Khóa luận Khảo sát ảnh hưởng của dịch nấm phytophthora capsici và các tác nhân hóa lý đến sự sinh trưởng và khả năng tạo đột biến của cây tiêu (piper nigrum l.) nuôi cấy mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: TÔ THỊ NHÃ TRẦM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *****000***** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TÔ THỊ NHÃ TRẦM TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY *****000***** EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Supervisor Student MSc. NGUYEN THI KIM LINH TO THI NHA TRAM Dr. LE DINH DON TERM: 2003 - 2007 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy trong suốt bốn năm qua. - TS. Lê Đình Đôn và ThS. Nguyễn Thị Kim Linh đã tận tình hƣớng dẫn và động viên trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Các anh chị phụ trách phòng 118 và 105 Khu Phƣợng Vỹ thuộc Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật - Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Cám ơn Thầy và các chị thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em tận tình. - Thầy Trần Ngọc Hùng cùng các chị thuộc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đại học Nông Lâm TP. HCM. - Các bạn Nguyễn Thị Ngọc Tú, Lê Thị Bích Uyển, Nguyễn Hoàng Quân, Trần Nguyễn Mỹ Châu khoa Nông Học thực hiên đề tài ở Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, bạn Văn Đào, Quốc Dũng CNSH30 và Anh Khoa, Tuyết Nhung, Ngọc Lợi CNSH31 cùng toàn thể lớp CNSH29 thân yêu đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Sinh viên thực hiện TÔ THỊ NHÃ TRẦM iv TÓM TẮT TÔ THỊ NHÃ TRẦM, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora sp. VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài đƣợc thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học Đại Học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tƣợng hồ tiêu (Piper nigrum L.) in vitro. Những kết quả đạt đƣợc: Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Ở nồng độ dịch nấm 30 và 40 % thì mô sẹo bị chết hoàn toàn. Nồng độ 20 % tạo nhiều tế bào bất thƣờng, mô vẫn còn khả năng sống sót và ở nồng độ này cho kết quả đột biến tế bào mô nhiều hơn. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo Nồng độ 10 mg/l BA kết hợp với 1 mg/l IBA và 20 mg/l BA với 1 mg/l IBA cho kết quả tạo chồi cao trong đó tối ƣu nhất vẫn là BA sử dụng ở nồng độ 10 mg/l kết hợp với 1 mg/l IBA. Mặt khác, nồng độ 20 mg/l IBA kết hợp với 1 mg/l BA và 1mg/l IBA kết hợp với 2 mg/l TDZ lại cho kết quả đột biến cao. Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu Ở liều xạ 20 Gy thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo hơn nhƣng để tạo đột biến thì ở liều xạ 40 Gy cho tỉ lệ biến dị cao hơn. Trên chồi thì liều xạ 20 Gy kích thích tạo sẹo nhiều và cả mô xốp nhƣng ở liều xạ 40 và 60 Gy cho nhiều thể đột biến hơn vì tạo đƣợc nhiều mô bất thƣờng và cấu trúc tế bào thay đổi nhiều. v SUMMARY The thesis titled “EFFECTS OF Phytophthora capsici EXTRACT, CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS ON THE GROWTH AND MUTATION OF IN VITRO BLACK PEPPER (Piper nigrum L.)” was carried out at Biotechnology Department and Plant Protection Department – Nong Lam University, HCMC from March 2007 to August 2007 under the supervision of MSc. Nguyen Thi Kim Linh and Dr. Le Dinh Don. The thesis contents three experiments. The first experiment was “effects of Phytophthora capsici on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with Phytophthora capsici extract at 20%, 30% and 40% for 21 days. The results showed that: On the medium having Phytophthora capsici extract at 30% and 40%, the mutation ratio were highter than that on the third medium on the day 14 t after culture. However, on these two mediums all black pepper callus were died on the day 21 st after culture. The second experiment was “effects of growth regulator on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus were cultured on MS medium with BA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with IBA (1 mg/l); IBA (10 mg/l, 20 mg/l) combined with BA (1 mg/l); and TDZ (1 mg/l, 2 mg/l) combined with IBA (1 mg/l). The results showed that: The medium supplemented with BA (10 mg/l) combined with IBA (1 mg/l) had highest shoot ratio. The medium supplemented with IBA (1 mg/l) combined with TDZ (1 mg/l) gave highest mutation ratio. The last experiment was “effects of Gamma ray on the growth and mutation of in vitro black pepper”. In vitro black pepper callus and shoot were treated by gamma ray at 20, 40 and 60 Gy. The results showed that: Callus formation in 20 Gy treatment was higher than that the treatments of 40 and 60 Gy. However, the mutation ratio in gamma ray at 40 and 60 Gy treatments were higher than that the treatments of 20 Gy. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa ............................................................................................................. i Lời cảm tạ ............................................................................................................ iii Tóm tắt ................................................................................................................ iv Mục lục ................................................................................................................ vi Danh sách các bảng ............................................................................................. ix Danh sách các hình .............................................................................................. x Danh sách các chữ viết tắt ................................................................................... xii PHẦN 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu ..................................................................................... 3 1.3. Giới hạn của đề tài ....................................................................................... 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu ................................................................... 4 2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu ............................................................................... 4 2.1.2. Tình hình phân bố ..................................................................................... 5 2.1.3. Tình hình sản xuất tiêu thụ trên thế giới và trong nƣớc ............................ 5 2.1.3.1. Tình hình sản xuất .................................................................................. 5 2.1.3.2. Tình hình tiêu thụ ................................................................................... 6 2.1.4. Tình hình bệnh trên cây tiêu...................................................................... 9 2.1.4.1. Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophthora capsici gây ra ............ 9 2.1.4.2. Bệnh tuyến trùng .................................................................................... 10 2.1.4.3. Bệnh khô đầu ngọn thối trái ................................................................... 10 2.1.4.4. Bệnh vằn lá do virus ............................................................................... 10 2.1.4.5. Các bệnh do dinh dƣỡng bất thƣờng ...................................................... 11 2.1.5. Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế ................................................... 11 2.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora capsici ..................................................... 12 2.3. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật ....................... 13 vii 2.3.1. Khái niệm bức xạ ...................................................................................... 13 2.3.2. Bức xạ gamma ........................................................................................... 14 2.3.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) .................................................................. 14 2.3.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống ...................................... 14 2.3.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa ................................................... 15 2.3.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ .................................. 16 2.3.6.1. Ngoài nƣớc ............................................................................................. 16 2.3.6.2. Trong nƣớc ............................................................................................. 17 2.4. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào tực vật .................................. 18 2.4.1. Khái niệm .................................................................................................. 18 2.4.2. Ứng dụng ................................................................................................... 18 2.4.3. Phƣơng pháp nhân phôi vô tính ................................................................ 19 2.4.3.1. Khái niệm ............................................................................................... 19 2.4.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính .......................................................... 19 2.4.3.3. Sự hình thành phôi vô tính ..................................................................... 19 2.4.3.4. Các kiểu phát sinh phôi soma ................................................................ 20 2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh truonwgr trong nuôi cấy mô tế bào thực vật ...... 21 2.5.1. Chất điều hòa sinh trƣởng ......................................................................... 21 2.5.2. Một số chất điều hòa sinh tƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô ........... 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................... 24 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu................................................................................... 24 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................ 24 3.3. Vật liệu nghiên cứu ...................................................................................... 24 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy ..................................................................... 24 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng ................................................................... 24 3.3.1.2. Phòng cấy ............................................................................................... 24 3.3.1.3. Phòng cấy nấm ....................................................................................... 24 3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng .................................................................................. 24 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy .................................................................. 25 viii 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................. 25 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ .................................................................... 25 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 28 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy................................................................... 28 3.4.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 28 3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch nấn Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ............................................ 28 3.4.2.2. Khảo sát sự ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu .......................................... 31 3.4.2.3. Khảo sát sự ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu ......................................................... 32 3.5. Phân tích thống kê ........................................................................................ 33 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 34 4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsicci đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ........................................... 34 4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro ...................................................... 34 4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici.................................................................................................................. 34 4.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ................................................................ 42 4.3. Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo, chồi tiêu .............................................................. 51 4.3.1 Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu ..................................................................................... 51 4.3.2. Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của chồi tiêu .......................................................................................... 58 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................... 64 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 64 5.2. Đề nghị ........................................................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 66 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 69 ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 21: Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) .................................................... 6 Bảng 2.2: Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 ................... 7 Bảng 2.3: Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 – 1999) ........................ 8 Bảng 2.4: Năng suất và sản lƣợng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 .............. 11 Bảng 3.1: Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu ............................................................................ 30 Bảng 3.2: Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu .................................................................................... 31 Bảng 3.3: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu .................................................... 32 Bảng 3.4: Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu ......................................................... 33 Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo ...... 37 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy .................................................................................................................. 38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo ........... 42 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo phôi của mô sẹo tiêu ............................................................................... 43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu ................................................................................ 44 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia γ đến khả năng sống sót của mô sẹo tiêu ........................................................................................................... 51 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến khả năng tạo phôi của mô sẹo ............... 52 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ sống của chồi tiêu ...................... 58 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của liều xạ gamma đến tỉ lệ tạo chồi của chồi tiêu ................ 59 x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 4.1: Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D ................................................................................................. 34 Hình 4.2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy ............ 35 Hình 4.3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy ......... 36 Hình 4.4: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy .. 37 Hình 4.5: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 39 Hình 4.6: Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) .......................................................................... 41 Hình 4.7: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) ......................................................... 41 Hình 4.8: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy .......................................................................................... 45 Hình 4.9: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy ............................................................................... 46 Hình 4.10: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................... 47 Hình 4.11: Mô xốp trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy ...................................................................................................... 48 Hình 4.12: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng (độ phóng đại 40  10) ........................................................................................................ 48 Hình 4.13: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) .............................................. 49 Hình 4.14: Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) .............................................. 50 xi Hình 4.15: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 2 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 53 Hình 4.16: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 3 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 54 Hình 4.17: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D sau 4 tuần chiếu xạ gamma .................................................................................... 55 Hình 4.18: Mặt cắt mô sẹo sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ...... 56 Hình 4.19: Mặt cắt mô sẹo sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ....... 57 Hình 4.20: Mặt cắt mô sẹo sau 4 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ......57 Hình 4.21: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ................................................................................................................... 60 Hình 4.22: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ........................................................................................................ 60 Hình 4.23: Chồi tiêu trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA sau 2 tuần chiếu xạ gamma ........................................................................................................ 61 Hình 4.24: Mặt cắt chồi tiêu sau 2 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ....... 62 Hình 4.25: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ..... 63 Hình 4.26: Mặt cắt chồi tiêu sau 3 tuần chiếu xạ gamma (độ phóng đại 40  10) ..... 63 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BA: N 6 – benzyladenine 2,4-D: 2,4 – Dichlorophenoxyacetic Acid Gy: đơn vị đo năng lƣợng hấp thụ IBA: Indole – 3 – butyric Acid MS: Murashige & Skoog, 1962 TDZ: Thidiazuron Ctv: cộng tác viên GA: Gibberellin A 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sự phát triển mạnh mẽ của khoa học công nghệ, nhất là công nghệ gen và công nghệ tế bào đã đóng góp to lớn vào lĩnh vực cải tiến giống cây trồng nông nghiệp phục vụ cho nhu cầu của con ngƣời. Cây hồ tiêu (Piper nigrum L.) là một mặt hàng xuất khẩu trọng yếu, mang lại nhiều lợi nhuận cho ngƣời nông dân Việt Nam. Sau những năm 1998, 1999, khi giá hồ tiêu tăng cao (60.000 đồng/kg), nhiều địa phƣơng đã tăng rất nhanh diện tích trồng hồ tiêu. Đến năm 2003, Việt Nam có tổng diện tích cây tiêu cả nƣớc tăng gần 5.000 ha so với năm 2002, dẫn đầu về sản lƣợng xuất khẩu hồ tiêu trên thế giới với 85.000 tấn (IPC). Việt Nam chiếm tỷ trọng xuất khẩu cao nhƣng chủ yếu là mặt hàng tiêu đen cấp thấp, bình quân năm 2003 xuất với giá 1.419 USD/tấn. Tháng 4 đầu năm 2004, lƣợng tiêu xuất khẩu của Việt Nam giảm 28% so với cùng kỳ năm 2003, đồng thời giá xuất khẩu cũng giảm mạnh (Phạm Thị Chín và Nguyễn Xuân Vinh, 2005). Nguyên nhân là do những năm gần đây, năng suất hạt giảm đáng kể so với những năm trƣớc, có khi mất trắng. Mặt khác, giá tiêu khô cân tại vƣờn lại bấp bênh (khoảng từ 16.000 – 20.000 ngàn đồng/kg) làm ngƣời dân không tự tin để tiếp tục canh tác. Do đó, nếu không có những giải pháp đúng đắn, kịp thời, mặt hàng tiêu xuất khẩu của Việt Nam sẽ ngày càng giảm sút về số lƣợng lẫn chất lƣợng. Nhìn chung, hiện trạng trồng tiêu của Việt Nam đang gặp phải một số hạn chế cần đƣợc khắc phục. Trong số đó, quan trọng nhất là khâu giống, vì hiện nay phần lớn các giống tiêu đang đƣợc trồng ở nƣớc ta đã lâu đời, chƣa đƣợc phục tráng tuyển chọn nên không ổn định về năng suất và khả năng kháng bệnh kém. Bên cạnh đó, kỹ thuật chọn và nhân giống còn tự phát, đơn điệu, trồng dựa vào truyền thống 2 là chủ yếu, chƣa áp dụng đƣợc tiến bộ khoa học kỹ thuật (Trần Văn Hòa, 2001). Tuy vậy đối với cây tiêu, tạo giống theo cách cổ điển là phƣơng pháp chủ đạo ở nƣớc ta và nhiều nƣớc trên thế giới. Biện pháp tạo giống cổ điển dựa trên các biến dị di truyền do tổ hợp hoặc do đột biến. Các biến dị có lợi cho sản xuất đƣợc chọn lọc, duy trì và củng cố qua hàng loạt thế hệ để phát triển thành giống mới. Đặc điểm nổi bậc về hình thái, sinh trƣởng, năng suất, chất lƣợng, tính chống chịu, đặc tính thích nghi, tính kháng bệnh, ổn định là những tiêu chuẩn quan trọng đƣợc định tính hay định lƣợng bằng phƣơng pháp chuẩn để đƣa một giống tiêu mới ra sản xuất hoặc xác nhận bản chất di truyền làm nguồn vật liệu cho công tác cải tiến giống. Ứng dụng những phƣơng pháp trong nuôi cấy mô bằng cách sử dụng dịch nấm (Phytopthora capsici), sử dụng chất kích thích sinh trƣởng và chiếu xạ gamma tạo đột biến để khai thác biến dị có lợi từ nguồn tài nguyên di truyền thực vật bản địa nhằm mong muốn tạo ra giống tiêu có kiểu di truyền mới chứa những đặc tính tốt về sinh trƣởng và phát triển cũng nhƣ khả năng thích nghi, tính chống chịu bệnh và cho năng suất cao. Để tiến xa hơn trong công tác giống, cung cấp số lƣợng lớn cây giống tiêu có những đặc điểm tốt và nhu cầu sản xuất – xuất khẩu giống tiêu này bằng cách áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật của nuôi cấy mô tế bào thực vật đồng thời cùng với sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng với sự hƣớng dẫn tận tình TS Lê Đình Đôn và ThS Nguyễn Thị Kim Linh, chúng tôi tiến hành đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH NẤM Phytophthora capsici VÀ CÁC TÁC NHÂN HÓA LÝ ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ KHẢ NĂNG TẠO ĐỘT BIẾN CỦA CÂY TIÊU (Piper nigrum L.) NUÔI CẤY MÔ” 3 1.2. Mục tiêu và yêu cầu Mục đích Tìm ra những cá thể lạ trong điều kiện nuôi cấy bất thƣờng. Yêu cầu Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong dịch nấm Phytophthora capsici. Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo đựơc nuôi cấy trong môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng ở nồng độ cao . Theo dõi sự sinh trƣởng phát triển và những biến đổi của mô sẹo và chồi tiêu đƣợc chiếu xạ tia gamma. 1.3. Giới hạn của đề tài Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chỉ chiếu xạ chƣa kết hợp với các hóa chất khác để tăng hiệu quả gây đột biến. Chƣa thực hiện kiểm tra sinh học phân tử để xác định loại biến dị. 4 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu 2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu Cây tiêu (Piper nigrum) thuộc họ Piperaceae, có nguồn gốc ở vùng Ghats miền Tây Ấn Độ, ở đây có nhiều giống tiêu hoang dại, mọc rất lâu đời. Sau đó, tiêu đƣợc ngƣời Hindu mang tới Java (Indonesia) vào khoảng 600 năm sau công nguyên. Cuối thế kỷ 12, tiêu đƣợc trồng ở Mã Lai. Đến thế kỷ 18, tiêu đƣợc trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ 20 thì tiêu đƣợc trồng nhiều ở các nƣớc nhiệt đới nhƣ Châu Phi với Mandagasca, Nigieria, Congo và Châu Mỹ với Brazil, Mexico. Tiêu du nhập vào Đông Dƣơng từ thế kỷ 17 nhƣng mãi đến thế kỷ 18 mới bắt đầu phát triển mạnh (Trần Văn Hòa, 2001). Tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo đƣợc phân thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có một lá đơn, hình trái tim, mọc cách. Ở nách lá có các mầm ngủ có thể phát sinh thành các cành tƣợc, cành lƣơn, cành ác (cành cho trái) tùy theo từng giai đoạn phát triển của cây tiêu. Hệ thống rễ thƣờng gồm từ 3 – 6 rễ cái và một chùm rễ phụ ở dƣới mặt đất, trên đốt thân có rễ bám (rễ thằn lằn). Tiêu là loại cây trồng có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu đƣợc sử dụng làm gia vị, trong y dƣợc, trong công nghiệp hƣơng liệu và làm chất trừ côn trùng. Chất gia vị: Hạt tiêu có vị nóng, cay, có mùi thơm hấp dẫn nên rất thích hợp cho việc chế biến các món ăn. Vì vậy mà tiêu đã trở thành gia vị đƣợc dùng rất phổ biến trên thế giới. Trong y dƣợc: Do có sự hiện diện của chất piperin, tinh dầu và nhựa có mùi thơm, cay, nóng đặc biệt, tiêu có tác dụng kích thích tiêu hóa, làm cho ăn ngon miệng. 5 2.1.2. Tình hình phân bố Tiêu là một loại cây đặc trƣng của miền nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp cho cây tiêu là từ 10 – 35 0C. Ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp với yêu cầu sinh lý về sinh trƣởng và phát dục, ra hoa đậu quả của cây tiêu và kéo dài tuổi thọ của vƣờn. Tiêu ƣa thích điều kiện khí hậu nóng ẩm, lƣợng mƣa trong năm cần từ 1500 – 2500 mm. Tiêu cũng cần một giai đoạn hạn tƣơng đối ngắn sau vụ thu hoạch để phân hóa mầm hoa tốt và ra hoa đồng loạt vào mùa mƣa năm sau. Do đó, ở Việt Nam tiêu đƣợc trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình, Kiên Giang (Phú Quốc), Đồng Nai (Long Khánh), Bình Phƣớc (Lộc Ninh). 2.1.3. Tình hình sản xuất tiêu thụ tiêu trên thế giới và trong nƣớc 2.1.3.1. Tình hình sản xuất Theo thống kê của FAO thì hiện nay trên thế giới có khoảng 70 nƣớc trồng tiêu. Tổng sản lƣợng tiêu hột tăng dần theo thời gian: năm 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn tiêu hột, năm 1978 là 160.000 tấn tiêu hột và 1983 là 180.000 tấn tiêu hột. Sau 1982 sản lƣợng tiêu trên thế giới giảm dần do sâu bệnh và thời tiết. Đồng thời một phần cũng do sự ô nhiễm môi trƣờng gây ảnh hƣởng tới sự thụ phấn của hoa tiêu. Trƣớc những năm 90, các nƣớc có sản lƣợng tiêu lớn là Brazil, Indonesia và Malaysia. Đến năm 2000, Ấn Độ đã vƣơn lên đứng vị trí thứ nhất, kế đến là Việt Nam (FAO, 2000). Đến năm 2001, Việt Nam đã vƣợt lên Ấn Độ để trở thành nƣớc có sản lƣợng tiêu lớn nhất thế giới. Với tốc độ sản xuất tiêu nhanh chóng ở Việt Nam và Ấn Độ, lƣợng cung trên thế giới đã vƣợt quá lƣợng cầu khiến giá tiêu trên thị trƣờng thế giới giảm mạnh hơn 50% từ 3.000 – 4.000 USD/tấn còn 1.500 – 1.800 USD/tấn (Bảng 2.2). Theo thống kê của Cộng đồng hạt tiêu thế giới IPC, lƣợng cung năm 2003 giảm 4% trong bối cảnh giá thấp và điều kiện canh tác không thuận lợi. Ngoài Việt Nam, nƣớc sản xuất hàng đầu, tăng 13% đạt mức 85.000 tấn, sản lƣợng lại giảm mạnh tại các nƣớc nhƣ Ấn Độ, Brazil và Malaysia do sâu bệnh và thời tiết. So với năm 2002 sản lƣợng và xuất khẩu của 6 nƣớc sản xuất 6 hạt tiêu chính trên thế giới. Trong những năm gần đây Ấn Độ, Indonesia và Việt Nam là những nƣớc có diện tích trồng tiêu lớn nhất thế giới. Ở Việt Nam, năm 1997 - 1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha. Diện tích tiêu tăng nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện tích tiêu của cả nƣớc) Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam chủ trƣơng tập trung thâm canh, cải tạo các vƣờn cây già cỗi, loại bỏ những giống tiêu kém hiệu quả và thay vào đó là các giống tiêu năng suất cao, chất lƣợng tốt (trồng giống tiêu Ấn Độ tại Vĩnh Linh, Quảng Trị, đẩy mạnh thâm canh tiêu tại các vùng Đông Nam Bộ), giữ ổn định diện tích từ 45.000 ha đến 50.000 ha và chỉ phát triển trên các vùng đất đƣợc xác định thích hợp cũng nhƣ khuyến khích nhân rộng mô hình sản xuất tiêu sạch (Bảng 2.3). 2.1.3.2. Tình hình tiêu thụ Nƣớc ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trƣờng tiêu thụ trong nƣớc hàng năm chỉ đạt khoảng 3.500 - 4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lƣợng tiêu dành cho xuất khẩu. Thị trƣờng tiêu xuất khẩu chủ yếu của Việt Nam (1996 - 6/2000) là các nƣớc: Mỹ, các nƣớc EU, Singapore. Bảng 2.1 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 đến 6 tháng đầu năm 2000 (Tại cảng Sài Gòn - Thành phố Hồ Chí Minh) Năm Số lƣợng (tấn) Thị trƣờng nhập 1996 1997 1998 1999 6 tháng đầu năm 2000 Tổng cộng 24.776 20.815 7.669 28.593 28.801 110.656 Mỹ, Ấn Độ, Singapore, EU, Hà Lan, Pháp, Ai Cập, Hồng Kông, Malaysia, Sudan, UAE, Bulgaria, Pakistan, Kuwait, Israel, Hy lạp, Đức, Hungari, Nga, Tây Ban Nha Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000. 7 Bảng 2.2 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) Quốc gia 1991 1992 1993 1994 1995 1996 Trung bình Asia & Pacific 182,016 183,721 144,976 158,028 169,189 153,988 165,320 India 55,000 60,000 55,000 50,000 55,000 60,000 55,833 Indonesia 61,000 62,000 23,500 42,500 59,000 39,200 47,867 Malaysia 29,000 26,000 17,600 16,000 13,000 12,000 18,933 Vietnam 8,900 7,830 18,500 20,000 20,000 20,000 15,872 China P.R. 13,108 12,321 10,461 12,409 5,000 8,000 10,217 Thailand 10,443 10,500 9,000 10,104 10,949 9,773 10,128 Sri Lanka 2,850 3,255 9,000 5,000 3,725 3,000 4,472 Cambodia 1,700 1,800 1,900 2,000 2,500 2,000 1,983 Brunei Darus 15 15 15 15 15 15 15 South Pacific 158 159 164 168 168 168 197 Fiji 140 145 145 150 150 150 176 Samoa 5 5 6 6 6 6 7 Micronisea 13 9 13 12 12 12 14 Latin America 51,774 30,615 26,427 25,303 21,940 21,690 29,625 Brazil 50,000 27,500 25,000 23,000 20,000 19,500 27,500 Mexico 894 2,395 734 1,363 1,000 1,250 1,273 Guatemala 360 370 380 380 380 380 375 Honduras 420 160 213 400 400 400 332 Saint Lucia 100 190 100 160 160 160 145 Africa 5,427 4,543 4,665 4,565 4,565 4,565 5,833 Madagasca 2,160 2,000 2,300 2,300 2,500 2,500 2,327 Malawi 1,000 900 700 700 700 700 900 Zimbabue 700 800 900 700 700 700 750 Benin 894 150 150 150 150 150 299 Kenya 200 300 400 300 300 300 300 Cote di Voire 100 100 100 100 100 100 100 Cameroon 63 63 65 65 65 65 64 Ethiopia 100 200 50 Zambia 30 30 50 50 50 50 43 Tổng 239,038 219,038 176,232 188,064 195,862 180,411 199,975 Nguồn: Proc. Peper Tech. Meet, 1997. 8 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) Đơn vị tính: DT (ha); NS (tấn/ha); SL (tấn) Nguồn: Tổng cục thống kê Việt Nam, năm 2000. Số thứ tự Hạng Mục Năm 1997 Năm 1998 Năm 1999 Diện tích Tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng DT tổng số DT thu hoạch Năng suất Sản lƣợng Cả nƣớc 9777 6243 2.08 13007 12783 7609 2.09 15883 15641 8939 2.12 18970 A Miền Bắc 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 I Bắc TBộ 1405 1153 0.69 795 1754 1261 0.74 932 1900 1337 0.75 1002 1 Nghệ An 279 226 0.70 158 279 230 0.70 161 284 230 0.75 172 2 Quảng Bình 181 149 0.64 95 199 153 0.48 73 209 156 0.55 86 3 Quảng Trị 842 702 0.70 491 1153 798 0.82 652 1284 870 0.80 696 B Miền Nam 8372 5090 2.40 12212 11029 6348 2.36 14951 13741 7602 2.36 17968 I DH Trung bộ 329 306 1.14 348 424 312 1.10 344 476 322 1.15 369 1 Quảng Nam 37 33 0.48 16 42 35 0.46 16 47 37 0.49 18 2 Bình Định 60 47 0.68 32 79 47 0.55 26 107 56 0.55 31 3 Phú Yên 97 97 1.92 186 166 105 1.91 201 186 115 1.95 224 4 Khánh Hòa 11 10 1.40 14 9 8 0.88 7 12 9 0.89 8 II Tây Nguyên 1712 999 1.63 1626 2492 1585 1.66 2638 3551 1833 2.00 3666 1 Gia Lai 303 128 0.70 89 695 238 0.75 179 1274 333 2.45 816 2 Đắc Lắc 1409 871 1.76 1537 1797 1347 1.83 2459 2277 1500 1.90 2850 III Đông Nam bộ 5893 3415 2.76 9412 7726 4080 2.75 11230 9115 5061 2.55 12925 1 Lâm Đồng 52 31 2.06 64 129 49 1.96 96 190 47 1.64 77 2 Bình Phƣớc 3437 704 10.06 7080 911 2100 3.78 7943 4816 2405 3.80 9139 3 Tây Ninh 245 185 1.25 231 298 240 1.63 391 495 263 1.82 478 4 Bình Dƣơng 244 138 2.21 305 249 143 2.30 329 262 145 2.30 334 5 Đồng Nai 52 520 0.92 480 611 428 1.07 457 630 430 1.07 461 6 Bình Thuận 270 150 1.93 289 656 291 1.65 480 850 496 1.71 846 7 BR-Vũng Tàu 996 565 1.38 780 1743 705 1.91 1349 1743 1150 1.22 1404 IV Đồng Bằng SCL 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 1 Kiên Giang 433 364 2.26 823 511 380 2.00 760 642 520 1.80 936 9 2.1.4. Tình hình bệnh trên cây tiêu Tiêu là một loại cây rất dễ bị bệnh, nhất là tại những vùng đã trồng tiêu lâu năm. Các bệnh chủ yếu thƣờng gặp trên cây tiêu gồm (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). 2.1.4.1. Bệnh chết nhanh dây tiêu do nấm Phytophothra gây ra Thành phần bệnh hại trên tiêu rất đa dạng và phong phú nhƣ: thán thƣ (Colletotrichum gloeosprioides), đen lá (Lansiondiplodia theobromce), đốm lá (Rosellina sp.), khô vằn (Rhizoctonia solani), bệnh chết nhanh dây tiêu (Phytophthora parasitica), bệnh chậm lớn cây lùn, bệnh tiêu điên và bệnh do tuyến trùng gây ra, chúng làm cho cây suy yếu, héo vàng rồi làm chết cây hay làm cho cây không phát triển. Trong đó bệnh chết nhanh dây tiêu thật sự là một tai họa cho nhà vƣờn, bệnh xuất hiện và lây lan rất nhanh, thƣờng làm tiêu chết hàng loạt gây mất trắng hay làm giảm năng suất trầm trọng. Bệnh thƣờng do nấm Phytophthora capsici sống trong đất gây ra, đôi khi còn kết hợp với các nấm khác nhƣ Fusarium sp., Pythium sp., Rhizoctonia solami cùng tấn công làm cây tiêu chết nhanh chóng. Bệnh thƣờng xảy ra trong mùa mƣa khi thời tiết ẩm (Trần Văn Hòa, 2001). Theo kết quả nghiên cứu của bộ môn Bảo Vệ Thức vật, Viện Kỹ Thuật Khoa Học Nông Lâm Nghiệp Tây Nguyên năm 1999 thì bệnh này xuất hiện với tỷ lệ thấp (0,11% ở Gia Lai), chƣa đƣợc coi là bệnh nguy hiểm cho cây tiêu ở vùng Tây Nguyên nhƣng đến năm 2000 - 2001 bệnh đã gây thành dịch ở một số vùng EaHLeo, Easup, CƣM’gar thuộc tỉnh Đắc Lắc. Ở tỉnh Gia Lai, vùng bị thiệt hại nặng là Mang Yang (Tạp chí thông tin khoa học kỹ thuật Nông Lâm Nghiệp, số 1/2001). Từ khi cây tiêu rũ lá vàng và rụng hàng loạt chỉ trong 5 - 7 ngày. Bệnh lây lan rất nhanh, qua đất, qua nƣớc tƣới, cả vƣờn tiêu bị hại chỉ trong vòng vài tuần hay vài tháng. Khi thấy triệu chứng héo dây thì bộ rễ đã bị nấm tấn công trƣớc 1,5 - 2 tháng, do đó bệnh rất khó phòng trị (Trần Văn Hòa, 2001). Bệnh này hại hầu hết các bộ phận của cây tiêu: thân, rễ, lá, cổ rễ, trái. Bộ phận rễ và phần thân ngầm bị nấm tấn công thối đen, vỏ bong ra khỏi rễ, phần dây trên mặt đất bị héo, lá chuyển sang màu vàng và rụng hàng loạt trong 7 - 14 ngày, để lại cành trơ trụi và khô đi, sau đó toàn cây bị 10 héo đen và chết. Vào mùa mƣa bệnh xuất hiện ở lá dƣới những vòng nâu đen, tập trung ở đầu lá, các đốm lớn dần, có màu nâu sậm và rất dễ rụng. Đến nay chƣa có biện pháp hữu hiệu để trị nấm Phytophthora capsici khi đã bị xâm nhập vào cây tiêu. Khi bệnh đã biểu hiện thì không còn chữa trị đƣợc nữa, cho nên hiện nay phòng bệnh là biện pháp chủ yếu để làm giảm tối thiểu thiệt hại do nấm Phytophthora capsici gây ra. 2.1.4.2. Bệnh tuyến trùng Đây là bệnh thƣờng thấy ở các vƣờn tiêu. Triệu chứng ban đầu là cây tiêu bị vàng, sinh trƣởng kém, năng suất giảm dần, khả năng hút phân kém hẳn mặc dù trƣớc đó có bón phân đạm đầy đủ. Cây bị bệnh có rễ bị sƣng, bị thối từng phần một, rễ ngắn lại và thúi đầu chóp rễ, ít phát triển rễ phụ. Vào mùa nắng nếu bị tuyến trùng cây khô héo rất nhanh, cây rất dễ bị các bệnh khác tấn công do đó chết rất nhanh. Tác nhân gây bệnh gồm có: nhóm tuyến trùng nội ký sinh gây bệnh bƣớu rễ, phổ biến là hai giống tuyến trùng có tên là Meloidogyne arenaria và Meloidogyne incognita. Hai loại này đục lỗ chui vào trong rễ để sống, chích hút dịch cây làm cho cây không hút đƣợc thức ăn, cây khô héo tạo thành bƣớu rễ. Nhóm tuyến trùng ngoại ký sinh chích hút rễ cây thƣờng gặp nhất là Pratylenchus, sống trong đất, chích rễ non hút chất dinh dƣỡnglàm cây suy yếu, mở đƣờng cho các loại vi sinh vật khác xâm nhập vào (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). Cách phòng trị tuyến trùng: có thể dùng Furadan để giới hạn bệnh 2.1.4.3. Bệnh khô đầu ngọn thối trái Bệnh này do Collextotrichum sp. gây ra làm cây ngƣng phát triển, các lá trên cùng úa vàng, trên lá và trái tiêu non xuất hiện những chấm và đốm đen làm lá, trái rụng sớm. Cây bị mất sức suy yếu (Plakidas A.G, 1954) 2.1.4.4. Bệnh vằn lá do virus Bệnh này do virus gây ra, trên lá nổi những vết xanh đậm xen kẽ với những đƣờng gân xanh nhạt bản lá bị cong, vẹo lại, rõ nhất là ở các lá non. Bệnh này thƣờng do rầy truyền từ cây bị bệnh sang. Khi cây bị bệnh này, tốt nhất là nhổ bỏ để 11 khỏi lây lan sang cây khác đồng thời phun thuốc diệt rầy để cắt môi giới truyền bệnh cho các cây còn lại (Mai Văn Quyền và ctv, 1996). 2.1.4.5. Các bệnh do dinh dƣỡng bất thƣờng Phần lớn các triệu chứng thiếu dinh dƣỡng ở cây tiêu đều bắt đầu bằng sự đổi thành màu vàng nhiều hoặc ít ở các lá non, khoảng giữa các gân lá (Phan Hữu Thịnh và ctv, 1987) 2.1.5. Nhu cầu về cây tiêu giống trong thực tế Tiêu là một mặt hàng xuất khẩu có giá trị cao, do đó mà diện tích trồng tiêu của nƣớc ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng, nhất là trên các vùng đất ở miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên. Sự gia tăng qua các năm từ 1995 đến năm 1999 theo niên giám thống kê 1999 đƣợc ghi nhận ở bảng 2.4 Bảng 2.4 Năng suất và sản lƣợng tiêu từ năm 1995 đến năm 1999 Năm Diện tích (*1.000 ha) Năng suất (tấn/ ha) Sản lƣợng (*1.000 tấn) 1995 70,0 1,23 9,3 1996 7,5 1,4 10,5 1997 9,8 1,3 13,0 1998 12,8 1,24 15,9 1999 15,0 1,18 17,8 Năng suất bình quân trên 1 ha của Việt Nam là 1,24 tấn còn thấp so với một số nƣớc trồng tiêu trên thế giới. Vì tiêu là mặt hàng có giá trị cao so với các nông sản khác nên diện tích trồng tiêu của nƣớc ta trong các năm qua đã không ngừng gia tăng từ 9.800 ha năm 1997 đã lên 12.800 ha năm 1998 (niên giám thống kê, 1998). Tuy nhiên nhìn chung hiện trạng trồng tiêu của nƣớc ta đang gặp phải một số hạn chế phải đƣợc khắc phục, nhất là về vấn đề khâu giống trồng của nƣớc ta đã lâu đời, chƣa đƣợc phục tráng tuyển chọn để tìm ra các giống tốt ổn định về mặt năng suất và kháng sâu bệnh. Kỹ thuật chọn và sản xuất giống còn tự phát và đơn điệu. Còn kỹ thuật trồng dựa vào truyền thống là chủ yếu, truyền từ đời này sang đời khác, chƣa áp dụng đƣợc các tiến bộ khoa học kỹ thuật. Việc chăm sóc còn nhiều giới hạn nhƣ việc bón phân chƣa cân đối, thời kỳ bón chƣa hợp lý. Về mặt phòng trừ sâu 12 bệnh nông dân cũng chƣa quan tâm đúng mức, trong lúc đó bệnh là đối tƣợng nguy hại nhiều nhất cho tiêu (Trần Văn Hòa, 2001). Từ đó, vấn đề cây tiêu ngày càng đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm hơn đặc biệt là vấn đề giống. Để tạo ra giống tiêu đạt yêu cầu về mặt năng suất cũng nhƣ phòng trừ sâu bệnh thì phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc quan tâm nhiều hơn cả. Trong đó, phƣơng pháp tạo phôi vô tính cây tiêu nhằm nhân nhanh giống và tạo ra giống tiêu sạch bệnh để đáp ứng nhu cầu thực tế của các nhà sản xuất. 2.2. Giới thiệu về nấm Phytophthora Phytophthora (Gr. Phyton: Thực vật; phthora: phá hoại), đƣợc đặt bởi Bary (1876). Nấm Phytophthora là loại khá phổ biến của lớp Oomycetes thuộc họ Pythiacea, bộ Pernoporales, sợi nấm không màu, không vách ngăn, đơn bào, kích thƣớc không đều, túi bào tử có hình trứng và hình quả chanh, trên đầu có nuốm hoặc không có nuốm, không màu, trong suốt. Bào tử hình cầu hoặc hình thận có hai lông roi, di chuyển rất nhanh trong nƣớc, nhiệt độ thích hợp để nấm sinh trƣởng và phát triển từ 25 - 30oC, pH 6 - 7. Các loài Phytophthora tấn công một phạm vi thực vật rộng lớn và là tác nhân gây một số dịch bệnh nghiêm trọng trên thế giới – điển hình nhƣ bệnh mốc sƣơng mai (hay tàn lụi muộn) trên khoai tây đã gây ra nạn đói ở Châu Âu những năm 1840, nguyên nhân do nấm P. infestans (Bourke, 1964). Bệnh Phytophthora đã đƣợc nghiên cứu sâu tại Châu Âu. Tuy nhiên, bệnh khá phổ biến ở vùng nhiệt đới ẩm và gây nhiều nguy hiểm làm mất mùa ở nhiều loại cây ăn quả quan trọng ở những vùng này; nhƣ bệnh thối rễ, thối cổ rễ, loét thân, tàn lụi lá và thối trái. Nấm P. palmivora đã gây rất nhiều bệnh trên nhiều loại cây trồng khác nhau: đen vỏ cacao; thân và trái đu đủ; thối rễ và tàn lụi trên cam quýt; thối chồi trên cọ; sọc đen trên cao su; thối rễ loét thân sầu riêng; chết nhanh trên tiêu. Trên cây tiêu dòng nấm Phytophthora gây hại đƣợc xác định là nấm Phytophthora capsici gây hại chủ yếu trong mùa mƣa, nhất là vào cuối mùa mƣa khi có khí hậu ấm và ẩm. Nấm Phytophthora sp. có thể tấn công riêng lẻ nhƣng đa số có sự kết hợp với các nấm khác nhƣ Fusarium, Pythium và Rhizoctonia. 13 Có thể nói Phytophthora là một nhóm lớn có mặt khắp mọi nơi trên thế giới và có hơn 1.000 cây ký chủ, một vài loài của Phytophthora đã trở thành dịch hại (Gregory, 1983). Trong khi P. cinnamomi đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới thì P. palmivora, P. paracitica (P. nicotianae) và P. citrophthora là đặc trƣng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; P. infestans, P. syringae và P. fragariae xuất hiện phổ biến ở vùng ôn đới. Điều kiện phát sinh bệnh, phát triển bệnh Bệnh héo nhanh do nấm Phytophthora sp. tấn công trên cây tiêu thƣờng xảy ra trong mùa mƣa, khi có khí hậu nóng và ẩm. Bệnh xảy ra trên những vƣờn thoát nƣớc kém, đất bị úng nƣớc hoàn toàn là điều kiện cho nấm phát triển. Nấm Phytophthora sống trong đất dƣới hình thức các sợi nấm (mycelium) hoặc các bào tử có vách dày gọi là noãn bào tử (oospores), các noãn bào tử tồn tại hàng năm trong đất. Khi đất ẩm, các noãn bào tử nảy mầm cho ra các sợi nấm (mycelia), các sợi nấm sinh ra các bào tử nang (sporangia), các bào tử nang chứa các cá thể gây bệnh gọi là động bào tử (zoospores). Các động bào tử chỉ phóng thích ra ngoài bào tử nang để đi gây bệnh khi đất bị úng nƣớc hoàn toàn. Khi ra ngoài các động bào tử dùng roi (flagella) bơi tới các rễ cây để gây bệnh hay bơi theo dòng nƣớc mƣa để tới các nơi khác trong vƣờn, làm bệnh lây lan rất nhanh. Vƣờn bị ngập úng nƣớc càng lâu thì áp lực bệnh càng lớn. Ngoài ra tuyến trùng cũng tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển, tuyến trùng xâm nhập vào rễ tạo vết thƣơng hở cho nấm xâm nhập vào gây bệnh (Trần Văn Hòa, 2001). 2.3. Giới thiệu về tia gamma và những ứng dụng trong thực vật 2.3.1. Khái niệm bức xạ Bức xạ là sự phát năng lƣợng vào môi trƣờng dƣới dạng tia (tia bức xạ). Bất kỳ bức xạ nào có khả năng ion hóa các nguyên tử hay phân tử mà nó gặp trên đƣờng đi đều coi là tia ion hóa. Tia ion hóa đƣợc chia làm 2 loại: Sóng điện từ: tia Roentgen (tia X), tia Gamma (tia γ). Các hạt cơ bản: α, β, Proton, Neutron. (Cục kiểm soát và An toàn Bức xạ, 2005). 14 2.3.2. Bức xạ Gamma Bức xạ gamma là bức xạ điện từ. Nó đi đƣợc khoảng cách lớn trong không khí và có độ xuyên mạnh. Khi đi vào cơ thể, chúng sẽ tƣơng tác với các chất có trong cơ thể và tạo ra các điện tử thứ cấp. Các điện tử thứ cấp này là các hạt mang điện nên sẽ gây ra hiện tƣợng ion hoá dẫn đến việc phá hủy các tế bào sống trong cơ thể. Xác suất tạo ra các điện tử thứ cấp tỉ lệ với năng lƣợng của bức xạ gamma theo hàm mũ. 2.3.3. Chất phóng xạ Coban (cobalt) Coban (Co 60) có nhiều ứng dụng trong công nghiệp và y học. Đây là kim loại phóng xạ dùng trong xạ trị. Kim loại này có đặc tính tạo ra bụi mịn. Nguồn Co60 hữu dụng trong vòng khoảng 5 năm, nhƣng ngay cả sau thời điểm này, mức độ phóng xạ vẫn rất cao. Nhiều sinh vật sống (kể cả ngƣời) phải cần đến một lƣợng nhỏ coban trong cơ thể để tồn tại. Coban là một thành phần trung tâm của vitamin cobalamin, hoặc vitamin B12. Tên gọi Coban (cobalt) có xuất xứ từ tiếng Đức kobalt hoặc kobold, nghĩa là linh hồn của quỷ dữ. Tên này do những ngƣời thợ mỏ đặt ra vì nó mang tính độc hại, gây ô nhiễm môi trƣờng. 2.3.4. Cơ chế tác động của bức xạ ion trên cơ thể sống Bức xạ là một trong những tác nhân gây ra sự tổn thƣơng bức xạ ở mức phân tử, tế bào và hệ thống cơ quan của cơ thể sinh vật. Các nguyên tử bị ion hóa sẽ làm cho các phân tử cấu tạo nên cơ thể sinh vật có những biến đổi về hóa học. Khi bị tác động thì gene bị biến đổi. Tùy theo mức độ tác động của bức xạ mà gene bị thay đổi ở những mức độ khác nhau. Sau khi nhận năng lƣợng của bức xạ ion hóa thì các tổ chức tế bào của cơ thể sinh vật sẽ chịu những biến đổi qua hai giai đoạn:  Giai đoạn hóa lý Giai đoạn này rất ngắn (10-13 - 10-16 giây), trong giai đoạn này các phân tử sinh học chịu tác dụng gián tiếp và trực tiếp của bức xạ ion hóa. 15 Tác dụng trực tiếp: bức xạ trực tiếp gây ion hóa và kích thích các phân tử trong tế bào làm tổn thƣơng các phân tử đó, đứt gãy liên kết trong các gene, các nhiễm sắc thể, làm sai lệch cấu trúc và tổn thƣơng đến chức năng của tế bào. Tác dụng gián tiếp: khi phân tử nƣớc trong cơ thể bị ion hóa sẽ tạo ra các gốc tự do, các gốc này có hoạt tính hóa học mạnh sẽ hủy hoại các thành phần hữu cơ nhƣ các enzyme, protein, lipit trong tế bào và phân tử DNA, làm tê liệt các chức năng của các tế bào lành khác. Khi số tế bào bị hại, bị chết vƣợt quá khả năng phục hồi của mô hay cơ quan thì chức năng của mô hay cơ quan sẽ bị rối loạn hoặc tê liệt, gây ảnh hƣởng đến cơ thể sinh vật. Trong giai đoạn hóa lý một số phân tử sinh học quan trọng nhƣ enzyme, nucleoprotein đã bị tổn thƣơng, ngƣời ta gọi đó là những tổn thƣơng hóa sinh  Giai đoạn sinh học Nếu những tổn thƣơng hóa sinh không phục hồi đƣợc, những tổn thƣơng chuyển hóa dẫn đến những tổn thƣơng hình thái và chức năng. Đó là giai đoạn sinh học của tác dụng bức xạ ion hóa. Giai đoạn sinh học có thể kéo dài từ vài ngày đến hàng chục năm sau khi chiếu xạ. 2.3.5. Cơ chế gây đột biến của bức xạ ion hóa Theo các kết quả nghiên cứu của Rapport (1961), Feitz (1964) và Heis (1965) thì khi tia phóng xạ vào cơ thể sinh vật sẽ tác động vào nhân tố di truyền trong tế bào theo các dạng sau: Tác động lên nhiễm sắc thể, gây ra hiện tƣợng đột biến nhiễm sắc thể. Tác động lên các nguyên tử của phân tử DNA, làm biến đổi cấu tạo gene, khi gene tự tái sinh tạo nên gene đột biến và hình thành nên những tính trạng mới. Sự tác động của tia phóng xạ lên nhân tố di truyền theo các cơ chế sau: Tác động lên phân tử DNA nghỉ, ngoài thời kì nhân đôi: Làm biến tính base trên DNA nhƣng không phá hủy DNA. Làm tách base khỏi khung ribose phosphate của DNA gây đứt chuỗi polynucleotide. Tạo các cầu nối đồng hóa trị giữa các base tƣơng xứng từ hai mạch của DNA, làm đứt đoạn DNA và gây ngắn chuỗi DNA. 16 Tác động lên phân tử DNA đang trong thời kì nhân đôi: Tạo các chất tƣơng tự base của DNA. Tạo các chất gây ngừng nhân đôi DNA hoặc gây loại trừ các base. Gây sự giao động tại chỗ do chuyển động nhiệt của các nguyên tử trong các base của DNA, gây rối loạn các phản ứng sinh lý, sinh hóa. Tác động lên hệ thống tổng hợp và sửa chữa DNA: Làm rối loạn chuỗi phản ứng sinh tổng hợp các base DNA, enzyme và làm biến đổi enzyme DNA polymerase. Ảnh hƣởng phối hợp. Tác nhân gây ảnh hƣởng lên hệ thống sửa chữa DNA, làm tăng dần số đột biến tự nhiên. Bức xạ ion hóa gây tác động tổng hợp tạo các mảnh đứt DNA hoặc tạo sự khâu mạch giữa hai chuỗi polynucleotide gần nhau và đối với vài trƣờng hợp có thể gây sắp xếp lại trật tự trên nhiễm sắc thể. 2.3.6. Những thành tựu nghiên cứu về đột biến phóng xạ 2.3.6.1. Ngoài nƣớc Phƣơng pháp gây đột biến gene bằng tia phóng xạ đã đƣợc nghiên cứu từ lâu. Năm 1925, Muller đã tiến hành thành công những công trình nghiên cứu thực nghiệm bằng tia X trên thực vật và trên vi khuẩn và đã tìm ra đƣợc những sinh vật biến dị nổi bật. Vì vậy năm 1925 đƣợc xem là năm ra đời ngành di truyền học phóng xạ. Ở Mỹ, Humphrey (1951), Rauling (1958), William (1960) và ở Đức, Jashchariss (1956) sau khi nghiên cứu xử lý tia phóng xạ trên cây trồng đều đi đến kết luận: "Tia phóng xạ đã làm thay đổi các đặc điểm sinh trƣởng, phát dục, hình thái tế bào, vật chất di truyền, đồng thời làm xuất hiện những biến dị có hại, có lợi hoặc trung tính trên nhiều loại cây trồng". Đa số các thí nghiệm đã chọn và thu các biến dị có lợi nhƣ: rút ngắn thời gian sinh trƣởng, tăng năng suất, tăng tính kháng sâu bệnh, ít đổ ngã, thấp cây, phân cành nhiều, tăng số lƣợng hoa, đổi màu hoa, tăng trọng lƣợng hoa. Năm 1964, tổ chức phối hợp FAO/IAEA (Cơ quan lƣơng nông liên hiệp quốc/ Cơ quan nguyên tử năng quốc tế) đƣợc thành lập và tổ chức này đã công bố 1.019 giống đột biến ở những cây có hạt đƣợc đƣa vào sản xuất và 523 giống đột 17 biến ở những cây sinh sản vô tính và các cây làm cảnh khác nhau. Nhiều loại cây trồng quan trọng có số đột biến lớn nhƣ: Đại mạch, Lúa, Lúa mì mềm, Đậu phộng, Đậu nành, Lúa mì cứng, Đậu Hà Lan, Bông vải, Kiều mạch và rất nhiều giống hoa khác nhau. Năm 2002, nhóm khoa học của Jammala Machaiah và Mrinal Pednekar, tại Trung tâm Nguyên tử Bhabha (Ấn Độ), đã dùng tia gamma yếu khử gần hết các thành tố axit oligosacharide dƣới vỏ đậu Hà Lan và còn rất nhiều nghiên cứu trên thế giới về ảnh hƣởng của tia gamma trên thực vật. 2.3.6.2. Trong nƣớc Tại Việt Nam từ năm 1965 – 1970 các nghiên cứu chọn giống đột biến cây trồng đƣợc bắt đầu thực hiện ở Đại học Tổng Hợp Hà Nội. Sau đó, các cơ sở nghiên cứu khác nhƣ: Viện khoa học Việt Nam, Viện khoa học nông nghiệp, Viện di truyền học, Viện cây lƣơng thực và thực phẩm, các trƣờng Đại học nông nghiệp tiến hành thí nghiệm với tia gamma trên những đối tƣợng cây trồng khác nhau. Năm 1968, Đại học nông nghiệp I (Hà Nội) đã xử lý phóng xạ Co60 trên đậu nành, thu đƣợc một số dòng có triển vọng nhƣ: M103, A75, A9 có năng suất cao. Năm 1977, Đại học nông nghiệp IV xử lý tia γ (Co60) trên giống đậu nành Santamaria tạo đƣợc hai giống: A1, A5 có năng suất cao, rút ngắn thời gian sinh trƣởng. Gần đây, Việt Nam có nhiều nghiên cứu đáng chú ý về ảnh hƣởng của tia gamma lên cây trồng nhƣ các nghiên cứu: Nguyễn Văn Vinh, 2002. Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến hom mía (Viện Khoa Học Kỹ Thuật Hạt Nhân). Hoàng Hƣng Tiến, 2003. Nghiên cứu phóng xạ kích thích hạt giống sắn mì (Trung Tâm Kỹ Thuật Hạt Nhân). Nguyễn Tiến Thịnh, 2004. Nghiên cứu chiếu xạ gamma liều thấp lên mẫu khoai tây giống (Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt). Ở Viện Khoa Học Miền Nam, 2004. Nghiên cứu gây đột biến giống Lan bằng tia gamma. 18 Nguyễn Thị Lang và Lê Xuân Thám, 2004. Nghiên cứu chiếu xạ gây đột biến giống lúa khô. Một số nghiên cứu về chiếu xạ kích thích hạt giống hoa Kiết Tƣờng; ảnh hƣởng tia phóng xạ γ trên hoa Lily. Trần Thanh Hân, 2005. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo cây khoai tây và ảnh hưởng kích thích sinh trưởng của bức xạ gamma liều thấp. Lê Văn Hòa , 2006. Nghiên cứu : "Xác điṇh khả năng gây đôṭ biến giống hoa lan cắt cành (Dendrobium sp.) bằng colchicine và tia gamma" (Khoa Nông nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng). Hiện nay, các đề tài khoa học nghiên cứu về ảnh hƣởng của tia gamma đến kiểu hình, khả năng kích thích sinh trƣởng trên đậu nành, lúa, bắp và những cây trồng khác đang tiếp tục đƣợc nghiên cứu. Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm áp dụng phƣơng pháp chiếu xạ tạo đột biến đa dạng trên hệ nuôi cấy in vitro nhiều cây trồng nhƣ khoai lang, khoai tây, dâu tằm, chuối, hoa cẩm chƣớng, hoa hồng, địa lan, cúc. Tuy nhiên kết quả thu đƣợc còn hạn chế (tài liệu của Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt năm 2002 – 2006). 2.4. Nhân giống vô tính bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Khái niệm Phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật không bị nhiễm vi sinh vật, đƣợc đặt trong môi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh đƣợc phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 2.4.2 Ứng dụng Kỹ thuật này thể hiện một số ƣu điểm đã đƣợc ứng dụng: Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh, tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh, cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến, sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn, lai xa qua nuôi cấy phôi và noãn, lai tế bào soma và tạo dòng protoplast, cải biến tính thực vật qua hấp thụ DNA ngoại lai, cố định nitrogen, cải thiện hiệu quả quang tổng hợpvà bảo quản nguồn gen quý. 19 Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật đƣợc ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Các vấn đề cơ bản về đời sống của mô và tế bào đơn trong môi trƣờng nhân tạo, nhu cầu về khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trƣởng, nguồn carbon của chúng, các kỹ thuật cơ bản để tách, nuôi cấy, điều khiển sự phân hóa từ các bộ phận khác nhau của cây trồng ngày càng đƣợc hiểu sâu sắc hơn. 2.4.3. Phƣơng pháp nhân phôi vô tính 2.4.3.1. Khái niệm Sự sinh phôi từ tế bào soma là một quá trình, qua đó một hay vài tế bào soma, trong các điều kiện thực nghiệm (bao gồm việc sử dụng các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật), có thể dấn thân vào một sự phân chia theo một trật tự nhất định để cho một phôi, theo kiểu giống hay gần giống nhƣ kiểu sinh phôi từ hợp tử (Bùi Trang Việt, 1994). 2.4.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy mô phôi vô tính Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lƣợng lớn thực vật bằng bioreactor. Tạo hạt nhân tạo, là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật và mở ra nhiều triển vọng mới trong công nghệ nuôi cấy tế bào. 2.4.3.3. Sự hình thành phôi vô tính Sự tạo phôi soma đƣợc thực hiện lần đầu tiên vào năm 1958 bởi Steward và Reinert. Tuy nhiên khoảng 20 năm sau mới có những nghiên cứu để có thể làm rõ cơ chế của sự sinh phôi vì sự phát sinh phôi soma chỉ xảy ra invitro với tần suất thấp và không đồng nhất trong những hệ thống nuôi cấy. Để có thể nghiên cứu sự phát sinh phôi soma ở mức độ phân tử cần phải thiết lập một hệ thống nuôi cấy đồng nhất và có hiệu suất cao. Sự hình thành phôi vô tính là quá trình tạo ra tế bào có khả năng sinh phôi giúp cho việc nhân dòng thực vật một cách nhanh chóng. Trong quá trình này, một tế bào đơn có thể đƣợc cảm ứng trở thành một phôi và từ đó phát triển thành cây nguyên vẹn (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). 20 Tế bào có khả năng sinh phôi là những tế bào đẳng kín, nhân to, tế bào chất đậm đặc và nhiều hạt tinh bột. Những tế bào này có hàm lƣợng protein và RNA cao (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Sự hình thành phôi vô tính trải qua hai giai đọan: Sự hình thành phôi vô tính có thể qua 2 con đƣờng là trực tiếp và gián tiếp: Phôi vô tính trực tiếp: đƣợc hình thành từ một tế bào hay một nhóm tế bào mà không thông qua sự hình thành callus. Phôi vô tính gián tiếp: đƣợc hình thành chủ yếu từ callus. Có 2 bƣớc dẫn đến sự hình thành phôi: Sự biệt hóa của tế bào có khả năng phát sinh phôi và sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình trái tim và phôi hình cá đuối. 2.4.3.4. Các kiểu phát sinh phôi soma Sự phát sinh phôi soma bất định Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của một số loài thực vật nhiệt đới. Các phôi bất định có thể đƣợc tạo trực tiếp từ tế bào đơn trên bề mặt của phôi non hoặc gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trong chƣơng trình di truyền cải tạo giống, chẳng hạn nhƣ: cứu các phôi bị chết non do lai tạo. Sự phát sinh đa phôi vô tính Hiện tƣợng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối mô có khả năng tạo phôi cao, khi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng mới sẽ phát triển và tăng trƣởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể đƣợc phân biệt với mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi nhuộm bằng acetocarmine. Dƣới ánh đèn tử ngoại các tế bào phôi có thể phát huỳnh quang màu xanh lá cây. Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng Hiện tƣợng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Ngƣời ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều lọai thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan sát khả năng tạo thành mô sẹo. 21 2.5. Vai trò của chất điều hòa sinh trƣởng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.5.1. Chất điều hoà sinh trƣởng Chất điều hòa sinh trƣởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trƣởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dƣỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật. Về đại cƣơng các chất điều hòa sinh trƣởng đƣợc chia làm hai nhóm: các chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng. Trong nuôi cấy in vitro thì sự cân bằng giữa các chất điều hòa sinh trƣởng với nhau là điều cần thiết. 2.5.2. Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng trong nuôi cấy mô Hiện nay 3 nhóm chất điều hòa sinh trƣởng thƣờng đƣợc dùng: auxin, cytokinin và gibberellin. Auxin Auxin tự nhiên là một nhóm các chất đƣợc tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, đƣợc vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào. Auxin bị phân hủy bởi ánh sáng, có tính phân cực. Ví dụ nhƣ: IAA (indolacetic acid), IBA (indolbultyric acid), NAA (napthtalene acetic acid), 2,4D (dichlophenoxy acetic acid) (Vũ Văn Vụ, 2000). Chức năng của auxin: Kích thích sự giãn nở của tế bào, làm tế bào phình to ra, làm tăng kích thƣớc của các cơ quan, ảnh hƣởng đến sự phân chia tế bào, kích thích sự tổng hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào nhƣ cellolose, pectin. Điều chỉnh tính hƣớng động của cây: quang hƣớng động và địa hƣớng động. Gây ra hiện tƣợng ƣu thế ngọn đƣợc giải thích bằng việc ức chế sinh trƣởng của chồi bên khi auxin đƣợc vận chuyển từ ngọn xuống dƣới. Kích thích sự hình thành rễ. Kích thích sự hình thành quả, sự lớn của quả, tạo nên quả đơn tính không hạt và kiềm hãm sự rụng lá, hoa, quả. Tạo phôi trong nuôi cấy huyền phù. 22 Các phản ứng auxin và sự tăng trƣởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, RNA và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trƣng quan trọng của auxin là tác động chủ yếu lên vách tế bào (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giãn nở tế bào (Roger Prat, 1993). Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, cenllulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981; Vũ Văn Vụ, 2003; Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Cytokinin Cytokinin hình thành chủ yếu trong hệ thống rễ thực vật. Ngoài ra, một số cơ quan còn non đang sinh trƣởng mạnh cũng có khả năng tổng hợp cytokinin nhƣ chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh. Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ, 2003). Cytokinin đƣợc sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Những cytokinin thƣờng gặp nhất là: Kinetin (6 Furfuril aminopurin), BA (6-Benzyl aminopurin), TDZ (thidiazuron). Đặc điểm của cytokinin: Cytokinin đƣợc vận chuyển trong cây không phân cực nhƣ auxin, có thể hƣớng ngọn và hƣớng gốc. Cytokinin trong cây có thể ở dạng liên kết và dạng tự do cũng nhƣ các phytohormone khác. Ở trong cây chúng bị phân giải bằng các enzyme, tạo nên sản phẩm cuối cùng là urê. Các cytokinin thƣờng dùng trong nuôi cấy mô: kinetin, BA, và PBA. Chức năng của cytokinin: Vai trò sinh lý đặc trƣng của cytokinin đối với thực vật là kích thích sự phân chia mạnh mẽ của tế bào. Ảnh hƣởng lên sự hình thành và phân hóa cơ quan đặc biệt là phân hóa chồi. Kìm hãm quá trình hóa già của các cơ quan và của toàn cây, kìm hãm sự phân hủy của diệp lục, protein và acid nucleic. 23 Phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, làm tăng sự nở hoa. Điều chỉnh hiện tƣợng ƣu thế ngọn. Ảnh hƣởng đến sự hoạt động sinh lý của cây do nó có ảnh hƣởng đến các quá trình trao đổi chất. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trƣởng trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bƣớu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). Trong những nghiên cứu gần đây về tạo phôi vô tính thực vật ngƣời ta thấy rằng việc kết hợp nồng độ auxin và cytokinin ở những nồng độ và tỷ lệ thích hợp sẽ có khả năng khích thích tạo thành phôi vô tính. Hiện nay nhiều nghiên cứu sử dụng TDZ (chất điều hoà tăng trƣởng thuộc nhóm cytokinin) có hoạt tính mạnh nhằm mục đích cảm ứng tạo phôi vô tính (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001). Gibberellin Gibberellin là nhóm phytohoocmon thứ 2 đƣợc phát hiện sau auxin, từ việc nghiên cứu bệnh lý “bệnh lúa von”. Năm 1926, Kurosawa (Nhật bản) đã thành công trong thí nghiệm gây bệnh von nhân tạo cho cây lúa và ngô. Yabuta (1934-1938) tách đƣợc 2 chất dƣới dạng tinh thể từ nấm lúa von gọi là gibberellin A và B, nhƣng chƣa xác định đƣợc bản chất hoá học của chúng. Năm 1955, hai nhóm nghiên cứu Anh và Mỹ phát hiện ra axit gibbellic ở cây lúa von và xác định công thức hoá học của nó (C19H22O6). Năm 1956, West, Phiney, Radley tách đƣợc gibberellin từ thực vât bậc cao và phát hiện trên 50 gibberellin và kí hiệu A1, A2, … A52 hoặc GA1, GA2, …GA52, trong đó A3 có hoạt tính mạnh nhất. Các gibberellin khác nhau chủ yếu ở vị trí nhóm –OH trong phân tử. GA đƣợc tổng hợp ở trong phôi đang sinh trƣởng, trong các cơ quan đang sinh trƣởng khác nhau nhƣ lá non, rễ non, quả non. Vai trò sinh lý: Kích thích mạnh mẽ sự sinh trƣởng kéo dài của thân, sự vƣơn dài của lóng cây họ lúa, ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng các đột biến lùn. Sử dụng GA ngoại sinh để cây phát triển bình thƣờng. Kích thích sự nẩy mầm của hạt và củ. Kích thích sự ra hoa, ảnh hƣởng đặc trƣng lên sự ra hoa là sự sinh trƣởng kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Ảnh hƣởng sự phân hoá giới tính: ức chế sự phát triển hoa cái và kích thích sự phát triển hoa đực. Làm tăng kích thƣớc của quả, tạo quả không hạt. 24 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu giống Vĩnh Linh in vitro có sẵn trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học - Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc tiến hành tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Khoa Nông Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt trong thời gian từ tháng 3 năm 2007 đến tháng 8 năm 2007. 3.3. Vật liệu nghiên cứu 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 3.3.1.1. Phòng chuẩn bị môi trƣờng Nồi hấp: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy, tủ lạnh bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ, bể rửa chai, ống nghiệm, bếp điện, cân phân tích, máy khuấy từ, máy đo pH và bình 250 ml. 3.3.1.2. Phòng cấy Tủ cấy vô trùng, đèn cực tím, giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy, các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng. 3.3.1.3. Phòng cấy nấm Tủ cấy nấm, đèn cực tím và các dụng cụ cấy gồm: dao, que cấy, đèn cồn, bình phun, giấy thấm. 3.3.1.4. Phòng tăng trƣởng Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy (0,6 x 2 m), trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2 m. 25 Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 20 C, nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây, ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây. 3.3.2. Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy Mẫu cấy: Mô sẹo và chồi của cây tiêu Vĩnh Linh Điều kiện nuôi cấy: cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ 26 2oC và ẩm độ 60 – 80%. Thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày. 3.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm là: MS (Murashige và Skoog, 1962), gồm các thành phần sau: Nguyên tố đa lượng NH4NO3 1650 mg/l KNO3 1900 mg/l MgSO4.7H2O 370 mg/l KH2PO4 170 mg/l CaCl2.2H2O 440 mg/l Vitamins Inositol 100 mg/l Nicotinic 0,5 mg/l Pyridoxin HCl 0,5 mg/l Thiamin HCl 0,1 mg/l Glyxin 2 mg/l Nguyên tố vi lượng H3BO3 6,2 mg/l MnSO4.4H2O 22,5 mg/l ZnSO4.7H2O 8,6 mg/l KI0,83 mg/l Na2MoO4.2H2O 0,25 mg/l CuSO4.5H2O 0,025 mg/l CoCl2.6H2O 0,025 mg/l Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 mg/l Na2 EDTA.2H2O 37,3 mg/l Các chất khác: Đƣờng sucrose: 30 g/l, agar: 8,5 g/l và pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8 Các chất điều hòa sinh trưởng: BA (N6-benzyladenine), IBA (Indole-3- butyric acid), TDZ (Thidiazuron), 2,4D (Dichlophenoxy acetic acid). 3.3.4. Các công thức xử lý chiếu xạ Đồng vị phóng xạ nhân tạo Co60 đƣợc sử dụng là nguồn phát xạ gamma tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt. 27 Tia γ có bản chất sóng điện từ, có bƣớc sóng ngắn nên không bị lệch hƣớng khi đi qua điện từ trƣờng và có khả năng đâm xuyên rất lớn. Trong xử lý phóng xạ ngƣời ta dùng hai đơn vị để đo lƣờng phóng xạ: Rad: để đo năng lƣợng hấp thụ. Rad là liều lƣợng bức xạ bất kỳ loại nào tạo ra trong môi trƣờng vật chất mà tia phóng xạ đó truyền qua. Roentgen (Г): đơn vị dùng để đo năng lƣợng phát xạ của tia ion có bản chất là sóng điện từ (tia X và tia γ) Tại viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt vào thời điểm tiến hành thí nghiệm cuối tháng 06/2007 máy phát xạ tia γ hoạt động với các thông số sau: Suất liều phát xạ tại chỗ: Liều đỉnh : 13,38 rad/giây. Liều trung tâm : 19,22 rad/giây. Liều đáy : 18,78 rad/giây. Liều dịch chuyển Liều đỉnh : 246,27 rad/giây Liều trung tâm : 396,27 rad/giây Liều đáy : 346,27 rad/giây Dung tích buồng chiếu là 4 lít. Chiều cao 24 cm, đƣờng kính 15 cm. Các ứng dụng và tính toán đƣợc dựa trên cơ sở suất liều phát xạ trung tâm và liều dịch chuyển trung tâm, công thức tính thời gian xử lý mẫu nhƣ sau: T = Liều cần chiếu (rad) – Liều dịch chuyển (rad) / Suất liều phát xạ (rad/ giây) T: thời gian mẫu cần đƣợc xử lý (giây) Trong đó:1 Gy = 100 rads. Vậy khi chiếu liều xạ: 200 Gy thì mất 17 phút 150 Gy thì mất 12,67 phút 100 Gy thì mất 8,33 phút 20 Gy thì mất 1,39 phút 40 Gy thì mất 3,12 phút 60 Gy thì mất 4,86 phút 28 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy Pha môi trƣờng MS (Murashige & Skoog) bổ sung nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA, TDZ, 2,4-D khác nhau tùy theo từng nghiệm thức. Môi trƣờng đƣợc cho vào bình nuôi cấy có dung tích là 250 ml, mỗi bình chứa 30 ml môi trƣờng hấp ở 121oC; 1,2 atm trong 25 phút. 3.4.2. Nội dung nghiên cứu 3.4.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu  Phƣơng pháp thí nghiệm Phƣơng pháp tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Tạo mô sẹo từ lá cây tiêu trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Quá trình hình thành mô sẹo sẽ xảy ra trong bóng tối và mô sẹo đƣợc tạo thành từ những vết thƣơng trong quá trình cắt mẫu lá. Sử dụng cây tiêu nuôi cấy in vitro, lấy mẫu lá cắt nhỏ thành những mẫu nhỏ (0,4 cm x 0,4 cm). Đặt vào môi trƣờng sao cho mặt dƣới lá tiếp xúc với môi trƣờng. Mỗi chai cấy 4 - 5 mẫu lá nhỏ. Sau đó, để vào trong bóng tối trong 2 tuần, khi từ những vết cắt bắt đầu xuất hiện sự sùi mô sẹo thì lấy ra để ngoài ánh sáng nhẹ (50 µmol/m2/s) để mô sẹo tiếp tục phát triển. Lấy mô sẹo để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tạo mô sẹo đƣợc tiến hành trong điều kiện: Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng: khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar và 8,5 g/l đƣờng saccharose, 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA. Môi trƣờng đã đƣợc khử trùng ở 1.2 atm, 121oC trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: Tối hoàn toàn trong 2 tuần đầu, 3 tuần sau đó cƣờng độ ánh sáng là 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%.Thời gian theo dõi thí nghiệm: 5 tuần 29 Phƣơng pháp nuôi cấy tạo dịch nấm Phytophthora capsici Giống nấm Phytophthora capsici sử dụng trong thí nghiệm là giống nấm đã đƣợc phân lập tại Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Nấm Phytophthora capsici đƣợc cấy và nuôi trong môi trƣờng CRA (môi trƣờng dinh dƣỡng cho nấm phát triển gồm: Cà rốt, CaCO3 và agar) 48 giờ. Sau đó đƣợc nuôi trong dung dịch nuôi cấy cà rốt 20%, để trong bóng tối từ 48-72 giờ. Rửa sạch và tiếp tục nuôi ngoài sáng trong nƣớc cất trong 2 - 3 ngày. Lọc nấm bằng vải lọc rồi lọc bằng giấy lọc và sau cùng là lọc bằng đầu lọc vô trùng với màng lọc có kích thƣớc 0,45 µm để lấy dịch nuôi cấy nấm tiến hành thí nghiệm. Nấm Phytophthora capsici đƣợc nuôi trong điều kiện: Nấm đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng CRA: môi trƣờng gồm cà rốt, CaCO3 và agar khử trùng ở 1.2 atm, 121 oC trong thời gian 25 phút. Thể tích môi trƣờng trên đĩa petri 10 ml. Nhiệt độ phòng và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 10 ngày. Chủng dịch nấm Phytophthora trong môi trƣờng nuôi cấy tạo mô sẹo Pha môi trƣờng MS lỏng có bổ sung 1 mg/l 2,4D và 3 mg/l BA hấp khử trùng. Lấy dịch nấm đã đƣợc vô trùng bằng đầu lọc vô trùng cho vào môi trƣờng thí nghiệm. Sau đó, cho môi trƣờng lỏng vào chai nuôi cấy 250 ml có sẵn một lớp bông gòn ở trong sao cho môi trƣờng vừa ngập qua miếng bông là đƣợc. Mô sẹo nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung dịch chiết thực hiện trong điều kiện: Cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s, mô sẹo đƣợc cấy trên môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 2,4-D 1 mg/l và BA 3 mg/l với nồng độ dịch nấm là 0, 20, 30 và 40%. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thí nghiệm. Thời gian theo dõi thí nghiệm 3 tuần. Giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem kết quả dƣới kính hiển vi Sau 1, 2 và 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng lắc có dịch nấm, tiến hành cắt lát mỏng mô sẹo, nhuộm mẫu và xem kết quả dƣới kính hiển vi với nhiều vật kính khác nhau. 30 Nhuộm mẫu bằng phẩm nhuộm hai màu là dung dịch gồm hai thứ phẩm nhuộm: Phẩm đỏ Carmin sẽ nhuộm màu hồng nhạt hay tím nhạt nếu màng tế bào bằng chất cellulose pectic. Phẩm xanh lục vert d’iod sẽ nhuộm màu xanh lục nếu màng tế bào bằng chất gỗ (ligin) hay bần (suberin). Quy trình nhuộm: Cắt lát mỏng mô sẹo. Ngâm trong nƣớc Javel trong 15 phút để loại nội dung tế bào. Rửa nƣớc cho sạch Javel. Ngâm mẫu trong acid acetic trong 5 phút để loại Javel còn lại. Rửa nƣớc cho sạch acid acetic. Nhuộm bằng phẩm nhuộm hai màu trong 3 phút. Rửa nƣớc cho sạch phẩm thừa.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên , 3 lần lặp lại. Thí nghiệm thực hiện với môi trƣờng nuôi cấy là môi trƣờng MS có bổ sung thêm 1 mg/l 2,4-D, 3 mg/l BA và các nồng độ dịch nấm khác nhau. Tổng số bình: 36. Tổng số mẫu cấy: 144. Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm chủng dịch nấm Phytophthora capsici trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo cây tiêu STT Tên nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 P0 0 3 4 2 P1 20 3 4 3 P2 30 3 4 4 P3 40 3 4  Chỉ tiêu theo dõi Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu tạo sẹo Trạng thái mô sẹo Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau. Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần. 31 3.4.2.2. Khảo sát ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu  Phƣơng pháp thí nghiệm Sử dụng mô sẹo đã tạo ra ở thí nghiệm 1 để tiến hành thí nghiệm. Pha môi trƣờng nghiệm thức là môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng với nồng độ khác nhau. Các chất kích thích đƣợc dùng trong thí nghiệm này gồm: BA, IBA và TDZ. Lấy mô sẹo cấy vào môi trƣờng đã chuẩn bị sẵn. Các thao tác chuẩn bị này đƣợc tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vô trùng. Mẫu đƣợc nuôi trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng. pH môi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2/s. Nhiệt độ: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian theo dõi thí nghiệm: 4 tuần. Sau 2, 3 và 4 tuần nuôi cấy thì giải phẫu, nhuộm mẫu mô sẹo tiêu và xem trên kính hiển vi nhƣ ở thí nghiệm 1.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Số bình của mỗi nghiệm thức: 3. Số mẫu trong 1 bình: 4. Tổng số bình: 63. Tổng số mẫu cấy: 252 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm của các môi trƣờng có chất kích thích sinh trƣởng trong nuôi cấy mô sẹo tiêu Nghiệm thức Môi trƣờng cơ bản Chất kích thích sinh trƣởng (mg/l) BA IBA TDZ K0 MS 3 0 0 K1 MS 10 1 0 K2 MS 20 1 0 K3 MS 1 10 0 K4 MS 1 20 0 K5 MS 0 1 1 K6 MS 0 1 2 32 3.4.2.3. Khảo sát ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô tiêu  Phƣơng pháp thí nghiệm Mô sẹo và chồi của tiêu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Mô sẹo đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l 2,4-D và 3 mg/l BA. Còn chồi đƣợc đặt trong môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA. Sau 3 tuần nuôi cấy, tiến hành chiếu xạ với liều xạ 20, 40 và 60 Gy tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lat. Sau 2, 3 và 4 tuần chiếu xạ thì tiến hành giải phẫu, nhuộm và xem mẫu trên kính hiển vi. Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose, 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D với sự thay đổi về liều xạ gamma, môi trƣờng đƣợc khử trùng ở 1,2 atm, 1210C trong 25 phút. Tƣơng tự, chồi tiêu cũng đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS có bổ sung 8,5 g/l agar, 30 g/l đƣờng saccharose và BA 3 mg/l. pH môi trƣờng: 5,8. Thể tích môi trƣờng: 30 ml /bình 250 ml. Cƣờng độ ánh sáng: 50 µmol/m2/s. Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày. Nhiệt độ nuôi: 25 ± 20 C và ẩm độ: 65 ± 5%. Thời gian thí nghiệm là 60 ngày.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm này đƣợc chia làm hai thí nghiệm gồm: Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên mô sẹo tiêu Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64. Tổng số mẫu cấy: 256. Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến mô sẹo tiêu STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 S0 0 4 4 2 S1 20 4 4 3 S2 40 4 4 4 S3 60 4 4 33 Thí nghiệm chiếu xạ gamma trên chồi tiêu Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Tổng số bình: 64 Tổng số mẫu cấy: 256 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm của liều xạ tia gamma ảnh hƣởng đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến chồi tiêu STT Tên nghiệm thức Liều xạ gamma (Gy) Số bình/nghiệm thức Số mẫu/bình 1 C0 0 4 4 2 C1 20 4 4 3 C2 40 4 4 4 C3 60 4 4  Chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 và 3 Tỉ lệ mẫu sống ở mỗi nghiệm thức Tỉ lệ mẫu xuất hiện chồi Trạng thái mô sẹo Xem và so sánh sự khác biệt (hình dạng, kích thƣớc) giữa các mô giải phẫu của các mẫu ở mỗi nghiệm thức khác nhau. Các chỉ tiêu trên đƣợc ghi nhận 7 ngày một lần 3.5. Phân tích thống kê Xử lý số liệu thống kê bằng cách phân tích ANOVA sử dụng phần mềm Statgraphics 7.0 34 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Ảnh hƣởng của dịch chiết nấm Phytophthora capsici đến sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu 4.1.1. Tạo mô sẹo từ mẫu lá cây tiêu in vitro Sau 2 tuần nuôi cấy trong bóng tối tại những vết cắt (ở mép lá) bắt đầu xuất hiện những vết sần là dấu hiệu mô sẹo bắt đầu hình thành. Sau 3 tuần tiếp tục phát triển ở điều kiện chiếu sáng (cƣờng độ ánh sáng 50 µmol/m2/s), mô sẹo đã phát triển ở toàn bộ mẫu lá. 4.1.2. Nuôi cấy mô sẹo tiêu trong môi trƣờng có bổ sung dịch chiết nấm Phytophthora capsici Sử dụng mô sẹo cấy vào môi trƣờng lỏng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch nấm với các nồng độ là 0, 20, 30 và 40%. B A Hình 4.1 Mô sẹo hình thành từ lá cây tiêu in vitro trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. A: Mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy trong điều kiện tối; B: Mô sẹo tiếp tục đƣợc nuôi cấy ở cƣờng độ ánh sáng nhẹ 50 µmol/m2/s 35 Tỉ lệ sống Sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm lỏng lắc, chúng tôi nhận thấy mô sẹo trong nghiệm thức P0 (đối chứng), P1, P2 và P3 vẫn phát triển bình thƣờng và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng. Tuy nhiên, ở nghiệm thức P0 mô sẹo phát triển hơn hẳn các nghiệm thức còn lại. Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Chúng tôi nhận thấy hầu hết các mô sẹo trong môi trƣờng có dịch nấm đều bị đen và môi trƣờng nuôi cấy cũng có màu đen nhạt. Các mẫu bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng chết đen đặc biệt là những phần mô sẹo thì bị đen nhiều. Ở nghiệm Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 1 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%. P0 P1 P2 P3 36 thức đối chứng mẫu sống sót tốt hơn so với các nghiệm thức khác và không có dấu hiệu bị đen. Điều này cho thấy rằng dịch nấm đã có những ảnh hƣởng nhất định đến khả năng sống sót của mô sẹo. Còn sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm thì các mẫu mô sẹo ở nghiệm thức P2 và P3 đều bị chết hoàn toàn, chỉ có nghiệm thức P1 mẫu vẫn còn sống nhƣng bên ngoài đều bị đen. Từ kết quả bảng 4.1 cho thấy có sự rất khác biệt giữa các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng về phƣơng diện thống kê. Điều này có thể giải thích là nồng độ dịch nấm đã tác động rất lớn đến khả năng sống của mô sẹo và mô sẹo chỉ có thể sống sót ở nồng độ dịch nấm thấp (< 20 %). P0 P1 P2 P3 Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 2 tuần nuôi cấy. P0: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA và 1 mg/l 2,4-D. P1: Mô sẹo trên môi trƣờng MS có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 20%. P2: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 30%. P3: Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung 3 mg/l BA, 1 mg/l 2,4-D và dịch chiết nấm 40%. 37 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici đến tỉ lệ sống của mô sẹo Nghiệm thức Nồng độ dịch nấm (%) Tỉ lệ sống (%) 1 tuần sau cấy 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy P0 0 100 a 100 a 100 a P1 20 100 a 66,7 b 25,0 b P2 30 91,7 b 50,0 c 0,0 c P3 40 91,7 b 33,3 d 0,0 c Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 P1 P0 P2 P3 Hình 4.4 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm sau 3 tuần nuôi cấy. P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. 38 Tỉ lệ tạo sẹo Sau 2 tuần nuôi cấy, ở nghiệm thức P0 và P1 mẫu vẫn tiếp tục tạo sẹo còn lại hai nghiệm thức P2 và P3 thì không tạo sẹo thêm mà mẫu có dấu hiệu đen và chết dần. Mẫu bị đen ở phần tiếp xúc với môi trƣờng và xung quanh mô sẹo nhƣng khi cắt mẫu thì phần bên trong mẫu vẫn còn xanh. Sau 3 tuần quan sát chúng tôi thấy các nghiệm thức có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê. Hiện tƣợng mẫu mô sẹo chết đen rất rõ và mẫu ở các nghiệm thức đều không tạo sẹo trừ nghiệm thức đối chứng. Bảng 4.2 Ảnh hƣởng của dịch nấm Phytophthora capsici lên mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy Nghiệm thức Dịch nấm (%) Tỉ lệ mô bị đen (%) Tỉ lệ tạo sẹo (%) P0 0 0,0 c 66,7 a P1 20 83,3 b 16,7 b P2 30 100 a 0,0 c P3 40 100 a 0,0 c Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Thông thƣờng hiện tƣợng đen của mô sẹo và sự thay đổi màu (bị đen) của môi trƣờng có thể là do hết chất dinh dƣỡng trong môi trƣờng nuôi cấy hay là do nuôi cấy mô sẹo dƣới cƣờng độ ánh sáng cao. Ở đây cả hai nguyên nhân trên đều không phải vì thời gian nuôi cấy chỉ mới 3 tuần (sau khi nuôi cấy khoảng 10 tuần thì dinh dƣỡng trong môi trƣờng mới bắt đầu hết) và điều kiện chiếu sáng khoảng 50 µmol/m2/s (cƣờng độ ánh sáng khá yếu). Mặt khác, ở cùng điều kiện thì ở nghiệm thức không có bổ sung dịch nấm thì hiện tƣợng mô sẹo bị đen và môi trƣờng chuyển màu không xảy ra. Có thể kết luận hiện tƣợng trên là do dịch nấm bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy đã ảnh hƣởng đến quá trình phát triển của mô sẹo. Dịch nuôi cấy nấm Phytophthora capsici chứa các trao đổi chất của nấm Phytophthora capsici, các hợp chất đó bao gồm các độc tố của loại nấm này đối với ký chủ của loại nấm này. Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, các tế 39 bào mô sẹo phân chia liên tục, đặc biệt ở các tế bào còn non hiện tƣợng phân chia tế bào rất mạnh mẽ (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Trong quá trình phân chia tế bào sẽ làm cho cấu trúc tế bào kém ổn định. Rất có thể độc tố nấm có trong dịch nấm đã tác động và làm ảnh hƣởng tới quá trình phân bào của mô sẹo. Có thể các tế bào tiếp xúc với môi trƣờng bị đen (các tế bào chết) là do các tế bào này đã tiếp xúc và chịu ảnh hƣởng trực tiếp từ dịch nấm. Vậy thì có hay không có các phản ứng của tế bào mô sẹo đối với độc tố của nấm Các tế bào mô sẹo sẽ có các phản ứng để chống lại với sự ảnh hƣởng của độc tố nấm. Tế bào sẽ sản sinh ra những chất để chống lại độc tố của nấm. Cơ chế phòng vệ của tế bào mô sẹo có thể là do 2 cơ chế: (1) các chất chống lại tác động của độc tố nấm là do các phản ứng sinh hóa phòng vệ của tế bào để chống chịu lại với các điều kiện bất lợi; (2) các chất chống lại tác động của độc tố nấm đƣợc sinh ra là do sự điều khiển của một gene nào đó. Sự tác động của độc tố nấm lên quá trình phân chia tế bào có thể tạo ra một đột biến giúp tế bào có khả năng chống chịu với độc tố nấm. Giải phẫu mô sẹo Các mẫu mô ở các nghiệm thức đều có hình thái giải phẫu giống nhau, các tế bào có cấu trúc, hình dạng đồng đều, nằm sát nhau không tìm thấy sự khác biệt về tế bào sau 1 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng có dịch nấm và môi trƣờng không có dịch nấm. Hình 4.5 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 1 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10) 40 Sau 2 tuần nuôi cấy, tiến hành cắt mẫu nhuộm phần mô sẹo trên (phần nằm trên môi trƣờng có màu xanh, trắng hay vàng xám) và phần mô sẹo dƣới (phần tiếp xúc với môi trƣờng). Kết quả nhuộm mẫu cho thấy: Phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng của tất cả các nghiệm thức đều cho kết quả nhuộm mẫu giống nhau. Các tế bào xếp sát nhau, hƣớng tâm (hƣớng về phần lõi trong của mẫu mô). Phần mô sẹo nằm dƣới môi trƣờng của nghiệm thức không chủng dịch nấm trong môi trƣờng nuôi cấy có kết quả nhuộm mẫu giống với phần mô sẹo nằm trên môi trƣờng. Kết quả nhuộm mẫu mô sẹo phần dƣới của các nghiệm thức có chủng dịch nấm cho kết quả khác biệt so với kết quả nhuộm mẫu của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Các tế bào phía trong gần lõi sắp xếp thƣa hơn còn tế bào ở mép bìa lại xếp dày đặc có kích thƣớc nhỏ hơn, tế bào không đồng đều và kích thƣớc tế bào cũng lớn hơn so với các tế bào phần trên và phần dƣới mô sẹo của nghiệm thức không chủng dịch nấm. Mặt khác, cũng có sự khác biệt giữa các tế bào trong từng nghiệm thức, ở nghiệm thức nồng độ dịch nấm 20 % các tế bào có kích thƣớc và hình dạng gần với nghiệm thức đối chứng, ở nồng độ dịch nấm 30 % và 40 % tế bào có kích thƣớc khác so với các nghiệm thức dịch nấm 20 % và đối chứng. Sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trƣờng dịch nấm, tiến hành cắt và nhuộm mẫu mô sẹo. Mẫu ở nghiệm thức P2 và P3 đã bị đen và chết hoàn toàn nên không giải phẫu đƣợc bởi mô bị mềm và rã ra. Do đó, chỉ có hình của hai nghiệm thức đối chứng và P1. Hình thái tế bào ở nghiệm thức đối chứng vẫn không có sự thay đổi còn nghiệm thức có dịch chiết nấm 20% cấu trúc tế bào không đồng đều (to, nhỏ, tròn ,méo) và các tế bào rời rạc. 41 P0 Hình 4.7 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng (P0) và môi trƣờng P1 sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. P1 P0 Hình 4.6 Mặt cắt mô sẹo tiêu sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung dịch nấm (độ phóng đại 40  10). P0: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 0%. P1: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 20%. P2: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 30%. P3: Môi trƣờng có bổ sung dịch nấm 40%. P2 P3 P1 42 4.2. Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu Tỉ lệ sống Những mẫu mô sẹo đƣợc sử dụng trong nghiệm thức này là những mô non, khả năng sống rất tốt nhƣng khi cấy vào môi trƣờng nghiệm thức thì có một số mẫu đã bị đen chết còn một số thì tạo ra mô xốp và cũng chết dần. Bảng 4.3 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến tỉ lệ sống của mô sẹo Nghiệm thức Tỉ lệ sống (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 100 a 100 a 100 a K1 97,7 a 91,7 b 75,0 b K2 100 a 91,7 b 66,7 c K3 91,7 a 91,7 b 50,0 d K4 91,7 a 66,7 c 16,7 f K5 100 a 91,7 b 41,7 e K6 100 a 91,7 b 33,3 g Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Kết quả xử lý số liệu cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa về tỉ lệ sống của mô sẹo ở các nghiệm thức chủ yếu là do nồng độ của các chất kích thích sinh trƣởng BA, IBA và TDZ. Sau 2 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức chƣa có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở thời gian nuôi cấy 3 tuần: các nghiệm thức có sự khác biệt về về mặt thống kê. Các mô sẹo đƣợc xử lý chất điều hòa sinh trƣởng BA, IBA và TDZ có sự khác biệt với nghiệm thức đối chứng. Ở thời điểm khảo sát này chúng tôi nhận thấy đã có nhiều mẫu bị đen và chết có nghĩa là các mô đã có phản ứng mạnh với nồng độ chất kích thích sinh trƣởng cao. Ở thời gian 4 tuần nuôi cấy: kết quả cho thấy các mẫu mô sẹo đối chứng cho tỉ lệ sống cao hơn hẳn các mô sẹo trong môi trƣờng nghiệm thức có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng. Nghiệm thức K1 (BA 10mg/l và IBA 1mg/l) 43 cho tỉ lệ sống cao hơn các nghiệm thức K2, K3, K4, K4 và K6. Trong khi đó nghiệm thức K4 (BA 1mg/l và IBA 20mg/l) cho tỉ lệ sống sót của mô sẹo là thấp nhất. Tỉ lệ tạo phôi Mô sẹo ở tất cả các nghiệm thức đều tạo phôi, có sự khác biệt giữa các nghiệm thức và tỉ lệ tạo phôi khác nhau ở từng giai đoạn phát triển. Bảng 4.4 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng tạo phôi của mô sẹo tiêu Nghiệm thức Tỉ lệ tạo phôi (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 41,7 c 58,3 b 66,7 ab K1 58,3 b 75,0 a 75,0 ab K2 97,0 a 75,0 a 66,7 ab K3 33,3 d 41,7 c 50,0 b K4 8,3 f 16,7 f 16,7 a K5 16,7 e 33,3 d 41,7 ab K6 16,7 e 25,0 e 16,7 a Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Nhìn chung tỉ lệ tạo phôi của mô sẹo tiêu khá cao ở cả 3 thời điểm. Có một số nghiệm thức (K2 và K6) tỉ lệ sau phôi giảm sau thời gian nuôi cấy do sau 4 tuần nuôi cấy có một số mô sẹo tạo ra mô xốp, mô mềm và những mô bị chết dần dần. Hai tuần sau cấy: nghiệm thức K2 (MS + BA 20mg/l + IBA 1mg/l) cho tỉ lệ tạo phôi cao nhất còn tỉ lệ tạo phôi thấp nhất là nghiệm thức K4 (BA 1mg/l + IBA 20mg/l). Kết quả sau 3 tuần nuôi cấy: theo bảng số liệu cho thấy hầu hết các nghiệm thức đều tăng tỉ lệ tạo phôi trừ nghiệm thức K2. Ở nghiệm thức K1 (BA 10mg/l + IBA 1mg/l ) cho tỉ lệ phôi cao và tạo phôi nhiều sau 1 tuần quan sát. Tỉ lệ phôi sau 4 tuần nuôi cấy: có 3 nghiệm thức có tỉ lệ tạo phôi tăng (K0, K3 và K5) còn lại các nghiệm thức thì tỉ lệ phôi giữa nguyên (K1 và K4) hoặc giảm xuống (K2 và K6). 44 Tỉ lệ tạo chồi Thông thƣờng tạo chồi auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao và tỉ lệ này thƣờng là cytokinin/auxin = 10/1. Do đó, nghiệm thức K1 (BA 10mgl + IBA 1mg/l) cho hệ số nhân chồi cao hơn hẳn, kế đến là nghiệm thức K2 (BA 20mg/l + IBA 1mg/l). Hầu hết các loại thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại có vai trò ức chế việc tạo chồi (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968) điều này đƣợc thể hiện rõ ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Ảnh hƣởng của chất kích thcíh sinh trƣởng đến khả năng tạo chồi của mô sẹo tiêu Nghiệm thức Tỉ lệ tạo chồi (%) 2 tuần sau cấy 3 tuần sau cấy 4 tuần sau cấy K0 16,7 c 33,3 b 66,7 e K1 16,7 c 50,0 c 50,0 d K2 33,3 e 66,7 d 50,0 d K3 25,0 d 50,0 c 25,0 c K4 0,0 a 8,3 a 0,0 a K5 16,7 c 8,3 a 8,3 b K6 8,3 b 8,3 a 0,0 a Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Từ kết quả xử lý số liệu chúng tôi nhận thấy hầu hết các nghiệm thức đều tạo chồi chỉ trừ nghiệm thức K4. Tỉ lệ tạo chồi từ mô sẹo sau 2 tuần nuôi cấy thấp vì ở giai đọan này chủ yếu là mô tăng sinh mô sẹo nhiều hơn. Sau 3 tuần nuôi cấy: các nghiệm thức có sự khác biệt về mặt thống kê. Tỉ lệ tạo chồi cao ở nghiệm thức K1, K2 và K3 còn lại tất cả các nghiệm thức đều tạo chồi nhƣng hệ số nhân chồi rất thấp. Tỉ lệ chồi sau 4 tuần nuôi cấy: tất cả các nghiệm thức có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng đều cho hệ số nhân chồi thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng 45 (MS + BA 3mg/l) và có hai nghiệm thức (K4 và K6) cho hệ số nhân chồi là 0 vì ở giai đọan này hầu hết các mẫu đều bị đen ngay cả chồi vẫn bị đen và chết. K0 K1 K2 K4 K5 K3 K6 Hình 4.8 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy. K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 46 Trong quá trình sinh trƣởng và phátt triển ở gian đọan thí nghiệm thì mô sẹo đã xuất hiện nhiều hiện tƣợng bất thƣờng nhƣ mô sẹo sau một thời gian nuôi cấy bị xốp, đen và bở. Hơn nữa, sau khoảng 4 tuần nuôi cấy thì nhiều mẫu đã tự tiết ra phenol làm đen cả K6 K4 K0 K5 K3 K2 K1 Hình 4.9 Mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy . K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 47 mẫu lẫn môi trƣờng nuôi cấy và dần dần mẫu đen chết kể cả những mô bị xốp và bở cũng chết. Theo Ceriani và cộng sƣ, 1992 thì nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở nhƣng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. K0 K6 K1 K2 K3 K4 K5 Hình 4.10 Mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy. K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. 48 Giải phẫu mẫu Các mẫu mô sẹo sau khi nuôi cấy trong môi trƣờng nghiệm thức 2, 3 và 4 tuần thì đƣợc giải phẫu, nhuộm và xem trên kính hiển vi để xem cấu trúc tế bào mô tiêu. Sau 2 tuần nuôi cấy thì các tế bào ở các nghiệm thức chƣa có sự khác biệt so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào nằm sát nhau, có hình dạng và kích thích tƣơng đối giống nhau. Hình 4.11 Mô xốp trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy Hình 4.12 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chấtt kích thích sinh trƣởng sau 2 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10) 49 Cắt mẫu sau thời gian 3 tuần nuôi cấy thì chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt về tế bào ở các nghiệm thức so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào có kích thƣớc, hình dạng không đồng đều và xếp thƣa hơn so với tế bào ở nghiệm tức đối chứng. Mẫu sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy có sự khác biệt về tế bào của từng nghiệm thức và khác so với nghiệm thức đối chứng. Các tế bào to hơn hẳn, hình dạng tế bào bị móp méo và xếp lộn xộn ở phần ngoài mô có nhiều tế bào bị biến dạng và ngay cả phần gần lõi cũng có những tế bào tƣơng tự. Đặc biệt là ở nghiệm thức có chất kích thích sinh trƣởng TDZ ở nồng độ 1mg/l kết hợp với IBA nồng độ 1 mg/l và nghiệm thức TDZ ở nồng độ 2 mg/l kết hợp với IBA nồng độ 1 mg/l, chúng tôi nhận thấy cấu trúc tế bào thƣa hơn nhiều và nhiều tế bào đã bị biến đổi hình dạng. A Hình 4.13 Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). A: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng đối chứng sau 3 tuần nuôi cấy; B: Mặt cắt mô sẹo trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 3 tuần nuôi cấy. B 50 K0 Hình 4.14 Mặt cắt mô sẹo tiêu trên môi trƣờng có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sau 4 tuần nuôi cấy (độ phóng đại 40  10). K0: Môi trƣờng gồm MS bổ sung 3 mg/l BA. K1: Môi trƣờng MS bổ sung 10 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K2: Môi trƣờng MS bổ sung 20 mg/l BA và 1 mg/l IBA. K3: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 10 mg/l IBA. K4: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l BA và 20 mg/l IBA. K5: Môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6: Môi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l TDZ và 1 mg/l IBA. K6 K5 K3 K4 K2 K1 51 4.3. Ảnh hƣởng của tia phóng xạ gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo, chồi tiêu 4.3.1. Ảnh hƣởng của tia gamma đến sự sinh trƣởng phát triển và khả năng tạo đột biến của mô sẹo tiêu Tỉ lệ sống Các mô sẹo tiêu đƣợc chiếu xạ từ 20 – 60 Gy. Tia gamma có thể ảnh hƣởng hoặc không ảnh hƣởng đến khả năng sông sót của mô sẹo tùy theo sự tƣơng tác của nó trên mô. Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của liều chiếu xạ tia γ đến khả năng sống sót của mô sẹo tiêu Nghiệm thức Liều xạ (Gy) Tỉ lệ sống sau chiếu xạ (%) 2 tuần 3 tuần 4 tuần S0 0 100 c 100 d 100 d S1 20 81,25 a 81,25 c 75,0 c S2 40 81,25 a 75,0 b 56,25 b S3 60 87,5 b 62,5 a 37,5 a Các số liệu đã được chuyển đổi hàm arcsin (x)1/2 trước khi xử lý thống kê. Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trung bình biểu hiện sự khác biệt ở mức P > 0,05 Từ kết quả bảng 4.6 có thể nhận thấy liều xạ đã tác động đến sự sống của mô sẹo. Ở nghiệm thức đối chứng sau 4 tuần nuôi cấy tỉ lệ sống vẫn đạt 100 % còn các nghiệm thức khác thì có sự khác biệt về tỉ lệ sống. Sau 2 tuần chiếu xạ tỉ lệ sống ở các nghiệm thức không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê nhƣng cả 3 nghiệm thức đều có mẫu bị chết. Ở thời điểm này mẫu vẫn tiếp tục tạo sẹo, hầu nhƣ không có sự thay đổi nhiều về hình thái bên ngoài duy chỉ có một số mẫu bị chết đen. Có lẻ, sau thời gian 2 tuần chiếu xạ thì tỉ lệ tế bào bị biến dạng vẫn còn ít nên mẫu vẫn sống chỉ có một số bị chết có thể là do bị tác động mạnh của phóng xạ. Ở thời điểm sau 3 tuần chiếu xạ: tỉ lệ sống ở 2 nghiệm thức S2 (liều xạ 40 Gy) và S3 (liều xạ 60 Gy) giảm nhiều so với nghiệm thức không chiếu xạ, còn nghiệm 52 thức S1 (liều xạ 20 Gy) tỉ lệ sống không đổi. Các mẫu bị xốp và đen nhiều sau 3 tuần chiếu xạ nhƣng khi cắt bên trong mẫu chúng tôi thấy mô sẹo vẫn còn sự sống (mô vẫn còn màu xanh). Hiện tƣợng này có thể giải thích là do đã có sự tƣơng tác của liều lƣợng phóng xạ với mô tiêu đã ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của mô sẹo. Mô sẹo tiêu sau 4 tuần chiếu xạ: tỉ lệ sống ở giai đoạn này đã có sự khác nhau về mặt thống kê. Nghiệm thức không chiếu xạ thì tỉ lệ sống vẫn đạt 100% còn ở tất cả các nghiệm thức còn lại tỉ lệ sống đều giảm và giảm nhiều nhất là ở nghiệm thức S3 kế đến là nghiệm thức S2. Từ kết quả tr