene Sắc ký điều chế nhiều lần với hệ dung môi benzene:chloroform (3:7) Hợp chất anthraquinone 59 Hợp chất anthraquinone sau khi đƣợc cô lập từ sơ đồ 4.1, sẽ đƣợc sử dụng nhƣ chất tham chiếu cho các thí nghiệm định lƣợng bằng HPLC về sau, với độ tinh khiết ƣớc tính đạt khoảng 70%. 4.3. Định lƣợng hợp chất anthraquinne trong các nguyên liệu nuôi cấy in vitro khác nhau bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC 4.3.1. Xây dựng đƣờng chuẩn Bảng 4.8: Bảng tƣơng quan nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak Nồng độ chất tham chiếu (ppm) Diện tích peak (mAU*S) 14 67,75 28 140,87 42 218,84 56 294,46 70 361,14 Kết quả đươc̣ trích từ phụ lục 3 Đồ thị 4.1: Đƣờng chuẩn tuyến tính giữa nồng độ anthraquinone tham chiếu và giá trị diện tích peak. y = 5.2884x - 5.5029 R 2 = 0.9994 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 20 40 60 80 Nồng độ (ppm) D iệ n tíc h pe ak (m A U *S ) 60 Hình 4.9: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 70 ppm. Hình 4.5: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm .ppm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.6: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 28 ppm ppm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắ ký đồ HPLC của anthraqu none tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.7: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 42 ppm pm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm Hình 4.8: Sắc ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 56 ppm pm Hình Error! No text of specified style in document..1. Sắ ký đồ HPLC của anthraquinone tham chiếu ở 14 ppm 61 Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng có hệ số tƣơng quan giữa nồng độ chất tham chiếu và diện tích peak là R2 ~ 1. Đây là một giá trị đáng tin cậy để khẳng định rằng nồng độ anthraquinone trong một mẫu chất có mối quan hệ tuyến tính với giá trị diện tích peak trong điều kiện chạy HPLC nhất định. Mối quan hệ này đƣợc thể hiện bằng phƣơng trình y = 5,2884x – 5,5029. Do đó đƣờng chuẩn này đƣợc sử dụng để tính hàm lƣợng anthraquinone trong các mẫu cần phân tích ở các thí nghiệm sau. 4.3.2. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của cách xử lý mẫu trong định lƣơṇg hợp chất anthraquinone Hình 4.10: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình A. Hình 4.11: Sắc ký đồ HPLC của mẫu cây D. burmanni đƣợc xử lý theo quy trình B. anthraquinone 62 Qua ghi nhận sắc ký đồ (Hình 4.10, 4.11) của hai mẫu cây đƣợc x ử lý theo 2 cách A, B (Sơ đồ 3.2) chúng tôi rút ra các nhận xét sau: Các mẫu cây qua giai đoạn sấy khô trƣớc khi xử lý mẫu sẽ cho các tín hiệu kết quả HPLC rõ ràng hơn các mẫu cây tƣơi: ở các mẫu cây tƣơi có xuất hiện tƣợng peak đôi trong khi các mẫu khô thì không. Nguyên nhân của hiện tƣợng này là do các chất nhớt trong mẫu tƣơi tạo độ nhớt cao cho dung dịch sắc ký. Độ nhớt này ảnh hƣởng đến tốc độ ly giải của cột cũng nhƣ độ hấp thu của mẫu phân tích. Ở các mẫu khô giai đoạn sấy đã làm mất đi phần lớn chất nhớt trong cây nên kết quả ghi nhận cải thiện đáng kể. Do giới hạn đề tài chƣa đủ thời gian để tối ƣu hơn nữa quy trình xử lý mẫu nhằm loại bớt các chất không quan tâm trong mẫu định lƣợng, kết quả sắc ký đồ còn lẫn nhiều tạp chất. Tuy nhiên, quy trình xử lý mẫu B sẽ làm tiền đề để có thể nghiên cứu hơn nữa cách loại tạp sau này. 4.3.3. Thí nghiệm 7: So sánh hàm lƣợng hợp chất anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Bảng 4.9: Kết quả so sánh hàm lƣợng anthraquinone trong các bộ phận khác nhau của cây in vitro Mẫu phân tích Mẫu thân lá Mẫu rễ Trọng lƣợng khô (mg) 300 300 Thể tích dung dịch phân tích (ml) 60 70 Y= giá trị diện tích peak (mAU*S) 728,70 682,27 X = nồng độ anthraquinone trong mẫu (ppm) 138,83 130,05 Hàm lƣợng anthraquinone (% so với trọng lƣợng khô) 2,78 3,03 63 Hình 4.12: Sắc ký đồ HPLC của mẫu rễ cây D. burmanni Vahl. Hình 4.13: Sắc ký đồ HPLC của mẫu thân lá cây D. burmanni Vahl. Kết quả ở bảng 4.9 và sắc ký đồ hì nh 4.12, 4.13 cho thấy hơp̣ chất anthraquinone hiêṇ diêṇ trong tất cả các bô ̣phâṇ của cây D. burmanni với hàm lƣợng tƣơng ứng là 2,78% (so với troṇg lƣơṇg khô ) ở mẫu thân lá và 3,03% ở mẫu rê.̃ So sánh với nhƣ̃ng công bố trƣớc đây về hàm lƣơṇg các hơp̣ chất quinone ở môṭ số loài Drosera thì hàm lƣợng này khá cao : theo Repcák và Galambosi (1994) [27], hàm lƣợng 7-methyljuglone trong cây D. rotundifolia là 2,7% trọng lƣợng khô và trong cây D. anglica là 2,1%; Krenn (1995) [21] cũng cho biết hàm lƣợng plumbagin trong 2 mẫu D. peltata là 0,569% và 0,305% so với trọng lƣợng khô; anthraquinone anthraquinone 64 hàm lƣợng plumbagin trong 11 mẫu D. madagascariensis dao động trong khoảng 0,002 - 0,01% so với trọng lƣợng cây khô. Tóm lạ i, kết quả này cho thấy tiềm năng rất cao của viêc̣ nuôi cấy in vitro cây D. burmanni Vahl trong thu nhâṇ hơp̣ chất quinone. Bên caṇh đó , bảng 4.9 cũng cho thấy hàm lƣợng anthraquinone trong rễ lớn hơn trong thân lá . Kết quả này đa ̃mở ra môṭ hƣớng nghiên cƣ́u có nhiều tiềm năng trong thu nhâṇ hơp̣ chất thƣ́ cấp : nuôi cấy rễ . Kỹ thuật nuôi cấy rễ t hƣc̣ vâṭ , nhằm thu nhâṇ các hơp̣ chất có nhiều trong rễ , đa ̃đƣơc̣ áp duṇg khá thành công trên thế giới, chẳng haṇ nhƣ năm 2001, Verma và ctv đa ̃sƣ̉ duṇg Agrobacterium rhizogenes để kích thích tạo rễ khi nuôi cấy Plumbago zeylanica giúp thu đƣợc hàm lƣợng plumbagin cao gấp 2,5 lần so với khi nuôi cấy ở điều kiêṇ bình thƣờng [30]. 4.3.4. Thí nghiệm