Khóa luận Định danh và phân nhóm nấm trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM ------ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHĨM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ------- ĐỊNH DANH VÀ PHÂN NHĨM NẤM Trichoderma spp. PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN THỊ KHẢ TÚ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii “Khơng gì cĩ thể so sánh đƣợc tình yêu tơi dành cho mẹ, ba, chị và em tơi, những ngƣời nắm giữ trái tim tơi trọn đời. Tơi luơn cảm thấy ấm áp bởi sự quan tâm và tình thƣơng chân thành của những ngƣời thân tộc dành cho tơi. Khơng bao giờ quên sự quan tâm, chia sẻ và những lời dạy dỗ của Thầy TS. Lê Đình Đơn, một ngƣời thầy lớn. Tơi luơn tự hào vì đã đƣợc học tập và rèn luyện ở trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh nĩi chung và bộ mơn Cơng nghệ sinh học nĩi riêng. Gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Nguyễn Văn Lẫm, chị Trần Thị Vân, Nguyễn Thị Thùy Dƣơng, Phạm Thị Minh Kiều, Trịnh Thị Phƣơng Vy và các Anh, Chị ở viện Nghiên cứu Cơng nghệ sinh học và Cơng nghệ mơi trƣờng, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh đã luơn quan tâm, tận tình giúp đỡ và hƣớng dẫn tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này. Luơn nhớ đến các bạn cùng lớp DH03SH với tơi và các bạn khoa Nơng học cùng làm chung ở phịng 105, bộ mơn Bảo vệ Thực vật, khoa Nơng học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, những ngƣời thật đáng mến. Cĩ những giai đoạn thật khĩ khăn trong cuộc sống và tơi thật may mắn cĩ đƣợc ngƣời bạn đã chịu đựng và luơn làm tơi cảm thấy ấm áp. Cảm ơn mày nhiều lắm Tuyền”. Nguyễn Thị Khả Tú iv TĨM TẮT Đề tài: “Định danh và phân nhĩm nấm Trichoderma spp. phân lập tại Việt Nam” do Nguyễn Thị Khả Tú thực hiện từ 19/3/2007 đến ngày 19/8/2007 tại bộ mơn Bảo vệ thực vật, khoa Nơng học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phịng Cơng nghệ sinh học thực vật, viện Nghiên cứu Cơng nghệ sinh học và Cơng nghệ mơi trƣờng, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Mục đích Định danh tên lồi 11 dịng nấm Trichoderma spp. phân lập ở Việt Nam. Phân nhĩm và xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dịng Trichoderma spp.. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dịng Trichoderma spp. (Trichoderma) với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. Phƣơng pháp thực hiện Kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) với dữ liệu của chúng trên NCBI bằng phần mềm ClustalX 1.83. So sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Kết quả đạt đƣợc Khẳng định tên lồi chính xác 10 dịng Trichoderma. Thiết lập và thể hiện rõ đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dịng Trichoderma. 11 dịng Trichoderma Việt Nam thuộc 5 lồi T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens (trừ dịng T. asperellum (T6)) cĩ quan hệ di truyền khá xa so với các dịng trên thế giới. 10 dịng cĩ nguồn gốc bản địa và dịng v T. asperellum (T6) là dịng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Mối quan hệ di truyền giữa 5 lồi này là bền vững và phù hợp với mối quan hệ về hình thái. Kết luận Với kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 cĩ thể định danh chính xác tên lồi và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa các lồi cũng nhƣ các dịng trong cùng lồi của Trichoderma. Sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA và nhất là trình tự một phần vùng tef1 cĩ thể phân biệt giữa dịng Trichoderma bản địa với các dịng ngoại lai. Mở ra triển vọng cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo của phƣơng pháp định danh trong đề tài. vi ABSTRACT “Identifying and grouping of Trichoderma spp. collected in Viet Nam”, thesis is carried out by Nguyen Thi Kha Tu, from 19 Mar, 2007 to 19 Aug, 2007 at Plant Protection Pepartment, Argonomy Faculty, Nong Lam University and Phytobiotechnology Laboratory, Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong Lam University. This thesis was based on molds identified results then using Clustal 1.83 and Treeview 1.6.6 software to compare ITS – rDNA (Internal Transcribed Space – rDNA) stable and apart of tef1 (EF – 1α, Translation Elongation Factor – 1 alpha) funtional regions with their data on NCBI to identifying species and grouping of 11 Trichoderma genus. Finally, ITS – rDNA and apart of tef1 regions of 11 Trichoderma genus were compared with their data at different ecological, geographic areas on over the world to clear the genetic relationship. The results show that confirming exactly the species of 10 Trichoderma genus, T68 genus was identified T. atroviride. Establishing and clearing the genetic relationship among 11 Trichoderma genus. In which, 11 Trichoderma genus in Viet Nam of 5 species T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum , T. virens (except T. asperellum genus (T6)) have a rather far genetic relationship from others in the world. 10 genus orginated from locality and T. asperellum (T6) is the one migrated in our country. Genetic relationship among 5 species is stable and suitable with morphological characteristics. vii MỤC LỤC TĨM TẮT ................................................................................................................. iv ABSTRACT .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... x DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC HÌNH ...................................................................................... xii Chƣơng 1 ..................................................................................................................... 0 MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 0 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 0 1.2. Mục đích ........................................................................................................ 0 1.3. Yêu cầu .......................................................................................................... 0 Chƣơng 2 ..................................................................................................................... 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 2 2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma ..................................................................... 2 2.1.1. Phân loại................................................................................................... 2 2.1.2. Nguồn gốc ................................................................................................ 2 2.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................... 3 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa, sinh học ....................................................... 4 2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng ....................................... 4 2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma ........................................................................... 6 2.3. Các phƣơng pháp định danh tên lồi nấm Trichoderma ................................ 7 2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA ........................................... 9 2.5. Giới thiệu về vùng tef1 ................................................................................. 10 2.6. Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass ....................... 10 2.7. Các nghiên cứu cĩ liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA .................. 11 2.8. Các nghiên cứu cĩ liên quan đến định danh và phân nhĩm Trichoderma ... 13 Chƣơng 3 ................................................................................................................... 15 viii VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................................................ 15 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu .................................................. 15 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................... 15 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................ 15 3.2. Hố chất ....................................................................................................... 16 3.3. Dụng cụ và thiết bị ....................................................................................... 17 3.4. Phục hồi các dịng Trichoderma. ................................................................. 17 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma ............................................................ 17 3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma ............................................................. 18 3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha lỗng DNA ............................................... 18 3.8. Phản ứng PCR .............................................................................................. 19 3.9. Đánh giá kết quả PCR ................................................................................. 21 3.10. Định danh tên lồi các dịng Trichoderma ................................................... 22 3.11. Phân nhĩm tạo phổ hệ di truyền .................................................................. 24 3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dịng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới ............................ 24 Chƣơng 4 ................................................................................................................... 25 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 25 4.1. Kết quả ly trích DNA ................................................................................... 25 4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ........... 26 4.3. Kết quả định danh tên lồi ........................................................................... 27 4.4. Kết quả phân nhĩm tạo phổ hệ di truyền ..................................................... 35 4.4.1. Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 ................................................................................................................ 35 4.4.2. Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA ........ 37 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI...... 39 4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới................................................................. 41 Chƣơng 5 ................................................................................................................... 44 ix KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 44 5.1. Kết luận ........................................................................................................ 44 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT µg: microgram µl: microlite µM: micromol/lite dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate. DNA: Deoxyribonucleic acid EDTA: Ethylene diamin tetracetic acid. PCR: Polymerase chain reaction. RAPD: Random amplified polymorphism DNA. RNA: Ribonucleic acid. SDS: sodium dodecyl sulfate. Taq: Thermus aquaticus. TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid. TE: Tris ethylene diamine tetra acetate. Tm: Melting Tempereture (nhiệt độ nĩng chảy). U: Đơn vị hoạt tính. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3. 1 Các dịng nấm sử dụng để định danh và phân nhĩm trong đề tài ........... 15 Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng ............................... 20 Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng ....... 21 Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ................................................................... 21 Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dịng Trichoderma trên NCBI ....... 22 Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dịng Trichoderma trên NCBI ..................... 23 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T37 với các lồi trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T42 với các lồi trên NCBI ............ 28 Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T38 với các lồi trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T19 với các lồi trên NCBI ............ 29 Bảng 4. 5 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T33 với các lồi trên NCBI ............ 30 Bảng 4. 6 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T2 với các lồi trên NCBI .............. 30 Bảng 4. 7 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T14 với các lồi trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 8 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T85 với các lồi trên NCBI ............ 31 Bảng 4. 9 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T88 với các lồi trên NCBI ............ 32 Bảng 4. 10 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T6 với các lồi trên NCBI ............. 32 Bảng 4. 11 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T68 với các lồi trên NCBI ........... 33 Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên lồi các dịng Trichoderma của đề tài ............... 33 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên mơi trƣờng PDA sau 2 – 3 ngày nuơi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) ................... 3 Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dịng cĩ mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI ............................................................................... 9 Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 . 20 Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên tồn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F .............................. 20 Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút .............................................................. 26 Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha lỗng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút ............ 26 Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, cĩ kích thƣớc 600 bp ...................................................................................... 27 Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1với cặp primer EF1 – 728R và EF1 – 986F, cĩ kích thƣớc 320bp ............................................................. 27 Hình 4. 5 Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS – rDNA (A) và một phần vùng tef1 (B). ...................................................................................................... 36 Hình 4. 6 Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS1– rDNA (A) và ITS2– rDNA (B) ................................................................................................................... 38 Hình 4. 7 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS1(A) và ITS2– rDNA (B) với dữ liệu của chúng trên thế giới. ............................................................................. 40 Hình 4. 8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dịng Trichoderma ....... Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 43 Hình 4. 9 Kết quả so sánh trình tự một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới ........................................... 42 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nấm Trichoderma là một loại nấm mốc cĩ phổ đối kháng rộng đối với các loại nấm gây bệnh hại cây trồng và cĩ khả năng kích thích sự phát triển của bộ rễ cây. Việc khai thác tiềm năng của Trichoderma dƣới dạng chế phẩm sinh học nhƣ một tác nhân sinh học phịng trừ nhiều bệnh hại cây trồng, giúp cho cây sinh trƣởng và phát triển tốt hơn đã và đang đƣợc các nƣớc trên thế giới trong đĩ cĩ nƣớc ta rất quan tâm nhằm tạo sản phẩm nơng nghiệp khơng cĩ dƣ lƣợng thuốc hĩa học là một yêu cầu bắt buộc vì sức khỏe cộng đồng, xuất khẩu và cân bằng mơi trƣờng sinh thái, hƣớng đến một nền nơng nghiệp bền vững. Vì thế, việc định danh chính xác tên lồi và xác định mối quan hệ di truyền của chúng trở nên thật cần thiết. Nhƣng do hệ thống định danh và phân loại của Trichoderma vẫn chƣa hồn chỉnh nên việc chỉ dựa đơn lẻ vào hình thái , trình tự vùng bảo tờn hoặc trình tự các vùng chức năng thì khơng thể định danh chính xác tên lồi của chúng (Gary J. Samuels, 2004). Khĩa luận tốt nghiệp này nhằm mục đích định danh tên lồi với độ chính xác cao, bằng cách kết hợp kết quả định danh dựa vào hình thái với trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 (4th large intron) mà phƣơng pháp định danh chỉ bằng hình thái khơng hồn tồn chính xác. Đồng thời, phân nhĩm tạo phổ hệ di truyền để thành lập dữ liệu chi tiết về quần thể nấm Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên lãnh thổ nƣớc ta. 1.2. Mục đích Định danh tên lồi và phân nhĩm xác định mối qua hệ di truyền giữa 11 dịng Trichoderma phân lập ở Việt Nam. . Xác định mối quan hệ di truyền 11 dịng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. 1.3. Yêu cầu Phục hồi 11 dịng Trichoderma từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn nấm. 1 Nuơi cấy và nhân sinh khối Trichoderma. Ly trích DNA từ sinh khối Trichoderma với độ tinh khiết cao. Thiết lập đƣợc quy trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Xác định đƣợc tên lồi 11 dịng Trichoderma trên cơ sở kết quả định danh dựa vào hình thái kết hợp với kết quả so sánh mức độ tƣơng đồng của trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA) bằng phần mềm ClustalX 1.83. Phân nhĩm và xác định đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dịng Trichoderma thơng qua việc so sánh trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Đánh giá đƣợc mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm ClustalX 1.83 và phần mềm TreeView 1.6.6. 2 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về nấm Trichoderma 2.1.1. Phân loại Trichoderma là một trong những nhĩm vi nấm gây nhiều khĩ khăn cho việc định danh, phân loại do cịn nhiều đặc điểm cần thiết cho việc định danh, phân loại vẫn chƣa đƣợc biết đầy đủ. Theo truyền thống, hệ thống phân loại thƣờng dựa vào sự khác biệt về đặc trƣơng hình thái; đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vơ tính. Năm 1801, Persoon ex Gray đã xác định Trichoderma thuộc giới fungi, ngành Ascomycota, lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae, giống Trichoderma (trích dẫn của Clipson, N. và cs, 2001). Đã cĩ hơn 50 lồi Trichoderma khác nhau đã đƣợc tìm thấy. Trichoderma đƣợc phân thành 5 nhĩm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium và Hypocreanum. Trong đĩ, nhĩm Saturnisporum khơng tìm thấy giai đoạn teleomorph (giai đoạn sinh sản hữu tính, đây là một dạng biến dị từ sự tái tổ hợp do lai chéo ngoại huyết nhƣ trong chu kì cận giới tính) và nhĩm Hypocreanum hiếm khi gặp cĩ giai đoạn này độc lập, chỉ cĩ 3 nhĩm Trichoderma, Pachybasium, Longibrachiatum cĩ giai đoạn teleomorph nên đƣợc gọi là Hypocrea, thƣờng khơng đƣợc dùng với mục đích kiểm sốt sinh học (Gary J. Samuels, 2004). 2.1.2. Nguồn gốc Trichoderma đƣợc tìm thấy khắp mọi nơi trừ ở những vĩ độ cực Nam và cực Bắc. Hầu hết các dịng Trichoderma đều hoại sinh, chúng phổ biến trong những khu rừng nhiệt đới ẩm hay cận nhiệt đới, ở rễ cây, trong đất hay trên xác sinh vật đã chết, hoặc thực phẩm bị chua, ngũ cốc, lá cây hay kí sinh trên những loại nấm khác (Gary J. Samuels, 2004). Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống và khơng sống nội kí sinh với thực vật. Mỗi dịng nấm Trichoderme khác nhau cĩ yêu cầu nhiệt độ và độ ẩm khác nhau (Gary E. Harman, 2000). 3 2.1.3. Đặc điểm hình thái (Gary J. Samuels, 2004) Khuẩn ty (sợi nấm) của Trichoderma khơng màu, cĩ tốc độ phát triển rất nhanh, trên mơi trƣờng PGA ban đầu cĩ màu trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng. Ở một số lồi cịn cĩ khả năng tiết ra một số chất làm thạch của mơi trƣờng PGA hĩa vàng. Hình 2. 1 Khuẩn ty T. harzianum (vùng màu trắng) phát triển trên mơi trƣờng PDA sau 2 – 3 ngày nuơi cấy và tạo thành bào tử (vùng màu xanh) Ở một số lồi Trichoderma cuống bào tử chƣa đƣợc xác định. Cuống bào tử là một nhĩm sợi nấm bện vào nhau. Một số lồi khác cĩ cuống bào tử mọc lên từ những cụm hay những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T. koningii), cĩ kích thƣớc từ 1-7 µm, cĩ hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng nhƣ bơng khơng rắn chắc, những nốt sần dạng này đƣợc tách dễ dàng khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động nhƣ chồi mầm. Bào tử đính của Trichoderma là một khối trịn mọc lên ở đầu cuối của cuống sinh bào tử (phân nhiều nhánh), mang các bào tử trần bên trong khơng cĩ vách ngăn, khơng màu, liên kết nhau thành chùm nhỏ nhờ chất nhầy. Đặc điểm nổi bật của nấm Trichoderma là bào tử cĩ màu xanh đặc trƣng, một số ít cĩ màu trắng (nhƣ T. virens), vàng hay xanh xám. Chủ yếu hình cầu, hình ellip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1.1µm) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài : rộng là hơn 1.4 µm), đa số các bào tử trơn láng. Kích thƣớc khơng quá 5 m. Nhờ cĩ khả năng tạo thành bào tử chống chịu (chlamydospores) mà 4 T. harzianum cĩ thể tồn tại 110 – 130 ngày dù khơng đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng. Chlamydospores là những cấu trúc dạng ngủ làm tăng khả năng sống sĩt của Trichoderma trong mơi trƣờng khơng đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng nên chlamydospores cĩ thể đƣợc dùng để tạo chế phẩm phịng trừ sinh học. 2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa, sinh học Đa số các dịng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất cĩ độ pH từ 2.5 đến 9.5. Phát triển tốt ở pH 4.5 – 6.5. Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ƣu thƣờng là 25 – 30 0C. Một vài dịng phát triển tốt ở 35 0C. Một số ít phát triển đƣợc ở 40 0C (Gary J. Samuels, 2004). Theo Prasun K. M. và Kanthadai R. (1997) hình thái khuẩn lạc và bào tử của Trichoderma khác nhau khi ở những nhiệt độ khác nhau. Ở 35 0C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thƣờng với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thƣờng, ở 37 0C khơng tạo ra bào tử sau 7 ngày nuơi cấy. Trichoderma là lồi sản xuất nhiều kháng sinh và enzyme nhƣ chitinolytic (enzyme phân giải chitin), cellulolytic (enzyme phân giải cellulose), đây là 2 enzyme chính phân giải thành và màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma. Một vài lồi Trichoderma cĩ tác động làm tăng tỉ lệ nẩy mầm. Tuy nhiên cơ chế của tác động này chƣa đƣợc biết (Gary J. Samuels, 2004). Trong quá trình sinh sản vơ tính của Trichoderma cĩ thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sĩt từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện mơi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng trong kiểu gen cũng nhƣ kiểu hình của cùng một lồi Trichoderma. Vì thế, sẽ tạo ra những dịng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dịng rất cĩ ý nghĩa trong nghiên cứu cũng nhƣ trong việc tạo chế phẩm sinh học kiểm sốt mầm bệnh thực vật (Gary E. Harman, 2000). 2.1.5. Cơ chế đối kháng với nấm gây bệnh cây trồng (Gary J. Samuels, 2004) Nấm Trichoderma đƣợc sử dụng để bảo vệ cây trồng chống lại nấm Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia spp., Sclerotinia spp., Botrytis spp., Fusarium spp. và Crinipellis spp. gây bệnh khơ vằn ở lúa; bệnh thối gốc chảy mủ ở cam quýt, sầu riêng; bệnh thối gốc trên các loại cây trồng nhƣ tiêu, bơng, nho, bắp, đậu nành, 5 mận, táo, cà rốt, hành, rau diếp do cĩ tính đối kháng với các nấm hại này bằng cách cạnh tranh dinh dƣỡng, kí sinh với nấm hại hoặc tiết kháng sinh, enzyme (chitinase, β-1,3-glucanase) phân hủy vách tế bào nấm gây bệnh cây trồng. Tiết kháng sinh: T. virens sản xuất gliotoxin và gliovirin, chúng kìm hãm sự phát triển của các lồi Rhizoctonia solani và Pythium spp. Isonitriles đƣợc sản xuất bởi T. hamatum, harzianum, viride, koningii, polysporum giúp hạn chế sự phát triển của nấm bệnh. Ở một vài lồi T. atroviride và T. viride tiết 6-pentyl alpha-pyrone (α – pyrones) cĩ hƣơng dừa, hoạt động của loại phytotoxin này cĩ thể ngăn cản sự nảy mầm của những nỗn bào tử nấm gây bệnh Phytophthrora cinnamomea và bào tử của Botrytis cinnerea. Peptaibols do T. polysporum, harzianum, koningii sản xuất giúp ngăn cản sự tổng hợp enzyme liên kết với màng trong sự hình thành tế bào, đồng thời hoạt động hỗ trợ enzyme phá huỷ thành tế bào ngăn chăn sự phát triển của mầm bệnh và kích thích cây trồng kháng lại mầm bệnh. T. virens, koningii, viride sản xuất sesquiterpenes và polyketides đƣợc T. harzianum sản xuất. Steroids (viridin) là một độc tố thực vật cĩ hiệu lực nhƣ một loại thuốc diệt cỏ giúp hạn chế sự nảy mầm của bào tử, đƣợc sản xuất bởi T. virens. Ký sinh: Trichoderma cĩ thể nhận ra vật chủ của nĩ nhờ cĩ tính hƣớng hố chất, nĩ ký sinh phân nhánh hƣớng về những nấm đã đƣợc định trƣớc (do những nấm này tiết ra các hĩa chất). Ngồi ra, vật kí sinh và vật đối kháng đƣợc Trichoderma nhận dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này cĩ thể do tự nhiên hay hĩa học (qua trung gian là lectin trên bề mặt tế bào của mầm bệnh và vật đối kháng). Đồng thời, Trichoderma kí sinh vào và cuộn quanh sợi nấm vật chủ thơng qua hình thành các dạng mĩc hay dạng giác bám, tiết enzyme chitinase, β – glucanase, protease những enzyme này cĩ khả năng bào mịn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ, đây là khả năng tấn cơng trực tiếp của Trichoderma. Khơng những thế, Trichoderma cịn cĩ khả năng tiết các enzyme phân giải nhƣ chitinase, glucanase, protease giúp bào mịn thành tế bào sau khi kí sinh và cuộn quanh nấm gây bệnh đối kháng với nĩ. Khi kí sinh vào cây T. asperellum tiết cellulase, cho phép nĩ tấn cơng những nấm nhƣ Phytophthora 6 spp. và Pythium spp. khi chúng bám vào cây trồng. Cạnh tranh: Trichoderma cạnh tranh khai thác với nấm gây bệnh cây trồng, làm suy kiệt chúng bằng cách hút hết dƣỡng chất một cách thụ động và dai dẳng bằng những bào tử chống chịu (chlamydospores). Ngồi ra, Trichoderma cịn cạnh tranh mơ già hoặc chết với nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp. gây bệnh cho cây (xâm nhập vào những mơ già hoặc mơ chết, sử dụng chúng làm nền tảng để từ đĩ xâm nhập vào những mơ khoẻ). Nấm Trichoderma sử dụng những mơ già và mơ chết của cây chủ, bằng cách đĩ nấm Trichoderma cạnh tranh và triệt tiêu đƣờng xâm nhiễm của nấm Botrysis spp. và Sclerotina spp.. Khơng những thế, Trichoderma cịn cạnh tranh dịch tiết của cây với nấm Phytium spp. do dịch tiết của cây kích thích sự nảy mầm, mọc thành khuẩn ty của những túi bào tử Phytium spp. (gây bệnh cho cây) và lây nhiễm vào cây. Trichoderma làm giảm sự nảy mầm của nấm Phytium spp. bằng cách sử dụng dịch tiết đĩ vì thế mà các bào tử Phytium spp. khơng thể nảy mầm. Trichoderma cịn đối kháng với các nấm gây bệnh bằng cách chiếm giữ vùng xâm nhiễm của mầm bệnh vào những vị trí bị thƣơng, do đĩ ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh. Ngồi ra, Trichoderma cịn cĩ khả năng cải tạo đất trồng, làm tăng độ phì nhiêu cho đất vì thế làm tăng năng suất cây trồng nhờ khả năng phân giải phospho khĩ tan cĩ rất nhiều trong đất mà cây khơng hấp thụ đƣợc và khả năng tiết các enzyme phân hủy chất hữu cơ nhƣ cellulase, glucanase thành các dạng dễ hấp thu. Bên cạnh đĩ, Trichoderma cũng tác động trực tiếp lên vùng rễ nhƣ loại bỏ mầm bệnh, làm tăng sự sinh trƣởng và phát triển của rễ hoặc từ những điểm mà Trichoderma tác động đến sẽ kích thích cây trồng tăng sản xuất các enzyme bảo vệ và các hợp chất kháng sinh nhờ đĩ giúp cây đề kháng tốt với mầm bệnh. 2.2. Cấu tạo tế bào Trichoderma Nấm mốc nĩi chung (trong đĩ cĩ Trichoderma) cĩ thành tế bào cấu tạo chủ yếu là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl hĩa) và các thành phần khác gồm β – glucan, α – glucan, mannoprotein (Siu-Wai Chiu và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8 – 33%) (Lâm Thanh Hiền, 1999) . Màng 7 tế bào dầy khoảng 7 µm thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%). Nhân phân hĩa, thƣờng hình trịn, đơi khi kéo dài, đƣờng kính khoảng 2 – 3 µm. Ty thể hình elip, luơn di động để tham gia vào quá trình hơ hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999). Những hiểu biết cơ bản về cấu tạo tế bào Trichoderma chính là cơ sở để chúng tơi lựa chọn và cải tiến các phƣơng pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp với nghiên cứu của đề tài. 2.3. Các phƣơng pháp định danh tên lồi của Trichoderma Đến thập niên 1990, việc định danh và phân nhĩm Trichoderma chỉ dựa vào đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh lý (đánh giá các isoenzyme). Năm 1969, Rifai đƣa ra các đặc điểm hình thái của tất cả các lồi Trichoderma. Sau đĩ, Bisett (1984, 1991a, 1991b, 1991c, 1992, 1998 (Gams và Bissett)) bổ sung các đặc điểm hình thái của Hypocrea và Gliocladium, là teleomorphs của Trichoderma. Phƣơng pháp định danh chỉ dựa vào hình thái khơng hồn tồn chính xác do một vài lồi Trichoderma cĩ đặc điểm hình thái rất giống nhau, chỉ khác nhau ở một vài đặc điểm rất khĩ nhận thấy và xác định nhƣ T. asperellum T. viride Chlamydospore nhìn thấy rõ trên đám bào tử non ở mặt sau đĩa petri. Chlamydospore ít thấy hoặc thấy khơng rõ ràng. Bào tử (conidia) cĩ dạng hình cầu hoặc hình oval. Khơng cĩ mùi dừa Bào tử cĩ hình trịn hoặc bán cầu. Cĩ mùi dừa T. longibrachiatum T. sinensis Trên mơi trƣờng PGA khuẩn lạc vẫn tăng trƣởng mạnh ở 40 0C. Khơng phát triển ở 40 0C trên mơi trƣờng PGA. Cành bào tử mọc vuơng gĩc. Cành bào tử mọc khơng vuơng gĩc (nhỏ hơn 900). T. atroviride T. koningii Khơng cĩ pustule (cụm bào tử). Cĩ pustule. 8 Bào tử hình oval. Khơng làm mơi trƣờng PGA cĩ màu Bào tử hình chữ nhật hoặc hình ellip. Làm mơi trƣờng PGA cĩ màu vàng Cĩ nhiều chlamydospore. Khơng cĩ chlamydospore. Cành bào tử mọc khơng vuơng gĩc (nhỏ hơn 900). Cành bào tử mọc vuơng gĩc với trục chính. T. atroviride T. viride Khơng cĩ hoặc ít thấy pustule Pustule xuất hiện nhiều Chlamydospore cĩ nhƣng chỉ nhìn thấy qua kính hiển vi Chlamydospore cĩ và nhìn thấy ở mặt sau của đĩa. Phƣơng pháp định danh và phân loại Trichoderma sau này đƣợc tăng cƣờng bằng phƣơng pháp phân tử . Kết hợp các maker phân tử (ITS1, ITS2, RAPD) với phân tích đăc̣ điểm sinh lý và kết quả phân nhĩm dựa vào hình thái để phân tích các teleomorphs của Trichoderma (Kuhls và cs (1996, 1997), Samuels (1996), Samuels và cs (1998), Turner và cs (1997)). Năm 2004, Druzhinina Irina và cs đã bổ sung hệ thống phân loại và phổ hệ di truyền của Trichoderma/ Hypocrea bằng cách kết hợp hình thái với phân tích sinh lý và phân tử. Hiện nay, vùng ITS – rDNA đƣợc xem là cơ sở đáng tin cậy để phân nhĩm và định danh Trichoderma. Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA và đặc điểm hình thái thì rất khĩ phân biệt đƣợc T. viride với T. koningii và T. atroviride nhƣng nếu phân tích thêm vùng tef1 (large intron) thì hồn tồn cĩ thể phân biệt giữa chúng. Phƣơng pháp định danh GCPSR (Genealogical Concordance Phylogenetic Species Recognition) là phƣơng pháp dựa vào mức độ tƣơng đồng và vị trí phù hợp của dịng Trichoderma phân tích với các dịng trong phổ hệ di truyền. Phƣơng pháp này cho kết quả định danh đáng tin cậy và tiết kiệm đƣợc chi phí, thời gian hơn phƣơng pháp định danh chỉ dựa vào hình thái. Năm 2002, Kullnig-Gradinger và cs sử dụng 4 vùng ITS– rDNA, mitssuDNA, tef1 (short intron thứ 5) và ech42 (large exon) để đánh giá phổ hệ di truyền của các lồi Trichoderma và cho kết quả rất đáng tin cậy. Tuy nhiên, trong định danh bằng phân tử địi hỏi dữ liệu Trichoderma trên GenBank phải nhiều và đầy đủ các lồi. 9 Nhƣng ngay cả khi địi hỏi này đƣợc đáp ứng thì vẫn xảy ra trƣờng hợp trình tự vùng ITS – rDNA của dịng cần định danh khi sƣ̉ duṇg cơng cu ̣Blast trên NCBI thì cĩ độ tƣơng đồng cao với quá nhiều lồi. Do đĩ, hình thái vẫn luơn là nền tảng để định danh, phân nhĩm Trichoderma và phƣơng pháp phân tử chỉ để xác nhận hoặc phân biệt những lồi mới (Kubicek C.P. và cs, 2003). Hình 2. 2 Kết quả Blast từ trình tự vùng ITS – rDNA của dịng cĩ mã số truy cập là AF 3362109 trên NCBI 2.4. Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS – rDNA rDNA (ribosomal DNA) là nhĩm gene mã hố rRNA của ribosome, cĩ nhiều bản sao và khơng mã hố cho bất kỳ protein nào. Đây là vùng gen bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác biệt của các sinh vật cùng lồi hay khác lồi, đĩng vai trị quan trọng trong các nghiên cứu quá trình tiến hố, phát sinh lồi, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của sinh vật cũng nhƣ các dịng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế 10 trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein cĩ kết quả phân loại thƣờng khơng chính xác và cần khoảng thời gian dài (Guarro và cs, 1999). rDNA chứa vùng 18S, ITS1, 5.8S, ITS2, 28S và IGS (Intergenic Spacer, là vùng kém bảo tồn nhất của rDNA). Vùng 5.8S – rDNA cĩ kích thƣớc rất nhỏ và ít cĩ sự biến đổi (Szymanski và cộng sự, 2001). Vùng ITS – rDNA là vùng cĩ rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu tiến hố của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thƣờng để xác định các biệt hố trong cùng lồi để lập phổ hệ di truyền (Guarro và cs, 1999). Các primer thiết kế trên những oligonucleotide cĩ tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật cùng giới nhằm khuếch đại các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh, tạo phổ hệ di truyền. Ngồi ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc thiết kế dựa trên các vùng khơng bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và ctv, 1996). Các primer chúng tơi sử dụng trong đề tài này cũng đƣợc thiết kế theo hai dạng trên. Vùng ITS, các primer đƣợc thiết kế dựa trên vùng bảo tồn 18S, 5.8S và 28S. Primer ITS2 và ITS3 đƣợc thiết kế, sàng lọc dựa trên vùng 5.8S – rDNA của N. crassa, Schizosaccharomyces pombe và S. cerevisiae, Vicia faba chuột. Vùng 28S – rDNA của S. prombe, S. cerevisiae và lúa (Oryza sativa) đƣợc so sánh để thiết kế ITS4. Primer ITS5 cĩ trình tự dựa vào vùng 18S – rDNA của N. crassa, cĩ đầu 5’ chỉ cách primer ITS1 25 bp (White và cs, 1989). 2.5. Giới thiệu về vùng tef1 Là vùng gen cĩ chức năng mã hĩa tạo protein elongation factor – 1α, protein này là nhân tố tham gia vào việc kéo dài chuỗi peptide. Đây là vùng mang tính bảo thủ cao với số bản sao thấp, cĩ chức năng chuyên biệt và đặc trƣng cho từng lồi Trichoderma. Do đĩ, nĩ đƣợc dùng để định danh chính xác tên lồi và phân biệt giữa các nhĩm với nhau hay giữa các lồi cùng nhĩm Trichoderma (Gary J. Samuels, 2005). 2.6. Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass Phƣơng pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lƣợng so với band của 11 phân tử Mass. Mẫu định lƣợng cần phải đƣợc pha lỗng một , hai , ba , …, n lần. Sau đĩ, các mẫu pha lỗng đƣợc kiểm tra bằng điện di và đƣợc so sánh với phân tử Mass, cho đến khi đạt đƣợc sự tƣơng đƣơng về kích thƣớc và độ sáng giữa band của mẫu pha lỗng với band của Mass. Từ đĩ, xác định đƣợc nồng độ của mẫu pha lỗng và tính đƣợc nồng độ của mẫu gốc do cĩ hệ số pha lỗng. Bảng 2.1 Các thơng số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng) 10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp 7 µg 700 bp 70 ng 700 bp 5 µg 500 bp 50 ng 500 bp 2 µg 200 bp 20 ng 200 bp 1 µg 100 bp 10 ng 100 bp Những hiểu biết về phƣơng pháp này là cơ sở để chúng tơi ƣớc lƣợng đƣợc nồng độ DNA ly trích và pha lỗng khi khơng sử dụng phân tử Mass. 2.7. Các nghiên cứu cĩ liên quan đến Trichoderma và vùng rDNA Palmer và cs (1990) đã so sánh trình tự SSU – rDNA (Small Subunit – rDNA) của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín. Kết quả cho thấy trình tự 18S – rDNA của nhân là cĩ nhiều biến đổi nhất. Đến năm 1991 và 1992, Bruns và cs đƣa ra liên tiếp các nghiên cứu trên vùng rDNA để phân nhĩm, nhận biết tính đa Hình 2. 3 Thang chuẩn về nồng độ của phân tử Mass (Bio- Rad) 2,5 µl mẫu chuẩn đƣợc pha lỗng với 10 µl loading buffer và TE đƣợc bơm vào gel agarose 1,8 %. Gel này đƣợc đặt ở hiệu điện thế 70 V trong 75 phút trong đệm TAE 1X. Gel đƣợc ngâm trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg/ ml EtBr) trong 15 phút và đƣợc giữ trong nƣớc 30 phút. 12 dạng và mối quan hệ di truyền của những lồi nấm sợi khi so sánh sự thay đổi trình tự của vùng SSU – rDNA (18S). Dựa trên trình tự vùng 18S, 5.8S và ITS – rDNA, Berbee và cs (1995) đã chứng minh Penicillium spp., Aspergillus spp. và Paecilomyces spp. thuộc lớp Trichocomaceae. Năm 1991, Bruns và cs phân tích trên vùng SSU – rDNA và chia giới nấm thành 4 lớp Acrasiomycota, Myxomycota, Oomycota, và Fungi. Cũng dựa vào phân tích trên vùng này, ngƣời ta cũng đã chứng minh Schizosaccharomycetales cĩ nguồn gốc từ lớp Myxomycota (Guarro và cs, 1999). Khi phân tích trên vùng LSU – rDNA (Large Subunit – rDNA, 24S), Wakefield và cs (1992) cho rằng P. carinii thuộc lớp nấm men Basidiomycete trong khi trƣớc đĩ ngƣời ta thƣờng lầm tƣởng lồi này thuộc nhĩm động vật nguyên sinh. Năm 1994, Leclerc M.C. và cs kết hợp so sánh trình tự vùng LSU – rDNA và SSU – rDNA đã chứng minh S. apiospermum and S. prolificans cĩ quan hệ về di truyền. Muthumeenakshi và cs (1994) đã chứng minh cĩ sự đa hình trên các dịng T. harzianum khi nghiên cứu những thay đổi trong vùng ITS – rDNA. Dùng nấm Trichoderma chống bệnh cho cây bơng, khoai tây và một số cây trồng khác, do Trichoderma cĩ sự cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh: thối rễ cây hồ thảo, thối đen rễ cây bắp cải, dƣa leo, cà chua, bầu bí, bệnh chết ẻo trên cây họ đậu, bệnh chết rạp trên cây thuốc lá, bệnh héo cây ở cây bơng, dƣa hấu, cây ăn trái và hàng loạt các bệnh do nấm gây ra (Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang 1997). Năm 1998, Nguyễn Thị Thuần đã chứng minh nấm Trichoderma cĩ hiệu quả trong phịng trừ bệnh cây trồng do các nấm hại cây trồng. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997) và Nguyễn Thị Thuần (1999) đã đề xuất những loại mơi trƣờng và điều kiện nhân sinh khối nấm Trichoderma với giá thành thấp từ những vật liệu rẻ tiền để tạo chế phẩm sinh học. Gary E. Harman (2000), nghiên cứu cơ chế tạo các enzyme phân huỷ lớp cellulose hay chitin nhƣ cellulase, chitinase, β – 1,3 glucanase của Trichoderma để xác định gene mã hĩa cho các enzyme này, đáp ứng cho nghiên cứu tạo dịng, loại bỏ hoặc gia tăng số lƣợng bản sao của gene vì thế tăng lƣợng enzyme sản sinh ra hoặc biến nạp vào trong cây làm gia tăng khả năng kháng bệnh cho cây. Đồng thời, 13 khi cây đƣợc bĩn vào rễ T. harzianum (T-22) thì giảm 40% lƣợng phân đạm cần bĩn cho một vụ bắp. Ngồi ra, Trichoderma cịn làm tăng sự nảy mầm và phát triển của cây, giúp cho bộ rễ phát triển mạnh hơn và giúp bắp, cải trở nên kháng tốt với khơ hạn và cĩ hiệu lực cao trong sản xuất nhiều loại enzyme ngoại bào trong đĩ cellulase dùng trong xử lý phân cắt polysaccharide (là chất đƣợc sử dụng nhiều trong chế biến lƣơng thực, thực phẩm và trong cơng nghiệp sợi) để làm tăng độ mềm và độ trắng của vải bơng trong cơng nghiệp sợi. Enzyme này cũng đƣợc sử dụng trong thức ăn gia cầm để tăng sự tiêu hố hemicellulose của lúa mạch hay từ những loại tinh bột khác. Trichoderma cịn đƣợc sử dụng để phân giải rác sinh hoạt và các phế thải nơng nghiệp nhờ khả năng tiết ra cellulase, enzyme này bền nhiệt hơn vi khuẩn (Nguyễn Xuân Thành, 2003). Ở viện Năng lƣợng Nguyên tử Việt Nam, Hồng Hƣng Tiến (2005) [49], đang tiến hành nghiên cứu “gây tạo và chọn lọc đột biến Trichoderma chống chịu thuốc trừ nấm hĩa học tồn lƣu trong đất canh tác bằng tia cực tím” [38]. Lê Đình Đơn và cs (2006) đã đánh giá hiệu quả phịng trừ nấm bệnh hại cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T. virens, T. harzianum và T. asperellum (cĩ nguồn gốc trong nƣớc). Thiết lập hồn chỉnh quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của ba loại nấm này và đã đăng ký thƣơng mại ba chế phẩm “Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh” và “BIO – TRI” với bản quyền thuộc trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, gĩp phần tạo sản phẩm nơng nghiệp an tồn trong sử dụng. 2.8. Các nghiên cứu cĩ liên quan đến định danh và phân nhĩm Trichoderma Năm 2002, Christian P. Kubicek và cs giải mã trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron, khuếch đại bằng cặp primer tef1fw và tef1rev) trên 96 dịng nấm đƣợc phân lập từ những địa điểm khác nhau ở Đài Loan, Indonesia, Campuchia, Thái Lan, Burma, Malaysia và Singapore. Kết luận 37 dịng là T. harzianum, 16 dịng T. virens, 8 dịng là T. spirale, T. asperellum cĩ 4 dịng, T. koningii cĩ 3 dịng, T. atroviride cĩ 3 dịng, 1 dịng là T. hamatum, 1 dịng là T. ghanense và 2 dịng là Hypocrea jecorina (anamorph là T. reesei). Và xác định sự 14 tƣơng quan, mối quan hệ di truyền của chúng, trong 4 lồi T. harzianum, T. virens, T. asperellum và T. atroviride thì T. harzianum cĩ quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với T. atroviride cĩ mối quan hệ di truyền gần nhau nhất. Đồng thời, xác nhận phổ hệ di truyền từ đặc điểm hình thái tƣơng đồng với phổ hệ di truyền phân tử vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 (5th large intron). Cũng vào năm này, Christopher R. Thornton và cs cũng sử dụng trình tự vùng ITS – rDNA để xác định mối quan hệ di truyền của các lồi phân lập đƣợc. Trong 5 lồi T. longibrachiatum, T. harzianum, T. virens, T. asperellum và T. atroviride thì T. harzianum cũng cĩ quan hệ di truyền gần với T. virens nhất và T. asperellum với T. atroviride cũng cĩ mối quan hệ di truyền gần nhau nhất, đồng thời T. longibrachianum cĩ mối quan hệ di truyền khá xa với các lồi cịn lại. Khi nghiên cứu trên 83 dịng nấm, Gary J. Samuels (2005) dựa vào hình thái nhận diện 72 dịng là Trichoderma và 19 dịng chƣa xác định chính xác cĩ phải đĩ là Hypocrea hay khơng. Khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2, đọc trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI để xác định tên lồi. Tuy nhiên, chỉ dựa vào vùng ITS – rDNA sẽ ko hồn tồn chính xác vì các lồi vẫn cĩ sự tƣơng đồng lớn về trình tự vùng này do đây là vùng bảo tồn. Do đĩ, việc xác định vùng gen chuyên biệt hơn nhƣ vùng gene mã hố actin (act1), calmodulin (cal1), endochitinase 42 (ech42) và vùng tef1 sẽ giúp việc định danh chính xác hơn, phân biệt đƣợc giữa các nhĩm với nhau hay giữa lồi cùng nhĩm. Lại Hà Tố Hoa (2006), khuyếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với 2 cặp primer ITS4 – ITS5 và ElongR – ElongF của dịng Trichoderma T4 (đƣợc TS. Lê Đình Đơn và cs phân lập và định danh bằng hình thái tại bộ mơn Bảo vệ thực vật, khoa Nơng học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh từ mẫu đất tại huyện Củ Chi, Tp. HCM), giải trình tự và so sánh với những dịng Trichoderma trên cơ sở dữ liệu NCBI và khẳng định tên lồi của dịng T4 là Trichoderma asperellum. Cĩ mức độ tƣơng đồng của vùng ITS – rDNA và vùng tef1fw – tef2rev cùng là 98%. 15 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian, địa điểm, đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Khĩa luận tốt nghiệp này đƣợc thực hiện từ 19/3/2007 đến 8/2007 tại phịng Bảo vệ thực vật, khoa Nơng học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh và viện Nghiên cứu Cơng nghệ sinh học và Cơng nghệ mơi trƣờng – phịng Cơng nghệ sinh học thực vật, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Đối tƣợng nghiên cứu Là 11 dịng Trichoderma phân lập từ các vùng sinh thái, địa lý khác nhau ở Việt Nam, đã đƣợc định danh bằng hình thái và xác định tính đối kháng với các nấm gây bệnh hại cây trồng bởi TS. Lê Đình Đơn và cs, tại bộ mơn Bảo vệ Thực vật, khoa Nơng học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, dựa theo khĩa phân loại Trichoderma của Gary J. Samuels (2004) và tiêu bản chuẩn. Bảng 3. 1 Các dịng nấm sử dụng để định danh và phân nhĩm trong đề tài Ký hiệu Tên lồi định danh dựa vào hình thái Địa điểm phân lập (Quận-Huyện, Tỉnh- Thành phố (đối tƣợng lấy mẫu)) Tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng T38 T. virens Quận Thủ Đức, Tp.HCM (đất) Sclerotium rolfsii (+++) * Pythium spp. (+++) Phytophthora spp. (+) * T14 T. harzianum Huyện Đa Oai, Lâm Đồng (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Pythium spp. (+++) Pythium spp. (+) Phytophthora spp. (++) * T6 Chƣa xác định Tiền Giang (dứa) Pythium spp. (++) Phytophthora spp. (++) Sclerotium rolfsii (++) 16 T37 T. sinensis Đồng Nai (sầu riêng) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T33 T. asperellum Kiên Giang (dứa) Rhizoctonia solani (+++) Phytophthora capsici (+++) T19 T. asperellum Tây Ninh (đậu phụng) Chƣa xác định T2 T. asperellum hoặc T. harzianum Lâm Đồng (trà) Chƣa xác định T42 T. viride Bình Phƣớc (dứa) Chƣa xác định T88 T. asperellum Đồng Nai (đất) Fusarium spp. (+++) Phytophthora spp. (+++) Sclerotium rolfsii (+++) T85 T. harzianum Nghệ An (đất rừng) Fusarium spp. (+) T68 T. atroviride Bình Phƣớc (đất rừng) Sclerotium rolfsii (+++) Rhizoctonia solani (+++) Fusarium spp. (+) (*): (+++) đối kháng mạnh, (++) đối kháng trung bình, (+) đối kháng yếu. 3.2. Hố chất Mơi trƣờng CAM để lƣu trữ nguồn Trichoderma: thành phần gồm bột bắp (30 g), đƣờng dextrose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Mơi trƣờng PGA (Potato Glusose Agar) để phục hồi Trichoderma: thành phần gồm khoai tây (200 g), glucose (20 g), agar (15 – 20 g) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Mơi trƣờng nhân sinh khối Trichoderma: thành phần gồm yeast extract (5 g), KH2PO4 (0.5 g), K2HPO4 (0.5 g), MgSO4 (0.5 g), glucose (20 g), CaCl2 (rất ít) và nƣớc cất vừa đủ 1 lít. Ly trích DNA tổng số Trichoderma: nitơ lỏng, lysis buffer, phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25: 24: 1), chloroform/ isoamyl alcohol (24: 1), isopropanol, ethanol 70 %, dung dịch TE 1X Hố chất cho điện di: gel agarose (gồm glucose và agar), đệm TAE 0.5X (dùng 17 để pha gel và làm buffer chạy điện di), ethidium bromide (nồng độ 5.10-3 % theo thể tích) và blue loading dye 6X (Promega) Hố chất cho phản ứng PCR (Promega): Taq DNA polymerase, 10X PCR buffer, dNTP, MgCl2, forward primer và reverse primer. 3.3. Dụng cụ và thiết bị Bình tam giác (250 ml, 500 ml (Đức)), giấy nhơm, nồi nấp khử trùng Tommy (Mỹ), máy lắc định ơn, máy vortex (IKA Works), ống nghiệm dung tích 15 ml (Đức), bộ cối chày nghiền mẫu (Đức), micropipette (10 l, 100 l, 1000 l (Đức)), tủ lạnh (-70 0C, -20 0C, - 4 0C (Sanyo – Nhật)), máy cất nƣớc 2 lần, máy chụp gel (Biorad – Mỹ), cối sứ và chày giã (Đức), eppendorf (0.2 ml, 05 ml, 1.5 ml (Mỹ), cân phân tích 4 số (Ohaus – Mỹ), máy hút và tủ cấy vơ trùng (Anh Quốc), pipet các loại (Nichiryo – Nhật), máy ly tâm lạnh (Hettich – Đức), bồn ủ nhiệt (Memmert), máy điện di (Cosmo Bio Co. – Nhật) và lị viba (Electrolux – Thụy Điển) 3.4. Phục hồi các dịng Trichoderma: từ những ống nghiệm lƣu trữ nguồn. Cách pha 1 lít mơi trƣờng PGA: 200 g khoai tây đƣợc gọt vỏ cắt nhỏ và đun sơi, lọc qua vải để chỉ lấy phần dịch nƣớc. Thêm vào đĩ lƣợng glucose, agarose nhƣ trên và lƣợng nƣớc cho vừa đủ 1 lít. Đun hỗn hợp trên cho đến khi agarose và glucose tan ra đều. Mơi trƣờng PGA đƣợc cho vào bình tam giác và hấp khử trùng ở 121 0C trong 20 phút bằng autoclave. Để mơi trƣờng nguội bớt rồi đổ khoảng 15 ml mơi trƣờng vào đĩa petri sạch (90 mm), để nguội mơi trƣờng sẽ đơng cứng lại. Dùng que cấy lấy những bào tử từ ống lƣu trữ nguồn Trichoderma, đặt lên giữa mặt thạch PGA trong đĩa petri. Sau 2 – 3 ngày các khuẩn ty Trichoderma sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa. 3.5. Nhân và thu sinh khối Trichoderma Nhân sinh khối Trichoderma: trong mơi trƣờng nhân sinh khối nấm lỏng lắc. Chuẩn bị mơi trƣờng: Tất cả các thành phần mơi trƣờng đƣợc cho vào một với lƣợng nƣớc cất vừa đủ dung lƣợng cần thiết, khuấy đều. Cho vào mỗi bình tam giác 100 ml mơi trƣờng. Hấp khử trùng trong 20 phút ở 121 0C. Để nguội. Cắt 2 khoảng nhỏ thạch chứa sợi nấm mọc trên mơi trƣờng PGA cho vào 18 những bình tam giác trên. Rồi đem lắc với cƣờng độ 150 vịng/ phút ở nhiệt độ phịng, để sợi nấm tiếp xúc tối đa với mơi trƣờng vì thế sợi nấm luơn ở trạng thái sinh trƣởng mạnh nên khơng mọc bào tử. Lắc liên tục cho đến khi sợi nấm mọc nhiều và đều khắp mơi trƣờng (khoảng 2 – 3 ngày), dừng lại và thu lấy sợi nấm. Cách thu lấy sợi nấm: Dùng vải và phễu lọc đã hấp khử trùng và sấy khơ để lọc thu lấy phần sợi nấm, vắt kiệt nƣớc rồi bỏ vào giấy bạc, cán mỏng để khi nghiền trong nitơ lỏng đƣợc dễ dàng, bảo quản ở -70 0C. 3.6. Ly trích DNA tổng số Trichoderma Tham khảo tài liệu của Sambrook và cs (1989), chúng tơi ly trích DNA nấm Trichoderma theo phƣơng pháp Lysis buffer cĩ cải tiến cho phù hợp điều kiện nghiên cứu. Lƣợng mẫu cần ly trích chiếm 1/ 3 thể tích mỗi ống nghiệm. Bƣớc 1: Nghiền sinh khối Trichoderma trong nitơ lỏng đến khi mịn, cho vào các ống nghiệm (thể tích 15 ml). Bƣớc 2: Thêm vào 3 ml lysis buffer. Trộn đều, ủ ấm ở 65 0C trong vịng 1 – 2 giờ. Bƣớc 3: Tiếp tục thêm vào 1 ml phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1). Nhẹ nhàn lắc đều. Ly tâm 10 phút với tốc độ 4000 vịng/ phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm cĩ dung tích 15 ml khác. Bƣớc 4: Thêm vào 1 ml chloroform/ isoamylalcohol (24: 1). Trộn đều, ly tâm với tốc độ 4000 vịng/ phút trong 10 phút ở 10 0C. Hút lấy phần dịch nổi ở trên (2 – 3 ml), cho vào ống nghiệm cĩ dung tích 15 ml khác. Bƣớc 5: Thêm vào một lƣợng isopropanol tỉ lệ khoảng 0.6 tổng thể tích của ống nghiệm. Đảo đều, nhẹ, để qua đêm ở -20 0C (hoặc để nhiệt độ phịng 5 – 10 phút). Bƣớc 6: Dùng que thu DNA tủa thành cụm ở đáy ống Bƣớc 7: Rửa tủa DNA trong ethanol 70 %, lập lại 3 – 4 lần. Bƣớc 8: Phơi tủa DNA thật khơ (trong 2 – 3 giờ). Pha lỗng bằng 1 ml TE 1X. 3.7. Kiểm tra kết quả ly trích và pha lỗng DNA Để kiểm tra kết quả ly trích cĩ thu đƣợc DNA tổng số hay khơng và DNA pha lỗng cĩ nồng độ thích hợp để thực hiện phản ứng PCR hay chƣa, chúng tơi tiến hành điện di sản phẩm ly trích và pha lỗng trên gel agarose 1%. 19 Bƣớc 1: Chuẩn bị gel agarose 1 %, cân 0.25 g agarose cho vào 25 ml TAE 0.5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều, đun nĩng trong lị viba ở 650 W trong 2 phút. Để chai nguội lại khoảng 50 – 60 0C, đổ vào khuơn thật bằng phẳng cĩ gắn lƣợc 12 – 18 giếng. Chờ gel đơng (khoảng 15 phút), lấy lƣợc ra và bắt đầu tiến hành nạp mẫu. Bƣớc 2: Nạp mẫu, xác định các thơng số điện di và đọc kết quả Đối với DNA tổng số: Dùng micropipette hút lấy 2 l mẫu, trộn đều với 2 l blue loading dye buffer 6X, hút tổng lƣợng thể tích là 4 l bơm vào 1 giếng trên gel agarose 1 %. Làm tƣơng tự với các mẫu khác. Tiến hành điện di bảng gel đĩ trong dung dịch đệm TAE 0.5 X, hiệu điện thế 110 V, cƣờng độ dịng điện 400 A trong 20 phút. Sau đĩ, bảng gel đƣợc chuyển vào thuốc nhuộm ethidium bromide (1%) trong khoảng 15 phút, rửa sạch và chụp gel bằng tia tử ngoại (UV) của máy Gel doc 2000 (Biorad) và kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm Quality One. Nếu sản phẩm ly trích cĩ DNA tổng số thì trên gel điện di sẽ cĩ band DNA phát sáng dƣới dạng vạch. Mức độ tập trung và độ đậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA. Từ đĩ, kết hợp với những hiểu biết về phƣơng pháp định lƣợng nồng độ DNA bằng phân tử Mass (mục 2.8.3, phần 2 tổng quan tài liệu), chúng tơi cĩ thể ƣớc lƣợng nồng độ DNA ly trích đƣợc và dự đốn đƣợc độ pha lỗng. Đối với DNA pha lỗng: Mỗi mẫu lấy 4 l trộn với 2 l loading buffer 6X, thao tác tiến hành tƣơng tự nhƣ trên. Kết quả thu đƣợc cho phép ta xác định đƣợc nồng độ cần thiết để chọn lấy và thực hiện phản ứng PCR. 3.8. Phản ứng PCR DNA làm khuơn: thu nhận qua quá trình ly trích DNA bộ gen của nấm Trichoderma, sau đĩ pha lỗng đến nồng độ DNA thích hợp cho phản ứng PCR khoảng 15 – 20 ng/ µl. Primer: PCR khuếch đại vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 với primer ITS4 và ITS5 (White và cs, 1990) và dựa vào sơ đồ, cấu trúc primer trên tồn vùng tef1 do Chaverri, P. và cs thiết lập năm 2003, chúng tơi chọn cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R (Carbone và Kohn, 1999) để khuếch đại một phần của vùng tef1. 20 Bảng 3. 2 Các primer dùng trong đề tài và trình tự của chúng Primer Trình tự primer theo chiều 5’- 3’ ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G EF1 – 728F CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG EF1 – 986R TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC Hình 3. 1 Sơ đồ phân vùng và vị trí primer trên vùng từ 18S đến 28S – rDNA và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer ITS4 và ITS5 Hình 3. 2 Sơ đồ các primer trên tồn vùng tef1 và vị trí vùng khuếch đại (vùng đánh dấu ellip) với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Các thành phần phản ứng PCR đƣợc phối trộn theo thứ tự đƣợc liệt kê ở bảng bên dƣới để đảm bảo hiệu quả cho phản ứng do Taq DNA polymerase khi trộn vào hỗn hợp phản ứng PCR sẽ hoạt động ngay. 21 Bảng 3. 3 Thành phần phản ứng PCR và liều lƣợng dùng cho một phản ứng Thành phần Thể tích sử dụng ( l) Nồng độ cuối Nƣớc cất 31.75 PCR buffer 10X 10.00 1.0X MgCl2 3.00 1.5 mM dNTP 0.50 0.2 mM Primer 1 1.50 10.0 pmol/ l Primer 2 1.50 10.0 pmol/ l Khuơn DNA 1.50 15.0 ng/ l Taq DNA polymerase 0.25 5.0 U/ l Tổng cộng 50.00 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR: tham khảo, kết hợp và cải tiến quy trình của Wang C. Z. (2002), White và cs. (1990), Carbone và Kohn (1999) và VBI – CLF (2002) cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Bảng 3. 4 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR Cặp primer ITS4 và ITS5 Cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 95 3 phút 1 95 3 phút 2 – 31 95 1 phút 2 – 31 95 1 phút 58 45 giây 58 45 giây 72 1 phút 72 1 phút 31 72 10 phút 31 72 10 phút 3.9. Đánh giá kết quả PCR Thực hiện tƣơng tự nhƣ phần đánh giá DNA pha lỗng ở mục 3.7 (kiểm tra kết quả ly trích và pha lỗng DNA). Các dịng nấm khác nhau đƣợc khuếch đại cùng 22 một cặp primer, trên band điện di khơng thể phân biệt đƣợc sự khác nhau giữa các dịng này, do đĩ cần phải giải trình tự sản phẩm PCR để phân tích. 3.10. Định danh tên lồi 11 dịng Trichoderma Sản phẩm PCR của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng nấm Trichoderma khảo sát đƣợc giải trình tự ở cơng ty Macrogen, Hàn Quốc. Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đĩ xác định tên lồi của 11 dịng Trichoderma khảo sát. Dữ liệu trên NCBI đƣợc chúng tơi so sánh với nhau (bằng phần mềm Clustal X 1.83) trong phạm vi từng lồi để chọn ra trình tự ổn định nhất (khơng cĩ đột biến) và 1 – 2 trình tự đột biến phổ biến (khơng cĩ đột biến điểm đơn lẻ). Việc làm này nhằm loại bỏ hiện tƣợng trình tự dịng khảo sát cĩ tỉ lệ tƣơng đồng cao với trình tự đột biến của lồi khác, sẽ làm nhiễu kết quả so sánh trình tự. Các lồi đƣợc sử dụng cho so sánh dựa theo tiêu chí Lồi đƣợc định danh dựa vào hình thái. Lồi cĩ đặc điểm gần giống về hình thái với lồi định danh dựa vào hình thái. Bảng 3. 5 Trình tự vùng ITS – rDNA của các dịng Trichoderma trên NCBI Tên lồi Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian cơng bố Tác giả T. asperellum AY266673 Trung Quốc 01-04-2003 Zhang,C.L. và Xu,T. AY380912 Mỹ 03-09-2003 Samuels,G.J. và cs T. atroviride AY585878 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs Z48818 Đức 29-03-1995 Kuhls,K. T. hamatum AJ507086 Úc 28-08-2002 Wuczkowski,M. và Kubicek,C.P. Z48816 Đức 29-03-1995 Kuhls,K. T. harzianum AF455502 Úc 04-12-2001 Buzina,W. và cs 23 AF362101 Hàn Quốc 19-03-2001 Park,D.S. và cs T. koningii DQ313146 Canada 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs DQ313135 Brazil 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs T. longibrachiatum AY328038 Hungary 08-07-2004 Kredics,L. và cs DQ297053 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs T. reesei X93938 Đức 04-12-1995 Kuhls,K. và cs T. sinensis DQ083012 Đài Loan 01-06-2005 Samuels,G.J. T. tomentosum AY154932 Iran 24-09-2002 Zafari,D. DQ085432 Canada 03-06-2005 Samuels,G.J. T. virens AF057599 Hoa Kỳ 31-03-1998 Ospina,M.D. và cs AF099008 Hoa Kỳ 16-10-1998 Samuels,G.J. và cs. T. viride DQ313155 New Zealand 01-12-2005 Samuels,G.J. và cs DQ315439 Anh 02-12-2005 Samuels,G.J. và cs Bảng 3. 6 Trình tự vùng tef1 của các dịng Trichoderma trên NCBI Tên lồi Mã số truy cập Địa điểm phân lập Thời gian cơng bố Tác giả T. asperellum AY376058 Hoa Kỳ 28-08-2003 Holmes,K.A. và cs AY857274 Úc 13-12-2004 Druzhinina,I.S. và cs T. atroviride AF348112 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs DQ307550 Sri Lanka 28-11-2005 Samuels,G.J. T. harzianum AF348101 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs AF348103 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs T. koningii DQ288997 Ecuador 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs DQ289002 Brazil 14-11-2005 Samuels,G.J. và cs 24 T. longibrachiatum AY937412 Hoa Kỳ 17-02-2005 Samuels,G.J. DQ297066 Mexico 15-11-2005 Sanchez,V. và cs T. saturnisporum AY937414 Nam Phi 14-09-2004 Samuels,G.J. T. sinensis AY750888 Đài Loan 14-09-2004 Samuels,G.J. T. tomentosum AY750882 Canada 14-09-2004 Samuels,G.J. Gliocladium flavofuscum AY750891 Hoa Kỳ 14-09-2004 Samuels,G.J. Hypocrea virens AY750894 Cote d'Ivoire 14-09-2004 Samuels,G.J. T. viride AF348116 Hoa Kỳ 09-02-2001 Samuels,G.J. và cs DQ307555 CH. Czech 28-11-2005 Samuels,G.J. và cs 3.11. Phân nhĩm xác điṇh mới quan hê ̣di truyền giữa 11 dịng Trichoderma Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma. Chúng tơi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6 từ đĩ phân nhĩm xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 3.12. Xác định mối quan hệ di truyền 11 dịng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đĩ xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 25 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả ly trích DNA tổng số Trichoderma Ly trích DNA là một bƣớc khởi đầu rất quan trọng, vì nĩ là yếu tố quan trọng hàng đầu quyết định sự thành cơng cho phản ứng PCR sau này. Đối với Trichoderma, việc ly trích gặp nhiều khĩ khăn do thành tế bào rất mỏng và mềm vì đƣợc cấu tạo chủ yếu bằng chitin thay vì cellulose nhƣ ở thực vật do đĩ rất dễ vỡ trong quá trình nghiền, bên trong tế bào chất lại chứa hàm lƣợng lớn polysaccharide, protein và lipid. Qui trình ly trích DNA của chúng tơi đơn giản nhƣng vẫn thu đƣợc DNA cĩ độ tinh khiết cao. Do ở qui trình này, mẫu đƣợc nghiền trong nitơ lỏng (giúp bảo vệ thành tế bào) đến khi thật mịn để các tế bào tách rời nhau ra, tạo điều kiện thuận lợi cho lysis buffer tác dụng phá thành tế bào. Mặt khác, việc sử dụng phenol/ chloroform/ isoamylalcohol (25: 24: 1), sau đĩ thêm bƣớc sử dụng chloroform/ isoamylalcohol (24: 1) giúp DNA tách ra khỏi protein và loại hết loại bỏ hết protein, polysaccharide, lipid, RNA cĩ trong mẫu và phenol cịn sĩt lại. Đồng thời, chúng tơi ly tâm tốc độ thấp (4000 vịng/ phút) kết hợp với kéo dài thời gian vừa phải (10 phút) ở nhiệt độ thấp (10 0C) giúp giảm sự gãy của DNA nhƣng vẫn đảm bảo sự phân lớp và tác dụng của các hĩa chất. Ngồi ra, việc tủa DNA bằng isopropanol (lạnh) để qua đêm và bƣớc dùng que thu tủa DNA mà khơng cần ly tâm giúp DNA bớt gãy vụng và thu đƣợc DNA tinh hơn. Do đĩ, DNA ly trích đƣợc với độ tinh khiết cao, đảm bảo cho phản ứng PCR đƣợc xảy ra. Dựa vào những hiểu biết về phƣơng pháp “định lƣợng DNA bằng phân tử Mass” (mục 2.8.3), chúng tơi định lƣợng DNA ly trích đƣợc khoảng 150 ng/ µl. 26 Hình 4. 1 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút Dựa vào band DNA thu nhận đƣợc từ kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc, tiến hành pha lỗng DNA tổng số đến nồng độ thích hợp thực hiện phản ứng PCR. Nồng độ DNA sau khi pha lỗng khoảng 15 ng/ µl Hình 4. 2 Kết quả điện di DNA tổng số Trichoderma ly trích đƣợc sau khi pha lỗng 10 lần, trên gel agarose 1 % ở 110 V, 400 A trong 20 phút 4.2. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Dựa vào thang ladder cho thấy qui trình PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4/ ITS5 và một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F/ EF1 – 986R cho kết quả thể hiện bằng điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, cĩ kích thƣớc lần lƣợt là 600 bp và 320 bp. Tất cả các mẫu đều xuất hiện band mong muốn và hồn tồn khơng cĩ band phụ, chỉ cĩ 1 trong tổng số 11 mẫu với cặp 27 primer ITS4 và ITS5 cho band mờ (mẫu T88), mẫu này khi thực hiện PCR lại chúng tơi tăng lƣợng DNA khuơn lên gần gấp đơi (2.5 ml) thì kết quả PCR cho band sáng rõ, khơng cĩ band phụ. Hình 4. 3 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA với cặp primer ITS4 và ITS5, cĩ kích thƣớc 600 bp Hình 4. 4 Kết quả điện di trên gel agarose 1 % ở 110V, 400A trong 20 phút, sản phẩm PCR khuếch đại một phần vùng tef1 với cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R, cĩ kích thƣớc 320 bp 4.3. Kết quả định danh tên lồi Trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma khảo sát đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI. Dựa vào độ tƣơng đồng di truyền (%) kết hợp với kết quả định danh bằng hình thái, để từ đĩ xác định tên lồi của 11 dịng Trichoderma khảo sát. Dịng T37: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. sinensis, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T37 là Trichoderma longibrachiatum. 28 Bảng 4. 1 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T37 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) (mã số truy cập-tên lồi-địa điểm phân lập) 1: X93938-T.reesei-Đức 100 99 99 99 99 99 98 2: AY328038-T.longibrachiatum-Hunrary 99 100 99 99 99 99 98 3: DQ297053-T.longibrachiatum-Mexico 99 99 100 100 100 99 99 4: T37-T.sinensis-ITS_rDNA-Việt Nam 99 99 100 100 100 99 99 5: Z48726-T.saturnisporum-Đức 99 99 100 100 100 100 99 6: AF048744-T.saturnisporum-Hàn Quốc 99 99 99 99 100 100 99 7: DQ083012-T.sinensis-Đài Loan 98 98 99 99 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: DQ297066-T.longibrachiatum-Mexico 100 100 99 78 78 81 84 2: T37-T.sinensis-tef1-Việt Nam 100 100 99 67 67 69 75 3: AY937412-T.longibrachiatum-Hoa Kỳ 99 99 100 76 75 80 84 4: AY750888-T.sinensis-Đài Loan 78 67 76 100 99 85 79 5: AY750889-T.sinensis-Đài Loan 78 67 75 99 100 85 78 6: AY937414-T.saturnisporum-Nam Phi 81 69 80 85 85 100 78 7: Z23012-T.reesei-Phần Lan 84 75 84 79 78 78 100 Dịng T42: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. viride, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T42 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 2 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T42 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY585878-T.atroviride-Hungary 100 100 100 100 99 99 99 98 99 2:Z48818-T.atroviride-Đức 100 100 100 100 100 99 98 98 98 3:DQ313146-T.koningiopsis-Canada 100 100 100 100 100 99 99 98 99 4:DQ313135-T.koningiopsis-Brazil 100 100 100 100 100 99 99 98 99 5:DQ313155-T.viride-New Zealand 99 100 100 100 100 100 98 98 98 6:DQ315439-T.viride-Anh 99 99 99 99 100 100 98 98 98 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 98 99 99 98 98 100 100 100 8:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 98 100 100 100 9:T42-T.viride-ITS_rDNA-Việt Nam 99 98 99 99 98 98 100 100 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 90 91 89 88 86 77 84 2:DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 89 92 89 89 85 78 84 3:AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 90 89 100 96 88 89 87 79 86 4:DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 91 92 96 100 90 91 87 85 88 5:DQ288997-T.koningii-Ecuador 89 89 88 90 100 96 84 78 85 6:DQ289002-T.koningii-Brazil 88 89 89 91 96 100 84 78 84 7:AY857274-T.asperellum-Úc 86 85 87 87 84 84 100 92 100 8:T42-T.viride-tef1-Việt Nam 77 78 79 85 78 78 92 100 92 9:AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 84 84 86 88 85 84 100 92 100 Dịng T38: Với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, chúng tơi xác định dịng T38 chỉ cĩ thể 29 là T. virens hay Gliocladium flavofuscum (là một teleomorph của T. virens) hoặc Hypocrea virens (cũng là một teleomorph của T. virens) nhƣng kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái (là T. virens), chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T38 là Trichoderma virens. Bảng 4. 3 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T38 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY154935-T.spirale-Iran 100 100 99 99 98 98 98 2: DQ083014-T.spira-Thái Lan 100 100 99 99 98 98 98 3: AF099008-T.virens-Hoa Kỳ 99 99 100 100 98 98 98 4: T38-T.virens-ITS_rDNA -Việt Nam 99 99 100 100 98 98 98 5: AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 98 98 98 98 100 99 99 6: AF455502-T.inhamatum-Úc 98 98 98 98 99 100 99 7: AF057599-T.virens-Hoa Kỳ 98 98 98 98 99 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY750890-T.spirale-Thái Lan 100 97 89 84 89 85 86 2: AY750896-T.spirale-Canada 97 100 89 84 89 86 86 3: AY750894-H.virens-Cote.d'Ivoir 89 89 100 96 99 85 85 4: T38-T.virens-tef1-Việt Nam 84 84 96 100 96 76 76 5: AY750891-G.flavofuscum-Hoa Kỳ 89 89 99 96 100 85 85 6: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 85 86 85 76 85 100 93 7: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 86 86 85 76 85 93 100 Dịng T19: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T19 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 4 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T19 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 100 99 98 98 98 97 97 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 97 97 97 97 97 3:Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 97 97 98 97 97 4:AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 98 98 98 97 97 5:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 97 98 100 100 100 99 99 6:T19-T.asperellum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 97 97 98 100 100 100 99 99 7:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 98 97 98 98 100 100 100 99 99 8:AJ507086-T.hamatum-Úc 97 97 97 97 99 99 99 100 100 9:Z48816-T.hamatum-Đức 97 97 97 97 99 99 99 100 100 Dịng T33: đƣợc chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác là Trichoderma asperellum dựa vào kết quả định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp 30 với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI. Bảng 4. 5 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T33 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 100 100 99 99 98 97 97 98 2:T33-T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 100 100 100 99 99 98 98 97 98 3:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 100 100 100 99 99 98 98 97 98 4:AJ507086-T.hamatum-Úc 99 99 99 100 100 97 97 97 97 5:Z48816-T.hamatum-Đức 99 99 99 100 100 97 97 97 97 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 98 98 98 97 97 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 98 98 97 97 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 98 98 98 97 97 99 100 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY857274-T.asperellum-Úc 100 92 100 87 87 86 85 84 2: T33-T.asperellum-tef1-Việt Nam 92 100 92 79 84 78 78 77 3: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 92 100 86 87 85 84 83 4: AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 87 79 86 100 96 90 89 85 5: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 87 84 87 96 100 91 92 87 6: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 86 78 85 90 91 100 99 84 7: DQ307555-T.viride-CH.Czech 85 78 84 89 92 99 100 84 8: AY750893-T.hamatum-Canada 84 77 83 85 87 84 84 100 Dịng T2: Tƣơng tự đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum hoặc T. harzianum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T2 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 6 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T2 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 97 97 98 98 98 92 90 2:DQ315439-T.viride-Anh 100 100 97 97 97 97 97 92 90 3:AJ507086-T.hamatum-Úc 97 97 100 100 99 99 99 91 90 4:Z48816-T.hamatum-Đức 97 97 100 100 99 99 99 91 90 5:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 98 97 99 99 100 100 100 92 91 6:T2_T.asperellum/harzianum-ITS_rDNA 98 97 99 99 100 100 100 92 91 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 98 97 99 99 100 100 100 92 90 8:AF055218-T.inhamatum-New Zealand 92 92 91 91 92 92 92 100 94 9:AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 90 90 90 90 91 91 90 94 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 100 99 87 80 85 84 71 71 2: DQ307555-T.viride-CH.Czech 99 100 85 80 85 84 67 67 3: AY857274-T.asperellum-Úc 87 85 100 92 100 84 76 75 4: T2-T.asperellum/harzianum-tef1 80 80 92 100 92 77 60 59 5: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 85 85 100 92 100 83 73 72 6: AY750893-T.hamatum-Canada 84 84 84 77 83 100 70 69 7: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 71 67 76 60 73 70 100 93 8: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 71 67 75 59 72 69 93 100 31 Dịng T14: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. harzianum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T14 là Trichoderma harzianum. Bảng 4. 7 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T14 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AF362101-T.inhamatum-Hàn Quốc 100 99 100 99 99 91 91 91 91 2:AF455502-T.inhamatum-Úc 99 100 99 99 99 91 90 90 90 3:T14_T.harzianum-ITS_rDNA-Việt Nam 100 99 100 99 99 91 91 91 91 4:AY154932-T.tomentosum-Iran 99 99 99 100 100 91 91 91 91 5:DQ085432-T.tomentosum-Canada 99 99 99 100 100 91 91 91 91 6:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 91 91 91 91 91 100 100 99 99 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 91 90 91 91 91 100 100 99 99 8:AJ507086-T.hamatum-Úc 91 90 91 91 91 99 99 100 100 9:Z48816-T.hamatum-Đức 91 90 91 91 91 99 99 100 100 Dịng T85: kết hợp kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI với kết quả định danh dựa vào hình thái là T. harzianum, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T85 là Trichoderma harzianum. Bảng 4. 8 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T85 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY154932-T.tomentosum-Iran 100 100 99 98 98 92 91 91 91 2:DQ085432-T.tomentosum-Canada 100 100 99 98 98 92 91 91 91 3:AF362101-T.harzianum-Hàn Quốc 99 99 100 99 99 91 91 91 91 4:AF455502-T.harzianum-Úc 98 98 99 100 100 91 90 90 90 5:T85-T.harzianum-ITS_rDNA-Việt Nam 98 98 99 100 100 91 91 90 91 6:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 92 92 91 91 91 100 100 99 99 7:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 91 91 91 90 91 100 100 99 99 8 AJ507086-T.hamatum-Úc 91 91 91 90 90 99 99 100 100 9 Z48816-T.hamatum-Đức 91 91 91 90 91 99 99 100 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348103-T.harzianum-Hoa Kỳ 100 92 93 91 75 76 71 2: T85-T.harzianum-tef1-Việt Nam 92 100 87 87 63 63 59 3: AF348101-T.harzianum-Hoa Kỳ 93 87 100 90 75 76 71 4: AY750882-T.tomentosum-Canada 91 87 90 100 72 75 70 5: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 75 63 75 72 100 100 86 6: AY857274-T.asperellum-Úc 76 63 76 75 100 100 87 7: AY750893-T.hamatum-Canada 71 59 71 70 86 87 100 32 Dịng T88: đƣợc định danh dựa vào hình thái là T. asperellum, kết hợp với kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T88 là Trichoderma asperellum. Bảng 4. 9 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T88 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AJ507086-T.hamatum-Úc 100 100 99 99 99 97 97 97 97 2:Z48816-T.hamatum-Germany 100 100 99 99 99 97 97 97 97 3:AY380912-T.asperellum-Hoa Kỳ 99 99 100 100 100 98 97 97 98 4:T88-T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 99 99 100 100 100 98 98 97 98 5:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 99 99 100 100 100 98 98 97 98 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 97 97 98 98 98 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 97 97 98 98 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 97 97 98 98 98 99 100 99 100 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AY857274-T.asperellum-Úc 100 92 100 87 87 86 85 84 2: T88-T.asperellum-tef1-Việt Nam 92 100 92 80 84 78 78 77 3: AY376058-T.asperellum-Hoa Kỳ 100 92 100 86 87 85 84 83 4: AF348112-T.atroviride-Hoa Kỳ 87 80 86 100 96 90 89 85 5: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 87 84 87 96 100 91 92 87 6: AF348116-T.viride-Hoa Kỳ 86 78 85 90 91 100 99 84 7: DQ307555-T.viride-CH.Czech 85 78 84 89 92 99 100 84 8: AY750893-T.hamatum-Canada 84 77 83 85 87 84 84 100 Dịng T6: kết hợp kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với các lồi trên NCBI, chúng tơi khẳng định tên lồi chính xác của dịng T6 là Trichoderma asperellum. Bảng 4.10 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T6 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1:AY380912-T.asperellum-USA 100 100 100 99 99 98 97 97 98 2:T6- T.asperellum-ITS_rDNA-ViệtNam 100 100 100 99 99 98 98 97 98 3:AY266673-T.asperellum-Trung Quốc 100 100 100 99 99 98 98 97 98 4:AJ507086-T.hamatum-Úc 99 99 99 100 100 97 97 97 97 5:Z48816-T.hamatum-Đức 99 99 99 100 100 97 97 97 97 6:DQ313155-T.viride-New Zealand 98 98 98 97 97 100 100 100 99 7:Z48818-T.atroviride-Đức 97 98 98 97 97 100 100 99 100 8:DQ315439-T.viride-Anh 97 97 97 97 97 100 99 100 99 9:AY585878-T.atroviride-Hungary 98 98 98 97 97 99 100 99 100 33 Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: AF348112-T.atroviride-USA 100 96 90 89 85 86 81 87 2: DQ307550-T.atroviride-Sri Lanka 96 100 91 92 87 87 84 87 3: AF348116-T.viride-USA 90 91 100 99 84 85 78 86 4: DQ307555-T.viride-CH.Czech 89 92 99 100 84 84 79 85 5: AY750893-T.hamatum-Canada 85 87 84 84 100 83 76 84 6: AY376058-T.asperellum-USA 86 87 85 84 83 100 100 100 7: T6-T.asperellum-tef1-Việt Nam 81 84 78 79 76 100 100 99 8: AY857274-T.asperellum-Úc 87 87 86 85 84 100 99 100 Dịng T68: định danh dựa vào hình thái là T. atroviride nhƣng kết quả tính độ tƣơng đồng di truyền (%) vùng ITS – rDNA với dữ liệu trên NCBI chỉ giúp kết luận tên lồi dịng T68 khơng phải là T. strigosum và với T. viride (là lồi rất dễ nhằm lẫn với T. atroviride khi định danh bằng hình thái) khơng kết luận đƣợc. Nên chúng tơi chỉ xác định tên lồi của dịng T68 là Trichoderma atroviride Bảng 4. 11 Độ tƣơng đồng di truyền (%) dịng T68 với các lồi trên NCBI Percent Identity Matrix - created by ClustalX (1.83) 1: DQ313155-T.viride-New Zealand 100 100 99 100 100 98 2: DQ315439-T.viride-Anh 100 100 99 99 99 98 3: AY585878-T.atroviride-Hungary 99 99 100 100 99 98 4: Z48818-T.atroviride-Đức 100 99 100 100 100 98 5: T68_T.atroviride-ITS_rDNA-Việt Nam 100 99 99 100 100 98 6: AY387661-T.strigosum-Hoa Kỳ 98 98 98 98 98 100 Bảng 4. 12 Kết quả định danh tên lồi các dịng Trichoderma của đề tài Kí hiệu Tên lồi định danh dựa vào hình thái Tên lồi đƣợc định danh chính xác dựa vào phân tử T37 T. sinensis T. longibrachiatum T42 T. viride T. asperellum T38 T. virens T. virens T19 T. asperellum T. asperellum (* ) T33 T. asperellum T. asperellum T2 T. asperellum/ T. harzianum T. asperellum T14 T. harzianum T. harzianum (* ) T85 T. harzianum T. harzianum T88 T. asperellum T. asperellum T6 Chƣa xác định T. asperellum (*** ) T68 T. atroviride T. atroviride (**) 34 (*): tên lồi được định danh chính xác bằng cách kết hợp kết quả định danh bằng hình thái với trình tự vùng ITS – rDNA.(**): tên lồi được xác định dựa vào hình thái và trình tự vùng ITS – rDNA. (***): tên lồi được khẳng điṇh dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Từ kết quả định danh trên, cho thấy kết quả định danh tên lồi bằng cách kết hợp kết quả định danh dƣạ vào hình th ái với trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA và một phần vùng chức năng tef1 thực hiện trong đề tài là hồn tồn đáng tin cậy do tỉ lệ tƣơng đờng di truyền của các lồi khảo sát với các lồi tƣơng ứng với nĩ là cao nhất (ITS – rDNA: 99 – 100 %, tef1: 92 – 100 %) và cao hơn hẳn các lồi khác (tef1: 5 – 24 %), đồng thời nĩ hồn tồn phù hợp với kết quả định danh dƣạ vào hình thái. Kết quả định danh dƣạ vào hình thái khơng hồn tồn chính xác do hệ thống định danh và phân loại dựa vào hình thái của Trichoderma vẫn chƣa hồn chỉnh (Gary J. Samuels, 2004) và một vài lồi Trichoderma cĩ đặc điểm hình thái khá giống nhau, chỉ khác nhau vài đặc điểm rất khĩ xác định. Trình tự vùng bảo tồn ITS – rDNA kết hợp với kết quả định danh dựa vào hình thái khơng phải lúc nào cũng cĩ thể khẳng định chính xác tên lồi của Trichoderma (T. atroviride (T68)). Khi đa ̃khẳng điṇh tên dòng là Trichoderma, đờng thời có tỉ lệ tƣơng đờng di truyền vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với lồi tƣơng ứng với nĩ là cao nhất và cao hơn hẳn các lồi khác thì mới có thể khẳng điṇh tên loài chính xác của chúng (T. asperellum (T6)). Vì nếu khơng cĩ đầy đủ các điều kiện này thì rất dễ xảy ra sai sót trong viêc̣ xác điṇh tên loài chính xác của chúng . Do giƣ̃a Trichoderma và các teleomorph của nĩ (Gliocladium hoặc Hypocrea) cĩ tỉ lệ tƣơng đồng di truyền vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 là ít cĩ sự khác biệt , đờng thời trong quá trình sinh sản vơ tính cĩ thể xảy ra hiện tƣợng đột biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sĩt từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điều kiện sinh thái, địa lý, mơi trƣờng sống khác nhau nên sẽ dẫn đến nhiều sai khác và đa dạng trong kiểu gen của cùng lồi Trichoderma. Vì thế, trong trƣờng hợp của Trichoderma khơng thể khẳng định chính xác tên 35 lồi chỉ dựa riêng lẻ vào trình tự vùng ITS – rDNA hoặc một phần vùng tef1 hay đặc điểm hình thái. 4.4. Kết quả phân nhĩm tạo phổ hệ di truyền 4.4.1. Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 Với dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA (11 dịng) và một phần vùng tef1 (8 dịng) nằm trong 5 lồi Trichoderma: longibrachiatum, asperellum, virens, harzianum, atroviride. Chúng tơi tiến hành so sánh các trình tự này với nhau bằng phần mềm Clustal X 1.83, kết quả đƣợc đọc bằng phần mềm TreeView 1.6.6, từ đĩ phân nhĩm và xác định mối quan hệ di truyền giữa chúng. 36 H ìn h 4 . 5 K ết q u ả p h ân n h ĩ m t ừ t rì n h t ự v ù n g I T S – r D N A ( A ) v àm ộ t p h ần v ù n g t ef 1 ( B ), (k í h iệ u d ị n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( tỉ n h )- đ ố i tƣ ợ n g l ấy m ẫu ) 37 Từ kết quả phân nhĩm trên, cho thấy các dịng T. harzianum và T. asperellum cĩ quan hệ di truyền phù hợp ở mức độ lồi, nên kết quả định danh là chính xác. Ở kết quả phân nhĩm vùng ITS – rDNA, các dịng T. asperellum chia thành hai nhĩm riêng biệt, cho thấy cĩ sự đột biến và đột biến này khơng phụ thuộc vào vùng địa lý, đối tƣợng lấy mẫu. Điều này cĩ thể đƣợc giải thích là do trong quá trình sinh sản vơ tính đã xảy ra đột biến hoặc sai sĩt trong quá trình phân chia tế bào. T. longibrachianum cĩ quan hệ di truyền khá tách biệt với các lồi khác và T. harzianum cĩ quan hệ di truyền gần với T. virens nhất so với các lồi khác. Tƣơng tự, T. asperellum cĩ quan hệ di truyền gần với T. atroviride nhất. Điều này hồn tồn phù hợp với mối quan hệ về đặc điểm hình thái giữa 5 lồi này. Chứng tỏ, đặc điểm về hình thái cĩ mối quan hệ mật thiết với trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1, do đĩ, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 cĩ tác động lớn đến biểu hiện về kiểu hình. Ngồi ra, mối quan hệ giữa 5 lồi này cũng hồn tồn phù hợp với kết quả phân nhĩm của Christian P. Kubicek và cs (2002), Christopher R. Thornton và cs (2002) (mục 2.6), cho thấy mối quan hệ di truyền giữa 5 lồi này là bền vững và khơng phụ thuộc vào sự phân bố về sinh thái, địa lý và đối tƣợng lấy mẫu. 4.4.2. Kết quả phân nhĩm từ trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA Trình tự vùng ITS1, 5.8S và ITS2 – rDNA của 11 dịng Trichoderma đƣợc so sánh với nhau bằng phần mềm ClustalX 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Để so sánh mức độ bảo tồn của từng vùng và xác định vùng cĩ ý nghĩa quyết định kết quả phân nhĩm của tồn vùng ITS – rDNA. Nhận thấy, trình tự vùng 5.8S của 11 dịng khảo sát giống nhau hồn tồn, vùng ITS1 cĩ sự khác biệt nhiều nhất trong tồn vùng ITS – rDNA. Chứng tỏ 5.8S là vùng bảo tồn nhất và vùng ITS2 bảo tồn hơn vùng ITS1. 38 H ìn h 4 . 6 K ết q u ả p h ân n h ĩ m t ừ t rì n h t ự v ù n g I T S 1 – r D N A ( A ) v à IT S 2 – r D N A ( B ), (k í h iệ u d ị n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( tỉ n h )- đ ố i tƣ ợ n g l ấy m ẫu ) 39 Kết quả phân nhĩm trên 2 vùng ITS1 và ITS2 – rDNA cho thấy vùng ITS2 cĩ kết quả phân nhĩm đúng với kết quả phân nhĩm của tồn vùng ITS – rDNA và phù hợp với mối quan hệ về đặc điểm hình thái hơn so với vùng ITS1. Do đĩ, kết quả phân nhĩm vùng ITS2 đáng tin cậy hơn vùng ITS1. Vì vậy, vùng ITS2 là vùng quyết định kết quả phân nhĩm của tồn vùng ITS – rDNA và vùng ITS2 chi phối biểu hiện hình thái Trichoderma nhiều hơn vùng ITS1. Vùng 5.8S khơng cĩ ý nghĩa trong việc phân nhĩm do chúng quá bảo tồn, ít cĩ sự khác biệt giữa các lồi. 4.5. So sánh vùng ITS1 và ITS2 – rDNA với dữ liệu của chúng trên NCBI Vùng ITS – rDNA 11 dịng Trichoderma phân lập ở Việt Nam đƣợc so sánh với dữ liệu của chúng trên NCBI ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới bằng phần mềm Clustal X 1.83 và đọc kết quả bằng phần mềm TreeView 1.6.6. Từ kết quả so sánh trên cho thấy, kết quả phân nhĩm của vùng ITS1 khơng hồn tồn chính xác và vùng ITS2 cho kết quả phân nhĩm rất đáng tin cậy. Chứng tỏ, trình tự vùng ITS2 cĩ sự phân hĩa di truyền đặc trƣng cho từng lồi hơn vùng ITS1 và một lần nữa chứng minh kết quả phân nhĩm vùng ITS2 đáng tin cậy hơn vùng ITS1 và vùng ITS2 là vùng quyết định kết quả phân nhĩm vùng ITS – rDNA. 40 H ìn h 4 .7 K ết q u ả so s án h t rì n h t ự v ù n g I T S 1 (A ) v à IT S 2 – r D N A ( B ) củ a 1 1 d ị n g T ri ch o d er m a V iệ t N am v ớ i d ữ l iệ u c ủ a ch ú n g t rê n th ế g iớ I, ( m ã số t ru y c ập / k í h iệ u d ị n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ( q u ố c g ia ) H ìn h 4 . 6 41 4.6. Xác định mối quan hệ di truyền của vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 với dữ liệu của chúng trên thế giới Hình 4.8 Kết quả so sánh trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dịng Trichoderma Việt Nam với dữ liệu của chúng trên thế giới (mã số truy cập/ kí hiệu dịng-tên lồi-vùng lấy mẫu (quốc gia)) 42 H ìn h 2 .9 K ết q u ả so s án h t rì n h t ự m ộ t p h ần v ù n g t ef 1 c ủ a 1 1 d ị n g T ri ch o d er m a V iệ t N am v ớ i d ữ l iệ u c ủ a ch ú n g t rê n t h ế g iớ I, ( m ã số t ru y c ập / k í h iệ u d ị n g -t ên l o ài -v ù n g l ấy m ẫu ) (q u ố c g ia )) H ìn h 4 . 7 43 Kết quả so sánh trên cho thấy các dịng cĩ mối quan hệ di truyền phù hợp ở mức độ lồi nên cĩ thể khẳng định kết quả định danh của chúng tơi là đúng so với kết quả định danh dựa vào vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 trên thế giới. Do đĩ, trình tự vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 của 11 dịng Trichoderma sẽ hổ trợ cho việc định danh và so sánh sự đa dạng di truyền giữa các dịng Trichoderma Việt Nam với các dịng Trichoderma trên thế giới. Đối với vùng ITS – rDNA, dịng T. atroviride (T68), T. harzianum (T14, T85) và T. virens (T38) cĩ quan hệ di truyền khá xa so với các dịng trên thế giới. Ở một phần vùng tef1 điều này xảy ra trên tất cả các dịng khảo sát (trừ T. asperellum (T6)). Nhƣ vậy, các dịng Trichoderma Việt Nam cĩ quan hệ di truyền khá xa so với các dịng phân lập ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. Điều này cĩ thể đƣợc lý giải là do tác động của điều kiện sinh thái, địa lý sống khác nhau nên dẫn đến nhiều sai khác và đa dạng về kiểu gen trong cùng lồi. Do đĩ, cĩ thể thấy rằng, trong 11 dịng phân lập ở Việt Nam, 10 dịng cĩ nguồn gốc bản địa và dịng T. asperellum (T6) cĩ thể là dịng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Điều này mở ra triển vọng nhằm sử dụng vùng ITS – rDNA và nhất là một phần vùng tef1 để phân biệt giữa dịng Trichoderma bản địa (Việt Nam) với các dịng ngoại lai nhằm ngăn ngừa ơ nhiễm sinh học cĩ thể xảy ra trong tƣơng lai và xác định nguồn gốc dịng Trichoderma. 44 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 1. Đã thiết lập và hồn thiện qui trình phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA (ITS1– 5.8S – ITS2) bằng cặp primer ITS4 và ITS5 và một phần vùng tef1 (4 th large intron) bằng cặp primer EF1 – 728F và EF1 – 986R. 2. Khẳng định tên lồi chính xác của 10 dịng Trichoderma khảo sát và dịng T68 tên lồi đƣợc xác định là T. atroviride. Kết quả này hồn tồn phù hợp với kết quả định danh dựa vào vùng ITS – rDNA và một phần vùng tef1 trên thế giới. 3. Thiết lập đƣợc mối quan hệ di truyền giữa 11 dịng Trichoderma thuộc 5 lồi T. longibrachiatum, T. asperellum, T. atroviride, T. harzianum, T. virens. Các dịng Trichoderma Việt Nam cĩ quan hệ di truyền khá xa so với các dịng trên thế giới. Trong 11 dịng phân lập ở Việt Nam cĩ 10 dịng cĩ nguồn gốc bản địa, dịng T. asperellum (T6) cĩ thể là dịng ngoại lai du nhập vào nƣớc ta. Mối quan hệ di truyền giữa 5 lồi này là bền vững, khơng phụ thuộc vào sự phân bố về sinh thái, địa lý, đối tƣợng lấy mẫu và phù hợp với mối quan hệ về hình thái. 4. Tạo đƣợc nguồn dữ liệu về trình tự vùng ITS – rDNA của 11 dịng và một phần vùng tef1 của 8 dịng thuộc 5 lồi Trichoderma. Dữ liệu này sẽ đĩng gĩp nguồn gen, hổ trợ cho cơng tác định danh, phân nhĩm, trao đổi thơng tin di truyền và nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các dịng Trichoderma Việt Nam với dữ lệu của chúng ở các vùng sinh thái, địa lý khác nhau trên thế giới. 5.2. Đề nghị 1. Tăng số dịng và số lồi nghiên cứu do chỉ cĩ 5 lồi đƣợc nghiên cứu và số dịng của T. longibrachiatum (T37), T. virens (T38) và T. atroviride (T68) sử dụng trong đề tài chỉ cĩ 1 dịng đại diện nên khơng thể nhận xét quan hệ di truyền giữa các dịng trong cùng một lồi, T. harzianum chỉ cĩ 2 dịng T14 và T85 nên khơng thể hiện chân thực mối quan hệ di truyền giữa chúng và điều này giúp thể hiện rõ hơn mối quan hệ di truyền ở mức độ vùng địa lý và đối tƣợng lấy mẫu (đất nơng 45 nghiệp, đất rừng, đất khai hoang, sầu riêng, dứa, đậu phụng, trà…). 2. Giải trình tự vùng tef1 (4th large intron) của dịng T. asperellum (T68) để cĩ thể khẳng định tên lồi chính xác của nĩ. 3. Mở rộng nghiên cứu mối quan hệ di truyền giữa trình tự vùng ITS – rDNA, một phần vùng tef1 với khả năng đối kháng các nấm bệnh cây trồng và tiết các enzyme cĩ giá trị thƣơng mại nhƣ cellulase, protease, glucanase của Trichoderma. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Việt Nam 1. Lại Hà Tố Hoa, 2006. Định danh nấm Trichoderma spp. dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA và vùng tef1. Luận văn tốt nghiệp kĩ sƣ Cơng nghệ sinh học, trƣờng Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 2. Lâm Thanh Hiền, 1999. Chƣơng 3, Hình thái cấu tạo các vi sinh vật cĩ nhân thật (Eucaryote). Vi sinh vật học đại cương (Tơ Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hƣơng). Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh, trang 59 – 61. 3. Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997. Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm. Nhà xuất bản Nơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh, trang 111-153. 4. Nguyễn Thị Thuần, 1998. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng. Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 35-38. 5. Nguyễn Thị Thuần, 1999. Phương pháp sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma để phịng trừ bệnh hại cây trồng. Tạp chí Bảo vệ Thực vật 4: 33-34. 6. Nguyễn Xuân Thành, 2003. Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật trong sản xuất nơng nghiệp và xử lý ơ nhiễm mơi trường. Nhà xuất bản Nơng nghiệp Hà Nội. Nƣớc ngồi 7. Berbee M.L., Yoshimura A., Sugiyama J., and Taylor J.W., 1995. Is Penicillium monophyletic an evaluation of phylogeny in the family Trichocomaceae from 18S, 5.8S and ITS ribosomal sequence data. Mycologia 87: 210-222. 8. Bissett J., 1984. A revision of the genus Trichoderma. I. Sec. Longibrachiatum sect. nov. Can J Bot, 62:924-931. 9. Bissett J., 1991a. A revision of the genus Trichoderma. II. Infrageneric classification. Can J Bot, 69:2357-2372 10. Bissett J., 1991b. A revision of the genus Trichoderma. III. Sect. Pachybasium. Can J Bot, 69:2373-2417. 47 11. Bissett J., 1991c. A revision of the genus Trichoderma. IV. Additional notes on section Longibrachiatum. Can J Bot, 69:2418-2420. 12. Bissett J., 1992. Trichoderma atroviride. Can J Bot, 70:639-641. 13. Bissett J., Szakacs G., Nolan C.A., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.M., Kubicek C.P., 2003. Seven new taxa of Trichoderma from Asia. Can J Bot, 81:570-586. 14. Bruns T.D., White T.J. and Taylor J.W., 1991. Fungal molecular systematics. Annu. Rev. Ecol. Syst. 22: 525-564. 15. Bruns T.D., Vilgalys R., Barns S.M., Gonzalez D., Hibbett D.S., Lane D.J., Simo L., Stickel S., Szaro T.M., Weisburg W.G., and Sogin M.L., 1992. Evolutionary relationships within the fungi: analyses of small subunit ribosomal DNA sequences. Appl. Environ. Microbiol. 61: 681-689. 16. Carbone I. and Kohn L.M, 1999. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia 91(3): 553-556. 17. Chaverri P., Castlebury L.A., Overton B.E., Samuels G.J., 2003b. Hypocrea/Trichoderma: species with conidiophore elongations and green conidia. Mycologia, 95: 1100-1140. 18. Christian P. Kubicek, John Bissett, Irina Druzhinina, Cornelia Kullnig- Gradinger, George Szakacs, 2002. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South-East Asian isolates. In website: 19. Christopher R. Thornton, Dennis Pitt, Gavin E. Wakley and Nicholas J. Talbot, 2002. Production of a monoclonal antibody specific to the genus Trichoderma and closely related fungi, and it use to detect Trichoderma spp. in naturally infected composts. Microbiology, 148, 1263-1279 20. Clipson N., Landy E., Otte M., 2001. European register of marine species: a check-list of the marine species in Europe and a bibliography of guides to their identification. Collection Patrimoines Naturels, 50, 15-19 21. Druzhinina I., Koptchinski A., Komon M., Bissett J., Szakacs G., Kubicek C.P., 48 2004b. A DNA-barcode for strain identification in Trichoderma. Manuscript submitted. 22. Gams W., Bissett J., 1998. Morphology and Identification of Trichoderma. In: Kubicek, C.P., Harman, G.E. (Eds.), Trichoderma and Gliocladium. Vol. 1. Basic Biology, Taxonomy and Genetics. Taylor and Francis Ltd., London, p.3-34. 23. Gary E. Harman., 2000. Trichoderma spp., including T. harzianum, T. viride, T. koningii, T. hamatum and other spp. Deuteromycetes, Moniliales (asexual classification system). Cornel University, Geneve, NY 14456. 24. Gary J. Samuels, 2004. Trichoderma a guide to identification and biology. Unit States Deparment of Agriculture Agricultural Research service Systermatic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705-2350, USA. Blackwell Science, Ltd 25. Gary J. Samuels, 9-2005. Trichoderma: Systematic, the Sexual State, and Ecology. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service Systematic Botany and Mycology Laboratory 304, B-011A Beltsville, MD 20705. Acepted for publication. 26. Guarro Josep, Gené Josepa and Stchigel Alberto M., 1999. Developments in fungal taxonomy. Clinical Microbiology Reviews Vol. 12, No. 3, pp. 454- 500. 27. Kubicek C.P., Bissett J., Druzhinina I., Kullnig-Gradinger C.M., Szakacs G., 2003. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South East Asian isolates. Fungal Genet Biol, 38:310-319. 28. Kullnig-Gradinger C.M., Szakacs G., Kubicek C.P., 2002. Phylogeny and evolution of the fungal genus Trichoderma-a multigene approach. Mycol Res, 106:757-767. 29. Kuhls K., Lieckfeldt E., Samuels G.J., Kovacs W., Meyer W., Petrini O., Gams W., Bưrner T., Kubicek C.P., 1996. Molecular evidence that the asexual 49 industrial fungus Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocrea jecorina. Proc. Natl Acad Sci USA, 93:7755-7760. 30. Kuhls K., Lieckfeldt E., Samuels G.J., Meyer W., Kubicek C.P., Bưrner T., 1997. Revision of Trichoderma section Longibrachiatum including related teleomorphs based on an analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences. Mycologia, 89:442-460. 31. Leclerc M.C., Philippe H. , and Guého E., 1994. Phylogeny of dermatophytes and dimorphic fungi based on large subunit ribosomal RNA sequence comparisons. J. Med. Vet. Mycol. 32: 331-341. 32. Muthumeenakshi S., Mills P.R., Brown A.E., and Seaby D.A., 1994. Intraspecific molecular variation among Trichoderma harzianum isolates colonizing mushroom compost in the British Isles. Microbiology 140: 769- 777. 33. Palmer, Makaroff C.A., Apel I.J., and Shirzadegan M., 1990. Fluid structure of plant mitochondrial genomes: evolutionary and functional implications. In M. T. Clegg and S. J. O'Brien [eds.], Molecular evolution, 85–96. Alan R. Liss, New York, NY 34. Prasun K. Mukherjee and Kanthadai Raghu, 1997. Effect of temperature on antagonistic and biocontrol pontential of Trichoderma sp. on Sclerotium rolfsii. Mycopathologia. 139: 151-155. 35. Rifai M.A., 1969. A revision of the genus Trichoderma. Mycol Pap, 116:1-116. 36. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2 nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 37. Samuels G.J., 1996. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycol Res, 100:923-935. 38. Samuels G.J., Petrini O., Kuhls K., Lieckfeldt E., Kubicek C.P., 1998. The Hypocrea schweinitzii complex and Trichoderma sect. Longibrachiatum. Stud Mycol, 41:1-54. 50 39. Siu-Wai Chiu & David Moore, 2001. Deciphering Fungal Morphogenesis. Website: 40. Szymanski Maciej, Barciszewska Miroslawa Z., Erdmann Volker A. and Barciszewski Jan, 2001. 5S Ribosomal RNA Database. Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1: 176-178. 41. Turner D., Kovacs W., Kuhls K., Lieckfeldt E., Peter B., Arisan-Atac I., Strauss, J., Samuels G.J., Bưrner T., Kubicek C.P., 1997. Biogeography and phenotypic variation in Trichoderma sect. Longibrachiatum and associated Hypocrea species. Mycol Res, 101:449-459. 42. Van de Peer Y., Chapelle S., and De Wachter R., 1996. A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucleic Acids Research. 24:3381-3391. 43. Virginia Bioinformatics Institute Core Facilities Laboratory, 2002. DNA sequencing protocols. 44. Wakefield A.E., Peters S.E., Banergi S., Bridge P.D., Hall G.S., and Hawksworth D.L., 1992. Pneumocystis carinii shows DNA homology with the ustomycetous red yeast fungi. Mol. Microbiol. 6:1903-1911. 45. Wang C.S., Li Z.Z., and Butt T.M., 2002. Molecular studies of co-formulated strains of the entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana. 46. White T.J., Bruns T.M, Lee S. and Taylor J., 1989. Genetics and Evolution (part three). Amplication and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for Phylogenetics. pp.315 – 320. 47. White T.J., Bruns T., Lee S. and Taylor J., 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: M.A., Innis et al. (Eds). PCR Protocols. A guide to Methods and Applications. Academic Press, San Diego, pp. 315-322. Website 48. PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1: Kết quả giải trình tự vùng ITS – rDNA với primer ITS4 và ITS5 ở cơng ty M