Khóa luận Khai thác dữ liệu est (expressed sequence tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của ong mật

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002-2006 Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ TRẦN NGỌC VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 iii LỜI CẢM TẠ Cảm ơn công lao nuôi dƣỡng, dạy dỗ của cha mẹ Xin chân thành cảm tạ Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ Sinh Học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. Chân thành cảm ơn TS. Bùi Minh Trí đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. Xin cảm ơn CN. Lƣu Phúc Lợi đã giúp đỡ, hỗ trợ tài liệu chuyên môn. Cảm ơn các anh chị tại phòng Sinh Hóa đã tạo điều kiện tốt cho tôi khi tiến hành thực hiện công việc tại Trung Tâm. Xin cảm ơn bạn bè thân yêu của lớp DH02SH đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tp. Hồ Chí Minh tháng 08 năm 2006 Sinh viên thực hiện Trần Ngọc Việt iv TÓM TẮT TRẦN NGỌC VIỆT, Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “KHAI THÁC DỮ LIỆU EST (Expressed Sequence Tags) NHẰM PHÁT HIỆN MICROSATELLITE PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÂN TÍCH VÀ SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ONG MẬT” Giảng viên hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2006 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Phân tích Thí Nghiệm - trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh Ở Việt Nam, nghề nuôi ong mật đã hình thành rất lâu và hiện nay các sản phẩm của ong mật hầu hết là đƣợc xuất khẩu. Hiệu quả kinh tế mang về từ nghề nuôi là khá cao. Tuy nhiên, việc nuôi ong chỉ tập trung chủ yếu ở một số vùng nhất định nhƣ Tây Nguyên (Đak Lak), miền Đông Nam Bộ, chƣa tận dụng đƣợc hết nguồn tài nguyên có sẵn. Sự hạn chế này là do chƣa xác định đƣợc loài ong cho mật nào phù hợp với từng vùng địa lý cụ thể tại Việt Nam. Chính vì thế chúng tôi tiến hành nghiên cứu về việc thiết lập nên primer chạy phản ứng PCR dựa vào chỉ thị microsatellite của các loài ong cho mật để làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu định danh và xác định đặc điểm di truyền của ong mật phục vụ cho việc mở rộng nghề nuôi ong mật ở các vùng ở Việt Nam. Những kết quả đã đạt đƣợc: ۰ Chúng tôi đã chọn đƣợc một nguồn dữ liệu (EST) tốt cho nghiên cứu ۰ Thiết lập đƣợc phƣơng pháp để tìm kiếm microsatellite từ nguồn EST ۰ Thiết kế đƣợc những cặp primer dựa vào vùng bảo tồn hai bên những loại microsatellite tìm đƣợc Kết luận: Sự thành công của việc thiết kế primer đã làm cơ sở cho những bƣớc nghiên cứu xa hơn về đặc điểm di truyền của các loài ong cho mật. Thành công này mở ra một triển vọng cho việc ứng dụng lĩnh vực Bioinformatic hỗ trợ cho nghiên cứu thực nghiệm, làm giảm đáng kể chi phí và đẩy nhanh tốc độ nghiên cứu thực nghiệm tại Trung Tâm. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ ……………………………………………………………………………..iii Tóm tắt …………………………………...………….………………………………..iv Mục lục …………………………………………………………………………..…….v Danh sách các chữ viết tắt............................................................................................viii Danh sách các bảng .......................................................................................................ix Danh sách các hình .........................................................................................................x 1. MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 1.1. Đặt vấn đề...........................................................................................................1 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu........................................................................2 1.2.1. Mục đích nghiên cứu .................................................................................2 1.2.2. Yêu cầu nghiên cứu ...................................................................................2 1.3. Giới hạn .............................................................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................................3 2.1. Giới thiệu chung về ong mật .............................................................................3 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật........................................................................3 2.1.1.1. Hình thái cơ thể ................................................................................3 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong ......................................................................6 2.1.2. Tổ chức của đàn ong ..................................................................................6 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong .....................................................................7 2.1.4. Các sản phẩm của ong ...............................................................................7 2.1.4.1. Mật ong .............................................................................................7 2.1.4.2. Phấn hoa .................................................................................................7 2.1.4.3. Sữa ong chúa ..........................................................................................7 2.1.4.4. Sáp ong ..................................................................................................8 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) ....................................................8 2.2.1. EST là gì? ..................................................................................................8 2.2.2. Phƣơng pháp tạo EST ................................................................................8 vi 2.3. Microsatellite là gì? .........................................................................................10 2.3.1. Các dạng microsatellite ...........................................................................10 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite .............................................................11 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite ....................................................................12 2.3.4. Marker phân tử (molecular markers) .......................................................13 2.3.5. Vì sao chọn marker microsatellite? .........................................................14 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) .............15 2.4.1. Nguồn gốc của Perl ......................................................................................15 2.4.2. Cấu trúc của Perl ..........................................................................................16 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scala data) ..............................................................16 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển ...............................................................................16 2.4.2.3. Các List, Array và Hash .......................................................................19 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con .........................................19 2.4.2.5. Package và Module ..............................................................................20 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) ....................................................................................21 2.5.1. Khái quát về mồi ..........................................................................................21 2.5.2. Đặc điểm của mồi .........................................................................................21 2.5.2.1. Tính chuyên biệt ...................................................................................21 2.5.2.2. Tính ổn định .........................................................................................22 2.5.2.3. Tính tƣơng thích ...................................................................................23 2.6. Tin sinh học ...........................................................................................................24 2.6.1. Khái niệm tin sinh học ..................................................................................24 2.6.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học ...........................................24 2.6.2.1. Genomics - Hệ gen học ........................................................................24 2.6.2.2. Sinh học tiến hóa ..................................................................................26 2.6.2.3. Phân tích chức năng gen .......................................................................26 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................................29 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu ...................................................29 3.1.1. Thời gian nghiên cứu ...............................................................................29 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu ...............................................................................29 3.2. Vật liệu và công cụ nghiên cứu .......................................................................29 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................29 vii 3.2.2. Công cụ nghiên cứu .................................................................................29 3.3. Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu .................................................................30 3.3.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát ...............................................................30 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .........................................................................31 3.3.2.1. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu .............................................31 3.3.2.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chi tiết ..........................................32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................................42 4.1. Kết quả tìm kiếm và tải trình tự EST về máy tính cá nhân .............................42 4.1.1. Kết quả tìm kiếm EST .............................................................................42 4.1.2. Kết quả tải trình tự EST về máy tính cá nhân .........................................43 4.2. Kết quả tìm và phân loại microsatellite ...........................................................44 4.2.1. Kết quả tìm microsatellite qua xử lý của EST_TRIMMER ....................44 4.2.2 Kết quả xử lý qua MISA ..........................................................................45 4.3. Kết quả thiết kế primer ....................................................................................49 4.3.1. Kết quả thiết kế primer qua 6 Script Perl ................................................49 4.3.2. Kết quả so sánh và chọn lọc primer đƣợc thiết kế ...................................56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................59 5.1. Kết luận ...........................................................................................................59 5.1.1. Sơ đồ phƣơng pháp thực hiện ..................................................................59 5.1.2. Kết quả đạt đƣợc .....................................................................................60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................60 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................61 7. PHỤ LỤC .................................................................................................................64 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ALP Amplified Length Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer –Polymerase Chain Reaction BLAST Basic Local Alignment Search Tools CEB Computional Evolution Biology DAF DNA Amplification Fringerprinting DDBJ DNA Data Bank of Japan EMBL the European Molecular Biology Laborary EST Expressed Sequence Tags NCBI the National Center for Biotechnology Information MPSS Massively Parllel Signatur Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction PDA Primer Design Assitant PERL Practical Extraction and Reporting Language RAPD Radom Aplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SNP Single Nucleotide Polymorphism SSCP Single Strand Conformation Polymorphism SSR Simple Sequence Repeats STS Sequence Tagged Sites ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA ..................................................................13 Bảng 4.1. Kết quả xử lý qua MISA ........................................................................47 Bảng 4.2. Thành phần của các dạng microsatellite .................................................47 Bảng 4.3. Tỷ lệ phần trăm các dạng microsatellite .................................................48 Bảng 4.4. Phần trăm các loại microsatellite chiếm tỷ lệ cao ..................................48 Bảng 4.5. Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR ............................................54 Bảng 4.6. Kết quả primer của dạng trinucleotide SSR ...........................................55 Bảng 4.7. Kết quả primer của dạng tetranucleotide SSR .......................................56 Bảng 4.8. Kết quả primer sau cùng của dạng dinucleotide SSR ............................57 Bảng 4.9. Kết Quả primer sau cùng của dạng tri/tetra-nucleotide SSR ..................57 Bảng 4.10. Trình bày loại SSR và mã số truy cập của EST ...................................58 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật .......................................................................3 Hình 2.2. Thể hiện ba phần chính của ong .....................................................................4 Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong .....................................................................4 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong ...................................................................5 Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong ...................................................................5 Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST ..............................................................................9 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST .................................................................................10 Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân ............................................................11 Hình 2.9. Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã ........................................................12 Hình 3.1. Trình bày qui trình nghiên cứu tổng quát .....................................................30 Hình 3.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chính ..........................................................31 Hình 3.3. Giao diện trên trang NCBI với từ khóa honeybee ........................................32 Hình 3.4. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER ........................................................35 Hình 3.5. Cú pháp thực thi của MISA ..........................................................................36 Hình 3.6. Giao diện của Primer3 ..................................................................................38 Hình 3.7. Giao diện của PrimerQuest ...........................................................................40 Hình 3.8. Giao diện của PDA .......................................................................................40 Hình 3.9. Giao diện của DNAClub ..............................................................................41 Hình 4.1. Kết quả tìm thấy EST trên NCBI .................................................................42 Hình 4.2. Kết quả download với tùy chọn có sẵn của NCBI .......................................43 Hình 4.3. Kết quả thực thi 4 tác vụ của EST_TRIMMER ...........................................45 Hình 4.4. File chứa kết quả trình tự EST đƣợc chọn ....................................................45 Hình 4.5. File định dạng FASTA .................................................................................45 Hình 4.6. Thể hiện kết quả thực thi của MISA ............................................................46 Hình 4.7. Kết quả của file new_ids170404 ..................................................................49 Hình 4.8. Kết quả trình diễn của ssrout170404 ............................................................50 Hình 4.9. Kết quả trình diễn của labdbout170404 ........................................................50 Hình 4.10. Xuất kết quả các thông số thiết lập từ script ..............................................51 Hình 4.11. Trình bày primer đƣợc thiết kế ...................................................................51 xi Hình 4.12. Trình diễn của rescreened170404 ...............................................................52 Hình 4.13. Kết quả màn hình xử lý qua 4_ssr_blast ....................................................52 Hình 4.14. Thể hiện EST và primer sau cùng ..............................................................53 Hình 4.15. Trình bày primer đạt đƣợc sau cùng ...........................................................53 Hình 5.1. Qui trình nghiên cứu thiết kế primer ............................................................59 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Trong thế giới động vật, ong mật là loài thuộc lớp côn trùng. Chúng xuất hiện cách đây 40 triệu năm vào thời kỳ Eocene. Ong mật có ở khắp nơi trên thế giới gồm nhiều loài khác nhau. Mỗi loài có điều kiện môi trƣờng phát triển khác nhau và hiệu quả sản xuất cũng khác nhau. Sản phẩm đƣợc làm ra bởi ong mật nhƣ phấn hoa, mật ong, sáp ong, sữa ong chúa, keo ong, nọc ong là các loại thực phẩm dƣợc liệu độc đáo có giá trị kinh tế cao. Ngoài ra, ong mật còn có tác động hữu ích đến nhiều loài động vật và đặc biệt là tác động rất cần thiết trên thực vật đó là thụ phấn hoa. Sự đa dạng và giá trị di truyền học của ong mật cần phải có phƣơng pháp để định danh chính xác từng loài và dƣới loài (thứ). Điều này rất cần thiết, nó có tác động quyết định đến hiệu quả kinh tế trong nghề nuôi ong nói riêng và ý nghĩa về bảo vệ đa dang sinh học nói chung. Công việc này sẽ phục vụ đắc lực trong việc tuyển chọn đƣợc loài ong phù hợp nhất cho nghề nuôi ong ở từng vùng địa lý riêng (nhƣ nguồn mật hoa, thời tiết…), đảm bảo bảo vệ “thuần khiết” đặc điểm di truyền ban đầu của mỗi loài ong. Hiện nay, marker microsatellite là một chọn lựa tốt trong việc phân tích sự đa dạng di truyền, lập bản đồ di truyền, nhận biết giữa các loài và các cá thể trong một loài. Dựa trên nguồn dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) chúng ta có thể tìm ra đƣơc những vị trí microsatellite có ở trên các EST một cách nhanh chóng nhờ vào lĩnh vực nghiên cứu gọi là tin sinh học (bioinformatics). Việc ứng dụng bioinformatic sẽ làm cho công việc nghiên cứu trở nên dễ dàng và chính xác hơn rất nhiều. Bioinformatic là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê và khoa học máy tính để giải quyết các vấn đề sinh học. Trên cơ sở đó tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khai thác dữ liệu EST (Expressed Sequence Tags) nhằm phát hiện microsatellite phục vụ cho công tác so sánh và phân tích đặc điểm di truyền của ong mật” 2 Đề tài đƣợc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí. Đối tƣợng nghiên cứu là các loài ong cho mật. 1.2. Mục đích và yêu cầu nghiên cứu 1.2.1. Mục đích nghiên cứu - Xây dựng đƣợc phƣơng pháp nhận diện marker microsatellite từ dữ liệu EST có tìm thấy microsatellite của các loài ong cho mật. - Thiết kế đƣợc primer từ hai vùng bảo tồn của microsatellite cho việc chạy phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) khuếch đại trình tự microsatellite đặc trƣng nhất. - So sánh lựa chọn, thiết kế đƣợc các công cụ tin học phù hợp nhất cho công việc nghiên cứu. 1.2.2. Yêu cầu - Tập hợp đƣợc toàn bộ và nhanh nhất dữ liệu EST hiện có của các loài ong mật để cho xác suất tìm thấy microsatellite là lớn nhất. - Phải có phƣơng pháp nhanh nhất trong việc xác định và phân loại microsatellite có trong các EST. - Xây dựng đƣợc một qui trình trong nghiên cứu về thiết kế mồi (primer) để thực hiện phản ứng PCR khuyếch đại microsatellite đặc trƣng có trong EST. - Mồi đƣợc thiết kế phải đảm bảo nghiêm ngặt về tiêu chuẩn các thông số kỹ thuật và tính đại diện cao, đảm bảo cho việc chạy phản ứng PCR có đƣợc kết quả tốt. 1.3. Giới hạn - Đề tài chỉ thực hiện trên loài ong mật. - Chỉ tiến hành thiết kế mồi và khảo sát toàn bộ qui trình trên lý thuyết mà chƣa đƣợc tiến hành kiểm tra lại bằng thực nghiệm. - Năng lực và thời gian có giới hạn nên việc nghiên cứu sẽ có những hạn chế nhất định. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về ong mật Trong thế giới động vật, ong mật thuộc ngành chân đốt (Athropoda), lớp côn trùng (Insecta), bộ cánh màng (Hymenoptera), họ ong mật (Apisdae), giống ong mật (Apis). Ong mật xuất hiện cách đây khoảng 40 triệu năm đƣợc tìm thấy trong mẫu hóa thạch vào thời kỳ Eocene (Mark L. Winston, 1987). Trên thế giới có 7 loài ong cho mật, ở Việt Nam có 4 loài chính: 1. Apis mellifera: Ong Ý 2. Apis cerena: Ong ruồi 3. Apis dorsata: Ong khoái hay ong gác kèo 4. Apis florae: Ong muỗi Trong đó hai loài Apis mellifera và Apis cerena có giá trị kinh tế cao, đang đƣợc nuôi rộng rãi. Hai loài còn lại chỉ đƣợc khai thác tự nhiên. 2.1.1. Cấu tạo cơ thể của ong mật 2.1.1.1. Hình thái cơ thể Hình 2.1. Hình thái các loài ong cho mật Ong có bộ vỏ bao ngoài đƣợc cấu tạo bởi chất chitin có vai trò nhƣ khung xƣơng ngoài nâng đỡ các cơ quan bên trong và chống lại các nhân tố bất lợi bên ngoài. Cơ thể ong gồm ba phần khớp động với nhau: đầu, ngực và bụng. Trong quá trình phát triển cơ thể ong phải trải qua những lần lột xác. 4 Hình 2.2. Thể hiện 3 phần chính của ong Phần đầu Hình 2.3. Hình thái phần đầu của con ong Đầu con ong có cấu tạo hình hộp, trên đầu có hai mắt kép. Đỉnh đầu có ba mắt đơn phân bố dạng tam giác. Trƣớc đầu có một đôi râu có nhiều đốt (râu ong đực có 12 đốt, râu ong chúa và ong thợ có 11 đốt), râu của ong là cơ quan xúc giác rất nhạy. Miệng và vòi ong có đặc điểm khác với những loài côn trùng khác có chức năng cắn, nghiền, hút. Ong dùng hàm trên cắn vật cứng, nghiền phấn hoa… Vòi hút của ong đặc trƣng cho từng giống, ong dùng vòi hút để hút mật hoa, sirô, nƣớc. Phần ngực Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. Ngực gồm 3 đốt: đốt ngực trƣớc, đốt ngực giữa và đốt ngực sau. Phần ngực mang các cơ quan vận động là cánh và chân ong. Các đốt ngực đƣợc chia ra nửa lƣng và nửa bụng. 5 Hình 2.4. Hình thái phần ngực của con ong Nửa lƣng có 2 đôi cánh: đôi cánh trƣớc lớn hơn đôi cánh sau, khi ong bay đôi cánh trƣớc móc lại với đôi cánh sau thông qua hệ thống móc cánh. Nửa bụng của phần ngực có 3 đôi chân gắn vào 3 đốt ngực tƣơng ứng. Phần bụng Hình 2.5. Hình thái phần bụng của con ong Bụng ong có 6 đốt và nối với phần ngực qua đốt chuyển tiếp. Mỗi đốt gồm hai nửa: nửa lƣng và nửa bụng, các đốt bụng nối với nhau bằng màng kitin mỏng và đàn hồi (nhờ màng này ong có thể thay đổi thể tích bụng), hai bên mỗi đốt bụng có lỗ thở. Ở phần bụng của 4 đốt bụng cuối cùng có cơ quan tiết sáp, cuối bụng có ngòi đốt (ong đực không có ngòi đốt, ong chúa trƣởng thành thì ngòi đốt có tác dụng nhƣ một máng đẻ trứng và là một vũ khi đánh nhau với các con ong chúa khác). Giữa đốt bụng thứ 5 và thứ 6 của ong có tuyến Naxonop tiết ra mùi đặc trƣng cho đàn ong (ở ong chúa tuyến này phát triển mạnh và tiết ra mùi đặc trƣng gọi là chất chúa để điều khiển hoạt động bìng thƣờng của đàn ong). 6 2.1.1.2. Các cơ quan bên trong Cơ quan tiêu hóa Ong mật thuộc vào các côn trùng ding dƣỡng chuyên tính, cơ quan tiêu hóa còn là nơi dự trữ tạm thời mật khi thu và chuyển về tổ. Cơ quan hô hấp Gồm hai lỗ thở, hệ thống khí quản phân nhiều nhánh, các túi khí và hệ thống mao quản trao đổi khí với các tế bào, mô trong cơ thể. Cơ quan tuần hoàn Hệ thống tuần hoàn của ong là hệ thống mở, tim gồm 5 ngăn, hai bên sƣờn của mỗi ngăn có các cửa để máu lƣu thông. Cơ quan thần kinh Cơ quan thần kinh của ong mật phát triển cao, bảo đảm mối liên hệ của đàn ong với môi trƣờng xung quanh, điều khiển mọi hoạt động thống nhất trong cơ thể ong. Cơ quan thần kinh của ong chia làm ba phần: thần kinh trung ƣơng, thần kinh ngoại biên, thần kinh thực vật. Cơ quan sinh dục Cơ quan sinh dục của ong chúa gồm hai buồn trứng hình quả lê, mỗi buồn trứng có rất nhiều ống dẫn trứng nằm song song với nhau. Cơ quan sinh dục của ong thợ về cấu tạo giống nhƣ cơ quan sinh dục của ong chúa, nhƣng không đƣợc phát triển hoàn chỉnh, hai buồn trứng ong thợ có dạng dải. Cơ quan sinh dục của ong đực gồm hai đôi dịch hoàn: ống dẫn tinh, tuyến phụ và bộ phận giao phối. 2.1.2. Tổ chức của đàn ong Đàn ong là một tổ chức phức tạp gồm hàng nghìn con liên kết với nhau thành một đơn vị thống nhất bằng quá trình trao đổi chất. Nhờ có sự thống nhất giữa các cá thể, đàn ong có thể giữ đƣợc nhiệt độ tối ƣu trong tổ, thu đƣợc nhiều mật và phấn hoa, bảo vệ tổ chống kẻ thù và phát triển. Mỗi đàn ong có những đặc điểm cá thể riêng: mùi đặc thù, khả năng khai thác mật và tiết sáp, khả năng chia đàn, sức chống bệnh truyền nhiễm… 7 Đàn ong chỉ sống và phát triển khi có đủ các thành phần. Mỗi cá thể trong đàn (ong chúa, ong thợ, ong đực) thực hiện một chức năng nhất định theo hƣớng bảo tồn và kéo dài cuộc sống của cả đàn. Ong chúa: ong chúa làm nhiệm vụ đẻ trứng Ong thợ: ong thợ làm nhiệm vụ nuôi ấu trùng, lấy mật và phấn hoa, xây bánh tổ, điều chỉnh nhiệt độ, làm sạch tổ, bảo vệ tổ, chăm sóc ong chúa… Ong đực: nhiệm vụ của ong đực là giao phối với ong chúa tơ 2.1.3. Yêu cầu dinh dƣỡng của ong Khẩu phần ăn tự nhiên của ong mật trƣởng thành phải có: protein (amino acid), carbonhydrate (đƣờng), lipid (acid béo, sterol), vitamin, chất khoáng (muối), nƣớc. Những nguồn dinh dƣỡng này trong khẩu phần ăn phải đƣợc xác định rõ tỉ lệ về số lƣợng và chất lƣợng để đạt đƣợc mức dinh dƣỡng cao nhất. 2.1.4. Các sản phẩm của ong mật 2.1.4.1. Mật ong Thành phần mật ong có trên 65% dạng đƣờng khử gồm glucose và fructose, còn saccharose ít, chỉ có khoảng 5%. Ngoài ra trong quá trình luyện mật hoa, con ong còn tiết ra một số acid hữu cơ có tác dụng làm cho đƣờng trong mật ong không bị lên men. 2.1.4.2. Phấn hoa Phấn hoa là sản phẩm giàu dinh dƣỡng đƣợc ong thu từ nhị hoa của các loài hoa khác nhau để làm thức ăn cho chúng. Phấn hoa chứa 30 – 35% protein, trong đó 10% là acid amin tự do, các enzyme, vitamin… (phấn hoa chứa 21 acid amin cần thiết cho cơ thể, trong đó có 10 acid amin không thay thế). Dùng phấn hoa có tác dụng tốt cho cơ thể, tăng cƣờng sức khỏe vì phấn hoa có nhiều chất dinh dƣỡng dễ hấp thụ… 2.1.4.3. Sữa ong chúa Sữa ong chúa (tên gọi có nguồn gốc lịch sử) là nguồn dinh dƣỡng cao cấp, là sản phẩm đặc biệt. Nó là nguồn thức ăn duy nhất để nuôi ong chúa và ấu 8 trùng của ong chúa do ong thợ non tiết ra. Sữa ong chúa có thành phần dinh dƣỡng nhƣ sau: protein (18%), lipid (6,46%), các vitamin, chất khô (39,95%), tro (0,83%). Sữa ong chúa kích thích quá trình trao đổi lipid và protein giúp cơ thể khỏe mạnh. Sữa ong chúa giàu hormon, vitamin E có tác dụng kích thích sinh lý, tái tạo tế bào, chống sự già cỗi của các hệ thống tế bào. Sữa ong chúa dùng để chữa các bệnh đƣờng tiêu hóa, gan, thận, nâng cao sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm. 2.1.4.4. Sáp ong Sáp ong là dẫn xuất của acid béo no và không no có phân tử lƣợng lớn, các acid tự do và rƣợu gồm 50 hợp chất, 75% là este, carbonhydrate 12 – 15%, acid béo tự do 13 – 15%. Ngoài ra còn có nọc ong và keo ong là những sản phẩm dƣợc liệu thiên nhiên có giá trị cao do ong mật tạo ra. 2.2. Nguồn gốc EST (Expressed Sequence Tags) 2.2.1. EST là gì? EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thƣờng dài từ 200 – 500 nucleotide) đƣợc tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5‟ hay 3‟ của cDNA). Gồm có 5‟EST và 3‟EST 5‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 5‟ của cDNA, có khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài và không thay đổi nhiều trong một họ gen. 3‟ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 3‟ của cDNA, dạng này có thể sẽ rơi vào vùng không mã hoá (non-coding) hay vùng không dịch mã (Untranslated Regions, UTRs). Do đó khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loài thấp hơn những trình tự mã hóa. Một Expressed Sequence Tag (EST) có thể sử dụng giúp cho việc xác đinh những gen chƣa biết và lập bản đồ của chúng trong một bộ gen (genome). 9 2.2.2 Phƣơng pháp tạo EST Sơ đồ nguồn gốc của EST Hình 2.6. Sơ đồ nguồn gốc của EST Sử dụng mRNA để tạo cDNA cDNA là gì? cDNA là một dạng của DNA đƣợc tạo ra trong các phòng thí nghiệm, sử dụng một loại enzyme gọi là reverse transcriptase. Tạo cDNA đi ngƣợc với tiến trình bình thƣờng của sự sao mã trong tế bào. Bởi vì, ngƣời sản xuất sử dụng mRNA làm khuôn (template) chứ không phải DNA. Không giống nhƣ DNA của bộ gen, cDNA chỉ chứa exon hay gen biểu hiện. mRNA là một chìa khóa để tìm thấy những gen biểu hiện trong bộ gen. Tuy nhiên, mRNA không bền vững ở bên ngoài tế bào. Do đó, các nhà khoa học đã sử dụng một loại enzyme đặc biệt để biến đổi nó thành dạng DNA (cDNA) bổ sung (complementary DNA). cDNA có cấu tạo bền vững hơn rất nhiều so với mRNA. Vì đƣợc tạo ra từ mRNA, các intron đã đƣợc bị loại bỏ nên cDNA chỉ đại diện cho những trình tự DNA biểu hiện. Từ cDNA đến EST Một cDNA đại diện cho một gen biểu hiện đƣợc phân lập, sau đó các nhà khoa học có thể giải trình tự từ hai đầu của phân tử này thƣờng khoảng 100 đến vài trăm nucleotide (khoảng 500 nucleotide) để tạo ra hai loại EST. Đó có thể là 5‟EST và 3‟EST. 10 Hình 2.7. Cách thức tạo nên EST 2.3. Microsatellite là gì? Microsatellite là trình tự đơn lặp lại (Simple Sequence Repeats - SSR) từ 1 – 10 nucleotide. Chúng xuất hiện khắp trong các loài sinh vật bậc cao, mặc dù tần số xuất hiện của SSR có sự biến đổi giữa các loài. SSR rất phong phú, nằm rải rác khắp nơi trong bộ gen và cho thấy mức độ đa hình cao hơn so với các marker di truyền khác. Những đặc điểm này, kết hợp lại làm cho SSR đƣợc xác định một cách dễ dàng, chúng đƣợc sử dụng làm marker phân tử. Khả năng tự thừa kế của SSR trong những tính trạng trội, đó là những thuận lợi mà chúng có đƣợc khi so sánh với các loại marker phân tử khác. SSR gần đây đã trở thành marker di truyền quan trọng, đặc biệt là với các loài ngũ cốc nhƣ lúa mì và lúa mạch. 2.3.1. Các dạng microsatellite Dạng mononucleotide SSR là dạng chỉ có 1 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ AAAAAAAAAA Dạng dinucleotide SSR là dạng trong trình tự lặp lại có 2 loại base. Ví dụ nhƣ GTGTGTGTGTGT Dạng trinucleotide SSR là dạng có đến 3 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ ATGATGATGATGATG Dạng tetranucleotide SSR là dạng có tới 4 loại base trong trình tự lặp lại. Ví dụ nhƣ ACGTACGTACGTACGT 11 Dạng trinucleotide xuất hiện ít hơn dạng dinucleotide tới 10 lần, dạng tetranucleotide thì ít hơn dạng trinucleotide (Ma và ctv., 1996) Sự lặp lại của polyA/T là rất phổ biến ở các loài. Tuy nhiên, sự phân bố giữa các loài rất khác nhau. Dạng này thƣờng không ổn định vì vậy trong phân tích di truyền và lập bản đồ di truyền… là không phù hợp. Dạng CA/GT thƣờng gặp trong các loài có vú, gấp đôi dạng AT và gấp 3 dạng AG/CT. Ở thực vật dạng thƣờng gặp là AA/TT và AT/TA. Chúng có thể đƣợc phần thành ba dạng, sau đây là 3 ví dụ cụ thể: Dạng liên tục: ATATATATATATAT Dạng kết hợp: GCGCGCGC TATATA Dạng ngắt quảng: CACACACA TGCT CACACACA Loại đa hình cao nhất là dạng không bị ngắt quãng. Tuy nhiên, trong thực tế dạng kêt hợp và ngắt quãng đƣợc tìm thấy nhiều hơn. 2.3.2. Cơ chế hình thành microsatellite Cơ chế đột biến hình thành microsatellite vẫn chƣa đƣợc hiểu biết một cách đầy đủ. Tuy nhiên, di truyền học và các nghiên cứu khác cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là do 2 quá trình sau: Quá trình bắt chéo lỗi trong quá trình giảm phân ( unequal crossing- over during meiosis) . Hình 2.8. Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân 12 Quá trình trƣợt lỗi trong sao mã (replication slippage) Đây đƣợc coi là nguyên nhân chủ yếu và nó xảy ra trên mạch chậm (lagging strand). Quá trình này liên quan đến quá trình trƣợt lỗi của enzyme polymerase trên phân tử DNA mới tổng hợp. Sự trƣợt lỗi này tạo ra một chỗ phình nhất thời có thể bị loại bỏ trong quá trình sửa lỗi hoặc là có thể kéo dài thêm ở mạch đối diện tạo thành một đoạn lặp lại dài hơn. Hình 2.9 . Cơ chế trƣợt lỗi trong quá trình sao mã 2.3.3. Ứng dụng của microsatellite SSR đƣợc sử dụng để lập bản đồ di truyền. Chúng dễ dàng sử dụng và chứa đựng thông tin cao có thể thay thế tốt cho RFLP trong kỹ thuật lập bản đồ di truyền ở ngƣời (Dib và ctv., 1996). Sự phát triển SSR trong thực vật là rất nhanh, và vị trí SSR hiện giờ đƣợc hợp nhất để thành lập bản đồ di truyền của tất cả các loài ngũ cốc (Liu và ctv., 1996; Korzun và ctv., 1997; Smith và ctv., 1997; Stephenson và ctv., 1998). SSR có thể đƣợc sử dụng trong công tác phân tích và so sánh đặc điểm di truyền của các loài. Sự đa hình của SSR đƣợc xác định bằng phƣơng pháp PCR với 13 mồi đƣợc thiết kế ở vùng bảo tồn hai bên SSR (flanking regions) trên cơ sở sự khác nhau về kích thƣớc của các băng khi điện di của trình tự lặp lại. 2.3.4. Marker phân tử (molecular marker) Chỉ thị phân tử là những đặc điểm thể hiện ở khía cạnh hoá học hay cấu trúc phân tử di truyền lại cho đời sau, giống nhƣ các nhân tố di truyền Meldel, nhƣng lại có thể định lƣợng đƣợc. Về nguyên tắc, bất cứ đoạn DNA nào phân biệt đƣợc hai cá thể, hai dòng hoặc các giống khác nhau thì có thể xem nhƣ là một marker DNA. Marker DNA có nhiều ƣu điểm hơn so với marker hình thái và isozyme vì sản phẩm thể hiện tính đa hình cao, tính đồng trội, tính ổn định không phụ thuộc vào yếu tố môi trƣờng. Các chỉ thị di truyền phân tử đƣợc sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, là cơ sở cho việc phân loại dƣới loài (thứ), phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa giữa loài (Ahn và ctv, 1993; Dunforal và ctv, 1995). Chúng có thể đƣợc dùng để chọn các tổ hợp lai (Nair và ctv, 1995; Zhang và ctv, 1995). Các chỉ thị DNA có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004): - Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain Reaction) (PCR-based): có các RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS - Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridization-based): RFLP, minisatellite. Bảng 2.1. Tên gọi một số marker DNA Chỉ thị (marker) Tên đầy đủ RAPD Random amplified polymorphic DNA AP-PCR Arbitrary primer-PCR DAF DNA amplification fingerprinting AFLP Amplified fragment length polymorphism ALP Amplicon length polymorphism SSR Simple sequence repeat (microsatellite) SSCP Single strand conformation polymorphism RFLP Restriction fragment length polymorphism 14 STS Sequence-tagged sites Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một chiến lƣợc đƣợc thế giới ủng hộ từ năm 1995, là phƣơng pháp tác động mạnh đến hiệu quả chọn giống với các marker có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở PCR để đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu. Sau khi đánh giá kiểu gen chúng ta so sánh với đánh giá kiểu hình để tìm ra mức độ chính xác của phƣơng pháp (Bùi Chí Bửu, 2002). 2.3.5. Vì sao chọn marker SSR? Hiện nay marker SSR là một công cụ mạnh (powerful tool) đƣợc ứng dụng rộng rải trong việc lập bản đồ bộ gen của các loài; phân tích đặc điểm di truyền của các loài, dƣới loài và các cá thể trong một loài phục vụ có hiệu quả cho công tác chọn giống trong chăn nuôi và trồng trọt; tìm hiểu về nguồn gốc và phân lập các gen gây bệnh (các gen có liên quan đến bệnh Alzheimer, ung thƣ ruột kết và nhiều bệnh khác) từ đó nghiên cứu ra phƣơng pháp điều trị. Marker SSR có các ƣu điểm nổi bật sau Di truyền đa allen và đồng trội Có tính chỉ thị cao (non- abundant) Có ở tận hai đầu của bộ gen (tính chỉ thị rộng) Marker RAPD thì dễ dàng phát triển nhƣng giới hạn trong nhiều mục đích ứng dụng (Haymer 1994). Microsatillite (Simple Sequence Repeats, SSRs) có độ đa hình cao, marker đồng trội, hiệu quả này đã đƣợc chứng minh qua nhiều mục đích ứng dụng bao gồm kỹ thuật finger-printing (Smith và Devey, 1994), nghiên cứu di truyền quần thể (Haymer 1994; Tsumura và ctv, 1996; Thomas và ctv, 1999), kiểm tra sƣ phân bố di truyền cho đời sau (Dow và ctv, 1995), kiểm tra sự thuần hóa (Morchen và ctv, 1996). SSR dễ dàng sử dụng hơn sự đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs) chỉ giải quyết đƣợc số lƣợng nhỏ DNA, sự đa hình cao và khả năng phân tích nhanh. Marker SSR có thể dễ dàng thay đổi giữa 15 các nhà khoa học bởi vì mỗi locus đƣợc xác định bởi trình tự mồi riêng. SSR phân tích nhanh hơn sự khuyếch đại đa hình ngẫu nhiên DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD) và sự chuyển đổi tốt hơn AFLP. SSR hiện giờ thay thế cho RFLP trong lập bản đồ di truyền các cây trồng nông nghiệp. Sự kết hợp của SSR với AFLP tạo nên bản đồ di truyền chi tiết. Sự đồng trội tự nhiên của SSR cũng là điểm mạnh trong lập bản đồ di truyền. 2.4. Ngôn ngữ lập trình Perl (Practical Extraction and Reporting Language) 2.4.1. Nguồn gốc của Perl Trƣớc khi Java hay JavaScript chiếm lĩnh Internet, và thậm chí trƣớc khi Web xuất hiện, Perl đã có một vai trò rất quan trọng. Từ viêc tự động hóa các tác vụ quản lý UNIX cho đến việc thực hiện thƣờng trình phân tích file, Perl đƣợc sử dụng nhƣ một ngôn ngữ tiện ích thực sự. Vào ngày 18 tháng 10 năm 1987, Larry Wall, tác giả của ngôn ngữ này, lần đầu tiên đƣa Perl vào sử dụng tại nhóm usenet comp.sourse. Ngôn ngữ mới này phát sinh từ ngôn ngữ lập trình C và bị ảnh hƣởng bởi các ngôn ngữ khác nhƣ BASIC, awk, sed, và UNIX shell. Perl là sự kết hợp các ƣu điểm của những ngôn ngữ trên. Những ngƣời có ít hay không có kinh nghiệm lập trình đều có thể học và sử dụng Perl để lập trình một cách dễ dàng. Ngoài việc dễ dàng học, Perl còn là một ngôn ngữ hữu dụng. Ngay từ đầu, Perl đã có một khả năng rất lớn trong việc thao tác text, file, và các tiến trình hệ thống. Từ lúc khai sinh đến nay, Perl đã có nhiều phiên bản, sau Perl 1.0 là Perl 2.0, …Perl 5.6. Perl 5.6 xuất hiện vào tháng 3 năm 2000. Bênh cạnh một cú pháp mới đƣợc dùng để diễn dịch và khai báo các thuộc tính thƣờng trình phụ, Perl 5.6 còn bổ sung khá nhiều đặc tính nhỏ mà những ngƣời lập trình yêu cầu vốn không có trong các phiên bản trƣớc. Các đặc tính này bao gồm: Hỗ trợ Unicode và UTF-8 Hỗ trợ 64 bit Hỗ trợ các file lớn hơn 2GB 16 Có nhiều khả năng chẩn đoán hơn Các loại cảnh báo theo phạm vi từ vựng Hàm open có thêm một số đối số Hàm pack đƣợc cải tiến thêm 2.4.2. Cấu trúc của Perl 2.4.2.1. Dữ liệu vô hƣớng (scalar data) Dữ liệu vô hƣớng (scalar data) ám chỉ một kiểu dữ liệu duy nhất gồm số và chuỗi. Đây là kiểu dữ liệu cơ bản nhất mà Perl đã quen xử lý. Biến vô hƣớng phải đƣợc đặt tên với ký tự “$”. Các số Theo quan điểm của ngƣời sử dụng, thƣờng có hai dạng khác nhau. Kiểu số thứ nhất là một interger, tức là một số nguyên. Các số nguyên này đƣợc trình bày với các cơ số 10. Kiểu thứ hai là số thập phân. Ngoài ra còn có hai kiểu số đặc biệt khác là các số bách phân và thập lục phân. Các số bách phân đƣợc trình bày với cơ số 8 và các số thập lục phân với các chữ số cơ số 16. Các chuỗi Một chuỗi là một loạt các ký tự liên tiếp. Một chuỗi có thể đƣợc tạo thành bởi bất kỳ tổ hợp ký tự nào từ bộ 256 ký tự. Chuỗi có hai dạng khác nhau, gồm chuỗi có dấu trích dẫn đơn và chuỗi có dấu trích dẫn kép. Khi viết một chƣơng trình cần phải lƣu một số các dữ liệu vô hƣớng cho nhiều muc đích lập trình khác nhau. Và nó sẽ đƣợc lƣu vào các biến vô hƣớng (scalar variable). Một biến vô hƣớng có thể đƣợc xem nhƣ là một thùng chứa. Ngƣời lập trình có thể đặt một giá trị vô hƣớng vào thùng này và lấy nó ra bất kỳ lúc nào khi cần nó. Ngƣời lập trình có thể thay đổi những gì họ có trong thùng chứa vào bất kỳ lúc nào trong khi một chƣơng trình đang thực thi. 2.4.2.2. Cấu trúc điều khiển 17 Cấu trúc điều khiển là tập hợp các câu lệnh điều kiện. Các câu lệnh điều kiện đƣợc sử dụng trong ngôn ngữ lập trình khi một quyết định cần đƣợc thực hiện trƣớc khi một phần mã đƣợc thƣc thi. Các khối câu lệnh Một khối lệnh là một chuỗi các câu lệnh thƣc thi đƣợc đƣợc nhóm lại với nhau bằng các dấu ngoặc „{„ và „}‟. Một khối lệnh trong một chƣơng trình trông giống nhƣ thế này: { $a = 12; $a + = 5; print “a equals $a\n”} Câu lệnh điều kiện if-then-else Câu lệnh điều kiện if-then-else nhận một biểu thức và đánh giá nó với một giá trị là đúng/sai. Nếu việc xác định của một biểu thức là giá trị đúng, khối lệnh cho phần câu lệnh then đƣợc thực thi. Nếu phần xác định của biểu thức là sai, khối lệnh else sẽ đƣợc thực thi. Cú pháp của câu lệnh điều kiện if-then-else nhƣ sau: if ( biểu thức) ví dụ: { #!/usr/bin/perl khối lệnh „then‟ $a = 20; } if($a =15){print “a is equal to 15.\n”;} else else{print “a is not equal to 15.\n”;} { khối lệnh „else‟ } Việc bỏ đi phần else của câu lệnh này là hoàn toàn hợp lệ nếu chúng ta không cần nó. Dƣới đây là cú pháp câu lệnh if-then mà không có else. If (biểu thức) { khối lệnh „then‟ } Việc có một khối lệnh else mà không có khối lệnh if trƣớc đó là không hợp lệ trong Perl. Câu lệnh điều kiện while 18 Câu lệnh điều kiện while là một câu điều kiện hữu ích bởi vì nó cho phép ngƣời lập trình lặp lại một khối lệnh bao nhiêu lần tùy ý. Lệnh while hoạt động giống nhƣ câu lệnh điều kiện if-then-else ở chỗ xác định một biểu thức cho việc đánh giá đúng/sai. Một khác biệt lớn là nó tiếp tục thực thi khối lệnh khi biểu thức là đúng. Dƣới đây là cú pháp cho câu lệnh điều kiện while. While (biểu thức) ví dụ: #!/usr/bin/perl { $a = 15; khối lệnh „while‟ while ($a<25) { } print“$a is still less than 25\n”;} Câu lệnh điều kiện until Câu lệnh điều kiện until ngƣợc với câu lệnh while. Khối lệnh until chỉ thực thi khi biểu thức xác định là sai. Dƣới đây là cú pháp cho câu lệnh điều kiện until. until (biểu thức) ví dụ: #!/usr/bin/perl { $a = 15; khối lệnh „until‟ } until ($a >25) { print “the value of is $a \n”; $a; } Câu lệnh điều kiện do while-until Trong một số trƣớng hợp, ngƣời lập trình có thể cần khối lệnh phải đƣợc thực thi ít nhất một lần. Perl cho phép ngƣời lập trình thực hiện điều này bằng cách sử dụng câu lệnh điều kiện do while-until. Câu lệnh có cú pháp nhƣ sau: do { khối lệnh „do‟ } until (biểu thức) Câu lệnh điều kiện do while–until cho phép bạn thƣc thi khối lệnh ít nhất một lần, bất kể biểu thức xác định nhƣ thế nào (đúng hay sai). Ví dụ #!/usr/bin/perl $a = 12; do { print “ the statement block has been excuted \n”; while ($a < 10) Câu lệnh điều kiện for 19 Câu lệnh for đƣợc sử dụng rộng rãi bởi các nhà lập trình trong tất cả các ngôn ngữ. Lý do của điều này là câu lệnh for cung cấp cho ngƣời lập trình một phƣơng pháp nhanh chóng xác định số lần mà một khối lệnh đƣợc thực thi. Cú pháp câu lệnh điều kiện for nhƣ sau. For (câu lệnh 1;biểu thức điều kiện; câu lệnh 2) { khối lệnh „for‟ } Ví dụ #!/usr/bin/perl for ($a=1;$a<10;$a++){# the for conditional statement print “the statement block has been executed $a times \n”;} 2.4.2.3. Các List, Array và Hash Danh sách (list) Danh sách là một nhóm dữ liệu vô hƣớng sắp xếp theo thứ tự, nó là một chuỗi các giá trị vô hƣớng đƣợc đặt trong các dấu ngoặc đơn, nó có dạng: (1, 2, 3, 6, 7, 12); (1, 2, “hello”, 3, 6 , “again”); (4, 5, “$name”, 7, 10). Các Array Một biến mảng (array variable) giống nhƣ một biến vô hƣớng trong đó nó đƣợc tạo ra để lƣu trữ dữ liệu. Sự khác biệt là biến mảng đƣợc thiết kế để lƣu trữ một danh sách trong khi một biến vô hƣớng đƣợc thiết kế để lƣu trữ một dữ liệu vô hƣớng số ít. Biến mảng đƣợc biểu thị bằng ký tự @ đầu tiên (@number). Các hash (băm) Một hash là một biến khác mà ngƣời lập trình có thể sử dụng để lƣu trữ dữ liệu vô hƣớng. Đối với các array, phần tử đâu tiên có một index là 0, phần tử thứ hai có một index là 1,… Mỗi trong các phần tử đƣợc chứa trong một hash có những gì đƣợc gọi là các khóa (key), các khóa đƣợc sử dụng làm index. Những khoá này có thể đƣợc ấn định bởi ngƣời dùng và chúng có thể là bất kỳ nếu muốn. Cú pháp của hash nhƣ sau. %hash = (key, element, key, element) 20 2.4.2.4. Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con Dòng chƣơng trình và các thƣờng trình con là một cách để giúp cho ngƣời lập trình phân chia mã của mình thành các đoạn. Bằng cách thực hiện điều này, ngƣời lập trình thƣờng có thể tổ chức chƣơng trình của mình tốt hơn theo chức năng. Ngoài ra, điều này còn cho phép ngƣời lập trình tạo các phần hay chức năng để sử dụng lại thay vì phải viết lại. Dòng chƣơng trình Khi bàn về dòng chƣơng trình lôgic, chúng ta ám chỉ đến dòng mà chƣơng trình đi qua khi nó giải quyết một tác vụ. Ví dụ, khi bạn thức dậy vào buổi sáng, bạn có thể tắm rửa, mặc đồ, ăn sáng, và sau đó đi làm. Một chƣơng trình đƣợc thiết kế logic sẽ tuân theo tiến trình tƣơng tự đó, bất kể bất kỳ điểm chung giữa các bƣớc nhƣ mở cửa hay đi bộ. Do đó, bằng cách tuân theo kiểu phƣơng pháp này, ngƣời lập trình sẽ khai báo các biến này thay vì tại phần trên cùng – và các thƣờng trình con thay vì tại phân dƣới cùng – khi cần thiết. Một dòng chức năng là nơi mà ngƣời lập trình nhóm các chƣơng trình lại với nhau. Ví dụ, tại cuối chƣơng trình, ngƣời lập trình kéo tất cả thƣờng trình con, đƣợc sắp xếp bằng chức năng tƣơng tự. Các thủ tục đi bộ, mở cửa, và lái xe có thể nằm kề nhau, trong khi đó nói chuyện và các dạng giao tiếp khác có thể theo sau. Thƣờng trình con Một thƣờng trình con là phƣơng pháp để tạo các hàm của Perl. Những hàm này cho phép ngƣời lập trình thực hiện mọi thứ từ việc truyền các đối số và chỉnh sửa các giá trị đến việc cho ra giá trị. Sự khai báo các thƣờng trình con trong ngôn ngữ Perl đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng từ khóa ngôn ngữ sách. Theo sau từ khóa này là một mã nhận dạng tên dùng để gọi thƣờng trình con khi cần đến. Sau đây là cú pháp cơ bản, trong đó NAME tham chiếu tên mà ngƣời lập trình muốn gọi thƣờng trình con và code là mã mà ngƣời lập trình muốn thực thi khi thƣờng trình con đƣợc gọi. Sub NAME { Code } 21 2.4.2.5 Package và Module Package Một package là một tập hợp các hàm Perl đƣợc nhóm thành một file đơn. File này, cũng đƣợc gọi là một thƣ viện (library) và có phần mở rộng .pl (đôi khi là .pm), đƣợc chỉ ra bởi tên file của nó trong mã. Một package khai báo một namespace khác của các biến và/hoặc các thƣờng trình con bên trong nó. Mục đích là để các biến tránh ghi đè lên nhau. Module Module không có gì hơn là một package. Điểm khác biệt duy nhất là một Module đƣợc thiết kế để sử dụng lại. Điều này đƣợc thực hiện bằng cách cho phép xuất một số hay tất cả các biến và thƣờng trình con của một Module sang các package khác. Trên đây, tôi chỉ trình bày sơ lƣợt một vài thành phần trong cấu trúc hoạt động của ngôn ngƣ lập trình Perl. Còn rất nhiều các yếu tố cấu tạo - nguyên tắc chi tiết ứng dụng của từng thành phần trong Perl mà do mục đích và yêu cầu của đề tài nên tôi không thể trình bày hết đƣợc. 2.5. Giới thiệu về mồi (primer) 2.5.1. Khái quát về mồi Mồi (primer) là một thành phần quan trọng không thể thiếu trong phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction). Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5‟ hay 3‟ của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi đƣợc thiết kế dựa vào vùng trình tự đã đƣợc biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Trong phản ứng PCR bao giờ cũng cần có cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngƣợc). Có rất nhiều tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp mồi nhƣ chiều dài mồi, tính chuyên biệt của cặp mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi, nhiệt độ bắt cặp, sự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi… để đảm bảo phản ứng PCR thành công và thu đƣợc sản phẩm nhân bản (một số lƣợng lớn bản sao của đoạn DNA khuôn ban đầu). 2.5.2. Đặc điểm của mồi (primer) 22 2.5.2.1 Tính chuyên biệt Duy nhất: chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA, nghĩa là trình tự primer chỉ xuất hiện một lần trên trình tự khuôn. Ngoài ra, cũng phải cần đảm bảo primer không thể bắt cặp bổ sung vào trình tự DNA của các nguồn có khả năng nhiễm nhƣ DNA ngƣời, chuột, tác nhân gây cùng triệu chứng. DNA khuôn 5‟ …TCAACTTAGCATGATCGGGTA…GTAGCAGTTGACTGTAAATTCAACTTAGCAA…3‟ 3‟-GTTGAATCGT-5‟ 3‟ -CATCGTCAACTGAC-5‟ 3‟-GTTGAATCGT-5‟ Primer 1 3‟-GTTGAATCGT-5‟ Không duy nhất Primer 2 3‟ -CATCGTCAACTGAC-5‟ Duy nhất Chiều dài: chiều dài của primer ảnh hƣởng đến tính duy nhất, nhiệt độ nóng chảy và nhiệt độ bắt cặp của primer. Nói một cách khác, primer càng dài thì nó càng thể hiện đƣợc tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để đảm bảo tính duy nhất thì chiều dài của primer tối thiểu là 15 base, thƣờng thì primer có chiều dài từ 17 – 28 base. Thành phần base: ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của quá trình lai, nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ lai và sự ổn định của cấu trúc phân tử. Các base đƣợc sắp xếp ngẫu nhiên thì thích hợp hơn là những vùng (A+T) dài hay là những vùng giàu (G+C). Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50 – 60% sẽ cho ta nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ lai thích hợp trong một phản ứng PCR bình thƣờng. Template DNA 5‟…TCAACTTAGCATGATCGGGCA…AAGATGCACGGGCCTGTACACAA…3‟ TACTAGCCCGT 2.5.2.2. Tính ổn định Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa sợi DNA là sợi đơn và một nửa còn lại là DNA sợi đôi. Tm là đặc tính của thành phần base. Thành phần (C +G) trong DNA cao sẽ dẫn tới nhiệt độ Tm cao vì liên kết H trong DNA mạnh hơn. Có nhiều công thức tính Tm, một trong những công thức đƣợc nhiều ngƣời sử dụng nhất có dạng nhƣ sau: Tm = 59.9 +0.41*(%GC) – 600/chiều dài 23 Nhiệt độ bắt cặp (Tanneal) là nhiệt độ mà tại đó primer bắt cặp vào DNA khuôn. Tanneal đƣợc tính theo công thức: Tanneal = Tm-primer – 4 0 C Để đảm bảo primer bắt cặp vào DNA mạch khuôn trƣớc khi hai sợi đơn của mạch khuôn bắt cặp với nhau thì: Tm-product - Tanneal 30 0 C Tính nghiêm ngặt trong quá trình bắt cặp của mồi: quyết định tính đặc hiệu của sản phẩm DNA đƣợc nhân bản. Tanneal là nhân tố ảnh hƣởng quan trọng nhất của tính chuyên biệt này. Nếu Tanneal quá thấp thì mồi sẽ bắt cặp không đặt hiệu tính nghiêm ngặt thấp. Ngƣợc lại, nếu Tanneal quá cao thì mồi không có khả năng bắt cặp tính nghiêm ngặt cao. Cấu trúc thứ cấp: nếu sự bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc hình thành dimer, hetero-dimer; mồi xuôi với mồi xuôi self-dimer, homo-dimer, giữa mồi ngƣợc với mồi ngƣợc self –dimer, homo-dimer; hay primer tự tạo cấu trúc kẹp tóc (hairpin) xảy ra nhiều hơn so với sự bắt cặp của primer với DNA mẫu thì hiệu quả nhân bản của phản ứng PCR sẽ giảm một cách rõ rệt. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp những cấu trúc này không ảnh hƣởng đến kết quả của phản ứng PCR vì nhiệt độ bắt cặp không cho phép sự hình thành các cấu trúc đó. Ví dụ: một số dimer hay hairpin chỉ hình thành ở nhiệt độ 300C. Trong khi đó nhiệt độ của phản ứng PCR thấp nhất cũng là 560C. Hairpin Self-Dimer Dimer 3‟ GGGAAA 8bp 3‟ GGGAAAATTCCAGGATCTAT 5‟ mồi xuôi 5‟TATCTAGGACCTTA 5‟ TATCTAGGACCTTAAAAGGG 5‟ TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3‟ 4bp 3‟ GGGAAAATTCCAGGATCTAT 5‟ 3‟CATGGAAACGTAGGAGAC5‟ mồi ngƣợc 5‟ TATCTAGGACCTTAAAAGGG 3‟ 3‟ GGGAA A 5‟ TATCTAGGACCTTA 2.5.2.3. Tính tƣơng thích 24 Sự hòa hợp của cặp mồi: mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngƣợc. Chúng đƣợc sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR, vì vậy phải đảm bảo điều kiện phản ứng PCR thỏa mãn cho cả mồi xuôi và mồi ngƣợc. Một đặc điểm cần chú ý là nhiệt độ bắt cặp. Nhiệt độ này thể hiện sự tƣơng thích giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc. Sự chênh lệch giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc cho phép là 30C. Nhiệt độ lai giữa môi xuôi và mồi ngƣợc càng gần thì phản ứng PCR diễn ra càng tốt. 2.6. Tin sinh học 2.6.1. Khái niệm tin sinh học Tin sinh học (bioinformatics) là một lĩnh vực khoa học sử dụng các công nghệ của các ngành toán học ứng dụng, tin học, thống kê và khoa học máy tính để giải quyết các vấn đề sinh học. Các nghiên cứu trong ngành sinh học tính toán (computational biology) thƣờng trùng lắp với sinh học hệ thống (systems biology). Những lĩnh vực nghiên cứu chính của nó bao gồm bắt cặp trình tự (sequence alignment), bắt cặp cấu trúc protein (protein structural alignment), dự đoán cấu trúc protein (protein structural prediction), dự đoán biểu hiện gen (gene expressions), tƣơng tác protein–protein (protein-protein interaction) và mô hình hóa các quá trình tiến hóa. Thuật ngữ tin sinh học và khoa học tính toán thƣờng dùng hoán đổi cho nhau, mặt dù cái trƣớc, nói một cách nghiêm túc là tập con của cái sau. Những mối quan tâm chính trong các dự án tin sinh học và khoa học tính toán là việc sử dụng các công cụ toán học để trích rút các thông tin hữu ích từ các dữ liệu hỗn độn đƣợc thu nhận từ các kỹ thuật sinh học với lƣu lƣợng mức độ lớn. Lĩnh vực khai thác dữ liệu (data mining) trùng lắp với sinh học tính toán về phƣơn diện này. Những bài toán đặc trƣng trong sinh học tính toán bao gồm việc lắp ráp (assembly) những trình tự DNA chất lƣợng cao từ các đoạn ngắn DNA đƣợc thu nhận từ kỹ thuật xác định trình tự DNA và việc dự đoán qui luật biểu hiện điều hoà gen (gene regulation) với dữ liệu từ các mRNA, microarray hay khối phổ (mass spectrometry). 2.6.2. Các lĩnh vực nghiên cứu chính của tin sinh học 2.6.2.1. Genomics - Hệ gen học 25 Phân tích trình tự Kể từ khi Phage - X174 đƣợc xác định trình tự (1977). Cho đến nay, trình tự DNA của rất nhiều loài đƣợc dự trữ trong các ngân hàng cơ sở dữ liệu. Việc thực hiện phân tích nguồn dữ liệu này về các vấn đề tìm kiếm gen cấu trúc (mã hóa cho một protein nào đó), quy luật những trình tự tƣơng đồng, so sánh gen trong cùng một loài hay giữa các loài, mối quan hệ phát sinh chủng loài là không thể thực hiện đƣợc bằng tay. Do đó, các chƣơng trình máy tính đã đƣợc phát triển và ứng dụng vào các công việc này với nguồn dữ liệu lên đến hàng tỷ và nhiều công đoạn nghiên cứu phức tạp khác. Mà dự án genome ngƣời (Human Genome Project) là một minh chứng. Trong dự án này các nhà tin sinh học đã phải mất cả hàng tháng trên một loạt siêu máy tính (các máy DEC Alpha ra đới năm 2000) để sắp xếp đúng toàn bộ số lƣợng trình tự DNA nhỏ (shotgun DNA sequence) đƣợc giải mã tạo nên một sợi DNA với kích thƣớc lớn mà với kỹ thuật hiện nay không thể giải mã đƣợc sợi DNA cở vài chục ngàn nucleotide. Giải mã genome hiện nay và giải thuật lắp ráp genome (genome assembly algorithms) là một trong những lĩnh vực nóng của tin sinh học. Chỉ định gen Annotation là quá trình đánh dấu các gen và các đặc tính sinh học (biological features) khác trong một chuỗi DNA. Hệ thống phần mềm làm nhiệm vụ “ genome annotation” đã đƣợc phát triển. Công việc này giúp cho lĩnh vực chuyên về nghiên cứu bản đồ gen (genomics). Dò tìm đột biến và SNP Rất nhiều nghiên cứu xác định trình tự (sequencing) hiện nay là nhằm tìm ra các đột biến điểm (point mutation) xảy ra các gen khác nhau trong ung thƣ. Tập sơ khởi (sheer volume) các dữ liệu đƣợc tạo ra đòi hỏi các hệ thống tự động đọc những dữ liệu kiểu chuỗi này (sequence data), rồi so sánh trình tự kết quả với các trình tự đã biết trên genome ngƣời, bao gồm những điểm đa hình trên các tế bào dòng tinh (germline) đã biết. Những hệ thống oligonucleotide microarray, bao gồm những hệ thống dùng để xác định điểm đa hình đơn nucleotide (Sinlge Nucleotide Polymophism) hoặc khảo sát tính dị biệt so sánh genome (comparative genomic hybridization) 26 với khả năng cho phép khảo sát một lúc hàng trăm ngàn vị trí trên cùng một bản đồ gen đang đƣợc sử dụng để xác định những đột biến thêm và mất đoạn nhiễm sắc thể trong quá trình hình thành ung thƣ. 2.6.2.2. Sinh học tiến hóa Phân loại học phân tử Tiến hóa học máy tính (Computional Evolutation Biology, CEB) đã ra đời trƣớc kỹ nguyên hệ gen học (genomics) nghiên cứu xây dựng các mô hình tính toán quần thể và sự biến thiên của chúng theo thời gian. Bảo tồn đa dạng sinh học Tin sinh học thƣờng áp dụng trong lĩnh vực bảo tồn đa dạng sinh học (biodiversity). Thông tin quan trọng nhất đƣợc thu thập chính là tên, mô tả, sự phân bố, trạng thái và kích thƣớc phân bố của các chủng loài (speciese), nhu cầu thói quen (habitat) mà cách mà mỗi tổ chức tƣơng tác với các chủng loài khác. Thông tin này đƣợc lƣu trữ trong cơ sở dữ liệu các máy tính, đƣợc truy xuất bởi các chƣơng trình phần mềm để tìm kiếm, hiển thị, phân tích thông tin đó một cách tự động và quan trọng nhất là để giao tiếp đƣợc với con ngƣời, đặc biệt là qua internet. Một ví dụ của ứng dụng này là dự án Speciese 2000. Nó là một dự án nghiên cứu toàn cầu dựa vào internet để giúp cung cấp thông tin về mỗi chủng loài đƣợc biết đến của cây, động vật, nấm (fungus), và vi khuẩn (microbe) còn tồn tại để làm cơ sở cho việc nghiên cứu đa dạng sinh học toàn cầu. 2.6.2.3. Phân tích chức năng gen Mức độ biểu hiện gen Nhà sinh học phân tử có thể đánh giá mức độ biểu hiện của một gen bằng cách xác định lƣợng mRNA đƣợc tạo ra từ gen đó thông qua các kỹ thuật nhƣ microarray, EST, SAGE (Serial Analygis of Gene Expression), MPSS (Massively Parllel Signature Sequencing), hay khối phổ định lƣợng protein. Tất cả những dữ liệu trên đƣợc tạo ra đều chứa thông tin nhiễu (noise-prone) làm việc phân tích, tính toán trở nên phức tạp. Yêu cầu thực tế đó đã cho ra đời một 27 lĩnh vực mới trong sinh học tính toán đó là phát triển công cụ thống kê để lọc tín hiệu xác đáng khỏi thông tin nhiễu trong những nghiên cứu biểu hiện gen đa lƣợng (high-thoughput gene expression). Nhận diện protein Protein microarray và hệ thống khối phổ cao năng (high- throughput mass spectrometry) có thể cung cấp hình ảnh (snapshot) tổng thể của các protein hiện có trong một mẫu sinh học (biological sample). Các ứng dụng tin sinh học có liên quan rất nhiều đến việc lý giải các dữ liệu thu đƣợc từ những hệ thống này. Đối với protein microarray, những nhà tin sinh học cần kiểm tra dữ liệu mRNA gắn trên array. Trong khi đó, những vấn đề tin sinh học liên quan đến việc gán (matching) dữ liệu phổ sắc ký MS với cơ sở dữ liệu về trình tự protein. Dự đoán cấu trúc protein Dự đoán cấu trúc là một ứng dụng quan trọng nữa của tin sinh học. Có thể dễ dàng xác định trình tự acid amin của protein từ trình tự gen mã hóa cho nó. Nhƣng protein chỉ có chức năng khi nó có cấu trúc bậc hai, bậc ba, bậc bốn. Sẽ là vô cùng khó khăn khi dự đoán cấu trúc gấp nếp này từ tình tự axit amin. Một số phƣơng pháp dự đoán cấu trúc bằng máy tính hiện đang phát triển. Trong đó ý tƣởng quan trọng trong nghiên cứu tin sinh học là về quan điểm tƣơng đồng. Với kỹ thuật mô phỏng tƣơng đồng (homology modeling), thông tin này đƣợc dùng để dự đoán cấu trúc của một protein khi đã biết cấu trúc của một protein khác tƣơng đồng với nó. Hiện tại, đây là cách dự đoán cấu trúc protein đáng tin cậy nhất. Các hệ thống sinh học kiểu mẫu Sinh học hệ thống bao gồm việc sử dụng khả năng mô phỏng bằng máy tính (computer simulation) các hệ cơ quan tế bào để có thể phân tích và hiển thị hóa (visualize) việc kết nối phức tạp của các quá trình. Sự sống nhân tạo (artificial life) hay tiến hóa ảo nổ lực nhằm tìm hiểu quá trình tiến hóa thông qua việc mô phỏng bằng máy tính các dạng sự sống (nhân tạo) đơn giản. Phân tích hình ảnh mức độ cao 28 Các kỹ thuật tính toán cũng đƣợc dùng để tăng tốc độ hoặc giúp tự động hoàn toàn quá trình xử lý định lƣợng, và phân tích một lƣợng lớn hình ảnh sinh học có chứa- thông- tin-cao. Các hệ thống xử lý ảnh hiện đại tăng cƣờng khả năng quan sát để giúp cho việc tính toán từ môt tập lớn và phức tạp các hình ảnh bằng cách cải tiến độ chính xác, tính khách quan, hay tốc độ. Một hệ thống phân tích đƣợc phát triển hoàn thiện có thể thay thế hoàn toàn ngƣời quan sát. Các công cụ phần mềm Một trong những công cụ dùng trong sinh học tính toán nổi tiếng nhất là BLAST, một giải thuật để tìm kiếm các trình tự acid nucleic hoặc protein tƣơng đồng lƣu trữ trên các cơ sở dữ liệu. Ba nguồn cơ sở dữ liệu công cộng lớn nhất (thƣờng đƣợc gọi là ngân hàng gen) là NCBI, EMBL, DDBJ. Các ngôn ngữ lập trình của máy tính nhƣ Perl và Python thƣờng đƣợc dùng để giao tiếp (interface) và ly trích (parse) dữ liệu từ các ngân hàng cơ sở dữ liệu sinh học (biological database) thông qua những chƣơng trình tin sinh học (bioinformatics program). Cộng đồng những lập trình viên sinh tin học đã triển khai nhiều dự án phần mềm mã nguồn mở (free/open source) nhƣ EMBOSS, Bioconductor, BioPerl, BioPhyton, BioRubi, BioJava. Điều này giúp cho việc chia sẻ, phát triển và phổ biến các công cụ lập trình và tài nguyên lập trình (programming objects) giữa các nhà tin sinh học. 29 Phần 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu 3.1.1 Thời gian nghiên cứu Đề tài đƣợc bắt đầu tiến hành nghiên cứu từ tháng 3 năm 2006 và phải hoàn thành vào ngày 15 tháng 8 năm 2006. 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và công cụ nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là toàn bộ EST (Expressed Sequence Tags) của của tất cả các loài ong cho mật (tính đến ngày 14-06-2006), hiện đã đƣợc công bố trên các ngân hàng cơ sở dữ liệu nhƣ NCBI, EMBL, DDBJ. Trong số trình tự EST này, sẽ có một số lƣợng nhất định các trình tự đơn lặp lại (Simple Sequence Repeats, SSRs). Trong số microsatellite tìm đƣợc có những microsatellite có đặc điểm đặc trƣng, đƣợc ứng dụng làm marker microsatellite. Và trên thực tế hiện nay marker microsatellite đang đƣợc sử dụng nhiều trong các dự án nghiên cứu nhƣ lập bản đồ bộ gen của các loài ngũ cốc, trong dự án genome ngƣời (Human Genome Project) và nhiều nghiên cứu khác trong việc phân tích, so sánh đặc điểm di truyền của các loài sinh vật. 3.2.2. Công cụ nghiên cứu Máy tính IBM với hệ điều hành window server 2003 và hệ điều hành Linux (phiên bản Fedora core 1) Internet truy cập cơ sở dữ liệu thế giới Trình biên dịch Active Perl 5.6 30 Phần mềm soạn thảo lập trình Perl: Ultraedit, Notepad Phần mềm thiết kế mồi Primer3 (Primer.exe) Các phần mềm thiết kế mồi với mã nguồn mở hiện đang có trên mạng: PrimerQuest. DNAClub, PDA… Phần mềm Blastall Phần mềm Formatdb Phần mềm MISA, EST_TRIMMER Cùng một số công cụ, cơ sở dữ liệu khác đƣợc sử dụng để so sánh và chọn lựa phƣơng thức tối ƣu nhất cho công việc nghiên cứu. 3.3. Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 3.3.1 Quy trình nghiên cứu tổng quát Xác định phân loại Microsatellite có trong EST Thiết kế primer cho phản ứng PCR dựa trên vùng hai bên locus SSR đặc trƣng Đối tƣợng nghiên cứu (các loài ong cho mật) Công cụ nghiên cứu (các phần mềm và thiết bị cần thiết) Vật liệu nghiên cứu EST của ong cho mật 31 Phân tích, so sánh để chọn ra những primer tốt nhất Hình 3.1. Sơ đồ trình bày quy trình nghiên cứu tổng quát Để tiến hành nghiên cứu đạt đƣợc hiệu quả nhanh và tốt thì việc đƣa ra một quy trình tổng quát là rất cần thiết. Việc thiết lập nên quy trình này giúp cho công việc nghiên cứu có một kế hoạch tƣơng đối và sẽ bố trí đƣợc công việc thực hiện trong các phân đoạn đƣợc tiến hành song song, có hiệu quả, đạt đƣợc kết quả trong thời gian sớm nhất và kết quả tốt nhất. Sau đây là qui trình nghiên cứu tổng quát, tôi đã xây dựng để hỗ trợ tốt theo những ƣu điểm nêu trên. 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.2.1. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu Bƣớc 1 Thu thập dữ liệu EST ● Script Perl ● Công cụ hỗ trợ từ NCBI Bƣớc 2 Tìm và phân loại microsatellite ● Xử lứ qua EST_TRIMMER ● Xử lý qua MISA Bƣớc 3 Thiết kế primer Tiến hành qua 6 script Perl 32 Bƣớc 4 So sánh, chọn lựa primer ● Primer3 ● Primerquest ● PDA ● DNAClub Hình 3.2. Sơ đồ các bƣớc tiến hành nghiên cứu chính Nhằm giúp cho công việc nghiên cứu đƣợc tiến hành nhanh, hiệu quả, chính xác các công việc đƣợc thực hiện lôgic việc thiết lập nên sơ đồ tiến hành nghiên cứu chi tiết từng bƣớc là điều cần làm. Công việc này là cụ thể hóa cho sơ đồ nghiên cứu tổng quát đƣợc xây dựng ở mục 3.1. Hơn thế nữa, sơ đồ nghiên cứu chi tiết sẽ giúp cho những ngƣời quan tâm đến đề tài dễ dàng hình dung, theo dõi từng công việc đƣợc làm trong đề tài. Vì mục đích đó, tôi xây dựng nên bảng đồ chi tiết trong nghiên cứu đƣợc trình bày cụ thể hình 3.2. 3.3.2.2. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu chi tiết Buớc 1: thu thập dữ liệu EST Chọn ngân hàng cơ sở dữ liệu nào có chứa nguồn EST nhiều nhất, chất lƣợng cao nhất. Vì rằng, mỗi ngân hàng cơ sở dữ liệu có số lƣợng khác nhau và mức độ trùng lắp dữ liệu cũng không loại trừ. Việc trùng lắp dữ liệu làm cho số liệu trở nên dƣ thừa không cần thiết và tốn thời gian hơn cho việc xử lý dữ liệu. Tôi sử dụng keywork “honeybee” và chọn lựa 3 ngân hàng cơ sở dữ liệu lớn nhất là NCBI, EMBL, DDBJ. Kết quả tìm đƣợc nhiều nhất trên trang NCBI với số lƣợng 24,468 trình tự EST. Bên cạnh đó, trang NCBI có trang download hỗ trợ, giúp cho ngƣời nghiên cứu có thể tải cùng lúc tất cả dữ liệu EST về máy cá nhân một cách nhanh chóng. Ngƣời nghiên cứu chỉ việc đánh từ khóa cần quan tâm và vào chọn dạng text là có thể dễ dàng tải trình tự cần nghiên cứu về máy của mình. Tuy nhiên, dạng định dạng còn phải phụ thuộc vào yêu cầu nghiên cứu cụ thể. 33 Hình 3.3. Giao diện trên trang NCBI với từ khóa “honeybee” Dùng ngôn ngữ lập trình Perl để thiết kế đoạn mã (Perl script) tải toàn bộ nguồn EST đã chọn về máy tính cá nhân. Chi tiết cấu trúc đoạn mã nhƣ sau: #!/usr/bin/perl –w # Day la day la script download du lieu EST tu NCBI ############################################## use strict; use LWP::Simple; my($path1,@content,$temp,@acc,$tam,$url); my(@raw,$undownacc,$file,$i); $path1="e:\\downpbp\\accession1.txt"; $viet=""; open(ACC,$path1)||die("Can't open file accession"); @content=; for($i=0;$i<=$#content;$i++){ $content[$i]=~s/\n{0,}\s{0,}//g; @acc=split(":",$content[$i]); $acc[1]=~s/\s{0,}//g; chomp($acc[1]); $url=" &txt=on&val="; $url.=$acc[1]; print"Trinh tu thu $acc[0] :\n"; print"$url\n"; if (@raw=get($url)){ $file="d:\\loi\\download\\database\\$acc[1].txt"; open (PBP,"+>$file")|| die("Khong luu duoc file DNA\n"); 34 print PBP @raw ; close (PBP); $viet=$acc[1]; }else{ #Neu ACCESSION nao khong tai duoc thi luu vao tap tin undown.txt print "$acc[1] tai khong duoc\n"; $undownacc = $acc[1]."\n"; $tam=$acc[1];}} $file="d:\\loi\\download\\undown.txt"; open (UNPBP, "+>$file")|| die("Khong luu duoc file DNA\n"); print UNPBP $undownacc ; close (UNPBP); Sở dĩ cần phải thiết lập đoạn mã ngoài việc tải trình tự bằng phƣơng tiện có sẵn từ trang NCBI là để dễ dàng cho việc phân loại trình tự EST có chứa microsatellite trong bƣớc thực hiện thiết kế mồi sau này. Bƣớc 2: tìm và phân loại microsatellite Tìm và phân loại microsatellite trong toàn bộ EST đã tải về máy, phải chọn lựa phần mềm tìm và phân loại phù hợp nhất, hay kết hợp các phần mềm với nhau, hay phải tự thiết kế. Đây là giai đoạn cần phải giải quyết tốt về vấn đề phân loại. Viêc phân loại thành cộng sẽ tạo thuận lợi rất nhiều cho các bƣớc tiếp sau. Nó sẽ giúp cho ngƣời nghiên cứu bƣớc đầu, xác định đƣợc tỷ lệ các dạng lặp lại, từ đó có thể loại bỏ đƣợc những dạng lặp lại không đặc trƣng, rút ngắn công đoạn nghiên cứu tiếp sau đó và làm cho việc xử lý số liệu còn lại đơn giản hơn. Trong bƣớc này, tôi sử dụng các phần mềm EST_TRIMMER và MISA. EST_TRIMMER là công cụ dùng cho việc tìm microsatellite từ EST. Ƣu điểm của EST_TRIMMER là dễ dàng thay đổi các thông số cần thiết cho việc tìm microsatellite. Vì vậy, tôi đã sử dụng EST_TRIMMER đầu tiên cho việc xác định microsatellite. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER có dạng: est_trimmer.pl [-amb=n,win] [tr5=(A|C|G|T),n,win] [-tr3=(A|C|G|T),n,win] [-cut=min,max] [-id=name] 35 [-help] Để chạy đƣợc chƣơng trình này thì cần phải thực hiện các công việc nhƣ sau: - Phải tải đƣợc script của EST_TRIMMER về máy tính cá nhân, và cần phải cài ngôn ngữ lập trình Perl ( Active Perl 5.6) vào máy. - Phải tạo một file trong đó có chứa dữ liệu EST theo định dạng FASTA. - Script của EST_TRIMMER và file chứa EST phải nằm trong cùng một thƣ mục. Hình 3.4. Cú pháp thực thi của EST_TRIMMER MISA là một công cụ dùng để tìm microsatellite. Nó đƣợc thiết kế dùng kết hợp với Primer3 trong việc tìm microsatellite và thiết kế primer vùng flanking của những locus microsatellite tìm đƣợc. Ở đây tôi chỉ ứng dụng MISA cho việc tìm microsatellite và chỉnh sửa thông số cần thiết theo yêu cầu nghiên cứu. Sở dĩ, tôi dùng MISA là vì công cụ này cho ra kết quả rõ ràng, dễ dàng cho việc phân loại tiếp sau. Và tôi không dùng cho việc thiết kế primer là vì các thông số trong thiết kế primer đã đƣợc mặc định và không thể chỉnh sửa nên không phù hợp cho mục đích nghiên cứu. Việc ứng dụng MISA không có gì phức tạp. Tuy nhiên, ngƣời mới bắt đầu thì cũng sẽ gặp một vài trở ngại. Vì vậy, trƣớc hết phải tham khảo kỹ phần readme của chƣơng trình này để có thể vận dụng vào mục đích ứng dụng của mình đƣợc. Sau đây là cách thức xử lý dữ liệu qua MISA. Trƣớc tiên, ngƣời ứng dụng cần phải đƣa script của MISA vào cùng thƣ mục với EST_TRIMMER ở trên (nếu dùng MISA cho cả việc thiết kế primer thì phải tải phần mềm Primer3_ core vào cùng thƣ mục). 36 Tiếp theo, ngƣời ứng dụng phải định dạng lại dữ liệu (dạng fasta và lƣu lại bằng một tên file mới) từ file kết quả đạt đƣợc từ việc thực thi EST_TRIMMER. Cuối cùng, ngƣời ứng dụng vào MS-DOS thực thi lệnh chạy MISA. Cú pháp để thực thi MISA có dạng: misa.pl là tên file chứa trình tự DNA theo định dạng FASTA. Hình 3.3: Cú pháp thực thi của MISA Sau khi dữ liệu đƣợc xử lý qua MISA, microsatellite đƣợc xác định và phân nhóm rõ ràng. Tất cả đƣợc lƣu trữ trong cùng một file. Việc cần làm bây giờ là tính tỉ lệ phần trăm của từng dạng microsatellite trong tổng số microsatellite và phần trăm của microsatellite với hai loại EST (5‟EST và 3‟EST). Mục đích của việc tính tỷ lệ phần trăm của từng dạng microsatellite và phần trăm của microsatellite của hai loại EST là xác định dạng microsatellite nào sẽ đƣợc sử dụng trong bƣớc thiết kế primer. Việc chọn lựa này loại bỏ đi một lƣợng lớn các dạng microsatellite nhƣng chiếm tỉ lệ rất thấp. Từ đó làm cho việc thiết kế primer sẽ đơn giản và chính xác hơn. Sau khi tính toán và chọn lựa các dạng mocrosatellite hoàn tất, việc làm kế tiếp là chuyển tất cả những dạng microsatellite chọn vào từng thƣ mục riêng biệt, chuẩn bị cho bƣớc thiết kế primer. 37 Bƣớc 3: thiết kế primer Đây là khâu rất quan trọng, primer đƣợc thiết kế phải đảm bảo nghiêm ngặt các thông số về nhiệt độ, tỷ lệ %GC, nhiệt độ chênh lệch giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc, không tạo cấu trúc kẹp tóc… của primer khi chạy phản ứng PCR. Đồng thời phải giải quyết đƣợc mức độ phức tạp của các dạng microsatellite có trong EST, có nhƣ vậy mới không bỏ sót đƣợc những microsatellite đặc trƣng. Nhiệt độ Tm của primer đƣợc thiết lập ở ba mức độ nhƣ sau: Tm = 65 - nhiệt độ cao nhất Tm = 63 - nhiệt độ trung bình Tm = 60 - nhiệt độ thấp nhất Sự chênh lệch giữa primer xuôi và primer ngƣợc tối đa là 10C Chiều dài primer có ba trƣờng hợp: Chiều dài tối đa = 28 base Chiều dài trung bình = 24 base Chiều dài tối thiểu = 20 base Phần trăm GC nằm trong khoảng từ 50% - 60% Mức độ phức tạp của các dạng microsatellite: microsatellite không chỉ có một dạng trong một EST mà trong một EST có thể có rất nhiều dạng microsatellite cùng tồn tại. Chính sự tồn tại đa dạng này làm cho công việc tìm microsatellite trở nên phức tạp hơn rất nhiều. Vì vậy, phải làm sao thiết kế đƣợc đoạn mã để đáp ứng yêu cầu thực có nhƣ trên. Công đoạn này đƣợc giải quyết qua 6 script perl cùng với sự hỗ trợ của các phần mềm Primer3, Blastall, Formatdb. Những Script Perl này đƣợc thiết lập và có thể nhúng vào các phần mềm Primer3, Blastall và Formardb. Thứ tự các script trên đƣợc sắp xếp từ 1 – 6 và thực thi các tác vụ nhƣ sau: 1_ssr_repeat_finder: thực thi tác vụ tìm và phân loại tất cả các EST có microsatellite, chuyển vào một file mới chuẩn bị cho bƣớc phân tích tiếp theo. 2_ssr_primer_designer: thực thi tác vụ thiết kế primer cho mục đích khuếch đại microsatellite chứa đựng trong một vùng trình tự. 38 3_ssr_primer_rep_check: thực thi tác vụ loại bỏ những mồi đã đƣợc thiết kế trên những trình tự lặp lại có độ phức tạp thấp. 4_ssr_primer_blast: thực thi tác vụ kiểm tra sự tƣơng thích những trình tự lặp lại đối với primer đã thiết kế 5_ssr_order_filter: thực thi tác vụ tạo ra một file chứa đựng chỉ những microsatellite có mồi duy nhất 6_ssr_order_formatter: thực thi tác vụ tạo ra một file chỉ chứa microsatellite có mồi duy nhất và cung cấp thông tin về primer một cách đơn giản, dễ quan sát. Trong đó script thứ 2 nhúng vào Primer3 trong việc thiết kế primer. Hình 3.6. Giao diện của Primer3 Primer3 là chƣơng trình thiết kế primer miễn phí. Chƣơng trình này đƣợc tạo bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên Cứu Y Sinh Học Whitehead và Trung Tâm Nghiên Cứu Genome của MTI (Whitehead Institute For Biomedical Research and Center For Genome Research). Primer3 rất dễ dàng sử dụng để thiết kế primer, nó có hàng trăm tùy chọn và có thể thay đổi đƣợc nếu ngƣời sử dụng không muốn sử dụng các thông số đã đƣợc mặc định. Để thay đổi các thông số này ngƣời sử dụng chỉ việc đƣa trình tự cần thiết kế primer của mình vào vị trí ô trống lớn nhƣ đƣợc thấy ở Hình 3.4, sau đó đƣa chuột vào các ô tùy chọn và gõ vào các thông số mong muốn của mình, tiếp theo chỉ việc ấn vào nút Pick Primers là chƣơng trình tự động thiết kế primer. 39 Tuy nhiên, vì có đến hàng trăm tùy chọn khác nhau nên để sử dụng có hiệu quả Primer3, ngƣời sử dụng cần tìm hiểu kỹ càng trƣớc khi điều chỉnh các thông số theo mong muốn là điều cần làm trƣớc tiên. Primer3 có thể sử dụng hoàn toàn miễn phí tại địa chỉ internet bin/primer/primer3_www.cgi Bƣớc 4: so sánh, chọn lựa primer Đây là buớc cuối cùng của cuộc nghiên cứu. Tuy không tốn nhiều công sức nhƣng cũng rất quan trọng. Bƣớc này với nhiệm vụ là chọn ra những cặp primer tốt nhất đảm bảo cho việc chạy phản ứng PCR đạt đƣợc kết quả nhƣ mong muốn. Trên cơ sở những cặp primer đã đƣợc thiết kế và sàng lọc ở bƣớc thứ 3, để có đƣợc những cặp primer đảm bảo là tốt nhất thì cần phải tiến hành chọn lựa lại lần cuối. Việc này đƣợc thực hiện thông qua việc kiểm tra lại các thông số của các cặp primer cùng với đó là sử dụng các phần mềm thiết kế primer khác nhƣ PrimerQuest, PDA, DNAClub. Việc sử dụng các phần mềm thiết kế primer này là nhằm so sánh tính duy nhất của primer. Từ các phân tích và so sánh này sẽ chọn lại đƣợc những cặp primer hoàn hảo nhất. Bƣớc này cần phải làm các nhiệm vụ nhƣ sau: Chọn lựa các primer đã thiết kế ở bƣớc thứ 3, kiểm tra về các thông số của từng cặp primer với các thông số đƣợc xây dựng trong chƣơng trình thiết kế primer. Thanh lọc bớt số lƣợng primer đƣợc tạo ra từ hai trình tự EST giống hệt nhau và chỉ chọn một, hay giữa hai primer để khuyếch đại cùng một sự đa hình của một dạng microsatellite có thông số thích hợp hơn. Sử dụng các phần mềm thiết kế primer để kiểm tra tính đồng nhất của primer. Tạo bảng danh sách các primer đƣợc chọn lựa cuối cùng. PrimerQuest PrimerQuest là chƣơng trình thiết kế primer đƣợc đặt trong trang web của hãng Intergrated DNA Technology (IDT) 40 ( PrimerQuest đƣợc viết lại trên nền của Primer3. Tuy nhiên, nó không giống với Primer3, giao diện của nó khác rất nhiều và có thêm nhiều tùy chon thú vị khác so với Primer3. Một trong những tiện ích hấp dẫn từ PrimerQuest đó là, ngƣời sử dụng có thể đặt thiết kế primer mình đã thiết kế ngay trên giao diện của PrimerQuest. Hình 3.7. Giao diện của PrimerQuest PDA (Primer Design Assistant) Không nhƣ hầu hết các chƣơng trình thiết kế primer đều chỉ nhận và thiết kế primer trên một trình tự DNA đƣa vào, PDA có khả năng thiết kế primer dựa trên một hay nhiều trình tự DAN đƣa vào. PDA đƣợc phát triển bởi các nhà khoa học thuộc Phân Viện Thống Kê Sinh Học và Tin Sinh Học của Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Đài Loan. PDA đƣợc sử dụng miễn phí qua internet tại trang web 41 Hình 3.8. Giao diện của PDA DNAClub DNAClub đƣợc thiết kế bởi Xiongfong Chen (xc@cornell.edu) với nhiều tính năng khác nhau. Ngƣời dùng có thể sử dụng chƣơng trình để thiết kế một bản đồ giới hạn của trình tự DNA đƣa vào, hay có thể thiết kế primer để nhân bản một trình tự DNA nào đó. Có thể sử dụng miễn phí DNAClub tại địa chỉ trang web Hình 3.9. Giao diện của DNAClub 42 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tìm kiếm và tải trình tự EST về máy tính cá nhân 4.1.1. Kết quả tìm kiếm EST Sau khi tôi kiểm tra và so sánh số lƣợng, chất lƣợng nguồn vật liệu EST từ ba ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI, EMBL và DDBJ. Kết quả, ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI có đƣợc dữ liệu EST tốt nhất. Ngoài ra, ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI còn có nhiều trang web hỗ trợ rất thuận tiện cho những bƣớc định dạng và download nguồn dữ liệu EST nầy về máy cá nhân. Kết quả tìm thấy EST trên NCBI (tính đến ngày 14-06-2006) Tổng số EST: 24468 Tổng số trang: 1233 Số EST trong một trang: 20 Số lƣợng EST là rất chênh lệch giữa các loài. Sự chênh lệch này do nhiều lý do khác nhau nhƣng yêu tố tạo nên EST là một lý do quan trọng. Có nhiều loài số lƣợng EST lại rất lớn nhƣ ở ngƣời (9572322 EST), ruồi giấm (499392 EST) . Với số lƣợng 24468 EST trên loài ong mật là một con số cho tiến hành nghiên cứu theo mục đích của đề tài là hoàn toàn khả thi. Vì thực tế đã có nhiều nghiên cứu cũng với mục đích thiết kế primer trên vùng bảo tồn hai bên microsatellite có trong EST với số lƣợng EST chỉ có vài ngàn nhƣng đã cho ra kết quả rất tốt (trên dâu tây 1800 EST-Kevin M Folta và ctv,2004; bông vải 9948 EST- Sukumar Saha và ctv, 2004) Hình 4.1: Kết quả tìm thấy EST trên NCBI 43 4.1.2. Kết quả tải trình tự EST về máy cá nhân Sau khi việc tìm kiếm và chọn lọc nguồn EST hoàn tất, công việc tiếp theo là phải tải đƣợc toàn bộ nguồn dữ liệu này về máy cá nhân. Nhƣ kết quả bên trên cho thấy, nếu thực hiện tải từng trình tự một EST về máy cá nhân thì vô cùng tốn thời gian, bởi số lƣợng rất nhiều. May mắn là trên trang NCBI có tùy chọn để download cùng lúc tất cả nguồn dữ liệu EST này. Nhƣng chỉ ở dạng text và nằm cùng trong môt file. Ngoài ra, thực tế nghiên cứu còn đòi hỏi phải thực hiện download nguồn dữ liệu này với mỗi EST vào từng file một và tên file là mã số truy cập (accession number) của EST. Do đó, cần phải lập trình để download đúng với yêu cầu nghiên cứu. Sau khi vào NCBI gõ từ khóa honeybee, tiếp theo chọn dạng text cho download, chỉ đƣờng dẫn vào trong thƣ mục cụ thể về máy cá nhân, đợi vài phút tác vụ download toàn bộ dữ liệu EST đã hoàn tất. Hình 4.2: Kết quả download với tùy chọn có sẵn của NCBI Download dữ liệu EST bằng việc thiết lập script perl. Công việc này đòi hỏi ngƣời nghiên cứu phải biết về lập trình hay có thể nhờ ngƣời biết lập trình và cố vấn về kiến thức chuyên môn của mình cho ngƣời đó để hoàn tất công việc. Sau khi thiết kế song script, đoạn mã đã thực thi công việc một cách hiệu quả và chỉ mất khoảng 30 phút cho tác vụ này. Kết quả đã download đƣợc 24648 trình tự EST, kết quả này đúng với số lƣợng EST hiện có trên NCBI. Tƣơng đƣơng với đó là việc thiết lập nên 24648 file dữ liệu EST có tên file là mã số truy cập. 44 Kết quả download không phải lúc nào cũng đạt đƣợc 100% mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ tốc độ đƣờng truyền của máy, vấn đề này có thể khắc phục đƣợc dễ dàng. Ngoài ra, một yếu tố quan trọng hơn đó là việc thiết lập nên script để thực thi tác vụ này. Nếu cách thức tổ chức các khối lệnh không tốt, không hợp lý… thì kết quả download sẽ không thƣc thi đƣợc hay thực thi không hoàn toàn. Script Perl thiết lập thực thi việc download trình tự EST đã hoạt động rất hiệu quả và hoàn thành 100% yêu cầu công việc trong thời gian tƣơng đối ngắn (30 phút). Điều này, cho thấy Script này đã đƣợc tổ chức các khối lệnh và các thƣờng trình phụ một cách chặt chẽ và tối ƣu nên đã đạt đƣợc yêu cầu đặt ra. 4.2. Kết quả tìm và phân loại microsatellite 4.2.1. Kết quả tìm microsatellite qua xử lý của EST_TRIMMER Số lƣợng EST đƣợc tải về là rất nhiều và thành phần microsatellite cũng rất phong phú. Tuy nhiên, sự phong phú của microsatellite không đồng nghĩa với hiệu quả cho mục đích nghiên cứu. Vì trong tất cả những dạng microsatellite này, có những dạng không có đủ cơ sở để làm chỉ thị hay sự đa hình là nhƣ nhau giữa các loài, các cá thể…Vì vậy trƣớc tiên cần phải xây dựng một phƣơng pháp tinh lọc những dạng microsatellite không cần đến trong việc tìm kiếm microsatellite. EST_TRIMMER là phần mềm giải quyết đƣợc yêu cầu trên. EST_TRIMMER thực thi các tác vụ nhƣ sau: Loại bỏ tất cả những EST có chiều dài ngắn hơn và dài hơn chiều dài nhỏ nhất và dài nhất đã đƣợc chọn Loại bỏ đi những dạng base N (A, T, G, C) kéo dài liên tục với giới hạn không hợp lý trong một độ dài base nhất định Loại bỏ dạng polyA/T ở đầu 5‟ và 3‟ Thiết lập nên file chứa kết quả 45 Hình 4.3: Kết quả thực thi 4 tác vụ của EST_TRIMMER EST_TRIMMER thực thi tạo ra hai file kết quả. Một file chứa kết quả tinh lọc (viet.log), một file (viet.results) chứa trình tự đƣợc chọn. File chứa kết quả đƣợc định dạng lại để tiến hành nghiên cứu xa hơn. Hình 4.4: File chứa kết quả trình tự EST đƣợc chọn 4.2.2. Kết quả xử lý qua MISA Hình 4.5: File định dạng FASTA 46 Một điều bất tiện ở EST_TRIMMER là kết quả không cho biết số lƣợng EST đƣợc chọn và bị loại bỏ là bao nhiêu. Nhƣng điều này đã có MISA giải quyết, tốt hơn thế nữa MISA còn cho ta thay đổi thêm vài thông số cần thiết mà với EST_TRIMMER chƣa thực hiện đuợc. Những tác vụ thực thi của MISA: Chọn lọc lại kích thƣớc chiều dài của EST Điều chỉnh mức độ đa hình của microsatellite. Điều chỉnh mức độ độ dài gián đoạn tối đa giữa hai microsatllite trong 1 EST Cho biết số lƣợng EST đã xử lý Cho biết số lƣợng base đã xem xét Cho biết số lƣợng microsatellite đã tìm đƣợc Cho biết số lƣợng trình tự chứa hơn 1 microsatellite Hình 4.6. Thể hiện kết quả thực thi của MISA Bảng 4.1: Kết quả xử lý của MISA KẾT QUẢ XỬ LÝ QUA MISA Tổng EST kiểm tra Tổng số base đã kiểm tra Số SSR tìm đƣợc Số EST chứa SSR Số EST chứa hơn 1 SSR Số EST chứa SSR cách nhau 100 base (interruptions) 24289 11170594 4737 3345 964 970 47 Qua bảng kết quả trên cho thấy, số lƣợng microsatellite tìm thấy là rất nhiều và cũng rất đa dạng. Không thể sử dụng hết số lƣợng microsatellite này làm móc (anchor) để thiết kế primer đƣợc. Vì nhƣ vậy sẽ không khả thi trong quá trình chọn lựa primer và mục đích nghiên cứu sẽ bị phân tán về hiệu quả. Do vậy, cần phải thực hiện thanh lọc lại trƣớc khi tiến hành thiết kế primer. Công việc thanh lọc ở đây cần làm là: ► Tính tỉ lệ phần trăm từng dạng microsatellite ► Tính tỉ lệ phân trăm 5‟EST và 3‟EST ► Chọn ra EST chứa microsatellite có tính đại diện cao Bảng 4.2 sau đây bƣớc đầu sẽ trình bày kết quả liệt kê tất cả thành phần của các dạng microstellite. Bảng 4.2: Thành phần các dạng microsatellite Các dạng microsatellite tìm đƣợc Di - Nucleotide Tri - nucleotide Tetra - nucleotide Penta - nucleotide Hexa - nucleotide AT; TA; GA; AG; CA; TC; TG; AC TAT; TTG; TCG; GAG; GAA; ATT; TCT; CTT; ATA; ATG; GGA; AGA; TTC; CTA; TGA; TGT; CTA; AGC; ACA; TCC; CAA; AAT; AGG; TTA; TAC; GAC; ACG; GAT; CGC; GCA; AAC; ACT; TAA; GGT; AAG; TAA; GCG; TCA ATAA; CCTT; GAAG; GTTC; CGAT; AAAG; TTCT; CTTT; GTAT; AAGA; TAAA; TCGT; AAAT; TGTA; AATA; ACAT; TTAA; TTTC; TACA; AGAT; GGGA; TCTTT; ATCG; TCGA; TTTA; AGCG; ATCC; CTCA; AAGG; AATA; TATT AGAAA; GAAGA; TTTTC; TCAAA; AAATA; AAATA; CTCTT; ATAAT; AAGAA; ATGAA; TATAT; TTTCT; TCGTGA; AGAGAC 48 Kiểm tra file kết quả cho thấy các dạng microsatellite chiếm tỷ lệ lớn là: dinucleotide SSR, trinucleotide SSR và tetranucleotide. Hại dạng còn lại chiếm tỉ lệ rất thấp. Cụ thể bảng kết quả 4.3 sẽ cho ta thấy rõ. Bảng 4.3. Phần trăm các dạng microsatellite Tỷ lệ phần trăm các dạng microsatellite Dinucleotide Trinucleotide Tetranucleotide Penta/hexanucleotide 36% (1705 SSR) 48% (2274 SSR) 15.6% (739 SSR) 0.4% (19 SSR) Qua bảng kết quả này nói lên một điều là sự đa hình của microsatellite hầu hết là thuộc vào ba loại di/tri/tetra-nucleotide SSR. Vì vậy vấn đề bây giờ là xác định tỷ lệ của từng loại microsatellite trong từng dạng microsatellite này. Bảng 4.4. Phần trăm các loại microsatellite chiếm tỉ lệ cao Tỷ lệ % các loại microsatellite trong 3 dạng di/tri/tetra-nucleotide SSR Dạng dinucleotide SSR Dạng trinucleotide Dạng tetranucleotide AG AT TG TA GA ATA ATT TTC AAAG TTTC 15% (256 SSR) 29% (495 SSR) 8% (136 SSR) 25% (426 SSR) 17% (290 SSR) 26% (591 SSR) 37% (841 SSR) 30% (682 SSR) 48% (355 SSR) 45% (333 SSR) Bảng thống kế cho thấy tỷ lệ phần trăm các loại microsatellite tập trung chủ yếu vào một số loại nhất định. Các loại microsatellite chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong các dạng trên không cần thiết phải liệt kê ra và cũng dễ dàng tính đƣợc là bao nhiêu theo quy tắc tam suất. Tuy nhiên việc tính những tỷ lệ này có lẽ sẽ không ảnh hƣởng gì đến kết quả của việc thiết kế primer. Khả năng chỉ thị của chúng là không khả thi vì không mang tính đặc trƣng (số lƣợng quá ít). Các loại microsatellite đƣợc liệt kê ở bảng trên sẽ đƣợc chuyển vào từng file riêng biệt chuẩn bị cho việc thiết kế primer. Về kết quả tính tỉ lệ phần trăm 5‟EST và 3‟EST, tỉ lệ tính ra là rất chênh lệch, hầu hết là 5‟EST (97% hay 3245 5‟EST). Chính vì sự chênh lệch quá lớn giữa hai 49 dạng EST hay đúng hơn là số lƣợng 3‟EST quá ít, mà việc thực hiện công việc này không đóng góp gì vào những bƣớc tiếp theo. 4.3. Kết quả thiết kế primer 4.3.1. Kết quả thiết kế primer qua 6 Script Perl Những script này đƣợc thiết kế làm việc liên tục từ script thứ 1 đến script thứ 6. Mỗi script thực hiện một chức năng riêng biêt, script thực hiện tác vụ phía trƣớc là tiền đề cho script kế tiếp thực thi tác vụ của mình. Hay output của script thứ 1 là input cho script thứ 2 và tƣơng tự nhƣ vậy đến sript thứ 6. Dữ liệu đƣợc xử lý lôgic qua từng script, các script này đƣợc thiết kế nhƣ một phần mềm tìm kiếm microsatellite, thiết kế primer, sàng lọc primer, cho ra kết quả primer cuối cùng. Việc thiết kế primer của chƣơng trình này nhờ vào Primer3, Blastall và Formatdb. Sau đây là kết quả thực thi tác vụ của từng script. ● 1_ssr_repeat_finder Script thứ nhất thực thi cho ra 3 file kết quả ► new_ids170404: liệt kê id của các trình tự có microsatellite ► ssrout170404: thể hiện mã số truy cập, trình tự EST và trình tự microsatellite ► labdbout170404: liệt kê tất cả microsatellite trong một EST, vị trí khởi đầu của microsatellite, số base của từng microsatellite và trình tự EST. Hình 4.7. Kết quả của file new_ids170404 50 Hình 4.8: Kết quả của ssrout170404 Hình 4.9. Kết quả trình diễn của labdbout170404 Trong đó ssrout170404 là input của 2_ssr_primer_designer. Ssrout170404 là một file chứa dữ liệu ở dạng text. Trong file này có 4393 EST chứa microsatellite. Số EST này là nguồn input cho script thứ hai thực thi tác vụ thiết kế primer. ● 2_ssr_primer_designer Script thứ hai thực thi tác vụ của nó cho ra 2 file kết quả. ► raw_primer3170404: in ra kết quả các thông số mặc định đƣợc thiết lập từ Primer3 và từ script thiết lập. 51 Hình 4.10. Xuất kết quả các thông số thiết lập từ script ► primer_results170404 Hình 4.11: Trình bày primer đƣợc thiết kế Số lƣợng primer đƣợc thiết kế còn khá nhiều (3417 cặp primer). Chắc chắn là không thể nào sử dụng tất cả số primer để chạy phản ứng PCR đƣợc. Tuy nhiên, vấn đề này sẽ đƣợc giải quyết qua bƣớc sàng lọc và chọn lại những cặp primer có chất lƣợng hơn qua 3_ssr_primer_rep_check. ● 3_ssr_primer_rep_check Script này lấy primer_results170404 làm input và cho ra output là rescreened170404. Script thứ 3 thực thi tác vụ chọn lọc lại primer đã đƣợc thiết kế từ 52 script thứ 2. Việc chọn lọc này sẽ cho ra những cặp mồi có chất lƣợng cao hơn (đảm bảo các thông số kỹ thuật đã thiết lập). Kết quả thực thi của 3_ssr_primer_rep_check chọn lọc ra đƣợc 175 cặp primer. Số primer này tiếp tục đƣợc xử lý qua script thứ 4 và thứ 5 để chọn ra những cặp primer cuối cùng. Hình 4.12: Trình diễn của rescreened170404 ● 4_ssr_primer_blast Script thứ tƣ này sẽ đƣợc nhúng vào Blastall nhờ chƣơng trình này gióng hàng các trình tự EST có microsatellite đƣợc chọn thiết kế primer ở script thứ 3 để tiếp tục chọn lại những trình tự có primer tốt nhất. Script này sẽ sử dụng rescreened170404 làm input và cho ra output là blastout170404. Hình 4.13: Kết quả màn hình xử lý qua 4_ssr_blast 53 ● 5_ssr_order_filter Đây là script cuối cùng thực thi tác vụ tinh lọc primer và các EST đƣợc thiết kế primer. Thành công của bƣớc này là cơ bản công đoạn thiết kế primer đã hoàn thành. Từ intput blastout170404, 5_ssr_order_filter thực thi tác vụ của mình cho ra output filter170404. Filter170404 sẽ chứa trình tự EST và primer đƣợc thiết kế từ nó. Đây là kết quả primer cuối cùng đã đƣợc chọn. Hình 4.14. Thể hiện EST và primer sau cùng ● 6_ssr_order_formatter Kết quả thể hiện những primer cuối cùng đƣợc thiết kế nhƣ đƣợc thấy phần nào ở Hình 4.14 thì chƣa thật rõ ràng. Vì vậy, script cuối cùng script thứ 6 làm nhiệm vụ định dạng lại và tách riêng một file chỉ chứa những cặp primer đƣợc chọn cùng với mã số truy cập của từng EST tƣơng ứng với primer đƣợc thiết kế, nhiệt độ Tm và kích thƣớc sản phẩm. Hình 4.15. Trình bày primer đạt đƣợc sau cùng 54 Bảng 4.5: Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR Kết quả primer của dạng dinucleotide SSR AG MX AATATTTAAGACGACCTGGCACGA CATACGTGAGGCACTTTCTCTTTC AAATTTGATGAACGGGAGAATGAA MN CGTGTCTCATCTCCTCCATTCTTT ACGAATTAATTTTTAACCATAGCGATT ATTACCAATATCGGTGCATTTGCT GA MX ACGTTGAAAATCGTAGCTCGAAAG GTTTTTGTCCTCCAGTTTCGGAT CACCTTATAATTCCACCTTCCTCG MN AAGTTTCCGTTCTCCTCGAGTTCT ACAAAACTTGTTGACTCACCCGAT TTACTCTCTCGTTCCTCTTCTCGC TC MX GAGGAAACGAGGTGTATCGGTTTA GCAACGATCTTGTCAATATACGCA TTAAACGAAGGATGATCCAAAACG AAAATCACATCAATTCCGTTATCTTTTT TCGATGCCAGTTTCGTTATTTCTT MN GGAGAGAATGAAAGAAAGTGCGAA ATAGAGGGAGAGCGTGAGGAAGAG GAGGACCTCAAGTGAACTGGGATA GGGATTACCGGTTAGCTCGATTAC TATGCGTATATCTCAGCGTACGGA AT MX CGGCTTTCGAGAACAAAATAAAAA TTTCTGAAAGAAGAAATCGGTTTGAG GGAACCAATCGTTGTTTCTCGTAT GGAACCAATCGTTGTTTCTCGTAT CGACAGCTAGGTGATTTCTATCCG ACCTTTCCTCTCGCTATCCAATTC MN GCTCGACCCATTACTTTCTTCCTT CATCAAAGAGGGCAAGAAATGGTA ACAAGATCAATGCCACGTCTTTTT ACAAGATCAATGCCACGTCTTTTT CTAAGTAATAAATCGTCGAGCCGC GCTCAGGCGATTGAGATTTAAGTG TA MX AGCTTAGCCAGCGAATTAATTTAAGA TGAACGAACAAATATGAGAAAGCG MN TAACGAACGTCGACGGTTAAAAA GGGTGGTCACTCCGATGTAGTAAT 55 Bảng 4.6: Kết quả primer của dạng trinuclotide SSR Kết quả primer của dạng trinucleotide SSR ATA MX TTCTCTTCGTTTCTTTCTTGCGTT TTCTTAGACGAATACAAAGAGGACAAAA TCGTTGATTCAAGAGAAAGAGAGGA ACCGTGAACATATCAAGGCGTATT MN CTTCAAGTGGGATAAGGTACGTCG CTTGAACTCTGAAATAACGCCGA GGCCTTCCAATCAACTCGAATAA AATCTTTTACTCGTCGTTGCTTCG TTC MX AGGTTCGATGAATTTTTCCAAAGG TTTTACGTCATCCGGTACATCAAG GTGTCGCAAGACCGTTCTTTTT ACGTGGCGAATAATTGCCTTACT AATTGGTCAATTGGTGTGTTGAAA MN TTCGAATCGAGGAATCAATAAAACA TTCTCGTTTGTTTCATTGTTTTCG CCAGAAGCACGTGTAAAACATCAA GATAAATTGCCATTGCCACGAT CCCCCTTCCCCTAATTGTAATTTT ATT MX TTCTCTTCGTTTCTTTCTTGCGTT TTCTTAGACGAATACAAAGAGGACAAAA TCGTTGATTCAAGAGAAAGAGAGGA ACCGTGAACATATCAAGGCGTATT MN CTTCAAGTGGGATAAGGTACGTCG CTTGAACTCTGAAATAACGCCGA GGCCTTCCAATCAACTCGAATAA AATCTTTTACTCGTCGTTGCTTCG 56 Bảng 4.7: Primer của dạng tetranucleotide SSR Trong đó MX:mồi xuôi, MN: mồi ngƣợc; chiều primer 5‟-3‟ 4.3.2. Kết quả so sánh và chọn lọc primer đƣợc thiết kế Kết quả cuối cùng đƣợc chọn này đƣợc chọn lọc lại sau khi tiến hành đƣa những trình tự EST của primer đã đƣợc thiết kế ở phần 4.3.1vào thiết kế lại ở các phần mềm thiết kế primer Primer3, PrimerQuest, PDA, DNAClub và dựa trên kích thƣớc sản phẩm, nhiệt độ chênh lệch giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc. Bảng 4.8 và bảng 4.9 là kết quả các cặp primer (9 cặp) của dạng dinucleotide và tri/tetra-nucleotide đƣợc chọn sau cùng khi sử dụng các phần mềm thiết kế primer đã đƣợc giới thiệu ở trên, cùng với đó là việc phân tích căn cứ trên các thông số nhƣ chiều dài sản phẩm, tỷ lệ GC%, nhiệt độ Tm của primer… Kết quả thiết kế primer của các phần mềm là khác nhau, chỉ có Primer3 là có tỉ lệ giống nhau cao nhất. Điều này cũng dễ hiểu, bởi vì mỗi chƣơng trình có các thông số kỹ thuật đƣợc thiết lập dựa trên các tiêu chuẩn khác nhau, đối tƣợng khác nhau. Vì vậy khi đƣa các trình tự EST chứa các SSR đã đƣợc thiết kế primer bằng bằng 6 Script Perl vào thiết kế primer trên các phần mềm thiết kế này thì cho ra các kết quả khác nhau. Kết quả primer của dạng tetranucleotide SSR AAAG MX TTCTCTTCGTTTCTTTCTTGCGTT TTCTTAGACGAATACAAAGAGGACAAAA TCGTTGATTCAAGAGAAAGAGAGGA MN CTTCAAGTGGGATAAGGTACGTCG CTTGAACTCTGAAATAACGCCGA GGCCTTCCAATCAACTCGAATAA TTTC MX ACTCGCCTTGTAAATTGGACGATA TGGCAAATGGAAAGAGAAGAAAGA CGTTCCTTCTTTCCTTCCTTTTTC TGGAGAGAAGAAAAGATCCCAATG MN GCGAAACGAAAAGTAGGAAACAAA GAAAAAGGAAGGAAAGAAGGAACG TGCTTCACGACACGCAATACTAAT CGGTAAAAATTGTGCGTCGTTAAT 57 Bảng 4.8: Kết quả primer sau cùng của dạng dinucleotide SSR Kết quả primer chọn lọc từ dạng dinucleotide SSR AG MX CATACGTGAGGCACTTTCTCTTTC MN ACGAATTAATTTTTAACCATAGCGATT GA MX ACGTTGAAAATCGTAGCTCGAAAG AAGTTTCCGTTCTCCTCGAGTTCT TC MN GCAACGATCTTGTCAATATACGCA ATAGAGGGAGAGCGTGAGGAAGAG AT MX ACCTTTCCTCTCGCTATCCAATTC GCTCAGGCGATTGAGATTTAAGTG TA MN TGAACGAACAAATATGAGAAAGCG GGGTGGTCACTCCGATGTAGTAAT Bảng 4.9: Kết quả primer đƣợc chọn của dang tri/tetra-nucleotide SSR Kết quả primer chọn lọc của dạng trinucletotide SSR ATA MX GATTCATGTGTTGGTCGCTGAATA MN CCCTCTCCCTGTTCCTCTCTTTTA TTC MX AGGTTCGATGAATTTTTCCAAAGG MN TTCGAATCGAGGAATCAATAAAACA Kết quả primer chọn lọc của dạng tetranucleotide SSR AAAG MX ACCGTGAACATATCAAGGCGTATT MN AATCTTTTACTCGTCGTTGCTTCG TTTC MX ACTCGCCTTGTAAATTGGACGATA MN GCGAAACGAAAAGTAGGAAACAAA Do đó, việc chọn lọc lại primer đƣợc căn cứ chủ yếu dựa vào Primer3 và kết quả cuối cùng của 6 Script Perl. Kết quả này cho thấy tính độc lập và ý đồ riêng trong nghiên cứu với từng đối tƣợng cụ thể. Và việc chọn lựa kết quả sau cùng tùy vào chủ ý của ngƣời nghiên cứu. 58 Bảng 4.10: Trình bày loại và mã số truy cập EST Loại microsatellite và mã số truy cập EST của các primer đã chọn Loại microsatellite Mã số truy cập AG CK631623 GA BP874879 TC BI502843 AT BP538128 TA BI517251 ATA BP874541 TTC BP875475 AAAG BI510009 TTTC BI514563 Để dễ dàng trong việc tìm và kiểm tra lại tính chính xác những cặp primer đã đƣợc thiết kế, tôi thiết lập nên bảng 4.10. Bảng 4.10 cho thấy những loại microsatellite và mã số truy cập của các EST tƣơng ứng chứa các loại microsatellite này. 59 Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 5.1.1. Sơ đồ phƣơng pháp thực hiện Từ quá trình thực hiện tôi xin đề xuất sơ đồ phƣơng pháp thực hiện cụ thể cho việc khai thác dữ liệu, xử lý và thiết kế primer đối với các SSR tìm đƣợc nhƣ sau EST từ NCBI Script Perl (Bƣớc 1 mục 3.2) Download sử dụng công cụ hỗ trợ từ NCBI Sử dụng phần mềm Phân loại EST lần 1 EST_TRIMMER EST đã đƣợc phân loại lần I Sử dụng phần mềm Phân loại EST lần 2 MISA Sử dụng 6 script Perl Chọn lọc primer lần 1 Primer chƣa chọn lọc Sử dụng DNA Club, Primer3, PrimerQuest Chọn lọc primer lần 2 Hình 5.1. Qui trình nghiên cứu thiết kế primer Trình tự EST EST chứa microsatellite Primer tốt nhất 60 5.1.2. Kết quả đạt đƣợc Đã tải đƣợc 24648 trình tự EST (mất khoảng 30 phút) Qua quá trình tìm và phân loại bƣớc đầu microsatellite, kết quả đã xác định ۰ 4737 microsatllite ۰ 3345 EST chứa microsatellite ۰ 964 EST chứa hơn 1 microsatellite ۰ 100 dạng interruptions Xác định đƣợc tỉ lệ các dạng microsatellite chiếm tỷ lệ cao ۰Dạng dinucleotide SSR: 36% (1705 SSR) ۰Dạng trinucleotide SSR: 48% (2274 SSR) ۰Dạng tetranucleotide SSR: 15,6% (739 SSR) Từ các dạng microsatellite chiếm tỷ lệ cao đã xác định đƣợc các loại microsatellite tin cậy cho việc thiết kế primer: ۰Dạng dinucleotide có các loại: AG, GA, TC, AT, TA ۰Dạng trinucleotide có các loại: ATA, ATT, TTC ۰Dạng tetranucleotide có các loại: AAAG, TTTC Kết quả thiết kế và chọn lọc primer đã chọn ra đƣợc 9 cặp primer đảm bảo các yêu cầu về các thông số cho primer khi thực hiện phản ứng PCR. 5.2. Đề nghị Cần tiến hành kiểm tra các cặp mồi này bằng thực nghiệm để kiểm tra hiệu quả cao nhất của đề tài Kết quả thành công nên mở rộng đối tƣợng nghiên cứu Nên tăng cƣờng đầu tƣ và xây dựng một chuyên ngành về lĩnh vực Bioinformatic tại Trung Tâm, việc này sẽ đóng góp rất lớn đến hiệu quả nghiên cứu của Trung Tâm. 61 Phần 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1.Bùi Chí Bửu - Nguyễn Thị Lang-1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc căn dbản trong chọn giống cây trồng – Nhà xuất bản Nông Nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 278 trang 2. CN. Lƣu Phúc Lợi, 2006. Bài giảng tin - sinh học ứng dụng, 37 trang