Tài liệu Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato spotted wilt virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l.) và cây đậu phộng (arachis hypogaea l.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật elisa và chẩn đoán tobacco mosaic vi: BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
…. ….
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC
VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)
VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY
NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2002-2006
Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
…. ….
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC
VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)
VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY
NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực h...
79 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1424 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus, tomato spotted wilt virus trên cây thuốc lá (nicotiana tabacum l.) và cây đậu phộng (arachis hypogaea l.) tại tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật elisa và chẩn đoán tobacco mosaic vi, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
…. ….
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC
VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)
VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY
NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2002-2006
Sinh viên thực hiện: VĂN NGỌC DUNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
…. ….
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC
VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED
WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum L.)
VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (Arachis hypogaea L.) TẠI TỈNH TÂY
NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT - PCR
Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện
PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN VĂN NGỌC DUNG
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
iii
LỜI CẢM TẠ
Con xin kính dâng lên cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc, người đã sinh thành, dưỡng
dục để con có được ngày hôm nay. Các em đã, đang và sẽ cùng chị chia sẻ những vui
buồn trong cuộc sống.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí
Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo nhiều thuận lợi học tập
cho em trong suốt bốn năm đại học.
Em xin cám ơn Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh -
Trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh cùng các anh chị tại Trung tâm đã tạo
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Vô cùng biết ơn PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt
những kinh nghiệm quý báu cho em để em có thể hoàn tất khóa luận tốt nghiệp.
Trân trọng cám ơn TS. Bùi Minh Trí cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài trường
đã hết lòng truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập.
Xin chân thành cảm ơn chị Hưng, chị Hà, anh Vũ, anh Trường, chị Hạnh, chị
Dương đã sẵn lòng giúp đỡ để em có thể hoàn thành tốt khóa luận này.
Cảm ơn các bạn cùng lớp Công Nghệ Sinh Học K28, niên khóa 2002 – 2006, đã
luôn đồng hành, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện
khóa luận.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 09 năm 2006
Văn Ngọc Dung
iv
TÓM TẮT
VĂN NGỌC DUNG. Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 09/ 2006.
“ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO
MOSAIC VIRUS, TOMATO SPOTTED WILT VIRUS TRÊN CÂY THUỐC LÁ
(NICOTIANA TABACUM L.) VÀ CÂY ĐẬU PHỘNG (ARACHIS HYPOGAEA L.)
TẠI TỈNH TÂY NINH BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ CHẨN ĐOÁN TOBACCO
MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT – PCR”.
Hội đồng hướng dẫn
PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN.
Đề tài được thực hiện tại các huyện Tân Biên, huyện Bến Cầu, huyện Dương Minh
Châu của tỉnh Tây Ninh và Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trường Đại học
Nông lâm TP. Hồ Chí Minh, từ tháng 03/ 2006 đến tháng 08/ 2006.
Nội dung tiến hành:
Tìm hiểu mức độ nhiễm TMV, CMV và TSWV trên cây thuốc lá và đậu
phộng tại tỉnh Tây Ninh.
Thu thập mẫu có triệu chứng nhiễm bệnh tại địa bàn điều tra.
Tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA nhằm xác định mẫu dương tính với
TMV, CMV và TSWV.
Chọn mẫu dương tính với TMV thực hiện RT – PCR, với mục đích xây dựng
quy trình RT – PCR chẩn đoán TMV, nhằm khẳng định lại kết quả ELISA.
Kết quả thu được:
Chưa phát hiện được TSWV trên thuốc lá và đậu phộng tại các huyện thu thập
mẫu ở tỉnh Tây Ninh.
Thuốc lá tại Tây Ninh nhiễm TMV với tỷ lệ khá cao (69,1%). Trong đó,
huyện Tân Biên nhiễm TMV là chủ yếu (69,2%) và ở Bến Cầu là CMV (60,6%).
Kỹ thuật RT – PCR bước đầu đã khuếch đại được đoạn gen đặc trưng của
TMV với kích thước 1000 bp. Điều này đã cho thấy rằng dòng TMV gây bệnh
trên thuốc lá tại Việt Nam đã biến đổi so với các dòng virus khác.
v
MỤC LỤC
PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Mục lục .................................................................................................................. v
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... x
Danh sách các hình ............................................................................................... xi
Danh sách các bảng .............................................................................................. xii
Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xiii
1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
1.2 Mục đích – Yêu cầu ......................................................................................... 2
1.2.1 Mục đích ............................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu ................................................................................................. 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3
2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá ................................................................................ 3
2.1.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 3
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 3
2.1.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 3
2.1.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 3
2.1.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 4
2.1.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 4
2.1.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 4
2.1.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 4
2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 4
2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng ............................................................................ 7
2.2.1 Vị trí phân loại ...................................................................................... 7
2.2.2 Nguồn gốc và phân bố .......................................................................... 7
vi
2.2.3 Đặc điểm di truyền ............................................................................... 7
2.2.4 Đặc điểm hình thái ................................................................................ 8
2.2.5 Đặc điểm trồng trọt ............................................................................... 8
2.2.5.1 Yếu tố khí hậu ........................................................................ 8
2.2.5.2 Yếu tố đất đai .......................................................................... 8
2.2.5.3 Yếu tố sinh vật ........................................................................ 8
2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng ..................................................................... 9
2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra ..................................................... 11
2.3.1 Sơ lược chung về virus gây hại thực vật ............................................ 11
2.3.1.1 Đặc điểm chung .................................................................... 11
2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật ......................................... 11
2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá ................... 12
2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng ............... 13
2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus ...................................................... 14
2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV ............................................. 15
2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV ................................................................... 15
2.4.3 Phân loại TSWV ................................................................................. 15
2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV ....................................................................... 16
2.4.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 16
2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 17
2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV ........................................... 17
2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV ................................................................. 20
2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus ............................................................. 20
2.5.1 Nguồn gốc của TMV .......................................................................... 20
2.5.2 Cấu trúc của virus TMV ..................................................................... 21
2.5.3 Phân loại TMV ................................................................................... 21
2.5.4 Dãy ký chủ của TMV ......................................................................... 21
2.5.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 21
2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 22
2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV ............................................. 22
2.5.8 Khống chế bệnh do TMV ................................................................... 24
vii
2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus .......................................................... 24
2.6.1 Nguồn gốc của CMV .......................................................................... 24
2.6.2 Cấu trúc của virus CMV ..................................................................... 24
2.6.3 Phân loại CMV ................................................................................... 24
2.6.4 Dãy ký chủ của CMV ......................................................................... 25
2.6.5 Con đường truyền bệnh ...................................................................... 25
2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh .................................................................... 26
2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV ............................................. 27
2.6.8 Khống chế bệnh do CMV ................................................................... 27
2.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra ............................................... 29
2.7.1 Phương pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử ............................ 29
2.7.2 Phương pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị ........................................... 29
2.7.3 Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng..................................... 29
2.8 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) .......................................... 30
2.8.1 Nguyên lý ELISA ............................................................................... 30
2.8.2 Phân loại ELISA ................................................................................. 30
2.8.2.1 ELISA trực tiếp .................................................................... 30
2.8.2.2 ELISA gián tiếp .................................................................... 30
2.8.2.3 Sandwich ELISA .................................................................. 31
2.8.3 Các yếu tố ảnh hưởng trong phản ứng ELISA ................................... 31
2.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng ELISA ......................... 31
2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction) ................................................................ 31
2.9.1 Nguyên tắc .......................................................................................... 31
2.9.2 Ưu nhược điểm của phản ứng PCR .................................................... 33
2.10 RT – PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction) ............. 34
2.10.1 Nguyên tắc ........................................................................................ 34
2.10.2 Phương pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA ................. 34
2.11 Một số kỹ thuật PCR khác ........................................................................... 35
2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo ............................................................................. 35
2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR ................................................................ 35
2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends) ................... 35
viii
2.12 Những nghiên cứu trong và ngoài nước bệnh do TMV, CMV, TSWV
gây ra ........................................................................................................... 36
2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 36
2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam ....................................................... 36
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 37
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 37
3.2 Phương pháp lấy mẫu..................................................................................... 37
3.3 Dụng cụ .......................................................................................................... 37
3.4 Phương pháp chẩn đoán TMV, CMV và TSWV bằng dDAS – ELISA ....... 38
3.4.1 Hóa chất .............................................................................................. 38
3.4.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 38
3.4.2.1 Ly trích mẫu ......................................................................... 38
3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA .................................................. 38
3.5 Phương pháp chẩn đoán TMV bằng RT – PCR ............................................ 40
3.5.1 Hóa chất .............................................................................................. 40
3.5.2 Phương pháp thực hiện ....................................................................... 41
3.5.2.1 Ly trích RNA ........................................................................ 41
3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT – PCR ................................................. 42
3.5.2.3 Đổ gel điện di ....................................................................... 43
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 45
4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA ................................................................... 45
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dương Minh Châu
và Bến Cầu ........................................................................................ 45
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại
huyện Tân Biên và Bến Cầu ............................................................. 46
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ...... 47
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu ....... 48
4.1.5 Tỷ lệ chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp
CMV và TMV trên số mẫu thu thập được ........................................ 50
4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát được trên cây thuốc lá ............. 51
4.2 Kết quả RT – PCR ......................................................................................... 55
ix
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 59
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 60
7. PHỤ LỤC .......................................................................................................... 63
x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp : Base pairs
cDNA : complementary DNA
CMV : Cucumber Mosaic Virus
Da : Dalton
DAS – ELISA : Double Antibody Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay
DEPC : Diethyl pyrodicarbonate
DNA : Deoxyribonucleic acic
DNase : Deoxyribonuclease
dNTP : Deoxynucleotide triphosphate
EDTA : Ethylendiaminetetraacid acetic
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Ig : Immunoglobulin
mRNA : Messenger ribonucleic acid
OD : Optical density
p – NPP : p – nitrolphenol phosphate
PBS – T : Phosphate buffer saline with Tween – 20
PCR : Polymerase Chain Reaction
PVP : Polyvinylpyrolydol
RT – PCR : Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction
ssRNA : Single strand RNA
Ta : Annealing temperature
TAE : Tris Acetate Ethylendiaminetetraacid acetic
Taq : Thermus aquaticus
Tm : Melting temperature
TMV : Tobacco Mosaic Virus
TSWV : Tomato Spotted Wilt Virus
UV : Ultra violet
xi
DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH TRANG
Hình 2.1 Nicotiana tabacum L. ......................................................................... 3
Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L. ..................... 6
Hình 2.3 Arachis hypogaea L. ......................................................................... 7
Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L. ................ 10
Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV ....................................................................... 15
Hình 2.6 Bọ trĩ trưởng thành dài 1 mm ........................................................... 17
Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật .............................. 19
Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV ......................................................................... 21
Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật ............................................ 23
Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV ......................................................................... 25
Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật ................................ 28
Hình 4.12 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu ................ 53
Hình 4.13 Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên ............... 54
Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện
Tân Biên ........................................................................................... 56
Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên thuốc lá nhiễm TMV tại huyện
Bến Cầu ............................................................................................ 57
xii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng ...................................... 45
Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với TMV, CMV và TSWV trên số mẫu thuốc lá .... 46
Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá ............................................ 47
Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá ............................................ 48
Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV
và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ................................................... 50
Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát được trên lá ......... 51
xiii
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dương tính, âm tính với CMV, TMV, TSWV .. 46
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ....................... 47
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu ...................... 48
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các
mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV ........................................................... 50
Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng trên lá ............................. 51
1
Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và đậu phộng (Arachis hypogaea L.) là hai
trong số các loại cây trồng công nghiệp khá quan trọng. Chúng không những là mặt
hàng tiêu dùng phục vụ cho đời sống con người mà còn là nguồn thu ngân sách đáng
kể của nhiều quốc gia trên thế giới. Do lợi ích kinh tế đó, nên chúng đã được trồng tại
nhiều nơi trên thế giới và không ngừng được mở rộng diện tích.
Tại Việt Nam, việc trồng thuốc lá và đậu phộng cũng đem lại những giá trị nhất
định, về phương diện sử dụng lẫn phương diện thương mại, đóng góp một phần không
nhỏ vào tổng thu nhập quốc gia. Tuy nhiên, các loại bệnh cây cũng theo đó mà không
ngừng phát triển, tấn công cây trồng, và đã gây ra không ít tổn hại cho việc trồng trọt
và sử dụng, nhất là bệnh do virus gây nên. Hiện nay, với khoa học tiên tiến, sinh học
hiện đại đã phát hiện được trên 650 loài virus gây bệnh cho thực vật.
Tỉnh Tây Ninh có diện tích trồng thuốc lá và đậu phộng khá lớn, sản lượng thu
hoạch hàng năm khá cao và mang lại nhiều lợi nhuận. Nhưng trong những năm gần
đây, việc trồng trọt hai loại cây này đã gặp nhiều tổn thất vì bệnh do virus gây ra.
Trong đó, Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV) và Tomato
Spotted Wilt Virus (TSWV) là ba loại virus mà tác hại của nó vô cùng nghiêm trọng,
dẫn tới giảm năng suất và chất lượng nguyên liệu cây trồng. Một khi bệnh đã phát triển
thành dịch thì rất khó khống chế và có khi phải tiêu hủy tất cả diện tích đã trồng trọt.
Việc làm này sẽ gây nhiều khó khăn và đem lại tổn thất lớn cho người trực tiếp canh
tác cũng như cho kinh tế đất nước.
Chính vì lý do đó mà chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá tình trạng nhiễm
Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus, Tomato Spotted Wilt Virus trên
cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) tại
tỉnh Tây Ninh bằng kỹ thuật ELISA và chẩn đoán Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ
thuật RT - PCR”, nhằm đưa ra phương pháp phát hiện bệnh sớm nhất, từ đó có biện
pháp ngăn chặn kịp thời, với mong muốn giảm bớt được thiệt hại do các virus này gây
2
ra, góp phần ổn định được nguồn thu nhập từ thuốc lá và đậu phộng cho tỉnh Tây Ninh
nói riêng và cả nước nói chung.
1.2 Mục đích Yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Chẩn đoán bệnh Cucumber Mosaic Virus (CMV), Tobacco Mosaic Virus (TMV)
và Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) và
cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) bằng kỹ thuật DAS – ELISA (Double Antibody
Sandwich – Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Phát hiện Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT – PCR (Reverse Transcriptase
– Polymerase Chain Reaction).
1.2.2 Yêu cầu
Lấy mẫu thuốc lá có triệu chứng nhiễm CMV, TMV, TSWV và đậu phộng có
triệu chứng nhiễm TSWV ngoài đồng ruộng, tại các huyện trên địa bàn tỉnh Tây Ninh.
Nắm vững nguyên tắc và các bước tiến hành của kỹ thuật DAS – ELISA và RT –
PCR, sau đó mới tiến hành chẩn đoán.
3
Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây thuốc lá
2.1.1 Vị trí phân loại
Ngành : Angiospermae
Lớp : Dicotyledones
Họ : Solanaceae
Tên khoa học : Nicotiana tabacum L.
Tên tiếng Anh : Tobacco
Tên tiếng Việt : Thuốc lá
2.1.2 Nguồn gốc và phân bố
Cây thuốc lá hoang dại đã có cách đây khoảng bốn ngàn năm, trùng với nền văn
minh của người da đỏ vùng Trung và Nam Mỹ. Hàng ngàn năm trước Công nguyên,
người da đỏ đã trồng thuốc lá trên những vùng đất mênh mông ở Nam Mỹ, Trung Mỹ,
Mexico ở Bắc Mỹ, quần đảo Antille và một số nơi khác. Họ dùng thuốc lá với mục
đích nghi lễ và chữa bệnh.
Năm 1492, trong chuyến thám hiểm tìm ra châu Mỹ, Christophe Columbus đã
phát hiện thấy người bản xứ ở quần đảo Antille hút một loại lá cuốn tròn gọi là
Tabaccos. Không lâu sau đó, thuốc lá đã được phổ biến và gieo trồng khắp thế giới.
Vào những năm 1530 – 1600, cây thuốc lá được các giáo sĩ người Pháp đưa vào
Việt Nam.
2.1.3 Đặc điểm di truyền
Bộ nhiễm sắc thể 2n = 48.
Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 3,9 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể.
Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 3,73 × 109 bp.
2.1.4 Đặc điểm hình thái.
Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm: Rễ cái, rễ nhánh, rễ hấp thụ và rễ bất định.
Rễ thường ăn sâu xuống đất từ 1,5 – 2 m.
Thuốc lá là cây cỏ nhất niên, cây trưởng thành thường cao 1 – 2 m, chỉ phân
nhánh ở ngọn. Trên thân cây có nhiều lóng, được phân cách bởi những đốt.
Hình 2.1 Nicotiana tabacum L.
4
Lá cây thuốc lá rất to, đơn nguyên, hình bầu dục, đầu hơi nhọn, mọc cách,
mềm, có lông dính ở hai mặt. Số lá trên thân chính trung bình từ 20 – 35 lá.
Hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, màu trắng hồng, hồng tươi, dài 1 – 2 cm.
Quả nang, hai ngăn. Mỗi cây có 100 – 150 quả trên một chùm hoa, có những
cây (tùy giống) có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa.
Hạt thuốc lá rất nhỏ, rất cứng, bề mặt vỏ hạt sù sì, nhiều nếp nhăn.
2.1.5 Đặc điểm trồng trọt
2.1.5.1 Yếu tố khí hậu
Thuốc lá là cây ưa sáng trực tiếp.
Cây có thể thích nghi với một phổ khí hậu rộng. Nhiệt độ lý tưởng cho cây
thuốc lá: 25oC – 28oC.
Độ ẩm không khí thích hợp cho cây thuốc lá: 70% 80%.
Độ ẩm đất thích hợp:
Giai đoạn đầu sinh trưởng: 60% 65%.
Giai đoạn sinh trưởng mạnh: 80%.
Giai đoạn già chín của lá: 60%.
2.1.5.2 Yếu tố đất đai
Cây thích hợp với đất nhẹ (đất pha cát hoặc đất cát), tơi xốp, thông thoáng tốt,
thoát nước dễ. Độ pH tốt nhất cho đất trồng thuốc lá ở thời kỳ đầu là pH = 6, hơi
kiềm ở thời kỳ sau là pH từ 7,5 đến 7,9.
Lượng phân bón cơ bản là: N: 40 – 80kg/ ha, P: 30 – 90kg/ ha và K: 50 –
110kg/ ha.
2.1.5.3 Yếu tố sinh vật
Cây dại, cây ký chủ, là thành phần gây hại đến sinh trưởng cây thuốc lá.
Động vật gây hại (trực tiếp, gián tiếp) cho cây thuốc lá ở nước ta có rất nhiều.
Tại miền Bắc Việt Nam, theo kết quả điều tra cho thấy có 40 loài sâu bệnh xuất
hiện và gây hại ở các vùng trồng thuốc lá. Trong đó có 9 loại bệnh do virus, 5 do vi
khuẩn, 12 loại bệnh nấm và 16 loại sâu.
2.1.6 Giá trị kinh tế và sử dụng
5
Lợi nhuận đối với người trồng thuốc lá rất cao. Sản phẩm chính của cây thuốc lá
là sản xuất ra các loại thuốc hút, nhai, ngửi.
Các bộ phận trên cây thuốc lá có tỷ lệ: Lá: 30%, thân: 40%, hạt: 20% và rễ: 10%.
Như thế, đối với các nước có nền công nghiệp chưa phát triển, thì việc sử dụng năng
suất sinh học còn rất thấp vì ngoài lá ra không tận dụng được các bộ phận còn lại để
sản xuất các sản phẩm khác.
Thành phần độc hại trong thuốc lá có nhiều, quá trình nhiệt phân, ngưng tụ trong
khi đốt, cháy (hút) đã tạo ra một số chất, ảnh hưởng sâu sắc đến hóa tính của lá thuốc.
Vì thế, để hạn chế độc hại của thuốc lá đòi hỏi nhà sản xuất thuốc lá phải nỗ lực tìm ra
các biện pháp để giảm bớt các thành phần này.
Người ta tận dụng các loại phế thải thân, lá thuốc lá để sản xuất ra sunfat nicotin,
có tác dụng tốt trong phòng trừ sâu bệnh trên đồng ruộng. Từ thân và lá thuốc lá, giáo
sư R. L. Wain (Anh) đã chiết xuất được sclareol và 13 epi sclareol có tác dụng
phòng trừ được bệnh rỉ sắt trong cây họ đậu.
Sản xuất nước hoa từ hoa thuốc lá, acid nicotinic, acid citric lấy từ cây thuốc lá
nhiều hơn từ 2 – 3 lần trong cam chanh để sử dụng vào công nghiệp thực phẩm. Chiết
xuất được trong hạt thuốc lá 35% 40% dầu sử dụng trong công nghiệp.
Thân cây thuốc lá còn được chế biến thành thức ăn gia súc có giá trị dinh dưỡng
cao, thu được 3 – 3,5 tấn/ ha hoặc thu được 12% 15% protein cao cấp trong cây
thuốc lá để làm thực phẩm. Ngoài ra, các phế thải của thuốc lá trong quá trình chế biến
như vụn, bụi được tận dụng chế biến làm phân hữu cơ khá tốt.
Về mặt nghiên cứu, cây thuốc lá được coi là đối tượng thử nghiệm các nghiên
cứu sinh học. Nicotiana spp. được dùng làm mô hình nghiên cứu in vitro về sự tái sinh
ở thực vật từ năm 1957. Trong những nghiên cứu cổ điển của Skoog và Miller thì
Nicotiana tabacum là đối tượng được chú ý sớm nhất. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô,
về sinh học phân tử đã đạt được nhiều thành công ở cây thuốc lá. Hy vọng trong tương
lai, cây thuốc lá sẽ còn có nhiều công dụng khác để phục vụ cho nhu cầu xã hội.
6
(C)
(A)
(B)
(A): Vườn cây thuốc lá
Hình 2.2 Một số hình ảnh về cây thuốc lá Nicotiana tabacum L.
(D)
(E) (F)
(B): Đặc điểm hình thái
(C), (D), (E), (F): Sự đa dạng về chủng loại và màu sắc
(
7
2.2 Giới thiệu về cây đậu phộng
2.2.1 Vị trí phân loại
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Magnoliopsida
Bộ : Fabales
Họ : Fabaceae
Phân họ : Faboideae
Giống : Aeshynoenaeae
Tên khoa học : Arachis hypogaea L.
Tên tiếng Anh : Peanut, groundnut
Tên tiếng Việt : Đậu phộng, lạc
2.2.2 Nguồn gốc và phân bố
Cây đậu phộng đã có từ khoảng 1500 – 1200 năm trước Công nguyên. Người
Inca trồng đậu phộng như một loại rau tên là “ynchis” dọc theo vùng duyên hải Peru.
Đến 1609, người Tây Ban Nha phát hiện thấy các vùng trồng đậu phộng ở Nam
Mỹ, đặc biệt trên những vùng đảo Tây Ấn, Mexico, vùng biển Đông – Đông Bắc
Braxin, trên những dãi đất ấm áp của vịnh Ria Plata (Argentina, Paragoay, cực Tây
Nam Braxin, Peru), và gọi tên là “mani”.
Có nhiều quan điểm của nhiều tác giả tranh luận về trung tâm khởi thủy chính
xác của loài Arachis hypogaea. Nhìn chung các quan điểm cho rằng Braxin là trung
tâm khởi nguyên của loài Arachis hypogaea, một số tác giả lại cho rằng nơi xuất xứ là
ở Bolivia (Krapovickas, 1968, Cardenas, 1969), vùng thượng lưu sông Plata.
Hiện nay, cây đậu phộng được trồng rộng rãi trên 100 nước từ 40o Bắc đến 40o
Nam thuộc vùng nhiệt đới và các vùng ấm áp trên thế giới. Châu Á đứng hàng đầu thế
giới về diện tích trồng đậu cũng như là sản lượng, tiếp theo là châu Phi, Bắc Mỹ rồi
đến Nam Mỹ.
Trong số 25 nước trồng đậu phộng ở Châu Á, Việt Nam đứng hàng thứ 5, và đậu
phộng đã được trồng khá phổ biến từ xưa đến nay ở nhiều nơi.
2.2.3 Đặc điểm di truyền
Bộ nhiễm sắc thể: 2n = 40.
Hàm lượng DNA trong nhân tế bào: 4,31 × 10-12 gram/ bộ nhiễm sắc thể.
Số cặp base trong bộ nhiễm sắc thể: 4,2 × 109 bp.
Hình 2.3 Arachis hypogaea L.
8
2.2.4 Đặc điểm hình thái
Đậu phộng có rễ cọc phát triển tốt. Rễ dạng bò khoẻ hơn dạng mọc đứng.
Đây là cây cỏ nhỏ, nhất niên, nhánh sà, có lông, chiều cao từ 20 – 40 cm.
Thân chính mọc từ đốt cuối của trụ trên lá mầm, hai lá mầm đối xứng nhau.
Có 4 hoặc 3 lá chét ( chỉ có ở Erectoides), hình dạng lá thay đổi từ thuôn, lưỡi
mác đến elip, elip thuôn dài, có lông bao phủ.
Hoa đậu phộng dạng cánh bướm, màu vàng, cánh rời, cây phát hoa ở nách lá,
các hoa ở gần mặt đất.
Quả hình thành dưới đất, thắt từ 1 – 5 đốt, mỗi đốt chứa 1 hạt với 2 lá mầm và
1 phôi thẳng. Bế quả có quả bì chạm trổ.
Hạt có vỏ lụa mỏng, đỏ, chiều dài 7 – 21 mm, đường kính 5 – 13 mm.
2.2.5 Đặc điểm trồng trọt
2.2.5.1 Yếu tố khí hậu
Cây sinh trưởng cần nhiều ánh sáng mặt trời và thời tiết ấm nóng.
Không mẫn cảm với chiều dài ngày.
Ở những vùng có lượng mưa từ 500 – 1250 mm phân phối đều, cây sẽ cho sản
lượng cao.
Đậu phộng không chịu đông giá và úng nước.
2.2.5.2 Yếu tố đất đai
Đất đai lý tưởng cho đậu phộng là thoát nước nhanh, màu sáng, lỏng, dễ vỡ,
phù sa pha cát có đầy đủ canxi và một lượng chất hữu cơ vừa phải (York và
Codwell, 1951).
Có thể đạt sản lượng cao trên đất hơi chua pH = 6 – 6,4 (Woodrof, 1966).
Cây khá mẫn cảm với đất mặn.
Đậu phộng có nhu cầu về chất dinh dưỡng các loại cao.
2.2.5.3 Yếu tố sinh vật
Có trên 90 loài sâu, 9 giống tuyến trùng gây hại cho đậu phộng trên đồng ruộng.
Ngoài ra cây còn chịu ảnh hưởng của các loại bệnh nấm.
Bên cạnh đó thì cỏ dại tranh với cây về độ ẩm của đất, chất dinh dưỡng, ánh sáng
và còn là ký chủ chuyển giao một số bệnh cây.
Ngoài ra, đậu phộng còn chịu thiệt hại bởi các loài sâu hại lá trong kho như mọt.
9
2.2.6 Giá trị kinh tế và sử dụng
Đậu phộng là cây thực phẩm, cây có dầu quan trọng dùng chế biến thành dầu
thực vật. Trong số các loại cây hạt có dầu trồng hàng năm trên thế giới, đậu phộng
đứng thứ hai sau đậu tương về diện tích trồng cũng như về sản lượng.
Giá trị dinh dưỡng trong 100g đậu phộng gồm có: 22g cacbonhydrat, 50g chất
béo và hàm lượng protein là 24g. 100g đậu phộng cung cấp 590 KCalo.
Các nhà khoa học thuộc Đại học Y Harvard (Mỹ) đã rút ra kết luận: Người
thường xuyên ăn đậu phộng hay bơ lạc sẽ ít có nguy cơ mắc bệnh tiểu đường type 2 so
với những người khác. Ăn 140g đậu phộng hay bơ lạc mỗi tuần sẽ giảm được 27%
nguy cơ mắc bệnh. Điều đó được giải thích là do trong đậu phộng có chứa chất béo
chưa bão hòa giúp cải thiện độ ổn định của insulin đường máu.
Ngoài các chất chống oxy hóa ra thì đậu phộng có chứa nhiều thành phần dinh
dưỡng khác nên nó còn giúp ngăn ngừa bệnh tim nhờ làm giảm lượng cholesterol
trong máu.
Đậu phộng là một trong những cây xuất khẩu thu ngoại tệ của nước ta. Hiện nay,
ngoài những vùng chuyên canh, thì nó đã và đang được trồng khá phổ biến ở nhiều
vùng trong nước. Mặc dù có vai trò quan trọng như vậy, nhưng nghiên cứu cơ bản
cũng như nghiên cứu các ứng dụng về đậu phộng ở nước ta nhìn chung vẫn còn nhiều
hạn chế.
10
(
Hình 2.4 Một số hình ảnh về cây đậu phộng Arachis hypogaea L.
(A) (B)
(C) (D)
(A): Đặc điểm hình thái
(B): Hoa đậu phộng
(C): Cây đậu phộng trưởng thành
(D): Hạt đậu phộng
11
2.3 Một số bệnh trên thực vật do virus gây ra
2.3.1 Sơ lƣợc chung về virus gây hại thực vật
2.3.1.1 Đặc điểm chung
Virus thực vật thuộc loại ký sinh chuyên tính cao độ. Chúng thiếu hệ thống men,
hoàn toàn phụ thuộc vào tế bào sống của cây trồng để phát triển và tích lũy số lượng.
Virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều loài cây và một loài cây có thể nhiễm
một hay nhiều virus.
Chúng không giết chết tế bào mà dùng vật chất của tế bào chủ tạo thành nhiều
virus mới. Cơ thể thực vật kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết.
Virus thực vật không có cấu tạo tế bào, là những nucleoprotein kích thước rất nhỏ
bé, cấu tạo rất đơn giản: Là protein và acid nucleic mà chủ yếu là RNA. Tuy nhiên,
cũng có khoảng 25 loài virus chứa DNA.
Protein gồm nhiều loại acid amin tạo thành: Alanin, glycin, lizin, aginin, acid
asparaginic, acid glutamic, lesin, sistein, prolin, triptophan. Các acid nucleic (RNA
hay DNA) sẽ quyết định bản chất protein của chúng.
Trọng lượng cơ thể của virus rất khác nhau từ 4,6 triệu Da đến 39 triệu Da.
Chúng có nhiều hình dạng khác nhau: Hình gậy, hình cầu, hình sợi, hình tinh
trùng. Một số virus trong những điều kiện nhất định của môi trường có thể tạo thành
các tinh thể.
2.3.1.2 Sự lan truyền bệnh virus thực vật
Đa số virus di chuyển theo bó mạch libe từ trên xuống dưới rồi lại từ dưới lên
trên khi các dòng chất dinh dưỡng được vận chuyển về các cơ quan sinh thực. Virus di
chuyển từ tế bào này sang tế bào khác bằng các cầu nối nguyên sinh hết sức chậm
chạp, di chuyển trong các mô mạch dẫn có tốc độ nhanh hơn.
Các con đường truyền bệnh:
Truyền qua nhân giống vô tính: Ghép cây, ghép chồi, chiết cành, gốc ghép,
cành ghép, cành giâm, nuôi cấy mô thực vật hay nhân giống vô tính từ củ hay
thân cây.
Truyền qua hạt giống hay phấn hoa cây trồng: Có khoảng 100 loài virus có
khả năng này, phần lớn tập trung ở họ bầu bí.
12
Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Trồng cây với mật độ dày, giao tán, lá cọ
sát nhau giữa cây bệnh với cây khỏe. Hay truyền qua vết thương do gió, chăm
sóc, thu hái, gia súc.
Truyền bệnh bằng côn trùng môi giới (nhện, tuyến trùng): Côn trùng là nhóm
môi giới (vectơ) truyền bệnh virus quan trọng nhất và gây thiệt hại kinh tế rất lớn
trên đồng ruộng. Một loại côn trùng thường chỉ là môi giới truyền bệnh cho một
loại virus mà thôi.
Các dạng tồn tại của virus trong cơ thể côn trùng:
Nhóm virus không bền vững là những virus không có khả năng tồn tại trong
cơ thể côn trùng từ vài phút tới 1 giờ. Đó là những virus lây bệnh nhanh chóng
trong khoảng thời gian từ 15 giây tới 30 phút sau khi chích hút ở cây bệnh và có
thể lây ngay.
Nhóm virus bền vững là những virus có thể sống bền vững trong cơ thể côn
trùng một thời gian từ vài giờ tới vài tuần lễ mới có khả năng truyền bệnh cho
cây và có thể truyền bệnh đến suốt đời. Đây là kiểu truyền bệnh theo phương
pháp sinh học.
Nhóm virus bán bền vững là những virus có kiểu truyền bệnh trung gian giữa
hai nhóm trên.
Trong mối quan hệ sinh học giữa virus và côn trùng thì virus rất có lợi: Tăng về
số lượng, tăng cường tính ký sinh gây bệnh và được đưa vào đúng tầng mô mẫn cảm
bệnh. Nhưng côn trùng môi giới sẽ bị giảm tuổi thọ, sức sinh sản và sức sống giảm.
Truyền bệnh nhờ nấm: Đa số các nấm sống trong đất đều có khả năng truyền
bệnh virus cho cây.
Truyền bệnh bằng dây tơ hồng (Cuscuta sp.): Đây là thực vật thượng đẳng ký
sinh tạo rễ ăn sâu vào thân cây sống để hút nhựa. Do vậy, có nhiều loại virus thực
vật di chuyển theo thân dây tơ hồng đi từ cây này sang cây khác để gây bệnh.
2.3.2 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây thuốc lá
Bệnh virus Y khoai tây
Triệu chứng: Rất đa dạng, điển hình nhất là khảm và gân xanh đậm, lá nhăn
nheo, biến dạng, cây bị lùn.
Virus gây bệnh: Potato Virus Y (PVY), thuộc nhóm Potyvirus.
13
Bệnh virus gây vết hằn thuốc lá
Triệu chứng: Bao gồm triệu chứng của TMV, CMV, lá bị khảm và có những
vệt xanh đậm dọc theo gân lá.
Virus gây bệnh: Tobacco Etch Virus (TEV), thuộc nhóm Potyvirus.
Bệnh virus đốm gân thuốc lá
Triệu chứng: Đa dạng tùy theo những dòng thuốc lá khác nhau, lá bị khảm
nhẹ, biến dạng, triệu chứng điển hình là hóa vàng dọc theo gân chính.
Virus gây bệnh: Tobacco Vein Mottling Virus (TVMV), nhóm Potyvirus.
Bệnh virus gây khảm cỏ linh lăng
Triệu chứng: Trên tàn lá xuất hiện dạng khảm có màu vàng trắng hay trắng,
đôi khi mất màu vùng mô giữa các gân lá, thường được xem như là bệnh khảm
calico, các dạng sọc vàng và chết hoại cũng có thể xảy ra. Thông thường, lá
không bị biến dạng, cây có thể hơi lùn và đôi khi trái bị biến dạng.
Virus gây bệnh: Alfalfa Mosaic Virus (AMV).
Bệnh virus cong lá thuốc lá
Triệu chứng: Lá cong và biến dạng, lốm đốm vàng và chết hoại, cây bị lùn.
Virus gây bệnh: Tobacco Leaf Curl Virus (TLCV).
2.3.3 Một số bệnh do các virus khác gây hại trên cây đậu phộng
Bệnh hoại tử chồi (thối ngọn)
Triệu chứng: Lá có các vòng đồng tâm úa vàng hoặc các mảng vàng xanh xen
lẫn nhau, cây thối ngọn, rồi lan sang các phần khác, cây bị ức chế sinh trưởng,
nách lá nảy chồi nhanh, các lá ở chồi nách giảm kích thước, bị vặn, đốm khảm và
úa vàng. Cây bị nhiễm sớm lá xoăn lại và thành dạng bụi.
Virus gây bệnh: Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV).
Bệnh chùn đậu phộng do virus
Triệu chứng: Đầu tiên xuất hiện các vết và đốm tròn úa vàng, sau đó mờ dần,
phiến lá màu xanh đậm với đốm nhạt, cây cằn lại, xanh tối, tạo thành một búi, lá
có đốm khảm, vòng vàng, quả nhỏ, rễ kém phát triển, đen tối, vỏ dễ bong, dễ
nhiễm các vật hại khác.
Virus gây bệnh: Peanut Clump Virus (PCV).
14
Bệnh hoa lá đậu phộng do virus
Triệu chứng: Cụm xanh tối rải rác xen kẽ với các vòng úa vàng xuất hiện ở
các lá non nhất, cây bị nhiễm không có dấu hiệu cằn cỗi.
Virus gây bệnh: Peanut Mottle Virus (PMV), thuộc virus khoai tây nhóm Y.
Bệnh virus đốm nhạt ở cây đậu bò
Triệu chứng: Gân lá trong, lá bị uốn cong, các vết hoại tử hình thành ở lá và
cuống làm rụng lá, cây lùn, quả ít, lá non có từng dải sọc.
Virus gây bệnh: Cowpea Mild Mottle Virus (CMMV).
Bệnh khảm xanh đậu phộng
Triệu chứng: Đốm úa vàng, ở lá chết non gân lá trong, cây bị hại nặng bị lùn.
Virus gây bệnh: Peanut Green Mosaic Virus (PGMV).
Bệnh đốm vàng đậu phộng do virus
Triệu chứng: Lá có khảm xanh rõ rệt.
Virus gây bệnh: Groundnut Chlorotic Spotting Virus (GCSV).
Bệnh khảm vàng
Triệu chứng: Lá non bị nhiễm có các đốm vàng sáng, nhăn nheo, mép lá cuốn
lên phía trên.
Virus gây bệnh: Được truyền bởi bọ phấn trắng Bemisia tabaci.
2.4 Giới thiệu về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV)
2.4.1 Nguồn gốc và sự lan truyền của TSWV
Năm 1915, TSWV được phát hiện lần đầu tiên khi gây thiệt hại lớn trên cà chua
trồng ở Australia. Đến năm 1920, bệnh đã lan tràn trên khắp lãnh thổ Australia và
nhiều vùng trên thế giới.
Năm 1926, TSWV xuất hiện trên cây thơm (dứa) ở Hawaii và phát triển thành
dịch ở California vào năm 1935.
Năm 1938, phát hiện thấy TSWV trên cà chua trồng trong nhà kính tại Ohio.
Vào những năm 1960, TSWV đã gây ra nhiều thiệt hại cho cà chua trồng tại
Hawaii.
Năm 1970, lần đầu tiên, TSWV được xác định là gây bệnh tại Georgia.
Năm 1971, TSWV gây bệnh trên cây đậu phộng ở Texas và hủy hoại nặng nề các
cánh đồng trồng đậu phộng vào năm 1985 – 1986.
15
Năm 1972, TSWV được phát hiện thấy lần đầu tiên tại Louisiana.
Năm 1989, TSWV gây thiệt hại nặng cho thuốc lá, đậu phộng và cà chua ở miền
Nam Georgia.
Trong hai năm 1997 và 1998, tại Florida, ước tính thiệt hại khoảng 40 triệu USD
mỗi năm do TSWV gây bệnh trên đậu phộng trồng tại đây (University of Florida,
2000).
2.4.2 Cấu trúc của virus TSWV
TSWV là virus thuộc họ Bunyaviridae, giống Tospovirus.
Bunyaviridae là một họ lớn gồm những virus được mang bởi động vật chân đốt,
gồm năm giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus.
Trong đó, Tospovirus được đánh giá là một trong mười nhóm virus gây bệnh cây
nghiêm trọng nhất. Virus thuộc họ này có vật liệu di truyền là ssRNA.
Genome của TSWV gồm ba phần: Một sợi RNA âm tính và hai sợi ambisene. Ba
sợi RNA này khác nhau về kích thước và được gọi là Large (L), Middle (M), Short
(S). Mỗi RNA được bao bọc bởi nhiều bản copy của 1 tiểu đơn vị Nucleocapside (N)
và 10 – 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwyk và cộng
sự, 1993). Giữa các đoạn L, M, S có trình tự kết thúc như nhau.
TSWV hình cầu, đường kính 80 – 110 nm (Lindsey Irons and Emily Sims).
2.4.3 Phân loại TSWV
TSWV được phân loại như là đại diện duy nhất của nhóm cây đơn thân (Mathew,
1979). Năm 1989, được phân chia thành 2 dòng: TSWV dòng L và TSWV dòng I.
Những năm 1989 - 1992, 2 dòng này được xác định là có đặc tính huyết thanh học
khác nhau và được đổi tên thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I).
Hình 2.5 Cấu trúc virus TSWV
16
Hiện nay, TSWV được phân loại là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới
trong họ Bunyaviridae. Người ta dựa trên tính huyết thanh và trình tự nucleotide mà
chia ra làm 6 loài:
Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I).
Groundnut Ring Spot Virus GRSV (nhóm huyết thanh II).
Tomato Chlorotic Spot Virus TCSV (nhóm huyết thanh III).
Impatiens Necrotic Spot Virus INSV (nhóm huyết thanh IV).
Groundnut Bud Necrosis Virus GBNV (nhóm huyết thanh V).
Wattermelon Silver Molt Virus WMSMV.
2.4.4 Dãy ký chủ của TSWV
TSWV có phổ ký chủ rất rộng, trên 600 loài và 70 họ thực vật, trải dài trên khắp
các lục địa. Nó bao gồm những cây cảnh như Aster, Vinca, Impatiens, Ranunculus,
Zinna và các cây trồng như Capsicum annuum, Lycopersicon esculentum, Lactuca
sativa và Solanum tuberosum, và Arachis hypogaea. Trong số đó, cỏ dại là nguồn
chứa TSWV chính (Y.Antignus và cộng sự, 1997).
2.4.5 Con đƣờng truyền bệnh
TSWV được truyền từ cây này sang cây khác thông qua nhiều loài bọ trĩ khác
nhau. Có ít nhất 4 loài bọ trĩ: Thrips tabaci Lind, Western Flower Thrips (bọ trĩ hoa)
(Frankliniella occidentalis), Frankliniella schultzei (Trybom), Frankliniella fusca
(Hind). Trong đó, do có sự phân bố rộng rãi nên Western Flower Thrips (Frankliniella
occidentalis) và Onion Thrips (bọ trĩ hành) (Thrips tabaci) là các vectơ chính truyền
bệnh.
Bọ trĩ (Thrips) là những côn trùng có kích thước rất nhỏ (0,5 1mm), khó thấy
bằng mắt thường, thân thon, di chuyển nhanh nhẹn bằng cách nhảy, con trưởng thành
có thể bay. Chúng thường di chuyển với số lượng lớn và bay theo gió tới hàng dặm.
Con trưởng thành màu nâu đen hay đen, ấu trùng màu vàng rơm. Con cái sinh
sản không cần con đực, đẻ trứng vào mô mềm của thân cây, lá hay hoa. Một ổ trứng có
từ 50 – 60 trứng, ấp trứng trong 7 ngày. Sau khi trứng nở, ấu trùng sẽ ăn ngay, trong
khoảng 6 – 7 ngày trước khi bắt đầu chuyển vào giai đoạn “ngủ”. Ấu trùng ăn mô bị
nhiễm khoảng 15 phút, chúng đưa virus vào bên trong cơ thể. Thời gian ăn càng kéo
dài thì khả năng mang virus càng tăng lên. Chỉ ấu trùng mới có khả năng mang virus.
17
Sau đó, chúng không ăn nữa, chui vào đất, sâu khoảng 8 cm, trở thành nhộng, và bắt
đầu “ngủ”. Kết thúc giai đoạn “ngủ”, chúng trở thành bọ trĩ trưởng thành, có cánh và
lên mặt đất. Thời gian để từ trứng trở thành bọ trĩ trưởng thành phụ thuộc vào nhiều
yếu tố: Nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện phát triển.
(
Ấu trùng bọ trĩ chưa lan truyền bệnh cho cây ngay được mà phải chờ đến khi
chúng trưởng thành.
TSWV sản sinh trong bọ trĩ sẽ tốt hơn khi bọ trĩ ở trong ký chủ thực vật của nó.
Có hai lý do để cần thời gian cho bọ trĩ trưởng thành:
Thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, từ miệng vào tuyến nước
bọt, để truyền cho cây khác.
Con non không có cánh nên khả năng di chuyển sang cây khác khó thực hiện
được, vì vậy phải đợi trưởng thành di chuyển dễ dàng hơn.
Mỗi năm có nhiều thế hệ bọ trĩ sinh ra và trưởng thành, nên số lượng của chúng
khá nhiều. Vòng đời trung bình của bọ trĩ vào khoảng 30 ngày.
2.4.6 Điều kiện phát triển bệnh
TSWV thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ dao động từ 20oC đến
37
o
C. Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp gây bất lợi cho bọ trĩ. Nhiệt độ lạnh trong mùa đông
cũng làm giảm đáng kể số lượng bọ trĩ.
TSWV phát triển trong suốt giai đoạn sinh trưởng, sinh dưỡng của cây, giai đoạn
mà virus được bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây khác, từ vùng này sang vùng khác.
Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Khi nhiệt độ xuống thấp, bọ
trĩ mang virus qua đông dưới dạng côn trùng nằm trong đất. Khi xuân tới, thời tiết ấm
áp, bọ trĩ sẽ di chuyển từ cỏ dại sang cây trồng để truyền bệnh. Do đó, TSWV cứ lây
Hình 2.6 Bọ trĩ trƣởng thành dài 1mm
18
nhiễm từ năm này sang năm khác, từ vụ này đến vụ khác từ những loài bọ trĩ ký sinh
trên cây (Ray Cerkauskas, 2004).
2.4.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TSWV
Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, tùy thuộc vào tuổi cây, điều kiện môi
trường, mức độ lây nhiễm, số lượng và thành phần các virus gây hại cho cây ký chủ.
Sự nhiễm bệnh cho cây ký chủ được biểu hiện thấy trên những tế bào biểu bì,
được truyền bệnh thông qua những vết thương do bọ trĩ cắn. Triệu chứng của bệnh sẽ
xuất hiện trong vòng từ 2 đến 4 ngày, hoặc từ 10 ngày đến 6 tuần, có khi lại lâu hơn.
Những cây con có thể bị héo và chết trong vòng 1 tuần kể từ khi nhiễm bệnh.
Cây nhiễm TSWV có triệu chứng chung là xuất hiện các vòng tròn đồng tâm,
những đốm héo trên lá non do sự hoại tử của các mô, có đốm lấm chấm. Đầu tiên
những đốm này có màu vàng, nhưng sau đó những vùng bị chết sẽ chuyển sang màu
nâu đỏ.
Từ cây con đến cây trưởng thành đều có thể bị TSWV tấn công. Khi bị nhiễm
virus, cây trồng bị cằn cỗi, còi cọc, chồi phát triển nghiêng về một bên (ne ngọn). Hình
thái của cây thay đổi: Lá cây nhăn nheo, vặn vẹo, như bóp nát, thân cây bị uốn cong,
ngã, rủ xuống, phát triển bất thường. Cây bị bệnh không phát triển trong nhiều tuần, lá
rụng dần và chết.
Cây trồng bị nhiễm bệnh vào giai đoạn đang phát triển thì có thể không ra quả
hoặc có quả nhưng rất nhỏ, có các đốm nhỏ hay các vòng hoại tử hay thể khảm trên vỏ
quả. Đặc điểm này làm giảm đi giá trị cảm quan khi sử dụng hay dùng thương phẩm.
Tuy nhiên, triệu chứng này có thể giống với các bệnh do các virus khác, vi khuẩn,
nấm hay stress môi trường gây ra. Vì thế cách chẩn đoán bệnh theo triệu chứng bên
ngoài chỉ là cách xác định bệnh nhất thời nên có thể không chính xác.
19
Cây thuốc lá Lá thuốc lá
Lá đậu phộng Cây đậu phộng
Lá cà chua Trái cà chua
Trái ớt
Thân
Hình 2.7 Triệu chứng nhiễm TSWV trên một số thực vật
(
20
2.4.8 Khống chế bệnh do TSWV
Cần phải loại ra và tiêu hủy nhanh chóng những cây có biểu hiện bệnh và
những cây nghi ngờ nhiễm bệnh tiềm ẩn.
Cây con rất dễ bị nhiễm TSWV, do đó nên trồng cây con trong nhà kính hoặc
sử dụng màng che cẩn thận, phun thuốc diệt côn trùng để ngăn ngừa bọ trĩ tấn
công.
Có mật độ trồng phù hợp để tránh sự di chuyển của các loài bọ trĩ từ những
vùng nhiễm bệnh đến.
Sử dụng cây trồng sạch bệnh, cây kháng bệnh.
Hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trên cùng một vùng đất.
Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị ảnh
hưởng của TSWV.
Loại bỏ các loài cỏ dại và cây mọc tự nhiên quanh khu vực trồng trọt.
Bỏ hoang các cánh đồng bị nhiễm sau khoảng 3 – 4 tuần.
Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm để kháng bệnh.
Khống chế bọ trĩ bằng các biện pháp sinh học để có hiệu quả và có lợi nhất,
mà không gây ô nhiễm môi trường.
Sử dụng nhiều loại thuốc trừ sâu khác nhau, đúng liều lượng và thời gian hợp
lý để tiêu diệt được nhiều loài bọ trĩ cùng một lúc và đạt được kết quả tốt nhất.
Thay đổi liên tục các loại thuốc trừ sâu để tránh sự kháng thuốc.
2.5 Giới thiệu về Tobacco Mosaic Virus (TMV)
2.5.1 Nguồn gốc của TMV
Năm 1892, nhà bác học Nga D. I. Ivanopski khi nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc
lá đã phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh”, không phải là vi khuẩn, không nhìn
thấy dưới kính hiển vi quang học mà có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn.
Năm 1898, M. Baijerinck, Đan Mạch, cũng đã phát hiện và xác nhận nguồn gây
bệnh đó mang tên tượng trưng là “virus” có nghĩa là “chất độc”.
Năm 1939, Kaushe Pfankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy
virus khảm thuốc lá TMV. Điều này đã giúp cho việc nghiên cứu và phát hiện nhóm
virus gây hại thực vật phát triển nhanh chóng và thu được nhiều thành tựu to lớn.
TMV là virus thực vật đầu tiên được phát hiện (Võ Thị Thu Oanh, 2002).
21
2.5.2 Cấu trúc của virus TMV
TMV hình que, dạng ống thẳng cứng, không di động, chiều dài 300 nm, đường
kính 18 nm, trọng lượng phân tử 39,4 triệu Da (Caspa, 1963). Lớp vỏ gồm 2134 phân
tử protein, chiếm 95% trọng lượng phân tử, mỗi phân tử protein gắn kết với 3
nucleotide kề cận trên sợi RNA và với các protein khác xung quanh, tạo thành cấu trúc
xoắn từ phải qua quanh phân tử RNA (16,3 phân tử protein cho 1 vòng xoắn). Mỗi
phân tử protein chứa 158 amino acid. Genome của virus là RNA dương tính. RNA
gồm 6401 ribonucleotide, cũng có cấu trúc xoắn tương tự, nằm chính giữa cách 1 bán
kính khoảng 4 nm, nhờ đó mà RNA không bị phân hủy bởi enzyme cellulase của lớp
vỏ protein.
(
2.5.3 Phân loại TMV
TMV thuộc giống Tobamovirus và là một thành viên trong loài virus có cấu trúc
giống xoắn alpha.
2.5.4 Dãy ký chủ của TMV
TMV có dãy ký chủ rộng lớn, 199 loài và 30 họ, nhưng ký chủ tự nhiên lại có
giới hạn, hầu hết thuộc họ Solanaceae: Thuốc lá, cà chua, tiêu, là những cây trồng dễ
bị ảnh hưởng nhất. Chưa có vectơ sinh học nào được tìm thấy.
2.5.5 Con đƣờng truyền bệnh
Hầu hết những côn trùng ăn lá đều có thể truyền TMV, nhưng không có hiệu quả.
TMV có khả năng xâm nhiễm và lây lan rất cao. Bệnh dễ lây lan đến mức chỉ cần có 1
cây bệnh thì có thể lây sang 8 – 10 cây khác.
Hình 2.8 Cấu trúc virus TMV
22
Virus dễ dàng truyền qua các vết thương cơ giới, tiếp xúc cơ học trong quá trình
trồng trọt hay do sự cọ xát vào nhau giữa lá khỏe và lá bị bệnh. Vì vậy, côn trùng
không phải là tác nhân chủ yếu trong việc truyền virus. TMV còn có thể lây sang từ
các sản phẩm như thuốc điếu, thuốc nhai.
Virus chủ yếu tồn tại trong xác cặn bã (thân, rễ cây) vụ trước còn lại trên mặt
luống, đây cũng là nguồn lây bệnh đáng kể, hay có thể từ các cây dại gần khu vực
vườn ươm như: Cà dại và cây thù lù cạnh (Physalis angulata L.), là những cây rất mẫn
cảm với virus này. Nếu trên ruộng đã có một số cây nhiễm virus thì sự lây lan chủ yếu
là do người trồng. Nếu cây con trong vườn ươm đã nhiễm virus thì bệnh sẽ biểu hiện
khoảng 1 tuần sau khi trồng.
2.5.6 Điều kiện phát triển bệnh
Bệnh dễ xảy ra khi cây dư ẩm, mọng nước. Quá trình lây bệnh trên cây trồng diễn
ra chủ yếu vào thời kỳ cây sinh trưởng mạnh. Bệnh lan nhanh vào giai đoạn nhổ cây,
xới xáo, vun luống, bẻ ngọn, bấm chồi.
Ngoài đồng ruộng, TMV có thể tồn tại với số lượng rất lớn trong rễ hoặc thân cây
vụ trước, cho đến khi cây thuốc lá vụ sau được trồng tiếp tục. TMV có trong thân cây
hoặc mảnh vụn thuốc lá sau khi thu hoạch xong, sẽ trở nên mất hoạt tính nếu bị nắng
mưa phân hủy trong vòng từ 5 đến 6 tháng. Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại suốt hơn 2
năm liền trong đất trồng hay các mảnh vụn của thân, rễ nếu các phần này không bị
phân hủy. Ngoài ra, loại đất trồng cũng có ảnh hưởng đến thời gian tồn tại của virus.
2.5.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm TMV
TMV có biểu hiện triệu chứng dạng khảm trên thuốc lá. Lá non bị biến dạng,
cong xuống, có khảm, loang lỗ xanh đậm, xanh nhạt, có chổ biến vàng dọc gân lá.
Triệu chứng này rõ rệt hơn trên lá non và mô non. Khảm không làm chết cây nhưng
nếu bệnh xảy ra cây sẽ bị còi cọc, héo rũ dần. Trong suốt thời gian nhiệt độ không khí
cao (khô, nóng), cường độ chiếu sáng mạnh, những lá bị bệnh có thể chết, hiện tượng
này gọi là “cháy do khảm”. Trường hợp này vùng chết lan rộng trên lá. Những lá bệnh
vặn vẹo, cong queo, kéo dài ra. Trong khi đó, rễ cây bệnh vẫn biểu hiện bình thường.
Triệu chứng bệnh thường biểu hiện sau khi trồng từ 7 đến 10 ngày trở lên. Càng
nhổ cây con bị bệnh càng muộn thì bệnh ngày càng nặng.
23
(E) (F)
(A): Trái cà chua
Hình 2.9 Triệu chứng nhiễm TMV trên thực vật
(B), (C), (D): Cây thuốc lá
(E), (F): Lá thuốc lá
(
(A)
(D)
(B)
(C)
24
2.5.8 Khống chế bệnh do TMV
Luân canh với cây trồng khác, không phải ký chủ của virus gây bệnh.
Tiêu hủy phần còn lại của cây sau thu hoạch.
Vệ sinh trong và ngoài khu vực gieo trồng.
Chọn vườn ươm trên đất mới hoặc đã luân canh từ 3 vụ trở lên.
Sử dụng giống kháng, cây sạch bệnh.
Tỉa bỏ cây bệnh ngay sau khi trồng càng sớm càng tốt.
Tuyệt đối không hút thuốc trong vườn ươm, ruộng trồng.
Khi vào vườn ươm và mỗi 15 – 20 phút làm việc trong luống ươm phải rửa
tay chân và công cụ bằng bột giặt hay bằng dung dịch sửa tươi.
Không được sử dụng vật dụng có liên quan đến thuốc lá nguyên liệu như: Bao
tải đóng kiện, tấm bạt che phủ, sọt đựng lá để che phủ luống ươm và vận chuyển
cây con cũng như lá thuốc tươi.
Áp dụng hiện tượng kháng chéo: Lây nhiễm chủng virus có độc tính thấp lên
cây khỏe nhằm tăng sức chống chịu của cây đối với virus khác có độc tính cao.
Cơ sở khoa học của hiện tượng được giải thích bằng giả thiết: Vỏ protein của
chủng virus lây nhiễm đầu tiên sẽ cản trở tách RNA ra khỏi vỏ protein của virus
sau, do đó ức chế sự nhân lên của virus này.
2.6 Giới thiệu về Cucumber Mosaic Virus (CMV)
2.6.1 Nguồn gốc
Bệnh do CMV được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1916 (Doolittle, 1916), là
một trong số những bệnh cây sớm nhất được biết là do virus gây ra. Sau đó, chúng
xuất hiện ở nhiều nơi khác nhau tại Mỹ, cuối cùng lan tới châu Âu và châu Phi (Price,
1934) và những nơi khác trên thế giới.
2.6.2 Cấu trúc của virus CMV
CMV hình tròn, đường kính 28 nm, trọng lượng phân tử vào khoảng 5,8 triệu đến
6,7 triệu Da, trong đó chứa 18% RNA và 82% protein. Genome của nó là ssRNA, có
kích thước 8621 kb. Genome chia ra làm 3 phần: Phần lớn nhất dài 3389 kb, phần thứ
hai dài 3035 kb và phần thứ ba dài 2197 kb (Gould và Symons, 1977). Tỷ lệ cơ bản
của các nucleotide: G: 24%, A: 23%, C: 23%, U: 30%. Cuối đầu 5’ của RNA có 1 mũ
methylnucleotide và không có poly (A) ở đầu 3’. Genome có cấu trúc giống như tRNA
25
hoạt động, có khả năng nhận tyrosine. Không tìm thấy 1 nucleic acid nào trong virion
mà không thuộc genome virus.
Virion được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của cây ký chủ và trong tế bào chất.
Trong tế bào chất nó có dạng kết tinh (thường là hình thoi, hình lục giác, hình cầu răng
cưa, hay dạng lõm).
(
2.6.3 Phân loại CMV
Cucumber Mosaic Virus thuộc họ Bromovidae. Họ này gồm 5 giống:
Cucumovirus, Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus và Oleavirus. Trong đó, CMV thuộc
giống Cucumovirus.
CMV gồm có nhiều dòng, bao gồm: A – CMV, E – CMV, L – CMV, N – CMV,
P – CMV, Z – CMV và WAI// WAII, nó được chia ra làm 2 nhóm kháng nguyên,
ToRS và DTL (Devergne, 1975).
2.6.4 Dãy ký chủ của CMV
CMV có dãy ký chủ rộng lớn, 191 loài trong 40 họ. Trong số đó, chịu ảnh hưởng
của virus này nhiều nhất là ớt (Capsicum annum L.), cà chua (Lycopersicon
esculentum Mill.) và chuối (Musa L. spp.).
Một số cây trồng ký chủ như: Các loại dưa, cà chua, rau spinach, cần tây, tiêu, cải
xoong, củ cải đường, củ cải, su su, thanh yên, bầu bí, đậu lima, hành tây, cây anh đào,
khoai tây, đại hoàng, cà rốt, thì là, ngò tây (Chupp và Sherf, 1960), mướp (Huang và
cộng sự, 1987), atiso (Chabbouh và Cherif, 1990).
Một số cây cảnh làm ký chủ: Cúc, cây phi yến, phong lữ, lay ơn, cây vòi voi, dạ
lan hương, vạn thọ, bìm bìm, dừa cạn, dã yên thảo, trúc đào, hoa mõm chó và các loại
cây có hoa rực rỡ (Chupp và Sherf, 1960; Agrios, 1978).
Hình 2.10 Cấu trúc virus CMV
26
2.6.5 Con đƣờng truyền bệnh
CMV có thể truyền bằng con đường cơ học nhưng vì không là virus bền vững
như TMV nên không được truyền bởi những người tiếp xúc với cây bệnh.
Virus lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá, có hơn 60 loài, bao gồm: Myzus persicae,
Acrythosiphon pisum và Aphis craccivora. Có 2 loại rệp: Có cánh và không cánh,
nhưng thường là không cánh. Rệp không cánh hình quả trứng màu xanh và đỏ. Khi
thiếu thức ăn, rệp mọc cánh để có thể di chuyển sang nơi khác. Rệp non chịu đói kém
hơn rệp trưởng thành và nhạy cảm với điều kiện bất lợi của môi trường, thuốc hóa học.
Trong quá trình sinh trưởng phát dục rệp non lột xác 3 lần. Trong đó, thành trùng
là vectơ quan trọng nhất. Tuy nhiên, tất cả các giai đoạn ấu trùng của rệp đều có thể
truyền bệnh. Khi chích hút trên lá bệnh, nó thu nhận virus vào vòi hút chỉ trong 5 giây
và truyền sang cây khỏe trong 10 giây. Do truyền theo kiểu virus không bền vững nên
khi chúng vừa chích hút xong trên cây bệnh lập tức bay sang cây khỏe gần đó truyền
bệnh ngay.
Vòng đời trung bình của rệp từ 7 đến 8 ngày, có thể có từ 15 đến 17 vòng đời
trong năm.
CMV còn được truyền thông qua hạt nhưng ở mức độ không ổn định trong 19
loài ký chủ, bao gồm một số cỏ dại, thực vật ký sinh.
2.6.6 Điều kiện phát triển bệnh
CMV sống tốt trong cơ thể rệp không ăn là 8 giờ và trong rệp đang ăn thì ít hơn 4
giờ. Tuy nhiên, rệp mất khả năng mang virus phụ thuộc vào nhiều yếu tố gồm: Nhiệt
độ, loài, hành vi tìm thức ăn của chúng, và thời gian di chuyển từ cây bệnh sang cây
khỏe. Khả năng rệp truyền CMV sẽ giảm đi sau 2 phút và sẽ mất khả năng lây bệnh
sau 2 giờ.
CMV xuất hiện trên thuốc lá trong suốt mùa vụ, đồng thời luôn tìm thấy dạng
khảm trên nhiều cây trồng khác quanh năm. Điều này phần nào giải thích tại sao CMV
tồn tại trên thuốc lá từ năm này sang năm khác.
CMV được giữ trong rễ của các cỏ dại lâu năm, hoa và cây trồng trong suốt mùa
đông và phát triển trở lại vào mùa xuân lúc rệp truyền virus cho những loại cây trồng
nhạy cảm với bệnh.
27
2.6.7 Triệu chứng bệnh trên cây nhiễm CMV
Triệu chứng CMV rất đa dạng tùy theo dòng thuốc lá, lại dễ nhầm lẫn với các
triệu chứng do virus khác gây ra như Tobacco Etch Virus (TEV), Tobacco Mosaic
Virus (TMV). Triệu chứng xuất hiện trên cây bệnh trong khoảng từ 6 đến 8 tuần sau
khi trồng.
Trên lá bệnh xuất hiện đốm vòng vàng nhạt, khảm nhẹ, chết hoại, hình thành lá
mới kéo dài, thùy lá co lại hình sợi, lá bị vặn xoắn, phiến lá bất thường, dày, hơi phồng
rộp (u lồi) dọc theo gân phía mặt dưới lá. Các lá còn non có mép bị uốn cong về phía
dưới, gân chính và các gân phụ nổi rõ, hơi cong queo, thun cuốn lại, thỉnh thoảng có
màu nâu nhạt. Nếu nhiễm nhẹ, các triệu chứng trên chỉ xuất hiện ở các tầng lá phía
trên của cây.
Cây bị bệnh ngả vàng, lùn, khoảng cách giữa các đốt ngắn lại, hoa biến dạng,
thường không cho quả, nếu có thì quả nhỏ, màu nhợt nhạt, lớn chậm.
2.6.8 Khống chế bệnh do CMV
Sử dụng giống kháng bệnh, làm sạch cỏ dại xung quanh ruộng.
Luân canh với cây trồng không là ký chủ của bệnh.
Loại bỏ ngay cây bệnh.
Bấm ngọn, bẻ chồi triệt để sẽ làm mất nguồn thức ăn ưa thích của rệp và loại
bỏ một phần rệp tập trung ở búp chồi, giảm thu hút rệp có cánh bay đến.
Phòng trừ rệp bằng các loại thuốc như: Confider, Oncol, Lanate 0,1% và bằng
con đường sinh học.
Do khả năng sinh sản của rệp rất lớn nên rất dễ xuất hiện rệp kháng thuốc. Vì
thế, sau 3 ngày phun thuốc phải kiểm tra lại, nếu thấy số lượng rệp không giảm
thì phải thay thuốc khác.
28
(A) (B)
(C) (D)
(E)
Hình 2.11 Triệu chứng nhiễm CMV trên một số thực vật
(F)
(A): Trái ớt
(B): Trái dưa leo
(C): Trái cà chua
(D): Cây cà chua
(E): Cây thuốc lá
(F): Rau diếp
(
29
2.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bệnh do virus gây ra
2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử.
Trong tế bào ký chủ, virus thường ở dạng kết tinh vô định hình hoặc có hình dạng
đặc trưng bởi vô số cá thể virus kết hợp với nhau. Các tinh thể này đôi khi rất khó
quan sát thấy. Vì vậy, để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng như mô
thực vật bị nhiễm bệnh, người ta sử dụng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại lớn.
Phương pháp trực tiếp và đơn giản nhất là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ
lá cây bệnh hay đã được làm tinh khiết cố định bằng hóa chất trên lưới đồng để quan
sát dưới kính hiển vi điện tử.
Có thể sử dụng kháng huyết thanh khi dùng phương pháp xem trực tiếp để phân
biệt trong trường hợp nghi ngờ mẫu có lẫn virus khác.
Ngoài ra, người ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và
nhuộm mẫu được cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật
bị nhiễm bệnh được cắt.
2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng cây chỉ thị
Cây chỉ thị thực chất cũng là những cây ký chủ (có thể là cây trồng hay cây dại)
nhưng có triệu chứng bệnh rất điển hình và biểu hiện bệnh nhanh chóng. Phương pháp
chẩn đoán bằng cây chỉ thị là một phương pháp khá chính xác trong nghiên cứu bệnh
virus thực vật.
Cây chỉ thị được chia làm hai nhóm:
Nhóm cây nhiễm bộ phận: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo
sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận
khác của cây.
Nhóm cây nhiễm hệ thống: Là những cây chỉ thị mà khi truyền bệnh nhân tạo
sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây.
2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng
Triệu chứng bệnh là biểu hiện bên ngoài, phản ánh những đặc điểm riêng biệt của
một loại bệnh do một nguyên nhân nào đó gây ra. Do đó, đối với các loại bệnh này,
chẩn đoán theo triệu chứng bệnh là một phương pháp nhanh chóng, khá chính xác. Vì
vậy, có thể căn cứ vào triệu chứng bên ngoài thể hiện những đặc trưng điển hình về
hình thái vết bệnh, màu sắc vết bệnh, vị trí và bộ phận bị bệnh mà chẩn đoán bệnh.
30
Tuy nhiên, trong một số trường hợp cũng dễ dẫn đến những nghi hoặc và nhầm
lẫn, nhất là trong trường hợp chẩn đoán các bệnh có cùng một triệu chứng bên ngoài
tương tự nhau nhưng thực chất lại do các ký sinh vật khác nhau gây ra.
Triệu chứng bệnh tuy có tính chất ổn định nhưng vẫn có thể biến đổi ít nhiều tùy
thuộc vào đặc điểm của giống cây và điều kiện ngoại cảnh.
Do đó, trong những trường hợp phức tạp cần phải tiến hành chẩn đoán bệnh bằng
các phương pháp bổ sung khác.
2.8 ELISA ( Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
2.8.1 Nguyên lý ELISA
Kỹ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng: Kháng nguyên, kháng
thể và cơ chất tạo màu, gồm hai bước:
Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
Phản ứng hóa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phóng oxi nguyên tử và
chính oxi nguyên tử này oxy hóa cơ chất tạo màu. Cơ chất tạo màu thay đổi màu
chứng tỏ sự có mặt của enzyme và chứng minh sự kết hợp kháng nguyên với
kháng thể.
2.8.2 Phân loại ELISA
2.8.2.1 ELISA trực tiếp (Direct ELISA)
ELISA trực tiếp được xem là dạng cơ bản nhất của ELISA. Là phương pháp đánh
dấu kháng thể với huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên. Trong phương pháp này,
kháng thể sơ cấp được đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên.
Phương pháp ELISA trực tiếp thường được dùng để dò lượng kháng nguyên có
trong mẫu bằng cách dùng kháng thể đơn dòng.
2.8.2.2 ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Hệ thống ELISA gián tiếp tương tự như ELISA trực tiếp ở chổ kháng nguyên
được cố định trong pha rắn và sau đó, được gắn kết với kháng thể đặc hiệu được thêm
vào. Tuy nhiên, các kháng thể này không gắn với các enzyme tạo màu như ở ELISA
trực tiếp mà lại được gắn kết bằng kháng thể thứ cấp (có gắn enzyme tạo màu) được
thêm vào sau đó. Các kháng thể thứ cấp này được sản xuất trong cơ thể động vật khác
loài so với động vật sản xuất ra kháng thể sơ cấp. Do đó, nếu kháng thể sơ cấp được
tạo ra từ cơ thể thỏ thì kháng thể thứ cấp sẽ là những Ig kháng thỏ sản xuất trong cơ
31
thể các động vật khác (thường là ngựa). Điều này tạo ra tính linh hoạt trong quá trình
sử dụng.
Phương pháp này sử dụng kháng thể thứ cấp được đánh dấu để phát hiện. Đầu
tiên, kháng thể sơ cấp được gắn với kháng nguyên. Tiếp theo, cho kháng thể thứ cấp
được đánh dấu vào để nhận biết kháng thể sơ cấp. Điều quan trọng là enzyme tạo màu
phải có tính đặc hiệu.
2.8.2.3 Sandwich ELISA
Sandwich ELISA là một xét nghiệm khá nhạy dùng để định lượng hormone,
kháng nguyên gây bệnh truyền nhiễm và cytokine. Dạng ELISA này có thể cần thiết
hơn ELISA trực tiếp và gián tiếp trong một vài trường hợp, đặc biệt là khi lượng mẫu
cần phân tích quá loãng để gắn kết lên đĩa polystyrene (ví dụ như một protein trong
nuôi cấy bề mặt) hoặc không gắn lên đĩa plastic (ví dụ như phân tử hữu cơ nhỏ).
Đây là phương pháp xét nghiệm dựa trên việc đo lượng chất cần phân tích khi
chất đó được gắn giữa hai kháng thể bắt (capture antibody) và kháng thể phát hiện
(detecting antibody).
2.8.3 Các yếu tố ảnh hƣởng trong phản ứng ELISA
Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng.
Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên.
Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên.
Hoạt tính chuyên biệt của kháng thể thứ hai.
2.8.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng ELISA
Đối chứng âm cho kết quả dương tính do bị nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ
kháng thể được đánh dấu hoặc do bản thân đối chứng bị nhiễm.
Đối chứng dương không xuất hiện màu mà mẫu kiểm tra có màu là do đối
chứng quá hạn sử dụng hay điều kiện bảo quản không tốt.
Đối chứng dương và mẫu kiểm tra có màu quá thấp thì cần phải kiểm tra lại
kháng thể được gắn vào enzyme và nồng độ chất tạo màu.
2.9 PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.9.1 Nguyên tắc
DNA polymerase là enzyme có chức năng tổng hợp các sợi đơn DNA. Tất cả các
DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần
32
sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (primer). Mồi là những đoạn DNA ngắn, có
khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài
để hình thành mạch mới.
Thông qua phương pháp PCR, hàng triệu đoạn DNA đồng nhất có thể được thu
thập một cách dễ dàng từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein,
polysaccharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền. Người ta
còn gọi nó là kỹ thuật tạo dòng DNA in vitro.
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ
gồm ba bước:
Bước 1: Biến tính sợi đôi thành sợi đơn (Denaturation)
Phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ
nóng chảy Tm của phân tử, thường là 94oC – 95oC, trong vòng 30 giây – 1 phút.
Bước 2: Giai đoạn lai (Hybridization)
Primer gắn vào 2 sợi đơn DNA ở vị trí chuyên biệt.
Giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer), cho phép
primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc
vào Tm của primer, và kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay giai đoạn kéo dài (Extension)
Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase, vốn là polymerase
chịu nhiệt, hoạt động tổng hợp tốt nhất, thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự
DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm
tăng gấp đôi lượng DNA khuôn mẫu lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân.
Theo tính toán, sau 30 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng mẫu ban đầu.
Theo nguyên tắc, PCR được áp dụng để khuếch đại các DNA có chiều dài từ 200 –
2000 bp.
Tổng số DNA khuếch đại = m × 2n
n : số chu kỳ.
m : số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân ra.
Để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta cần phải có thông tin tối thiểu về
trình tự đó để tạo các primer bổ sung chuyên biệt. Các primer này gồm 1 primer xuôi
33
(forward primer), ký hiệu là F và 1 primer ngược (reverse primer), ký hiệu là R. Từ
“xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi” và “ngược” so với chiều phiên mã của gen.
2.9.2 Ƣu nhƣợc điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm
Độ nhạy rất cao.
Thao tác đơn giản.
Thời gian thực hiện nhanh.
Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.
Định lượng so sánh một sản phẩm thu nhận từ nhiều nguồn gốc khác nhau.
Cho phép khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, dễ bị
phân hủy từng phần như trong các vết máu để lâu ngày, hóa thạch, tóc, móng tay
người đã chết.
Có thể giúp nhận biết được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn hay đột biến
điểm.
Hạn chế
Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu
tiên.
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với
những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1,5 kb cho
kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác
định qua thực nghiệm.
Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng
khuếch đại bản sao của phương pháp này.
Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của những lần
thao tác trước. Việc mở nắp các eppendorf sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng
không gian kín, như phòng thí nghiệm, sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại
thoát ra khỏi eppendorf bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị,
dụng cụ rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn
đề này bằng một số biện pháp sau:
Các công đoạn thao tác khác nhau phải được tiến hành ở những địa điểm cách
xa nhau.
34
Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không được sử dụng vào
các thao tác khác để tránh sự nhiễm.
Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phần tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.
Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ,
tính toán sao cho đủ với các lần thao tác.
Các hãng sản xuất đưa ra thị trường nhiều hệ thống có thể loại bỏ hoàn toàn
sự ngoại nhiễm. Tuy nhiên bất lợi là giá thành cao.
Các sai sót gây ra do Taq polymerase.
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (1000 nucleotide thì
enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không quan trọng nếu chỉ cần xem xét kích
thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác
định chính xác trình tự nucleotide của DNA.
Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt. Ví dụ:
Đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của
nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình
tự chính xác.
2.10 RT – PCR ( Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)
2.10.1 Nguyên tắc
Phương pháp RT – PCR dùng để nhân hay khuếch đại DNA bổ sung nhờ enzyme
“Reverse transcriptase”. RNA được chuyển mã ngược thành cDNA nhờ enzym phiên
mã ngược. cDNA được khuếch đại nhờ Taq polymerase.
Sử dụng hai primer có tính chuyên tính đối với gen, một cDNA có chuỗi trình tự
đã được biết rõ, người ta cho khuếch đại trong PCR. Tuy nhiên, cái khó là làm sao
phân lập những bản sao của cDNA toàn bộ chiều dài, vì cơ sở thông tin về chuỗi mã
của phân tử mRNA cũng rất hạn chế. Chuỗi mã chưa được biết này nằm kề một đoạn
nhỏ của chuỗi mã đã biết rõ, chuỗi mã chưa được biết không thể được khuếch đại bằng
phương pháp PCR thông thường.
2.10.2 Phƣơng pháp thực hiện trong phản ứng tổng hợp cDNA
Trường hợp 1: Đối với các loại virus có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp cDNA
có thể được thực hiện dựa vào các loại primer: oligo(dT), primer chuyên biệt cho
gen cần khuếch đại và cuối cùng là primer ngẫu nhiên – các đoạn gồm 6
35
nucleotide. Đoạn oligo(dT) dùng mRNA làm dây nền để tổng hợp cDNA dây
đơn. Kết quả là cuối dây cDNA tạo thành móc hình cong. Khi mRNA được xử lý
với NaOH, móc cong này trở thành primer cho DNA polymerase I, hoàn thành
việc cặp dây đôi DNA. Móc cong này được cắt bởi S1 nuclease.
Trường hợp 2: Đối với các loại virus không có đuôi poly(A) thì sự tổng hợp
cDNA chỉ dựa vào các primer chuyên biệt.
2.11 Một số kỹ thuật PCR khác
2.11.1 Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR)
Kỹ thuật này dùng phân lập các phần nằm trước hoặc sau một đoạn DNA đã biết,
từ đó phân tích được chuỗi nucleotide nằm trước hoặc sau của một gen. Kỹ thuật này
gồm các giai đoạn sau:
Cắt DNA bằng enzyme giới hạn.
Các đoạn DNA được nối lại thành dạng vòng và sử dụng như DNA khuôn cho
phản ứng PCR với hai mồi đặc hiệu xuất phát từ phần DNA đã biết.
Như vậy kỹ thuật này được sử dụng để xác định promoter hoặc các đoạn
nucleotide làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen.
2.11.2 Kỹ thuật NESTED – PCR
Nguyên tắc của kỹ thuật này tương tự như kỹ thuật PCR bình thường. Sản phẩm
DNA của phản ứng PCR thứ nhất (với cặp primer thứ nhất) được dùng làm khuôn cho
phản ứng PCR thứ hai (dùng cặp primer thứ hai) với khoảng cách giữa hai primer lần
sau ngắn hơn lần trước. Làm như vậy nhằm tăng tính đặc hiệu, tính chính xác cho sản
phẩm cần khuếch đại và sản lượng thu được cũng nhiều hơn.
2.11.3 Kỹ thuật RACE (Rapia Amplification of cDNA Ends)
Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’ (5’RACE) và 3’ (3’RACE) của trình tự cDNA.
Kỹ thuật thực hiện với đầu 5’:
Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua phiên mã ngược từ phân tử mRNA bằng
mồi RT (có gắn Phospho ở đầu 5’) đặc hiệu.
Phân hủy RNA ở thể lai DNA – RNA bằng RNase H.
Tạo vòng (circularization) sợi đơn cDNA hoặc tạo chuỗi (concatemers)
bằng RNA ligase.
Khuếch đại DNA bằng NESTED – PCR.
36
Kỹ thuật thực hiện đối với đầu 3’:
Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất qua sự phiên mã ngược với adaptor dT ở đầu
3’ của mRNA.
Thực hiện PCR gen bằng mồi đặc hiệu và primer adaptor dT có ba vị trí
cắt giới hạn (dT – 3 sites adaptor primer) (Kpn I, Xba I, BamH I).
Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn thích hợp (Kpn I hoặc Xba I
hoặc BamH I).
Tạo dòng đoạn DNA nhận được (sau khi cắt) ở vectơ thích hợp và xác
định trình tự.
2.13 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc bệnh do TMV, CMV, TSWV gây ra
2.13.1 Những nghiên cứu trên thế giới
Năm 1996, Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker đã chuyển gen
N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen.
Năm 1998, Ki Huyn Ryu, Chung Ho Kim và Peter Palukaitis đã chứng minh rằng
protein vỏ của CMV quy định dãy ký chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì.
Năm 2001, R. T. Folkertsma, R. W. Goldbach và J. Hille đã mô tả gen SW – 5
của Lycopersicon pervuvianum tạo ra tính kháng TSWV.
Năm 2002, Luciana Tavella và cộng sự đã tiến hành việc xác định TSWV trong
vector dẫn truyền là Frankliniella occidentalis.
2.13.2 Những nghiên cứu tại Việt Nam
Một vài nghiên cứu tại trường Đại học Nông lâm TP Hồ Chí Minh trong những
năm gần đây:
Năm 2003, Nguyễn Ngọc Bích đã nghiên cứu một số bệnh do virus trên thuốc lá
tại tỉnh Tây Ninh bằng phương pháp ELISA. Kết quả cho thấy: Tại thời điểm điều tra,
CMV, TMV, TSWV đang phát triển khá mạnh ở vùng này.
Năm 2005, Nguyễn Đình Trường chẩn đoán thấy trên cây ớt (Capsicum annum
L.) ở ngoại thành TP. Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận có nhiễm TSWV, nhưng
chưa phát triển mạnh.
Năm 2005, Lâm Ngọc Hạnh sau khi đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus trên cà
chua (Solanum lycopersicum) đã có kết luận: Tại Lâm Đồng, cà chua nhiễm CMV là
chủ yếu, TSWV chưa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm điều tra.
37
Phần 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 03 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006.
Địa điểm lấy mẫu: Xã Trà Vong – Huyện Tân Biên – Tỉnh Tây Ninh.
Xã Tân Thuận – Huyện Bến Cầu – Tỉnh Tây Ninh.
Xã Lộc Ninh – Huyện Dương Minh Châu – Tỉnh Tây Ninh.
Tiến hành chẩn đoán CMV, TMV và TSWV tại Trung tâm Phân tích Thí
nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu
Công tác điều tra được tiến hành như sau:
Liên hệ với các hộ dân trồng thuốc lá và đậu phộng tại tỉnh Tây Ninh, thực hiện
điều tra theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu: Đặc điểm vườn trồng,
chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh.
Khâu lấy mẫu được thực hiện như sau:
Lấy mẫu theo phương pháp năm điểm trên hai đường chéo góc. Lấy phần
ngọn cây bị xoăn đọt, lá bị khảm, có triệu chứng của bệnh do TMV, CMV và
TSWV gây ra. Tùy theo diện tích vườn có thể lấy từ 5 tới 10 mẫu, cho vào bọc
nylon, có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ vườn, loại cây, tuổi cây,
triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu được cho vào thùng xốp và được giữ lạnh
cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu.
Mẫu được đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện được giữ lạnh và bảo
quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích.
3.3 Dụng cụ
Cối, chày sứ nghiền mẫu, kéo cắt mẫu, cân phân tích, micropipette P10, P100,
P1000, eppendorf, đầu tip, tủ định ôn, tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ sấy, máy ly tâm, đĩa
ELISA (mỗi đĩa 96 giếng), máy rửa ELISA, máy đọc ELISA, máy PCR, bồn điện di,
bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp gel.
38
3.4 Phƣơng pháp chẩn đoán CMV, TMV và TSWV bằng dDAS – ELISA (direct
Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
3.4.1 Hóa chất
Bộ kit ELISA cho CMV, TMV và TSWV do công ty BioRad cung cấp gồm:
Extraction buffer (dung dịch đệm trích mẫu).
Coating buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể).
Conjugate buffer X1 (dung dịch đệm pha kháng thể có gắn enzyme)
Substrate buffer X1 (dung dịch đệm pha cơ chất).
Kháng thể đơn dòng.
Kháng thể gắn enzyme.
Chất chỉ thị màu p – Nitrophenyl phosphate (p – NPP).
Dung dịch đệm rửa (PBS – T).
Đối chứng dương (Positive control).
Đối chứng âm (Negative control).
3.4.2 Phƣơng pháp thực hiện
3.4.2.1 Ly trích mẫu
Mẫu lấy về được trữ ở -20oC. Cân 0,5 gam mẫu lá cho vào cối, thêm 2,5 ml dịch
trích mẫu, nghiền thật nát vụn thành dạng dung dịch. Sau đó, cho mẫu nghiền vào
eppendoff 1,5 ml gần đầy, ghi ký hiệu mẫu.
Ly tâm 5000 vòng/ phút trong 3 phút, ở 4oC. Dùng micropipette P1000 hút phần
dịch nổi sang eppendorf 1,5 ml mới, ghi ký hiệu mẫu (loại bỏ cặn lắng). Giữ ở 4oC để
thực hiện ELISA trong vòng 24 giờ.
3.4.2.2 Thực hiện phản ứng ELISA
Bước 1: Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí. Mỗi đĩa 2 đối chứng âm và 2 đối chứng
dương.
Bước 2: Pha loãng kháng thể trong dung dịch đệm (coating buffer), theo tỷ lệ
có sẵn trong kit. Trên mỗi đĩa sử dụng 60 giếng, mỗi giếng hút vào 100 µl, chạy
trên 5 đĩa. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại và đặt vào tủ ủ ở 37oC, trong
2 giờ.
Bước 3: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa
ELISA.
39
Bước 4: Mỗi đối chứng âm và dương được hòa tan với 1 ml nước cất. Hút
nước cất, 100 µl mỗi giếng, cho vào cột đầu tiên (số 1) (Substrate). Hút 100 µl
đối chứng dương vào mỗi giếng, vào 2 ô PC (Positive control). Hút 100 µl đối
chứng âm vào mỗi giếng, vào 2 ô NC (Negative control). Hút 100 µl dung dịch
trích mẫu vào mỗi giếng, tổng cộng 135 mẫu, cho vào 5 đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi
mẫu 2 giếng. Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa lại. Ủ qua đêm ở 4oC.
Bước 5: Rửa 3 lần với PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa ELISA.
Bước 6: Pha kháng thể có gắn enzyme vào dung dịch đệm tương tự như pha
kháng thể bước 2. Hút 100 µl nước cất vào mỗi giếng, cho vào cột số 1. Hút 100
μl dung dịch kháng thể có gắn enzyme vào mỗi giếng từ cột số 2 đến cột số 11.
Dùng băng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ ở 37oC trong 2 giờ.
Bước 7: Rửa 3 lần với dung dịch rửa PBS T, mỗi lần 3 phút bằng máy rửa
ELISA.
Bước 8: Hòa tan p - NPP trong dung dịch đệm Subtrate để đạt nồng độ cuối là
1mg/ ml của p - NPP.
Cách pha: Nghiền nát thành bột mịn 7 viên p- NPP (mỗi viên 5 mg), cho
vào 35 ml dung dịch đệm Subtrate (không màu), chờ 5 phút để p - NPP tan hoàn
toàn trong dung dịch đệm. Hút 100 µl cho vào mỗi giếng, dán băng keo lại. Ủ ở
37
oC trong 30 phút.
Bước 9: Đọc kết quả bằng máy đọc OD với bước sóng 450 nm, tại các thời
điểm 30 phút, 1 giờ, 2 giờ sau khi ủ với chất tạo màu.
OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate).
OD mẫu so với ngưỡng (ngưỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm).
POS: Kết quả dương tính - nhiễm bệnh khi OD của mẫu vượt quá ngưỡng.
NEG: Kết quả âm tính - không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dưới ngưỡng.
Bên cạnh đó kết quả cũng có thể được đánh giá bằng mắt thường thông qua sự
đổi màu của các giếng:
Những giếng xuất hiện màu vàng: Giếng chứa mẫu bị nhiễm bệnh.
Những giếng không màu: Giếng chứa mẫu không bị nhiễm bệnh.
40
Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên đĩa ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25
C Substract BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25
D Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26
E Substract PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26
F Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27
G Substract NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27
H
Chú thích: Substract: Nước cất.
BF: Dịch trích, PC: Đối chứng dương, NC: Đối chứng âm.
Vùng load mẫu (số từ 1 đến 27)
3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán TMV bằng RT PCR (Reverse Transcriptase
Polymerase Chain Reaction)
3.5.1 Hóa chất
Hóa chất ly trích RNA:
Lysis solution (dịch trích mẫu).
Low stringency wash solution (dịch rửa nhẹ).
High stringency wash solution (dịch rửa nặng).
Elution solution (dịch hòa tan RNA).
DNase I dạng bột.
Dịch pha loãng DNase I.
Polyvinylpyrolidone – 40 (PVP) 2%.
Các hóa chất để thưc hiện phản ứng RT - PCR:
Kit tổng hợp cDNA do BioRad cung cấp.
Dung dịch đệm PCR (10 X PCR buffer).
iTaq DNA polymerase 5U/ µl.
Hỗn hợp dNTP 10 mM.
MgCl2 50 mM.
cDNA được tổng hợp ở trên.
41
Primer (F và R).
Agarose.
Loading dye 6X (thuốc nhuộm).
Thang chuẩn (ladder) 1000 bp (BioRad).
TAE 1X.
Nước không chứa nuclease (Nuclease free water).
3.5.2 Phƣơng pháp thực hiện
3.5.2.1 Ly trích RNA
Bước 1: Cân khoảng 60 mg mẫu đã qua chẩn đoán ELISA cho kết quả dương
tính, cắt nhỏ mẫu (<5 mm). Cho mẫu vào cối (đã qua xử lý với NaOH, EDTA,
rửa bằng nước cất, bọc giấy bạc, đem hấp khử trùng ở 121oC trong 20 phút, sấy
khô 1 ngày đêm), nghiền mẫu thành bột mịn với nitơ lỏng.
Bước 2: Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube ly tâm 2 ml có nắp đậy (không có
RNase). Hòa tan mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) bổ sung PVP 2%
(gồm 14 μl PVP 2% + 700 μl dung dịch ly giải cho mỗi mẫu).
Bước 3: Thêm 700 μl dung dịch ly giải đã được trộn ở trên vào tube 2 ml chứa
mẫu, trộn mẫu bằng pipet khoảng 10 lần (hút lên xuống để phá vỡ mẫu).
Bước 4: Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút, chuyển toàn bộ dịch nổi vào tube ly
tâm 2 ml mới có nắp đậy.
Bước 5: Thêm 700 μl ethanol 70%, hòa tan bằng pipet cho đến khi dịch không
còn phân lớp.
Bước 6: Ủ ấm dung dịch hòa tan (elution solution) trong bồn ủ (water bath) ở
70
oC (chuẩn bị cho bước 15). Đặt RNA binding column (RNA bc) vào tube 2 ml
không nắp.
Bước 7: Cho 700 μl dung dịch ở bước 5 vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng trong
60 giây (ở 4oC), loại bỏ dịch lọc trong ống rửa và đặt RNAbc trở lại. Cho dịch
còn lại vào cột, ly tâm 60 giây. Làm tiếp cho đến khi hết dịch.
Bước 8: Dịch rửa low stringency (20 ml) từ 5X pha loãng bằng 80 ml ethanol
95% 100% xuống còn 1X.
Bước 9: Cho 700 μl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000 vòng
trong 30 giây ở 4oC, loại bỏ dịch lọc.
42
Bước 10: Pha DNase I (đang ở dạng bột mịn) với 250 μl Tris 10mM
7,5pH
. Hòa tan bằng pipet (trộn nhẹ).
Bước 11: Trộn 5 μl DNase I với 75 μl dung dịch DNase delution trong tube
1,5 ml. Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNAbc. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 15
phút, ly tâm 12000 vòng trong 30 giây. Loại bỏ dịch lọc (phần dịch bên dưới).
Bước 12: Cho 700 μl dung dịch high stringency vào RNAbc, ly tâm 12000
vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc.
Bước 13: Cho 700 µl dung dịch low stringency vào RNAbc, ly tâm 12000
vòng trong 30 giây ở 4oC. Loại bỏ dịch lọc.
Bước 14: Ly tâm thêm 12000 vòng trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn dịch rửa.
Bước 15: Chuyển RNAbc vào tube 1,5 ml có nắp, cho vào 80 μl dung dịch
rửa trôi (elution solution) ở bước 6, để 1 phút cho dung dịch thấm, ly tâm 12000
vòng trong 2 phút ở 4oC để thu RNA tổng số. Bảo quản ở 4oC hay sử dụng ngay
cho RT – PCR.
3.5.2.2 Khuếch đại bằng RT PCR
RT PCR 2 bước:
Bước 1: Tổng hợp cDNA
Thành phần hóa chất:
5X iScript Reaction Mix 4 μl
iScript Reverse Transcriptase 1 μl
Nuclease free water 13 μl
RNA tổng số 2 μl
Tổng thể tích 20 μl
Thay đổi lần lượt RNA tổng số chạy thí nghiệm: 2 μl, 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl.
Chu trình nhiệt:
5 phút 25oC
40 phút 42oC
5 phút 85oC
Giữ ở 4oC
43
Bước 2: Khuếch đại bằng PCR
Sử dụng cặp primer có trình tự như sau:
Forward primer: Tm = 64
o
C
5’-CCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGG-3’
Reverse primer: Tm = 64
o
C
5’-CCCTCGCTTTATTACGTGCCTGCG-3’
Thành phần hóa chất:
Thể tích Nồng độ cuối
iTaq buffer 10X 5 μl 1 X
MgCl2 2,5 μl 2,5 mM
dNTP 1μl 200 µM
iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl
primer F 1 µl 0,4 μM
primer R 1 µl 0,4 μM
Nuclease free water 34 µl
cDNA 5µl
Tổng thể tích 50 μl
Chu trình nhiệt:
1 chu kỳ 3 phút ở 94oC
35 chu kỳ 1 phút ở 94oC
1 phút ở 57oC
1 phút 15 giây ở 72oC
1 chu kỳ 7 phút ở 72oC
Giữ ở 4oC trong 10 phút.
3.5.2.3 Đổ gel điện di
Chuẩn bị gel agarose 1% 2%.
Agarose đã được nấu chín đến 50oC – 60oC, 650W trong 2 phút, đổ vào khuôn
và chèn lược vào để tạo gel.
Lấy luợc ra, ngâm gel trong dung dịch TAE 1X.
Hút 2 μl loading dye trộn đều với 4 μl mẫu PCR.
44
Bơm cẩn thận 6 μl hỗn hợp mẫu và thuốc nhuộm vào giếng.
Chạy điện di: Hiệu điện thế 50 V, cường độ dòng điện 245 mA, trong 60 phút.
Lấy gel ra, ngâm trong ethidium bromide (1%) trong 20 phút.
Rửa gel.
Đọc kết quả dưới tia UV.
Chụp hình gel để lưu lại.
Đọc kết quả phản ứng PCR:
Dương tính khi có đoạn 921 bp, âm tính khi không có đoạn 921 bp.
45
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA
4.1.1 Tỷ lệ nhiễm TSWV trên đậu phộng tại huyện Dƣơng Minh Châu và Bến
Cầu
Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV trên đậu phộng
Huyện Số mẫu (+) Tổng số mẫu Tỷ lệ nhiễm (%)
Dương Minh Châu 0 35 0
Bến Cầu 0 30 0
Chú thích: (+): Dương tính
Kết quả trên cho thấy tất cả các mẫu đậu phộng thu thập được đều không có biểu
hiện dương tính với TSWV (0%).
Đậu phộng trồng tại 2 huyện này có triệu chứng biểu hiện giống như triệu chứng
bệnh do TSWV gây ra nhưng không phát hiện được dương tính khi chẩn đoán bằng kỹ
thuật ELISA. Điều này, có thể giải thích là do bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường.
Qua người dân, chúng tôi biết rằng, nước tưới tiêu tại địa bàn điều tra được lấy từ
những giếng đào sâu trong lòng đất, tận dụng mạch nước ngầm là chủ yếu. Thời điểm
tiến hành điều tra, thu thập mẫu nhằm vào những tháng tỉnh Tây Ninh đang là mùa
khô, thời tiết khá nóng, nắng gay gắt, giếng đào dần cạn nước, đất trồng khô, nứt nẻ,
và việc thiếu nước tưới đã xảy ra, nhưng vẫn chưa có biện pháp khắc phục.
Đậu phộng trồng tại đây bị thiếu nước lâu ngày nên hình thái cây bị biến đổi: Lá
vàng, thân cây rủ xuống. Nắng khá gay gắt và nóng làm cháy lá, đốm lá, gây héo lá,
giống như bị hoại tử và lá rụng dần. Các triệu chứng này đã dẫn tới việc lầm tưởng cây
đã nhiễm TSWV.
Kết quả này còn chứng tỏ một điều là không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng
bên ngoài mà xác định bệnh.
Bên cạnh đó, cũng có khả năng là thật sự TSWV chưa nhiễm trên đậu phộng ở
huyện Dương Minh Châu và Bến Cầu vào thời điểm thu thập mẫu.
46
4.1.2 Tỷ lệ nhiễm CMV, TMV và TSWV trên thuốc lá thu thập tại huyện Tân
Biên và Bến Cầu
Thể hiện qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.1.
Bảng 4.2 Kết quả ELISA đối với CMV, TMV, TSWV trên thuốc lá
Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Số mẫu (-) Tổng số mẫu
Tỷ lệ nhiễm
(%)
CMV 26 26 52 50
TMV 29 13 42 69,1
TSWV 0 70 70 0
Chú thích: (+): Dương tính
(-): Âm tính
0
10
20
30
40
50
60
70
CMV TMV TSWV
Số mẫu dương
tính
Số mẫu âm tính
Số mẫu điều tra
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ số mẫu thuốc lá dƣơng tính, âm tính với CMV, TMV và TSWV
Sau khi tiến hành chẩn đoán TSWV cho 70 mẫu thuốc lá thu được tại 2 huyện
Tân Biên và Bến Cầu của tỉnh Tây Ninh, không phát hiện được mẫu dương tính với
TSWV (0%). Điều này có thể được giải thích bởi 3 lý do sau:
Tại các huyện thu thập mẫu, TSWV vào thời điểm này còn ít, chưa phát tán
rộng, nên chưa lấy được đúng mẫu đã nhiễm TSWV.
Do mẫu được lấy chủ yếu dựa theo triệu chứng bên ngoài nên có thể mẫu đã
nhiễm các virus khác với TSWV nhưng triệu chứng biểu hiện lại tương tự như nhiễm
TSWV.
S
ố
m
ẫ
u
Tác nhân gây bệnh
47
Vì thu thập theo triệu chứng nên có thể những triệu chứng này là do ảnh
hưởng bởi các yếu tố môi trường, phân bón hay do điều kiện canh tác gây ra.
Ngoài ra, các mẫu thuốc lá và đậu phộng cùng được lấy tại huyện Bến Cầu đều
không có biểu hiện nhiễm TSWV (0%), kết quả này cũng góp phần cho thấy rằng tại
đây TSWV chưa xuất hiện và gây bệnh.
Trong khi đó, mẫu thuốc lá có biểu hiện dương tính với CMV (50%) và TMV
(69,1%) khá cao. Như vậy, có thể nói rằng vào tháng 4 năm 2006 (thời gian thu thập
mẫu), cây thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh đang chịu ảnh hưởng của CMV và TMV.
4.1.3 Tỷ lệ nhiễm CMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu
Bảng 4.3 Kết quả ELISA đối với CMV trên thuốc lá
Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Tân Biên 20 33 60,6
Bến Cầu 6 19 31,6
Chú thích: (+): Dương tính
0
10
20
30
4
50
60
70
Tân Biên Bến Cầu
Mẫu dương tính
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm CMV giữa Tân Biên và Bến Cầu
Kết quả từ Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.2 cho thấy: Trên tổng số mẫu thuốc lá thu được
tại từng địa bàn điều tra, huyện Tân Biên có tỷ lệ nhiễm CMV khá cao (60,6%), trong
khi đó tại huyện Bến Cầu tỷ lệ nhiễm CMV ít hơn (31,6%). Như vậy, Tân Biên có tỷ
lệ thuốc lá nhiễm CMV cao gấp 2 lần so với Bến Cầu. Kết quả này có thể lý giải như
sau:
T
ỷ
l
ệ
%
Huyện
48
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tân Biên Bến Cầu
Mẫu dương
tính
CMV được lây lan chủ yếu qua rệp thuốc lá. Khi khảo sát tại huyện Tân Biên
ta thấy cỏ dại, lùm bụi khá nhiều, không được phát quang. Đây chính là nơi cư trú tốt
cho rệp, và tạo điều kiện cho chúng sinh sôi, phát triển mạnh mẽ. Vì thế, tại đây CMV
được lan truyền nhanh hơn, nhiều hơn.
Tại Bến Cầu, công tác vệ sinh, dọn dẹp cỏ dại quanh khu vực trồng thuốc lá
được thực hiện tốt hơn. Các bụi rậm được phát quang sạch sẽ, rệp không còn chổ để
trú ẩn, không có điều kiện thuận lợi để phát triển. Nên số lượng không tăng thêm
nhiều, khả năng truyền virus cũng giảm.
4.1.4 Tỷ lệ nhiễm TMV trên thuốc lá tại huyện Tân Biên và Bến Cầu
Bảng 4.4 Kết quả ELISA đối với TMV trên thuốc lá
Huyện Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Tân Biên 18 26 69,2
Bến Cầu 11 16 68,8
Chú thích: (+): Dương tính
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm TMV giữa Tân Biên và Bến Cầu
Các số liệu từ Bảng 4.4 và Biểu đồ 4.3 đã cho thấy: Tại huyện Tân Biên, thuốc lá
nhiễm TMV khá cao (69,2%) và tại huyện Bến Cầu, tỷ lệ này cũng khá cao (68,8%).
Khi so sánh tỷ lệ thuốc lá bệnh giữa 2 huyện, ta nhận thấy rằng tỷ lệ này là tương
đương nhau.
T
ỷ
l
ệ
%
Huyện
49
TMV chủ yếu tồn tại trong tàn dư thực vật của vụ truớc để lại trên đồng
ruộng. Nhưng hiện nay, tại các huyện này, sau khi thuốc lá được thu hoạch xong thì
phần thân, rễ còn lại sẽ được giữ làm phân bón cho vụ sau mà không được đốt bỏ.
Điều này đã tạo điều kiện cho TMV phát triển trở lại và tiếp tục gây bệnh cho vụ trồng
kế tiếp.
TMV nằm trong xác cặn bã thực vật sẽ bị phân hủy ngoài tự nhiên trong vòng
từ 5 đến 6 tháng do thời tiết. Tuy nhiên, vì Tây Ninh là một địa bàn chuyên canh trồng
thuốc lá ở nước ta nên các vụ mùa được trồng liên tục, kế tiếp nhau, không có thời
gian nghỉ giữa 2 vụ. Do đó, cây thuốc lá nhiễm bệnh từ vụ này sang vụ khác, năm này
sang năm khác mà không thể khắc phục được.
Tỷ lệ nhiễm TMV khá cao tương đương nhau tại huyện Tân Biên và Bến Cầu
cũng còn do sự lưu thông giữa những vùng trồng thuốc lá trong tỉnh. Những đoàn xe
vận chuyển thuốc lá nguyên liệu trong quá trình di chuyển từ vùng này sang vùng kia,
đồng thời cũng mang TMV trên những lá thuốc còn sót lại hay trên những vật dụng có
liên quan theo và góp phần phát tán bệnh.
Ngoài ra, thuốc lá thường xuyên nhiễm CMV, TMV trong suốt mùa vụ và từ năm
này sang năm khác còn vì lý do khách quan sau:
Tây Ninh là vùng trồng thuốc lá phổ biến với diện tích lớn, nhưng chủ yếu
việc trồng trọt diễn ra ở những hộ gia đình, tập quán của người nông dân là thường
trồng những loại cây như bầu bí, dưa, thơm hay vài loại hoa làm cảnh, đây chính là
những cây ký chủ của CMV và TMV. Đồng thời luôn tìm thấy dạng khảm trên các cây
trồng này quanh năm. Nên khi các cây này đã nhiễm virus thì nó dễ dàng và nhanh
chóng phát tán sang thuốc lá.
Khi trong vườn thuốc lá xuất hiện cây bị bệnh, nhưng vì lý do kinh tế, mà
người nông dân thường vẫn tiếp tục trồng những cây này, mà không tỉa bỏ, vì thế từ
một vài cây bệnh ban đầu đã mau chóng lan sang các cây khác.
50
4.1.5 Tỷ lệ thuốc lá chỉ nhiễm CMV hay chỉ nhiễm TMV hay nhiễm hỗn hợp
CMV và TMV trên số mẫu thu thập đƣợc
Bảng 4.5 Kết quả ELISA đối với mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp CMV và TMV
và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV
Tác nhân gây bệnh Số mẫu (+) Tổng số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Chỉ nhiễm CMV 0
42
0
Chỉ nhiễm TMV 20 47,6
Nhiễm CMV và TMV 11 26,2
Chú thích: (+): Dương tính
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Chỉ
nhiễm
CMV
Nhiễm
CMV và
TMV
Chỉ
nhiễm
TMV
Mẫu dương tính
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ giữa các mẫu thuốc lá nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các
mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV
Theo kết quả từ Bảng 4.5 và Biểu đồ 4.4, số mẫu thuốc lá chỉ nhiễm TMV chiếm
tỷ lệ cao nhất là 47,6%. Số mẫu nhiễm hỗn hợp CMV và TMV là 26,2%, nhưng không
có mẫu nào nhiễm CMV mà không nhiễm TMV. Điều này cũng có nghĩa là tất cả các
mẫu điều tra lúc này đều bị nhiễm TMV. Như vậy, có thể nói rằng TMV đang là virus
gây bệnh chủ yếu cho thuốc lá ở Tân Biên và Bến Cầu vào thời điểm khảo sát.
T
ỷ
l
ệ
%
Tác nhân gây bệnh
51
0
10
20
30
40
50
60
70
80
TC1 TC2 TC3
Mẫu dương tính
4.1.6 Tỷ lệ bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên cây thuốc lá
Sau khi so sánh kết quả chẩn đoán bằng phương pháp ELISA và triệu chứng trên
lá cây thuốc lá quan sát được trên đồng ruộng, tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh được thể hiện
qua Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.5.
Bảng 4.6 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc trên lá
Triệu chứng Số mẫu (+) Số mẫu điều tra Tỷ lệ nhiễm (%)
Lá dày, phồng rộp (TC1) 2 8 25
Lá có khảm xanh – vàng (TC2) 55 70 78,6
Lá khảm nặng, hoại tử (TC3) 10 25 40
Chú thích: (+) : Dương tính
TC1: Triệu chứng 1 [Hình 4.12 (D) và 4.13 (B)]
TC2: Triệu chứng 2 [Hình 4.12 (C)]
TC3: Triệu chứng 3 [Hình 4.13 (C) và 4.13 (D)]
Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ thuốc lá nhiễm bệnh theo triệu chứng
Từ tỷ lệ này có thể cho phép nhận định: Các lá thuốc lá có triệu chứng khảm xanh
– vàng (TC2) có khả năng nhiễm CMV và TMV (78,6%) khá cao.
Một số cây thuốc lá có biểu hiện triệu chứng khác như: Cây lùn, còi cọc hơn so
với các cây khác (tất cả được trồng cùng lúc và trong điều kiện canh tác như nhau) như
trong Hình 4.13 (E). Nhưng trên lá của tất cả các cây có sự thay đổi hình thái vừa nêu
trên đều mang một hay tất cả các triệu chứng đã xét trong Bảng 4.6. Vì vậy, có thể nói
T
ỷ
l
ệ
%
Triệu chứng
52
việc thu thập mẫu thuốc lá nhiễm CMV, TMV dựa vào triệu chứng biểu hiện trên lá
cây sẽ dễ dàng hơn là thu thập theo các triệu chứng khác.
Bên cạnh đó, cũng có một số cây thuốc lá có mang các triệu chứng như trên,
nhưng lại không cho kết quả dương tính khi tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA.
Điều này, một lần nữa cũng khẳng định rằng việc xác định cây nhiễm virus mà chỉ dựa
vào triệu chứng biểu hiện là không hoàn toàn chính xác.
Trong quá trình điều tra, thu thập mẫu, chúng tôi thấy có triệu chứng cong ngọn
trên cây thuốc lá, là triệu chứng đặc trưng do TSWV gây ra. Tuy nhiên, những mẫu
này, sau khi dùng kỹ thuật ELISA để chẩn đoán đã không cho kết quả dương tính. Có
lẽ, đó là do số lượng của TSWV quá ít, không đủ để biểu hiện thành phản ứng dương
tính.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tỷ lệ nhiễm bệnh của từng
giống thuốc lá. Vì bà con nông dân ở đây đa số chỉ biết là mua giống tại công ty nào
thôi, hầu như không quan tâm đến giống của cây thuốc lá đang trồng là gì.
Một lý do nữa, là do chưa có điều kiện để đánh giá tình trạng nhiễm CMV, TMV
và TSWV trên các cây thuốc lá được trồng trong nhà lưới (ngăn cách bọ trĩ, rệp thuốc
lá mang virus tới lây nhiễm cho cây) và các cây thuốc lá được trồng trong vườn của
Tổng Công ty Thuốc lá tại tỉnh Tây Ninh, nên nghiên cứu này chỉ được thực hiện trên
những cánh đồng trồng thuốc lá của các hộ gia đình. Vì thế, chúng tôi chưa khảo sát
được tỷ lệ nhiễm virus của thuốc lá khi trồng ngoài tự nhiên và khi trồng trong điều
kiện cách ly với côn trùng môi giới truyền bệnh.
53
(A) (B)
(C) (D)
Hình 4.12: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Bến Cầu (2006)
(A): Cây thuốc lá khỏe
(B), (C), (D): Triệu chứng cây thuốc lá nhiễm virus TMV
54
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
(B), (C), (D), (E), (F): Triệu chứng cây nhiễm virus CMV và TMV
Hình 4.13: Hình chụp cây thuốc lá khỏe và bệnh tại huyện Tân Biên (2006)
(A): Cây thuốc lá khỏe
55
4.2 Kết quả RT – PCR
Sau khi có kết quả chẩn đoán bằng kỹ thuật ELISA, chọn những mẫu dương tính
mạnh với TMV tiến hành chẩn đoán bằng kỹ thuật RT – PCR.
Tiến hành ly trích RNA tổng số (80 µl) từ lá thuốc lá bằng kit ly trích
Aurum
TM
Total RNA Mini Kit do Bio – Rad cung cấp.
Thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA (20 µl) với bộ kit iScriptTM cDNA
Synthesis Kit cũng do Bio – Rad cung cấp.
Kết quả RT – PCR thu được có thành phần hóa chất và chu trình nhiệt như sau:
Bước 1: Tổng hợp cDNA
Thành phần hóa chất:
5X iScript Reaction Mix 4 μl
iScript Reverse Transcriptase 1 μl
Nuclease free water 13 μl
RNA tổng số 2 μl
Tổng thể tích 20 μl
Chu trình nhiệt:
5 phút 25oC
40 phút 42oC
5 phút 85oC
Giữ ở 4oC
Bước 2: Khuếch đại cDNA bằng PCR
Thể tích Nồng độ cuối
iTaq buffer 10X 5 μl 1 X
MgCl2 2,5 μl 2,5 mM
dNTP 1μl 200 µM
iTaq DNA polymerase 0,5 μl 0,5 μl
primer F 1 µl 0,4
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- VAN NGOC DUNG - 02125142.pdf