Khóa luận Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu đa dạng di truyền của cây mắm biển (avicennia marina) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2003 – 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN: LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS. BÙI MINH TRÍ LÊ ĐỨC TUÂN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 ii LỜI CẢM ƠN Con xin cảm ơn ba mẹ cùng gia đình đã nuôi con đến ngày khôn lớn và cho con ăn học thành tài. Em xin chân thành cảm ơn: Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học. Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận. Thầy Bùi Minh Trí, đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Các anh chị trong Trung tâm Phân tích và Thí nghiệm Hóa Sinh đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa luận. Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thu thập mẫu. Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh, chị trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu. Xin cám ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã cùng tôi chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt 4 năm đại học. Xin chân thành cảm ơn! LÊ ĐỨC TUÂN iii TÓM TẮT LÊ ĐỨC TUÂN, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2007. “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. BÙI MINH TRÍ. Cây mắm biển (Avicennia marina) là một trong những loài thực vật đặc trƣng sinh sống ở rừng ngập mặn đem lại giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao.Tuy nhiên, những thập niên trở lại đây loài mắm biển có dấu hiệu lụi tàn. Vì vậy việc xây dựng chiến lƣợc phát triển lâu dài đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao, vấn đề đánh giá tổng quát quỹ gene và mức độ đa dạng của quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh đƣợc xem là một việc làm cấp thiết. Sau một thời gian thực tập ở Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, chúng tôi đã đạt đƣợc kết quả: - Thu thập đƣợc 52 mẫu lá mắm với những đặc điểm hình thái khác nhau. - Xác định điều kiện tối ƣu để bảo quản mẫu lá mắm. - Hoàn thiện quy trình ly trích DNA từ lá mắm, ly trích tốt 47/52 mẫu - Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm. Qua thử nghiệm trên ba primer: primer 1 và primer RAH8 và primer OPAC10 thì thấy primer OPAC10 cho sản phẩm thể hiện sự đa dạng về di truyền cao. - Kết quả chạy RAPD với primer 1 chỉ cho 1 band đồng hình kích thƣớc 400 bp cho cả ba loài mắm, giúp xác định đƣợc marker chỉ thị cho loài mắm (Avicenniaceae). - Kết quả chạy RAPD với primer OPAC10 cho trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ sự đa hình giữa các mẫu. Chúng iv tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90% và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10%. Kết quả phân tích trên phần mềm NTSYS (Numercial Taxonomy System) phiên bản 2.1, 7 mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40. Nhóm 1 gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00. v MỤC LỤC Chƣơng Trang Trang tựa .............................................................................................................. ii Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii Tóm tắt ................................................................................................................. iv Mục lục ................................................................................................................. v Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... viii Danh sách các hình ............................................................................................... ix Dang sách các bảng .............................................................................................. x Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................... 1 1.2 Mục đích, yêu cầu ....................................................................................... 2 1.2.1 Mục đích ..................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ....................................................................................................... 2 1.2.3 Hạn chế của đề tài ..................................................................................... 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 3 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học ........................................................ 3 2.1.1 Đa dạng sinh học ......................................................................................... 3 2.1.2 Đa dạng di truyền ........................................................................................ 3 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền .......................................... 4 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................... 4 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ......................................... 4 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ ....................................... 8 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............ 9 2.3 Cây mắm biển.......................................................................................... 11 vi 2.3.1 Hình thái học ........................................................................................... 11 2.3.2 Nơi sống và sinh thái............................................................................... 12 2.3.3 Phân bố .................................................................................................... 12 2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật ............................................................... 13 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ .................................... 14 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di .................................. 15 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền.......................................... 16 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử ................ 16 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái ....................................................................................... 17 2.5.1.2. Chỉ thị isozyme ....................................................................................... 17 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA ................................................................. 18 2.5.2 Kỹ thuật PCR .......................................................................................... 18 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR ......................................................................... 18 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR........................................................ 19 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR ....................................................................... 21 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) ........... 22 2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..................... 22 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD .................................................................. 25 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD ............................................................ 25 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD ................................................................ 25 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ........................... 27 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................. 27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu .............................................................................. 27 3.1.2 Địa điểm thực hiện .................................................................................. 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm .................................................................................. 27 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 27 vii 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA ........................................................... 27 3.3.2 Quy trình ly trích DNA ............................................................................. 31 3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA .................................................................. 33 3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD ......................................................................... 34 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD.................................... 34 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 35 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS ............................................. 38 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 40 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ ........................ 40 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA ............................. 41 4.2.1 Bảo quản mẫu .......................................................................................... 41 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích ................................................................... 41 4.3 Kết quả chạy RAPD ................................................................................ 43 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 ...................... 43 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng .............................. 44 4.3.3 Thí nghiiệm 3 .......................................................................................... 45 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 48 5.1.1 Kết luận ..................................................................................................... 48 5.1.2 Đề nghị ...................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 50 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 52 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp: Base pair CNMT: Công Nghệ Môi Trƣờng CNSH: Công Nghệ Sinh Học DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxynucleotide triphosphate E: East EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid EtBt: Ethidium bromide N: North. OD: Optical density PCR: Polymerase chain reaction RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature TE: Tris EDTA. TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA. UNESCO: United Nations Educational Scientific, and Cultural Organization UV: Ultra Violet ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ................ 5 Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm ........................................................ 11 Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR ........................................................ 21 Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền ........................................................................................................ 25 Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) ........................................................... 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ ................................................ 42 Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 .................................................... 44 Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) ........ 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 .......................................................... 45 Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 ....................................................... 46 Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 ....................................................... 47 Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ ........................................................................................................ 48 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác nhau ...................................................................................................................... 16 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác nhau ...................................................................................................................... 16 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 .......................... 36 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 . 37 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 .......................... 37 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 .......................... 38 1 Chƣơng 1 LỜI MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Mắm biển (Avicennia marina) là một nhóm các loại cây rừng ngập mặn, phân bố rộng khắp trên toàn thế giới trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa triều lên và triều xuống về phía Nam của Bắc chí tuyến [17]. Sau 22 năm khôi phục, tổ chức UNESCO sau khi kiểm tra công trình rừng ngập mặn Cần Giờ đã thống nhất công nhận là khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn vào ngày 21/01/2000 [18]. Ở nƣớc ta, cây mắm thƣờng sống ở những vùng rừng ngập mặn nhƣ Cần Giờ, Long An, Củ Chi… dùng làm liệu xây dựng là cây có giá trị kinh tế và môi trƣờng rất cao. Gỗ mắm đƣợc sử dụng rộng rãi để xây dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than mắm cho nhiệt lƣợng cao và ít khói. Các khu rừng mắm có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc hoá, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Mặt khác, các khu rừng mắm là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã. Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, đƣợc sự hƣớng dẫn của TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài “HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN TRÊN QUẦN THỂ MẮM BIỂN (Avicennia marina) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 2 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích  Bƣớc đầu phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể mắm từ các mẫu  Hoàn thiện kỹ thuật RAPD trên cây mắm biển.  Đánh giá về mặt di truyền quần thể mắm trồng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.  Ứng dụng trong tuyển chọn giống mắm phục vụ cho việc tái tạo rừng ngập mặn trong tƣơng lai. 1.2.2 Yêu cầu  Thiết lập phƣơng pháp ly trích DNA và bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD thích hợp cho cây mắm biển.  Thu thập mẫu lá từ những cây mắm biển có tuổi khác nhau và có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, có màu sắc trái khác lạ…  Ly trích đƣợc DNA từ mẫu lá mắm với độ tinh sạch cao.  Thu thập đƣợc bằng kỹ thuật RAPD.  Vẽ cây phân loại loài bằng phần mềm NTSYS. 1.2.2 Hạn chế của đề tài  Chỉ nghiên cứu đa dạng di truyền của một vài quần thể ở rừng ngập mặn Cần Giờ  Không có đủ điều kiện để thu thập lƣợng mẫu lớn.  Chỉ tiến hành chạy RAPD trên 3 primer.  Thời gian thực hiện từ 20/04/2007 đến 30/08/2007. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 2.1.1 Đa dạng sinh học Theo quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên - WWF (Word Wildlife fund) (1989), đa dạng sinh học đƣợc định nghĩa nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là các gen chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp tồn tại trong môi trƣờng”. Do vậy đa dạng sinh học đƣợc xem xét theo 3 mức độ:  Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất, từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.  Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần thể sống cách ly về địa lý cũng nhƣ các cá thể cùng chung sống trong một quần thể.  Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng nhƣ các quần xã sinh vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tƣơng quan giữa chúng với nhau (Phạm Bình Quyền, 2002).  Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân biệt có tầm rộng và là chiến lƣợc nghiên cứu của nhiều nƣớc trên thế giới. 2.1.2 Đa dạng di truyền Các cá thể trong một quần thể thƣờng có genome khác nhau. Sự đa dạng về genome đƣợc biểu hiện qua sự khác nhau về gen giữa các cá thể. Những alen khác nhau của cùng một gen có thể làm cho sự phát triển các đặc điểm sinh lý ở mỗi cá thể khác nhau là khác nhau. Những cây trồng đƣợc trồng lai ghép hay những động vật đƣợc lai tạo từ những genome khác nhau có thể tạo ra những giống cây trồng, 4 vật nuôi cho năng suất cao, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt (Richard B. Primack, 1999). Trong quá trình sinh sản hữu tính, kiểu gen của các cá thể trong quần thể sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp do đột biến. Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sự tồn tại các kiểu gen dị hợp trong quần thể. Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể cho phép các quần thể này thích nghi hơn với những thay đổi môi trƣờng (Richard B. Primack, 1999). 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và nó cũng quan trọng đối với con ngƣời. Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời. 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ, đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai-Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành Phố Hồ Chí Minh có toạ độ địa lý nhƣ sau: Vĩ độ Bắc: 100 22’14’’ - 100 37’39’’ Kinh độ Đông :1060 46’12’’ – 1070 00’59’’ Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000. Tổng diện tích: 71.370 ha. Dân số: 57.403ngƣời. Tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,Tp. Hồ Chí Minh 5 Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu. Khí hậu Cần Giờ có hai mùa rõ rệt: mùa mƣa từ tháng 5 -10 và mùa nắng từ tháng 11 – 4. Nhiệt độ trung bình 25,80C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.300 – 1.400 mm/năm. Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp 6 Cách Tp. Hồ Chí Minh 30 – 40 km theo đƣờng chim bay, rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc gọi là “Lá phổi xanh của Thành phố” với chức năng điều hoà không khí, giảm ô nhiễm và hấp thu CO2 do các hoạt động công nghiệp. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc công nhận là khu rừng phòng hộ từ năm 1991. Ủy ban nhân dân Tp. Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tƣ xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002 - 2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001. Rừng ngập mặn tập trung ở huyện Cần Giờ (phía Nam Thành phố) vốn là rừng nguyên sinh, xuất hiện đã lâu năm theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi cửa sông ven biển; ƣu thế loài cây mắm (Avicenniaceae) có kích thƣớc lớn; với hệ thực vật khá phong phú khoảng 104 loài thuộc 48 họ [14]. Thời thuộc Pháp, nó là rừng cấm, song khoảng từ năm 1961 - 1970 bị các đợt khai quang rải chất độc hóa học của Mỹ, nên có tới 80% diện tích rừng vùng này bị hủy diệt, khiến đại bộ phận đất đai trở thành những trảng cỏ cây bụi thứ sinh. Từ năm 1978, thành phố Hồ Chí Minh đã đầu tƣ trồng phục hồi hàng chục ngàn ha rừng mắm, chủ yếu tập trung vào khoảng thời gian 1978 – 1986 [16]. Về cấu trúc quần thể thực vật rừng ngập mặn, sự phân bố các quần xã phụ thuộc rõ rệt vào điều kiện lập địa - mà ở vùng ngập mặn, thì mức độ ngập thủy triều và độ dẽ chặt của đất là yếu tố chi phối chủ yếu. Nhìn chung, các quần xã thực vật quen thuộc ở rừng ngập mặn phía Nam nƣớc ta, hầu nhƣ đều hiện diện tại Cần Giờ. Ngoài một số trên diện tích không lớn đất "giồng" đã đƣợc canh tác nông nghiệp và trồng cây vƣờn ra, ở Cần Giờ hiện có các quần xã thực vật tự nhiên chủ yếu, đƣợc hình thành và phân bố tuần tự từ nơi đất thấp, bùn lỏng chƣa cố định đến nơi cao ít ngập triều đất đã cố định, nhƣ: quần xã mắm có các hợp tác xã mắm thuần loại- mắm trắng (Avicennia alba), mắm đen (Avicennia officinalis); các quần xã mắm hỗn giao với đƣớc hoặc với bần trắng (Sonneratia alba); quần xã dà + mắm có các xã hợp dà + mắm đen (ceriop tagal + Avicennia alba); quần xã chà là có các xã hợp chà là thuần loại (Phoenix paludosa), chà là + ráng đại (Acrostichum aureum), chà là + giá (Excoecaria agallocha) và nhiều loài cây khác nhƣ sú, cóc (Lumnitzera 7 racemosa)…, thể hiện quy luật diễn thế thảm thực vật rừng ngập mặn, theo độ cao địa hình một cách rõ rệt và nhạy cảm [19]. Từ khi phục hồi, môi trƣờng sinh thái vùng ngập mặn Cần Giờ đƣợc cải thiện, chim, thú đã dần dần tái hiện, nhƣ cá sấu, khỉ, heo, chồn, cáo, trăn, rắn.. và hàng chục loài chim. Ðồng thời, sản lƣợng tôm cá vùng rừng ngập mặn cũng ngày càng nâng cao. Tác dụng to lớn của rừng ngập mặn Cần Giờ, là bảo vệ bờ lấn biển và về lâu dài, còn là giữ vai trò "lá phổi" điều hòa khí hậu cho Thành phố, cho các vùng lân cận và tô điểm cảnh quan phục vụ phát triển du lịch [19]. Sau ngày miền Nam hoàn toàn giải phóng 30/4/1975, rừng ngập mặn Cần Giờ thuộc địa phận huyện Duyên Hải, tỉnh Đồng Nai. Đến năm 1978, huyện Duyên Hải đƣợc giao lại cho thành phố Hồ Chí Minh với tổng diện tích toàn huyện lúc đó là 71.361 ha, trong đó diện tích rừng ngập mặn và đất lâm nghiệp là 34.468 ha. Lâm trƣờng Duyên Hải lúc đó trực thuộc Ty Lâm nghiệp Tp. Hồ Chí Minh đƣợc thành lập vào năm 1978. Từ năm 1984 trở đi, một số loài cây khác nhƣ gõ biển (Intsia bijuga), dà vôi (Ceriops tagal), dà quánh (C. decandra), cóc trắng (Lumnitzera racemosa), xu ổi (Xylocarpus granatum), tra (Thespesia populnea)… cũng đƣợc trồng để phủ xanh các vùng đất cao, ít ngập triều. Rừng ngập mặn Cần Giờ là một trong những khu rừng ngập mặn ở Việt Nam mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cƣ. Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35 loài thực vật, phổ biến là mắm quăn (Avicennia lanata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans)… [18]. Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại nhanh chóng ở rừng ngập mặn Cần Giờ nhƣ khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá… trong đó có nhiều loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam nhƣ Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa… Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các loài chim tự nhiên đã và đang hình 8 thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nƣớc ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài qúy hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới [18]. 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp.  Vùng lõi (4.721 ha) Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động của con ngƣời. Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn. Các chức năng chính bao gồm: - Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên. - Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc. - Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều. - Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn.  Vùng đệm (37.339 ha) Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn trong vùng lõi. Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi. Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng 9 Sác, thăm thú sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ngƣời dân, nâng cao ý thức và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển. Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã nhƣ khỉ, rái cá, kỳ đà … kiếm ăn. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm.  Vùng chuyển tiếp: 29.310 ha Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng. Tạo điều kiện thuận lợi và đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng. Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thủy sản, diêm nghiệp và dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ. Đây là vùng chuyển tiếp có nhiều tiềm năng cho hoạt động kinh tế, đặc biệt là phát triển du lịch sinh thái, phát triển nông nghiệp, ngƣ nghiệp và thủy sản bền vững. Hệ thống nhà nghỉ, khách sạn, nhà hàng vùng ven biển Cần Giờ rất hấp dẫn khách du lịch. 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc quản lý theo hệ thống rừng đặc dụng (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) theo quyết định số 173/CT ngày 29/05/1991 do Chủ tịch Hội đồng Bộ trƣởng phê duyệt thành lập Rừng phòng hộ Môi trƣờng. Ủy ban nhân dân Tp. Hồ Chí Minh đã phê duyệt dự án đầu tƣ xây dựng Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ giai đoạn 2002- 2011 theo Quyết định số 8413/QĐ-UB ngày 12/12/2001. 10 Ủy ban nhân dân Huyện Cần Giờ: Trực tiếp quản lý về mặt hành chính, đất đai, tài nguyên rừng cũng nhƣ tất cả các hoạt động kinh tế, xã hội, dân cƣ trên địa bàn huyện. Các cơ quan trực thuộc bao gồm:  Ban Quản lý rừng ngập mặn Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh: Quản lý tài nguyên rừng, thực hiện chính sách bảo vệ rừng, cung cấp nguồn trợ cấp cho các hộ dân trong rừng. Các đơn vị trực thuộc ban quản lý là các tiểu khu. Các tiểu khu chịu trách nhiệm quản lý rừng và các hộ dân sống trong khu vực đó.  Ủy ban nhân dân xã, phƣờng, thị trấn: Quản lý về mặt hành chính trong địa bàn xã, thị trấn. Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn: Quản lý tài nguyên rừng theo ngành, các chủ trƣơng chính sách từ Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Các cơ quan trực thuộc chính gồm:  Chi cục Kiểm lâm: Tuần tra, bảo vệ rừng theo luật pháp hiện hành. Chi cục có các Trạm Kiểm lâm nằm ở các vị trí xung yếu trong rừng để công tác bảo vệ rừng đạt hiệu quả.  Chi cục Phát triển Lâm nghiệp: Xây dựng kế hoạch tổng thể, nguồn nhân lực và tài chính cho công tác trồng và bảo vệ rừng.  Trung tâm Nghiên cứu Khoa hoc Kỹ thuật và Khuyến nông: Cung cấp và tƣ vấn giống cây trồng vật nuôi, các mô hình kinh tế phát triển nông lâm nghiệp hài hoà với môi trƣờng. Sở Du lịch, Sở Tài nguyên và Môi trường, Sở Khoa học và Công nghệ: Quản lý theo ngành về các lĩnh vực liên quan: Phát triển du lịch, nghiên cứu triển khai các đề tài khoa học, công nghệ, hệ thống giám sát môi trƣờng, tuyên truyền giáo dục, đào tạo… Các công ty kinh doanh tư nhân: Bao gồm các công ty dịch vụ du lịch, các chủ đầm nuôi tôm, đánh bắt thuỷ hải sản… tham gia bảo vệ môi trƣờng thông qua việc đóng góp thuế phí… 11 Các trường đại học, viện nghiên cứu: Triển khai các đề tài nghiên cứu khoa học, giám sát, đánh giá tác động môi trƣờng, tuyên truyền giáo dục ngƣời dân nâng cao ý thức bảo vệ rừng… Ban Quản lý khu dự trữ sinh quyển: Ban quản lý khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ dƣới sự quản lý và chỉ đạo trực tiếp của Ủy ban Nhân dân huyện Cần Giờ và Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn với vai trò và nhiệm vụ điều phối tổng thể các hoạt động trên theo đúng tiêu chí của khu dự trữ sinh quyển là kết hợp hài hoà giữa bảo tồn và phát triển kinh tế, đồng thời tạo điều kiện triển khai các đề tài nghiên cứu khoa học, tuyên truyền giáo dục và đào tạo, mở rộng hợp tác quốc tế. 2.3 Cây mắm biển. Tên Việt Nam: Mắm biển Tên La Tinh: Avicennia marina Họ: Verbenaceae Chi: Avicennia Lớp: Magnoliopsida Bộ: Lamiales Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 2.3.1 Hình thái học Cây mắm có thể đạt đƣờng kính gốc và chiều cao khác nhau, có loài đạt đƣờng kính gốc 60 cm và chiều cao 30 m. Cây mắm trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi (cặc mắm) có nhiệm vụ hấp thụ dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phối cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi. 12 Vì thiếu cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đƣớc và vẹt [19].  Hình dáng: Cây gỗ, cao đến 10 m với đƣờng kính 0,5 m, nhánh thấp, tán rộng, cành non, có lông tơ màu trắng hay xám, thân ít khi thẳng, vỏ không nứt, màu trắng với lớp vỏ cóc có dạng phiến mỏng (giống nhƣ vỏ ổi), rễ phổi đứng.  Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến nguyên láng, mỏng, thƣờng quăn queo, hình xoan, đầu nhọn hay tù, chân nêm, dài 3 – 5 cm, bìa nguyên, hơi dợn sóng và có lông ở gân phụ, cuống dài 0,5 cm, nhiều lông nhỏ.  Rễ: Rễ phổi đứng.  Hoa: Hoa vàng, to 5 – 8 mm, có mùi thơm mạnh, tạo thành tán - gié ở ngọn, thƣờng có 3 nhánh, lá bắc phụ hình bầu dục, lõm, tai đài không bằng nhau và có lông tơ, vành hình ống, ngắn hơn cánh, có thùy bằng nhau, dài 1 – 2 mm, tròn dài, 4 tiểu nhị: (2 dài, 2 ngắn), bầu nhụy hình trụ, tròn ở dƣới, không vòi nhụy. Trổ bông vào tháng 10 - 12 dƣơng lịch.  Quả: Trái hình tim, dài 1,5 – 2 cm, vỏ màu vàng xanh, đầy lông mịn. Cho trái mắm vào tháng 4 - 6 dƣơng lịch. 2.3.2 Nơi sống và sinh thái. Tại rừng sát Cà Mau, thƣờng gặp loài này trên đất bồi đã dẽ chặt, dọc bờ biển ít ngập bởi nƣớc triều, tạo thành quần thụ đơn thuần hoặc hỗn giao với các loài Avicennia officinalis (mắm đen), Excoecaria agallocha (giá) và Ceriop decandra (dà quánh). 2.3.3 Phân bố  Việt Nam: Bà Rịa – Vũng Tàu, Cà Ná, Phan Rang (Bình Thuận).  Thế giới: Thái Lan, Inđônexia, Philippin, Ai Cập, Soudan, Ả Rập, Phi Châu, Bồ Ðào Nha, Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Xri Lanca, Trung Hoa (Hải Nam), Ðài Loan, Hồng Kông, Nhật (Ryukyu), Tân Tây Lan, Madagascar, Úc Châu ... 13 2.4 Quy trình ly trích DNA thực vật Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997)… Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc:  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền). Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS, Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các enzyme thuỷ phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-196oC). Sau đó sử dụng chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học).  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein. Sự loại bỏ này dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid/ protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/ nƣớc). Mẫu đƣợc lắc nhẹ trong dung dịch phenol/chloroform/iso amylalcohol (tỉ lệ 25/24/1). Dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol, chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng thông thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận 14 lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại trên mẫu. Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: - DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. - Có lẫn tạp RNA trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polysaccharide trong mẫu DNA. - Có lẫn tạp polyphenol trong mẫu DNA. 2.4.1 Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA có trong mẫu ly trích. Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA tinh khiết một đơn vị OD260 nm tƣơng ứng với:  50 g/ml DNA sợi đôi.  40 g/ml DNA sợi đơn hay RNA.  20 g/ml oligonucleotide sợi đơn. ` Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide trong mẫu ly trích. Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp protein thì kết quả tính toán sẽ không chính xác. Ngoài đỉnh hấp thụ là 280 nm protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các acid nucleotide và làm 15 sai lệch giá trị thật của nồng độ acid nucleotide. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta tính tỷ lệ OD260 nm/OD280 nm.  Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.  Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều. Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel. 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phƣơng pháp điện di Nguyên tắc của kỹ thuật điện di: Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: Gel agarose và gel polyacrylamide.  Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đôi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Bảng 2.1. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel agarose (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (kb) 0,6  0,8 0,9  1,2 1,2  1,5 1 20 0,5  7 0,5  5 16  Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. (Lƣu ý: Gel polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng. Bảng 2.2. Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau Nồng độ gel polyacrylamide (%, w/v) Kích thƣớc đoạn DNA dạng thẳng (bp) 4 5 8 11 200  800 80  200 40  100 10  50 Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau: Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly trích nhƣ gẫy, lẫn tạp… 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác 17 với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là tính đa dạng di truyền [2]. Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Ngƣời ta thƣờng tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra đƣợc sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị.[2]. Có 3 loại chỉ thị thƣờng đƣợc sử dụng: - Chỉ thị hình thái. - Chỉ thị isozyme. - Chỉ thị phân tử. 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ đƣợc liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà ngƣời ta có thể phát hiện đƣợc. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lƣợng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện đƣợc, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.5.1.2 Chỉ thị isozyme Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy ngƣời ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau đƣợc mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, isozyme có thể đƣợc phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị isozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lƣợng chỉ thị có thể phát hiện đƣợc nhiều hơn, tuy nhiên số lƣợng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng [2]. 18 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA. Là những chỉ thị phân tử DNA đƣợc tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học do số lƣợng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày ngƣời ta càng tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể đƣợc chia ra làm 2 nhóm:  Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP. Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA nào đó trong ống nghiệm, phƣơng pháp này có ba axit nucleic: một DNA dây đôi cần phải khuyếch đại, hai sợi đơn đóng vai trò mồi (primer) với kích thƣớc rất ngắn chạy theo chiều thuận và chiều nghịch trên DNA nền, thêm vào là DNA polymerase, dNTP và một muối Mg2+. 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR Đƣợc miêu tả qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.  Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở nhiệt độ 50oC – 56oC. 19  Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thƣờng đƣợc tiến hành ở 70oC – 72oC. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTP, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ. Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất: Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 20  Nồng độ enzyme: Thƣờng sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu nhƣ nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme.  Các dNTP: Hàm lƣợng các dNTP trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTP (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tƣơng đƣơng nhau.  Hàm lƣợng MgCl2: Nồng độ tối ƣu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hƣởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thƣờng hàm lƣợng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2,5 mM. Chu trình nhiệt:  Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu nhƣ tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau.  Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trƣớc tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo.  Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). 21  Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Ba bƣớc này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ.  Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ đƣợc bảo quản ở 4oC hay –20oC. 2.5.2.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ƣu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trƣng riêng. Các biện pháp tối ƣu đó liên quan đến những vấn đề.  Trình tự của primer: Trình tự của primer xác định kích thƣớc, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ƣớc lƣợng đƣợc nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thƣờng chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).  Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó: Tm = 2 o C x (A+T) + 4 oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981). Với A, T, G, C là số lƣợng các nucleotide tƣơng ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ƣớc lƣợng.  Nồng độ MgCl2: ảnh hƣởng lớn đến kết quả phản ứng, ngƣời ta thƣờng thay đổi nồng độ của MgCl2 trƣớc tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.  Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thƣờng khoảng 200 μM.  Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).  Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thƣờng là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA. 22  Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dƣ thừa.  Tỉ lệ primer/DNA khuôn: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tƣợng dimer – primer sẽ xuất hiện do lƣợng DNA khuôn thấp và lƣợng primer quá cao. Ngƣợc lại, sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản. 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này đƣợc lai với những đoạn dò (probe) đƣợc đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn dò chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [2], [6]. 2.5.4 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trƣớc, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện nhƣ nhau sẽ tạo ra số lƣợng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tƣơng ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lƣợng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến [2], [6]. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải đƣợc biết rõ trƣớc khi chuẩn bị các primer 23 tƣơng ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thập kỷ 90, một kỹ thuật phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi là RAPD (Random amplified polymorphic DNA) đã ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác nhau (William, 1990; Welsh và ctv., 1991). Hình 2.4: Nguyên lý chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên bằng việc dùng một primer chứa một trật tự nucleotide ngẫu nhiên. Thƣờng primer này chứa từ 9 - 12 oligonucleotit, tối thiểu là 4 bp. Có hàng ngàn loại primer chứa khoảng 10 bp nhƣng số lƣợng primer dùng trong nghiên cứu này rất hạn chế. Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn đối diện của DNA khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản đƣợc (thƣờng 200 - 2000 nucleotide) thì đoạn DNA sẽ đƣợc nhân lên. Sự có mặt của sản phẩm này đƣợc quan sát thông qua điện di trên gel agarose hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tƣơng đồng hoàn toàn hay một phần giữa DNA genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thƣớc ngắn nên dễ tìm đƣợc các đoạn tƣơng đồng trên các mạch đơn DNA trong genome. Vì thế, nó là một phƣơng pháp có hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa các cá 24 thể. Ví dụ, tần số tìm thấy sự đa hình RAPD là 0,3 / 1 primer ở cây Arabidopsis thaliana là 0,5 / 1 primer ở cây đậu tƣơng, 1 / 1 primer ở ngô (Lê Duy Thành, 2000). Các ƣu điểm chính của chỉ thị RAPD không cần biết trƣớc trình tự nuleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với một lƣợng nhỏ DNA tính bằng nanogam và trên một số lƣợng mẫu thí nghiệm lớn. Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD thƣờng dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại. Để nghiên cứu sự đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD có thể tiến hành với các bƣớc nhƣ sau:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR.  Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid.  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYS-pc, UPGMA cluster.). Các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa đạng sinh học và nguồn gốc di truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng đƣợc sử dụng cho những mục đích sau:  Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó nhƣ tính trạng chất lƣợng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua (Tatieni và ctv., 1996; Winter và ctv., 1995).  Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể.  In dấu vân tay (DNA fingerprinting).  Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (Somaclonal variation). Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền nhƣng chỉ thị RAPD cũng có một số hạn chế nhƣ sau: 25  Có tính trội (dominant) do đó khó phân biệt đƣợc những gen lặn hay cá thể dị hợp tử.  Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thƣờng không thống nhất.  Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu.  Độ tin cậy còn tuỳ thuộc vào kỹ thuật cá nhân. 2.5.4.1 Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu.  Thao tác đơn giản.  Chất lƣợng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao.  Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.  Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp.  Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [1]. 2.5.4.2 Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD  Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao.  Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.  Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD đƣợc phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhƣng vẫn còn đƣợc sử dụng do ƣu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:  Đánh giá đa dạng di truyền: Đã đƣợc áp dụng trên các đối tƣợng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,… 26  Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tƣơng quan giữa kiểu gene và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv., 1999). 27 Chƣơng 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện. 3.1.1 Thời gian nghiên cứu. Đề tài đƣợc nghiên cứu từ 20/04/2007 đến 30/08/2007. 3.1.3 Địa điểm thực hiện. Mẫu lá mắm đƣợc thu thập tại khu dự trữ rừng ngập mặn Cần Giờ. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và chạy RAPD tại Viện Nghiên cứu CNSH và CNMT Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu thí nghiệm. Mẫu lá mắm thu thập tại 3 tiểu khu 17, tiểu khu 18 và tiểu khu 21 ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Nguyên tắc thu thập mẫu:  Xác định đƣợc vị trí cụ thể của cây lấy mẫu trên bản đồ thông qua hệ thống định vị toàn cầu GPS (Global Position System).  Thu thập lá của cây mắm biển (lá già, lá non, lá bánh tẻ).  Lấy theo đƣờng chéo của từng tiểu khu.  Cách 400 m lấy một mẫu, mỗi mẫu lấy 6 đến 8 lá các loại ( lá non, lá bánh tẻ và lá già ).  Chọn mẫu lá từ những cây có đặc điểm khác biệt nhƣ: thân cây to, cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị mối, cây có u, cây có hình dáng lá khác lạ, … 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA a. Thiết bị và dụng cụ  Chày và cối (Đức).  Bình và khay đựng Nitơ lỏng. 28  Cân điện tử (Ohaus - Mỹ).  Bồn ủ nhiệt (Memmert - Anh).  Tủ lạnh 4oC và -20oC.  Máy Vortex (IKA - Đức).  Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh).  Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức).  Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản).  Lò Viba (Electrolux).  Tủ sấy (Jencons - Anh).  Máy điện di (Biorad).  Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển).  Đầu túyp các loại (Đức).  Pipet các loại (Nichiryo – Nhật Bản).  Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ).  Máy PCR (BioRad – Thụy Điển).  Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản).  Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp). b. Hóa chất ly trích. HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65oC Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc 29 Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc 30 ion hóa trị II nhất là ion Mg ++ khi dùng. Tris-HCl 1M (C4H12ClNO3, M=157,6 g/mol) Dung dịch đệm, đảm bảo môi trƣờng ly trích ổn định ở pH8. Ở độ pH này DNA ổn định nhất Pha 100ml: - 19,7 g bột Tris-HCl + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp121oC/20 phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần 31 EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100 ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: -10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc 3.3.3 Quy trình ly trích DNA Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành thực hiện ly trích DNA tổng số trên 2 quy trình: Quy trình ly trích mẫu tƣơi [Doyle và Doyle (1988)] và quy trình ly trích cải tiến. 32 a. Quy trình 1: Quy trình ly trích mẫu tƣơi theo Doyle và Doyle (1988) gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650 C trong 45 phút.  Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24:1), khuấy bằng vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C.  Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.  Bƣớc 4: Chuyển lấy dịch trong.  Bƣớc 5: Thêm vào 250 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200 C khoảng 30 phút (nên để qua đêm).  Bƣớc 6: Li tâm 5 phút 14.000 vòng ở 100 C. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 7: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 1giờ.  Bƣớc 8: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200 C trong 30 phút.  Bƣớc 9: Li tâm 10 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 370 C trong 30 phút.  Bƣớc 12: Bảo quản mẫu ở 40 C. b. Quy trình 2: Quy trình ly trích của Doyle đƣợc cải tiến bởi Lâm Vỹ Nguyên, 2006 gồm 12 bƣớc:  Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong nitơ lỏng, cho vào eppendorf.  Bƣớc 2: Thêm 1,2 ml dịch trích EB, vortex kỹ ở tốc độ thấp (600 - 800 vòng/phút). Ủ qua đêm ở 55oC. 33  Bƣớc 3: Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 4: Thêm 500 l Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ. Ly tâm 12.000 vòng trong 15 phút ở 4oC. Thu dịch nổi.  Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4. Thu đƣợc V l dịch nổi.  Bƣớc 6: Thêm 0,2 V Sodium acetate 3M và 0,6 V Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ -20oC trong 90 phút.  Bƣớc 7: Ly tâm 10.000 vòng trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.  Bƣớc 8: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 70% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 9: Rửa kết tủa bằng cách thêm 400 l ethanol 100% và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch trong.  Bƣớc 10: Phơi thật khô kết tủa ở nhiệt độ phòng.  Bƣớc 11: Hòa tan kết tủa trong 100 l TE 1X, ủ ở 37oC đến khi kết tủa tan hoàn toàn (có thể ủ qua đêm).  Bƣớc 12 : Bảo quản mẫu ở -20oC. 3.3.4 Kiểm tra kết quả ly trích DNA a. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế. Một cách tổng quát, hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260 nm) – (36 * OD280 nm)] * n Với:  OD260 nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm.  OD280 nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280 nm.  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100). Cách tiến hành: 34  Xây dựng nền: Dùng dung dịch TE 1X để tạo nền.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X: Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD. b. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel. Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 0,8 % ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA trong 15 phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các band trên gel. 3.3.5 Thực hiện kỹ thuật RAPD 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD a) Dụng cụ, thiết bị:  Pipet (0,5 – 10 l, 10 – 100 l).  Đầu túyp (10 l, 100 l).  Eppendorf loại 200 l.  Tủ cấy vô trùng (Anh).  Máy PCR (BioRad – Thụy Điển).  Máy điện di. b) Hóa chất:  Taq polymerase (BioRad – Thụy Điển).  Buffer free Mg++.  MgCl2.  dNTPs 35  Agarose(Pháp)  Loading dye 6X  Ladder 100 bp  Ethidium Bromide.  Nƣớc siêu sạch.  Primer: Sử dụng ba primer: Trình tự của primer 1: 5’ TGCCGAGCTG 3’ và Tm = 40,7 0 C Trình tự của primer RAH8: 5’GAGAGCCAAC 3’ và Tm = 31,9 o C Trình tự của primer OPAC10: 5’ AGCAGCGAGG 3’ và Tm = 34 0 C 3.3.4.3 Bố trí thí nghiệm Nhằm tìm ra đƣợc chu kỳ nhiệt và thành phần hóa chất tối ƣu cho kỹ thuật RAPD trên cây mắm, chúng tôi đã tiến hành 3 thí nghiệm.  Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và bảng 3.2 Bảng 3.1. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/µl 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 18,3 l Tổng thể tích phản ứng 25 l 36 (Nguyễn Thị Lang, 2002) Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 33 94 1 34 1 72 1 1 72 10 Giữ ở 40 C (Nguyễn Thị Lang,2002)  Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và bảng 3.4 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 2 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 17,8 l 37 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 40 1 72 2 1 72 15 Giữ ở 40 C  Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10, với thành phần các chất và chu kỳ nhiệt đƣợc thể hiện ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 3 Hóa chất Nồng độ đầu Lƣợng hút Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 pmol/ l 0,3 l 1,2 pmol/µl Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 20 ng/ l 1 l 20 ng H2O 17,8 l 38 Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 3.6. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 36 1 72 2 1 72 15 Giử 40 C Một số lƣu ý khi thực hiện phản ứng RAPD: Trong thành phần của phản ứng, Taq polymerase đƣợc sử dụng với thể tích rất nhỏ (0,1 - 0,2 l) và không có pipet nào có thể hút chính xác một thể tích nhỏ nhƣ vậy. Vì vậy, để đảm bảo độ chính xác của thí nghiệm, thông thƣờng ngƣời ta trộn một lần nhiều phản ứng, sau đó đem chia ra các ống và cho DNA mẫu vào sau cùng. Các thao tác trộn mẫu phải đƣợc thực hiện trong tủ cấy vô trùng nhằm tránh sự tạp nhiễm. Trong quá trình trộn mẫu, hóa chất và DNA mẫu phải đƣợc giữ lạnh để tránh hƣ hỏng. Các thao tác trộn mẫu phải tiến hành nhẹ nhàng, tránh tạo bọt trong quá trình trộn. 39 Taq polymerase phải đƣợc bỏ vào sau cùng. Sau khi đã cho Taq vào trong hỗn hợp, các thao tác tiếp theo phải tiến hành nhanh chóng vì Taq sẽ hoạt động ngay. 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS Các band thu đƣợc từ kết quả điện di số liệu từ RAPD đƣợc mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1. Band nào có thì chuyển thành 1, band không có chuyển thành 0. Bảng mã hóa đƣợc lƣu dƣới dạng file excel và chuyển sang phần mềm NTSYS phiên bảng 2.1 để xử lý. Số liệu này sẽ đƣợc sử dụng để xây ma trận tƣơng đồng (Similarity matrix) hoặc ma trận khoảng cách (Distance matrix). Các ma trận này biểu hiện cho mối quan hệ xa gần về mặt di truyền giữa các mẫu phân tích và đƣợc xây dựng trên công thức toán học của Nei và Li (1979). Sxy= 2nxy/ (nx + ny ) XY: số băng giữa hai mẫu. X: số băng của mẫu x. Y: Số băng của mẫu y. Sxy: Hệ số tƣơng đồng giữa 2 mẫu x và y. Từ Sxy ta tính đƣợc khoảng cách di truyền giữa x và y. Dxy= 1 - Sxy Từ kết quả phân nhóm dựa trên kiểu gen và nhận xét mối tƣơng quan dựa trên các đặc điểm hình thái, rút ra kết luận về sự đa dạng di truyền ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ. Chúng tôi đã tiến hành thu thập 52 mẫu lá mắm ở 3 tiểu khu 17; 18 và 21 với những đặc điểm hình thái khác nhau, sau đó nghiên cứu sự đa dạng di truyền. (A) (B) Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) 41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA 4.2.1 Bảo quản mẫu Mẫu lá sau khi thu thập đƣợc đƣa vào trung tâm phân tích bảo quản ở -20 0 C, bảo quản mẫu ở nhiệt độ này thì mẫu vẫn còn tƣơi sau 2 tuần điều này rất thuận lợi cho việc phân tích DNA.Trƣớc khi cho mẫu vào túi nilong thì phải ép cho không khí ra ngoài rồi mới buộc miệng túi lại. Làm nhƣ vậy sẽ giữ cho mẫu không bị hóa nâu trong một thời gian tƣơng đối dài. Việc trữ mẫu đã nghiền trong nitơ lỏng ở điều kiện -70oC có thể trữ đƣợc trong vòng 20 ngày và mẫu nhanh chóng bị hƣ hỏng (hóa nâu, dập…) ngay khi vừa lấy ra khỏi tủ lạnh. Để đạt đƣợc kết quả ly trích tốt nhất nên ủ mẫu với dịch trích EB ngay khi vừa nghiền xong. 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích Ban đầu chúng tôi thực hiện theo quy trình 1 [Quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)]. Kết quả chúng tôi không thu đƣợc DNA mẫu hoặc là lƣợng DNA thu đƣợc không tinh sạch bị smear và gẫy vụn rất nhiều. Điều này có thể là do quá trình bảo quản mẫu không tốt làm cho mẫu bị hƣ hỏng. Ngoài ra còn có thể do các thao tác ly trích chƣa đƣợc chuẩn nhƣ vortex quá mạnh, nghiền mẫu quá mạnh làm DNA bị đứt gẫy. Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình này hoàn toàn không tinh sạch và không đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. 42 Việc ly trích DNA từ mẫu mắm gặp nhiều khó khăn vì lá mắm có chứa nhiều polysaccharide làm cho dịch trích rất nhớt. Có thể chất nhớt này đã hạn chế sự kết tủa của DNA và làm cho DNA bị trôi đi khi đổ bỏ dịch trong ở bƣớc 6, 9, 10, 11. Đồng thời trong lá mắm còn chứa nhiều chất thứ cấp nên làm hạn chế tác dụng của các hóa chất ly trích. Sau nhiều lần thay đổi một số yếu tố nhƣ thời gian ủ, lƣợng mẫu, tốc độ ly tâm, thử nghiền mẫu trong nitơ lỏng … chúng tôi đã hoàn thiện và quyết định ly trích theo quy trình 2 (Quy trình cải tiến). Mẫu DNA thu đƣợc từ quy trình 2 tốt và đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD. Qua quá trình hoàn thiện quy trình ly trích, chúng tôi rút ra một số kết luận:  Việc sử dụng nitơ lỏng trong giai đoạn nghiền mẫu cho kết quả ly trích tốt hơn so với mẫu nghiền trực tiếp với dịch trích EB. Mẫu lá mắm sau khi nghiền với nitơ lỏng nên ủ ngay với dịch trích EB để cho kết quả tốt hơn.  Tăng thời gian ủ mẫu và giảm nhiệt độ ủ giúp cho lƣợng DNA đƣợc phóng thích tốt hơn.  Giảm tốc độ ly tâm tránh cho DNA bị đứt gẫy.  Việc ly tâm và thu dịch nổi trƣớc khi thêm chloroform có thể đã loại bỏ đƣợc phần lớn chất thứ cấp trong lá mắm giúp cho chloroform có tác dụng tốt hơn.  Ly trích DNA từ mẫu lá mắm non sẽ dễ dàng hơn và DNA ly trích đƣợc có độ tinh sạch cao hơn. Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 Từ kết quả ly trích thể hiện ở hình 4.3, chúng tôi thấy rằng lƣợng DNA bị đứt gãy và smear rất nhiều không thể dùng để chạy RAPD. 43 Do đó chúng tôi tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (quy trình 2). Sản phẩm DNA cho kết quả tốt đủ điều kiện để thực hiện RAPD. Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) Tuy nhiên kết quả đo OD cho thấy tỷ lệ mẫu đạt tiêu chuẩn còn thấp. Điều này là do những mẫu đó đã đƣợc ly trích lâu và trữ ở 4oC làm mất dần lƣợng DNA trong mẫu. Vì vậy chúng tôi quyết định trữ mẫu ở nhiệt độ -20oC. Quy trình ly trích sử dụng -mercaptroethanol có tác dụng phá hủy mạnh thành tế bào giúp cho việc giải phóng DNA hiệu quả hơn, muối sodium acetate làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA và cho chloroform isoamyl acohol 2 lần với việc ly tâm tốc độ cao giúp loại bỏ đƣợc tạp chất nhƣ protein, polysaccharide... qua đó chất lƣợng DNA thu đƣợc tốt hơn. Nhìn chung quy trình ly trích khá ổn định và hiệu quả, vấn đề là tìm cách hạn chế sự đứt gãy của DNA, điều này phụ thuộc nhiều vào các tác nhân cơ học nhƣ nghiền mẫu, vortex mẫu. Chúng tôi tiến hành ly trích trên 52 mẫu, kết quả thu đƣợc DNA trên 47 mẫu đạt hơn 90%. Những mẫu ly trích không thành công là những mẫu lá đã trƣởng thành. Điều này là do lá trƣởng thành chứa nhiều chất thứ cấp nhƣ phenol, polysaccharide … làm ảnh hƣởng đến hoạt tính của hóa chất ly trích và làm mất một lƣợng lớn DNA trong quá trình loại bỏ tạp chất. Ngoài ra, việc bảo quản mẫu không tốt cũng là nguyên nhân làm cho lƣợng DNA trong mẫu bị mất đi. 4.3 Kết quả chạy RAPD 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1. Qua thí nghiệm 1, chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.5. 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 Ở thí nghiệm 1, chúng tôi thực hiện PCR 2 mẫu thử nghiệm. Kết quả điện di thể hiện cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại rất mờ không thể phân biệt rõ các band. Do đó kết quả này chƣa có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền trên quần thể mắm biển. Điều này có thể do một số nguyên nhân nhƣ:  Chất lƣợng mẫu chƣa tốt, còn lẫn nhiều tạp chất làm ảnh hƣởng đến phản ứng PCR.  Lƣợng DNA mẫu chƣa đủ.  Lƣợng Taq DNA polymerase sử dụng chƣa đủ hoạt tính.  Lƣợng primer chƣa đủ.  Chu kỳ nhiệt chƣa tốt, thời gian kéo dài chƣa đủ dẫn đến sản phẩm PCR không hoàn thiện. Với những nhận định trên, chúng tôi đã có những thay đổi trong thành phần hóa chất cũng nhƣ chu kỳ nhiệt để có thể tối ƣu hóa phản ứng PCR ở các thí nghiệm sau. 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở bảng 3.3. Qua thí nghiệm 2 chúng tôi thu đƣợc kết quả thể hiện ở hình 4.6. 45 Ở thí nghiệm 2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR cho 6 mẫu với 6 cây khác nhau đó là đƣng, cóc trắng, đƣớc đôi, mắm đen, mắm biển và mắm trắng, các mẫu này đƣợc chạy cùng 1 chu kỳ và cùng một nồng độ giống nhau. Kết quả điện di cho thấy, 3 mẫu: mắm đen; mắm biển và mắm trắng đều chỉ cho 1 band đồng hình có kích thƣớc khoảng 400 bp. Do chỉ có một band đồng hình nên kết quả ở thí nghiệm 2 không có ý nghĩa trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền. Tuy nhiên có thể band 400 bp này là band đặc trƣng cho họ mắm (Avicenniaceae) và có thể là marker để phân biệt loài mắm với các loài khác. Do đó nên tách band này để giải trình tự nhằm phục vụ cho công tác nghiên cứu đặc thù cây mắm ở rừng Cần Giờ. 4.3.3 Thí nghiệm 3: Sử dụng primer OPAC10 với chu kỳ nhiệt ở bảng 3.5. Qua thí nghiệm 3, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở hình 4.6. Kết quả điện di PCR tốt, cho độ đa hình cao. Chúng tôi thực hiện chạy RAPD với primer OPAC10 trên 5 mẫu kết quả thu đƣợc trung bình 6 band/mẫu. Số lƣợng band/mẫu không cao nhƣng lại thể hiện rõ 46 sự đa hình giữa các mẫu. Chúng tôi thu đƣợc 9 band đa hình chiếm tỷ lệ 90 % và 1 band đồng hình chiếm tỷ lệ 10 % (kích thƣớc cụ thể không xác định), kích cỡ của các band khoảng từ 300 bp – 1200 bp (hình 4.8). Band đồng hình có mặt trong tất cả các mẫu còn band đa hình có ở mẫu này nhƣng không có ở mẫu kia. Các band đa hình là cơ sở phân biệt giữa các mẫu có tính trạng khác nhau từ đó làm nền tảng để phân chia và xác định giống. Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại rừng Cần Giờ Từ kết quả thu đƣợc trên gel điện di chúng tôi mã hóa thành dạng nhị phân 0 và 1 để phân tích mối tƣơng quan di truyền giữa các mẫu nghiên cứu bằng phần mềm NTSYS phiên bản 2.1. Việc phân tích kết quả PCR trên phần mềm NTSYS cho kết quả nhƣ sau:  Năm mẫu mắm đƣợc khảo sát đƣợc chia làm 2 nhóm chính với khoảng cách phân nhóm là 0,40. Nhóm I gồm 4 mẫu: M8, M18, M25, M40. Các cây này có hệ số đồng dạng di truyền cao từ 0,67 – 1,00.  Nhận xét về M1, dựa vào cây phân sinh ở trên chúng tôi thấy rằng M1 có Tiểu khu 21 Tiểu khu 17 Tiểu khu 18 Tiểu khu 18 47 sự khác biệt về mặt di truyền so với 4 cây còn lại. Để giải thích về sự khác biệt này, chúng tôi trở lại nguồn gốc của nó. M1 là giống tái sinh tự nhiên, qua qúa trình hỗn giao và điều kiện môi trƣờng làm cho M1 thay đổi một tính trạng hoặc có thể do sự đột biến. Điểm đặc biệt là giống M1 sống ở bờ biển cho nên có một số thay đổi về mặt di truyền.  Riêng M18 và M40, 2 cây này sinh sống trong một tiểu khu và đƣợc trồng cùng một thời điểm do đó ít thấy sự khác biệt về mặt di truyền. Càng về sau thì hệ số đồng dạng di truyền giữa các cây mắm biển sẽ tăng. Do đó, chúng ta cần trồng xen những giống mắm ở các tiểu khu khác nhau nhằm tạo đƣợc sự đa dạng sinh học cần thiết để tái tạo rừng.  Giữa M8, M25 và M40 có hệ số đồng dạng di truyền rất thấp dao động từ 0,9 đến 1,0. Hiện nay rất khó xác định đƣợc nguồn gốc của các cây này, tuy nhiên, xét về mặt vị trí địa lý thì M8 đƣợc trồng ở tiểu khu 18, còn M18 và M40 đƣợc trồng ở tiểu khu 21.  M25 là giống đƣợc tái sinh tự nhiên và sống chung với các quần thể Mắm trắng, Mắm đen, cũng có thể có một số biến đổi về mặt hình thái.  M1, M8, M18, M25, M40 có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,4 đến 1,00. 48 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.2 Kết luận Từ các kết quả thu đƣợc, chúng tôi rút ra một số kết luận nhƣ sau:  Sử dụng lá mắm non để ly trích sẽ thu đƣợc lƣợng DNA mẫu tốt nhất.  Mẫu lá khi vừa nghiền xong nên ủ ngay với dịch trích EB.  Quy trình ly trích DNA của lá mắm ổn định. Ly trích đƣợc 47 mẫu (trên tổng số 52 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử.  Quá trình bảo quản DNA mẫu rất quan trọng. Một số mẫu DNA đƣợc ly trích đã bị mất dần lƣợng DNA khi bảo quản ở 4oC.  Quy trình RAPD tƣơng đối hoàn thiện.  Sử dụng primer OPAC10 cho số band khuyếch đại cao  Primer OPAC10 dùng trong kỹ thuật RAPD cho 10 band đối với các mẫu thí nghiệm, trong đó có 1 band đồng hình và 9 band đa hình. Primer OPAC10 có tính đa hình đối với quần thể mắm biển (Avicennia marina) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Độ đa hình dạng giữa các mẫu thấp ngoại trừ mẫu M1. 49  Primer 1 dùng trong kỹ thuật RAPD chỉ cho 1 band đồng hình. Primer 1 có thể dùng để làm marker chỉ thị phát hiện giống mắm (Avicenniaceae) với các giống khác ở rừng Cần giờ.  Với việc phân tích RAPD sử dụng primer OPAC10 thì quần thể mắm tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động trong khoảng 0,40 – 1,00. 5.3 Đề nghị  Tối ƣu hóa quy trình RAPD trên cây mắm biển.  Tiếp tục sử dụng primer OPAC10 để đánh giá tính đa dạng di truyền với một lƣợng mẫu lớn hơn đối với quần thể mắm.  Khảo sát thêm các primer khác nhằm có đƣợc kết quả đa dạng di truyền chính xác nhất.  Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể mắm biển (Avicennia marina) nói riêng.  Nghiên cứu thêm về những cây mắm biển có hình thái khác lạ trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 3. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 612 trang 4. Lê Văn Khôi và ctv., 2006. Khôi phục và phát triển hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành Phố Hồ Chí Minh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 5. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 51 7. Lê Đình Lƣơng, 2001. Nguyên lý kỹ thuật di truyền. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 8. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây được đôi (Rhizophora apiculata Blume) ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Khóa luận tốt nghiệp kỹ sƣ Công Nghệ Sinh Học. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. 9. Richard B. Primack, 1999. Cơ sở sinh học bảo tồn. Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 10. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam – Viện Công Nghệ Sinh Học Hà Nội. 11. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 139 – 154. 12. Nguyễn Văn Uyển và Nguyễn Tiến Thắng, 2000. Những kiến thức cơ bản về Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Giáo Dục Tp. HCM. 244 trang. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI: 13. Akira Komiyama, 1998. Mortality and growth of cut pieces of viviparous mangrove (Rhizophora apiculata and R. mucronata) seedlings in the field condition. Forest Ecology and Management, 112: 227 – 231. 14. Brown T. A., 1997. Gene cloning an introduction. Third edition. UMIST, Manchester, UK.. Chapman and Hall. 334 pages. 15. Mukkamala L., 2002. Molecular phylogeny of mangroves IX molecular marker assisted intra-specific variation and species relationships in the Indian mangrove tribe Rhizophoreae. Aquatic Botany, 74: 201 – 217. 16. Tanksley S. D., Ahn N., Cause M., Coffman R., Fulton T., McCouch S. R., Sencond G., Tai T., Wang Z., Wu K., Yu Z.. 1991. RFLP mapping of rice genome. Rice genetic, 2: 435 - 449. Intenational Rice Research Institute. TÀI LIỆU TỪ INTERNET: 52 17. g_quan/ 18. 19. 20. 21. 22. 860066e546/ 53 PHỤ LỤC TÊN MẪU TIỂU KHU TỌA ĐỘ PHÚT GIÂY ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI AM1 18 N 100 26’ 47.2’’ E 1060 54’ 20.7’’ Cây mọc tốt, nhiều nhánh AM2 18 N 100 26’ 47.4’’ E 1060 54’ 22.5’’ Cây thấp, bị sâu ăn AM3 18 N 100 26’ 47.4’’ E 1060 54’ 43.0’’ Cây trung bình, gốc bi sạt lỡ AM4 18 N 100 26’ 43.7’’ E 1060 54’ 49.1’’ Cao 4 m, nhiều nhánh AM5 18 N 100 26’ 33.2’’ E 1060 55’ 15.2’’ Cây cao 5 m, thân yếu ớt AM6 18 N 100 26’ 33.5’’ E 1060 55’ 50.0’’ Cây mọc khỏe, nhiều nhánh AM7 18 N 100 28’ 36.5’’ E 1060 55’ 53.4’’ Cao 7 m, nhiều nhánh, lá xanh tốt, có hoa và trái AM8 18 N 100 28’ 30.5’’ E 1060 55’ 31.9’’ Cao 3m, thân yếu ớt,lá bị sâu ăn AM9 18 N 100 28’ 52.7’’ E 1060 54’ 57.4’’ Cao 6m, nhiều nhánh AM10 17 N 100 23’ 45.0’’ E 1060 54’ 48.4’’ Cây mọc yếu, thân bị mối ăn AM11 17 N 100 24’ 11.8’’ E 1060 53’ 59.8’’ Cao 5 m, thân bị mối ăn AM12 17 N 100 25’ 28.1’’ E 1060 53’ 32.7’’ Cao 6m, lá bị sâu ăn AM13 17 N 100 26’ 33.6’’ E 1060 53’ 17.2’’ Cây mọc tốt, nhiều nhánh AM14 17 N 100 24’ 27.9’’ Cao 7m, gốc bị sạt lỡ 54 E 1060 53’ 53.2’’ AM15 21 N 100 25’ 26.5’’ E 1060 53’ 33.2’’ Cây cao, lá xanh tốt, có hoa và trái AM16 21 N 100 26’ 02.7’’ E 1060 53’ 15.2’’ Cây mọc yếu ớt AM17 21 N 100 26’ 45.1’’ E 1060 53’ 17.8’’ Cây phát triển kém, bị cháy lá 55 Thống kê hiện trạng rừng – đất của 24 tiểu khu thuộc Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ Tiểu khu Rừng trồng (ha) Rừng tự nhiên (ha) Đất trống Đất khác Tổng diện tích (ha) 1 890,41 309,14 29,65 1.229,20 2 1.236,41 355,04 34,03 232,16 1.857,64 3 719,09 449,85 81,22 1.250,16 4 1.200,39 369,20 34,14 137,50 1.741,23 5 772,17 252,15 21,21 99,42 1.144,95 6 980,40 397,79 29,45 125,25 1.532,89 7 624,71 230,83 265,68 1.121,22 8 960,49 133,17 157,84 268,72 1.520,22 9 923,34 440,43 86,06 129,97 1.579,80 10 1.236,58 298,89 5,63 62,53 1.603,63 11 667,28 314,47 5,55 249,52 1.236,82 12 775,53 141,59 261,52 1.178,64 13 898,42 243,55 373,61 1.515,58 14 740,17 299,43 486,33 1.525,93 15 1.024,04 539,97 212,09 414,16 2.190,26 16 782,36 325,82 13,80 492,33 1.614,31 17 1.252,85 569,35 172,77 1.994,97 18 746,54 468,82 466,85 1.682,21 19 518,49 354,16 421,15 1.293,80 56 20 762,90 618,33 80,04 448,73 1.910,00 21 722,62 322,85 5,90 778,16 1.829,53 22 300,83 246,09 2,80 229,93 779,65 23 1.434,00 416,86 1.093,18 2.944,04 24 1.257,42 860,28 57,56 212,04 3.387,30 Tổng 21.427,44 8.958,06 746,10 7.532,38 38.663,98 (Nguồn: Ban quản lý Khu Bảo tồn thiên nhiên rừng ngập mặn Cần Giờ) 57 Bảng ma trận tương đồng một số cây mắm biển ỏ rừng Cần Giờ M1 M8 M18 M25 M40 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1 58 Bảng mã hóa chỉ số di truyền các mẫu chạy RAPD trên primer OPAC10. M1 M8 M18 M25 M40 M1 1,00 M8 0,30 1,00 M18 0,40 0,90 1,00 M25 0,50 0,60 0,70 1,00 M40 0,40 0,90 1,00 0,70 1,00 Mẫu OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm Nồng độ DNA 59 AM1 0.091194 0.052121 1.749659 385.9747 AM2 0.021316 0.012636 1.686926 88.58804 AM3 0.071687 0.042125 1.701769 299.2612 AM4 0.033725 0.022381 1.506858 131.5587 AM5 0.04484 0.019294 2.324039 212.5852 AM6 0.03186 0.015387 2.070579 145.0062 AM7 0.0408 0.020084 2.031463 184.329 AM8 0.0846 0.043811 1.931022 374.4144 AM9 0.099372 0.055977 1.775229 423.5327 AM10 0.087193 0.048581 1.794796 373.5524 AM11 0.080778 0.041681 1.938005 358.042 AM12 0.054111 0.028858 1.875078 236.4694 AM13 0.060632 0.043957 1.379348 223.1301 AM14 0.028961 0.017237 1.680165 120.1115 AM15 0.032535 0.022489 1.446707 123.6848 AM16 0.032067 0.019065 1.681983 133.0674 AM17 0.054854 0.038525 1.423855 206.3417 AM18 0.036523 0.024599 1.484735 141.1733 AM19 0.037981 0.022475 1.689922 157.9905 AM20 0.024727 0.013502 1.831358 106.9256 AM21 0.048591 0.025885 1.877188 212.4514 AM25 0.09906 0.055315 1.790834 423.9534 AM26 0.030023 0.014881 2.017539 135.2731 AM27 0.02886 0.015387 1.875609 126.1362 AM40 0.022709 0.011084 2.048809 102.9372 AM52 0.024727 0.013502 1.831358 106.9256