Khóa luận Khảo sát độc tính của nấm metarhizium anisopliae trên sùng trắng (phyllophaga crinita)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA NẤM Metarhizium anisopliae TRÊN SÙNG TRẮNG (Phyllophaga crinita) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: Ninh Thị Huyền Nga Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA NẤM Metarhizium anisopliae TRÊN SÙNG TRẮNG (Phyllophaga crinita) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001-2005 Giáo viên hướng dẫn: TS. Trần Tấn Việt TS. Lê Đình Đôn Sinh viên thực hiện: Ninh Thị Huyền Nga Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 3 LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên con vơ cùng biết ơn ba mẹ đã sinh thành, dưỡng dục và nuơi dạy con đến ngày hơm nay. Với lịng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn quý thầy cơ trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, truyền đạt mọi kiến thức cho em trong suốt thời gian em theo học tại trường. Em vơ cùng biết ơn thầy Trần Tấn Việt, thầy Lê Đình Đơn người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những khĩ khăn, vướng mắc trong thời gian làm đề tài và giúp em hồn thành tốt đề tài này. Bên cạnh đĩ em xin chân thành cảm ơn cơ Oanh, cơ Thuận và thầy Trúc đã giúp đỡ em và tạo điều kiện thuận lợi cho em khi làm thí nghiệm bên phịng 105, phịng cơn trùng. Em xin cảm ơn chị Ngọc phịng cơn trùng, chị Thơ, chị Kiều, chị Vy phịng 118 đã tận tình giúp đỡ em và chị Tùng Anh đã hướng dẫn cho em trong thời gian em làm đề tài. Ngồi ra tơi xin cảm ơn chú Ba, chú Tư, anh Linh ở trại phân Nơng Học đã giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập đề tài. Sau cùng tơi xin cảm ơn bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và động viên tơi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Tp.HCM, tháng 8 năm 2005 Sinh viên Ninh Thị Huyền Nga 4 TĨM TẮT NINH THỊ HUYỀN NGA, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CỦA NẤM Metarhizium anisopliae TRÊN SÙNG TRẮNG. Giảng viên hướng dẫn: TS. TRẦN TẤN VIỆT TS. LÊ ĐÌNH ĐƠN Nấm Metarhizium anisopliae là loại nấm diệt được các cơn trùng trên đồng ruộng rất hiệu quả. Lợi dụng đặc điểm này người ta đã tạo ra chế phẩm sinh học MA diệt trừ các loại sâu, rầy… trên đồng ruộng giúp cải thiện năng suất cây trồng nơng nghiệp. Đề tài đã được thực hiện tại trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh nhằm khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên gồm 18 nghiệm thức trong đĩ 14 nghiệm thức ứng với 10 dịng nấm (BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8, MA 2, CP MA, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3,MA 11 và MA 13) và 4 nghiệm thức đối chứng bao gồm: để nguyên, phun nước, phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước và đối chứng gây vết thương. Các nghiệm thức được thực hiện dựa trên 3 phương pháp gây nhiễm, 5 mẫu trên mỗi nghiệm thức. Cĩ 3 dịng nấm cĩ khả gây độc trên sùng trắng là BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11. Trong đĩ dịng MA 11 biểu hiện độc tính cao nhất (tỷ lệ sùng chết 80%). Phương pháp gây nhiễm 1 và phương pháp gây nhiễm 2 khơng mang lại hiệu quả khi gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng. Phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm) là phương pháp hiệu quả khi gây nhiễm các dịng nấm BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11. Các dịng cịn lại (BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 2, CP MA, MA 13) khơng hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm. 5 MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii TĨM TẮT ..................................................................................................................... iv MỤC LỤC ...................................................................................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ....................................................................... vii DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ ................................................................................... viii Chương 1: Lời mở đầu ................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2 Mục đích yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1 Mục đích .................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................... 2 Chương 2: Tổng quan tài liệu ........................................................................................ 3 2.1 Giới thiệu sùng trắng ................................................................................................ 3 2.1.1 Mơi trường sống, nguồn thức ăn và khả năng gây hại của sùng trắng ................. 3 2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố, chu kì sống, tập tính hoạt động của sùng trắng và xác định lồi .............................................................................................................. 3 2.1.3 Các giai đoạn phát triển khác của sùng trắng ....................................................... 5 2.1.4 Biểu hiện gây hại ................................................................................................... 6 2.1.5 Các biện pháp hạn chế sùng trắng ......................................................................... 6 2.2 Chế phẩm sinh học diệt cơn trùng ............................................................................ 7 2.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của biện pháp phịng trừ sinh học ..................... 7 2.2.1.1 Giai đoạn tiền sử đến năm 1888......................................................................... 7 2.2.1.2 Giai đoạn phát triển từ năm 1888 đến năm 1940 ............................................... 9 2.2.1.3Giai đoạn phát triển từ 1940 năm đến năm 1960 .............................................. 10 2.2.1.4 Giai đoạn phát triển từ năm 1960 đến nay ........................................................ 11 2.2.2 Vai trị của chế phẩm sinh học ............................................................................ 11 2.2.3 Tính ưu việt của chế phẩm sinh học ................................................................... 13 2.2.4 Các bước áp dụng biện pháp sinh học ................................................................ 14 2.2.5 Một số chế phẩm sinh học diệt cơn trùng hiện nay............................................. 15 2.3 Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae ................................................................ 15 6 2.3.1 Nấm ký sinh cơn trùng ........................................................................................ 15 2.3.2 Nấm Metarhizium anisopliae .............................................................................. 18 2.3.2.1 Phổ kí chủ của nấm Metarhizium anisopliae ................................................... 19 2.3.2.2 Tác động của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể cơn trùng ................... 19 2.3.2.3 Độc tố diệt cơn trùng của nấm Metarhizium anisopliae .................................. 19 2.3.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa của M.anisopliae .................................................. 19 2.3.2.5 Các dạng nấm Metarhizium anisopliae ............................................................ 20 2.4 Các nghiên cứu trong nước và trên thế giới ........................................................... 21 2.4.1 Các nghiên cứu trong nước ................................................................................. 21 2.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 21 Chương 3: Vật liệu – Phương pháp ............................................................................. 23 3.1 Nuơi sùng trắng ...................................................................................................... 23 3.2 Nhân giống nấm Metarhizium anisopliae .............................................................. 24 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae .............................................. 26 3.3.1 Phương pháp khảo sát độc tính ........................................................................... 26 3.3.2 Bố trí thí nghiệm ................................................................................................. 27 Chương 4: Kết quả và thảo luận .................................................................................. 29 4.1 Giai đoạn nuơi sùng ............................................................................................... 29 4.2 Giai đoạn nhân nấm ............................................................................................... 29 4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae .............................................. 32 4.3.1 Phương pháp gây nhiễm 1 và 2 ........................................................................... 32 4.3.2 Phương pháp gây nhiễm 3 ................................................................................... 36 4.3.3 Ảnh hưởng của các phương pháp gây nhiễm nấm .............................................. 40 4.3.4 Hiệu quả của các dịng nấm với các phương pháp xử lý .................................... 41 Chương 5: Kết luận và kiến nghị ................................................................................. 43 5.1 Kết luận .................................................................................................................. 43 5.2 Kiến nghị ................................................................................................................ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 44 7 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Bảng tra phổ tác động của nấm bất tồn trên động vật chân đốt ................... 16 Bảng 2.2 Bảng tra các lồi trong chi nấm lục cương .................................................... 18 Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm diệt sâu và cơn trùng gây hại .............. 25 Bảng 3.1 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 1 .................................................. 27 Bảng 3.2 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 2 .................................................. 27 Bảng 3.3 Bảng bố trí thí nghiệm theo phương pháp 3 .................................................. 28 Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dịng nấm trong 1 g bột nấm ................................... 31 Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 1 ...................................................................................................................................... 32 Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 2 ...................................................................................................................................... 33 Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 3 ................................................................................................................ 36 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp gây nhiễm 1,2 và 3 trên dịng nấm M.anisopliae BXĐTV 3 ................................................................................................. 41 Bảng 4.6 Hiệu quả của các dịng nấm với 3 phương pháp gây nhiễm .......................... 42 8 DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Hình 2.1 Các đốt hậu mơn từ các lồi sùng trắng khác nhau .......................................... 4 Hình 2.2 Vịng đời sùng .................................................................................................. 5 Hình 4.1 Sùng nuơi trong điều kiện thí nghiệm ............................................................ 29 Hình 4.2 Nấm Metarhizium anisopliae trên mơi trường thạch và trên mơi trường xốp (cơm) ....................................................................................................................... 30 Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước .................................................................................................................. 34 Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2. ............................................................................................................................ 35 Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương ............................................ 37 Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3 ................................................................... 38 Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3 .............................................................. 39 Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm ....................................... 40 9 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cơn trùng gây hại luơn là mối đe dọa cho nền sản xuất nơng nghiệp. Đối với các quốc gia dựa vào nền nơng nghiệp, sự nguy hại đĩ càng nghiêm trọng. Chính vì vậy chúng trở thành đối tượng quan tâm trong rất nhiều nghiên cứu khoa học với mong muốn là làm sao loại trừ được các cơn trùng gây hại? Qua nhiều thập kỉ, để diệt các cơn trùng gây hại người ta đã sử dụng biện pháp hĩa học như một biện pháp đem lại hiệu quả tối đa.Tuy nhiên song song với lợi ích đĩ, biện pháp hĩa học gây xáo trộn hệ sinh thái, làm thối hĩa đất và làm ơ nhiễm mơi trường. Cao hơn nữa là vấn đề kháng thuốc và dư lượng thuốc hĩa học tồn đọng trong thực vật gây tác động xấu đến sức khỏe của con người. Trước thực tế đĩ, con người phải tìm kiếm một phương pháp khác vừa hiệu quả vừa an tồn cho con người và khơng ơ nhiễm mơi trường đồng thời khơng làm mất cân bằng sinh thái, biện pháp phịng trừ bằng sinh học ra đời. Biện pháp này dựa trên khả năng kí sinh của các lồi nấm, vi khuẩn và virus; cĩ nghĩa là sử dụng các sinh vật sống để diệt trừ cơn trùng gây hại. Nhờ những ưu điểm của mình, biện pháp này hiện đang được các nhà khoa học khắp thế giới rất quan tâm và là hướng ưu tiên hàng đầu trong cơng tác phịng trừ sâu bệnh. Hiện nay nấm được sử dụng rộng rãi trong phịng trừ các cơn trùng gây hại do tính hiệu quả và các lợi ích về mơi trường và con người, hơn thế nữa nấm cịn một ưu điểm về phổ kí sinh rộng. Chính vì vậy, việc sản xuất chế phẩm nấm diệt cơn trùng đã dần dần được chú trọng. Do sự đa dạng về các chủng lồi với độc tính khác nhau, các nghiên cứu về nấm vẫn khơng ngừng được tìm tịi nghiên cứu. Trong các loại nấm diệt cơn trùng, nấm Metarhizium anisopliae được xem là một loại nấm cĩ khả năng diệt cơn trùng rất hữu hiệu. Theo các nghiên cứu trước, loại nấm này cĩ khả năng diệt được cào cào và bọ xít với hiệu quả rất tốt. Đặc biệt trong phổ kí sinh của mình, nấm M. anisopliae cĩ thể diệt được một số lồi bọ cánh cứng cĩ thể gây hại nghiêm trọng cho cây trồng nơng nghiệp. Trong số các 10 lồi bọ cánh cứng đĩ, các cơn trùng họ bọ hung là lồi cơn trùng rất được quan tâm hiện nay do khả năng gây hại nghiêm trọng trên rễ thực vật của ấu trùng (cịn gọi là sùng trắng) và khả năng gây hại trên lá của thành trùng. Trước thực tế đĩ, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng .” 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Chọn lựa phương pháp nhân nấm thích hợp cho nghiên cứu.  Đánh giá độc tính của các dịng nấm Metarhizium anisopliae để chọn lọc được các dịng cĩ độc tính cao. 1.2.2 Yêu cầu  Hiểu biết về đặc điểm sinh học, nguồn thức ăn, tập tính hoạt động của sùng trắng. Từ đĩ tìm ra cách thức nuơi thích hợp đối với sùng trắng.  Tìm hiểu đặc điểm sinh học của nấm Metarhizium anisopliae và các phương pháp nuơi cấy và nhân giống nấm thích hợp cho nghiên cứu. 11 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sùng trắng Cĩ hơn 100 lồi bọ cánh cứng thuộc họ bọ hung từ vài giống khác nhau (Cyclocephala, Phyllophaga, Ataenius) được xem là sùng trắng. Tuy nhiên gọi chung là Phyllophaga crinita. Đặc điểm sinh học của chúng giống nhau nhưng khác nhau về sự phân bố, mơi trường sống, chu kì sống và thời gian xuất hiện. Nhìn chung các lồi bao gồm: Cyclocephala immaculata (Oliver), Cotinis nitida (Linnaeus). Một thành viên quan trọng khác của họ bọ hung là Popillia japonia di chuyển vào Đơng Bắc Mỹ và di cư đến phía Tây và Nam. 2.1.1 Mơi trường sống, nguồn thức ăn và khả năng gây hại của sùng trắng Mơi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng chủ yếu trên các đồng cỏ. Sùng ăn trên lá cỏ, các thực vật cấy ghép và cây trang trí trong nơng nghiệp. Chúng là cơn trùng gây hại nghiêm trọng đến thức ăn của bị, gây hại đến bắp lúa miến và mía đường. Ngồi ra sùng cịn ăn các chất hữu cơ mục nát Hầu hết sự tàn phá trên thực vật do sự gây hại của sùng trên rễ. Sùng trắng là một trong những cơn trùng phá hoại lớp đất mặt. Chúng ăn rễ cỏ và cĩ thể phá hoại hồn tồn hệ thống rễ của thực vật. Vùng rộng của lớp đất mặt cĩ thể bị chết trong một thời gian ngắn. 2.1.2 Đặc điểm sinh học, phân bố, chu kì sống, tập tính hoạt động của sùng trắng và xác định lồi Sùng trắng là ấu trùng hình chữ C của một nhĩm lớn bọ cánh cứng được gọi là bọ hung. Nhiều lồi bọ hung được tìm thấy ở bang United States dưới các đám cỏ. Hầu hết các lồi quan trọng là: bọ cánh cứng Nhật Bản , Popillia japonica Newman; lồi bọ cánh cứng tháng 5 và tháng 6 , Phylophaga spp.; lồi bọ da phía bắc và phía nam, Cyclcephala spp.; ataenius, Ataenius spretulus. Cụ thể hơn, các con sùng trắng phân bố rộng khắp trên trái đất, chúng là ấu trùng của bọ da Châu Âu, Rhizotrogus majalis (Razoumowsky); Bọ cánh cứng ở Châu Á, Maladera castanea ; và bọ cánh cứng vào tháng 6, Cotinis nitida. 12 Cĩ nhiều lồi sùng trắng ở Nebraska. Hầu hết các nhĩm quan trọng là bọ da Cyclocephala spp. (ấu trùng một năm), bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 Phyllophaga spp. (vịng đời 3 năm), và vài lồi riêng trong nhĩm riêng của chúng, black turfgrass ataenius, Ataenius spretulus. Việc xác định các giai đoạn ấu trùng của 3 nhĩm này cĩ thể thực hiện được bằng cách kiểm tra các đốt hậu mơn. (Nguồn Bọ da Loại sùng trắng này hồn thành chu kì sống của nĩ trong một năm. Thành trùng màu nâu rám nắng, dài 15mm và nhỏ hơn ấu trùng tuổi 3. Thành trùng thường xuất hiện từ cuối tháng 6 đến tháng 7. Chúng bị hấp dẫn bởi ánh sáng và thường ở quanh các cửa sổ hoặc các đèn hành lang. Thành trùng để trứng trên mặt đất thành từng cụm nhỏ. Ấu trùng nhỏ nở ra từ trứng và bắt đầu ăn rễ cỏ. Hầu hết sự phá hoại xuất hiện vào cuối mùa và sớm giảm khi ấu trùng tiến đến giai đoạn ấu trùng thứ 2. Khi bắt đầu thời tiết lạnh, các ấu trùng di chuyển sâu hơn xuống đất cho đến khi qua mùa đơng. Khi đất trở nên ấm hơn trong mùa xuân chúng di chuyển lên trên và ăn rễ cỏ trong một thời gian ngắn, hĩa nhộng và nhũ hĩa thành thành trùng để bắt đầu chu kì sống mới. Bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 Ấu trùng ăn chủ yếu các cây mục nát. Ấu trùng đào bới làm nhổ bật cỏ. Cĩ thể thấy ấu trùng trên mặt đất sau cơn mưa rào. Chúng rất dễ nhận biết vì chúng thường đi bằng lưng chứ khơng đi bằng chân Các ấu trùng loại này phải mất 3 năm để hồn thành chu kì sống. Tuy nhiên cĩ thể dưới 2 năm ở nhiệt độ đất trung bình.Thành trùng màu nâu tối được gọi là Ataenius Phyllophaga Cyclocephala Hình 2.1 Các đốt hậu mơn từ các lồi sùng trắng khác nhau. 13 Hình 2.2 Vịng đời sùng (Trích Peter A.C. Ooi, 2005) Phyllophaga grubs, ngắn hơn 16mm. Thành trùng bị hấp dẫn bởi ánh sáng ban đêm và cĩ thể ăn lá cây. Thành trùng hoạt động trong mùa xuân, thường từ cuối tháng 5 cho đến đầu tháng 7. Trứng được đặt trong đất và nở sau một vài ngày. Các ấu trùng nhỏ ăn suốt đầu mùa hè, di chuyển xuống đất đến khi qua đơng. Sang mùa hè thứ 2 chúng ăn nhiều – gây hại nhiều, rồi di chuyển xuống đất đến qua mùa đơng thứ 2. Chúng tiếp tục ăn trong năm thứ 3, qua đơng là trưởng thành và nhũ hĩa sau mùa xuân để hồn tất chu kì sống. Chúng cĩ thể được xác định qua các đốm đen ở dọc 2 bên cơ thể Black Turfgrass Ataeciusi Chu kì sống của lồi này liên quan đến cả ấu trùng một năm và ấu trùng 3 năm, nhưng thành trùng và ấu trùng thì nhỏ hơn nhiều. Hầu hết các lồi trong nhĩm đều ăn phân để sống. Sự gây hại của chúng chủ yếu xuất hiện trong bãi chơi gơn vào mùa mát cịn trong mùa ấm thì khơng thấy. Thành trùng màu nâu tối và dài khoảng 6 mm. Ấu trùng cĩ vẻ bề ngồi giống các sùng trắng khác, nhưng nhỏ hơn nhiều. Phải cĩ một lượng lớn các ấu trùng xuất hiện trước khi sự phá hoại xuất hiện. Các con thành thục qua đơng trong khu vực bảo vệ sát mặt đất. Chúng vũ hĩa trong mùa xuân và đặt trứng trên mặt đất. Thế hệ đầu tiên ăn vào tháng 5 và tháng 6, thế hệ tiếp theo nhũ hĩa vào tháng 7. 2.1.3 Các giai đoạn phát triển khác của sùng trắng: Bọ hung cĩ chu kỳ sống hồn tồn với trứng, ấu trùng, nhộng và con trưởng thành. Các con bọ cánh cứng Nhật Bản, bọ da, bọ cánh cứng tháng 6, bọ da Châu Âu, bọ cánh cứng phương Đơng và bọ cánh cứng Châu Á cĩ chu kì sống một năm. Các bọ cánh cứng tháng 5/ tháng 6 thường mất 2 hoặc 3 năm để phát triển trong Ohio nhưng một số lồi phía nam thì cĩ chu kì sống một năm. Black turgrass ataenius và các bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 trưởng thành qua đơng thì thành con trưởng thành. 14 Trứng: Hầu hết trứng cĩ màu trắng kem dài 1,5mm và hình trái xoan nhỏ khi được đẻ đầu tiên trong đất. Chúng hút nước từ đất và lớn lên dần dần trở nên trịn ra. Nhộng: Nhộng thường dài hơn con trưởng thành và thường nằm trong các ổ đất 24 – 48 mm. Nhộng cĩ màu kem sau đĩ tối dần trước khi thành trùng. Thành trùng: Thành trùng là các con bọ hung khỏe mạnh, các con bọ cánh cứng hình bầu dục với cái anten trên đầu. Nhìn chung là dễ xác định bằng mắt thường nhưng việc xác định một số lồi bọ cánh cứng tháng 5/tháng 6 và các con bọ da thì cần phải cĩ chuyên gia. 2.1.4 Biểu hiện gây hại Sau khi nở từ trứng, các ấu trùng nhỏ của cả 3 nhĩm đều ăn rễ cỏ. Dấu hiệu đầu tiên của sự tổn thương được xác định bằng các vùng cỏ sắp chết và mất màu thể hiện các triệu chứng tương tự như do tình trạng ẩm. Đầu tiên các vùng chết nhỏ nhưng sẽ lan rộng và kết thành khối khi các ấu trùng sinh trưởng và mở rộng vị trí ăn. Cỏ cĩ thể chết do hệ thống rễ bị phá hoại nếu hơi ẩm đất khơng được duy trì để khuyến khích sự tái sinh của ngọn. Nĩi chung, 8 – 10 sùng một năm hoặc 3 – 5 ấu trùng 3 năm hiện diện trước khi sự tổn thương xuất hiện. Trong khi các nhân tố khác cĩ thể gây các triệu chứng tương tự thì thật dễ dàng để xác định nếu các ấu trùng cĩ mặt. Kiểm tra đất quanh khu vực rễ. Nếu khơng cĩ sùng thì kiểm tra cỏ để tìm các nguyên nhân khác như rễ nơng, sâu kéo màng, bệnh, mật độ dày quá mức, nhiệt độ nĩng, và/hoặc do rệp. 2.1.5 Các biện pháp hạn chế sùng trắng  Biện pháp sử dụng tuyến trùng kí sinh: Các tuyến trùng kí sinh thương mại (Steinernema carpocapsae hoặc Heterohabditis) cĩ thể diệt sùng rất đã hiệu quả. Các tuyến trùng hoạt động tốt nhất dưới đất ẩm vì vậy tưới nước là rất quan trọng.  Biện pháp sử dụng hĩa chất ( thuốc trị bệnh): Xử lý thuốc vào cuối mùa hè sau khi trứng nở, sùng nhỏ ăn và gây hại sẽ được kiểm sốt. Vì hầu hết các loại thuốc sử dụng trên đồng cỏ chỉ tồn tại trong thời gian ngắn nên sử dụng thuốc trị bệnh cần cĩ thời gian chính xác để xử lý hiệu quả. Sùng cĩ thể bị tổn thương khi xử lý thuốc vào cuối mùa hè, nhưng sau đĩ sẽ trở nên khĩ ngăn chặn. Cần quan sát 15 sự nhiễm bệnh trong thời gian chính xác và tưới nước sau khi sử dụng để giữ sùng ở gần mặt đất và để rửa thuốc trừ sâu. Xử lý thuốc hĩa học cĩ ưu điểm là hiệu quả rất nhanh chĩng nhưng khơng thể sử dụng lâu dài vì cĩ thể dẫn đến hiện tượng lờn thuốc, gây ảnh hưởng đến mơi trường, làm mất cân bằng hệ sinh thái và ảnh hưởng đến sức khỏe con người và các động vật nuơi.  Sử dụng thiên địch tự nhiên: là biện pháp xử lý dựa trên vài lồi thú ăn mồi (ví dụ như các con bọ cánh cứng đất…) và các lồi kí sinh. Ấu trùng ong bắp cày kí sinh trên sùng trắng và giết chết nĩ rồi chuyển sang giai đoạn kén trong đất. Mặc dù biện pháp sử dụng thiên địch tự nhiên ít khi diệt hồn tồn quần thể sùng trắng nhưng biện pháp này chỉ khống chế dựa trên các sinh vật từ tự nhiên nên khơng làm biến đổi hệ sinh thái mơi trường giúp mơi trường được cân bằng, khơng gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người đồng thời cĩ thể duy trì quần thể sùng trắng ở một mức độ cho phép để sử dụng vào các mục đích khác cĩ lợi cho con người. 2.2 Chế phẩm sinh học diệt cơn trùng 2.2.1 Lịch sử hình thành và phát triển của biện pháp sinh học Biện pháp sinh học được hình thành và phát triển dựa vào những quan sát và thực nghiệm của các nhà nghiên cứu tự nhiên từ thời xa xưa. Cho đến hơm nay biện pháp sinh học đã phải trải qua những bước thăng trầm trong nhiều thế kỷ. Nhìn chung lịch sử hình thành và phát triển của biện pháp sinh học được chia thành 4 giai đoạn: 2.2.1.1 Giai đoạn tiền sử đến năm 1888 Con người đã áp dụng biện pháp sinh học để trừ dịch hại từ rất lâu vì vậy, biện pháp sinh học cịn được gọi là biện pháp bảo vệ thực vật cổ truyền. Theo Coppel và Mertins (1977),việc áp dụng biện pháp sinh học đầu tiên để trừ dịch hại là việc người Ai Cập cổ đại thuần hĩa mèo rừng để bắt chuột trong nhà. Theo Vaxiliev (1975) và Hồng Đức Nhuận (1979), nơng dân Việt Nam cũng biết sử dụng cơn trùng cĩ ích từ rất sớm, ngay từ thế kỷ I – IV, nơng dân nước ta đã biết dùng kiến vàng để trừ sâu hại trong vườn cam quýt (1995). Cịn theo Forskal (1775) và Botta (1841), người Yêmen chuyển các tổ kiến cĩ ích về định cư chúng trên cây chà là để trừ các cơn trùng cĩ hại (Doutt, 1964; Coppel và Mertins, 1977). 16 Mặc dù vậy mãi đến những năm của thế kỷ XVI – XVII, những dẫn liệu mới cĩ giá trị khoa học và thực tiễn. Cuốn sách “De Animalibus Insectis” của Aldrovandi cơng bố năm 1602 là cơng trình đầu tiên viết về biện pháp sinh học (Phạm Văn Lầm, 1995). Trong cuốn sách này, Aldrovandi đã miêu tả ong kén trắng tập thể Apanteles glomeratus ký sinh trên sâu non lồi bướm Pieris rapae nhưng ơng vẫn chưa phân biệt được kén và trứng của ong ký sinh. Hiện tượng ký sinh cơn trùng chỉ được giải thích đúng bởi Vallisnieri vào năm 1760. Ngồi ra cịn cĩ các tài liệu cơng bố về cơn trùng ký sinh và cơn trùng bắt mồi ăn thịt của Gedert, Degeer, Reamur, E.Darwin,… đã đặt nền mĩng cho sự hình thành khái niệm vế biện pháp sinh học trừ sâu hại. Linnaeus (1760) đã đưa ra khái niệm “cân bằng tự nhiên”, đây là một trong những cơ sở lý luận quan trọng của biện pháp sinh học (Phạm Văn Lầm, 1995). Từ thế kỷ XVII đến thế kỷ XVIII, những tư tưởng khoa học ngày càng được phát triển mạnh mẽ. Những quan sát, mơ tả đơn giản, riêng biệt các hiện tượng ký sinh cơn trùng ký sinh và cơn trùng bắt mồi, bệnh lý cơn trùng là những chuẩn bị càn thiết cho sự hình thành những ý niệm về vai trị của thiên địch trong hạn chế sự sinh sản của sâu hại. Trong thế kỷ XIX, nhiều cơng trình nghiên cứu về thiên địch của sâu hại được tiến hành như ấn phẩm nổi tiếng “Đại cương về cơn trùng” do Kirby viết vào năm 1862 (Kirby, Spense, 1862), cuốn sách “Ong cự ký sinh cơn trùng” của Ratzeburg xuất bản năm 1844 (Coppel, Mertins, 1977; Doutt, 1964), tác phẩm “tuyển tập về cơn trùng” của Kollar xuất bản năm 1840. Nhưng những nghiên cứu này chỉ mang tính chất thơng tin, chưa ứng dụng được trong thực tiễn. Năm 1878, Metschnikov quan sát được bệnh nấm của bọ hung hại lúa mì Anisoplia austriaca do nấm Entomophthora anisopliae, nay đổi thành Metarhizium anisopliae (Zimmermann, 1992). Năm 1884, Metschinikov sản xuất bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng lớn để bán. Sự thành cơng này mở đầu cho việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trừ sâu hại và khuyến khích các nhà khoa học tiến hành thử nghiệm nhiều loại nấm để trừ sâu hại. Qua các thí nghiệm, các nhà nghiên cứu đã hiểu ra rằng hiệu quả của nấm trừ cơn trùng phụ thuộc rất lớn vào ẩm độ mơi trường (Coppel và Mertins, 1977). Qua chương trình áp dụng nấm Beauveria 17 globurifera để trừ bọ xít lúa mì Blissus leucopterus trên đồng ruộng vào năm 1891–1892, vì hiệu quả gây bệnh của nấm khơng giống nhau nên các chủ trang trại khơng thích áp dụng biện pháp này (Coppel va Mertins, 1977; Weiser, 1966). 2.2.1.2 Giai đoạn phát triển từ năm 1888 đến năm 1940 Năm 1889, Koebele nhập nội bọ rùa Rodolia cardinalis từ Australia sang California để trừ rệp sáp Icerya purchasi hại cam quýt thành cơng (Doutt,1964), đánh dấu sự phát triển của biện pháp sinh học. Phương pháp Koebele giúp biện pháp sinh học trở thành biện pháp cĩ hiệu quả trong phịng chống dịch hại. Từ năm 1893 đến năm 1912, ở Hawaii Koebele đã thực hiện thành cơng nhiều chương trình áp dụng biện pháp sinh học cĩ giá trị lớn cho sự phát triển của biện pháp sinh học chống cơn trùng gây hại cây trồng (Coppel và ctv, 1977). Từ đây các chương trình nhập nội thiên địch được tiến hành rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới để trừ nhiều lồi sâu hại quan trọng trong nơng nghiệp. Ngồi việc nhập nội thiên địch, các nhà khoa học cịn tiến hành nghiên cứu nhân thả thiên địch như nhân nuơi ong mắt đỏ Trichogramma từ năm 1910 – 1911 ở nước Nga và Trung Á, kéo theo rất nhiều thực nghiệm nghiên cứu ong mắt đỏ. Năm 1928, Fladers tìm được qui trình nhân nuơi ngài mạch quanh năm, gĩp phần đẩy mạnh việc nghiên cứu sử dụng ong mắt đỏ (Schepetilnikova, 1974). Mặc dù vi khuẩn gây bệnh cho cơn trùng đã được biết từ lâu nhưng đến những năm đầu thế kỷ XX mới cĩ một số thí nghiệm sử dụng vi khuẩn để trừ sâu hại. Chế phẩm thương mại đầu tiên từ vi khuẩn Bacillus thiringiensis là “Sporeine” được sản xuất trước năm 1938. (Jacobs, 1951). Chương trình áp dụng biện pháp sinh học trừ cỏ dại đầu tiên cĩ ý nghĩa do Koebele tiến hành ở Hawaii vào năm 1902 (Perkins và Swezey, 1924). Đầu thế kỷ XX, các nước Australia, Sri – Lanka, Ấn Độ, Cộng Hịa Nam Phi, New Zealand, Madagscar, đảo Mauritius tiến hành nhập nội cơn trùng từ cỏ dại (Julien, 1992). Những nghiên cứu dùng nấm trừ cỏ dại được bắt đầu từ cuối thế kỷ XIX (Halsted, 1894). Những nghiên cứu về biện pháp sinh học trừ bệnh hại cơn trùng được chú ý từ năm 1908, Potter đã chứng minh rằng hoạt tính của vi sinh vật gây bệnh cho cây cĩ thể được ức chế bằng các sản phẩm trao đổi chất của chính nĩ (Baker, 1985). Năm 18 1926, Sanford đã gợi ý dùng quần thể vi khuẩn hoại sinh cĩ trong phân xanh để phịng chống bệnh ghẻ khoai tây (Baker, 1985). Năm 1929, Hino và Kato thơng báo hiện tượng Ciccinobolus sp. Ký sinh nấm Oidium spp. Năm 1932, Weidling mơ tả hiện tượng Trichoderma ký sinh trên một số nấm khác. Năm 1937 – 1938, Drechsler nghiên cứu hiện tượng nấm ký sinh nấm nấm ăn tuyến trùng (Snyder và ctv, 1976) . Tĩm lại, đây là giai đoạn phát triển mạnh mẽ của biện pháp sinh học trừ cơn trùng gây hại, là thời kỳ biện pháp sinh học cĩ nhiều thành cơng rực rỡ, là thời kỳ biện pháp sinh học được ứng dụng rộng rãi trên tồn thế giới. 2.2.1.3 Giai đoạn phát triển từ năm 1940 đến năm 1960 Năm 1939, thuốc hĩa học trừ sâu tổng hợp ra đời và được sử dụng rộng rãi. Theo phân tích của Sailer (1972) về sự lãng quên biện pháp sinh học trước sự ra đời của DDT: năm 1915 tương quan số lượng các cơng trình nghiên cứu biện pháp hĩa học và biện pháp sinh học là 1 : 1, trong những năm chiến tranh thế giới thứ hai tương quan này là 6 : 1, năm 1946 tương quan này nghiêng hẳn sang biện pháp hĩa học 20 : 1 (Phạm Văn Lầm, 1995). Tuy vậy vẫn cĩ những chương trình nghiên cứu biện pháp sinh học được tiến hành như sự phát hiện độc tố alpha của Toumanoff (1953), nội độc tố delta của Hannay (1953), ngoại độc tố beta của Hall và Arkawa (1959) (Coppel và ctv, 1977); phát hiện nhiều thực khuẩn thể tấn cơng vi khuẩn gây bệnh gây bệnh cây trong tự nhiên và cho rằng cĩ thể dùng các thực khuẩn thể này để bảo vệ cây khơng bị một số vi khuẩn (Fulton, 1950; Stolp, 1956; Cross, 1959); và những nghiên cứu về các vi sinh vật khác như hồn thiện phương pháp nuơi cơn trùng vật chủ và các thiên địch của chúng (Hagen và Franz, 1973), ong mắt đỏ Tricogramma (Schepetilnikova, 1974), ong ăn lá Diprion herlyniae (Sommonds và ctv, 1976). Trong thời kỳ này, các nhà cơn trùng học đã biết lợi dụng thiên địch tại chỗ trong phịng chống cơn trùng hại với những biện pháp bảo vệ thiên địch trong tự nhiên: phun thuốc theo băng, dùng thuốc cĩ thời gian tác dụng ngắn, chuẩn bị nơi qua đơng cho chim ăn sâu,… (Coppel và ctv, 1977; Telenga, 1959). Bắt đầu từ thập kỷ 50, cùng với những phát hiện các nấm chuyên tính để trừ cỏ dại: nấm Colletotrichum xanthii trừ cỏ Cuscuta (Leach,1946) và trừ cỏ Xanthium 19 spinosum (Butler, 1951), nấm Alternaria cuscuta (Simmonds và ctv, 1976); thiên địch để trừ cỏ dại được nhập nội taị các nước phát triển (Australia, Canada, Hoa Kỳ,…) lẫn các nước đang phát triển (Nevis, Kenya, Tanzania, Chile,…) (Julien, 1992). Những dẫn liệu về cơ sở khoa học của biện pháp sinh học trừ bệnh hại cây trồng xuất hiện nhiều trên các bào chí khoa học, Stout (1950) tìm thấy một chủng yếu virus gây bệnh khảm ở đào, cây bị nhiễm virus này chỉ gây triệu chứng bệnh rất nhẹ, và cây vẫn cĩ triệu chứng bệnh rất nhẹ khi bị nhiễm chủng mạnh của chính virus đĩ. Gramann (1950) cũng quan sát thấy hiện tượng tương tự ở nhĩm virus X của khoai tây (Snyder, 1976). Như vậy khi nhiễm virus cĩ độc tính gây bệnh yếu cho cây, cây sẽ chống lại được các chủng cĩ độc tính gây bệnh cao. Ngồi ra nấm ký sinh nấm cũng được thực hiện nghiên cứu bởi Aytoun (1953), Boosalis (1954, 1956), Butler (1957). Cơn trùng ăn tuyến trùng thực vật cũng được chú ý đến bởi Aguilar (1944), Brown (1954), Hutchinson và ctv (1960),… Một số nhà khoa học phê phán biện pháp hĩa học, nghiện cứu biện pháp hĩa học với biện pháp sinh học: dùng thuốc cĩ tác dụng chọn lọc, giảm nồng độ, giảm số lần dùng thuốc, chọn thời gian dùng thuốc thích hợp (Michelbacher, Bacon, 1952; Smith, Allen, 1954; Bartlett, 1956). Năm 1959, khuynh hướng sinh thái với các nguyên lý sinh thái học được hình thành và chấp nhận trong bảo vệ thực vật. 2.2.1.4 Giai đoạn phát triển từ năm 1960 đến nay Do yêu cầu phải bảo vệ mơi trường, những nhà khoa học phải tăng tốc tìm kiếm những biện pháp bảo vệ thực vật khơng độc hại, khơng nguy hiểm cho sức khỏe con người và mơi trường sống. Và biện pháp sinh học đã, đang và sẽ là một nhĩm biện pháp cần được tập trung tìm kiếm, nghiên cứu trên thế giới. Các lĩnh vực nghiện cứu về biện pháp sinh học được mở rộng và đạt được nhiều thành cơng. Biện pháp sinh học được coi là biện pháp quan trọng, là cốt lõi của phịng trừ tổng hợp địch hại. 2.2.2 Vai trị của chế phẩm sinh học Theo thống kê của tổ chức Lương - Nơng Thế Giới cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đỡ với 100 lồi sâu hại khác nhau,10.000 lồi nấm, 200 lồi vi khuẩn, 600 lồi tuyến trùng và 600 lồi virus gây bệnh. Quả là 20 một lực lượng hùng hậu tấn cơng cây trồng, gây tổn thất cho mùa màng. Hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên thế giới bị mất trắng. Để khắc phục tình trạng trên, con người đã tích cực tìm kiếm các biện pháp phịng chống các tác nhân gây hại. Từ đĩ ra đời nền cơng nghiệp hĩa học thuốc trừ sâu, diệt các mầm bệnh cho cây trồng. Cho đến nay khơng ai cĩ thể phủ nhận vai trị tích cực của thuốc hĩa học trừ sâu bệnh hại cây trồng. Cĩ thể nĩi khơng một biện pháp bảo vệ mùa màng nào hơn biện pháp hĩa học về mặt hiệu quả và qui mơ. Nhưng biện pháp hĩa học cũng cĩ mặt hạn chế của nĩ. Người ta đã biết quá nhiều trường hợp ơ nhiễm mơi trường khi dùng chất diệt cỏ hoặc thuốc trừ sâu hĩa học, làm cho người bị ngộ độc , súc vật bị chết và cả hệ sinh vật đi kèm quanh cây trồng cũng bị ảnh hưởng. Cân bằng sinh thái bị phá hủy nghiêm trọng. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm bị phân hủy và cĩ thể giữ tác dụng của mình rất lâu trong đất (ví dụ DDT giữ được 25 năm). Như vậy các hợp chất này được tích lũy trong đất và nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đặc biệt nghiêm trọng hơn là sự tùy tiện về liều lượng và thời gian phun thuốc hĩa học chồng sâu bệnh đã tạo nên dư lượng thuốc khơng cho phép trên các loại rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm rất tai hại cho sức khỏe con người. Trước thực trạng này, con người khơng chịu bĩ tay. Những cuộc tìm kiếm, thử nghiệm các biện pháp mới để phịng chống sâu bệnh đã được tiến hành và cuối cùng cũng thu được những kết quả rất khả quan. Cũng từ đĩ các chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh cho cây trồng cĩ nguồn gốc sinh học được ra đời. Thoạt tiên người ta chỉ chú ý đến những lồi cơn trùng cĩ lợi cho đấu tranh sinh học như bọ xít, bọ rùa, ong kí sinh… Sau một thời gian người ta lại phát hiện được vai trị tích cực của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của sinh quần. biện pháp sinh học được hồn thiện thêm dần khi người ta sử dụng vi sinh vật để phịng trừ sâu bệnh cho cây trồng. Ở nhiều nước, chế phẩm sinh học được sản xuất ở qui mơ lớn và được sử dụng rộng rãi trong cơng tác phịng trừ sâu bệnh cho hàng triệu hecta cây trồng và cây rừng. Cĩ thể nĩi biện pháp đấu tranh sinh học bằng vi sinh vật đã thực sự trở thành một nội dung quan trọng của hệ thống phịng trừ sâu bệnh tổng hợp. 21 2.2.3 Tính ưu việt của chế phẩm sinh học - Khơng gây độc hại cho người động vật và cây trồng; cĩ khả năng tiêu diệt một cách chọn lọc các loại sâu bệnh. Người ta nĩi chúng cĩ tính đặc hiệu cao trong việc tiêu diệt các loại cơn trùng. Trong khi đĩ, thuốc trừ sâu hĩa học gây độc cho người, gia súc nếu tiếp xúc lâu dài, một số là tác nhân gây ung thư. Do khơng độc hại đối với con người, lại khơng ảnh hưởng xấu đến khu hệ sinh vật quanh hệ rễ của cây trồng , nên chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh cĩ nguồn gốc vi sinh vật khơng phá vỡ cân bằng hệ sinh thái, khơng gây ơ nhiễm mơi trường sống. - Việc sử dụng các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu bệnh cho đến nay chưa phát hiện được hiện tượng “lờn thuốc” ở các loại cơn trùng. Đĩ là điều rất đáng được quan tâm, vì ở các thuốc hĩa học trừ sâu bệnh, do đã được sử dụng lâu dài trước nay và việc sử dụng cịn quá tùy tiện nên hiện nay tính lờn thuốc xuất hiện ngày một nhiều ở các loại sâu bệnh, bắt buộc người ta phải nâng dần nồng độ sử dụng lên mà hiệu quả lại cứ giảm dần. - Con người đã và đang nghiên cứu mở rộng tác dụng của chế phẩm thuốc trừ sâu cĩ nguồn gốc vi sinh vật bằng nhiều biện pháp. Một trong những biện pháp đĩ là thực hiện chuyển các gen chi phối việc tạo tính độc đối với cơn trùng gây hại sang cho nhiều loại cây trồng, tạo nên những cây trồng tự nĩ cĩ khả năng kháng được các loại sâu hại. Đây là tác dụng mà những chế phẩm thuốc trừ sâu hĩa học khơng thể cĩ được. - Các chế phẩm sinh học diệt cơn trùng cĩ nguồn gốc vi sinh vật khác với các hợp chất hĩa học trừ sâu hại bởi bản chất sống của nĩ, tức nĩ chứa các nhân tố gây bệnh, làm chết cơn trùng là những sinh vật sống. Do vậy việc bảo quản và xử lý các chế phẩm này ngồi đồng ruộng cũng cĩ những yêu cầu khác biệt so với các hợp chất trừ sâu hại. Một hiện tượng tự nhiên tạo thuận lợi lớn cho con người sử dụng chế phẩm sinh học cĩ nguồn gốc vi sinh vật để diệt sâu hại là khi phun ra ngồi thiên nhiên, các vi sinh vật trong chế phẩm đều cĩ khả năng thích nghi cao, hội nhập vào tự nhiên một cách khá thuận lợi để cĩ thể tham gia vào các hoạt động đấu tranh sinh học một cách khá tích cực. Cụ thể khi ta phun chế phẩm lên một loại cây trồng nào đĩ, các vi sinh vật trong chế phẩm (ví dụ như vi khuẩn, nấm…) đều 22 cĩ khả năng trở thành một thành viên trong sinh quần nơi đĩ, và chúng tự sinh sơi nảy nở tăng lên về số lượng. - Các vi sinh vật diệt cơn trùng cĩ thể nhiễm lên cơn trùng bằng nhiều cách khác nhau: bằng con đường tiêu hĩa (ở vi khuẩn), qua da, tầng cuticum (ở nấm)… Điều đĩ cho phép tăng cường khả năng nhiễm thành cơng của vi sinh vật vào cơn trùng. - Các vi sinh vật diệt cơn trùng cĩ thể tồn tại trong điều kiện mơi trường khơng thuận lợi (khơng vật chủ, điều kiện khí hậu khắc nghiệt…) ở nhiều dạng khác nhau: dạng bào tử (vi khuẩn thuộc giống Bacillus), dạng hạch nấm hay giả hạch nấm (các giống nấm Beauveria, Metarhizium). - Khả năng phát tán rộng trong tự nhiên của các giống vi sinh vật cĩ ý nghĩa rất lớn trong việc tăng cường lây lan tạo thành dịch bệnhở cơn trùng. Ở một số nấm cĩ khả năng bắn bào tử của nĩ tới một nơi cĩ khoảng cách gấp ngàn lần kích thước của bào tử. Ngồi ra một số nấm, vi khuẩn, virus cịn cĩ thể được lan truyền rộng, nhờ dịng khơng khí, nước mưa và cơn trùng… Với những đặc điểm sinh học như trên, các vi sinh vật diệt cơn trùng cĩ thể xuất hiện bất ngờ, với một tốc độ nhanh, mang tính chất một ổ bệnh, dẫn đến gây chết cơn trùng trên một địa bàn rộng. Do vậy giúp bảo vệ cây trồng cĩ hiệu quả đáng kể. 2.2.4 Các bước áp dụng biện pháp sinh học  Bảo tồn và gia tăng khả năng hoạt động của quần thể thiên địch sẵn cĩ trên đồng ruộng và trên những cánh đồng lân cận. Sự bảo tồn thiên địch sẵn cĩ trên đồng ruộng là tối cần thiết. Những thiên địch sẵn cĩ trên đồng ruộng thường đã thích nghi với con chủ và với mơi trường của chúng, vì vậy bảo vệ chúng những biện pháp canh tác thích hợp là một biện pháp sinh học tốt hơn so với biện pháp nhân nuơi đắt tiền những thiên địch địa phương và nhập nội để thả vào đồng ruộng.  Tặng nhanh quần thể thiên địch địa phương bằng cách nhân nuơi và thả thiên địch vào đồng ruộng. Thu nhập, nhân nuơi và thả các sinh vật ăn mồi và ký sinh: 23 Điều này cĩ tiến hành bằng cách thu thập ký sinh và sinh vật ăn mồi ở những nơi mà mật số của chúng cao để chuyển tới nơi mà mật số cuả chúng thấp. Ký sinh và sinh vật ăn mồi cũng cĩ thể được nhân nuơi, nhưng việc nhân nuơi ở nước ta hiện nay chưa phát triển.  Sử dụng những vi sinh vật gây bệnh cho cơn trùng để phịng trừ sâu hại. Những vi sinh vật gây bệnh cho cơn trùng trong tự nhiên như: vi khuẩn, nấm, siêu vi khuẩn, tuyến trùng là những tác nhân sinh học quan trọng giúp cho việc hạn chế quần thể sâu hại. Trong những lồi vi sinh vật gây bệnh cho cơn trùng này nấm trắng và nấm xanh đĩng một vai trị quan trọng và đặc biệt các chế phẩm từ các nấm này đã được Viện Lúa ĐBSCL sản xuất ra hàng loạt với số lượng lớn. 2.2.5 Một số chế phẩm sinh học diệt cơn trùng hiện nay  Chế phẩm cĩ nguồn gốc vi khuẩn : Agritol (Hoa kì), Bathurin (Tiệp Khắc), Entobakterin (Nga), Japidemic (ở Nhật), Doom (ở Hoa Kì).  Chế phẩm cĩ nguồn gốc từ nấm; Beauverine (Hoa Kì).  Chế phẩm cĩ nguồn gốc từ virus: Biotrol VHZ, Vinex, Viron H, Polyviocide. 2.3 Giới thiệu nấm Metarhizium anisopliae 2.3.1 Nấm kí sinh cơn trùng Cũng như vi khuẩn, nhiều lồi nấm cĩ quan hệ cộng sinh hoặc hoại sinh với cơn trùng, trong đĩ cĩ nhiều lồi nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tượng bệnh lý và dẫn đến hủy diệt cơn trùng. Nấm gây bệnh cộn trùng cĩ ý nghĩa rất lớn vì cĩ thể gây chết thường xuyên với tỷ lệ chết cao cho nhiều lồi cơn trùng hại và là những tác nhân điều hịa tự nhiên rất hiệu quả. Cơn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thường, vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ tồn bộ bề mặt ngồi của cơ thể cơn trùng. Cơ thể cơn trùng bị chết do nấm khơng bị tan rã, mà thường giữ nguyên hình dạng ban đầu, tồn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm. Hầu hết nấm gây bệnh cơn trùng là Phycomycetes và Deuteromycetes (nấm bất tồn). Bào tử của các nấm này tấn cơng bên ngồi hoặc bên trong ruột cơn trùng. Sau đĩ bào tử nẩy mầm và sợi nấm xâm nhập vào xoang dịch cơn trùng. Cái chết cĩ thể là kết quả của sự sản sinh độc tố của nấm hoặc sau khi sử dụng dịch cơ thể. Tiếp theo các chất dự trữ ở cơ thể cơn trùng sẽ được sử dụng, hệ sợi chết và sự 24 hình thành bào tử bắt đầu, cịn sinh khối dư sẽ hoạt động như một điểm gây nhiễm sau. Bảng 2.1 Bảng tra phổ tác động của nấm bất tồn trên động vật chân đốt. Lồi Cơn trùng mục tiêu Aschesonia aleyrodis Beauveria bassiana Beauveria brongniartii Hirsutella thompsonii Metarhizium anisopliae Nomuraea rileyi Verticilium lecanii White fly Colorado beetle Cockchafer Rust mites Bọ cánh cứng, rệp Catepillars Aphids, Whitefly (Nguồn file: ///C/user/THUAN/Fun_Bio.htm) Tác dụng gây bệnh của nấm trên cơn trùng là bào tử nẩy mầm, xâm nhập vào cơ thể và sinh sản trong xoang làm yếu và phá hoại chức năng trao đổi chất của cơn trùng.  Nhờ giĩ, mưa bào tử nấm lây lan đến sâu khỏe, gặp điều kiện độ ẩm và nhiệt độ thích hợp phình lên nẩy mầm thành ống mầm, ống mầm tiếp xúc với da cơn trùng mà hình thành vịi bám. Vịi bám là một tế bào cĩ kích thước gấp 2 – 3lần bào tử, cĩ dịch nhầy để dính vào da. Vịi bám hình thành sợi nhỏ chọc thủng da. Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn. Sợi ngắn nhờ áp lực đẩy vào lớp trong cuối cùng đạt đến da thật. Nếu cơn trùng lột xác chúng lại hình thành vịi bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm. Nấm thơng qua áp lực cơ giới để xâm nhập vào trong cơ thể cơn trùng và nhờ tác dụng của enzyme phân giải mà chọc thủng biểu bì. Những enzyme phân giải là proteaza, lipoaza và kitinaza. Muốn da phân giải hết trước hết là nhờ proteaza rồi lipoaza, cuối cùng mới cĩ tác dụng của kitinaza. Nấm gây bệnh cứng sâu tổng hợp rất nhiều enzyme. Mỗi lồi nấm khác nhau sẽ hình thành các enzyme khác nhau nhưng chúng đều cĩ thể tự tạo ra enzyme kitinaza. 25  Sự thay đổi bệnh và sự rối loạn chức năng trong cơ thể cơn trùng. Sự sinh sản trong cơ thể cơn trùng là cho hoạt động trao đổi chất, các cơ quan mơ bị phá hoại, mất chức năng sinh lý và phát sinh sự rối loạn. Trước hết là sợi nấm trong xoang sinh trưởng phát triển. Khác với virus và động vật nguyên sinh, nấm phải tiết các chất độc và enzyme để giết chết vật chủ rồi sinh trưởng phát triển trên xác cơn trùng, hình thành các hạch nấm làm cho cơn trùng cứng lại, một số lồi nấm khơng tiết chất độc mà sinh sản hàng loạt trong cơ thể cơn trùng mà sau khi sâu chết mới làm vỡ và biến dạng các cơ quan. Hầu hết chúng cĩ tính xu mỡ, tập trung quanh cơ quan thể mỡ, sau khi sâu chết chúng mới làm biến đổi thể mỡ. Nấm xâm nhập vào cơ thể cơn trùng luơn luơn xuất hiện phản ứng biến màu đen, hình thành các đốm đen. Sự hình thành các đốm đen là do enzyme phenoloxydaza trong dịch thể cơn trùng. Sự sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hĩa khử limfa trong máu. Do sinh sản nhiều nấm sẽ làm tắc hệ tuần hồn cơn trùng; gây đĩi sinh lý tế bào vật chủ; chất độc sinh ra làm thay đổi sinh hĩa cơ thể và làm tê liệt thần kinh, từ đĩ làm mất đi và làm rối loạn cơ năng sinh lý. Chúng sẽ biểu hiện hơ hấp thất thường, giảm sức sinh sản, ức chế sự lột xác. Nhộng ngài tằm trời sau khi bị bệnh nấm mốc sâu tiêu hao lượng oxy xuống 7 lần; sâu non bọ lá khoai tây sau khi bị bệnh nấm bạch cương cường độ hơ hấp tăng lên nhiều lần. Phần lớn đều cho rằng sự hơ hấp này là do tác dụng phản ứng của vật chủ đối với vật gạy bệnh. Sau khi tiêm chất độc của nấm cho sâu non chúng thường biểu hiện thay đổi biến thái của sâu và ức chế quá trình lột xác, cuối cùng làm cho sâu chết. Sử dụng nấm bạch cương nhiễm vào nhiều lồi sâu hại, chúng đều giảm sức sinh sản rõ rệt. Ngài đục táo, mọt cà phê sau khi phun chế phẩm nấm bạch cương tỷ lệ đẻ trứng của con cái giảm xuống 45 – 60%.  Phân loại nấm gây bệnh cơn trùng Nấm gây bệnh cơn trùng thuộc nhiều nhĩm nấm khác nhau: từ nhĩm nấm nguyên thủy sống dưới nước đến nhĩm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho cơn trùng cĩ mặt trong cả 4 lớp nấm: 26 Nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm đảm Basidiomycetes và nấm bất tồn Deuteromycetes. Lớp Nấm bậc thấp Phycomycetes: Trong lớp nấm này. Các lồi ký sinh trên cơn trùng tập trung ở 3 bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt cĩ những họ nấm gồm tất cả các lồi đều là ký sinh trên cơn trùng như Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae. Những giốn nấm ký sinh sơn trùng quan trọng của lớp nấm bậc thấp là: Coelosporidum, Chytriopsis (bộ Chytridiales), Coelomomyces (bộ Blastocladiales) và Entomophthora (bộ Entomophthorales). Lớp nấm túi Ascomycetes: Trong lớp nấm túi cĩ bộ Laboulbiniales là những nấm ngoại ký sinh cơn trùng cĩ chuyên tính cao, cịn các loại nấm khác đều là nội ký sinh của cơn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho cơn trùng là: Cordiceps, Aschersonia (bộ Hypocreales). Lớp nấm đảm Basidiomycetes: Trong lớp nấm đảm chỉ cĩ hai giống cĩ các lồi gây bệnh trên cơn trùng. Đĩ là giống Septobasidium và Uredinella. Lớp nấm bất tồn Deuteromycetes: Phần lớn các lồi nấm bất tồn ký sinh cơn trùng đều thuộc bộ Moniliales. Những giống Beauveria, Paecilomyces, Spicarina, Metarhizium, Cephalosporiuma và Solosporella chứa các lồi khi xâm nhiễm vào cơn trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định. 2.3.2 Nấm Metarhizium anisopliae Bảng 2.2 Bảng tra các lồi trong chi nấm lục cương như sau: 1 Bào tử phân sinh hình ống hoặc trứng, giữa lõm, hai đầu bằng, khuẩn lạc màu xanh lá cây, màu đen nhạt hoặc xanh đồng thau 1’ Bào tử hình bầu dục, hai đầu trịn hoặc một đầu bằng, khuẩn lạc màu xanh vàng nhạt hoặc vàng nâu Nấm lục cương lục vàng (M.Flavoviride) 2 Bào tử phân sinh dài 3,5 – 9µm Nấm lục cương bọ hung bào tử ngắn (M.anisopliae var.ansopliae) 2’ Bào tử phân dài 9 – 18µm Nấm lục cương bọ hung bào tử dài (M.anisopliae var.major). (Theo Trần Văn Mão năm 2004) 27 2.3.2.1 Phổ kí chủ của nấm Metarhizium anisopliae Cho đến nay người ta đã biết được trên 70 lồi cơn trùng bị nấm này tiêu diệt, trong số đĩ cĩ tới 34 lồi cơn trùng cánh cứng và chỉ cĩ 5 lồi cơn trùng cánh vảy. Một số lồi cơn trùng điển hình mẫn cảm với nấm này là: - Melolontha melolontha - Melolontha hippocastanei - Anisopliae autriaca - Oryctes rhinoceros - Otiorrhychus ligustici - Plusia gamma 2.3.2.2 Tác động của nấm Metarhizium anisopliae vào cơ thể cơn trùng Nấm lục cương sau khi rơi trên bề mặt của cơn trùng trong khoảng 24 giờ sẽ nảy mầm, tạo thành ống mầm chui xuyên qua vỏ của cơn trùng, sau đĩ tiếp tục phân nhánh tạo thành một mạng sợi nấm chằng chịt trên khắp bề mặt của cơ thể cơn trùng. Lúc này ngoại độc tố được tiết ra sẽ tác động lên cơn trùng khiến cho cơn trùng chết. 2.3.2.3 Độc tố diệt cơn trùng của nấm Metarhizium anisopliae Các độc tố diệt cơn trùng do nấm sinh ra khơng phải là enzyme, cĩ trọng lượng phân tử thấp, các sản phẩm này cĩ thể giết chết cơn trùng ngay cả khi hiện diện với nồng độ thấp. Độc tố diệt sâu của nấm bao gồm nhiều ngoại độc tố cĩ tên là destrucin A, B C và D. Destrucin A và B cĩ thể tách từ dịch nuơi cấy nấm lục cương. Destrucin A cĩ cơng thức nguyên là C29H47O7N5, điểm sơi 188 oC (Theo A. Suzuki và những cộng sự 1966, 1970). Destrucin B cĩ cơng thức nguyên là C30H51O7N5, điểm sơi 234 o C (Theo Tamura, 1965). Đĩ là những depsipeptid vịng. 2.3.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa của M.anisopliae - Khơng thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất khơng cĩ kitin. - Sống được ở nhiệt độ thấp (8oC), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 chúng cĩ thể sống sĩt tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất bào tử đính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đĩ cĩ chủng Aeromonas (thí nghiệm in vitro). 28 - Ở dưới 10oC và trên 35oC thì sự hình thành bào tử khơng thể xảy ra. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30oC và chết ở 49oC trong 10 phút. - Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trưởng là 25oC và pH 3,3 – 8,5. - M. anisopliae cĩ khả năng phân giải tinh bột, celluloza và kitin (lơng và da cơn trùng). 2.3.2.5 Các dạng nấm Metarhizium anisopliae Theo Tulloch (1976), nấm Metarhizium anisopliae cĩ 2 dạng: Metarhizium anisopliae var. major cĩ bào tử dài, Metarhizium anisopliae var. anisopliae cĩ dạng bào tử ngắn. Ngồi ra, Metarhizium anisopliae var. anisopliae Tulloch khác Metarhizium anisopliae var. majus Johnston về hình thái học và phạm vi kí chủ. - Metarhizium anisopliae var. anisopliae thơng thường kí sinh bọ cây, sâu ăn lá, bọ xít đen hại lúa Scotinophara sp. Và các dạng cơn trùng hại lúa khác. Nĩ cĩ thể hại nhiều cơn trùng trên lúa và bọ nhảy. Thể bình dạng hình trụ, kích thước 6 – 13 x 2 - 4 m gắn vào cuống bào tử đính khỏe trên hệ sợi nấm màu trắng. Bào tử đính hình trụ đến hình elip rộng hay dạng trịn, kích thước 4,5 – 8,5 x 2,5 - 4 m và tạo thành những chuỗi khơ dài song song cĩ dạng bột màu xanh tối đến xanh vàng. Nấm này nhìn thấy trong mơi trường thuần cũng giống như trên cơn trùng. - Metarhizium flavoviride kí sinh trên ấu trùng bọ vịi . Điển hình là Metarhizium flavoviridevar. minus kí sinh trên bọ cây và sâu ăn lá lúa ở Philippines và Solomon Anh. Thể bình hình dùi trống, kích thước 9 – 15 x 3 – 4 m gắn vào cuống bào tử đính trên hệ sợi nấm màu trắng. Bào tử đính hình elip, kích thước 4,5 – 7,5 x 2 - 3 m và tạo thành những khối bào tử màu xanh hơi xám. - Metarhizium album kí sinh sâu Cicadellid Cofana spectra và sâu ăn lá ở Philippines và Indonesia. Cuống bào tử đính dài 80 m, cĩ sự phân nhánh mọc vịng gần chĩp đỉnh. Mỗi nhánh sinh ra 2 – 5 thể bình hình trụ đến hình dùi trống. Bào tử đính hình trụ, dài 8 -11 m. 29 2.4 Các nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới 2.4.1 Các nghiên cứu trong nước Năm 1996, Phạm Thị Thùy đã thử nghiệm chế phẩm nấm xanh trên rầy nâu hại lúa Nilaparvata lugens tuổi 2 – 3, sâu đo xanh hại đay Anomis flava tuổi 3 và châu chấu sống lưng vàng Pratanga succineta trưởng thành. Khi thử nghiệm chế phẩm nấm xanh trong phịng thí nghiệm, tỷ lệ rầy chết 65% – 80% sau 10 ngày phun ở nồng độ 6 x 108 bào tử/ml, sâu chết 60%–70% sau 7 ngày phun ở nồng độ 5 x 108 bào tử/ml, châu chấu chết 36.5% - 96.7% sau 10 ngày – 15 ngày phun ở nồng độ 5 x 10 9 bào tử/ml. Phạm Thị Thùy cũng đã thử nghiệm chế phẩm nấm xanh ngồi đồng ruộng cho kết quả như sau: Trên rầy, tỷ lệ sùng chết 50% - 60% sau 10 ngày phun ở nồng độ 5 x 1013 bào tử/ha; trên sâu, tỷ lệ sùng chết 7.3% – 79.5% sau 7 ngày–10 ngày phun; trên châu chấu, tỷ lệ sùng chết 78.1% – 79.2% sau 35 ngày phun Năm 2000, lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thùy đã sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarhizium anisopliae cĩ hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre trong phịng thí nghiệm, trong nhà lưới và ngồi đồng. Năm 2002, Nguyễn Thị Lộc dùng chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae thử nghiệm trên rầy nâu, bọ xít hơi, sâu cuốn lá nhỏ gây hại ở lúa. 2.4.2 Các nghiên cứu trên thế giới 1968, Veen đã sưu tập tài liệu trên 200 lồi cơn trùng bị ký sinh bởi Metarhizium anisopliae trong đĩ Metarhizium Species - Metarhizium anisopliae, “nấm nho xạ xanh” thường gây bệnh cho cơn trùng hại cây trồng. Năm 1978 và năm 1981, Ferron thảo luận về sinh thái học và thực tế sử dụng của Metarhizium anisopliae. Nấm này được sử dụng ở Brazil để phịng trừ spittlebugs của ve sầu vảy như Mahanarva postica (Wlk.) trên bọ cánh lớn. Năm 1986, qua một vài thử nghiệm trong việc sử dụng Metarhizium, Rombach đã đưa ra kết luận dịch bệnh của Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviridae cĩ thể được bắt đầu trong việc bộc phát sâu đục thân bởi dấu hiệu ứng dụng bào tử. 30 Qua thí nghiệm kiểm tra nấm Metarhizium anisopliae lặp lại trên Sogatodes oryzickola (Muir), của Albonoz và Parada (1984), tỷ lệ chết 100% ở nồng độ 109 bào tử/ml và tỷ lệ chết chỉ đạt 50% ở nồng độ 107 bào tử/ml. Năm 1987, Aguda đã tiến hành thử nghiệm với hệ sợi nấm Metarhizium anisopliae khơ. Kết quả 3 tuần sau khi phun thuốc, tỷ lệ chết vượt quá 80%. Năm 1991, Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phịng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% tại Australia. 31 Chƣơng 3 VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP Thời gian tiến hành: từ tháng 3 năm 2005 đến tháng 7 năm 2005. Địa điểm nghiên cứu: Phịng 118, phịng kiểm dịch cơn trùng và phịng 105, khu Phượng Vĩ, Trường Đại Học Nơng Lâm TP.HCM. 3.1 Nuơi sùng trắng  Nguồn sùng trắng Sùng trắng được lấy từ trại phân của khoa Nơng Học, Đại học Nơng Lâm thành phố HCM và ở Tiền Giang Phân trộn đất lấy tại trại phân nơi sùng sống. Sơ dừa.  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ cần thiết như hộp nuơi sùng, khay nhựa và vật tư trong phịng cơn trùng.  Điều kiện nuơi Nhiệt độ: Sùng được nuơi ở nhiệt độ phịng (28oC). Độ ẩm: độ ẩm của mơi trường tương đối giống với mơi trường sống của sùng trong tự nhiên.  Tiến hành - Chuẩn bị hộp nuơi: hộp trịn hình trụ cĩ đường kính đáy 10cm, đường kính miệng hộp 12cm, chiều cao hộp 12cm. Mỗi hộp nuơi 1 con sùng. - Cho mơi trường đất phân vào hộp với độ cao hỗn hợp khoảng 8cm. Sau đĩ thả sùng vào. Cứ 2 tuần thì thay mơi trường cho sùng một lần. Chúng ta cĩ thể tăng cường dinh dưỡng cho sùng bằng cách thêm vào hộp nuơi một lát cam hoặc táo vào mỗi lần thay mơi trường. Trong trường hợp mơi trường quá khơ thì ta cĩ thể phun nước để độ ẩm của mơi trường khơng khác biệt với mơi trường sống của sùng trong tự nhiên. 32 3.2 Nhân giống nấm Metarhizium anisopliae  Nguồn nấm Nấm Metarhizium anisopliae với các dịng BDLA8, BDTN15, BXĐTV3, BXDLA8, RBC-Q9-3, SCLLLA4, Ma2, Ma11, Ma13 được phân lập từ bọ dừa, bọ xít đen ở Long An, bọ dừa ở Tây Ninh, rầy bơng cúc ở quận 9, sâu cuốn lá lúa ở Long An, bọ xít đen ở Trà Vinh và chế phẩm Ma của Viện Luá Đồng Bằng Sơng Cửu Long (CP MA).  Thiết bị và vật tƣ Các dụng cụ và vật tư cần thiết trong phịng thí nghiệm như que cấy, dụng cụ cắt thạch, mũi mác, bịch nylon, đĩa petri, bình tam giác, buồng đếm hồng cầu, tủ sấy, máy lắc, nồi hấp autoclave, cân phân tích, bếp điện, khay nhựa và các dụng cụ khác. Các hố chất cần thiết như glucose, agar,… - Mơi trường nuơi cấy: Mơi trường PGA (Potato Glucose Agar): Khoai tây: 200 g Agar: 15 g Đường:20 g Nước cất: 1000 ml Mơi trường lỏng: Bã bia: 20 g Glucose: 20 g Nước cất: 1000 ml Cĩ thể thay glucose bằng mật rỉ. - Mơi trường nhân giống Mơi trường cơm  Qui trình lên men xốp nhân giống Metarhizium anisopliae Cĩ thể sử dụng phương pháp lên men xốp tạo chế phẩm vi sinh vật diệt sâu, cơn trùng cĩ hại từ vi nấm, trong đĩ sau khi bổ sung dịch dinh dưỡng vào các cơ chất khác nhau như bột đậu nành, bã đậu phụ, cám, gạo, lúa, mày ngơ,… người ta tiến 33 hành nhiễm giống nấm và cho lên men. Khi sinh khối nấm đạt cực đại tiến hành thu hồi sinh khối, xử lý và tạo sản phẩm chứa cả bào tử và hệ sợi nấm. Sơ đồ 3.1 Qui trình lên men xốp tạo chế phẩm nấm diệt sau và cơn trùng gây hại  Tiến hành - Chuẩn bị mơi trường: rửa sạch gạo, ngâm trong nước cất, để qua đêm. Sau đĩ hấp mơi trường ở 121oC trong 30 phút. Hai ngày sau hấp lại cũng ở 121oC trong 30 phút. Để mơi trường qua 1 đêm rồi cấy nấm vào. Mơi trường dịch thể, lắc 200 vịng/phút, nuơi to = 28 – 30oC Mơi trường xốp trong bình 250 ml, nuơi 4 – 5 ngày ở to = 28 – 32oC Mơi trường xốp trong chậu thủy tinh so sánh (khử trùng 100oC trong 30 – 40phút) + 10% giống. Nuơi 10 ngày ở toC = 28 – 30 oC. Độ ẩm khoảng 90 – 95%. Làm khơ ở nhiệt độ phịng. Cĩ quạt. Độ ẩm 10% hoặc sấy ở 40oC. Nghiềm nhỏ. Đĩng bao nhãn. Kiểm tra chất lượng. Bảo quản ở 5 – 10oC trong tối và sử dụng. Ống giống 5 – 7 ngày 34 - Chuẩn bị nấm: Nấm Metarhizium anisopliae 6 ngày sau khi cấy trên mơi trường PGA, khi tảng nấm đã phát triển. - Cấy nấm Nấm 6 ngày sau khi cấy trên mơi trường PGA từ đĩa petri được băm nhuyễn rồi cho vào bình tam giác chứa 75 ml mơi trường. Sau đĩ đem lắc 170 vịng/phút ở 28 OC trong 3 ngày để chuẩn bị nhân nấm trên mơi trường xốp (mơi trường cơm). Cho một ít mơi trường cơm đã chuẩn bị vào bịch nylon. Hút 5ml dịch nấm trong bình tam giác cho vào mỗi bịch nylon, buộc kín miệng, xoi những lỗ nhỏ trên bịch nylon. Khi nấm phủ xanh hết bề mặt, phơi khơ rồi sử dụng ray lọc bào tử nguyên chất ta được bột bào tử. Tính bào tử nấm trong 1 g bột nấm: Pha 1 g bột nấm trong 10ml nước cất vơ trùng. Cơng thức tính số lượng bào tử trong 1g bột nấm: 4000 x 1000 x a x 10 -n D = b D: Số bào tử trong 1 g bột nấm. a: Số bào tử đếm được. n: Nồng độ pha lỗng. b: Số ơ nhỏ của buồng đếm hồng cầu. 3.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 3.3.1 Phƣơng pháp khảo sát độc tính Phương pháp 1: Bột bào tử nấm Metarhizium anisopliae với lượng khác nhau được trộn đều trong đất. Sau đĩ thả sùng vào mơi trường và theo dõi. Phương pháp 2: Pha bào tử thu được với nước đến nồng độ mong muốn. Sau đĩ phun dung dịch nấm lên đất và lên sùng rồi theo dõi.  Phương pháp 3: Gây vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm nấm lên sùng theo theo phương pháp 1 hoặc 2. - Theo dõi sùng: 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày sau khi gây nhiễm. 35 Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ chết. 3.3.2 Bố trí thí nghiệm Giai đoạn 1: Gây nhiễm sùng theo phương pháp 1 với các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 và nghiệm thức đối chứng là sùng để nguyên. Bảng 3.1 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 1 STT Nghiệm thức Số mẫu 1 BDTN 15 5 2 BDLA 8 5 3 BXĐTV 3 5 4 BXĐLA 8 5 5 Đối chứng 5 Giai đoạn 2: Gây nhiễm theo phương pháp 2 với các dịng MA 2, CP MA và 2 nghiệm thức đối chứng. Đối chứng 1 là mơi trường bã bia + mật rỉ, đối chứng 2 là nước. Bảng 3.2 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 2 STT Nghiệm thức Số mẫu 7 MA 2 5 8 CP MA 5 9 Đối chứng 1 5 10 Đối chứng 2 5 Giai đoạn 3: Gây nhiễm theo phương pháp 3 với các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8, SCLLLA 4, RBC – Q9 – 3, MA 11, MA 13 và nghiệm thức đối chứng là sùng gây vết thương. 36 Bảng 3.3 Bảng bố trí nghiệm thức theo phương pháp 3 STT Nghiệm thức Số mẫu 11 BDTN 15 5 12 BDLA 8 5 13 BXĐTV 3 5 14 BXĐLA 8 5 15 SCLLLA 4 5 16 RBC – Q9 – 3 5 17 MA 11 5 18 MA 13 5 19 Đối chứng 5 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Giai đoạn nuơi sùng Sùng được nuơi trong mỗi hộp nhựa riêng biệt và giữ ổn định trong ít nhất 2 tuần (Hình 4.1). Hình 4.1 Sùng được nuơi trong điều kiện thí nghiệm 1. Hộp nhựa cĩ các kích thước: đường kính miệng hộp 12 cm; đường kính đáy 10cm, chiều cao 12 cm; 2. Sùng trắng tuổi 3 dài 3 cm; 3. hỗn hợp đất phân (mơi trường sống và nguồn thức ăn của sùng trắng). Rồi từ sau 2 tuần nuơi ổn định trong phịng thí nghiệm mới cĩ thể cho gây nhiễm với nấm vì khoảng thời gian từ lúc đem mẫu sùng về nuơi đến lúc nuơi ổn định sùng cĩ thể chết vì nhiều nguyên nhân, cĩ thể chết do shock mơi trường, do nhiệt độ thay đổi, do độ ẩm khơng phù hợp hay do bị thương trong quá trình thu mẫu và vận chuyển về phịng thí nghiệm… Cũng cĩ thể chết trong lúc nuơi do mơi trường thiếu dinh dưỡng hoặc do khơng khéo léo trong khi thay mơi trường làm sùng bị thương. Nếu trong giai đoạn này đem gây nhiễm với nấm thì kết quả sẽ khơng chính xác. Do vậy ta cần nuơi sùng ổn định ít nhất 2 tuần để đảm bảo khi gây nhiễm sùng hồn tồn khỏe mạnh. 4.2 Giai đoạn nhân nấm Nấm sau 6 ngày cấy trên đĩa petri (Hình 4.2a) được chuyển vào bình tam giác 250 ml chứa mơi trường bã bia + glucose + nước cất và lắc trong 3 ngày ở 28oC sẽ được nhân trên mơi trường xốp (Hình 4.2b). 3 1 2 38 a Nấm M.anisopliae trên mơi trường PGA (potato glucose agar) Nấm M.anisopliae trên mơi trường cơm Hình 4.2 Hình thái nấm Metarhizium anisopliae trên mơi trường PGA và trên mơi trường cơm a. Nấm M.anisopliae trên mơi trường PGA sau 9 ngày cấy trên đĩa petri; b. Nấm M.anisopliae trên mơi trường cơm sau 9 – 11ngày nuơi cấy. Số lượng bào tử của các dịng nấm M.anisopliae khác nhau là khác nhau. Nhờ buồng đếm hồng cầu, số lượng bào tử của các dịng nấm Metarhizium anisopliae trong 1g bột nấm thu được từ mơi trường xốp (Bảng 4.1)  Phương pháp nhân nấm trên mơi trường xốp Trong phương pháp nhân nấm, chúng tơi nhân nấm trên mơi trường lỏng rồi mới đưa sang mơi trường xốp. Trên thực tế chúng ta cĩ thể đưa thạch trực tiếp từ mơi trường thạch sang mơi trường xốp. Tuy nhiên thời gian để nấm mọc xanh hết bề mặt mơi trường rất lâu (khoảng 11 – 14 ngày) và tốn cơng cho nhiều lần băm thạch. Thêm vào đĩ do thời gian tiếp xúc với mơi trường khơng khí lâu (tốn thời b 39 gian nhiều trong việc băm thạch) nên rất dễ nhiễm. Trong khi đĩ, nếu sử dụng sinh khối nấm từ mơi trường lỏng để nhân trên mơi trường xốp, thời gian để nấm lên xanh hết bề mặt mơi trường là 9 – 10 ngày và chỉ mất thời gian cho một lần băm thạch. Bảng 4.1 Số lượng bào tử của các dịng nấm trong 1g bột nấm Dịng nấm Số lượng bào tử trên 1 g Số lượng bào tử trên 1 ml BDTN 15 3,47 x 10 10 BDLA 8 6,88 x 10 10 BXĐTV 3 4,25 x 1010 BXĐLA 8 8,44 x 109 RBC – Q9 – 3 1,11 x 1010 SCLLLA 4 2,54 x 10 10 MA 2 5 x 10 9 MA 11 5,47 x 10 9 MA 13 8,11 x 10 9 CP MA 5 x 10 9 Mặt khác, khi áp dụng phương pháp nhân nấm trên mơi trường xốp, ta cĩ thể thu được chế phẩm khơ (tức bột nấm) để thuận tiện cho quá trình gây nhiễm nấm theo phương pháp gây nhiễm khơ. Mơi trường xốp được sử dụng là mơi trường cơm vì mơi trường cơm dễ dàng lọc bào tử tinh khơng chứa mơi trường. Nguyên nhân của cách làm này chính là để tránh hiện tượng sùng chết vì mơi trường xốp trong quá trình gây nhiễm.  So sánh với phương pháp nhân nấm trên mơi trường lỏng. Như chúng ta đã biết, nhân nấm trong mơi trường lỏng cĩ ưu điểm là rất dễ làm, thời gian lên men ngắn, lượng nấm đưa vào rất ít trong khi lượng nấm thu được lại rất lớn và dễ phát hiện khi dung dịch nhiễm khuẩn (mơi trường nhiễm khuẩn bị đục) tuy nhiên chúng ta khơng thể sử dụng để gây nhiễm vì bào tử thu được là bào tử chồi nên thời gian lưu trữ ngắn, sức chống chịu kém dễ bị mất hoạt tính trong khi thời gian theo dõi sự nhiễm bệnh lại dài (21 ngày) trong khoảng thời 40 gian đĩ bào tử nấm cĩ thể đã mất hoạt tính hoặc đã chết trong mơi trường chứa hệ sinh vật đất. Trong khi đĩ phương pháp lên men xốp nấm M.anisopliae mặc dù thời gian lên men dài nhưng hiệu quả lên men cao, lượng nấm đưa vào ít nhưng lượng nấm thu được là khổng lồ, nguyên liệu dễ kiếm, rẻ tiền và rất dễ làm. Mặt khác, bào tử nấm thu được là bào tử đính nên cĩ thể lưu trữ lâu và khả năng chịu đựng mơi trường bất thuận tốt hơn. Do đĩ phù hợp với thí nghiệm gây nhiễm nấm phải theo dõi một thời gian dài tuy rằng trong quá trình nhân nấm phương pháp này cĩ một nhược điểm là khĩ kiểm sốt sự nhiễm tạp. 4.3 Khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae 4.3.1 Phƣơng pháp gây nhiễm 1 và 2 4 nghiệm thức ứng với 4dịng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3, BXĐLA 8 cho gây nhiễm theo phương pháp 1 và nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên) được kết quả như sau: Bảng 4.2 Kết quả gây nhiễm nấm Metarhizium anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 1 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 0 _ BXĐLA 8 0 _ Đối chứng 0 _ Qua bảng 4.2, các nghiệm thức trên đều cho kết quả tỷ lệ sùng chết là 0%. Điều này đưa chúng tơi đến các giả định như sau: Cĩ thể các dịng nấm M.anisopliae đem gây nhiễm khơng cĩ khả năng diệt sùng trắng (hay cịn gọi là khơng cĩ độc tính). Nguyên nhân này rất hay gặp phải trong các nghiên cứu vì rất khĩ tìm được một dịng gây độc tính trên sùng trắng. Cũng cĩ thể phương pháp gây nhiễm chưa phù hợp, cĩ thể do nồng độ gây nhiễm chưa cao? Tuy nhiên nguyên nhân này khơng khơng thuyết phục vì nồng độ bào tử gây nhiễm là rất cao hoặc do khi gây nhiễm, nấm được trộn với đất, nấm cĩ thể bị 41 bị ức chế bởi các vi sinh vật đất? Nguyên nhân này cũng xảy ra nhưng khơng đáng kể. Một nguyên nhân nữa cũng cĩ thể xảy ra là lớp da của sùng quá dày khiến cho nấm khơng thể xâm nhập qua da để ký sinh và diệt sùng, trong trường hợp này thì cần hỗ trợ thêm chất làm bào mịn da của sùng thậm chí cĩ thể gây vết thương nhẹ giúp nấm dễ dàng xâm nhập vào cơ thể sùng, ký sinh và diệt sùng. Với nhiều giả thuyết đưa ra trên, chúng tơi chú ý đến 2 nguyên nhân: một là các dịng trên khơng cĩ độc tính; hai là nguyên nhân do lớp da sùng quá dày, nấm khơng thể xâm nhập qua lớp da để ký sinh và diệt sùng. Do đĩ chúng tơi tiến hành gây nhiễm tiếp tục theo phương pháp 2 và phương pháp 3. Thử nghiệm phương pháp gây nhiễm 2 đối với 2 dịng nấm MA 11, CP MA và theo đĩ 2 nghiệm thức đối chứng là mơi trường bã bia + mật rỉ + nước và nước. Bảng 4.3 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 2 Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết(ngày) MA 2 0 _ CP MA 0 _ Đối chứng 1 0 _ Đối chứng 2 0 _ Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae theo phương pháp 2 cũng khơng khác gì so với phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết vẫn là 0% (Hình 4.3). Với phương pháp 2 trên hai dịng nấm MA 2 và CP MA từ Viện Lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long, kết quả vẫn khơng khác biệt. Từ các kết quả trên, chúng tơi tiếp tục đặt ra giả thuyết các dịng nấm M.anisopliae này cĩ khả năng gây độc trên sùng trắng? Phương pháp gây nhiễm cĩ phù hợp? Và chúng tơi bắt đầu tiến hành gây nhiễm theo phương pháp gây nhiễm 3 (tạo vết thương nhẹ trước khi cho sùng tiếp xúc nấm). 42 Hình 4.3 Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước và phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước a.Nghiệm thức đối chứng sùng phun nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun nước 21 ngày ; b. Nghiệm thức đối chứng sùng phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước: 5 mẫu sùng đều sống sau khi phun mơi trường bã bia + mật rỉ + nước 21 ngày. Kết quả từ nghiệm thức đối chứng (hình 4.3) chứng tỏ sùng vẫn sinh trưởng bình thường khi phun nước và mơi trường bã bia + mật rỉ + nước. Điều này cho ta thấy rằng sự sinh trưởng và phát triển của sùng khơng bị ảnh hưởng bởi nước và mơi trường. Từ đây, cho ta lựa chọn nhiều hơn trong quá trình nhân nấm tạo chế phẩm diệt sùng thí dụ ta cĩ thể lựa chọn những mơi trường xốp khác cho số lượng bào tử nhiều hơn như mơi trường chứa cám, bột ngơ, đậu nành và trấu… Kết quả này cũng chứng minh cho kết quả thí nghiệm của chúng tơi là hồn tồn chính xác. Theo đĩ, khi gây nhiễm sùng với các dịng MA 2 và CP MA bằng phương pháp 2, sùng vẫn sinh trưởng bình thường. Cĩ nghĩa là theo phương pháp gây nhiễm 2, các dịng này khơng cĩ thể hiện độc tính trên sùng trắng. Tương tự như vậy, gây nhiễm các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐTV 3 và BXĐLA 8 theo phương pháp 1 cũng khơng cĩ hiệu quả. Do đĩ, các dịng BDTN 15, BDLA 8,BXĐTV 3 và BXĐLA 8 cũng khơng thể hiện độc tính. a b 43 Hình 4.4 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 theo phương pháp 1 và MA 11 và CP MA theo phương pháp 2 1. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm M.anisopliae BDTN 15 theo phương pháp 1 cho tỷ lệ sùng chết là 0%; 2. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm BDLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 3. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 1, tỷ lệ sùng chết là 0%; 4. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm MA 2 theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%; 5. Sùng được gây nhiễm với dịng nấm CP MA theo phương pháp 2, tỷ lệ sùng chết là 0%. 1 2 3 4 5 44 4.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm 3 Sau khi tiến hành gây nhiễm trên phương pháp 1 và phương pháp 2 khơng cĩ kết quả. Chúng tơi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 3 được kết quả như sau: Bảng 4.4 Kết quả gây nhiễm nấm M.anisopliae trên sùng trắng theo phương pháp 3. Nghiệm thức Tỷ lệ sùng chết (%) Thời gian chết (ngày) BDTN 15 0 _ BDLA 8 0 _ BXĐTV 3 20 7 BXĐLA 8 0 _ SCLLLA 4 20 17 RBC – Q9 – 3 0 _ MA 11 80 5 – 17 MA 13 0 _ Đối chứng 0 _ Từ bảng 4.3, nghiệm thức BXĐTV 3, SCLLLA 4, MA 11 cho tỷ lệ sùng chết lần lượt là 20%, 20% và 80%. Kết quả này chứng tỏ lồi nấm này cĩ khả năng ký sinh và diệt sùng. Đặc biệt các dịng cĩ độc tính cao cĩ khả năng diệt sùng rất hiệu quả (dịng MA 11 cho tỷ lệ sùng chết là 80%). Như vậy ta hồn tồn cĩ thể khẳng định nấm Metarhizium anisopliae cĩ độc tính diệt sùng và cĩ thể sản xuất được chế phẩm nấm diệt sùng tuy nhiên cần phải nghiên cứu nhiều hơn nữa về các dịng nấm M.anisopliae để tìm được dịng cĩ độc tính cao hơn. Các dịng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8, RBC – Q9 – 3, MA 13 đều cho tỷ lệ sùng chết là 0%. Đặc biệt, đối chứng gây vết thương trong nghiệm thức đối chứng (Hình 4.5) vẫn sinh trưởng bình thường trong thời gian theo dõi (7 ngày, 14 ngày, 21 ngày) nên kết quả thí nghiệm của chúng tơi là chính xác. Thêm vào đĩ kết quả này cũng giúp chúng tơi chắc chắn hơn trong giả thuyết lớp da sùng quá dày khiến nấm khơng thể xâm nhập để ký sinh và diệt sùng. Như vậy trong phương pháp gây nhiễm 3 này các dịng BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8 cũng khơng thể hiện độc tính của nấm trên sùng trắng. 45 Hình 4.5 Kết quả nghiệm thức đối chứng gây vết thương Sùng được gây vết thương sau 21 ngày theo dõi, tỷ lệ sùng chết là 0%.  Kết quả phân lập nấm từ sùng nhiễm bệnh. Các dịng cĩ tính độc trên sùng trắng MA 11, BXĐTV 3, SCLLLA 4 được chúng tơi phân lập lại để khẳng định chính xác kết quả thí nghiệm của chúng tơi (Hình 4.8). So với nấm Metarhizium anisopliae mà chúng tơi lấy tù ống nghiệm gốc đem cấy trên đĩa petri, các nấm M.anisopliae mà chúng tơi phân lập từ sùng nhiễm bệnh cĩ tốc độ sinh trưởng nhanh hơn biểu hiện ở thời gian gia tăng kích thước đường kính khuẩn lạc: thời gian đường kính khuẩn lạc nấm phân lập từ sùng nhiễm bệnh trên mơi trường PGA tăng đến 3 cm là 3 ngày trong khi thời gian là 5 ngày với nấm lấy từ ống gốc. Trong khi đĩ, hình thái nấm vẫn khơng hề thay đổi. 46 Hình 4.6 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm M.anisopliae BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 theo phương pháp 3. 1. 1/5 Sùng chết sau 7 ngày gây nhiễm với dịng nấm BXĐTV 3; 2. 1/5 Sùng chết sau 17 ngày gây nhiễm với dịng nấm SCLLLA 4; 3,4,5,6. 4/5 sùng chết khi gây nhiễm với nấm MA 11 N. Vùng nấm ký sinh trên sùng trắng. Vùng cĩ màu xanh là bào tử nấm đã hình thành. Vùng cĩ màu trắng là vùng sợi nấm đang phát triển. 4 N 3 N 5 N N 1 N 2 N 6 47 Hình 4.7 Kết quả gây nhiễm sùng với các dịng nấm BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 13, RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. BDTN 15. Nghiệm thức BDTN 15, 5/5 Sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BDTN 15 theo phương pháp 3; BDLA 8. Nghiệm thức BDLA 8, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BDLA 8 theo phương pháp 3; BXĐLA 8. Nghiệm thức BXDLA 8, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm BXĐLA 8 theo phương pháp 3; MA 13. Nghiệm thức MA 13, 5/5 sùng nhiễm khơng chết khi gây nhiễm với dịng nấm MA 13; RBC – Q9 – 3. Nghiệm thức RBC – Q9 – 3, 5/5 sùng khơng chết khi gây nhiễm dịng nấm RBC – Q9 – 3 theo phương pháp 3. 48 Hình 4.8 Kết quả phân lập nấm M.anisopliae từ sùng nhiễm a. Nấm M. anisopliae sau 5 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm MA 11; b. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm BXĐTV 3; c. Nấm M.anisopliae sau 6 ngày cấy trên mơi trường PGA, được phân lập từ sùng nhiễm SCLLLA 4. 4.3.3 Ảnh hƣởng của phƣơng pháp gây nhiễm nấm So sánh nghiệm thức BXĐTV 3 khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1và 2 với chính dịng nấm này theo phương pháp 3 và kiểm tra với 2 nghiệm thức đối chứng (sùng để nguyên và sùng tạo vết thương): Từ dịng MA 11 Từ dịng BXĐTV 3 Từ dịng SCLLLA 4 a b c 49 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của phương pháp gây nhiễm 1,2 và 3 trên dịng nấm M.anisopliae BXĐTV 3 Nghiệm thức Tỷ lệ gây chết (%) BXĐTV 3 (khơng gây vết thương) 0 Đối chứng (để nguyên) 0 BXĐTV 3 (gây vết thương) 20 Đối chứng (gây vết thương) 0 Kết quả cho ta thấy phương pháp 3 cĩ hiệu quả hơn khi gây nhiễm nấm M.anisopliae dịng BXĐTV 3 trên sùng trắng. Phương pháp 1 khơng khác biệt so với phương pháp 2, các dịng BDTN 15, BXĐLA 8, BDLA 8 cho kết tương tự khi tiến hành gây nhiễm theo phương pháp 1 và phương pháp 2. 4.3.4 Hiệu quả của các dịng với các phƣơng pháp xử lý Qua thí nghiệm, ba dịng BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 cĩ hiệu quả với phương pháp gây nhiễm 3 (phương pháp tạo vết thương nhẹ trước khi gây nhiễm). Hiệu quả của các dịng nấm thể hiện ở tỷ lệ sùng chết khi gây nhiễm từng dịng trên sùng trắng, lần lượt là 20%, 20% và 80%. Cịn tất cả các dịng cịn lại khơng hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm (tỷ lệ sùng chết là 0%). Kết quả này cũng đặt ra trước chúng tơi những câu hỏi: các dịng nấm này phải chăng khơng thể hiện độc tính của chúng khi gây nhiễm theo 3 phương pháp trên? Hay chúng khơng thể thể hiện độc tính trước giai đoạn sùng trắng trong vịng đời của các con bọ cánh cứng? Hay chúng hồn tồn khơng cĩ độc tính với tất cả các giai đoạn sống của bọ cánh cứng? 50 Bảng 4.6 Hiệu quả của các dịng nấm với 3 phương pháp gây nhiễm Hiệu quả gây nhiễm (%) Dịng nấm Phương pháp 1 Phương pháp 2 Phương pháp 3 BDTN 15 0 0 BDLA 8 0 0 BXĐTV 3 0 20 BXĐLA 8 0 0 MA 2 0 CP MA 0 SCLLLA 8 20 RBC – Q9 – 3 0 MA 11 80 MA 13 0 51 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Ở giai đoạn nuơi sùng, thời gian nuơi sùng ổn định phải sau 2 tuần để đảm bảo cho sùng khơng bị chết bởi các nguyên nhân khác trước khi gây nhiễm nấm cĩ nghĩa là để tránh hiện tượng giảm số lượng sùng khơng mong muốn. Từ đĩ chúng ta cĩ thể khẳng định chính xác hơn về kết quả nghiên cứu. Trong giai đoạn nhân nấm, qui trình nhân nấm mà chúng tơi chọn nghiên cứu là lên men trên mơi trường xốp (mơi trường cơm). Tuy nhiên qua thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy vẫn cĩ thể chọn nhiều qui trình nhân nấm khác cho số lượng bào tử cao hơn hoặc chọn những qui trình nhân nấm sao cho khơng làm mất hoạt tính của nấm hoặc giảm đến mức thấp nhất sự mất hoạt tính của nấm bằng cách: chúng ta cĩ thể nuơi nấm trong mơi trường chứa bột cào cào chẳng hạn hoặc giảm tối đa các bước cấy chuyền. Qua thí nghiệm khảo sát độc tính của nấm Metarhizium anisopliae trên sùng, ba dịng nấm cĩ khả năng gây độc trên sùng trắng là BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11, trong đĩ dịng Ma11 biểu hiện tính độc cao nhất, tỷ lệ sùng chết 80%. Và phương pháp gây vết thương nhẹ trước khi cho tiếp xúc nấm là phương pháp hiệu quả với các dịng nấm BXĐTV 3, SCLLLA 4 và MA 11 khi gây nhiễm trong điều kiện thí nghiệm. Các dịng nấm cịn lại BDTN 15, BDLA 8, BXĐLA 8, MA 2, MA 13, CP MA, RBC – Q9 – 3 cĩ thể khơng hiệu quả với cả 3 phương pháp gây nhiễm hoặc khơng cĩ khả năng gây độc trên giai đoạn sùng (một giai đoạn trong vịng đời của bọ cánh cứng) hay cĩ thể chúng hồn tồn khơng cĩ độc tính trên tất cả các giai đoạn sống của bọ cánh cứng. 5.2 Đề nghị Cần chọn lọc các phương pháp nhân nấm thích hợp để gây nhiễm trên từng loại sùng khác nhau. Cải tiến phương pháp nhân nấm để tránh hiện tượng nấm giảm hoạt tính qua nhiều lần cấy chuyền. 52 Nghiên cứu nhiều hơn về các dịng nấm Metarhizium anisopliae để chọn lọc nhiều dịng cĩ hoạt tính cao, cĩ khả năng ký sinh trên nhiều giai đoạn sống của sùng trắng và nhiều cơn trùng gây hại khác nhau. Từ đĩ chọn lọc dịng thích hợp làm chế phẩm diệt cơn trùng hiệu quả. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. GS.TS. Trần Văn Mão, 2004. Sử dụng vi sinh vật cĩ ích, tập II - Ứng dụng nấm cộng sinh và sinh vật phịng trừ sâu hại. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. 2. Lê Nguyễn Ngọc Tùng Anh,2004. Luận văn tốt nghiệp Nghiên cứu các qui trình lên men nấm Metarhizium sp. Đại học Nơng Lâm tp Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Xuân Thành – Lê Văn Hưng - Phạm Văn Tồn, 2003. Giáo trình Cơng nghệ vi sinh vật trong sản xuất nơng nghiệp và xử lý ơ nhiễm mơi trường. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. 4. PTS Nguyễn Thị Chắt,1999. Cơn trùng cơ bản. Đại học Nơng Lâm –Tp Hồ Chí Minh. 5. Trần Thị Thanh, 2000. Cơng nghệ vi sinh. Nhà xuất bản giáo dục. 6. Bùi Xuân Đồng, Nguỵễn văn Huy, 2000. Vi nấm dùng trong cơng nghệ sinh học. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật Hà Nội. 7. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh. 8. Nguyễn Thị Thư Hương, 2004. Nghiên cứu và đánh giá tính độc của nấm Metarhizium spp. ký sinh trên cơn trùng gây hại. Luận văn Thạc sĩ. Trường Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 9. Nguyễn Thị Lộc, Võ Thị Bích Chi, Nguyễn Thị Nhàn, Phạm Quang Hưng, Huỳnh Văn Nghiệp, Vũ Tiến Khang và Nguyễn Đức Thành, 2002. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng hai chế phẩm sinh học để quản lý các lồi sâu hại lúa. Viện lúa ĐBSCL. Trang 274 – 293. 10. Phạm Thị Thùy - Viện Bảo vệ Thực vật Hà Nội, Nguyễn Văn Thiêm và ctv – Chi cục Bảo vệ Thực vật Bến Tre và Võ Hiền Đức – Trung tâm Bảo vệ Thực vật Phía Nam. Kết quả khảo nghiệm chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae để phịng trừ bọ hại dừa (Brontispa sp.) ở Bến Tre năm 2000. 54 Tài liệu tiếng Anh 1. Ferron, P. 1978. Biological control of insect pests by entomogenous fungi. Annu. Rev. Entomol 23: 409-422. 2. Lawrence A. Lacey. Biological techniques, Manual os Techniques in Insect Pathology. Yakima Agricultural Research Laboratory, USDA – ARS, 5230 Konnowac Pass Road, Wapato, WA 98951, USA. 3. Milner R.J, 1989. Recent progress with Metarhizium anisopliae for pest control in Australia. In proceedings of the first Asia/Pacific conference on Entomology – Chiang Mai, November, 1989. 4. Richard J. Milner, 2000. Biocontrol News and Information. Vol. 21 No. 2 47N – 50N. 5. Rombach, M.C., R.M. Aguda and D. W. Roberts,1986b. Biological control of the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Homoptera: Delphacidae) with dry mycelium applications of Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Philipp. Entomol. 8: 613-627. 6. S.P. Singh and P. Rethinam, 2004. Cocoinfo international. Vol 11, No. 2. Trang Web 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. file:///C/user/THUAN/Fun_Bio.htm 12. 13. 55 14. 15. 16.