Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đước đôi (rhizophora apiculata blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ VÕ CÔNG DANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM TẠ Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy sinh tất cả vì con. Cảm ơn các anh em, những ngƣời luôn tạo động lực cho tôi tiến lên. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa cùng các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học. Chân thành cảm ơn! Võ Công Danh iv TÓM TẮT VÕ CÔNG DANH, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ rất có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là cấp thiết nhằm bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Những kết quả đạt đƣợc Thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc với những đặc điểm hình thái khác nhau Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá đƣớc Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá đƣớc Xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây đƣớc Kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7%. Phân tích kết quả RAPD với phần mềm NTSYSpc cho kết quả nhƣ sau: các mẫu đƣớc trồng cùng năm có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu đƣớc trồng năm 1978 và năm 1980 có hệ số đồng dạng di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83. Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 và trồng năm 1996 có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi nguồn giống tại chỗ và nguồn giống Cà Mau có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67. ( II ) ( III ) v SUMMARY VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007. “DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE BY RAPD-PCR” Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp forest eco-conservation area has a high economic and environmental value. Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop this area in a sustainable way. Obtained results were: Collected 40 samples of Rhizophora apiculata Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5 polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made up 83,3 percents and 16,7 percents of bands. Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results: Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00. Compare R. apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a similarity from 0,50 to 0,83. The similarity of local R. apiculata and the one planted in 1991 or in 1996 is 0,50. While the local R. apiculata and the one from Camau plants had long distance from 0,33 to 0,67. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG LỜI CẢM TẠ .................................................................................................................. iii TÓM TẮT ....................................................................................................................... iv SUMMARY ..................................................................................................................... v MỤC LỤC ....................................................................................................................... vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ................................................................................... xi Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1 1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài ...................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ........................................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 1.2.3. Giới hạn đề tài .................................................................................................. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................................ 3 2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 3 2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................... 5 2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................ 6 2.2. Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi ....................................... 8 2.2.1. Hình thái học .................................................................................................... 8 2.2.2. Phân bố ............................................................................................................. 9 2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc ...................................................................................... 9 2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật .............................................................................. 9 2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA .............................................................................. 11 vii 2.4. PCR (Polymerase chain reaction) ........................................................................... 12 2.4.1. Khái niệm ....................................................................................................... 12 2.4.2. Nguyên tắc ..................................................................................................... 13 2.4.3. Ứng dụng ........................................................................................................ 13 2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm ......................................................................................... 13 2.5. Đa dạng di truyền .................................................................................................... 14 2.5.1. Khái niệm ...................................................................................................... 14 2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền ........................................................... 14 2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) ..................................................................... 15 2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ................................... 16 2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .................................... 17 2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .......................................... 18 2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc ...................................... 21 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ........................................ 22 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện .............................................................................. 22 3.1.1. Thời gian thực hiện ......................................................................................... 22 3.1.2. Địa điểm thực hiện ......................................................................................... 22 3.2. Vật liệu thí nghiệm .................................................................................................. 22 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi .................................................................................................. 22 3.2.2. Hoá chất thí nghiệm ........................................................................................ 23 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm ................................................................................ 24 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................................... 25 3.3.1. Bố trí thí nghiệm ............................................................................................. 25 3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 25 3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích ................................................................................. 28 3.3.4. Kỹ thuật RAPD ............................................................................................... 30 viii 3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS ....... 34 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 36 4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................................................................................................. 36 4.2. Bảo quản mẫu ..................................................................................................................... 36 4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA ..................................................................................... 37 4.4. Kết quả phản ứng RAPD – PCR ......................................................................................... 44 4.4.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................................. 44 4.4.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................................. 45 4.4.3. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................. 45 4.4.4. Thí nghiệm 4 .............................................................................................................. 46 4.4.5. Thí nghiệm 5 .............................................................................................................. 47 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................................... 51 5.1. Kết luận ............................................................................................................................... 51 5.2. Đề nghị ................................................................................................................................ 51 TÀI LIÊU THAM KHẢO ......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ............................................................................................................ 53 TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI ........................................................................................... 54 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A, T, G, C, U: Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine, Uracine bp: Base pair CTAB: Cetyltrimethyl Ammonium Bromide dNTP: Deoxynucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleic acid EB: Extraction Buffer EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid ng: Nanogram OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA SDS: Sodium Dodecyl Sulfate SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA TE: Tris EDTA Tm: Melting temperature UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UBND: Ủy ban Nhân dân UV: Ultra Violet x DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................................... 4 Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD ...................................................................... 19 Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đƣớc đôi ......................................................................... 23 Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ ................................................................. 36 Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) ...................................................................... 40 Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3). ................................... 40 Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .......................................................................................................... 41 Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu lá đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................................................................... 41 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................................................................... 44 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ ở thí nghiệm 2 ................................... 45 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 ở thí nghiệm 3................. 45 Hình 4.9 Sản phẩm PCR thử nghiệm 2 primer OPAC10 VÀ OPA10 ........................... 46 Hình 4.10 Sản phẩm PCR của 10 mẫu đƣớc ở thí nghiệm 5 ......................................... 47 Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển ngập mặn Cần Giờ ............................................................................................... 48 ( I ) ( II ) xi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc ...................................... 12 Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ............ 15 Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ................................................................. 30 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD .................................... 31 Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 ....................................................................................................... 32 Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD với primer OPAC10 ....................................................................................................... 33 Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD với primer OPA10 và OPAC10. ........................ 33 Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng trong phản ứng RAPD .................... 33 Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đƣớc (Lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD ..................................................................................................... 42 Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đƣớc dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD .................................................................................................... 43 Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đƣớc đôi theo quy trình 3 ...................................... 39 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Đƣớc đôi hay đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh tế và môi trƣờng. Gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói [13]. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Rừng đƣớc sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác các khu rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. [5] Trong chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập măn Cần Giờ đã bị hủy diệt hoàn toàn bởi hàng chục ngàn tấn bom đạn, hàng triệu lít hóa chất khai quang đã rải xuống gây thiệt hại vô cùng nghiêm trọng về tài nguyên và môi trƣờng sinh thái. Từ năm 1978, Thành phố tiến hành khôi phục lại hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ với hầu hết giống đƣớc đƣợc thu mua ở Năm Căn (Cà Mau). Qua 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ” vào ngày 21/01/2000 [5]. Trƣớc áp lực là khu dữ trữ sinh quyển thế giới cùng với những vai trò vô cùng quan trọng về kinh tế và môi trƣờng thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi là vô cùng cấp thiết. Trên cơ sở đó, các cơ quan chức năng sẽ có chiến lƣợc bảo vệ, quản lý và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ theo hƣớng đa dạng sinh học. Rừng đƣớc trồng thuần rất nhạy cảm và dễ bị tổn hại khi có những tác động bên ngoài. Mặt khác chúng ta cũng có thể tìm ra các chỉ thỉ phân tử nhằm rút ngắn thời gian cho quá trình chọn giống, tạo giống phục vụ cho công tác trồng rừng, đảm bảo cho sự phát triển bền vững. 2 Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy Bùi Minh Trí, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích, yêu cầu, giới hạn của đề tài 1.2.1. Mục đích Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây đƣớc đôi. Xác định đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi tại khu dữ trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 1.2.2. Yêu cầu Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số từ mẫu lá đƣớc Nắm vững kỹ thuật RAPD, hạn chế sai sót khi thực hiện Hiểu rõ phần mềm NTSYSpc 2.1 1.2.3. Giới hạn đề tài Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu đối với quần thể đƣớc tại một số tiểu khu trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chỉ tiến hành kiểm tra 2 primer chọn lọc dùng trong RAPD Thời gian thực hiện từ ngày 08/05/2007 đến 30/08/2007. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai - Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh có tọa độ địa lý nhƣ sau: Vĩ độ Bắc 10022’14’’ – 10037’9” Kinh độ Đông 106046’12’’ – 107000’59’’ Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp Biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Khí hậu Cần Giờ có hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 - 10 và mùa nắng từ tháng 11 – 4. Nhiệt độ trung bình 25,80C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.300 – 1.400 mm/năm. [5] Trƣớc kia rừng ngập mặn Cần Giờ che phủ một vùng khoảng 40.000 ha; Tài nguyên động thực vật, thủy sản nƣớc lợ hết sức phong phú, đa dạng. Tán rừng dày kín, cây rừng cao trung bình trên 20 m, đƣờng kính 25 – 40 cm. Đƣớc (Rhziophora apiculata) là loài chiếm ƣu thế, cùng với các loài khác nhƣ bần trắng (Sonneratia alba), mấm trắng (Avicennia alba), đƣng (Rhizophora mucronata), vẹt (Sonneratia alba), xu (Xylocarpus spp.), cóc (Lumnizera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria aagallocha). Trong thời gian chiến tranh chống Pháp và đặc biệt trong thời kỳ chống Mỹ , bom đạn cùng các loại chất độc hóa học đã hủy hoại gần nhƣ toàn khu rừng này. Đến 1978, Thành ủy và UBND Thành phố Hồ Chí Minh chỉ đạo ngành Lâm Nghiệp, UBND huyện Cần Giờ phục hồi lại hệ sinh thái rừng ngập mặn đa dạng độc đáo này. Hiện nay, rừng ngập mặn Cần Giờ có trên 30.000 ha, chiếm 17% diện tích tự nhiên của toàn Thành phố và 46% diện tích của toàn huyện Cần Giờ.[5] 4 Thảm thực vật Cần Giờ là môi trƣờng sống cho nhiều loài động vật; Theo thống kê năm 1999 nhƣ sau: Khu hệ động vật thủy sinh không xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ, 19 bộ, 6 lớp, 5 ngành. Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ và 13 bộ. Ghi chú: Vùng đệm Vùng lõi Vùng chuyển tiếp Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5 Khu hệ động vật có xƣơng sống trên cạn có 9 loài lƣỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam nhƣ tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus), rắn cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn hổ mang (Naja naja), rắn hổ chúa (Ophiophagus), vích (Chelonia), cá sấu hoa cà (Crocodylus posus) [5] Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nƣớc và 79 loài không phải là chim nƣớc sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau. 2.1.2. Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Theo báo cáo về diễn biến môi trƣờng Việt Nam năm 2005 của tổ chức SIDA, phần đa dạng sinh học đã đánh giá: “Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ, nằm ở huyện ven biển phía Nam Thành phố Hồ Chí Minh, đã trở thành một trong những điểm phục hồi rừng ngập mặn lớn nhất thế giới. Khu này có diện tích 75.740 ha, gồm chủ yếu là rừng ngập mặn, với trên 200 loài động vật và thực vật nƣớc mặn và nƣớc lợ”. Tổng diện tích 75.740 ha đƣợc phân chia thành 3 vùng: vùng lõi, vùng đệm và vùng chuyển tiếp. [5] 2.1.2.1. Vùng lõi Tổng diện tích: 4.721 ha gồm các tiểu khu 3, 4b, 6, 11, 12, 13 với sự đa dạng cao về thực vật, động vật và các dạng sinh cảnh của rừng ngập mặn. Các chức năng chính: Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn cả rừng trồng và rừng tự nhiên. Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn và các môi trƣòng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc. Bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên cả các loài thực vật lẫn động vật. Nghiên cứu khoa học 6 Du lịch sinh thái (Phải có giới hạn). [5] 2.1.2.2. Vùng đệm Tổng diện tích: 37.339 ha bao gồm các tiểu khu 1, 2, 4a, 5, 7, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24. Chức năng: phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ƣu thế, bao gồm: Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển. Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hoá nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái. Các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng trong vùng này cho cƣ dân địa phƣơng. 2.1.2.3. Vùng chuyển tiếp Tổng diện tích: 29.310 ha bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ cả các khu lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ biển dọc theo ven biển Cần Thạnh, Long Hoà, Lý Nhơn. Chức năng: Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên nhiên cần phải đƣợc hài hòa. Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu mở rộng không gian có sẵn nhƣ môi trƣờng sống cho các loài thú hoang dã từ vùng đệm. [5] 7 2.1.3. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ vừa là “lá phổi” vừa là “quả thận” có chức năng làm sạch không khí và nƣớc thải từ các Thành phố công nghiệp từ thƣợng nguồng sông Đồng Nai – Sài Gòn trƣớc khi ra Biển Đông. Tán cây rừng dày kín là một nhà máy khổng lồ hấp thụ CO2 và cung cấp nguồn O2 quan trọng cho Thành phố, đƣợc gió mùa Đông Nam góp phần thổi từ biển vào Nội thành nơi đang bị ô nhiễm trầm trọng. Theo số liệu khoa học của đề tài nghiên cứu “Phát triển mảng xanh đô thị Thành phố Hồ Chí Minh Đến 2010”, tính trên diện tích 20.000 ha rừng trồng ở Cần Giờ trong suốt 25 năm qua, lƣợng CO2 do cây rừng hấp thu đƣợc là 10.164.440 tấn, lƣợng O2 sinh ra là 6.776.296 tấn.[5] Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trƣờng lý tƣởng lọc nƣớc thải từ Thành phố Hồ Chí Minh, các khu công nghiệp Bình Dƣơng, Biên Hòa đƣa xuống trƣớc khi ra biển. Số lƣợng nƣớc thải hàng năm đƣa xuống rừng Cần Giờ là 587.000 m3. [5] Các loài vi sinh vật trong đất, trong nƣớc sinh sôi phát triển nhƣ vi khuẩn, nấm sợi, nấm men. Chúng có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ rơi rụng, các xác bã động thực vật, khoáng hóa thành các chất dinh dƣỡng, thức ăn cung cấp cho các loài động thực vật rừng ngập mặn. Đặc biệt một số loài nấm sợi, nấm men có khả năng phân giải dầu DO rất mạnh, làm cho nguồn nƣớc bị ô nhiễm trở nên trong sạch. [5] Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trƣờng cung cấp thức ăn và bảo vệ các loài thuỷ sản sinh sôi, phát triển. Cây rừng có tác dụng điều hoà nhiệt độ nƣớc và không khí. Nguồn lợi thủy sản xuất khẩu của Cần Giờ mang lại là rất lớn. Hàng năm đạt từ 400 - 500 tỷ đồng, góp phần quan trọng nâng cao đời sống nhân dân vùng rừng Cần Giờ. [5] Sau khi rừng Cần Giờ đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển của thế giới, lƣợng du khách đến tham quan, nghỉ ngơi, học tập và nghiên cứu khoa học ngày càng tăng và số tiền thu đƣợc mỗi năm hàng chục tỷ đồng. Các hoạt động du lịch 8 sinh thái đã và đang tăng lên, tạo ra thêm nhiều công ăn việc làm nâng cao đời sống ngƣời dân. [5] 2.2 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi Giới: Plantae Nhóm: Tracheophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Rhizophorales Họ: Rhizophoraceae Giống: Rhizophora Loài: Rhizophora apiculata 2.2.1. Hình thái học Thân: cây cao 20 – 30 m, đƣờng kính có thể đạt tới 50 cm vỏ đen hay nâu sậm với các đƣờng nứt ngang vòng qua thân, gỗ màu đỏ có đƣờng tỷ, rễ phụ hình chân nôm có thể cao tới 1,5 m. Lá: lá hình bầu dục và dài 15cm, rộng 6 cm, đầu nhọn, gân chính. Cuống lá màu đỏ dài từ 1,5 – 3 cm, lá phụ màu hồng hay hơi đỏ dài từ 4 – 8 cm có tác dụng bảo vệ lá non. Hoa: hoa tự tán mọc ở nách lá, hoa không cuống kích thƣớc từ 3 – 4 mm xuất phát từ các búp hình noãn dài 15 – 20 mm, lá nhỏ cong lên đầy thịt có kẻ hở hình răng bao vòng phần dƣới của hoa. Đài hoa có cánh cong vào trong, nhọn, dài 10 – 14 mm, rộng từ 6 – 8 mm. Cánh đài hơi nhọn, mỏng không có lông, xoay quanh một nhuỵ đối diện dài 8 – 11 mm. Nhụy có 4 ở ngoài cánh hoa và 4 ngoài đài hoa không cuống nhọn, dài từ 6 – 7,5 mm, bầu noãn bán hạ phần trên cao hơn mặt đĩa từ 1,5 – 2,5 m, vòi nhuỵ dài từ 0,5 – 1 mm đầu bị chẻ đôi. Đƣớc trổ bông sau 5 – 6 năm vào tháng 4 – 5 đầu mùa mƣa. [9] Trái: màu xanh, khi già có màu nâu hoặc hồng dài từ 20 – 25 cm, phần dƣới phình ra, phần trên đƣợc bao bởi một ống trùm lên lá non phủ xuống 2 – 3 cm. Đầu 9 chóp có một mũi tà màu hơi hồng khi trái chín., mùa rụng trái thƣờng xảy ra từ tháng 7 – 9 hàng năm. Thời gian bắt đầu ra hoa đến lúc trái thuần thục thƣờng kéo dài 36 tháng, có khoảng 40 – 50 trái/kg. Trái nảy mầm trong một tuần lễ sau khi trồng. 2.2.2. Phân bố Đƣớc (Rhizophra apiculata) là loài cây mọc chủ yếu ở rừng ngập mặn, vùng cửa sông ven biển khu vực nhiệt đới. Rừng ngập mặn phồn thịnh nhất là ở Đông Nam Á nhƣ Malaysia, Indonesia, Thailand, Nam Việt Nam, Campuchia, Philippin. Đƣớc thích mọc trên đất phù sa cận sinh đã đƣợc bần (Sonneratia alba), mấm (Avicennia alba) cố định. 2.2.3. Vai trò của rừng đƣớc Đƣớc là loài cây có sinh khối lớn, gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Đƣớc sau khi trồng 15 năm có thể thu đƣợc 15 tấn gỗ/ha [13]. Rừng đƣớc sản sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc hóa, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Hơn thế nữa các khu rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm. 2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng 10 là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền). Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thủy phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-1980C). Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (Phá vỡ hóa học). Bƣớc 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (Nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (Chloroform, nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 24/1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại. Bƣớc 3: tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. [3] 11 Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.3.1. Đánh giá chất lƣợng DNA 2.3.1.1. Định lƣợng DNA bằng quang phổ Sau khi ly trích, chất lƣợng DNA đƣợc xác định bằng máy soi màu ở độ dài sóng 260nm. DNA trong dung dịch (1mg/ml) sẽ hấp thu sóng 260 nm. Một đơn vị OD trong điều kiện sóng 260 nm (OD260) sẽ cho kết quả nồng độ DNA ở 50 μg/ml của DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid tinh sạch. Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị hấp thu bƣớc sóng 280 nm (OD280). Tỷ số OD260/OD280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất nhƣ phenol hoặc protein. Tỷ số OD260/OD280 là 1,8 đối với DNA tinh khiết. 2.3.1.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của acid nucleic là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodiester của các sợi acid nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một giá thể bán rắn gọi là gel có tác dụng phân tách các phân tử acid nucleic theo kích thƣớc. Các phân tử acid nucleic đi qua những lỗ nhỏ trong gel, kích thƣớc phân tử càng lớn thì di chuyển càng chậm trong gel. Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Tùy theo kích thƣớc các phân tử cần phân tích ngƣời ta sử dụng 1 trong 2 loại gel: Polyacryamid: phân tích DNA sợi đơn kích thƣớc dƣới 500 bp. Gel đƣợc đổ giữa 2 tấm thuỷ tinh và phƣơng điện di là phƣơng thẳng đứng. Các phân tử DNA đƣợc đánh dấu bằng đồng vị phóng và nhận biết vị trí bằng phƣơng pháp phóng xạ 12 tự ghi, hoặc nhuộm bằng chất nhuộm chuyển biệt nhƣ bạc, khi đó các băng sẽ có màu tím đỏ dƣới ánh sáng ban ngày bình thƣờng. [8] Agarose: phân tích DNA sợi đôi, kích thƣớc từ 0,5 – 2kb. Gel đƣợc đổ trên giá thể nằm ngang và điện di theo phƣơng nằm ngang. Để phát hiện DNA trên gel ngƣời ta dùng chất nhuộm ethidium bromide, chúng có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại, acid nucleic sẽ hiện ra dƣới dạng các vạch màu đỏ cam có thể chụp ảnh và ghi nhận lại.[8] Dựa vào kết quả điện di: so sánh các băng với băng chuẩn có thể biết chất lƣợng DNA ly trích nhƣ gãy, lẫn tạp. Bảng 2.1 Phân tách các đoạn DNA trong gel theo kích thƣớc [8] (Lê Đình Lƣơng, 2001) (Lê Đình Lƣơng, 2001) (Lê Đình Lƣơng, 2001) 2.4. PCR (Polymerase chain reaction) 2.4.1. Khái niệm Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng tỉ bản sao DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu. [6] Loại gel Phạm vi phân tách (bp) 0,3% agarose 50.000 đến 1000 0,7% agarose 20000 đến 300 1,4% agarose 6000 đến 300 4% acrylamid 1000 đến 100 10% acrylamid 500 đến 25 20% acrylamid 50 đến 1 13 2.4.2. Nguyên tắc Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: Biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài. Biến tính: đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn. Nhiệt độ thiết kế là 940C Gắn mồi: đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (sợi đơn). Nhiệt độ thay đổi từ 50 - 600C. Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ dài của cặp primer. Kéo dài: 720C, 60 – 90 giây. Đây là bƣớc kéo dài primer nhờ hoạt động của Taq polymerase. Nhiệt độ 720C là tối ƣu cho hoạt động của Taq polymerase. Sau 25 - 35 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 720C trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 2.4.3. Ứng dụng Đánh giá mức độ biến dị di truyền trong một loài sinh vật thông qua mức độ biểu hiện đa hình. Nghiên cứu sự khác biệt di truyền giữa các giống, giữa quần thể khác loài. Thiết lập bản đồ di truyền thông qua các phƣơng pháp phân tích các kỹ thuật trong sinh học phân tử nhƣ RAPD, STS, SSR, AFLP. Nghiên cứu và phân tích gia phả của sinh vật. Kiểm tra và xác định nguồn gốc con lai. Thiết lập hệ thống phân loại phân tử thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử có liên quan. Giải trình tự DNA. Ứng dụng chỉ thị phân tử để phát hiện gen. Chẩn đoán bệnh trong y khoa, chẩn đoán nhóm máu, phát hiện các bệnh trong y khoa. 14 Phục hồi những gen đã tồn tại cách đây hàng triệu năm. [6] 2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm 2.4.4.1. Ƣu điểm Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện đƣợc. 2.4.4.2. Nhƣợc điểm Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính. 2.5. Đa dạng di truyền 2.5.1.Khái niệm Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. [18] 2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ. Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là kế hoạch dài hạn. Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học. Từ năm 2000 trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp, theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5] Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm trọng. 15 2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) Là những chỉ thị đƣợc tạo ra nhờ phƣơng pháp cắt DNA bằng enzym giới hạn (Restriction enzyme) hoặc qua PCR. Các chỉ thị phân tử này có thể liên kết với một gen nào đó nằm trên nhiễm sắc thể. Các chỉ thị phân tử có nguồn gốc từ hai nhóm: Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp lai DNA: RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), minisatelite. Chỉ thị phân tử dựa vào phƣơng pháp PCR: RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequense Repeats/microsatellite repeats), STS (Sequence Tagged Sites), DAF (DNA Amplification Fingerprinting). [7] Bảng 2.2 Các loại chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền [2] (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) Tên đầy đủ AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPD Random Amplified Polymorphic DNA DAF DNA Amplification Fingerprinting ALP Amplicon Length Polymorphism SSR Simple Sequence Repeat (Microsatellite) SSCP Single Strand Conformation Polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer-PCR SNP Single Nucleotide Polymorphism STS Sequence – Tagged Sites 16 2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 2.6.1.1. Định nghĩa RFLP đƣợc định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu hiện sự khác nhau về kích thƣớc các phân đoạn đƣợc tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác.[9] 2.6.1.2. Phƣơng pháp Phƣơng pháp này cho phép so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn - nhằm tìm hiểu xem có hay không đột biến điểm (Làm mất hoặc xuất hiện vị trí giới hạn) hoặc có hay không sự thay đổi một đoạn trình tự DNA. Trƣờng hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy các band DNA giống nhau hoàn toàn về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại, nếu có đột biến điểm hoặc có thay đổi một đoạn trình tự DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các band DNA. Sự giống nhau hoặc khác nhau về các band DNA này đƣợc nhận biết qua ảnh phóng xạ tự ghi hoặc đánh dấu probe. 2.6.1.3. Ứng dụng Chỉ thị phân tử RFLP có thể đƣợc sử dụng trong một số nghiên cứu nhƣ: Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình DNA). Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể Lập bản đồ di truyền (Genetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống (Thí dụ nhƣ một số chỉ thị phân tử RFLP liên kết với gen quy định tính trạng số lƣợng). [2] 17 2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 2.6.2.1. Định nghĩa AFLP đƣợc định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gene, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gene. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt. [1] 2.6.2.2. Phƣơng pháp Gồm các giai đoạn: Tách chiết DNA Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Thông thƣờng, enzyme cắt giới hạn sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thƣờng xuyên (Tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thƣờng xuyên (Nhằm hạn chế số lƣợng các đoạn cắt). Nối trình tự DNA với các adaptor (Trình tự tiếp hợp). Sau khi cắt bằng cặp enzyme một trình tự nối mạch đôi Adaptor sẽ đƣợc gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR đƣợc thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide. Khuếch đại đoạn cắt giới hạn. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới đƣợc khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích Chạy điện di các đoạn đƣợc khuếch đại trên gel polyacrylamide. 18 2.6.2.3. Ứng dụng Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể (Ghi nhận qua sự đa hình DNA) Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể (Phylogenetic analysis). Lập bản đồ di truyền (Gennetic map) phục vụ công tác chọn tạo giống. 2.6.2.4. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của AFLP  Ƣu điểm Lƣợng DNA cần dùng ít Tạo nhiều băng khuếch đại - khả năng đa hình cao. Kết quả có độ tin cậy cao, có khă năng lặp lại. Không cần biết trƣớc trình tự DNA genome.  Nhƣợc điểm Cần DNA có độ tinh sạch cao, không làm tạp nuclease hoặc ức chế nó. AFLP là chỉ thị di truyền trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp. 2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 2.6.3.1. Phƣơng pháp Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những chỉ thị để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu. Các bộ primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa 19 trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình phản ứng PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: Các mũi tên biểu thị cho các primer (Các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 là các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào. Sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm A: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5. Sản phẩm B: là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6. Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại. Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau. [17] Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 20 Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản: Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một số vấn đề: Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số band trên gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng. PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau. Taq polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại và nồng độ của Taq polymerase đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm. Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf. 2.6.3.2. Ứng dụng Xác định sự đa dạng di truyền, sự tƣơng quan di truyền. Lập bản đồ di truyền. 2.6.3.3. Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD  Ƣu điểm Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít. Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. 21 Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao. Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.  Nhƣợc điểm Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định. Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc 2.6.4.1. Nghiên cứu ngoài nƣớc Năm 1997, Madasamy Parani và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP để nghiên cứu mối quan hệ giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). Kết quả nghiên cứu cho thấy có mối quan hệ rất gần giữa cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) và cây đƣng (Rhizophora mucronata). [14] Năm 2002, Mukkamala Lakshmi và cộng sự đã sử dụng RAPD và RFLP nghiên cứu mối quan hệ giữa các cây thuộc họ đƣớc (Rhizophoreae) tại Ấn Độ. Kết quả nghiên cứu cho thấy mối quan hệ di truyền của 10 loài thuộc họ đƣớc trong rừng ngập mặn Ấn Độ. [15] 2.6.4.1. Nghiên cứu trong nƣớc Có rất nhiều nghiên cứu về cây đƣớc tuy nhiên hầu hết liên quan đến đặc điểm hình thái, các tính trạng nông học nhƣ: tăng trƣởng đƣờng kính của Đƣớc tại huyện Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 1995). Nghiên cứu sinh khối và năng suất sơ cấp rừng Đƣớc trồng tại Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh, Sở Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn (Viên Ngọc Nam và Nnk, 1996). 22 Về nghiên cứu đa dạng di của truyền Lâm Vỹ Nguyên (2006) đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Thời gian và điạ điểm thực hiện 3.1.1. Thời gian thực hiện Đề tài đƣợc thực hiện từ 08/05/2007 đến 30/08/2007. 3.1.2. Địa điểm thực hiện Mẫu lá đƣớc đƣợc thu thập tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phản ứng RAPD tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ Môi trƣờng. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.1.2. Mẫu đƣớc đôi Mẫu đƣớc đôi (Rhizophora apilata Blume) đƣợc lấy ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.  Cách thức lấy mẫu: Lấy mẫu đƣớc theo đƣờng chéo, cách 1500m lấy 1 mẫu. Sử dụng xe gắn máy đối với đƣờng bộ và ghe đối với đƣờng sông để thu thập lá của cây đƣớc đôi (Lá già, lá non). Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ. Ghi nhận nguồn gốc và xác định một số tính trạng về kiểu hình: hình dáng lá, hoa, trái của cây. Chọn mẫu lá từ trên những cây đƣớc đôi có năm tuổi khác nhau. 23 Mỗi mẫu lấy khoảng 15 - 20 lá, cho vào bịch nylon và để vào thùng lạnh để bảo quản độ tƣơi của lá . Đồng thời ghi đầy đủ những thông tin của cây đƣợc lấy mẫu theo phiếu thu thâp̣ . (Tham khảo phụ lục 5). Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trêm bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System). Ký hiệu tên mẫu: AXY, BXY với A là đƣờng chéo thứ nhất, B là đƣờng chéo thứ hai, XY là số thứ tự của mẫu. Cách bảo quản mẫu đƣa về phòng thí nghiệm: Mẫu sau khi lấy đƣợc cho vào thùng lạnh để bảo quản tạm thời. Sau đó chuyển về phòng thí nghiệm trữ mẫu ở nhiệt độ -200C. 3.2.2. Hoá chất thí nghiệm 3.2.2.1 Các hoá chất dùng ly trích DNA CTAB EDTA 0,5M Ethanol 100% Mercaptro Ethanol Ethanol 70% Sodium Acetate 3M Iso Propanol TE 1X Chloroform NaCl 5M Chloroform Tris-HCl 1M Isoamyl Alcohol Polyvidon Hình 3.1 Lá, hoa và trái đƣớc đôi 24 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra định lƣợng DNA TE 1X 3.2.2.3. Các hoá chất dùng trong phƣơng pháp RAPD Buffer dNTP Taq DNA polymerase MgCl2 Primer: OPAC10 và OPA10 Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV 3.2.2.4. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả Agarose Ladder 3000 bp TAE 0,5X Ethidium bromide Loading dye 3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm Chày và cối (Đức) Bình và khay đựng Nitơ lỏng Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) Tủ lạnh 40C và -200C Máy Vortex (IKA - Đức) Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) 25 Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux) Tủ sấy (Jencons-Anh) Máy điện di (Biorad) Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu tuýp các loại (Đức) Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản) Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (BioRad – Thụy Điển) Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Bố trí thí nghiệm  Giai đoạn 1: Tách chiết và tinh sạch DNA từ các mẫu đƣớc đôi thu đƣợc. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế.  Giai đoạn 2: tối ƣu hóa kỹ thuật RAPD với các mẫu DNA thu đƣợc. Khảo sát nồng độ Mg2+ Khảo sát nồng độ primer  Giai đoạn 3: thực hiện phản ứng RAPD với các mẫu đƣớc thu đƣợc  Giai đoạn 4: phƣơng pháp đánh giá đa dạng di truyền bằng phần mềm NTSYSpc. 3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 26 Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 3 quy trình: Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle (1988) [9] Quy trình 2: Quy trình ly trích cải tiến [9] Quy trình 3: Quy trình cải tiến từ quy trình 1 và quy trình 2 3.3.2.1. Quy trình 1 [9] Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988: o Bƣớc 1: cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB (Extraction Buffer) vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút. o Bƣớc 2: thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút, 14.000 vòng/phút ở 100C. o Bƣớc 3: chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. o Bƣớc 4: chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 l RNase, ủ ở 370C trong 1 giờ. o Bƣớc 5: thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C khoảng 30 phút (Nên để qua đêm). o Bƣớc 6: li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 7: cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 1giờ. o Bƣớc 8: thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để -200C trong 30 phút. o Bƣớc 9: li tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 10: rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 11: lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. 27 o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở 40C. 3.3.2.2. Quy trình 2 [9] Mẫu lá đƣợc ly trích theo quy trình ly trích mẫu tƣơi của Doyle và Doyle, 1988 đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006. o Bƣớc 1: lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf. o Bƣớc 2: thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600-800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 550C. o Bƣớc 3: ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi. o Bƣớc 6: thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -200C trong 90 phút. o Bƣớc 7: ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. o Bƣớc 8: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 9: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 10: phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng. o Bƣớc 11: hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 370C đến khi kết tủa tan hoàn toàn (Có thể ủ qua đêm). o Bƣớc 12: bảo quản mẫu ở -200C. 3.3.2.3. Quy trình 3 28 o Bƣớc 1: lấy 0,3 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf. o Bƣớc 2: thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đến khi hỗn hợp đồng nhất. Ủ 650 trong 1 giờ. o Bƣớc 3: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 4: thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Thu dịch nổi. o Bƣớc 5: lập lại bƣớc 4. Thu dịch nổi. o Bƣớc 6: thêm 250 µl Isopropanol lạnh, đảo trộn kỹ. Ủ -200C qua đêm o Bƣớc 7: ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong o Bƣớc 8: cho vào 300 µl TE 1X, ủ 370 C trong 1 giờ. o Bƣớc 9 : thêm 20 µl sodium acetate 3M và 640 µl Ethanol 100% trộn đều và ủ -200 C trong 1 giờ. o Bƣớc 10 : ly tâm 11.000 vòng/phút trong 15 phút , đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 11: rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 3 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch trong. o Bƣớc 12: lặp lại bƣớc 11. Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng. o Bƣớc 13: hòa tan kết tủa trong 50 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút o Bƣớc 14: bảo quản mẫu ở -200C. 3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích 3.3.3.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di DNA sau khi đƣợc ly trích sẽ đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Dƣới tác dụng của điện trƣờng, do tích điện âm (Do tính chất của nhóm phosphate) nên DNA di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của agarose, sự cọ xát giữa hạt agarose và phân tử DNA tạo ra lực kháng làm ngăn cản sự chuyển dịch của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực 29 cản càng mạnh, do đó DNA có phân tử càng nhỏ di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy ta có thể phân loại đƣợc các đoạn DNA trên gel agarose. [8] Sau khi chạy điện di, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA để quan sát. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel.  Cách tiến hành: Pha gel agarose với nồng độ 1%: cân 0,125 g agarose cho vào 12,5 ml dung dịch TAE 0,5X. Đun sôi bằng lò Viba dƣới bƣớc sóng 650W trong 2 phút. Đổ gel, chờ 30 phút để agarose đông. Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 2 μl loading dye và 4 μl DNA mẫu. Chạy điện di ở điều kiện 100 V, 400 mA, thời gian 20 phút. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide 100 mg/ml trong 20 phút, sau đó đƣa vào máy Geldoc đọc kết quả. Gel sau khi nhuộm sẽ đƣợc chụp bằng tia tử ngoại UV. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ phát sáng dƣới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di thể hiện nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. 3.3.3.2. Định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Các mẫu DNA li trích sau khi đã định tính đƣợc kiểm tra độ tinh sạch và ƣớc lƣợng hàm lƣợng DNA bằng cách đo mật độ quang OD (optical density) với bƣớc sóng 260 nm và 280 nm bằng máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần. Giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu DNA cho phép xác định nồng độ DNA trong dung dịch. Đồng thời để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch 30 DNA thƣờng đo giá trị OD280. Khi giá trị OD260/OD280 = 1.8 – 2.2 thì dịch trích DNA đƣợc coi là tinh sạch. [10] Hàm lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62.9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * Độ pha loãng  Cách tiến hành : Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn. Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: hút 5 l dung dịch DNA hòa tan với 495 µl TE 1X. Cho vào Curvette để tiến hành đo OD. Sản phẩm DNA tổng số sau khi tách chiết đƣợc định tính bằng phƣơng pháp điện di và đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp quang phổ kế. Từ đó ta sẽ chọn ra quy trình ly trích DNA tổng số tốt nhất dựa trên độ sáng, độ rõ, không bị gãy của các băng DNA và không bị nhiễm protein. 3.3.4. Kỹ thuật RAPD 3.3.4.1. Primer Sử dụng 2 primer: primer OPA 10 và primer 0PAC10 để chạy RAPD Trình tự của primer OPA 10: 5’ AGTGAACGCC 3’ và Tm = 30,70C Trình tự của primer OPAC 10: 5’AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 340C 3.3.4.2. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1 Sử dụng OPAC10 khảo sát quy trình RAPD Mục đích thí nghiệm: khảo sát quy trình RAPD Phƣơng pháp tiến hành: chọn 3 mẫu DNA chất lƣợng tốt thực hiện phản ứng RAPD với mồi OPAC10 theo bảng 3.1 và bảng 3.2. Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di. Bảng 3.1 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD [6] 31 (Đƣợc trích từ Nguyễn Thị Lang, 2002) Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/ l Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng H2O 17,8 l Tổng thể tích phản ứng 25 l (Nguồn: Lê Hồng Phong, 2007) Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến phản ứng RAPD. Mục đích thí nghiệm: tối ƣu quy trình RAPD Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 45 94 30 giây 36 30 giây 72 1 phút 1 72 5 phút Giữ 40C 32 Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di. Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg2+ đến sản phẩm RAPD Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nồng độ Mg2+ 3mM 2,5 mM 2mM Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer lên phản ứng RAPD Mục đích thí nghiệm: tối ƣu hóa quy trình RAPD Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 4 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức gồm 1 mẫu DNA. Phƣơng pháp tiến hành: tiến hành chọn 3 mẫu DNA có chất lƣợng tốt và primer OPAC10 để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD. Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm PCR với primer OPAC10 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 33 Nồng độ primer 1,2 pmol/ l 1 pmol/ l 0,8 pmol/ l 0,6 pmol/ l Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di. Thí nghiệm 4: Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và OPAC10. Mục đích thí nghiệm: thử nghiệm primer OPA 10, OPAC10 theo quy trình RAPD tối ƣu. Thiết kế thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí gồm 2 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 2 lần với 1 mẫu DNA. Phƣơng pháp tiến hành: chọn 1 mẫu DNA và 2 primer OPAC10, OPA 10 để tiến hành thí nghiệm. Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA10 và OPAC10 Chỉ tiêu đánh giá: độ sáng, độ rõ của các band DNA đƣợc khuếch đại trên gel điện di. Thí nghiệm 5: Thực hiện phản ứng RAPD với 10 mẫu theo thành phần hóa chất (Bảng 3.6) và chu kỳ nhiệt (Bảng 3.1) Bảng 3.6 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Primer OPAC 10 0PA 10 34 MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 M Primer 100 pmol/ l 0,15 l 0,6 pmol/ l Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 50 ng/ l 1 l 50 ng/ l H2O 17,95 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD: Trong thành phần của phản ứng, Taq polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,1 - 0,2 l) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn (mix) một lần nhiều phản ứng, sau đó đem chia ra các ống và cho DNA mẫu vào sau cùng. Các thao tác trộn phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt trong quá trình trộn. Taq polymerase phải đƣợc bỏ vào sau cùng. Các thao tác tiếp theo phải tiến hành nhanh chóng vì Taq polymerase sẽ hoạt động ngay. 35 3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS Từ kết quả phản ứng RAPD, tiến hành xác định mức độ đa hình của các mẫu đƣớc từ mẫu thu đƣợc bằng cách so sánh các phân đoạn DNA. Các phân đoạn đƣợc ghi nhận dựa trên sự có mặt hay không có mặt của chúng trên ảnh điện di. Nếu xuất hiện phân đoạn DNA thì kí hiệu là 1, không thì kí hiệu là 0. Các số liệu thu đƣợc sẽ đƣợc sử lý và phân tích trong chƣơng trình NTSYS Version 2.1 (Numercial Taxonomy System) để tìm ra mối tƣơng quan giữa các đối tƣợng nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây. [16] Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979). Sxy = 2 xy / x + y Xy: số băng giữa hai mẫu. X: số băng của mẫu x. Y: Số băng của mẫu y. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y Dxy = 1 - Sxy Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 36 37 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 40 mẫu lá đƣớc gồm nhiều năm tuổi khác nhau với những đặc điểm hình thái nhƣ: cây mọc bình thƣờng, cây ốm yếu, cây to khỏe, cây bị mối mọt ăn, cây có hai màu trái xanh và đỏ (Xem phụ lục 5). Tổng số mẫu thu thập đƣợc là rất ít so với tổng diện tích hơn 75.000 ha của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣng cũng đã đại diện đƣợc phần nào quần thể đƣớc tại đây. 4.2. Bảo quản mẫu Mẫu lá già không thể bảo quản lâu dài ngay cả trong điều kiện -200C. Mẫu lá đƣợc bảo quản trong tủ lạnh -200C sẽ nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Khoảng thời gian mẫu bị hƣ hỏng chỉ trong hơn 10 giây, Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 38 không kịp để nghiền mẫu trong dịch trích. Điều này là do khi trữ ở -200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá đƣớc. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣớc đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Những mẫu bị hóa nâu, dập nát thì việc ly trích DNA gặp rất nhiều khó khăn và không thể cho kết quả tốt. Tuy nhiên, những mẫu lá non luôn đƣợc bao bọc bởi hai lá phụ màu đỏ thẫm và có thể bảo quản trên 4 tháng ở -200C. Hai lá phụ còn giúp lá non không bị dập nát và hóa nâu khoảng 15 phút sau khi lấy ra khỏi tủ -200C. Qua một số thí nghiệm bảo quản mẫu chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Để lấy đƣợc số lƣợng mẫu lớn và kết quả ly trích tốt chúng ta chỉ nên lấy lá non. Những lá non tốt là những lá đƣợc lá phụ bao bọc kỹ càng bởi các lá phụ. Cho mẫu thu đƣợc vào túi nilông ép hết không khí ra, buộc thật chặt miệng túi. Bảo quản bằng nƣớc đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và trữ mẫu ở -20 0 C. Sau khi cân mẫu phải cho vào dung dịch ly trích để nghiền ngay hoặc cho vào nitơ lỏng. Mẫu sau khi cân phải luôn đảm bảo điều kiện nhiệt độ của nitơ lỏng cho đến khi cho dịch trích EB vào. 4.3. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA DNA là thông tin di truyền, là vật liệu quan trọng dùng trong các thao tác nghiên cứu về phân tử. Vì vậy, hoàn thiện quy trình ly trích DNA nhằm thu đƣợc DNA tinh sạch, có chất lƣợng cao là bƣớc đầu tiên, không thể thiếu trong các nghiên cứu về sinh học phân tử. Ban đầu chúng tôi thực hiện theo quy trình 1 (Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle, 1988)). Ở quy trình này mẫu lá đƣớc đƣợc nghiền trực tiếp trong dịch trích EB nhằm phá vỡ vách tế bào để thu nhận DNA. Kết quả chúng tôi không 39 thu đƣợc DNA mẫu hoặc là lƣợng DNA thu đƣợc không tinh sạch và bị gẫy vụn rất nhiều. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này không đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng RAPD. Sau khi thay đổi một số yếu tố nhƣ: nghiền mẫu nhẹ nhàng để tránh đứt gãy, thay đổi tốc độ vortex, thay đổi tốc độ ly tâm, nhƣng DNA mẫu thu đƣợc vẫn không tinh sạch và bị gãy vun rất nhiều. Vì vậy chúng tôi quyết định ly trích theo quy trình 2. Theo quy trình này mẫu lá non đƣợc nghiền trong nitơ nhằm tách rời từng tế bào, sau đó ủ với dịch trích EB nên DNA mẫu thu đƣợc theo quy trình này không bi đứt gãy. Tuy nhiên chất lƣợng DNA vẫn không đảm bảo do lƣợng tạp chất quá nhiều và nồng độ DNA thấp. DNA đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng RAPD theo quy trình này là rất thấp. Việc ly trích DNA từ mẫu đƣớc gặp nhiều khó khăn vì lá đƣớc có chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sự kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 6, 9, 10, 11. Đồng thời trong lá đƣớc còn chứa nhiều chất thứ cấp nên làm hạn chế tác dụng của các hóa chất ly trích. Sau các thử nghiệm chúng tôi quyết định bổ sung vào dịch trích EB một chất là polyvidon. Ngoài ra chúng tôi cũng thay đổi tốc độ vortex, ly tâm để tối ƣu quy trình ly trích. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này ổn định, tinh sạch và đủ tiêu chuẩn chạy RAPD. Áp dụng quy trình 3, chúng tôi tiến hành ly trích 40 mẫu. Kết quả định lƣợng DNA bằng quang phổ kế cho thấy tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng từ 1,5 đến 2,3 và lƣợng DNA trong mỗi mẫu đều lớn hơn 80 ng/µl. Trong 40 mẫu thu đƣợc có 65% mẫu có tỉ lệ OD260/OD280 >1,8 và hàm lƣợng DNA trung bình ở mỗi mẫu là 243 ng/µl. 40 Thêm 20 l sodium acetate và 640 l ethanol 100%. Đảo trộn kỹ, ủ -200C trong 1 giờ. Bƣớc 4 Bƣớc 5 Bƣớc 6 Bƣớc 7 Bƣớc 8 Thu đƣợc dung dịch đồng nhất Thu đƣợc dung dịch Nghiền thật mịn Nghiền 0,3 g mẫu lá non trong nitơ lỏng Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex kỹ, ủ 650C trong 1 giờ Ly tâm 11.000 vòng/15phút/40C, hút dịch nổi Thêm 500 l Chloroform:Isoam yl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 11.000 vòng/15ph/40C, hút dịch nổi Thêm 250 l Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -20 0 C qua đêm. Lập lại bƣớc 4, thu đƣợc dịch nổi Ly tâm 11.000 vòng / 15 phút/ 4 0 C. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. Thêm 300 l TE 1X, ủ 370C trong 1 giờ Bƣớc 1 Bƣớc 2 Bƣớc 3 Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C. Đổ bỏ dịch trong. Cho vào 400 l ethanol 70%, ly tâm 12 vòng/15 phút/40C để rửa tủa. Đổ bỏ dịch trong. Lặp lại bƣớc11. đổ bỏ dịch trong. Thu kết tủa. Hòa tan tủa trong TE 1X ở 370C trong 30 phút. Bảo quản mẫu trong - 20 0 C. Bƣớc 9 Bƣớc 10 Bƣớc 11 Bƣớc 12 Bƣớc 13 13 13 Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đƣớc đôi theo quy trình 3 41 Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ ly trích theo quy trình 1 (Hình a), quy trình 2 (Hình b), quy trình 3 (Hình c) Chúng tôi sử dụng quy trình tối ƣu để ly trích DNA của 6 mẫu lá non. Kết quả điện di (hình 4.3) cho thấy các band DNA của những mẫu lá non đậm, sáng và ít lẫn tạp chất. Các band DNA của những mẫu lá già mờ, nhiều tạp chất. Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc lá non (Hình a) và lá già (Hình b) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ly trích theo quy trình 3 Theo kết quả định lƣợng bằng quang phổ kế (Bảng 4.2) chúng tôi thu đƣợc những kết quả sau : DNA đƣợc ly trích từ 6 mẫu lá non có tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,6 đến 2,2. Trong đó 4 mẫu có tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,2 chiếm 66,67%. Hàm lƣợng DNA trong mỗi mẫu đều lớn hơn 160 ng/µl và trung bình ở mỗi mẫu là 260 ng/µl. DNA đƣợc ly trích từ 6 mẫu lá già có tỉ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1,3 đến 1,7. Hàm lƣợng DNA trong mỗi mẫu trong khoảng 60 ng/µl đến 180 ng/µl và trung bình ở mỗi mẫu là 130 ng/µl. Từ những kết quả trên, chúng tôi thấy rằng DNA ly trích từ lá non có độ tinh sạch cao còn DNA ly trích từ lá già (c) (a) (b) A1 A2 A3 A4 A1 A2 A3 A4 (b) (a) A1 A2 A3 A4 A5 A6 A1 A2 A3 A4 A5 A6 42 còn lẫn nhiều tạp chất. Hàm lƣợng DNA ly trích từ lá non gấp 2 lần hàm lƣợng DNA đƣợc ly trích từ lá già. Qua khảo sát trên chúng tôi quyết định chỉ dùng lá non để ly trích DNA theo quy trình tối ƣu. . Hình 4.4 DNA tổng số của 17 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Hình 4.5 DNA tổng số pha loãng của 17 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 43 Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đƣớc (lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) NA1 1,8254 8,2763.10 -2 4,5340.10 -2 360 GA1 1,7044 3,4710.10 -2 2,0365.10 -2 150 NA2 1,7382 6,6635.10 -2 3,8336.10 -2 160 GA2 1,5640 4,3621.10 -2 2,7891.10 -2 170 NA3 2,2164 5,6665.10 -2 2,5566.10 -2 260 GA3 1,6478 2,3654.10 -2 1,4355.10 -2 100 NA4 1,8169 4,2361.10 -2 2,3315.10 -2 180 GA4 1,6140 1,3645.10 -2 0,8454.10 -2 60 NA5 1,6352 5,6522.10 -2 3,4566.10 -2 230 GA5 1,6377 3,6545.10 -2 2,2315.10 -2 150 NA6 1,9506 8,6454.10 -2 4,4322.10 -2 380 GA6 1,3536 3.3251.10 -2 2,4565.10 -2 120 Chú thích: Các mẫu có ký hiệu “N” ở đầu là các mẫu lá non. Các mẫu có ký hiệu “G” ở đầu là các mẫu lá già. 44 Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đƣớc dùng để thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị phân tử RAPD Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) A1 1,9545 8,2763.10 -2 4,2344.10 -2 370 A4 1,8169 4,2361.10 -2 2,3315.10 -2 180 A8 1,9412 6,2356.10 -2 3,2123.10 -2 280 A12 1,8760 7,9646.10 -2 4,2455.10 -2 350 A16 1,8646 2,6544.10 -2 1,4236.10 -2 120 B1 2,1263 5,6423.10 -2 2,6536.10 -2 260 B4 1,8232 5,5654.10 -2 3,0525.10 -2 240 B8 1,8182 2,6665.10 -2 1,4666.10 -2 120 B12 1,9632 4,6525.10 -2 2,3699.10 -2 210 B16 1,8726 8,6554.10 -2 4,6222.10 -2 380 Qua quá trình ly trích chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Sau khi cắt, cân mẫu nên bỏ ngay vào nitơ lỏng. Thuận lợi của việc nghiền mẫu trong nitơ lỏng: DNA rất ít bị đứt gãy, nghiền dễ dàng, nhanh chóng. Mẫu sau khi cân phải luôn đảm bảo điều kiện nhiệt độ của nitơ lỏng cho đến khi cho dịch trích EB vào. Dịch trích EB khi bảo quản thƣờng có hiện tƣợng kết tủa (CTAB) ảnh hƣởng đến hiệu quả ly trích DNA, do đó cần ủ dung dịch EB ở 650 C trƣớc khi sử dụng. Ủ mẫu với dịch trích EB trong thời gian 1 giờ và 2 giờ ở 650C không có sự khác biệt. 45 Việc ly tâm và thu dịch nổi trƣớc khi thêm Chloroform có thể đã loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá đƣớc giúp cho Chloroform có tác dụng tốt hơn. Sau khi thêm Chloroform nên đảo trộn nhẹ nhàng và ly tâm ngay để tránh Chloroform phá hủy DNA. Khi chuyển lấy dịch trong cẩn thận tránh lấy phạm vào phần tạp phía dƣới, nếu không độ tinh sạch sẽ không cao. Chất lƣợng mẫu DNA trong thời gian bảo quản phụ thuộc nhiều vào giai đoạn làm khô mẫu (Bƣớc 12), (Ba giờ là tốt nhất) Rã đông mẫu quá nhiều sẽ ảnh hƣởng đến chất lƣợng DNA. 4.4. Kết quả phản ứng RAPD - PCR 4.4.1. Thí nghiệm 1 Sử dụng primer OPAC10 với thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.1 và bảng 3.2 Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.6 Hình 4.6 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 3 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ A1 A2 A3 46 Kết quả điện di cho thấy cả 3 mẫu đều có những đoạn DNA đƣợc khuếch đại nhƣng mờ. Nguyên nhân có thể do thành phần hóa chất hoặc số chu kỳ chƣa phù hợp. Do đó, chúng tôi thực hiện thí nghiệm 2 để tìm quy trình tối ƣu hơn. 4.4.2. Thí nghiệm 2 Sử dụng primer OPAC10 khảo sát nồng độ Mg2+ Qua thí nghiệm 2, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.7 Chú thích: 1, 2, 3: số lần lặp lại của mỗi nghiệm thức Kết quả điện di cho thấy chỉ có Mg2+ nồng độ 3 mM thì những đoạn DNA mẫu đƣợc khuếch đại. Mg2+nồng độ 2mM và 2,5 mM không cho kết quả trên gel điện di. Vì vậy chúng tôi quyết định chọn Mg2+ nồng độ 3 mM để tối ƣu các thành phần hóa chất khác. 4.4.3. Thí nghiệm 3 Sử dụng primer OPAC10 khảo sát nồng độ primer Qua thí nghiệm 3, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.8 Chú thích: 1, 2, 3, 4 : tƣơng ứng với các nghiệm thức. 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Hình 4.7 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ Mg2+ ở thí nghiệm 2 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Hình 4.8 Sản phẩm PCR khảo sát nồng độ primer OPAC10 ở thí nghiệm 3 47 Kết quả điện di cho thấy các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ở tất cả các nồng độ primer. Các band DNA đƣợc khuếch đại ở các nghiệm thức 1, 2, 3 tuy cho band sáng nhƣng các band tách không rõ ràng. Điều này ảnh hƣởng việc xác định số band và kích thƣớc band dễ sai lệch trong nghiên cứu di truyền. Các đoạn DNA đƣợc khuếch đại ở nghiệm thức 4 không sáng nhƣng các band DNA đƣợc tách rất rõ ràng. Chúng tôi quyết định sử dụng nồng độ primer ở nghiệm thức 4 để thực hiện phản ứng RAPD. 4.4.4. Thí nghiệm 4 Thực hiện phản ứng RAPD thử nghiệm với primer OPA 10 và OPAC 10 với thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.6 và bảng 3.1. Qua thí nghiệm 4, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.9 Hình 4.9 Kết quả PCR khảo sát 2 primer OPAC10 VÀ OPA 10 Kết quả điện di cho thấy primer OPAC10 cho band DNA tốt, còn primer OPA10 không thấy band DNA khuếch đại. Do đó chúng tôi chỉ sử dụng primer OPAC10 nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc đôi khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. OPAC10 OPA 10 48 4.4.5. Thí nghiệm 5 Thực hiện phản ứng RAPD với 10 mẫu với primer OPAC10 theo thành phần hóa chất, chu kỳ nhiệt ở bảng 3.6 và bảng 3.1. Qua thí nghiệm 5, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.10 Chúng tôi thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên 10 mẫu kết quả thu đƣợc 5 band đa hình chiếm tỷ lệ 83,3% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 16,7% (kích thƣớc khoảng 170 bp), kích cỡ của các band khoảng từ 100 bp – 600 bp (hình 4.10). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhƣng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Tuy lƣợng mẫu nghiên cứu không lớn nhƣng trong tất cả các mẫu nghiên cứu, band đồng hình 170 bp luôn xuất hiện. Band này có thể là band đặc biệt dùng để phân biệt loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác phân biệt và chọn giống. A1 A4 A8 A12 A16 B1 L B4 B8 B12 B16 Hình 4.10 Kết quả PCR với pimer OPAC10 của 10 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 170 pb 49 Coefficient 0.46 0.60 0.73 0.87 1.00 A12 A1 A4 B4 A8 A12 A16 B1 B16 B12 B8 ( I ) ( II ) Hình 4.11 Cây phân nhóm di truyền của 10 mẫu đƣớc đôi thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 1991 1996 1978 1980 Nguồn Giống Cà Mau Nguồn Giống tại chỗ 50 Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1 cho kết quả nhƣ sau: Mƣời mẫu đƣớc đƣợc chia thành 2 nhóm. Nhóm I chủ yếu là những mẫu đƣớc có nguồn giống từ Cà Mau (Trừ B12) bao gồm các mẫu: A1, A4, A8,A12,B1, B4, B16, B12. Nhóm II chỉ có 1 mẫu đƣớc có nguồn giống tại chỗ là B8. Các mẫu đƣớc trồng cùng năm 1978 (A1, A4, B4, A8), có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – 1,00. Các mẫu A1, A4, B4 có độ tƣơng đồng di truyền là nhƣ nhau. Mẫu A8 có khác biệt di truyền so với các mẫu A1, A4, B4 Các mẫu đƣớc trồng cùng năm 1980 (A12, A16, B1, B16) có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,83 – đến 1,00. Mẫu B16 có khác biệt di truyền so với A12, A16, B1 nhƣng mức độ tƣơng đồng di truyền là khá cao. Điều này là hợp lý vì nguồn cây con để tái tạo rừng ngập mặn Cần Giờ từ năm 1978 đến 1983 đều lấy từ rừng ngập mặn Cà Mau. Những cây đƣớc đôi trồng năm 1978 và năm 1980 có mức độ di truyền biến thiên trong khoảng 0,50 – 0,83. Sự khác biệt di truyền này có thể do vị trí, sự lai tạo và thụ phấn chéo giữa các cây đƣớc đôi ở Cà Mau. Các mẫu đƣớc nguồn gốc tại chỗ đƣợc trồng năm 1991 (B12) và trồng năm 1996 (B8) có hệ số đồng dạng di truyền là 0,50. Những cây đƣớc đôi trồng từ nguồn giống tại chỗ (B12, B8) và trồng từ nguồn giống từ Năm Căn (Cà Mau) có hệ số đồng dạng di truyền khá thấp từ 0,33 đến 0,67. Đây là kết quả của quá trình lai tạo và thụ phấn chéo giữa các cây đƣớc đôi. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền giữa các cây đƣớc đôi sẽ giảm. Qua phân nhóm di truyền chúng ta có thể sử dụng các cây đƣớc đôi nhóm I lai tạo với các cây đƣớc đôi nhóm II sẽ tạo ra quần thể đa dạng về nguồn gen bởi vì các cây đƣớc có khoảng cách di truyền xa nhau thì khả năng tạo ra con lai có nhiều tính trạng càng cao. ( II ) ( III ) 51 Hầu hết quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc trồng từ năm 1978 đến năm 1983 và nguồn giống trồng rừng là trái đƣớc đƣợc thu mua ở Cà Mau (Hệ số đồng dạng di truyền từ 0,5 đến 1,00). Cần gia tăng tính đa dạng di truyền của quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng cách: trồng xen các cây có bố mẹ đƣợc trồng năm 1996 hoặc những cây đƣớc đƣợc lai tạo từ nhóm I và nhóm II vào những khu rừng đƣớc có nguồn gốc từ Cà Mau. Bên cạnh đó, chúng ta có thể tạo các cây đƣớc lai giữa các loài đƣớc (Rhizophora apiculata, Rhizophora mucronata, Rhizophora stylosa) để nâng cao tính đa dạng di truyền của quần thể đƣớc. Song song việc gia tăng tính đa dạng di truyền chúng ta cần có chiến lƣợc bảo tồn và phát triển nguồn gen của quần thể đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng ta phải luôn chăm sóc rừng đƣớc phù hợp với cấp tuổi, cấp đất bằng những giải pháp kỹ thuật lâm sinh và quản lý thích hợp, cụ thể cho từng tiểu khu. Mặt khác từng bƣớc tiến hành trồng xen những cây đƣớc lai vào các khu rừng đƣớc trồng thuần để sau 10 đến 15 năm tới sẽ tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững. 52 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau: Mẫu lá đƣớc có thể bảo quản lâu trong điều kiện -200C. Tuy nhiên để ly trích cho kết quả tốt thì sau cân mẫu phải nhanh chóng cho vào nitơ lỏng. Sử dụng lá đƣớc non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất. Quy trình ly trích DNA của lá đƣớc rất ổn định. Tỷ lệ mẫu tinh sạch đạt đến 65% trên tổng số mẫu ly trích. Primer OPAC10 có tính đa hình đối với quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Với việc phân tích RAPD sử dụng primer OPAC10 thì quần thể đƣớc tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,33 – 1,00 5.2. Đề nghị Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 để đánh giá tính đa dạng di truyền với một lƣợng mẫu lớn hơn đối với quần thể đƣớc. Khảo sát thêm các primer khác nhằm có đƣợc kết quả đa dạng di truyền chính xác nhất. Tách riêng band 170 bp khi thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 để giải trình tự nhằm phục vụ cho việc phân biệt giữa loài đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) với các loài khác thuộc họ Rhizophorceae trong rừng ngập mặn. Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của khu dự trữ sinh quyển rừng 53 ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể đƣớc đôi (Rhizophora apiculata Blume) nói riêng. Nghiên cứu thêm về những cây đƣớc đôi có hình thái khác lạ trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ còn có một loài có tên địa phƣơng là đƣớc râu với những đặc điểm hình thái rất khác so với giống đƣớc (Rhizophora apiculata Blume). Do vị trí phân bố của đƣớc râu khá xa (Thuộc tiểu khu 14) nên chúng tôi chƣa có điều kiện lấy mẫu nghiên cứu. Hiện nay vẫn chƣa xác định đƣợc tên khoa học chính xác của loài này. Vì vậy chúng tôi đề nghị nghiên cứu trên cây đƣớc râu để có khả năng phát hiện ra đƣợc một loài mới tại Việt Nam. Do đó chúng ta nên trồng xen các cây có nguồn giống tại chỗ vào khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ sẽ tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để xây dựng hệ sinh thái bền vững. 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Việt Nam. 2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông nghiệp. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24-30; 122-124. 4. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP Hồ Chí Minh. 612 trang. 5. Lê Văn Khôi và ctv, 2006. Khôi phục và phá triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành Phố Hồ Chí Minh. Nhà xuất bản nông nghiệp. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản nông nghiệp. 7. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản nông nghiệp. 8. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật. 9. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi Rhizophora apiculata Blume. ở Khu Dự trữ Sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Việt Nam. 10. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 55 11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 12. Akira Komiyama, 1998. Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R. mucronata) seedlings in the field condition. Forest Ecology and Management, 112 (1998) p 227 – 231. 13. Bo Christensen, 1978. Biomass and primary production of Rhizophora apiculata Bl. In a mangrove in Southern Thailand. Aquatic Botany, 4 (1978) p. 43 – 52. 14. Madasamy Parani, 1997. Molecular Phylogeny of mangroves III Parentage analysis of a Rhizophora hybrid using Random Amplified Polymorphic DNA and Restriction Fragment Length Polymorphism markers. Aquatic Botany 58 (1997) p 165-172. 15. Mukkamala Lakshmi, 2002. Molecular phylogeny of mangroves IX Molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae. Aquatic Botany, 74 (2002) p. 201 – 217. 16. F James rohlf, 2000. NTSYSpc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. Department of Ecology and Evolution State University of New york. Website: 17. 18. htm PHỤ LỤC Phụ lục 1 Công dụng và cách pha hóa chất trong ly trích DNA HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65 o C Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất Pha 100ml: - 15,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc Phụ lục 2 Kết quả ly trích DNA từ cây đƣớc đôi theo quy trình 3 A18 A19 A20 A21 A22 A23 A24 A25 A26 A27 A28 A29 A30 Phụ lục 3 Bảng mã hóa số liệu kết quả phản ứng RAPD ở thí nghiệm 5 Phụ lục 4 Ma trận hệ số di truyền của 10 mẫu đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. A1 A4 A8 A12 A16 B1 B4 B8 B12 B16 A1 1,00 A4 1,00 1,00 A8 0,83 0,83 1,00 A12 0,83 0,83 0,67 1,00 A16 0,83 0,83 0,67 1,00 1,00 B1 0,83 0,83 0,67 1,00 1,00 1,00 B4 1,00 1,00 0,83 0,83 0,83 0,83 1,00 B8 0,33 0,33 0,50 0,50 0,50 0,50 0,33 1,00 B12 0,50 0,50 0,33 067 0,67 0,67 0,50 0,50 1,00 B16 0,67 0,67 0,50 0,83 0,83 0,83 0,67 0,67 0,83 1,00 A1 A4 A8 A12 A16 B1 B4 B8 B12 B16 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Phụ lục 5 Bảng lý lịch 40 mẫu đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Tên mẫu Tiểu khu Năm trồng Tọa độ Đặc điểm mẫu 48p UTM A1 21 1978 0708583 1150288 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A2 17 1980 0707998 1150623 Cây cao, mọc khỏe, lá dày A3 17 1978 0707448 1152105 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A4 21 1978 0706752 1154072 Cây cao, ốm yếu, lá ít A5 17 1980 0706898 1156443 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A6 21 1996 0706380 1157741 Cây nhỏ, mọc tốt A7 11 1990 0705765 1158774 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A8 11 1978 0705441 1159250 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A9 11 1979 0705161 1159715 Cây cao, ốm yếu, lá ít A10 11 1991 0704781 1160407 Cây nhỏ, ốm yếu, bị mối A11 11 1978 0704086 1161940 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn A12 11 1980 0703881 1162362 Cây cao to, tƣơi tốt, lá dài, dày A13 10 1996 0703258 1163077 Cây nhỏ, mọc tốt A14 10 1978 0702913 1163559 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A15 10 1978 0702489 1164263 Cây cao, ốm yếu, lá ít A16 10 1980 0701380 1165102 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn A17 10 1990 0700542 1165786 Cây nhỏ, mọc tốt A18 10 1980 0700167 1167848 Cây cao, ốm yếu, lá ít A19 5B 1978 0699834 1168976 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt A20 5B 1990 0700092 1171091 Cây trung bình, mọc yếu B1 10B 1980 0704654 1161886 Cây cao, ốm yếu, dây leo quấn quanh B2 10B 1978 0704353 1162004 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B3 10A 1978 0704558 1162782 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B4 10A 1978 0705498 1163894 Cây cao to, rất tƣơi tốt, có trái xanh, trái đỏ B5 6B 1980 0705498 1163893 Cây cao, ốm yếu, lá ít B6 6B 1996 0705911 1163727 Cây nhỏ, mọc khỏe B7 6B 1980 0706852 1163693 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn B8 6B 1996 0707424 1163700 Cây nhỏ, rất nhiều nhánh, tƣơi tốt B9 6B 1978 0707851 1163576 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B10 6B 1978 0708594 1163382 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B11 6B 1991 0709080 1163798 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn B12 13 1991 0709814 1164396 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn B13 7 1980 0710845 1165053 Cây cao, ốm yếu. bị kiến, mối ăn B14 7 1980 0711177 1165656 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B15 7 1980 0711348 1166061 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B16 7 1980 0711394 1166150 Cây cao to, mọc khỏe, tƣơi tốt B17 7 1996 0712199 1167244 Cây nhỏ, tƣơi tốt B18 2B 1991 0713389 1168187 Cây trung bình, tƣơi tốt B19 2B 1991 0714899 1168188 Cây trung bình, mọc yếu, bị mối B20 2B 1991 0715316 1168346 Cây trung bình, tƣơi tốt Phụ lục 6 Bảng giá trị OD của 40 mẫu đƣớc đôi ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) A1 1,8254 8,2763.10 -2 4,5340.10 -2 360 A2 1,7382 6,6635.10 -2 3,8336.10 -2 160 A3 2.2164 5,6665.10 -2 2,5566.10 -2 260 A4 1,8169 4,2361.10 -2 2,3315.10 -2 180 A5 1,6352 5,6522.10 -2 3,4566.10 -2 230 A6 1,9506 8,6454.10 -2 4,4322.10 -2 380 A7 2,0552 5,6654.10 -2 2,7566.10 -2 260 A8 1,9412 6,2356.10 -2 3,2123.10 -2 280 A9 2,3884 5,6464.10 -2 2,3641.10 -2 270 A10 1,6005 8,5556.10 -2 5,3456.10 -2 350 A11 1,9624 3,6549.10 -2 1,8625.10 -2 160 A12 2,3116 7,9646.10 -2 3,4455.10 -2 380 A13 2,1261 5,6432.10 -2 2,6542.10 -2 260 A14 1,9046 7,3621.10 -2 3,8654.10 -2 320 A15 1,7051 1,9871.10 -2 1,1654.10 -2 80 A16 1,8646 2,6544.10 -2 1,4236.10 -2 120 A17 1,6287 4,6125.10 -2 2,8321.10 -2 190 A18 1,7719 6,4695.10 -2 3,6512.10 -2 280 A19 1,8514 3,2516.10 -2 1,7563.10 -2 140 A20 2,0082 5,3216.10 -2 2,6499.10 -2 240 Mẫu Tỉ lệ OD260/OD280 OD260 OD280 Nồng độ DNA (ng/µl) B1 2,1263 5,6423 2,6536 240 B2 1,7581 2,9856 1,6982 260 B3 1,7992 6,3251 3,5156 130 B4 1,8232 5,5654 3,0525 270 B5 2,4233 7,3216 3,0213 240 B6 1,8573 3,4589 1,8623 350 B7 2,3836 7,6542 3,2112 150 B8 1,8182 2,6665 1,4666 370 B9 1,6393 6,2314 3,8012 120 B10 1,5954 5,1245 3,2121 260 B11 1,9138 3,2316 1,6886 210 B12 1,9632 4,6525 2,3699 140 B13 1,9273 7,2316 3,7522 210 B14 1,6467 3,8123 2,3151 320 B15 2,0833 5,3215 2,5543 160 B16 1,7949 8,6554 4,8222 240 B17 1,6527 8,6321 5,2231 370 B18 2,4006 3,6521 1,5213 360 B19 2,1176 5,3621 2,5321 180 B20 1,8210 6,2137 3,4123 250