Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm tomato spotted wilt virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật elisa và xây dựng quy trình chẩn đoán tomato spotted wilt virus bằng kỹ thuật rt – pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÀ CHUA TẠI TỈNH TIỀN GIANG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOMATO SPOTTED WILT VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. BÙI CÁCH TUYẾN NGUYỄN HỒNG PHƢỚC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY EVALUATION ON THE STATUS QUO OF TOMATO SPOTTED WILT VIRUS AFFECTING TOMATO PLANT IN TIEN GIANG PROVINCE BY ELISA AND FORMULATING THE RT – PCR PROCESS TO DIAGNOSE TOMATO SPOTTED WILT VIRUS Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: BUI CACH TUYEN NGUYEN HONG PHUOC Term: 2003 – 2007 HCMC, 9/2007 iv LỜI CẢM TẠ  Em xin chân thành cảm tạ: PGS.TS. Bùi Cách Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành khóa luận. Ban Giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh, Ban Chủ nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Ban Giám đốc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và toàn thể Anh Chị đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp em hoàn thành tốt khóa luận. TS. Lê Đình Đôn cùng quý Thầy – Cô trong và ngoài trƣờng đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và làm khóa luận.  Em xin cám ơn chị Dƣơng, chị Hƣng, chị Hạnh, anh Lẫm, anh Trƣờng, anh Vũ đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.  Cảm ơn tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K29 niên khóa 2003 – 2007, đã luôn gắn bó, chia sẻ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận.  Con vô cùng biết ơn cha mẹ đã dạy bảo, nuôi dƣỡng con đƣợc nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2007. Sinh viên Nguyễn Hồng Phƣớc v TÓM TẮT KHÓA LUẬN  Nguyễn Hồng Phƣớc, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 năm 2007, “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.  Nội dung thực hiện: Thu mẫu có triệu chứng nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định huyện Chợ Gạo, xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công. Xác định tỉ lệ nhiễm TSWV trên cà chua tại các xã Bình Ninh, Hòa Định, Bình Nhì, Thạnh Nhật thuộc tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Mẫu biểu hiện dƣơng tính mạnh đƣợc chọn để thực hiện phản ứng RT – PCR. Từ đó tìm ra quy trình RT – PCR chẩn đoán bệnh TSWV.  Kết quả đạt đƣợc: 1. Xác định tỷ lệ nhiễm TSWV tại các địa bàn nhƣ sau: Huyện Chợ Gạo Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Thị xã Gò Công Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 % 2. Bƣớc đầu tìm đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc để chẩn đoán bệnh TSWV. vi SUMMARY  This is Nguyen Hong Phuoc studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2007. The thesis entiled “Evaluation on the status quo of Tomato Spotted Wilt Virus affecting tomato plant in Tien Giang province by ELISA and formulating the RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus” This research was conducted from 3th, 2007 to 8th, 2007 in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University.  The contents of this are as follows: Collecting the samples with Tomato Spotted Wilt Virus symptoms in Binh Ninh and Hoa Dinh villages of Cho Gao district, Binh Nhi and Thanh Nhat of Go Cong town. Diagnosing Tomato Spotted Wilt Virus in tomato at Binh Ninh, Hoa Dinh, Binh Nhi anh Thanh Nhat villages of Tien Giang province by DAS – ELISA kit. Samples of Tomato Spotted Wilt Virus with positive reaction are selected to conduct the RT – PCR. The RT – PCR protocol to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus was tested.  The results of this research are as follows: 1. DAS – ELISA result data show that: Cho Gao district: Hoa Dinh village: 12,0 % Binh Ninh village: 13,16 % Go Cong town: Binh Nhi village: 14,29 % Thanh Nhat village: 10,0 % 2. Finding out the one step RT – PCR process to diagnose Tomato Spotted Wilt Virus. vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN .......................................................................................... v SUMMARY .............................................................................................................. vi MỤC LỤC ................................................................................................................ vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH ....................................................................................... xi DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... xii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ .................................................................................. xiii Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục đích ........................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ............................................................................................................. 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3 2.1. Sơ lƣợc về cây cà chua ..................................................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố .............................................................................. 3 2.1.2. Phân loại học ............................................................................................. 4 2.1.3. Đặc điểm thực vật học ............................................................................... 4 2.1.4. Giá trị dinh dƣỡng ..................................................................................... 5 2.2. Sơ lƣợc về bệnh hại cà chua ............................................................................. 6 2.2.1. Đặc điểm chung bệnh do virus .................................................................. 6 2.2.2. Sự lan truyền bệnh virus thực vật ............................................................. 7 2.2.3. Sơ lƣợc về TSWV ..................................................................................... 8 2.2.3.1. Nguồn gốc TSWV .............................................................................. 8 2.2.3.2. Cấu trúc TSWV .................................................................................. 9 2.2.3.3. Phân loại TSWV .............................................................................. 10 2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV .................................................................... 11 viii 2.2.3.5. Con đƣờng truyền bệnh .................................................................... 11 2.2.3.6. Hình thức tấn công và gây bệnh ....................................................... 12 2.2.3.7. Điều kiện phát triển .......................................................................... 13 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh ............................................................................. 13 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV ............................................................. 14 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh ................................................................. 16 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng ......................................... 16 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ................................................ 17 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ................................. 17 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA ............................................................................... 18 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR .......................................................................... 19 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR .................................................. 19 2.3.5.2. Nested PCR ...................................................................................... 20 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) . 20 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV ............................................................ 23 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài ........................................................................... 23 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc ........................................................................... 23 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 24 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 24 3.2. Vật liệu ........................................................................................................... 24 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị .................................................................................. 24 3.2.1.1. Dụng cụ ............................................................................................ 24 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị ............................................................................. 25 3.2.2. Hoá chất .................................................................................................. 25 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA............................................... 25 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR ......................................... 26 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 28 3.3.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 28 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu .............................................................................. 28 ix 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV ............................................................... 30 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA ........................................................................ 30 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR ................................................................... 32 3.3.3.3. Đổ gel điện di ................................................................................... 38 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 40 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA ............................................ 40 4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo .............................. 40 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công ............................... 41 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công .......... 42 4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng ....................................................... 43 4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR....................................... 44 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA ............................................................ 44 4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA ............................................................ 45 4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi ..................................................... 46 4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR................................................................... 46 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc .......................................................... 46 4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc......................................................... 46 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 48 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 48 5.2. Đề nghị ........................................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 50 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus RNA: Ribonucleic acid RNase: Ribonuclease DNA: Deoxyribonucleic acid DNase: Deoxyribonuclease cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid bp: Base pair DEPC: Diethyl pyrocarbonate ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay DAS – ELISA: Direct double antibody sandwich PCR: Polymerase chain reaction RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction PBS-T: Phosphate buffer saline with TWEEN – 20 p-NPP: p – nitrophenyl phosphate Ta: Annealing temperature Tm: Melting temperature UV: Ultra violet OD: Optical density xi DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV ................................................................................ 10 Hình 2.2. Chu trình sống của bọ trĩ ........................................................................... 12 Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua .............................................................. 14 Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc ................................................................. 21 Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc ................................................................... 21 Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số .................................................................... 44 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA .............................................................. 45 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc ....................................... 47 xii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B., 1993; PROSEA, 1994) ................................................................................ 5 Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu .................................................................................. 30 Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu ................................................................. 30 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí ELISA ................................................................................... 31 Bảng 3.4. Thành phần hóa chất RT – PCR một bƣớc ............................................... 35 Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA ...................................................... 36 Bảng 3.6. Thành phần hoá chất PCR ........................................................................ 37 Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo ............................................................................................................ 40 Bảng 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công .......................................................................................................... 41 Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công .................... 42 xiii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ĐỒ THỊ TRANG Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo ................................................... 40 Đồ thị 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại thị xã Gò Công ................................................... 41 Đồ thị 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công ......................... 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cà chua (Solanum lycopersicum) là cây trồng rất quan trọng, nó không những phục vụ nhu cầu hằng ngày của con ngƣời mà còn đem lại thu nhập cho ngƣời dân mà xa hơn nữa là góp phần không nhỏ vào ngân sách nhà nƣớc. Chính vì lợi nhuận không nhỏ đó mà cà chua đƣợc trồng vào tất cả các mùa trong năm, ở khắp mọi nơi trên thế giới. Tiền Giang với điều kiện khí hậu thích hợp, nƣớc tƣới dồi dào và đất đai màu mỡ rất phù hợp để trồng rau màu, trong đó cà chua chiếm diện tích khá lớn, nó nhƣ là nguồn thu nhập không thể thiếu của ngƣời dân nơi đây. Nhƣ là một quy luật của tự nhiên, đi đôi với sự gia tăng về diện tích, tăng cƣờng thâm canh thì dịch bệnh gia tăng không kém. Dịch bệnh là một trong những trở ngại lớn cho việc canh tác của ngƣời dân, dịch bệnh làm thiệt hại không nhỏ cho thu nhập ngƣời dân và ngân sách nhà nƣớc. Trong số những bệnh hại cây trồng thì bệnh do virus là nguy hiểm nhất do chƣa có thuốc trị đặc hiệu, kèm theo là khả năng lây lan rất nhanh, khó nhận biết ở giai đoạn sớm, và khi phát thành bệnh thì đã gây thiệt hại rất lớn không thể kiểm soát đƣợc. Trong số những bệnh do virus gây ra thì TSWV gây thiệt hại rất lớn cho việc canh tác cà chua, thuốc lá và những cây trồng họ Solanaceae. Điều đó đặt ra một nhu cầu cấp thiết làm sao để sớm phát hiện và loại bỏ cây bị nhiễm. Đây không chỉ là vấn đề quan trọng đối với các nƣớc Trung Quốc, Mỹ, Brazil, Mehico… mà còn đối với các nƣớc nhiệt đới khác, trong đó có Việt Nam. Ngày nay với sự phát triển vƣợt bậc khoa học và công nghệ đặc biệt là của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử đã giúp cho việc chẩn đoán sớm bệnh một cách nhanh, chính xác nhiều bệnh virus. 2 Xuất phát từ thực tế trên cùng với sự chấp nhận của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh và sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Bùi Cách Tuyến, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tình trạng nhiễm Tomato Spotted Wilt Virus trên cà chua tại tỉnh Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA và xây dựng quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT - PCR” nhằm góp phần kiểm soát dịch bệnh. 1.2. Mục đích Chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại Tiền Giang bằng kỹ thuật ELISA. Xây dựng hoàn chỉnh quy trình chẩn đoán Tomato Spotted Wilt Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. 1.3. Yêu cầu Thu mẫu cà chua có triệu chứng nhiễm bệnh TSWV . Nắm vững kỹ thuật và các bƣớc tiến hành DAS – ELISA. Lấy mẫu có phản ứng dƣơng tính mạnh với DAS – ELISA tiến hành phản ứng RT – PCR. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Sơ lƣợc về cây cà chua 2.1.1. Nguồn gốc và phân bố Cà chua có nguồn gốc ở Peru, Ecuado và Bolivia. Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng trọt ngày nay vẫn còn đƣợc tìm thấy ở dọc theo dãy núi Anđơ (Peru), Ecuado và Bolivia (De Candolle,1884). Tuy nhiên Mehico là đất nƣớc đâu tiên trồng trọt hóa cây trồng này dựa vào 3 chứng cứ: cà chua trồng bắt đầu từ Châu Mỹ; đƣợc trồng trọt hóa trƣớc khi chuyển xuống Châu Âu, Châu Á và tổ tiên của cà chua trồng ngày nay là cà chua Anh Đào đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Mỹ, sau đó đến vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi; những nghiên cứu về enzyme định vị và sự biến đổi di truyền của các dạng cà chua tìm thấy ở Mehico, Trung Mỹ và Peru cũng nhƣ nghiên cứu về khoảng cách di truyền giữa các giống nguyên thủy tại những nơi này và các giống hiện đại đã kết luận rằng Mehico là quê hƣơng của cà chua trồng ngày nay (PROSEA, 1999; Trần Khắc Thi và Mai Thị Phƣơng Anh, 2003). Đầu thế kỷ 16 cà chua đƣợc phát hiện trồng ở Ý, Đức, Pháp, Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha. Ngày nay cà chua là loại rau ăn quả dùng làm thực phẩm, đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, là loại rau có giá trị dinh dƣỡng rất lớn và phong phú (Tạ Thu Cúc, 2001). Ở Việt Nam cà chua đƣợc trồng chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng trung du Bắc Bộ (Hà Nội, Hà Bắc, Hải Phòng,…) và ở miền Nam (Lâm Đồng, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh,…). 4 2.1.2. Phân loại học Lớp (Class) Magnoliopsida Lớp phụ (Subclass) Asteridae Bộ (Order) Solanales Họ (Family) Solanaceae Giống (Genus) Solanum Loài (Species) Solanum lycopersicum Tên tiếng Anh Tomato Tên tiếng Việt Cà chua 2.1.3. Đặc điểm thực vật học Cây cà chua có bộ nhiễm sắc thể lƣỡng bội 2n = 24, cây thân thảo hằng niên hoặc lƣu niên, là cây tự thụ phấn. Rễ cà chua thuộc loại rễ chùm, có khả năng phát triển rộng và sâu rất nhanh. Rễ cà chua có thể ăn sâu tới 1 – 1,5 m (điều kiện tối hảo), hệ rễ phát triển chủ yếu ở tầng đất 0 – 30 cm. Rễ cà chua phát triển rất mạnh ở giai đoạn cây con, khi rễ chính bị đứt thì rễ phụ phát triển rất nhanh. Thân cây cà chua thuộc loại thân bụi. Cà chua có đặc tính phân cành rất mạnh (một nách lá có một mầm nách), thân có nhiều đốt. Lúc nhỏ toàn thân phủ một lớp lông tơ mềm, chứa nhiều nƣớc, thân dòn dễ gãy, có dạng hình tròn hay hình bầu dục. Lá cà chua thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá kép có từ 3 – 4 đôi lá chét, ở ngọn có một lá riêng biệt gọi là đỉnh lá. Mỗi lá chét có răng cƣa sâu nông khác nhau tùy giống, trên mặt lá có một lớp lông tơ. Hoa thuộc loại hoa hoàn chỉnh, hoa tự thụ phấn là chủ yếu, không có mùi thơm và hoa tiết ra nhiều chất độc. Số lƣợng hoa trên chùm thay đổi tùy giống và tùy thời tiết, thƣờng từ 5 – 20 hoa. 5 Quả thuộc loại quả mọng, nhiều nƣớc, chia ra nhiều ô. Trọng lƣợng quả thay đổi rất lớn có thể từ 2 – 3 g đến 200 – 300 g. Khi trái còn non có màu xanh, khi chín có màu vàng, vàng da cam đến đỏ. Hạt cà chua nhỏ, dẹp, nhiều lông. Bên ngoài hạt đƣợc bao bọc bởi một lớp acid amin, trung bình có 50 – 350 hạt trong quả, trọng lƣợng 1000 hạt là 2,5 – 3,5 g. 2.1.4. Giá trị dinh dƣỡng Cà chua là loại rau ăn quả rất đƣợc ƣa thích vì phẩm chất ngon và chế biến đƣợc nhiều cách. Cà chua còn cho năng suất cao nên đƣợc trồng rộng rãi và canh tác khoảng 200 năm nay ở Châu Âu để làm cây thực phẩm. Bảng 2.1. Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thịt trái cà chua (McGlasson, B., 1993; PROSEA, 1994) Thành phần Hàm lƣợng Thành phần Hàm lƣợng Hàm lƣợng nƣớc 94,7 g Kali 200 mg Proteine 1,0 g Na 45,8 g Chất béo 0,1 g Clo 38 mg Cabohydrate 3,6 g P 16 mg Vitamine A 1700 I.U Ca 8 mg Thiamine (B1) 0,04 – 0,1 mg S 24 mg Vitamine C 18 – 21 mg Mn 10 mg β – carotene 0,34 mg Mg 10 mg Axit citric 0,43 mg Fe 0,3 – 0,6 mg Axit Nicotinic (PP) 0,7 mg Zn 0,2 mg Riboflavin 0,02 mg Năng lƣợng 56 – 80 KJ Axit Malic 0,08 mg 1 mg = 3330 I.U 6 2.2. Sơ lƣợc về bệnh hại cà chua Bệnh hại cà chua là trở ngại lớn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới, có khoảng 200 bệnh cà chua đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau, nhƣng có thể chia làm 2 nhóm nguyên nhân chính gây bệnh trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh. Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng… Bệnh không do ký sinh thƣờng là do nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng… Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại nhƣ : Bệnh khảm vàng: TMV (Tomato Mosaic Virus) Bệnh khảm mảng lồi lõm: CMV (Cucumber Mosaic Virus) Bệnh đốm héo: TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) Bệnh xoăn ngọn cà chua: TLCV (Tomato Leaf Curl Virus) Bệnh xoăn vàng ngọn: TYLCV (Tomato Yellow Leaf Curl Virus) Bệnh đốm hình nhẫn: TRSV (Tomato Black Ring Virus) Bệnh lùn lụi cà chua: TBSV (Tomato Bushy Stunt Virus) (Nguồn: Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến và Nguyễn Mạnh Chinh, 2003) 2.2.1. Đặc điểm chung bệnh do virus (Vũ Triệu Mân, 1999) Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ. Chúng thiếu hệ thống men, hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số lƣợng. Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều virus. Virus không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành nhiều virus mới. Cơ thể thực vật kiệt quệ dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết. 7 Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thƣớc rất nhỏ bé, cấu tạo rất đơn giản: là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy nhiên, cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA. Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan. Các acid nucleic (RNA hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng. Trọng lƣợng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da. Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh trùng. Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trƣờng có thể tạo thành các tinh thể. 2.2.2. Sự lan truyền bệnh virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999) Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dƣới rồi lại từ dƣới lên trên khi các dòng chất dinh dƣỡng đƣợc vận chuyển về các cơ quan sinh thực. Virus di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn. Các con đƣờng truyền bệnh: Truyền qua nhân giống vô tính: ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép, cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay thân cây. Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: có khoảng 100 loài virus có khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí. Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: trồng cây với mật độ dày, giao tán, lá cọ sát nhau giữa cây bệnh với cây khỏe, hay truyền qua vết thƣơng do gió, chăm sóc, thu hái, gia súc. Truyền bệnh bằng côn trùng môi giới (nhện, tuyến trùng): côn trùng là nhóm môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn trên đồng ruộng. Một loại côn trùng thƣờng chỉ là môi giới truyền bệnh cho một loại virus mà thôi. 8 Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng: Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây tới 30 phút sau khi chích hút ở cây bệnh và có thể lây ngay. Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền bệnh cho cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời. Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian giữa hai nhóm trên. Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi: Tăng về số lƣợng, tăng cƣờng tính ký sinh gây bệnh và đƣợc đƣa vào đúng tầng mô mẫn cảm bệnh. Nhƣng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức sống giảm. Truyền bệnh nhờ nấm: đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng truyền bệnh virus cho cây. Truyền bệnh bằng dây tơ hồng: đây là thực vật thƣợng đẳng ký sinh tạo rễ ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa. Do vậy, có nhiều loại virus thực vật di chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh. 2.2.3. Sơ lƣợc về TSWV 2.2.3.1. Nguồn gốc TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng ở cả vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên toàn thế giới. TSWV đƣợc báo cáo đầu tiên vào năm 1915 khi gây thiệt hại rất lớn trên cà chua ở Úc, sau đó đƣợc mô tả chính xác là bệnh gây ra bởi virus (Brittlebank, 1919). Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và nhiều vùng trên thế giới. Bên cạnh ớt, cà chua và các loại hoa màu chính yếu nhạy cảm với TSWV thì còn có cây họ cúc, khoai tây, đậu phụng, thuốc lá, rau diếp, và một số loại hoa màu khác. 9 Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng tại Hawaii. Năm 1970, lần đầu tiên TSWV đƣợc xác định là gây bệnh tại Georgia. Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng các cánh đồng trồng đậu phộng vào năm 1985 – 1986. Năm 1989, TSWV gây thiệt hại nặng cho thuốc lá, đậu phộng và cà chua ở miền Nam Georgia. Tỉ lệ nhiễm khoảng 59 – 90 % điều này đƣa đến hậu quả là nó ảnh hƣởng lên các loại hoa màu có giá trị thƣơng mại, và trong thời gian gần đây nó là một trong những loại virus làm ảnh hƣởng đến các loại hoa màu nhiều nhất. (Lindsey Irons and Emily Sims). 2.2.3.2. Cấu trúc TSWV Lớp vỏ lipid có chứa 2 loại glycoprotein G1 và G2 bao quanh một genome RNA gồm 3 phần đã đƣợc đóng gói chặt chẽ bởi nhiều bản sao của tiểu đơn vị nucleoprotein (N) và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwijk và cộng sự, 1993). Bộ gene virus là RNA chia làm 3 phần, là loại ambisense ssRNA chứa 5 gen mã hóa ít nhất 6 protein cấu trúc của virus: LRNA (dài 8.897 nucleotide) là RNA lớn nhất. Đó là sợi negative sense và là sợi đơn cistron. LRNA mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA. MRNA (4.821 nucleotide) mã hóa 2 protein vỏ (G1 và G2) và một protein phi cấu trúc đƣợc xem nhƣ là protein di chuyển từ tế bào đến tế bào (NSm). SRNA (2.916 nucleotide) mã hóa nucleoprotein (N) và một protein phi cấu trúc thứ 2 (NSs). (Nguồn: Elliott và cộng sự,2000). 10 Hình 2.1. Cấu trúc virus TSWV 2.2.3.3. Phân loại TSWV TSWV thuộc họ Bunyaviridae, họ Bunyaviridae có 5 giống là: Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó Tospovirus là một trong mƣời virus gây bệnh cây phổ biến nhất. TSWV đƣợc phân là đại diện duy nhất của nhóm đơn thân xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989, TSWV đƣợc chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I; đến giữa những năm 1989 – 1992, hai dòng này đƣợc xác định có đặc tính huyết thanh học khác nhau và chúng đƣợc đổi tên thành TSWV (TSWVdòng L) và INSV (TSWV dòng I). Hiện nay, TSWV đƣợc phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Ngƣời ta dựa trên đặc tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà chia ra làm 6 loài: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I). Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II). Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III). Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV). Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V). Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV. 11 2.2.3.4. Dãy ký chủ của TSWV TSWV có phổ ký chủ rất rộng, chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và nhiều cây trồng khác nhau trên toàn thế giới. Hiện nay danh sách ký chủ của TSWV khoảng 1000 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn (German và cộng sự, 1992). Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm các loại cây trồng quan trọng nhƣ ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, cần tây, rau diếp và nhiều loại cây cảnh. Ở những vùng có mùa đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa đông mát mẻ thì cây ký chủ hằng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng. 2.2.3.5. Con đƣờng truyền bệnh TSWV đƣợc truyền từ cây này sang cây khác thông qua các loài bọ trĩ. Chúng là những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5 mm) sống cả ở trên hoa, lá và đất. Có chín loài bọ trĩ đƣợc xem là vector truyền TSWV, trong đó những loài Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F. schultzei (Trybom), F. fusca (Hind), Thrips tabaci Lind đƣợc xem là vector chính truyền bệnh vì khả năng phân bố rộng rãi của chúng. Bọ trĩ trƣởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh sản không cần con đực. Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa, ấu trùng vừa nở ra bắt đầu ăn ngay. Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm chúng thu virus vào bên trong, thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên đến khi ấu trùng phát triển hoàn thiện chúng sẽ chui vào đất và trở thành nhộng. Sau đó chúng trƣởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất. Ấu trùng bọ trĩ chƣa lan truyền bệnh cho cây ngay đƣợc mà phải chờ đến khi chúng trƣởng thành. Những con bọ trĩ trƣởng thành có thể mang virus suốt đời nhƣng không truyền cho giai đoạn trứng. Thế hệ kế tiếp mang virus bằng việc ăn cây bị nhiễm. Thời gian từ trứng đến giai đoạn trƣởng thành có thể thay đổi do nhiều yếu tố. 12 Hình 2.2. Chu trình sống của bọ trĩ (Nguồn: T.A. Zitter and M.L. Daughtrey, 1989) 2.2.3.6. Hình thức tấn công và gây bệnh Con đƣờng xâm nhập và nhân bản của virus đƣợc thể hiện qua các giai đoạn sau. Đầu tiên là sự tấn công của hạt virion. Hai là xâm nhập vào và cởi bỏ lớp áo của hạt virus và sự hợp nhất giữa màng virus và màng nhân. Ba là quá trình sao mã sơ cấp. Bốn là quá trình dịch mã của các đoạn mRNA L và S bởi các ribosome tự do, trong khi đó sự dịch mã của các đoạn mRNA M bởi các ribosome gắn trên màng. Năm là giai đoạn tổng hợp và phủ (encapsidation) một đầu bằng đoạn nucleotide để thích hợp nhƣ là những khuôn mẫu đối với RNA genome hoặc trong một số trƣờng hợp là những mRNA. Sáu là sự tái bản genome tiếp theo là sự sao mã thứ cấp. Sau đó là sự tạo hình, bao gồm cả protein G1 và G2 từ genome M trong tiểu thể golgi. Giai đoạn cuối cùng trong tiến trình xâm nhiễm là sự hợp nhất giữa 13 khối tế bào chất với màng tế bào và giải phóng virion trƣởng thành (Lindsey Irons và Emily Sims) 2.2.3.7. Điều kiện phát triển Theo Best bệnh thích nghi với thời tiết ấm áp, thời tiết ấm và khô là điều kiện tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản. Nhiệt độ trung bình trong ngày vào khoảng 25oC kết hợp với lƣợng mƣa giảm là điều kiện tối ƣu cho bọ trĩ lẫn TSWV phát triển. Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng của cây, giai đoạn mà virus đƣợc bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác dễ dàng. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ. Mƣa nhiều và to trong mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp, vì vậy dịch bệnh thời điểm này cũng giảm đi. Virus TSWV có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ trĩ mang virus qua đông dƣới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân đến, thời tiết ấm áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh trên cây. 2.2.3.8. Triệu chứng bệnh Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy theo tuổi cây, điều kiện canh tác, mức độ nhiễm bệnh. Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm, những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên những đốm này có màu vàng, nhƣng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu nâu đỏ. Khi bị nhiễm virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên, lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, nhƣ bóp nát, thân cây bị uốn cong, ngã, rủ xuống, phát triển bất thƣờng. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá rụng dần và chết. 14 Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả hoặc có quả nhƣng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ quả, làm năng suất giảm và giảm giá trị cảm quan. (Nguồn: Ken Pernezny và cộng sự, 2003). Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn, nấm hay stress môi trƣờng gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác Hình 2.3. Triệu chứng TSWV trên cà chua 2.2.3.9. Khống chế bệnh do TSWV Hiện nay hai phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của TSWV. 15  Sử dụng cây kháng Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho) và cây kháng TSWV. Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trên thị trƣờng: Giống Amelia (HMX – 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm Fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt. Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn. Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm Fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444.  Chiến lƣợc quản lý TSWV Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ – ký sinh – vectơ đã giúp chúng ta phát triển những biện pháp canh tác nhằm làm giảm đáng kể thiệt hại do TSWV gây ra trên những cây trồng nhạy cảm. Nếu sử dụng riêng lẻ từng biện pháp thì hiệu quả sẽ không cao. Vì vậy ngƣời ta thƣờng kết hợp nhiều biện pháp với nhau để giảm đến mức tối thiểu thiệt hại do virus gây ra. Biện pháp quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, bao gồm các kỹ thuật: Bảo vệ cây con: cây con rất dễ bị nhiễm TSWV vì vậy cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV, trồng trong nhà kính hoặc sử 16 dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn để làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm. Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn. Tránh trồng độc canh, nên hạn chế trồng cùng một loại cây trồng nhiều lần trên một ruộng đất. Trồng luân canh giữa các loại cây trồng nhạy cảm và không nhạy cảm với TSWV để loại bỏ mầm bệnh. Trồng với mật độ thích hợp sẽ hạn chế đƣợc bệnh. Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh. Loại bỏ những nguồn chứa TSWV, cày đất nơi thu hoạch, loại bỏ các loài cỏ dại là ký chủ của TSWV chung quanh đồng ruộng. Nên bỏ hoang các đồng ruộng bị nhiễm bệnh khoảng 1 tháng. Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lƣợng và thời gian hợp lý để tiêu diệt đƣợc nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt đƣợc kết quả tốt nhất. Khống chế bọ trĩ bằng biện pháp sinh học là có hiệu quả và có lợi nhất lại không ảnh hƣởng đến môi trƣờng. 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng (Vũ Triệu Mân, 2003) Triệu chứng là những biểu hiện bên ngoài, phản ánh đặc điểm riêng biệt của một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Đối với bệnh này, chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phƣơng pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài điển hình về hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận cây bị bệnh mà chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp cũng dẫn đến nhầm lẫn, nhất là trong trƣờng hợp chẩn đoán các bệnh có triệu chứng bên ngoài tƣơng tự nhau nhƣng do các tác nhân khác nhau gây ra. Triệu chứng bên ngoài vẫn có thể biến đổi ít nhiều 17 tùy thuộc vào đặc điểm của giống cây, kỹ thuật canh tác và yếu tố ngoại cảnh. Do đó, trong những trƣờng hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng các phƣơng pháp bổ sung khác. 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị (Vũ Triệu Mân, 2003) Cây chỉ thị là những cây ký chủ nhƣng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phƣơng pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh virus thực vật. Đối với virus cây chỉ thị đƣợc chia làm hai nhóm: Nhóm cây nhiễm bộ phận: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Nhóm cây nhiễm hệ thống: là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử (Vũ Triệu Mân, 2003) Trong tế bào ký chủ, virus thƣờng ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng đặc trƣng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô thực vật bị nhiễm bệnh, ngƣời ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn. Phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay đã đƣợc làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt trong trƣờng hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác. Ngoài ra ngƣời ta còn dùng lát cắt mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm bệnh đƣợc cắt. 18 2.3.4. Phƣơng pháp ELISA (Vũ Triệu Mân, 2003) Phƣơng pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phƣơng pháp ELISA cho phép phát hiện và định lƣợng các thành phần nhƣ là: peptide, kháng nguyên, kháng thể, enzyme, hormone…1978 Clark và Adam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật ELISA để chuẩn đoán bệnh virus hại khoai tây và từ đó kỹ thuật này đƣợc công nhận là có độ chính xác cao hơn các phƣơng pháp huyết thanh học thông thƣờng. Kỹ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ RIA (Radio Immuno Assay) thì kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn nhƣng vẫn đảm bảo độ chính xác nhƣ nhau. Thành phần cơ bản của phản ứng ELISA gồm: kháng nguyên, kháng thể, và cơ chất tạo màu. Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cho tất cả các dạng ELISA là: ELISA trực tiếp (Direct ELISA): Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ đƣợc gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ đƣợc phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã đƣợc gắn enzyme). ELISA gián tiếp (Indirect ELISA): Phƣơng pháp này khác ELISA trực tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không đƣợc gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể đƣợc gắn với enzyme). 19 Sandwich ELISA: Đây là một dạng ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy. Kết quả thí nghiệm đƣợc đánh giá thông qua sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (kháng thể sơ cấp) và kháng thể phát hiện (kháng thể thứ cấp). Kĩ thuật này cũng đƣợc phân làm hai dạng: Direct sandwich ELISA Indirect sandwich ELISA 2.3.5. Phƣơng pháp RT – PCR 2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR (Bùi Chí Bửu, 1999) Khi DNA polymerase hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sens primer hay forward primer) và một mồi ngƣợc (antisens primer hay reverse primer). PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau: Biến tính phân tử DNA (Denature) Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing) Tổng hợp mạch mới (Extension) Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần. Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho quá trình biến tính và bắt cặp. 20 2.3.5.2. Nested PCR (Mc Pherson M.J., 2000) Đây là dạng cải biến của phƣơng pháp PCR, trong đó phản ứng sẽ đƣợc thực hiện lần lƣợt với hai hay nhiều cặp mồi, sau đó các mồi còn lại sẽ khuếch đại những đoạn nằm bên trong của sản phẩm PCR ban đầu bằng cách sử dụng sản phảm PCR đầu tiên này làm khuôn mẫu. Phƣơng pháp nested – PCR cũng có thể thực hiện với một cặp mồi đầu tiên và một mồi đơn cho phản ứng nested – PCR sau đó. Phƣơng pháp này đƣợc gọi là Heminested – PCR (HN – PCR). Với phƣơng pháp này, độ đặc hiệu của phản ứng tăng lên nhiều do mồi “nested” sẽ loại bỏ hầu nhƣ tất cả các sản phẩm không đặc hiệu của lần PCR đầu tiên. Tuy nhiên sử dụng nhiều mồi nên độ nhạy của phản ứng cũng tăng lên, do đó phản ứng dễ nhiễm hơn so với PCR thông thƣờng. Vì vậy phải hết sức cẩn thận khi thao tác ở từng giai đoạn PCR . 2.3.5.3. RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) Cùng với các phƣơng pháp: Real Time PCR, Nested PCR thì RT – PCR là một cải biến của phƣơng pháp PCR thông thƣờng nhằm đáp ứng những mục đích sử dụng khác nhau. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử dụng kỹ thuật RT – PCR. Trƣớc hết RNA đƣợc chuyển thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc . Mồi sử dụng trong giai đoạn này có thể là mồi “ngƣợc” của PCR giai đoạn sau, có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với đuôi poly A của mRNA), mà cũng có thể là hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth polymerase cho cả hai giai đoạn. Kỹ thuật RT – PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp cổ điển nhƣ Northern blot (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). 21 RT – PCR một bƣớc: trong kỹ thuật RT – PCR một bƣớc quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra trong cùng một phản ứng. Hình 2.4. Quy trình RT – PCR một bƣớc RT – PCR hai bƣớc: trong kỹ thuật này quá trình tổng hợp cDNA và quá trình khuếch đại diễn ra ở phản ứng tách biệt nhau. Hình 2.5. Quy trình RT – PCR hai bƣớc 22  Tổng hợp cDNA trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : Ly trích RNA tổng số, trong đó có RNA của virus. Tổng hợp cDNA reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA. (1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích. (3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả.  Khuếch đại cDNA lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau: Biến tính: chuyển dây đôi thành dây đơn Bắt cặp: primer gắn vào vị trí chuyên biệt có trình tự bổ xung với nó trên cDNA khuôn mẫu. Kéo dài: kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase. Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (thông thƣờng: 94oC, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần. Một kỹ thuật mới phát triển là kỹ thuật in situ RT – PCR cho phép khuếch đại các RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc 23 tiến hành trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame. 2.4. Một số kết quả nghiên cứu về TSWV 2.4.1. Nghiên cứu nƣớc ngoài Sonya Broughton, Roger Jones và Brenda Coutts (2004) nghiên cứu về biện pháp quản lý bọ trĩ và bệnh TSWV. John M. Sherman, James W. Moyer, và Margaret E. Daub (1998) khảo sát khả năng chống chịu của cây hoa cúc với sự biểu hiện gene N (Nucleocapsid) của virus TSWV. M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky (2002) đánh giá hiệu quả của việc sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV và sử dụng Acibenzolar – S – methyl nhằm quản lý TSWV. M. D. Bandla, L. R. Campbell, D. E. Ullman, và J. L. Sherwood (1997) sử dụng kỹ thuật điện di protein và phản ứng huyết thanh có đánh dấu huỳnh quang để nghiên cứu về sự tƣơng tác giữa Glycoprotein của TSWV với thụ thể tiếp nhận ở thành dạ dày bọ trĩ. 2.4.2. Nghiên cứu trong nƣớc Nghiên cứu về virus nói chung và TSWV nói riêng còn khá mới, chủ yếu là những nghiên cứu ở các trƣờng Đại học. Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM (2003) bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus (TSWV, CMV, TMV) bằng kỹ thuật DAS – ELISA. Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM (2005) điều tra bệnh TSWV trên cây thuốc lá trong vƣờn nhân giống cây con tại tỉnh Tây Ninh. 24 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian tiến hành nghiên cứu từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2007. Địa điểm lấy mẫu: lấy mẫu cà chua có triệu chứng bệnh TSWV tại tỉnh Tiền Giang tiến hành thu mẫu và trữ ở -200C cho đến khi phân tích. Việc phân tích đƣợc tiến hành tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh thuộc Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Môi Trƣờng (RIBET), Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu 3.2.1. Dụng cụ và thiết bị 3.2.1.1. Dụng cụ Cối, chày sứ Lọ đựng hóa chất Eppendorf Hộp đựng đầu tip Micropipette Đầu tip Đĩa ELISA (microplates) 96 giếng Ống đong Khay đổ gel Bồn chứa ethium bromide Các dụng cụ cung cấp kèm theo kit ly trích RNA 25 3.2.1.2. Máy móc, thiết bị Máy cất nƣớc Cân phân tích Máy li tâm Tủ cấy Tủ mát Tủ định ôn Bồn ủ nhiệt Máy rửa ELISA Bồn ủ ELISA Máy đọc ELISA Máy vortex (IKA Works) Máy PCR Lò viba (Electrolux) Máy điện di Máy đọc gel 3.2.2. Hoá chất 3.2.2.1. Hoá chất dùng trong kỹ thuật ELISA Sử dụng kit ELISA do Agdia cung cấp gồm các thành phần sau: Dịch trích mẫu (SEB1 extract buffer 1X) Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer) Kháng thể (Capture antibody) Dịch rửa (PBST wash buffer) Đối chứng dƣơng (Positive control) Đối chứng âm (Negative control) Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (ECI enzyme conjugate buffer) 26 Kháng thể gắn enzyme alkaline – phosphatase (Conjugate antibodies) Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu (PNP substrate buffer) Chất chỉ thị màu p – NPP Ngoài ra còn sử dụng thêm: Cồn 70 % Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kỹ thuật RT – PCR  Hóa chất dùng trong ly trích RNA: sử dụng kit ly trích SV total RNA Isolation System do Promega cung cấp. Những hóa chất có sẵn trong kit: Dịch trích mẫu (RNA lysis buffer) Dịch pha loãng RNA (RNA dilution buffer) Dịch rửa (RNA wash solution) DNase I dạng bột DNase stop solution Dịch pha loãng DNase I (Yellow core buffer và MnCl2) Nuclease free water Bên cạnh đó cần sử dụng thêm các hoá chất đã có sẵn trong phòng thí nghiệm: β – mercaptoethanol 14,2 M Ethanol 95 – 100 % NaOH 0,1 M EDTA 1M DEPC (Diethyl pyrocarbonate)  Hóa chất dùng chạy RT – PCR  RT – PCR một bƣớc Reverse transcription 10X buffer MgSO4, 25 mM dNTP mix, 10 mM M – MLV reverse transcriptase 27 Taq DNA polymerase Primer xuôi Primer ngƣợc RNasin Nuclease free water  RT – PCR hai bƣớc Dùng tạo cDNA: sử dụng kit tổng hợp cDNA (Reverse transcription system) do Promega cung cấp với các thành phần sau: AMV reverse transcriptase Recombinant RNasinR ribonuclease inhibitor Oligo(dT)15 primer (0,5 µg/µl) Radom primers (0,5 µg/µl) 1,2 kb kanamycin positive control RNA (0,5 µg/µl) dNTP mix, 10 mM Reverse transcription 10X buffer MgCl2, 25 mM Nuclease free water Hoá chất sử dụng phản ứng PCR: do Promega cung cấp gồm có: Green GoTaq flexi bufer 5X MgCl2 (25 mM) dNTPmix (10 mM) GoTag DNA polymerase (0,5 U/µl) Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease – free water) Primer: Cặp mồi 1: L1 (4377 – 4396) R 5’ – AAT TGC CTT GCA ACC AAT TC – 3’ Tm = 53,7 L2 (4121 – 4140) F 5’ – ATC AGT CGA AAT GGT CGG CA – 3’ Tm = 56,5 (J.Morris) 28 Cặp mồi 2 : P28 (3977 – 3996) 5’ – AGA GTG ATC CAT CGG AAG CC – 3’ Tm = 54 M6 (4700 – 4723) 5’ – GCA ATA GAG AGG AAT AAT CGC TCC – 3’ Tm = 55  Hóa chất sử dụng trong điện di Agarose TAE 0,5X Loading dye Ethium bromide Ladder 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Nội dung nghiên cứu Lấy mẫu cà chua có triệu chứng TSWV tại tỉnh Tiền Giang để tiến hành phân tích. Tiến hành phản ứng ELISA với mẫu bệnh thu đƣợc. Thống kê và so sánh tỉ lệ nhiễm TSWV giữa các vùng lấy mẫu thông qua kết quả ELISA. Lấy mẫu ELISA có biểu hiện dƣơng tính mạnh khảo sát nhằm tìm ra quy trình RT – PCR phù hợp. 3.3.2. Phƣơng pháp lấy mẫu Do đặc tính cà chua đƣợc trồng rất phổ biến tại Tiền Giang nên việc lấy mẫu đƣợc tiến hành bằng cách liên hệ trực tiếp với hộ dân trồng cà chua. Tùy theo diện tích vƣờn trồng có thể lấy từ 10 – 15 mẫu, cách lấy mẫu theo sơ đồ bố trí lấy mẫu ở bảng 3.1, những mẫu còn lại đƣợc lấy một cách ngẫu nhiên. Lấy mẫu lá cà chua ở phần ngọn có triệu chứng bệnh TSWV trữ ở -200C cho đến khi tiến hành nghiên cứu (số lƣợng mẫu tùy vào số lƣợng thí nghiệm có thể tiến hành). Lấy mẫu cà chua không quá non và cũng không quá già. 29 30 Bảng 3.1. Sơ đồ bố trí lấy mẫu 1 3 5 2 4 Số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Bảng 3.2. số lƣợng mẫu và vị trí lấy mẫu Tỉnh Huyện Xã Số lƣợng mẫu Tiền Giang Chợ Gạo Hòa Định 25 Bình Ninh 38 Gò Công Bình Nhì 42 Thạnh Nhật 30 Tổng số lƣợng mẫu 135 3.3.3. Phƣơng pháp phát hiện TSWV 3.3.3.1. Phƣơng pháp ELISA Tiến hành theo hƣớng dẫn của protocol của kit ELISA Lấy 0,5 g mẫu trữ ở -200C cho vào cối thêm 2,5 ml dịch trích mẫu. Nghiền thật nát vụn, sau đó đổ vào eppendorf và ghi ký hiệu thật cẩn thận. 31 Đem ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong 3 phút ở nhiệt độ 40C. Dùng micropipette hút phần dịch nổi sang một eppendorf mới và cũng ghi nhãn cẩn thận, trữ ở 40C Các bƣớc tiến hành: Bƣớc 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí theo hƣớng dẫn của Kit Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 H BF: ex tract buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng NC (Negative control): Đối chứng âm Substrate: chỉ load nƣớc cất Bƣớc 2: pha dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể 1/200, sau đó cho 100 µl kháng thể vào cột 2 – 11, dán băng keo và đem ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ. Bƣớc 3: rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS – T bằng máy rửa. Bƣớc 4: cho nƣớc cất vào cột số 1(100 µl/giếng), cho đối chứng dƣơng và đối chứng âm vào 2 ô PC và 2 ô NC (100 µl/giếng), dịch nghiền mẫu (100 µl/giếng) vào ô từ 1 – 27. Đem ủ ở 40C qua đêm Bƣớc 5: rửa lại 3 lần với PBS – T bằng máy rửa. 32 Bƣớc 6: pha dung dịch đệm pha loãng kháng thể, pha loãng kháng thể có gắn enzyme 1/200. Hút 100 µl dung dịch kháng thể có gắn enzyme đã đƣợc pha vào mỗi giếng , dán băng keo lại, sau đó đem ủ ở 370C trong 2 giờ. Bƣớc 7: rửa lại 3 lần với PBS – T Bƣớc 8: hoà tan pNPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là 1 mg/ml của pNPP. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở 370C trong 30 phút Bƣớc 9: đọc kết quả bằng máy đọc OD sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ.Trong đó, giá trị và biện luận của test ELISA đƣợc tính thông qua các giá trị đo OD của buffer, các đối chứng dƣơng, âm và của mẫu sau khi đã trừ đi giá trị OD của các giếng substrate (các giai đoạn đầu đƣợc phủ bằng nƣớc cất). OD mẫu = OD đọc đƣợc – OD của giếng substrate Giá trị OD này của mẫu sẽ đƣợc so sánh với một giá trị gọi là ngƣỡng (với ngƣỡng = hai lần giá trị OD trung bình của đối chứng âm) Kết quả: POS – đƣợc đánh giá là nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt xa ngƣỡng NEG – đƣợc đánh giá là không nhiễm bệnh khi giá trị OD của mẫu dƣới ngƣỡng. Ngoài ra, còn có thể đọc kết quả bằng mắt thƣờng thông qua sự tạo màu có thể nhìn thấy đƣợc của substrate bị thủy phân bởi enzyme: Màu vàng tƣơng ứng với kết quả dƣơng tính. Không màu tƣơng ứng với kết quả âm tính. Tuy nhiên phƣơng pháp này độ tin cậy không cao so với việc đọc kết quả bằng máy. 3.3.3.2. Phƣơng pháp RT – PCR Các mẫu có biểu hiện dƣơng tính mạnh với kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn để tiến hành phản ứng RT – PCR. Kỹ thuật RT – PCR đƣợc chia ra làm 2 dạng: RT – PCR một bƣớc (quá trình tạo cNDA và quá trình PCR diễn ra trong cùng 1 phản 33 ứng), RT – PCR hai bƣớc (quá trình tạo cDNA và quá trình PCR diễn ra trong 2 phản ứng riêng biệt).  Ly trích RNA Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA (SV total RNA isolation system). Tuy nhiên ta phải chuẩn bị trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau: Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc có chứa DEPC. Đầu tip, eppendorf phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng Pha RNA lysis buffer Pha RNA wash solution Pha DNA stop solution Tris base pH = 7,5 Ethanol 70 %, 100 % β – mercaptoethanol Các bƣớc tiến hành ly trích RNA 1. Cân khoảng 30 mg mẫu lá có biểu hiện dƣơng tính với phản ứng ELISA, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền. 2. Cho 30 mg mẫu đã nghiền vào eppendorf 1,5 ml có nắp đậy. cho 175 µl RNA lysis buffer (đã bổ sung β – mercaptoethanol) vào eppendorf. 3. Thêm 350 µl RNA dilution buffer, trộn đều và ly tâm với tốc độ 12000 vòng ở 40C trong 10 phút. Hút dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml. 4. Cho 200 µl ethanol 95 % vào eppendorf chứa dịch nổi, trộn bằng pipet 3 – 4 lần. 5. Hút dịch mẫu cho vào Spin Column Assembly (có trong kit). Ly tâm ở tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi Collection tube. 34 6. Cho 600 µl RNA wash solution (đã bổ sung ethanol 95 %) vào Spin Column Assembly. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 7. Pha DNase I dạng bột với 275 µl Nuclease free water 8. Pha 5 µl DNase I + 40 µl yellow core buffer + 5 µl MnCl2. Cho 50 µl dung dịch DNase vào Spin Column Assembly, trộn đều bằng pipet. 9. Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Thêm 200 µl DNase stop solution (đã bổ sung ethanol 95 %). Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. 10. Thêm 600 µl RNA wash solution. Ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 11. Thêm 250 µl RNA wash solution vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 2 phút ở 40C. Loại phần dịch bên dƣới. 12. Chuyển Spin Column Assembly sang Elution tube 1,5 ml ( có trong kit). 13. Thêm 100 µl Nuclease free water vào Spin Column Assembly, ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 1 phút ở 40C. 14. Loại bỏ Spin Column Assembly, trữ Elution tube có chứa RNA ở -700C. Mẫu RNA ly trích đƣợc dùng làm nguyên liệu tiến hành chạy RT – PCR một bƣớc hoặc tổng hợp cDNA để chạy RT – PCR hai bƣớc.  Kiểm tra sản phẩm RNA bằng điện di Lấy mẫu RNA vừa ly trích (có sử dụng DNase I và không có sử dụng DNase I) tiến hành điện di trên gel agarose 1 %. So sánh kết quả đạt đƣợc. 35  RT – PCR một bƣớc Bảng 3.4. Thành phần hóa chất RT – PCR một bƣớc Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl RNA tổng số 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào đủ 25 µl Tổng thể Tích 25 µl (Nguồn: Febbraio và Giugno, 2002) Chu kỳ nhiệt 1 chu kỳ: 480C trong 45 phút 94 0 C trong 2 phút 45 chu kỳ: 94 0 C trong 30 giây 50 0 C trong 1 phút 72 0 C trong 2 phút 1 chu kỳ: 720C trong 10 phút Giữ ở 40C 36 RT – PCR 2 bƣớc: Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA. Quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của bộ kit (Reverse Transcription System). Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA nhƣ sau: Thể tích RNA tổng số tiến hành thí nghiệm là 2, 3, 4, 5 µl Primer sử dụng trong phản ứng tạo cDNA là Oligo(dT)15 primer và radom hexanucleotide primer Bảng 3.5. Thành phần hóa chất tổng hợp cDNA Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA Đối với Oligo(dT)15 primer 42 0 C trong 15 phút 94 0C trong 5 phút Giữ ở 40C Thành phần Thể tích hút MgCl2 (25 mM) 4 µl Reverse Transcription buffer (10X) 2 µl dNTPmix (10 mM) 2 µl Recombinant RNasin ribonuclease inhibitor 0,5 µl AMV Reverse Transcription 1 µl Oligo(dT)15 Primer or Radom primer 4 µl Total RNA 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào cho đủ 20 µl Tổng thể tích 20 µl 37 Đối với radom hexanucleotide primer Ủ nhiệt độ phòng 10 phút 42 0 C trong 15 phút 94 0C trong 5 phút Giữ ở 40C cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc trữ ở -20 0C để chạy PCR sau. Bƣớc 2: Khuếch đại bằng PCR Bảng 3.6. Thành phần hoá chất PCR Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút Green GoTaq flexi buffer 5X 1X 10 µl MgCl2 25 mM 1,5 mM 3 µl dNTP mix 10 mM 0,2 mM 1 µl GoTaq DNA polymerase 5 U/ µl 1,25 U 0,25 µl Primer L1 10 µM 1 µM 5 µl Primer L2 10 µM 1 µM 5 µl cDNA 2 µl Nuclease free water 23,75 µl Tổng thể tích 50 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng 1 chu kỳ 5 phút ở 940C 30 chu kỳ 1 phút ở 940C 1 phút ở 550C 1 phút ở 720C 38 1 chu kỳ 10 phút ở 720C Giữ ở 4oC trong 15 phút Trên đây là protocol chuẩn (J.Morris), nhƣng trong quá trình tiến hành chúng tôi thấy không cho kết quả nên đã có một số thay đổi để tìm ra qui trình phù hợp, một số thay đổi nhƣ sau: Hạ nhiệt độ bắt cặp từ 550C xuống 530C, 520C; 500C Hạ nhiệt độ bắt cặp kết hợp với tăng chu kỳ từ 30 chu kỳ lên 35 chu kỳ; 40 chu kỳ Hạ nhiệt độ bắt cặp, tăng chu kỳ kết hợp với tăng nồng độ mồi từ 1 µM lên 2 µM, 3 µM Tăng nồng độ MgCl2 từ 1,5 mM lên 2 mM; 2,5 mM Tăng nồng độ Taq DNA polymerase từ 1,25 U lên 1,5 U Hạ nhiệt độ bắt cặp xuống 520C, 530C; kết hợp tăng chu kỳ lên 40; tăng nồng độ mồi 2 µM; tăng nồng độ MgCl2 2 mM; tăng nồng độ Taq DNA polymerase 1,5 U. 3.3.3.3. Đổ gel điện di Chuẩn bị gel agarose 1 % 2 %. Agarose đã đƣợc nấu ở 650 W trong 1,5 phút, đổ vào khuôn đã chèn lƣợc để tạo giếng cho gel. Khi gel đông lấy lƣợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 0,5X. Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR. Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và loading dye vào giếng. Chạy điện di: hiệu điện thế 50 V, cƣờng độ dòng điện 250 mA, trong 60 phút. Lấy gel ra, nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (1 %) trong 20 phút. Rửa gel Đọc kết quả bằng máy đọc gel Chụp hình gel để lƣu lại. 39 Kết quả phản ứng PCR dƣơng tính : Có băng 276 bp đối với cặp mồi L1, L2 Có băng 704 bp đối với cặp mồi P28, M6 40 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật ELISA 4.1.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc huyện Chợ Gạo Bảng 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Ninh và xã Hòa Định thuộc huyện Chợ Gạo Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Hòa Định 25 3 12,0 Bình Ninh 38 5 13,16 12,00 13,16 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 HÒA ĐỊNH BÌNH NINH XÃ TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.1. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo 41 Qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV tại huyện Chợ Gạo tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau: Xã Hòa Định 12,0 % Xã Bình Ninh 13,16 % Nhận xét: tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã khảo sát thuộc huyện Chợ Gạo là tƣơng đƣơng nhau. Nhƣ vậy có thể kết luận rằng bệnh TSWV chƣa chỉ phân tán rải rác tại huyện Chợ Gạo, bệnh không tập trung tại một địa điểm nhất định và chƣa phát thành đại dịch tại đây 4.1.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại hai xã thuộc thị xã Gò Công Bảng 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại xã Bình Nhì và xã Thạnh Nhật thuộc thị xã Gò Công Xã Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Bình Nhì 42 6 14,29 Thạnh Nhật 30 3 10,0 10,00 14,29 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 BÌNH NHÌ THẠNH NHẬT XÃ TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.2. Tỉ lệ nhiễm TSWV tại thị xã Gò Công 42 Kết quả trên cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV hai xã khảo sát thuộc thị xã Gò Công cũng tƣơng đối thấp, cụ thể nhƣ sau: Xã Bình Nhì 14,29 % Xã Thạnh Nhật 10,0 % Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV tại xã Bình Nhì cao hơn xã Thạnh Nhật, tuy nhiên sự khác biệt là không đáng kể . Điều này đã nói lên một điều là TSWV cũng xảy ra rải rác tại thị xã Gò Công, bệnh chƣa đủ điều kiện phát triển thành đại dịch ở thời điểm khảo sát. 4.1.3. Tỉ lệ nhiễm bệnh TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Bảng 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV của huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công Địa bàn Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tỉ lệ nhiễm (%) Huyện Chợ Gạo 63 8 12,7 Thị xã Gò Công 72 9 12,5 Tổng 135 17 12,6 12,70 12,50 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 H.CHỢ GẠO TX.GÒ CÔNG ĐỊA BÀN TỈ LỆ (%) Đồ thị 4.3. Tỉ lệ nhiễm TSWV huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công 43 Thông qua kết quả trên ta thấy tỉ lệ nhiễm TSWV ở huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công là ngang nhau. Nhƣ vậy từ kết quả ELISA đã phần nào cho chúng ta biết tình hình nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là không cao, trung bình khoảng 12,6 %. Bệnh TSWV chƣa phát triển thành dịch một phần là do ảnh hƣởng của điều kiện tự nhiên nơi đây buộc ngƣời dân nơi đây xuống giống đồng loạt, ngƣời dân thƣờng xuyên sử dụng thuốc diệt công trùng, ngƣời dân đã biết phủ bạt để hạn chế dịch bệnh, cộng thêm vào đó là ngƣời dân thay đổi các loại cây trồng khác nhau, vệ sinh đồng ruộng nên virus không có cây kí chủ quanh năm, nhƣng không đƣợc chủ quan bởi vì với sự phát tán rộng rãi của virus này là nguy cơ tìm ẩn rất nguy hiểm, có thể bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào nếu không có biện pháp quản lý phù hợp. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo độ tuổi và theo giống rất khó xác định vì: Thời điểm xuống giống tại địa bàn điều tra là đồng loạt nhau Đối với tên giống cây thì ngƣời dân rất ít quan tâm. 4.1.4. Tỉ lệ nhiễm TSWV theo triệu chứng Qua đánh giá khách quan có thể ƣớc tính tỉ lệ nhiễm TSWV tại tỉnh Tiền Giang là khoảng 60 %. So sánh tỉ lệ nhiễm bệnh qua triệu chứng và kết quả ELISA ta thấy có điều bất hợp lý là tỉ lệ nhiễm TSWV qua triệu chứng cao hơn nhiều so vơi kết quả ELISA (cao gấp 2,6 lần). Tuy nhiên không thể chỉ dựa vào điểm này mà kết luận phƣơng pháp ELISA không chính xác, bởi vì nguyên tắc phản ứng ELISA dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể nên có độ đặc hiệu và độ tin cậy rất cao. Từ kết quả trên cho thấy không thể chỉ dựa vào triệu chứng để kết luận tỉ lệ nhiễm bệnh đƣợc. Bởi vì trên cây trồng có rất nhiều bệnh khác nhau, triệu chứng của chúng tƣơng tự nhau, thêm vào đó sự tƣơng tác giữa các bệnh có thể tạo ra những triệu chứng của bệnh khác. Ngoài ra, triệu chứng bệnh dƣới điều kiện môi 44 trƣờng khác nhau thì sẽ biểu hiện thành những triệu chứng khác nhau rất khó nhận biết. 4.2. Kết quả phát hiện TSWV bằng kỹ thuật RT – PCR 4.2.1. Kết quả kiểm tra sản phẩm RNA (a) (b) Hình 4.1. Kết quả điện di RNA tổng số Chú thích: Hình 4.1.a không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Hình 4.1.b có sử dụng DNase I trong quá trình ly trích So sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b ta thấy có sự khác biệt rất lớn giữa sử dụng DNase I và không sử dụng DNase I trong quá trình ly trích. Ở Hình 4.1.a sản phẩm RNA có rất nhiều tạp, tạp này có thể là DNA hoặc RNA của tế bào thực vật hoặc là cả hai bởi vì khi nhuộm trong ethium bromide thì cả DNA và RNA đều có thể phát sáng dƣới tia UV. Ngƣợc lại ở Hình 4.1.b sản phẩm RNA tƣơng đối sạch, có thể là DNase I đã phân giải phần lớn các phân tử DNA nên khi nhuộm với ethium bromide thì không còn đủ số lƣợng để phát sáng dƣới tia UV. Khi so sánh kết quả Hình 4.1.a và Hình 4.1.b thì ta có thể khẳng định: Tạp trong quá trình ly trích RNA (không sử dụng DNase I) phần lớn là DNA tế bào thực vật. Vì khi sử dụng DNase I thì kết quả điện di không thấy xuất hiện tạp. 45 Kết quả ly trích RNA đã không đạt kết quả hoặc do lƣợng RNA quá ít nên không đủ để phát sáng. 4.2.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA 1 2 3 4 Hình 4.2. Kết quả điện di sản phẩm cDNA Chú thích: Giếng 1: thực hiện phản ứng reverse transcription với 2 µl RNA tổng số Giếng 2: thực hiện phản ứng reverse transcription với 3 µl RNA tổng số Giếng 3: thực hiện phản ứng reverse transcription với 4 µl RNA tổng số Giếng 4: thực hiện phản ứng reverse transcription với 5 µl RNA tổng số Kết quả điện di cho thấy khi chạy phản ứng reverse transcription với các thể tích RNA tổng số lần lƣợt 2 µl, 3 µl, 4 µl và 5 µl đều không cho sản phẩm cDNA trên gel điện di. Điều này có thể do lƣợng RNA tổng số ly trích đƣợc quá ít nên khi chạy reverse transcription sản phẩm cDNA tạo ra quá ít nên không phát sáng dƣới tia UV sau khi nhuộm ethium bromide, hoặc cũng có thể là quá trình reverse transcription đã không thành công. 46 4.2.3. Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Chúng tôi đã tiến hành Blast trên NCBI để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi và thu đƣợc kết quả là cả 2 cặp mồi L1, L2 và P28, M6 đều chỉ bắt cặp đặc hiệu với virus TSWV dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds. Length=8897 4.2.4. Kết quả phản ứng RT – PCR 4.2.4.1. Phản ứng RT – PCR hai bƣớc Sau khi thay đổi hầu hết các thông số phản ứng, kết quả chạy RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả dƣơng tính với virus TSWV, chúng tôi đƣa ra nhận định sau: Kết quả ly trích RNA đã không thành công Do quá trình tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành với mồi ngẫu nhiên hay mồi Oligo (dT) nên đôi khi không tạo ra sản phẩm là các đoạn gen cần khuếch đại. Hàm lƣợng RNA tổng số quá thấp đến việc cDNA đƣợc tạo ra rất ít. Trong khi đó chúng ta chỉ sử dụng một lƣợng nhỏ sản phẩm cDNA để chạy PCR nên không cho kết quả dƣơng tính. 4.2.4.2. Phản ứng RT – PCR một bƣớc Sau khi phản ứng RT – PCR hai bƣớc không cho kết quả chúng tôi đã tiến hành chạy thử nghiêm quy trình RT – PCR một bƣớc với cặp mồi L1, L2và đã cho kết quả nhƣ sau: 47 Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT – PCR một bƣớc Chú thích: L: Ladder Từ kết quả trên ta thấy bên cạnh băng sản phẩm (276 bp) có xuất hiện băng sản phẩm phụ khoảng 140 bp. Điều này có thể do: Nồng độ MgCl2 quá cao (2 mM) nên ảnh hƣởng đến độ đặc hiệu của mồi. Nhiệt độ bắt cặp thấp (500C) so với Tm của mồi lần lƣợt là 53,70C và 56,5 0C làm giảm độ đặc hiệu của mồi. Nồng độ Taq polymerase cao (2,5 U) cũng làm tăng mức độ tạp của sản phẩm RT – PCR. Do điều kiện hạn chế của đề tài, ban đầu chúng tôi chỉ chuẩn bị hóa chất để chạy RT – PCR hai bƣớc nên chúng tôi chƣa có đủ điều kiện để tối ƣu, phản ứng RT – PCR một bƣớc chỉ dừng lại mức thử nghiệm. Nhận định chung Sau khi kết hợp kết quả phản ứng ELISA, phản ứng RT – PCR một bƣớc và phản ứng RT – PCR hai bƣớc có thể kết luận có hai nguyên nhân làm phản ứng RT – PCR không ra kết quả: Phản ứng tạo cDNA đã không tạo ra sản phẩm chứa đoạn gen mong muốn. Hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên khi sử dụng lƣợng nhỏ (2 – 5 µl) để tổng hợp cDNA, sau đó lại chỉ dùng 2 µl trong tổng số 20 µl sản phẩm cDNA để chạy PCR. Nhƣ vậy lƣợng cDNA hút đƣợc để tiến hành PCR là rất ít hoặc có thể không có. 276 bp Phần tạp L 48 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Sau khi tiến hành chẩn đoán bệnh TSWV trên cà chua tại huyện Chợ Gạo và thị xã Gò Công thuộc tỉnh Tiền Giang chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Tỉ lệ nhiễm TSWV theo địa bàn điều tra Xã Hòa Định: 12,0 % Xã Bình Ninh: 13,16 % Xã Bình Nhì: 14,29 % Xã Thạnh Nhật: 10,0 % Tỉ lệ nhiễm theo triệu chứng trung bình trong tỉnh là 60,0 % Chƣa xây dựng đƣợc quy trình RT – PCR hai bƣớc chẩn đoán TSWV. Bƣớc đầu tìm ra đƣợc quy trình RT – PCR một bƣớc chẩn đoán bệnh TSWV, tuy nhiên cần tối ƣu một vài thông số để đạt hiệu quả tốt hơn. 5.2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu mức độ gây hại theo giống, theo độ tuổi và theo các thời điểm khác nhau trong năm. Đặc biệt nghiên cứu khả năng lây nhiễm TSWV trên các đối tƣợng khác. Kết hợp sử dụng cây chỉ thị chẩn đoán sớm bệnh TSWV trên đồng ruộng. Tiếp tục xây dựng quy trình RT – PCR hia bƣớc chẩn đoán TSWV. Dù quy trình RT – PCR một bƣớc cho ra sản phẩm nhƣng kết quả vẫn còn tạp. Chúng tôi đề nghị thay đổi các thông số về nhiệt độ, thời gian, số chu kì, hóa chất (Taq polymerase, MgCl2,MgCl2, primer) lƣợng RNA khuôn mẫu…. để kết quả tốt hơn. 49 Đối với phản ứng RT – PCR hai bƣớc để khắc phục trƣờng hợp hàm lƣợng RNA tổng số quá ít nên xây dựng quy trình Nested – PCR. Giải trình tự sản phẩm PCR để khẳng định chắc chắn hơn về kết quả PCR. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Mai Thị Phƣơng Anh, Trần Văn Lài và Trần Khắc Thi, 1996. Rau và trồng rau (giáo trình cao học nông nghiệp). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 254 trang 2. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến, Nguyễn Mạnh Chinh, 2003. Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng (quyển 2: cây thực phẩm). Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 596 trang 3. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2005. Sinh học phân tử (Giới thiệu phương pháp và ứng dụng). Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 238 trang 4. Tạ Thu Cúc, 1999. Kỹ thuật trồng cà chua. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP.Hồ Chí Minh, Việt Nam. 104 trang 5. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử (Khái niệm – Phương pháp – Ứng dụng). Tái bản lần thứ nhất. Nhà xuất bản Giáo dục, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 301 trang 6. Lâm Ngọc Hạnh, 2005. Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng quá trình chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 114 trang 7. Nguyễn Thị Lan, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 219 trang 8. Lê Đình Lƣơng, Quyền Đình Thi, 2004. Kỹ thuật di truyền và ứng dụng. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia, Hà Nội, Việt Nam. 304 trang 51 9. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 103 trang. 10. Nguyễn Đình Trƣờng, 2005. Nghiên cứu hiện trạng nhiễm bệnh TSWV trên cây ớt bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu xây dựng phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR. Khóa luận tốt nghiệp ngành Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 85 trang 11. Khoa Nông Học, trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, 2006. Giáo trình cây rau. 175 trang TÀI LIỆU TIẾNG NƢỚC NGOÀI 12. Craig H. Canaday, 2007. Tomato spotted wilt virus (TSWV) information and control strategies. Dept of Entomology and Plant Pathology, The University of Tennessee, West Tennessee Research and Education Center (WTREC) Jackson, Tennessee. 8 pages 13. Sonya Broughton, Roger Jones and Brenda Coutts, 2004. Management of thrips and tomato spotted wilt virus. Farmnote No. 69/2004. 4 pages 14. M.J. McPherson and S.G. Moller, 2000. PCR. BIOS Scientific Publishers Ltd. Chapter 3/p 23 – 59 15. Paul Maris, 2004. Evaluation of thrips resistance in pepper to control Tomato spotted wilt virus infection. Thesis Wageningen University – with references – with summary in Dutch. ISBN 90 – 8504 – 002 – 7. 120 pages 16. J.Morris, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, Y041 1LZ, UK. Protocol for the diagnosis of quarantine organisms. 35 pages 17. H. D. Shew and G. B. Lucas, 1990. Compendium of Tobacco disease. APS PRESS. 67 pages 18. College of Agricultural & Environmental Sciences, 2005. Tospoviruses In Solanaceae and Other Crops in The Coastal Plain of Georgia. Research report number 704, december, 2005. 40 pages 52 19. Introduction to Antibodies – Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA). 20. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoadSorbent Assay). INTERNET 21. 22. 23. 24. 25. PHỤ LỤC Phụ lục 1 Hình chụp kết quả ELISA Phụ lục 2 Kết quả blast với cặp mồi L1, L2 Distance tree of results Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links AB190813.1 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence 37.4 37.4 34% 3.3 100% AY070218.1 Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 37.4 37.4 34% 3.3 100% D10066.1 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds 37.4 74.7 68% 3.3 100% dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence Length=8917 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4133 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4152 gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds Length=8640 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4100 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4119 dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds Length=8897 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 39 aTCAGTCGAAATGGTCGGCA 58 |||||||||||||||||||| Sbjct 4121 ATCAGTCGAAATGGTCGGCA 4140 Score = 37.4 bits (40), Expect = 3.3 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Minus Query 1 AATTGCCTTGCAACCAATTC 20 |||||||||||||||||||| Sbjct 4396 AATTGCCTTGCAACCAATTC 4377 Phụ lục 3 Kết quả blast với cặp mồi P28, M6 Distance tree of results Accession Description Max score Total score Query coverage E value Max ident Links AY070218.1 Tomato spotted wilt virus RNA- dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds 44.6 44.6 43% 0.020 100% D10066.1 Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds 44.6 81.9 80% 0.020 100% AB198742.1 Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds 39.2 39.2 43% 0.83 95% AB190813.1 Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence 39.2 39.2 43% 0.83 95% gb|AY070218.1| Tomato spotted wilt virus RNA-dependent RNA polymerase (L) gene, complete cds Length=8640 Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 4698 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4675 dbj|D10066.1|TSWLRPOLM Tomato spotted wilt virus L RNA encoding RNA polymerase, complete cds Length=8897 Sort alignments for this subject sequence by: E value Score Percent identity Query start position Subject start position Score = 44.6 bits (48), Expect = 0.020 Identities = 24/24 (100%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||||||||| Sbjct 4723 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 4700 Score = 37.4 bits (40), Expect = 2.9 Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%) Strand=Plus/Plus Query 1 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 20 |||||||||||||||||||| Sbjct 3977 AGAGTGATCCATCGGAAGCC 3996 dbj|AB198742.1| Tomato spotted wilt virus gene for L protein, complete cds Length=8913 Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Plus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4183 GCAATAGAGAGGAATAATTGCTCC 4206 > dbj|AB190813.1| Tomato spotted wilt virus RNA segment L, complete sequence Length=8917 Score = 39.2 bits (42), Expect = 0.83 Identities = 23/24 (95%), Gaps = 0/24 (0%) Strand=Plus/Minus Query 32 GCAATAGAGAGGAATAATCGCTCC 55 |||||||||||||||||| ||||| Sbjct 4734 GCAATAGAGAGGAATAATTGCTCC 4711 Phụ lục 4 Thành phần hóa chất phản ứng RT – PCR một bƣớc đã chọn Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích hút M – MLV buffer 5X 1X 5 µl dNTPmix 10 mM 0,2 mM 0,5 µl Primer 1 10 µM 0,4 µM 1 µl Primer 2 10 µM 0,4 µM 1 µl MgSO4 25 mM 2 mM 2 µl M - MLV reverse transcriptase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl DNA polymerase 5 U/µl 2,5 U 0,5 µl RNA tổng số 2 – 5 µl Nuclease free water Thêm vào đủ 25 µl Tổng thể Tích 25 µl Phụ lục 5 PHIẾU ĐIỀU TRA Mã số ..................................................................................................................... Nơi lấy mẫu ........................................................................................................... Chủ hộ ................................................................................................................... Giống cây .............................................................................................................. Tuổi cây ................................................................................................................ Tình trạng vƣờn .................................................................................................... Cách trồng ............................................................................................................. Độ thuần ................................................................................................................ Diện tích trồng ...................................................................................................... Năng suất .............................................................................................................. Mùa vụ .................................................................................................................. Bệnh có thƣờng xảy ra không ............................................................................... Triệu chứng ...........................................................................................................