Khóa luận Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (cucumber mosaic virus, tobacco mosaic virus và tomato spotted wilt virus) trên cà chua (solanum lycopersicum) ở tỉnh lâm đồng bằng kỹ thuật elisa và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán tobacco mosaic virus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐÁNH GIÁ TÌNH TRẠNG NHIỄM BỆNH VIRUS (CUCUMBER MOSAIC VIRUS, TOBACCO MOSAIC VIRUS VÀ TOMATO SPOTTED WILT VIRUS) TRÊN CÀ CHUA (Solanum lycopersicum) Ở TỈNH LÂM ĐỒNG BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN TOBACCO MOSAIC VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN LÂM NGỌC HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ: Gia đình là chỗ dựa về vật chất và tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn. Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM. Ban Chủ Nhiệm bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn. PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. PGS. TS. Trần Thị Dân, TS. Đinh Duy Kháng, TS. Bùi Minh Trí, TS. Lê Đình Đôn, anh Nguyễn Đức Toàn đã tận tình giúp đỡ tôi thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Các thầy cô đã cho tôi nhiều kiến thức bổ ích. Anh Nguyễn Văn Sơn cùng các anh chị trong Chi Cục Bảo vệ Thực vật tỉnh Lâm Đồng đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn. Chú Nguyễn Văn Sang và các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đơn Dƣơng, anh Nguyễn Tấn Ngọc cùng các anh chị trong Phòng Nông Nghiệp huyện Đức Trọng đã tận tình hỗ trợ, chỉ dẫn tôi. Các thầy cô, anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 27 và tất cả các anh chị, bạn bè đã gắn bó, góp sức cùng tôi trong suốt thời gian học tập và làm luận văn vừa qua. iv TÓM TẮT Lâm Ngọc Hạnh. Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT-PCR” đƣợc tiến hành tại huyện Đơn Dƣơng, huyện Đức Trọng và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm, từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. Thí nghiệm đƣợc thực hiện gồm 3 nội dung chính. 1. Mẫu đƣợc thu theo triệu chứng bệnh virus, mỗi ruộng 5 mẫu kết hợp với điều tra sơ bộ tình hình bệnh trên cà chua ở 21 thôn và 2 thị trấn thuộc huyện Đơn Dƣơng và Đức Trọng. Từ đó, đánh giá tình hình bệnh virus trên cà chua ở địa bàn nghiên cứu. 2. Xác định tác nhân gây bệnh virus chính trên cà chua (TMV, CMV, TSWV) bằng phƣơng pháp DAS-ELISA sử dụng kháng thể đa dòng. Mẫu đƣợc phân tích là những lá cà chua có triệu chứng bệnh virus. Mỗi mẫu lá đƣợc kiểm tra trên 3 virus để xác định có virus nào trong 3 virus trên nhiễm riêng lẻ hay đồng thời lên mẫu đang nghiên cứu hay không. 3. Mẫu dƣơng tính TMV đƣợc chọn để thực hiện RT-PCR nhằm bƣớc đầu xây dựng quy trình RT-PCR để chẩn đoán TMV. Từ đó, khẳng định lại kết quả ELISA đồng thời sản phẩm thu đƣợc từ RT-PCR sẽ đƣợc dùng cho những nghiên cứu xa hơn. Kết quả thu đƣợc: - Điều tra sơ bộ tình hình bệnh ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng cho thấy tại thời điểm nghiên cứu cà chua ở Đức Trọng bị tàn phá nặng nề bởi bệnh virus trong khi cà chua ở Đơn Dƣơng vẫn tốt. - Kết quả DAS-ELISA cho thấy dịch bệnh virus ở Đức Trọng chủ yếu là do CMV gây ra. TMV có gây bệnh nhƣng ít hơn. TSWV chƣa gây bệnh ở khu vực này vào thời điểm nghiên cứu. - Bƣớc đầu tìm đƣợc một quy trình RT-PCR tạo ra sản phẩm khá đặc hiệu nhƣng chƣa khẳng định đƣợc đó là sản phẩm khuếch đại từ khuôn mẫu nào. v SUMMARY This is Lam Ngoc Hanh studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th , 2005. The thesis entitled “Diagnosing Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA and formulating the RT-PCR process to diagnose Tobacco Mosaic Virus in Viet Nam”. This research was conducted from 3th, 2005 to 8 th , 2005 at Don Duong, Duc Trong districts and in the laboratory of biotechnology and chemistry of Nong Lam University. The objects of this research are as follows: - Collecting the samples with the virus symptoms, 5 samples per each field and generally investigating the virus infection on tomato in Don Duong and Duc Trong districts so that the virus disease incidence in Don Duong and Duc Trong districts can be evaluated. - Diagnosing pathogens in tomato such as Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus by DAS-ELISA kit using polyclonal antibodies from rabbit. The samples tested are tomato leaves appearing the virus symptoms. Each sample is tested for Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus and Tomato Spotted Wilt Virus. - Samples of Tobacco Mosaic Virus positive are seleted to conduct the RT-PCR. We try to formulate the RT-PCR process used to both diagnose Tobacco Mosaic Virus and confirm DAS-ELISA results. The results of this research are as follows: - Through the general investigation on tomato in Don Duong and Duc Trong districts, we find out that tomato in Duc Trong have been severely destroyed by viruses. - DAS-ELISA result data show that Cucumber Mosaic Virus is the key pathogen creating virus disease epidemic in Duc Trong on 3 th , 2005 while Tobacco Mosaic Virus appears mildly and Tomato Spotted Wilt Virus is not found now in these areas. - Finding out the RT-PCR process that can amplify the pretty specific product but the product has not been confirmed yet. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Lời cảm tạ . ................................................................................................................. i Tóm tắt ...... ................................................................................................................ ii Tóm tắt bằng tiếng Anh ............................................................................................ iii Mục lục ..... ............................................................................................................... iv Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii Danh sách các bảng, biểu đồ .................................................................................... ix Danh sách các hình ............................................................................................... x PHẦN I. MỞ ĐẦU ................................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1 1.2. Mục đích yêu cầu ..................................................................................... 2 1.2.1. Mục đích ......................................................................................... 2 1.2.2. Yêu cầu ........................................................................................... 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1. Cà chua ..................................................................................................... 3 2.1.1. Sơ lƣợc về cà chua ......................................................................... 3 2.1.2. Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới ................................ 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt .............................................. 4 2.2. Bệnh hại trên cà chua ............................................................................... 4 2.2.1. Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) ........................... 6 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra ..................................... 6 2.2.1.2 Phân loại của TSWV .......................................................... 7 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế .................. 7 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV ........................................................ 8 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV ....................................................................... 8 2.2.1.6 Tính chất của TSWV .......................................................... 9 2.2.1.7 Vector truyền ...................................................................... 9 vii 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV ............................ 10 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh ................................................................ 11 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV ............................................... 11 Cây kháng ...................................................................... 11 Quản lý TSWV ............................................................... 12 2.2.2. Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) ................................... 14 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh ................................................................. 14 2.2.2.2 Phân loại của TMV ............................................................. 14 2.2.2.3 Sự phân bố của TMV .......................................................... 14 2.2.2.4 Ký chủ của TMV ................................................................ 14 2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của TMV ................................................ 14 2.2.2.6 Tính chất của TMV ............................................................. 16 2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh ........................................................ 17 2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV ....................................... 17 2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV ................................................. 17 2.2.2.10 Phòng trừ .......................................................................... 19 2.2.3. Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) ................................. 19 2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV .................................................. 19 2.2.3.2 Phân loại CMV ................................................................... 20 2.2.3.3 Phạm vi phân bố ........................................................................... 21 2.2.3.4 Ký chủ ................................................................................. 21 2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV ................................................ 21 2.2.3.6 Tính chất lý hóa của CMV ................................................. 23 2.2.3.7 Sự truyền bệnh .................................................................... 24 2.2.3.8 Điều kiện phát triển của bệnh ............................................. 24 2.2.3.9 Triệu chứng .................................................................................. 25 2.2.3.10 Phòng trừ ........................................................................... 25 2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật ............................ 26 2.3.1. Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị ............................ 26 viii 2.3.2. Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu ..................................... 26 2.3.3. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng học ................................ 26 2.3.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh ..................... 27 2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. ............................................... 28 2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA ............................................ 28 2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. ........................................... 28 Direct Sanwich ELISA hay DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA) ................................ 28 Indirect Sanwich ELISA ................................................ 28 2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA) ....................................... 28 2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor .......... 28 2.3.5. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự đoạn DNA. ................... 29 2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphirm) .................................................................. 29 2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT-PCR đối với RNA ................... 29 2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác ............................... 29 2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng probe đánh dấu ............................... 29 2.3.5.5 Array ................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp DAS-ELISA và phƣơng pháp RT-PCR ............................. 30 2.4.1. Phƣơng pháp DAS-ELISA ............................................................. 30 2.4.2. Phƣơng pháp RT-PCR ................................................................... 30 2.5. Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây ...................................... 32 2.5.1. Ở nƣớc ngoài .................................................................................. 32 2.5.2. Ở Việt Nam .................................................................................... 33 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 34 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................... 34 3.1.1. Thời gian thực hiện đề tài .............................................................. 34 3.1.2. Địa điểm thực hiện đề tài ............................................................... 34. ix 3.2. Vật liệu ..................................................................................................... 34 3.2.1. Dụng cụ .......................................................................................... 34 3.2.2. Hóa chất ........................................................................................ 34 3.3. Phƣơng pháp ............................................................................................. 35 3.3.1. Điều tra và lấy mẫu ....................................................................... 35 3.3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................ 35 3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS-ELISA ............................................. 35 3.3.2.2 Chẩn đoán bằng RT-PCR ................................................... 36 Ly trích RNA ................................................................. 36 Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA ............ 37 Phản ứng PCR ................................................................ 38 3.3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR ..................................................... 44 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................. 46 4.1. Phản ứng ELISA ....................................................................................... 46 4.1.1. Kết quả ELISA ............................................................................... 46 4.1.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV .................................................. 47 4.1.3. Tỷ lệ bệnh theo tuổi cây thể hiện trong số mẫu điều tra ................ 48 4.1.4. Tỷ lệ bệnh theo địa điểm thể hiện trong số mẫu điều tra ............... 49 4.1.5. Tỷ lệ bệnh theo giống cà thể hiện trong số mẫu điều tra .............. 51 4.1.6. Triệu chứng thực tế trong các mẫu thí nghiệm .............................. 52 4.1.7. Tỷ lệ bệnh theo loại triệu chứng quan sát đƣợc ............................. 53 4.2. Kết quả của phản ứng RT-PCR ................................................................ 57 Kết quả RT-PCR sử dụng cặp primer 1 ............................................... 57 Kết quả RT-PCR sử dụng 2 cặp primer 2 và 3 ..................................... 62 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 70 5.1. Kết luận .................................................................................................... 70 5.2. Đề nghị ..................................................................................................... 71 PHẦN VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 73 1 2 x PHỤ LỤC 1 Thành phần các dung dịch trong phản ứng ELISA ............................... 76 PHỤ LỤC 2 Thành phần các chất trong kit tổng hợp iScriptTM. ............................. 77 PHỤ LỤC 3 Thành phần các hóa chất trong phản ứng PCR ..................................... 78 PHỤ LỤC 4 Hình chụp các đĩa chứa mẫu phân tích bằng ELISA ............................ 79 PHỤ LỤC 5 Bảng câu hỏi điều tra ............................................................................. 80 PHỤ LỤC 6 Danh sách các trình tự tƣơng đồng với TMV dòng ở Trung Quốc dùng để thiết kế primer. ......................................................................... 81 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMV: Cucumber Mosaic Virus TMV: Tobacco Mosaic Virus TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus CTV: Citrus Tristeza Virus TLCV: Tomato Leaf Curl Virus (bệnh xoăn ngọn cà chua) TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus (bệnh xoăn vàng ngọn), TRSV: Tomato Black Ring Virus (bệnh đốm hình nhẫn) TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus (bệnh lùn bụi cà chua) PV Y: Potato Virus Y PV X: Potato Virus X DMSO: dimethyl sufoxide ELISA: enzyme linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction N: Nucleoprotein cDNA: complementary DNA ssRNA : single strand RNA MP: Movement Protein (Protein di chuyển) CP: Coat Protein (Protein vỏ) ORF: open reading frame m 7 Gppp: 7- methyl guanosine triphosphate HR: Hypersensitive Response (phản ứng siêu nhạy cảm) SAR: system acquired resistance (tính kháng có hệ thống) PR protein: pathogenesis- related protein VPg : protein liên kết với genome satRNA: satellite RNAs (RNA vệ tinh) DEP : delution end point LIV : longevity invitro TIR : thermal inactivation range. xii DANH SÁCH CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ BẢNG, BIỂU ĐỒ TRANG Bảng 4.1 Kết quả ELISA đối với TSWV, TMV và CMV trên tổng số mẫu. ........................................................................... 47 Bảng 4.2 Tỷ lệ các mẫu nhiễm hỗn hợp virus CMV và TMV so với các mẫu nhiễm chỉ CMV hay TMV. .......................... 48 Bảng 4.3 Tỷ lệ (%) bệnh virus theo tuổi cây trong tổng số mẫu điều tra. ................................................................................. 49 Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu nhiễm bệnh TMV, CMV và TSWV giữa Đơn Dƣơng và Đức Trọng. .................................................... 50 Bảng 4.5 Tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ........................ 53 Bảng 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 53 Biểu đồ 4.1 Biểu diễn tỷ lệ dƣơng tính và âm tính CMV, TMV, TSWV. 47 Biểu đồ 4.2 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm giữa các mẫu nhiễm hỗn hợp TMV và CMV và các mẫu chỉ nhiễm CMV hay TMV. ........ 48 Biểu đồ 4.3 Biểu diễn tỷ lệ phần trăm mẫu bị nhiễm virus theo tuổi cây .. 49 Biểu đồ 4.4 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ................ 51 Biểu đồ 4.5 Biểu diễn tỷ lệ bệnh TMV và CMV trên 2 giống cà đƣợc trồng phổ biến ở Đơn Dƣơng và Đức Trọng. ......................... 53 Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ cà chua bệnh theo triệu chứng quan sát đƣợc .............. 54 xiii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ .............................................................. 10 Hình 2.2 Amblyserus cucumeris ................................................................. 13 Hình 2.3 Amblyseius degenerans ................................................................ 13 Hình 2.4 Hypoaspis aculeifer ...................................................................... 13 Hình 2.5 Orius insidiosus ............................................................................ 13 Hình 2.6 A, B: virion của TMV; C,D: tinh thể TMV. ............................... 16 Hình 2.7 Triệu chứng điển hình của TMV ở cà chua ................................. 18 Hình 2.8 Cấu tạo của CMV ......................................................................... 22 Hình 2.9 Triệu chứng điển hình của CMV ở cà chua ................................. 25 Hình 4.1 Ruộng cà chua bị nhiễm bệnh virus ở ở Đức Trọng .................... 52 Hình 4.2 Ruộng cà chua khỏe ở Đơn Dƣơng ............................................. 52 Hình 4.3 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ................................. 55 Hình 4.4 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm TMV và CMV ........................ 55 Hình 4.5 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV .......................................... 55 Hình 4.6.1 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.6.2 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.7 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 55 Hình 4.8 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.9 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.10 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.11 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ........................................... 56 Hình 4.12 Triệu chứng lá cà chua có nhiễm CMV ............................................ 56 Hình 4.13 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 2 ........................................... 58 Hình 4.14 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 3 ........................................... 59 Hình 4.15 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 4 ........................................... 59 Hình 4.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR lần 5 ........................................... 60 Hình 4.17 Kết quả PCR lần 1 và 2 trên 4 mẫu ............................................. 62 xiv Hình 4.18 Kết quả PCR lần 3 ........................................................................ 64 Hình 4.19 Kết quả PCR lần 8, 9, 10, 11, 12 trên 2 mẫu 2 và 3 ..................... 66 Hình 4. 20a Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67 Hình 4.20b Kết quả RT-PCR lần thứ 13 ......................................................... 67 Hình 4.21 Mức độ tƣơng đồng của trình tự các dòng TMV trên thế giới ....................................................................................... 69 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc trồng rộng rãi trên thế giới từ thế kỷ thứ 19 cho đến nay ( Đây là cây trồng thích hợp với hoạt động trồng trọt bán thời gian và qui mô nhỏ. Cà chua có giá trị thƣơng mại khá cao. Mỗi năm, nƣớc Mỹ thu về hàng tỷ đô la từ thị trƣờng xuất khẩu cà chua. Cà chua là loại rau cao cấp rất đƣợc ƣa chuộng vì nó có giá trị dinh dƣỡng cao. Các nhà khoa học Nga còn cho biết: quả cà chua có thể dùng làm vắc - xin phòng chống bệnh viêm gan siêu vi A, B, bệnh AIDS và bệnh viêm não. Nhu cầu cà chua luôn luôn lớn và kỹ thuật trồng cà chua lại không quá phức tạp hay khó khăn, không tốn nhiều trang thiết bị đặc biệt. Vì những lý do đó mà cà chua thƣờng đƣợc trồng xen canh với các cây rau màu khác trên những vùng đất thích hợp. Thế nhƣng, cà chua có thể bị ảnh hƣởng bởi rất nhiều bệnh, bao gồm bệnh do ký sinh (nhƣ nấm, vi khuẩn, virus, mycoplasma, tuyến trùng) và bệnh không do ký sinh (nhƣ độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng). Bệnh do virus gây ra là khó khống chế nhất và có thể tạo ra tổn thất rất nặng nề khi bệnh lan ra thành dịch. Trong 10 năm trở lại đây, bệnh virus thực vật đã lan rộng hơn và xuất hiện nhiều dịch bệnh virus hơn. Ở Việt Nam, bệnh virus trên cà chua cũng xuất hiện ở nhiều nơi trên diện tích lớn. Ví dụ nhƣ dịch virus vào tháng 3 năm 2005 ở huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng đã làm cho 27 ha cà chua ở đây thiệt hại gần nhƣ 100% (Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật tỉnh Lâm Đồng). Do đó, cần phải xác định xu hƣớng lây lan của virus trên thế giới và tiến hành những hoạt động kiểm dịch ở những nơi cần thiết đồng thời tiến hành những nghiên cứu xa hơn nhằm phục vụ cho việc phòng chống bệnh virus cho cây trồng. Xuất phát từ tình hình phát triển của cà chua và bệnh virus trên cà chua mà chúng tôi thực hiện đề tài: ”Đánh giá tình trạng nhiễm bệnh virus (Cucumber Mosaic Virus, Tobacco Mosaic Virus và Tomato Spotted Wilt Virus) trên cà chua (Solanum 2 lycopersicum) ở tỉnh Lâm Đồng bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán virus Tobacco Mosaic Virus bằng kỹ thuật RT - PCR”. 1.2. Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Chẩn đoán và phát hiện CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus) và TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus) trong mẫu lá nghi ngờ bệnh virus bằng kỹ thuật DAS - ELISA (double antibody sanwich - enzyme linked immunosorbent assay). Từ đó, đánh giá tình hình bệnh ở khu vực nghiên cứu. - Bƣớc đầu xây dựng quy trình chẩn đoán TMV bằng RT - PCR. 1.2.2 Yêu cầu - Xác định tỉ lệ bệnh do các virus TMV, CMV, TSWV gây ra trên đồng ruộng. Từ đó khuyến cáo tác hại và các biện pháp khống chế bệnh do các virus này gây ra. - Nắm vững nguyên tắc và các bƣớc tiến hành của kỹ thuật ELISA và RT - PCR. 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cà chua 2.1.1 Sơ lƣợc về cà chua Cà chua (Solanum lycopersicum) có xuất xứ ở miền Nam và Trung Mỹ. Cà chua thuộc giới thực vật (Plantae), thuộc chi Magnoliopsida, chi phụ là Asteridae, thuộc bộ Solanales, thuộc họ Solanaceae, thuộc giống Solanum, thuộc loài Solanum lycopersicum. Tên cà chua xuất phát từ một từ trong tiếng Nahuatl là tomatl ( 2.1.2 Tình hình phát triển của cà chua trên thế giới và Việt Nam Sự xuất hiện của cà chua (Solanum lycopersicum) đƣợc xác định là từ những năm 70 trƣớc công nguyên ở Nam Mỹ. Vào thế kỉ 16, cà chua còn mọc hoang ở vùng núi Andes của Nam Mỹ và phát triển ở Mêxicô. Sau đó, những ngƣời Châu Âu khám phá vùng đất mới này và cà chua đƣợc vận chuyển về châu Âu bằng tàu. Do có hàm lƣợng Licopen cao nên cà chua nhanh chóng đƣợc trồng ở Châu Âu để sử dụng vào các bữa ăn hàng ngày và đƣa vào công nghiệp chế biến rau quả. Ngƣời phƣơng Tây đặc biệt sùng bái quả cà chua. Từ năm 1931 - 1999, ở châu Âu có khoảng 131 công trình nghiên cứu về cà chua. Sản lƣợng cà chua ƣớc tính ở một số nƣớc Châu Âu năm 2004 nhƣ sau: Tây Ban Nha (2.300 tỷ tấn) tăng 34% so với năm 2003, Italy (5.800 tỷ tấn) tăng 9% so với năm 2003, Hy Lạp (1.050 tỷ tấn) tăng 8% so với năm 2003. (Nguồn: Attaché Reports, USDA/FAS and USDA/ERS). Mỹ đã tạo ra cây khoai - cà có đặc điểm cho củ (ở dƣới đất) giống khoai tây và cho trái (ở trên cây) giống cà chua. Tại Nhật Bản, cà chua cũng đƣợc khuyến khích ăn hàng ngày để phòng chống các bệnh tim mạch và ung thƣ. Trung Quốc cũng cho phép các giống “rau quả không gian” đƣợc trồng trên diện rộng khắp đất nƣớc. Trong đó, diện tích “cà chua không gian” (tạo giống mới bằng tia vũ trụ trên không gian) chiếm hơn 2000 ha (Nguồn: "Rau quả không gian” ở Trung Quốc. Ngày 26 tháng 09 năm 2004). Chính phủ Malaysia đã thực hiện nhiều giải pháp nhằm phát triển 4 công nghệ sau chế biến rau quả, trong đó cà chua là một trong 8 loại rau đƣợc đƣa vào danh sách ƣu tiên. Ở Việt Nam, trong định hƣớng và mục tiêu phát triển nông nghiệp, nhà nƣớc ta khuyến khích trồng các loại rau quả xuất khẩu, trong đó có cà chua. Năm 2003 diện tích cà chua thu đông và vụ đông cả nƣớc ta đạt 11.936 ha. Vụ Đông 2003 ở Hà Tây - một trọng điểm cà chua cho xuất khẩu của Nam Định, huyện Hải Tây trồng 135 ha cà chua, huyện Hải Hậu đƣa diện tích cà chua lên trên 40 ha. Trên diện tích 1.450 ha cà chua vụ đông của Nam Định có 652 ha đƣợc ký hợp đồng bao tiêu sản phẩm giữa nhà máy chế biến và nông dân. Việt Nam đã đƣa ra thị trƣờng giống cà chua HT mang thƣơng hiệu Việt Nam. Đây là giống rau lai cao cấp đầu tiên ở nƣớc ta có khả năng cạnh tranh trên thị trƣờng. Nhƣ vậy, trên thế giới và cả ở Việt Nam cà chua luôn đƣợc quan tâm và khai thác nhƣ là một nguồn lợi không nhỏ, không thể thiếu đƣợc. 2.1.3 Tình hình sản xuất cà chua ở Đà Lạt Với điều kiện thiên phú về nhiệt độ, ẩm độ và bức xạ, Đức Trọng và Đơn Dƣơng là 2 huyện trọng điểm về rau và cà chua của tỉnh Lâm đồng. Hàng năm 2 huyện này trồng đến 3.500 ha cà chua (trong tổng diện tích 4.500 ha trồng rau màu của toàn tỉnh Lâm Đồng) với sản lƣợng ƣớc tính khoảng 150.000 tấn. Cà chua đã trở thành cây trồng chủ lực cho vùng rau này. Những năm trƣớc, bệnh héo rũ do vi khuẩn luôn đe dọa cà chua ở đây. Nông dân đã chuyển qua trồng giống cà ghép (ghép giống M186 với gốc cà dại) để tăng sức chống chịu với điều kiện ngoại cảnh và bệnh, trong đó chủ yếu là bệnh héo rũ do vi khuẩn. Năm 2005, do thời tiết phức tạp: nắng hạn kéo dài kết hợp với tiết trời khô hanh đã làm cho bệnh virus phát triển nhanh chóng. Ở Đức Trọng, hàng loạt cây cà chua đã bị phá bỏ vì bệnh virus. Ƣớc tính vào tháng 3 năm 2005 có khoảng 27 ha cà chua bị nhiễm bệnh virus (gần 100%) ở Đức Trọng (Nguồn: Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật Tỉnh Lâm Đồng). 2.2 Bệnh hại trên cà chua Bệnh cà chua trở thành yếu tố giới hạn trong sản xuất cà chua ở nhiều vùng trên thế giới. Gần 200 bệnh cà chua đã đƣợc biết đến do những nguyên nhân khác nhau gây ra. 5 Có 2 nhóm nguyên nhân gây bệnh chính trên cà chua là bệnh do ký sinh và bệnh không do ký sinh. Bệnh do ký sinh gồm có: bệnh do nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Bệnh không do ký sinh thƣờng là do độ ẩm của đất, nhiệt độ, ánh sáng không thích hợp hay bởi sự mất cân bằng dinh dƣỡng, mối quan hệ về oxy không hợp lý, hay ảnh hƣởng của thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu, sấm chớp. Những triệu chứng không do ký sinh gây ra thƣờng nhẹ hơn những triệu chứng gây ra bởi ký sinh và gây khó khăn thêm cho việc chẩn đoán bệnh cho cây trồng. Riêng đối với bệnh virus thì trên cây cà chua vùng nhiệt đới có rất nhiều loại virus gây hại nhƣ CMV (Cucumber Mosaic Virus), TMV (Tobacco Mosaic Virus), TSWV (Tomato Spotted Wilt Virus), CTV (Citrus Tristeza Virus). Các virus này gây ra những triệu chứng tƣơng đối giống nhau là lá vàng loang lổ, xoăn, cây nhỏ, đều lan truyền qua bọ phấn Bemisia. Mật độ bọ phấn càng cao thì tỷ lệ cây bị bệnh xoăn lá càng nhiều. Bệnh phát triển nhiều trong điều kiện thời tiết ấm áp, nhiệt độ từ 20 - 30oC, nhiều nắng, ít mƣa. Tỷ lệ mắc bệnh và tính nghiêm trọng của bệnh thay đổi từ mùa này sang mùa khác vì những mối quan hệ phức tạp (2). Bệnh virus hại cà chua Bệnh virus hại cà chua là 1 tập đoàn có rất nhiều bệnh hại, trong đó các loại virus quan trọng gây ra rất nhiều tác hại cho cà chua ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới gồm: bệnh khảm vàng (TMV: Tomato Mosaic Virus), bệnh khảm mảng lồi lõm (CMV: Cucumber Mosaic Virus), bệnh đốm héo (TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus), bệnh xoăn ngọn cà chua (TLCV: Tomato Leaf Curl Virus), bệnh xoăn vàng ngọn (TYLCV: Tomato Yellow Leaf Curl Virus), bệnh đốm hình nhẫn (TRSV: Tomato Black Ring Virus), bệnh lùn bụi cà chua (TBSV: Tomato Bushy Stunt Virus) và virus X, Y của khoai tây (5) . Bệnh virus đang gây thiệt hại nặng nề cho nền sản xuất cà chua ở nƣớc ta và ở nhiều nƣớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới. Cây cà chua bị bệnh thƣờng không có quả hoặc quả rất nhỏ. Nhiều trƣờng hợp bệnh rất nặng, không cho thu hoạch gây ra mất mùa cà chua. Sơ lƣợc về CMV, TMV và TSWV 6 Hiện nay, thuật ngữ “emerging plant virus” đã đƣợc hình thành. Thuật ngữ này xuất phát từ thuật ngữ “emerging virus” đƣợc đúc kết từ đầu những năm 1980 để mô tả tình cảnh bi kịch do bệnh AIDS gây ra. Sau đó, thuật ngữ này dƣờng nhƣ trở nên thích hợp với tình hình dịch bệnh virus trên cây trồng. Ba virus điển hình cho thuật ngữ này là CMV, TMV, CTV vì ba virus này phân bố rất rộng về địa lý, rất dễ gây ra dịch bệnh cho những cây trồng quan trọng về kinh tế. TSWV (có khi đƣợc gọi là “Super virus”) trong những năm gần đây lại gây dịch bệnh nghiêm trọng trên hai đối tƣợng có giá trị kinh tế cao là cà chua và thuốc lá. Ngƣời ta xếp TSWV vào loại “re - emerging plant virus”. Hiện nay, ba virus CMV, TMV, TSWV đang gây bệnh rất nguy hiểm trên cà chua. 2.2.1 Sơ lƣợc về Tomato Spotted Wilt Virus (TSWV) 2.2.1.1 Lịch sử của bệnh do TSWV gây ra Trƣớc đây, virus TSWV đƣợc báo cáo dƣới nhiều tên khác nhau, ví dụ: virus đồng thau cà chua (Tomato Bronzing Virus), Kromnek Virus, Pineapple Yellow Potyvirus, Makhorka Tip Chlorosis Virus, Vira Cabeca Virus và nhiều tên khác (Sakimura, 1962; Best, 1968; Smith, 1972) (1). Hiện nay, virus TSWV thƣờng đƣợc gọi là Tomato Spotted Wilt Virus hay Tomato Spotted Wilt Tospovirus hay Pineapple Yellow Spot Virus. Nó còn có các tên khác nhƣ Spotted Wilt, Bronze Leaf (ở Anh), Maladie bronze’e (ở Pháp), Bronceado (ở Tây Ban Nha). Ngoài ra, tên Lycopersicon Virus 3 cũng đƣợc sử dụng rộng rãi để chỉ virus TSWV. Sự thay đổi trong thuật ngữ phản ánh sự thay đổi nhiều của triệu chứng bệnh, tùy thuộc vào loài virus, cây chủ và vùng địa lý nơi bệnh đó đƣợc tìm thấy. Báo cáo đầu tiên về bệnh do TSWV (bệnh héo đốm cà chua) trên cà chua có từ năm 1915 ở miền Nam nƣớc Úc (Brittlebank, 1919). Bệnh gây ra thiệt hại nghiêm trọng cho cà chua ở Úc trong nhiều năm và vẫn là vấn đề nghiêm trọng ở New South Wales. Những vùng khác cũng có tổn thất nặng nhƣ Argentina, Hawaii. Sau chiến tranh thế giới thứ hai, bệnh héo đốm cà chua giảm rõ rệt ở Tây Âu và Mỹ (có thể do việc phòng trừ bọ trĩ bằng hóa chất) trong khi ở Đông Âu, Nam Mỹ và Nam Phi, virus này vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng. Những năm đầu của thập niên 80, TSWV đã phát triển nhanh chóng và lan rộng ra nhiều vùng địa lý khác nhau (Barker, 1989; Marchoux và cộng sự, 1991; Varia và cộng sự, 1993) cùng với sự phát triển nhanh 7 chóng của vectơ bọ trĩ cẩm chƣớng (Frankliniella occidentalis) (Mantel và Van de Vrie, 1998; Brodsgaard, 1989). Từ năm 1998, TSWV đã trở thành vấn đề chính cho những ruộng cà chua (4). Bệnh do virus TSWV bộc phát trên nhiều quốc gia sản xuất nông nghiệp trên khắp các lục địa, chủ yếu trong vùng khí hậu nóng. Ở vùng khí hậu ôn đới thì TSWV phổ biến trong canh tác nhà lƣới. 8 2.2.1.2 Phân loại của virus TSWV TSWV thuộc họ Bunyaviridae, một họ lớn của những virus đƣợc mang bởi động vật chân đốt. Họ Bunyaviridae có 5 giống là Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus, Phlebovirus và Tospovirus. Trong đó, Tospovirus đƣợc xem là thuộc 10 virus gây bệnh cây nổi bật nhất. Tác động của Tospovirus rất lớn. Một thời gian dài TSWV đƣợc phân loại nhƣ là đại diện duy nhất của nhóm virus cây đơn xuất xứ từ nhóm “Tomato Spotted Wilt Virus” (Mathews, 1979). Năm 1989, TSWV đƣợc chia thành TSWV dòng L và TSWV dòng I. Giữa năm 1989 và 1992, hai dòng này đƣợc xác định là khác nhau về huyết thanh học và tên của chúng đã đƣợc thay đổi thành TSWV (TSWV dòng L) và INSV (TSWV dòng I). Nhờ sinh học phân tử, ngƣời ta nhận thấy virus TSWV có những đặc tính chung của họ Bunyaviridae. Vì vậy, hiện nay TSWV đƣợc phân loại nhƣ là nhóm nguyên thủy của chi Tospovirus mới trong họ Bunyaviridae. Sử dụng kháng huyết thanh đơn dòng và đa dòng để xác định cấu trúc nucleoprotein của TSWV, ngƣời ta thấy rằng TSWV là loài gây bệnh cho nhiều cây trồng trên thế giới (de Avila và cộng sự, 1990). Những nghiên cứu này cũng chứng minh sự tồn tại của những loài Tospovirus khác nhau là TSWV: Tomato Spotted Wilt Virus (nhóm huyết thanh I), GRSV: Groundnut Ringspot Virus (nhóm huyết thanh II), TCSV: Tomato Chlorotic Spot Virus (nhóm huyết thanh III), INSV: Impatiens Necrotic Spot Virus (nhóm huyết thanh IV), GBNV: Groundnut Bud Necrosis Virus (nhóm huyết thanh V), WSMV: Wattermelon Silver Molt Virus. 2.2.1.3 Phân bố về địa lý và tầm quan trọng về kinh tế TSWV thƣờng ở vùng ôn đới và cận nhiệt đới. TSWV đã đƣợc ghi nhận ở Ấn Độ, châu Á, châu Úc, Macedonia, Nam Serbia, Nam và Bắc Mỹ. Ở châu Âu, TSWV xuất hiện ở nơi có khí hậu ấm và trong các nhà kính. Ở Yugoslavia, TSWV trãi rộng ở những vùng khô, ấm và có nắng nhiều. TSWV gây đe dọa nghiêm trọng trong sản xuất cà chua và thuốc lá. TSWV là một trong 10 virus gây hại nghiêm trọng nhất. TSWV gây thiệt hại trên toàn thế giới hơn 1 tỉ đô la hàng năm (Goldbach and Peter, 1994). 2.2.1.4 Dãy kí chủ của TSWV 9 TSWV có phổ ký chủ rất rộng. Chúng tấn công trên nhiều cây cảnh, cỏ dại và nhiều cây trồng khác nhau. Những công trình nghiên cứu về loài ký chủ mới của TSWV đƣợc xuất bản với tốc độ rất nhanh (German và cộng sự, 1992). Cho đến nay, danh sách ký chủ của TSWV là 1090 loài cây, thuộc 15 họ thực vật một lá mầm, 69 họ thực vật hai lá mầm và một họ thực vật có hoa ẩn. Ký chủ mẫn cảm với TSWV gồm nhiều cây công nghiệp quan trọng nhƣ ớt, đậu nành, khoai tây, thuốc lá, cà chua, các loại rau nhƣ cần tây, rau diếp. Hoa thƣợc dƣợc (Dahlia pinnata Cav.) rất mẫn cảm với virus này. Đậu phộng đƣợc xem là ký chủ chính của virus này ở Úc và Hoa Kỳ. Cây bồ công anh (Taraxacum officinalis L.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), và nhiều loài cà hoang dại đều là ký chủ của TSWV. Cây cảnh và cỏ dại thƣờng là nguồn chứa TSWV. Ở những vùng có mùa đông băng giá thì cây kí chủ đa niên là nguồn chứa TSWV đáng kể, các vùng có mùa đông mát mẻ thì cây ký chủ hàng niên là nguồn chứa TSWV để lây lan cho cây trồng. Việc lây nhiễm nhân tạo trên Petunia là nhanh nhất, chính vì vậy nó là cây chỉ thị tốt cho TSWV. 2.2.1.5 Cấu tạo của TSWV Các phần tử virus bằng nhau về kích cỡ và có đƣờng kính khoảng 85nm. Đặc trƣng của những phần tử TSWV là vỏ lipid chứa 2 loại glycoprotein G1 và G2 bao quanh một genome RNA gồm ba phần đã đƣợc đóng gói chặt chẽ bởi nhiều bản sao của tiểu đơn vị nucleoprotein (N) và 10 - 20 bản sao của protein lớn (L) là polymerase của virus (Van Poelwijk và cộng sự, 1993). Bộ gen virus là RNA chia thành 3 phần, là loại ambisense ssRNA chứa 5 gen mã hóa ít nhất 6 protein cấu trúc của virus: - LRNA (dài 8.897 nucleotide) là RNA lớn nhất. Đó là sợi negative sense và là sợi đơn cistron. LRNA mã hóa cho RNA polymerase phụ thuộc RNA. - MRNA (4.821 nucleotide) mã hóa 2 protein vỏ (G1 và G2) và một protein phi cấu trúc đƣợc xem nhƣ là protein di chuyển từ tế bào đến tế bào (NSm). - SRNA (2.916 nucleotide) mã hóa nucleoprotein (N) và một protein phi cấu trúc thứ 2 (NSs). 10 RNA có những trình tự cuối bổ sung từng phần, cho phép RNA thích nghi với sự thành lập vòng giả (Elliott và cộng sự,2000). Bộ gen của virus mã hóa cho 6 protein đặc biệt: - RNA polymerase (330kDa) đƣợc mã hóa bởi LRNA. - Protein NSM (34kDa) có mặt trong sự di chuyển từ tế bào virus sang tế bào chủ, đƣợc mã hóa bởi MRNA sense. - Glycoprotein G1 (78kDa) và G2 (58kDa) nhô ra trên bề mặt của virus, đƣợc mã hóa bởi MRNA sense bổ sung. - Protein NSS (52kDa) đƣợc mã hóa bởi SRNA sense (chức năng chƣa biết). - Protein N (29kDa) là protein cấu trúc bao phủ đoạn RNA genome tạo ra nucleocapside, đƣợc mã hóa bởi sợi RNA sense bổ sung (Hull, 2002). 2.2.1.6 Tính chất của virus TSWV TSWV có nhiệt độ Q10 là 41,2oC, độ pha loãng tối thiểu (DEP) là 1: 10-5, thời gian sống trong in vitro (LIV) của nó ở 24oC từ 2 đến 5 giờ, điểm nhiệt độ virus không hoạt động (TIR) là 40 - 46oC. Virion đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của cây chủ, trong tế bào chất. Thể vùi có trong tế bào nhiễm, có hình dạng bất thƣờng. Những cụm viron hay không bào có thể nảy chồi từ túi chứa dịch của lƣới nội chất. 2.2.1.7 Vector truyền Tất cả virus đều kí sinh bắt buộc, có nghĩa là chúng không thể sống sót ở bên ngoài kí chủ và lan truyền bởi hạt hay côn trùng. TSWV đƣợc mang bởi bọ trĩ (thrips). Chúng là những côn trùng cực nhỏ (khoảng 0,5mm) sống ở trên hoa, lá và đất. Có chín loài bọ trĩ đƣợc xem là vector truyền TSWV. Trong đó, có những loài quan trọng nhất vì chúng phân bố rất rộng rãi, đó là: Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), F. schultzei (Trybom), F. fusca (Hind), Thrips tabaci Lind. Vì sự phân bố rộng của Western Flower Thrip (Frankliniella occidentalis), Onion thrips (Thrips tabaci) nên chúng đƣợc xem là vector chính của bệnh. Sự nhiễm tự nhiên trên đồng ruộng gây ra bởi bọ trĩ theo kiểu bền vững (Hình 2.1). Bọ trĩ đẻ trứng trong những mô mềm của thân, lá hay hoa. Ấu trùng vừa nở ra (có màu vàng) bắt đầu ăn ngay. Khi ấu trùng ăn mô bị nhiễm khoảng 15 phút, chúng thu virus vào 11 bên trong. Thời gian ăn kéo dài thì khả năng mang virus tăng lên. Ấu trùng phát triển đầy đủ sẽ chui vào đất (sâu khoảng 8cm) và trở thành nhộng, không ăn nữa. Sau đó chúng trƣởng thành, có cánh, nhô lên khỏi mặt đất. Ấu trùng bọ trĩ chƣa lan truyền bệnh cho cây ngay đƣợc mà phải chờ đến khi chúng trƣởng thành. Có 2 lý do để cần thời gian này: (1) phải có thời gian để virus di chuyển bên trong cơ thể bọ trĩ, chúng đi từ miệng vào tuyến nƣớc bọt, khi đó chúng sẵn sàng cho sự truyền qua một cây khác; (2) bọ trĩ non không có cánh nên khó có cơ hội di chuyển từ cây này sang cây khác và hầu nhƣ hoàn toàn không thể tiếp cận đƣợc những cây mới trồng ra ruộng. Những con bọ trĩ trƣởng thành có thể mang virus suốt đời nhƣng không truyền cho giai đoạn trứng. Thế hệ kế tiếp mang virus bằng việc ăn cây bị nhiễm. Thời gian từ trứng đến giai đoạn trƣởng thành có thể thay đổi do nhiều yếu tố, ngƣời ta xác định đƣợc là 14 ngày ở 29,5oC đối với Western Flower Thrip. Hình 2.1 Chu trình sống của bọ trĩ (Nguồn: T.A. Zitter and M.L. Daughtrey và J.P. Sanderson, 1989.) Câu hỏi đặt ra là TSWV có đƣợc truyền qua hạt không? Ngƣời ta đã chứng minh rằng cây nhiễm TSWV không thể truyền virus sang hạt của nó và hạt nhiễm virus là do từ bên ngoài (Y. Antignus et al, 1997). 2.2.1.8 Điều kiện phát triển của bệnh do TSWV Theo Best, ánh sáng mặt trời ngăn cản sự hình thành vết hoại tử. Do đó, khi cây đƣợc chiếu sáng liên tục cây sẽ ít bệnh hơn và thời điểm xuất hiện bệnh cũng trễ hơn. Bệnh thích nghi với điều kiện thời tiết ấm áp (đối với các nƣớc nhiệt đới là thời tiết mát và ẩm). Nhiệt độ cao, ẩm độ thấp là điều kiện rất bất lợi cho bọ trĩ. Mƣa nhiều và to trong mùa đông cũng làm giảm số bọ trĩ xuống mức thấp. Thời tiết ấm áp và khô là điều kiện tốt nhất cho bọ trĩ sinh sản. Bệnh trở thành dịch trong suốt giai đoạn sinh trƣởng sinh 1. Trứ ng 2. Ấ u trùng (thu virus) 3. Nhộ ng (không ă n) 4. Nhộ ng (không ă n) 5. Bọ trĩ trư ở ng thành (truyề n virus) 12 dƣỡng của cây, giai đoạn mà virus đƣợc bọ trĩ lan truyền từ cây này sang cây kia dễ dàng. Theo nhận định của các nhà nghiên cứu thì nhiệt độ bình quân trong ngày vào khoảng 25 oC kết hợp với lƣợng mƣa giảm là điều kiện tối ƣu cho bọ trĩ lẫn TSWV phát triển. Virus này có thể qua đông trên nhiều loại cây trồng. Thrips tabaci qua đông dƣới dạng thành trùng, nằm trong đất. Vào mùa xuân khi thời tiết ấm áp, bọ trĩ di chuyển từ cỏ dại chờ cơ hội tấn công cây trồng. Ngƣời ta thấy rằng, các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của côn trùng môi giới trong việc di chuyển từ cây này sang cây khác có lẽ quan trọng hơn kích thƣớc quần thể côn trùng. Bởi vì chỉ cần một côn trùng mang mầm bệnh cũng có thể gây bệnh cho cây. Theo Selman và Grant, sự thay đổi độ dài ngày không ảnh hƣởng đến thời gian ủ bệnh của triệu chứng toàn diện nhƣng nhiệt độ thì có ảnh hƣởng. 2.2.1.9 Triệu chứng bệnh Triệu chứng cây nhiễm TSWV rất đa dạng, thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trƣởng của cây, điều kiện môi trƣờng (nhất là nhiệt độ), mức độ lây nhiễm, số lƣợng và thành phần các nòi virus cùng phối hợp gây hại cho cây ký chủ. Cây bệnh có triệu chứng là: lá non thƣờng chuyển màu vàng và sau đó phát triển nhiều vết đen nhỏ, đốm tròn. Sau đó những đỉnh đang sinh trƣởng có thể chết và gốc có thể có sọc. Những cây bị nhiễm thƣờng phát triển một bên hay bị còi cọc (lùn) và rũ xuống. Triệu chứng này có thể giống với bệnh do nấm, vi khuẩn hay stress do môi trƣờng. Nếu chỉ dựa vào triệu chứng mà xác định bệnh thì có thể dẫn đến kết quả không chính xác. Cây bị nhiễm vào đầu mùa có thể không cho quả và những cây bị nhiễm sau khi đã tạo quả sẽ cho quả rất nhỏ. Biểu hiện triệu chứng của trái bệnh là ở trái xanh có nhiều vùng có vòng tròn đồng tâm mờ, có vết tròn mất màu xanh, ở trái chín những vòng này chuyển sang màu đỏ trắng hay đỏ vàng rất dễ quan sát. 2.2.1.10 Khống chế bệnh do TSWV Hai phƣơng pháp chung đƣợc sử dụng là sử dụng cây kháng TSWV và chiến lƣợc quản lý nhằm giảm tác hại của virus. Cây kháng Sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép thúc đẩy quá trình nhận dạng, chọn lọc và lai tạo cây mới. Những marker phân tử liên kết với tính kháng TSWV đã đƣợc tìm thấy 13 trong những dòng cà chua phát triển từ những dòng lai giữa SW 307 (Brommonschenkel, Tanksley và Cho, chƣa xuất bản) và cây kháng TSWV với những khoảng cách liên kết nhỏ nhất đƣợc chọn lọc. Trong tƣơng lai, sử dụng những cây này cùng với những marker liên kết sẽ thúc đẩy sự phát triển tính kháng cho những cây cà chua thƣơng mại khác với khoảng cách liên kết nhỏ nhất (10). Một số giống cà chua lai kháng TSWV sẵn có trong thƣơng mại: - Giống Amelia (HMX - 0800) do công ty Harris Moran Seed cung cấp. Đặc tính của giống này là trái chín khá sớm, trái to, kháng TSWV, tuyến trùng, và 3 nòi nấm fusarium gây héo. Amelia đƣợc thử nghiệm ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher trên 3 năm gần đây và cho kết quả tốt. - Giống EX 1405037 do công ty Seminis Seeds cung cấp. Đặc tính của giống này là trái cà chua to, chín hơi trễ. EX 1405037 không cho kết quả tốt nhƣ Amelia ở Mountain Horticultural Crops Research Station ở Fletcher vào năm 2002 vì thời gian chín lâu hơn. - Giống BHN 444 và BNN 640 do Seigers và công ty hạt Seedway cung cấp. Đặc tính của giống BHN 444 là cho trái lớn nhƣng hình dạng trái hơi thô, giống BHN 640 có tính kháng với ba nòi nấm fusarium gây héo và kháng TSWV và trái của nó nhỏ hơn nhƣng bóng hơn BHN 444. Quản lý TSWV Hiểu biết rõ về mối quan hệ giữa kí chủ - ký sinh - vectơ sẽ giúp ta phát triển những biện pháp canh tác mà làm cho tổn thất do TSWV gây ra với những cây trồng nhạy cảm là nhỏ nhất. Không có biện pháp nào có hiệu quả đáng kể nếu sử dụng riêng rẽ. Ngƣời ta thƣờng kết hợp những biện pháp với nhau để giảm mức độ thiệt hại một cách đáng kể. Chiến lƣợc quản lý hiệu quả nhất là phòng ngừa, gồm những kỹ thuật sau: 1. Bảo vệ cây con: Cây con dễ bị nhiễm TSWV khi không đƣợc bảo vệ. Bọ trĩ sẽ tấn công vào những lá có màu xanh nhạt của cây non. Vì thế cây con cần đƣợc trồng ở những nơi có cây trồng nhạy cảm với TSWV nếu không thì nên trồng cây con trong nhà kính hoặc sử dụng màng che cẩn thận. Phun thuốc diệt côn trùng đều đặn có thể làm giảm khả năng sống của bọ trĩ trong vƣờn ƣơm. 14 2. Tránh trồng độc canh: Nên hạn chế việc trồng liên tục cùng một loại cây trồng trên cùng một vùng đất. 3. Luân canh: Tránh trồng những cây nhạy cảm với TSWV trong những vùng đang bị tác động mạnh của TSWV. Trồng những cây không nhạy cảm với TSWV vào vùng này trong khoảng 3 tuần để cho bọ trĩ đi ra khỏi vùng đó sẽ làm giảm tác hại của TSWV và cho phép trồng những cây nhạy cảm với TSWV hiệu quả hơn. 4. Loại bỏ những nguồn chứa TSWV: Cày lại đất ở nơi đã thu hoạch hay nơi đã từng bị bỏ hoang để loại bỏ nguồn chứa virus và nguồn thức ăn của bọ trĩ. 5. Quản lý cỏ: Có nhiều loại cỏ là kí chủ của TSWV, chúng đóng vai trò là nguồn chứa virus. Quan trọng là loại bỏ cỏ ngay thời điểm quần thể bọ trĩ thấp để giảm tối thiểu việc bọ trĩ tích lũy và di chuyển vào đồng ruộng. 6. Trồng cỏ trên đồng ruộng sẽ kích thích bọ trĩ trƣởng thành di chuyển đến. Vì thế, cần hạn chế điều này. 7. Trồng xen cây nhạy cảm với cây không nhạy cảm. Có rất nhiều cây không nhạy cảm với TSWV nhƣ: cây bông cải xanh, cải bắp, bí, dƣa chuột, hành, cà rốt, khoai lang. 8. Loại bỏ những cây có triệu chứng bệnh ngay lập tức. 9. Khống chế bọ trĩ bằng phƣơng pháp sinh học là hiệu quả nhất và có lợi cho môi trƣờng nhất. Bốn tác nhân sinh học đã đƣợc sử dụng. 15 (Nguồn:http//:www.substratus.com/sw8529.asp.tomato spotted wilt virus fact sheet.html). 1. Amblyserus cucumeris: Ăn chủ yếu ở giai đoạn ấu trùng của bọ trĩ (Hình 2.2). 2. Amblyseius degenerans: Tƣơng tự nhƣ Amblyserus cucumeris nhƣng di chuyển nhanh hơn và có thể sống đƣợc trong điều kiện độ ẩm thấp (Hình 2.3). 3. Hypoaspisspp: Là rệp cây ăn thịt, sống trong đất, ăn nhộng của bọ trĩ (Hình 2.4). 4. Orius insidiosus: Ăn tất cả các giai đoạn mà bọ trĩ có thể di động, nhạy cảm với ngày dài và phát triển ít nhất 13 giờ chiếu sáng/ngày (Hình 2.5). 2.2.2 Sơ lƣợc về Tobacco Mosaic Virus (TMV) 2.2.2.1 Lịch sử của bệnh do TMV gây ra Bệnh khảm thuốc lá đƣợc đề cập đến từ năm 1857. Đến năm 1892 virus TMV đƣợc nhà bác học Nga Ivanopski phát hiện. Lúc đó ông đang nghiên cứu về bệnh hoa lá thuốc lá và phát hiện thấy một loại “nguồn gây bệnh” không nhìn thấy dƣới kính hiển vi quang học và có thể lọt qua ống lọc vi khuẩn. Năm 1898, nhà bác học Đan Mạch M. Baijerinck cũng đã phát hiện và xác nhận nguồn gây bệnh đó đƣợc mang tên tƣợng trƣng là: “virus”, có nghĩa là “chất độc”. Đến năm 1939, Kaushe Pfankuch và Ryska sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát thấy virus đó là TMV. Nhƣ vậy, virus TMV là virus thực vật đƣợc phát hiện sớm nhất. Kể từ đó, việc nghiên cứu và phát hiện nhóm nguyên nhân gây Hình 2.2 Amblyserus cucumeris Hình 2.3 Amblyseius degenerans Hình 2.4 Hypoaspis aculeifer Hình 2.5 Orius insidiosus 16 bệnh mới này đƣợc phát triển nhanh chóng và thu đƣợc nhiều thành tựu to lớn. Virus này đƣợc nhận biết sớm nhất là do nó có thể nhiễm vào cây dễ dàng, thể hiện triệu chứng bền vững và dễ nhận ra. 2.2.2.2 Phân loại của TMV TMV chƣa đƣợc xếp vào họ nào. TMV thuộc giống Tobamovirus, thuộc loài Tobacco Mosaic Virus. 2.2.2.3 Sự phân bố của TMV TMV có thể phân bố rộng khắp thế giới. Ngƣời ta đã tìm thấy virus này ở: châu Âu, Argentina, châu Úc, Đan Mạch, Pháp, Hungary, Iceland, Ấn Độ, Italy, Nhật Bản, Kenya, Hà Lan, Peru, Tây Ban Nha, Anh , Mỹ. 2.2.2.4 Ký chủ của TMV TMV có thể lây nhiễm cho hơn 30 họ cây thực vật hạt kín, chúng tấn công vào những cây có tầm quan trọng về kinh tế nhƣ: cà chua, ớt, cà tím, thuốc lá, cây dã yên (petunia), và cây cúc vạn thọ (marigold). 2.2.2.5 Đặc điểm cấu tạo của virus TMV Virion của TMV không có vỏ. Nucleocapsid hình gậy, thƣờng là thẳng, dài khoảng 300nm, có đƣờng kính khoảng 18nm. Có thể quan sát đƣợc trục của nó, có đƣờng kính là 2nm, vòng xoắn ốc của nó cao 2,3nm (Hình 2.7). Trọng lƣợng phân tử của virion là 49.800.000. Chúng có thể kết tinh và tích lũy trong dịch cây với nồng độ khá cao: 1g/lít. TMV sinh sản tốt ở nhiệt độ 24 - 30oC. TMV bị phân hủy ở pH 11, mẫn cảm với tia Rơnghen. Virion chứa 5% nucleic acid. Virion chứa chỉ một phân tử RNA positive - sense sợi đơn thẳng. Chiều dài tổng cộng của genome là 6.395 nucleotide (Goelet và cộng sự, 1982). Tỷ lệ cơ bản của các nucleic acid là 25,4% Guanine; 29,8% Adenine; 18,5% Cytosine; 26,3% Uracil. Đầu 5’ của genome có mũ, trình tự là m7G5’ppp5 (’Gp). Genome TMV thiếu vùng poly A ở đầu 3’. Đầu 3’ có cấu trúc giống tRNA (nhận histidine). Nucleic acid không thuộc genome của virus không đƣợc tìm thấy trong virion. Sub - genomic mRNA đƣợc tìm thấy trong những tế bào nhiễm. 17 Virion của TMV chứa 95% protein. Genome của TMV mã hóa cho 6 protein bao gồm: - 2 Replicases có trọng lƣợng là 126kDa và 183kDa. + Protein 126kDa có 2 vùng: Vùng có khả năng gắn mũ ở đầu cuối N (có lẽ cần cho sự gắn mũ) có cấu trúc bậc hai đặc trƣng của methyltransferase và guanylyltransferase. Vùng thứ hai giống nhƣ helicase ở đầu C. Hoạt động helicase sẽ cần để loại bỏ cấu trúc bậc hai của RNA khuôn mẫu. Nhƣng hoạt động helicase vẫn chƣa đƣợc chứng minh. (Armando de Menezes Neto, 2005.) + Thêm vào 2 vùng của replicase 126kDa, protein 183kDa có vùng thứ ba: vùng chứa motif của RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp). Có lẽ nó cung cấp hoạt động xúc tác cho sự tổng hợp RNA. - Protein di chuyển (Movement Protein) (MP) có kích thƣớc 30kDa, có đuôi 264 amino acid và có hoạt tính sinh học khi đƣợc phosphoryl hóa. - RNA polymerase: kích thƣớc 54kDa. - Charged protein có kích thƣớc rất nhỏ, chỉ gồm 40 amino acid. - Protein vỏ (Coat Protein) (CP): kích thƣớc 17,5kDa. Đây là protein đƣợc biết đến nhiều nhất của TMV, có đuôi 159 amino acid (17,5kDa). Protein bao quanh toàn bộ genome và bảo vệ RNA khỏi sự phân hủy bên trong và bên ngoài tế bào. Các protein vỏ này gắn kết với toàn bộ khối RNA của TMV. Virion của TMV không chứa lipid. Ngƣời ta tìm thấy dấu vết của ion kim loại trong phân tử virion. Nucleic acid có khả năng nhiễm. Genome tái bản trên những cấu trúc màng trong tế bào chất. Protein đƣợc tổng hợp bởi ribosome thuộc tế bào chất. Vị trí lắp ráp cho đến nay vẫn chƣa đƣợc biết. Protein vỏ đƣợc dịch bởi mRNA trong tế bào chất. 18 Hình 2.6 A, B: virion của TMV; C,D: tinh thể TMV. (Nguồn : 2.2.2.6 Tính chất của TMV Tỷ trọng nổi là 1,325g/cm3 trong CsCl (sau khi cố định với formaldehyde). Điểm đẳng điện ở pH 3,5. LIV: 3000 ngày. DEP: log10 chia cho 3 - 6. Khả năng nhiễm qua nhựa không thay đổi khi xử lý với di - ethyl ether. Khả năng nhiễm vẫn duy trì khi phân giải với protease, hay xử lý với phenol hoặc chất tẩy rửa. TMV ở dạng kết tinh thành tinh thể hình lục giác và tinh thể giữ tính độc rất lâu, sau 25 năm vẫn còn khả năng xâm nhiễm gây bệnh. Sinh sản mạnh ở 24 - 30oC, nếu nhiệt độ đến 37 - 38oC thì TMV không sinh sản nữa và ứng với lúc đó cây khó biểu hiện triệu chứng bên ngoài. Virus chết khi sấy lá bệnh ở 140oC trong 30 phút. Nhiệt độ làm mất hoạt tính: (Q10) Q10TMV = 93 oC. Ngƣỡng pha loãng của TMV : 10-6. A B 19 Các chỉ tiêu về tính chống chịu trên có thể dao động đôi chút do phụ thuộc vào các chủng virus khác nhau và các điều kiện với mức độ chính xác khác nhau. 20 2.2.2.7 Đặc điểm truyền bệnh của TMV TMV có khả năng xâm nhiễm cao. TMV từ những cây khô có thể gây nhiễm đến 50 năm. Bệnh truyền nhiễm dễ dàng qua con đƣờng tiếp xúc cơ học, thông qua các vết thƣơng xây xát. Virus vận chuyển trong cây theo mạch dẫn. Thời kì tiềm dục ở nhiệt độ 30 oC là khoảng 5 ngày, trung bình 8 - 14 ngày, ở nhiệt độ thấp là 2 tháng. Bệnh phát triển mạnh và thể hiện triệu chứng điển hình khi nhiệt độ 25 - 30oC, nếu nhiệt độ cao hơn 38oC hay thấp hơn 18oC thì ít bệnh. Khi đó, cây sinh trƣởng tốt hơn. Bón đạm nhiều, cây sinh trƣởng phát triển mạnh, sẽ có nhiều mô non và mềm, làm cho bệnh nặng hơn. Cây dƣ ẩm, mọng nƣớc dễ nhiễm bệnh hơn. Bệnh lan nhanh vào giai đoạn nhổ cây con, trồng trọt, xới và ngắt ngọn. Cách thức lây lan là chỉ tiêu tối cần cho việc xác định từng loại virus. TMV có thể lây lan từ sự tiếp xúc giữa các lá cây với nhau (Zaitlin và Israel, 1975). 2.2.2.8 Sự phát sinh phát triển của TMV Virus không tồn tại trong hạt giống. Sự nhiễm vào hạt dễ dàng xảy ra trong quá trình thu hạt từ phần thịt của quả cà chua. Vì thịt của cà chua là nơi mà virus TMV đƣợc phóng thích ra từ quả bị nhiễm, rồi chúng dính vào bề mặt hạt và không gây ra tác động gì trong nhiều tháng. Có khoảng 94% hạt cà chua mang TMV. Virus tồn tại trong cây bệnh tồn dƣ, chƣa phân hủy nằm trong đất. (Technical bulletin: greenhouse crop manageenzymt series. Virus có thể kết tinh trong lá khô rụng trong đất, trong thuốc lá điếu và trong nhiều ký chủ khác nằm trong 36 họ cây trồng nhƣng chủ yếu là cây họ cà. Phần lớn sự lây nhiễm bệnh khảm do TMV ngoài đồng ruộng đều bắt nguồn từ tàn dƣ của vụ trƣớc hoặc từ cỏ dại. Hiện nay, TMV đã tạo thành dịch bệnh trên cà chua và ớt chủ yếu là do sự truyền bệnh dễ dàng qua cơ học và qua cây bị nhiễm còn sót lại trong đất. Nhựa cây bị nhiễm rất dễ truyền bệnh do nồng độ TMV trong tế bào cây cao. Thƣờng thì nhiễm TMV bắt nguồn từ cây con và trồng từ cây con thì bị bệnh nhiều hơn trồng trực tiếp bằng hạt. 21 Ngƣời ta thấy rằng bào tử động của nấm Olpidium brassicae cũng truyền loại virus này. Một số cây dùng làm cây chỉ thị cho TMV là cây rau muôi (Chenopodium quinoa), cây cà độc dƣợc (Datura stramonium). 2.2.2.9 Triệu chứng bệnh do TMV Mức độ biểu hiện triệu chứng TMV trên lá cà chua phụ thuộc vào tính nhạy cảm của cây, tính độc của dòng virus, giai đoạn phát triển của cây và điều kiện môi trƣờng. Trong nhà kính, triệu chứng biểu hiện rõ ràng hơn trên đồng ruộng. Vào mùa đông khi mà cƣờng độ ánh sáng thấp, ngày ngắn, nhiệt độ dƣới 20oC làm cho cây thấp và lá vặn vẹo thành dạng lá dƣơng xỉ. Triệu chứng khảm cũng thƣờng đƣợc thấy trên lá non. Lá có những vùng xanh đậm và xanh nhạt. Vùng xanh đậm có xu hƣớng trở nên dày hơn vùng xanh nhạt (Hình 2.7). Lá non bị biến dạng, cong xuống. Cà chua bị nhiễm bởi những dòng TMV gây hoại tử hay nhiễm TMV cùng với những virus khác sẽ xuất hiện những vết hoại tử trên cây và cây chết từng phần. Những cây già có xu hƣớng hồi phục và phát triển tiếp tục mà không bị biến đổi gì nhiều. Một số cà chua có thể chống chịu với TMV. Khi đó triệu chứng biểu hiện nhẹ hơn, và sự nhiễm chỉ tạo ra tác động nhỏ đến sản lƣợng. Hình 2.7 Triệu chứng điển hình của TMV ở cà chua (Nguồn: UC IPM Pest Management Guidelines: Tomato Diseases, 2003). Ở bên trong tế bào, virion đƣợc tìm thấy trong tất cả các phần của tế bào chủ, trong tế bào chất và trong nhân. Virion có thể tìm thấy trong lục lạp. Thể vùi có mặt trong các tế bào nhiễm. Thể vùi là những tinh thể trong tế bào chất và những thể X vô hình. Thay đổi 22 khác của tế bào là lục lạp bị tàn phá khi cây bị nhiễm hệ thống. Sự thiếu lục lạp góp phần tạo ra những vùng có màu sáng hay những vùng bị mất diệp lục. Sự tàn phá mô lá và cấu trúc tế bào dẫn đến sự giảm quang hợp của cây. 23 2.2.10 Phòng trừ TMV - Phun sữa toàn phần lên cây có thể bảo vệ cây không bị nhiễm TMV trong 10 ngày. Nên phun trƣớc khi trồng cây khi mà không thể ngăn công nhân sử dụng thuốc lá. Phun với nồng độ khoảng 0,5kg sữa khô trong 4 lít nƣớc ngay trƣớc khi trồng cây. - Chỉ sử dụng hạt khỏe mạnh để sản xuất cây con trong vƣờn ƣơm. Bất hoạt TMV dính trên bề mặt trái bằng cách nhúng hạt trong dung dịch HCl 2% trong khoảng 24 giờ hay dung dịch Trisodium phosphate (Na3PO4) 10% trong ít nhất là 15 phút hoặc xử lý hạt ở nhiệt độ cao (85oC trong 24 giờ hay 70oC trong 2 - 4 ngày) trong quá trình thu hạt, sau đó rửa và làm khô hạt để ngăn chặn những tác động có hại cho phôi bởi những hóa chất ăn mòn. - Không trồng cây con bị nhiễm. Những cây cà chua nhiễm nên đốt bỏ đi trƣớc khi trồng lại. - Suốt quá trình sản xuất cây con và trồng cây, những dụng cụ, trang thiết bị, quần áo có dính nhựa cây nên đƣợc làm sạch. Khử trùng dụng cụ chăm sóc bằng Focmalin 1: 25. Rửa tay bằng xà phòng, đặc biệt là sau khi tiếp xúc với cây bệnh. Cấm hút thuốc trong giờ làm việc vì TMV có thể nhiễm qua thuốc lá (những sản phẩm nhƣ thuốc điếu, thuốc nhai, xì gà). - Nhƣ tất cả các virus khác, không thể cứu cây khi cây nhiễm bệnh. Trƣớc hết cần chứa cây trong túi cẩn thận, rồi đem chúng ra vùng khác và hủy bỏ. Diệt các côn trùng hại. Tiêu diệt côn trùng chủ yếu là rệp - vectơ truyền bệnh - bằng một số thuốc hóa học nhƣ: Butyl 10 WP, Fenbis 25 EC, Sapen alpha 5 EC, Netoxin 18 DD. Không cần phun thuốc trừ bệnh vì không có hiệu quả. - Cần dọn sạch cỏ vì chúng là kí chủ cho TMV tồn tại. Cà chua không đƣợc trồng luân canh với cây họ cà: ớt, khoai tây, thuốc lá và một số hoa nhƣ petunia, begonia. - Chọn giống chống chịu bệnh, kháng bệnh. - Vệ sinh đồng ruộng: dọn sạch tàn dƣ cây bệnh, cỏ dại. Tiêu hủy sớm thân rễ của cây trồng vụ trƣớc. 2.2.3 Sơ lƣợc về Cucumber Mosaic Virus (CMV) 2.2.3.1 Lịch sử của bệnh do CMV 24 Bệnh khảm dƣa chuột đƣợc mô tả đầu tiên vào năm 1916 (Doolittle, 1916), là một trong số những bệnh cây sớm nhất đƣợc biết là do virus gây ra (Jagger, 1916). Những bài thuyết trình về bệnh này xuất hiện sớm ở Mỹ, sau đó ở châu Âu và châu Phi (Price, 1934) và các nƣớc còn lại trên thế giới. Trong thời gian đầu, những công cụ để xác định sự tồn tại của virus chuyên biệt rất hạn chế. Sau đó, CMV cũng đƣợc biết là do Cucumber Mosaic Virus (CMV) gây ra (Kaper và Waterworth, 1981). Một số lƣợng rất lớn những bài mô tả chi tiết về đặc điểm sinh vật học của CMV đƣợc xuất bản (Edwardson và Christie, 1991; Kaper và Waterworth, 1981; Palukaitis và cộng sự, 1992; Roossinck, 1999). Nhiều dòng CMV đã đƣợc mô tả. Dữ liệu di truyền hiện nay chứa trình tự của khoảng 60 protein khác nhau, và 15 trình tự genome virus hoàn chỉnh. CMV có 3 nhóm phụ là IA, IB và II với khoảng 25% trình tự nucleotide là khác nhau giữa chúng (Roossinck và cộng sự, 1999). Vì vậy, CMV là virus có khả năng thích ứng cao, với khả năng tiến hóa lạ thƣờng. Khả năng này làm cho nó vừa là mối đe dọa cho nông nghiệp thế giới, vừa là mô hình lý tƣởng cho nghiên cứu sự tiến hóa của những virus RNA. 2.2.3.2 Phân loại CMV Các tên khác nhau của virus này là: Banana Infectious Chlorosis Virus, Coleus Mosaic Virus (Creager, 1945; Holcomb và Valverde, 1991), Cowpea Banding Mosaic Virus, Cowpea Ringspot Virus, Cucumber Virus 1, Lily Ringspot Virus (Brierley và Travis, 1958), Pea Top Necrosis Virus, Peanut Yellow Mosaic Virus, Southern Celery Mosaic Virus (Doolittle, 1916; Price, 1935; Wellman, 1934), Soybean Stunt Virus (Hanada và Tochihara, 1982), Spinach Blight Virus, Tomato Fern Leaf Virus, Pea Western Ringspot Virus. Ngƣời ta thƣờng viết tắt là: CMV. Virus này thuộc họ Bromoviridae. Họ Bromoviridae gồm có 5 giống là Alfamovirus, Bromovirus, Ilarvirus, Cucumovirus, Oleavirus. Trong giống Cucumovirus có một loài là Cucumber Mosaic Virus. Virus này có nhiều dòng, những dòng đƣợc biết rõ là: A - CMV, E - CMV, L - CMV, N - CMV, P - CMV, Z - CMV và WAI/WAII. Dƣờng nhƣ những dòng này có 2 nhóm kháng nguyên là ToRS và DTL (Devergne, 1975), có 2 thành viên thêm vào của giống này là Peanut stunt virus (PSV) và Tomato aspermy virus (TAV). 25 RNA3 của tất cả các thành viên của giống có thể đƣợc trao đổi với nhau trong khi đó RNA1 và 2 chỉ có thể đƣợc trao đổi trong loài. Những trình tự tƣơng đồng cho thấy virus có quan hệ với Brome Mosaic Virus và trình tự của RNA1 và RNA2 cho thấy CMV có quan hệ với Alfalfa Mosaic Virus và Tobacco Mosaic Viruses (Rezaian và cộng sự, 1985; Davies and Symons, 1987). 2.2.2.3 Phạm vi phân bố CMV có thể phân bố khắp nơi trên thế giới. Ngƣời ta tìm thấy CMV ở: châu Âu, châu Úc, Canada, Pháp, Ấn Độ, Nhật Bản, Triều Tiên, Ma - rốc, New Zealand, Phần Lan, Tây Ban Nha và Mỹ. 2.2.3.4 Ký chủ CMV gây nhiễm trên 1.000 loài cây, gồm các thành viên của 85 họ thực vật. CMV là loài virus có dãy kí chủ rộng nhất đƣợc biết đến cho đến nay. Một trong số những cây rau cải quan trọng bị ảnh hƣởng bởi CMV là ớt (Capsicum annuum L.), cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.), chuối (Musa spp L.). Những cây ký chủ khác là: dƣa chuột, bí (squash), cần tây, tiêu, củ cải đƣờng, khoai tây, dƣa chuột ri, dƣa hấu, dƣa gang, thanh yên, cây bầu bí (gourd), đậu lima, đậu tằm, hành, cà tím, cây đại hoàng, cà rốt, cây thì là, cây củ cần, rau mùi tây (parsley) (Chupp and Sherf, 1960), cây mƣớp (Huang và cộng sự, 1987), cây atoso (Chabbouh and Cherif, 1990). Ký chủ là cây cảnh gồm: cây cúc tây (China aster), cúc (chrysanthemum), cây phi yến (delphinium), hoa xô đỏ (salvia), cây phong lữ (geranium), gilia, hoa lai ơn (gladiolus), cây vòi voi (heliotrope), lan dạ hƣơng (hyacinth), lily, cúc vạn thọ (marigold), cây sen cạn (nasturtium), cây dừa cạn (periwinkle), cây thuốc lá cảnh (petunia), cây giáp trúc đào (phlox), hoa mõm chó (snapdragon), tulip và cúc zinnia (Chupp and Sherf, 1960; Agrios, 1978). 2.2.3.5 Đặc điểm cấu tạo của CMV Dƣới kính hiển vi điện tử CMV có dạng hình cầu, đƣờng kính 28nm. Virion của CMV không có vỏ (Hình 2.8). Có nhiều loại virion nhƣng kích thƣớc tƣơng đối giống nhau. Các nucleocapsid của CMV giống nhau và không phát hiện đƣợc thông qua thuốc nhuộm. Có 32 capsomer trên một nucleocapsid. CMV có nhiều chủng loại gây bệnh trên 26 nhiều loại cây trồng khác nhau. Bao gồm các chủng Y, M, S, Q. Chúng khác nhau về đặc tính sinh học. 27 Hình 2.8 Cấu tạo của CMV (Nguồn: Smith, T, J., Chase, E., Schmidt, T., Perry, K., 2000). Virion chứa 18% nucleic acid. Virion chứa 3 đoạn RNA sợi đơn positive - sense thẳng (RNA1, RNA2 và RNA3). Phân tử lƣợng 5,8 - 6,7x10-6. Cucumovirus cần 3 RNA sợi đơn có chức năng để gây nhiễm là RNA 1, 2 và 3. Chiều dài tổng cộng của genome là 8.621 nucleotide. Đoạn RNA lớn nhất có kích thƣớc là 3.383 nucleotide (RNA1); đoạn thứ 2 là 3.012 nucleotide (RNA2); đoạn thứ ba là 2.199 nucleotide (RNA3); đoạn thứ tƣ là 1000 nucleotide (RNA4). MRNA mã hóa cho protein vỏ (RNA4, một đoạn của RNA3). Tỷ lệ cơ bản của các nucleic acid là 24% Guanine; 23% Adenine; 23% Cytosine; 30% Uracil. Đầu 5’ của genome có một mũ hay còn gọi là protein liên kết với genome (VPg). Trình tự mũ là m7G5’ppp5 (trên cả 4 RNAs). CMV không có poly A ở đầu 3’. Đầu 3’ của tất cả các RNA của CMV đều có cấu trúc giống tRNA (cấu trúc nhận tyrosine). Không tìm thấy nucleic acid nào trong virion mà không thuộc genome của virus. Nucleic acid của genomic và subgenomic đều đƣợc đóng gói. Sub - genomic mRNA đƣợc tìm thấy trong các tế bào nhiễm. Genome đƣợc chia thành ba loại phân tử khác nhau (mỗi loại chứa một phân tử RNA1, hoặc một phân tử RNA2, hay một trong hai phân tử RNA3 và RNA4). Mảnh RNA thứ tƣ (RNA4) mã hóa một protein là một protein vỏ đƣa tin, thành phần RNA thứ 5 là CARNA 5 (RNA5 kết hợp với CMV) nhƣng cũng đƣợc gọi là RNA vệ tinh Virion chứa 82% protein. CMV mã hóa cho 5 protein trên 3 RNA. RNA1 chỉ là RNA đơn cistron, mã hóa cho protein 1a. Protein này cần cho sự tái bản của virus và chứa methyl transferase và helicase motif (Kadaré và Haenni, 1997; Rozanov và cộng sự, 28 1992). RNA2 mã hóa cho 2a protein có kích thƣớc là 31kDa, một polymerase của virus (Ishihama and Barbier, 1994; O’Reilly và Kao, 1998), và 2b protein, đƣợc biểu hiện từ sự dƣ thừa của subgenomic RNA là RNA 4A (Ding và cộng sự, 1994). Khung đọc (ORF) 2b đƣợc đè lên (overprinted) đầu carboxy của khung đọc 2a. Khung đọc này không đƣợc tìm thấy trong tất cả các thành viên của giống Bromoviridae mặc dù có một khung đọc ở vị trí tƣơng tự đƣợc tìm thấy ở Tobacco streak virus, một thành viên của giống Ilarvirus. 2b protein của dòng CMV thuộc nhóm phụ thứ II đƣợc thấy là ức chế sự yên lặng sau dịch mã của ký chủ (post - transcriptional gene silencing (PTGS)) (Béclin và cộng sự, 1998; Brigneti., và cộng sự, 1998). RNA3 mã hóa cho protein di chuyển (movement protein) (MP) có kích thƣớc là 9,9kDa đƣợc biểu hiện từ đầu 5’ của khung đọc và protein vỏ (coat protein) (CP) đƣợc biểu hiện từ subgenomic RNA4. Cả hai protein này đều cần cho sự di chuyển của CMV (Canto và cộng sự, 1997). Virion không chứa lipid. Nucleic acid có thể gây nhiễm (không cần protein vỏ hay mRNA4 cho sự nhiễm). CMV có thể che dấu một phân tử ký sinh khác là RNA vệ tinh (satellite RNA (satRNA)). SatRNA của CMV không mã hóa một protein nào mà nó phụ thuộc vào RNA để có hoạt động sinh học. SatRNA của CMV là những RNA thẳng, nhỏ, không có khả năng mã hóa (Garcisa - Arenal và Palukaitis, 1999; Roossinck và cộng sự, 1992). 2.2.2.6 Tính chất lý hóa của CMV Tỷ trọng nổi là 1,367g/cm3 trong CsCl (sau khi cố định với formaldehyde). Điểm đẳng điện ở pH 5,5 (dòng Q). Tỷ số A260/A280 là 1,7. TIR: 55 - 70oC. LIV: 1 - 10 ngày. DEP: log10 chia cho 3 - 6. Khả năng nhiễm qua nhựa không thay đổi khi xử lý với di - ethyl ether. Khả năng nhiễm vẫn duy trì hoặc giảm khi phân giải với protease nhƣng vẫn duy trì khi xử lý với phenol hay chất tẩy rửa (detergent). 2.2.2.7 Sự truyền bệnh Virus truyền chủ yếu qua tiếp xúc cơ học từ cây bệnh sang cây khỏe thông qua vết thƣơng cơ giới. Virus truyền qua khoảng 10 loại Cucusta. Virus có thể truyền từ cây lâu năm và cây dại sang các cây trồng khác nhờ côn trùng môi giới. Chúng lan truyền chủ yếu nhờ rệp đào theo kiểu kém bền vững (Lucas, 1975; Agrios, 1997; Davis và Nielsen, 1999; Hull, 2002). Trên 60 loại côn trùng là vectơ 29 của virus này, gồm Acyrthosiphon pisum, Aphis craccivora và Myzus persicae (chúng truyền bệnh qua những gai nhỏ). Vì dãy kí chủ rộng của CMV mà nhiều loài cỏ có thể là nguồn chứa CMV và góp phần vào sự truyền bệnh của virus này. Nhìn chung CMV cần một thời kì tạo vỏ trong khoảng 1 phút nhƣng khả năng truyền bệnh giảm xuống và bị mất sau vài giờ. Hiệu quả truyền bệnh khác nhau tùy theo loại virus, dòng virus, loài cây kí chủ, điều kiện môi trƣờng và thời gian trong năm. Sự nhiễm virus của cà chua bởi rệp không phổ biến vì cà chua không phải là kí chủ yêu thích của rệp. Rệp thƣờng định cƣ trên dƣa chuột, dƣa hấu và bí. Ngƣời ta thấy, CMV đƣợc truyền dễ dàng bằng cơ học nhƣng vì không phải là virus bền vững nhƣ TMV nên CMV không đƣợc truyền bởi những công nhân tiếp xúc với cây bệnh. CMV không truyền qua hạt cà chua. 2.2.2.8 Điều kiện phát triển của bệnh do CMV Nguồn bệnh có thể tồn tại quanh năm. Bệnh lan truyền mạnh vào mùa đông và mùa xuân khi rệp xuất hiện nhiều. Bệnh hại nặng trên một số cây rau vụ đông trồng muộn. Cây non mẫn cảm với bệnh hơn cây trƣởng thành. 2.2.2.9 Triệu chứng Hình 2.9 Triệu chứng điển hình của CMV ở cà chua (Nguồn: AVRDC - the World Vegetable Center, 2004). Triệu chứng của CMV có thể bị nhầm lẫn với các triệu chứng do virus khác gây ra nhƣ: TEV (Tobaco Etch Virus), TMV. Tuy nhiên, quan sát kỹ ta thấy trên lá cà chua triệu chứng biểu hiện rõ ràng hơn. Cà chua bị nhiễm CMV biểu hiện những thay đổi bệnh lý. Đầu tiên, trên lá xuất hiện đốm và khảm nhẹ, chúng tăng lên dần cùng với sự phát triển của bệnh. Những lá mới hình thành có hình dạng sợi kéo dài ra một cách bất thƣờng (thùy lá co lại hình sợi) (Hình 2.9). Triệu chứng này có thể tƣơng tự nhƣ triệu chứng gây ra bởi TMV - dạng lá dƣơng xỉ. Ở dạng lá dƣơng xỉ, phiến lá non không bị ức chế hoàn toàn nhƣ 30 ở dạng lá non có hình sợi nhƣng nó dài và hẹp bất thƣờng. Những triệu chứng gây ra bởi CMV có thể là triệu chứng chuyển tiếp: lá ở tầng dƣới và lá non ở trên đỉnh có biểu hiện triệu chứng nặng; ngƣợc lại lá ở tầng giữa có thể biểu hiện bình thƣờng. Cây bệnh có màu vàng, lùn, khoảng cách giữa các đốt ngắn lại. Những dòng độc có thể gây ra hoại tử dọc theo mạch dẫn của lá, những sọc hoại tử dọc theo thân và chết đầu rễ. Hoa bị biến dạng, thƣờng không cho quả. Nếu cây hình thành quả thì quả nhỏ, màu nhợt nhạt, lớn chậm. Nếu cây bị nhiễm cả CMV và TMV thì không đậu quả. Cây nhiễm bệnh càng sớm thì thiệt hại càng nặng. Mức độ thiệt hại phụ thuộc vào số cây bị nhiễm. SatRNA có thể có ảnh hƣởng rất lớn lên triệu chứng gây ra bởi CMV từ yếu cho đến nghiêm trọng (Yoshida và cộng sự, 1985). Một vài RNA vệ tinh có tác động tăng cƣờng triệu chứng nhƣ cây lùn hơn hay có loại RNA vệ tinh gây mất diệp lục, có loại gây hoại tử nghiêm trọng. Một vụ bùng phát mạnh của những vết bệnh lý bị hoại tử nặng đã ảnh hƣởng đến hàng ngàn hecta cà chua ở miền Nam của Ý vào năm 1988 gắn liền với sự xuất hiện của CMV và RNA vệ tinh. Mặt khác nhiều vệ tinh lại loại bỏ một phần hay toàn bộ triệu chứng bình thƣờng của CMV tạo ra một cây bị nhiễm nhƣng trông vẫn khoẻ mạnh. Bên trong tế bào, virion đƣợc tìm thấy trong không bào và trong tế bào chất của cây. Thể vùi có mặt trong các tế bào nhiễm. Thể vùi là những tinh thể trong tế bào chất (thƣờng có hình thoi, hình lục giác hay hình cầu) hoặc xuất hiện nhƣ những thể rỗng, chúng chứa virion. 2.2.2.10 Phòng trừ - Dùng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh. - Vì hầu hết sự nhiễm ban đầu đều xuất phát từ những cây cỏ lâu năm nên việc loại bỏ những cây cỏ này thì có lợi hơn là phun thuốc diệt côn trùng. Việc loại bỏ những cây cỏ lâu năm hay cây hai năm chính đang sống ở gần cây trồng có thể làm giảm áp lực lên virus. Áp dụng thuốc diệt côn trùng và xịt dầu khoáng đƣợc sử dụng để khống chế virus này cũng nhƣ những virus đƣợc truyền theo kiểu không bền vững khác. - Loại bỏ cây bệnh. 31 - Phun thuốc trừ rệp. Khử trùng phƣơng tiện thu hái. Hạn chế gây vết thƣơng, xây xát trong quá trình chăm sóc. - Chăm sóc để cây sinh trƣởng phát triển tốt, bảo vệ cây, tránh nhiễm CMV vào giai đoạn cây con. 2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh virus trên thực vật 2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: Nhóm chỉ thị theo bộ phận và nhóm chỉ thị theo hệ thống. Trong đó, nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC. Nhóm chỉ nhóm thị theo hệ thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên toàn cây. 2.3.2 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng chỉ thị màu Đây là phƣơng pháp chẩn đoán có độ chính xác thấp, thƣờng chỉ đạt 70 - 90%. Chính vì vậy phƣơng pháp này chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán ban đầu. Phổ biến là phƣơng pháp nhuộm màu bằng sunfat đồng. Các tế bào của cây họ bầu bí, cà khi bị nhiễm bệnh sẽ bị nhuộm màu nâu đỏ còn tế bào của cây khỏe chỉ có màu nâu hay không nhuộm màu. Ngƣời ta thƣờng dùng CuSO4.5H2O 3% để chẩn đoán cây nhiễm CMV. 2.3.3 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng Triệu chứng ngoài: Các triệu chứng phổ biến là cây lùn hoặc thấp, khảm, vàng úa, úa vàng mạch dẫn, sáng gân lá, đốm vòng, chết hoại lƣu dẫn hoặc chết tế bào, biến dạng lá hoặc thân, khối u bên ngoài trên lá hoặc rễ, nứt cánh hoa hay hoa. Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi. 2.3.4 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kháng huyết thanh Nguyên tắc của phƣơng pháp là khi đƣa một protein lạ vào cơ thể động vật, cơ thể động vật sẽ sinh ra một kháng thể để chống lại sự xâm nhập đó, gọi là phản ứng miễn dịch 32 của cơ thể động vật. Ứng dụng phản ứng miễn dịch này, ngƣời ta đã đƣa những kháng nguyên virus thực vật vào cơ thể động vật rồi lấy kháng huyết thanh ra để thực hiện việc chẩn đoán, phát hiện bệnh hại thực vật. Các phƣơng pháp chẩn đoán bằng huyết thanh thông thƣờng nhƣ làm phản ứng trên lam kính hiển vi, làm phản ứng kết tủa trong ống nghiệm, làm phản ứng huyết thanh trên nền thạch, phƣơng pháp khuếch tán gel miễn dịch và phƣơng pháp điện di miễn dịch. Phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym (enzym linked immunosorbent assay - ELISA) có độ tin cậy cao hơn phƣơng pháp huyết thanh thông thƣờng. Thực chất, ELISA là phƣơng pháp kháng huyết thanh cao cấp, sử dụng kháng thể globulin và nghiên cứu chẩn đoán protein. Kháng thể sẽ đƣợc cố định trên bề mặt giếng trong một đĩa (microtitre plate) và dịch chiết từ cây đƣợc cho vào giếng. Nếu virus đang nghiên cứu có mặt trong cây thì nó sẽ kết hợp với kháng thể đã đƣợc cố định trên bề mặt. Bất kỳ phần nào của dịch chiết mà không đƣợc kết hợp sẽ bị rửa trôi đi trƣớc khi thêm kháng thể thứ cấp vào. Kháng thể thứ cấp cho phép phát hiện virus một cách gián tiếp bởi vì có một enzyme dính vào. Enzyme này sẽ tác động lên một cơ chất (substract) và làm đổi màu của cơ chất. Sự thay đổi màu này sẽ đƣợc phát hiện bằng máy đo ảnh phổ (spectrophotometer). Sử dụng phƣơng pháp ELISA có các thuận lợi nhƣ: - Đơn giản: Chỉ sử dụng đĩa ELISA và một vài thiết bị liên quan. - Nhanh - Rẻ - Có thể sử dụng kit. Hiện nay, hầu nhƣ ngƣời ta chỉ sử dụng kit. - Có thể kiểm tra nhiều mẫu cùng một lúc (27 mẫu với 1 lần lặp lại trên mỗi đĩa) Có 3 phƣơng pháp ELISA cơ bản. 2.3.4.1 Phƣơng pháp Direct ELISA. - Ƣu điểm: Đơn giản nhất - Nhƣợc điểm: 33 + Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thƣờng thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phƣơng pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope. + Tốn công: phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tƣợng. 2.3.4.2 Phƣơng pháp Indirect ELISA - Ƣu điểm: Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thƣơng mại hóa. - Nhƣợc điểm: Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tƣởng đƣợc. 2.3.4.3 Phƣơng pháp Sanwich ELISA. Có thể chia thành 2 hệ thống:  Direct Sanwich ELISA hay DAS - ELISA (Double antibody sandwich - ELISA) - Ƣu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau. - Vì phƣơng pháp này có ƣu điểm hơn hẳn những phƣơng pháp khác mà chúng tôi chọn phƣơng pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu. Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện. Mối quan hệ về kích thƣớc và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hƣởng đến thử nghiệm.  Indirect Sanwich ELISA Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể đƣợc gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên. Ngoài ELISA, còn hai phƣơng pháp đáng tin cậy nữa là: tissue blot immunoassay (TIBA) và quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor. 2.3.4.4 Tissue blot immunoassay (TIBA): Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện nhờ vào 34 mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA, nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit cũng đã sẵn có cho nhiều virus. 2.3.4.5 Quartz crystal microbalance (QCM) immunosensor Trong kỹ thuật phát hiện virus thực vật mới này, một đĩa tinh thể thạch anh đƣợc phủ với kháng thể chuyên biệt cho virus. Cho một điện thế qua đĩa sẽ làm cho đĩa hơi bị lệch vì ảnh hƣởng của áp lực điện. Sự hấp thu các phần tử virus lên bề mặt tinh thể sẽ làm thay đổi tần số dao động cộng hƣởng theo kiểu phụ thuộc vào nồng độ. Do đó, có thể định lƣợng virus. Phát triển kỹ thuật này với mục tiêu là độ nhạy của nó bằng ELISA nhƣng nhanh hơn ELISA và kinh tế. Có thể phát hiện ở nồng độ 1ng phần tử virus trong nhựa thô của cây. 35 2.3.5 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào trình tự của đoạn DNA. 2.3.5.1 Phƣơng pháp RFLP - PCR (Restriction Fragenzymt Length Polymorphirm - PCR) RFLP đƣợc sử dụng trong sự kết hợp với PCR để nhận dạng ra sự khác biệt giữa các virus dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của những vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn (restriction enzyme). Sau khi thực hiện PCR, sản phẩm khuếch đại sẽ đƣợc cắt với các enzym cắt giới hạn và kích thƣớc của các mảnh sẽ đƣợc phân tích qua điện di trên gel. RFLP - PCR là phƣơng pháp có thể đƣợc sử dụng để phân biệt những dòng virus khác nhau mà không cần cloning hay đọc trình tự. Hiệu quả của nó phụ thuộc vào sự đa hình trong những vị trí nhận biết của enzym cắt giới hạn (restriction enzyme). 2.3.5.2 Phƣơng pháp PCR hay RT - PCR RT - PCR (Reverse transcription - PCR) và PCR là 2 kỹ thuật quen thuộc dùng để phát hiện và nhận dạng virus RNA và virus DNA của cây. Quy trình này rất nhạy. Vì đối tƣợng nghiên cứu là RNA nên chúng tôi chọn phƣơng pháp RT - PCR để nghiên cứu. 2.3.5.3 Các kỹ thuật liên quan đến PCR khác Gồm có: Multiplex RT - PCR, Fluorescence RT - PCR using TaqmanTM technology, competitive fluorescence PCR, immunocapture PCR, nested PCR có các ứng dụng và mục đích riêng. 2.3.5.4 Phƣơng pháp sử dụng mẫu dò đánh dấu Sự lai của những mẫu dò (probe) DNA hay RNA cho thuận lợi là có thể phát hiện nucleic acid của virus ở cả 2 dạng sợi đơn và sợi đôi. Mẫu dò cDNA thì thích hợp hơn mẫu dò RNA khi cần phát hiện RNA virus vì thể lai RNA/RNA bền vững hơn thể lai DNA/DNA. Dịch chiết RNA từ mô bị nhiễm đƣợc chuyển lên màng và mẫu dò đƣợc lai lên đó để phát hiện. 2.3.5.5 Array Cả microarray và macroarray đều đƣợc sử dụng nhƣ là một công cụ để xem xét những thay đổi có liên quan ở mức độ biểu hiện toàn mRNA cũng nhƣ sự đa hình của 36 từng nucleotide đơn và tƣơng tác giữa ký chủ - tác nhân gây bệnh. Nhƣng có những giới hạn cho việc phát hiện virus thực vật. 2.4 Phƣơng pháp DAS - ELISA và phƣơng pháp RT - PCR 2.4.1 Phƣơng pháp DAS - ELISA DAS ELISA gồm sự dính thụ động của kháng thể vào pha rắn (đáy giếng). Những kháng thể này sau đó kết hợp với các kháng nguyên đƣợc thêm vào. Những kháng nguyên đƣợc pha loãng trong blocking buffer nhằm ngăn sự dính không chuyên biệt của chúng vào pha rắn. Ở đây, những phần của blocking buffer không nên chứa bất kỳ kháng nguyên nào mà có thể kết hợp với kháng thể bắt. Sau khi ủ và rửa, chỉ còn phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn. Kháng thể bắt sau đó đƣợc thêm vào. Do vậy, đây là sự kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích và kháng thể bắt. Kháng thể thứ hai này có thể giống kháng thể một hoặc khác về nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể. Sau khi ủ, rửa, thêm cơ chất vào và đọc trên máy đo quang phổ. Vì sử dụng một kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn về tính chuyên biệt và những thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt. Điều này giới hạn sự linh hoạt của phƣơng pháp, ví dụ nhƣ mỗi kháng thể đƣợc sử dụng phải đƣợc đánh dấu riêng (cho những kháng nguyên khác nhau). Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn về sự chuẩn bị kháng thể. Hệ thống cũng bị giới hạn ở chỗ kháng nguyên phải có ít nhất hai epitope vì cả hai kháng thể bắt và phát hiện đều kết hợp trực tiếp với kháng nguyên. Kháng thể bắt trên pha rắn và kháng thể phát hiện có thể chống lại những epitope khác nhau trên phức hợp kháng nguyên. Do đó, thuận lợi khi khảo sát sự khác biệt nhỏ giữa những kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể phát hiện và kháng thể bắt khác nhau. Việc sử dụng cùng một kháng thể bắt và phát hiện có thể dẫn đến vấn đề khi có giới hạn về vị trí gắn kết sẵn có cho sự phát hiện. Kích thƣớc và mối quan hệ không gian của các epitope trên kháng nguyên đích là rất quan trọng và có thể ảnh hƣởng mạnh đến thử nghiệm. 2.4.2 Phƣơng pháp RT - PCR 37 RT - PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA trên khuôn mẫu RNA, do một DNA polymerase là reverse transcriptase (RT enzyme) xúc tác. Tổng hợp cDNA (complementary DNA) trên khuôn RNA gồm ba bƣớc : - Bƣớc 1: Chiết xuất RNA tổng số, trong đó có RNA của virus. - Bƣớc 2: Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất nhờ reverse transcriptase. Tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm, primer để tổng hợp sợi DNA đầu tiên có thể đƣợc lai chuyên biệt với một gen đích hay có thể kết hợp với toàn RNA. Có ba loại primer có thể dùng trong tổng hợp cDNA. (1) Oligo (dT): kết hợp với đuôi poly A của mRNA của động vật hữu nhũ. (2) Primer chuyên biệt với trình tự đã chọn trên RNA đích. (3) Random hexanucleotide: có thể khởi đầu sự tổng hợp cDNA ở nhiều điểm trên RNA khuôn mẫu tạo ra nhiều đoạn bản sao của toàn phân tử RNA. Chúng hữu dụng khi RNA đích là quá dài hay chứa quá nhiều cấu trúc bậc hai đến nỗi sự tổng hợp cDNA không bắt đầu hiệu quả bởi oligo (dT) hay primer chuyên biệt. Trong hầu hết trƣờng hợp, mục đích của những nhà nghiên cứu là tạo cDNA ban đầu dài và chứa nhiều thành phần của phân tử bổ sung với trình tự RNA đích. Do đó primer chuyên biệt là lựa chọn tốt nhất. Tiếp đến là oligo (dT) cũng tốt cho sự lựa chọn. Random hexamer không chuyên biệt và tạo ra những phân tử cDNA dài, ngắn khác nhau đƣợc sử dụng khi những phƣơng pháp kia không hiệu quả. - Nhân sợi cDNA thứ nhất lên nhiều bản bằng PCR. Giai đoạn này gồm có 3 bƣớc nhƣ sau: + Denature (biến tính): Chuyển dây đôi thành dây đơn + Annealing (bắt cặp): Primer gắn vào vị trí trên dây khuôn mẫu có mã đối xứng với nó. + Extension (kéo dài): Kéo dài chuỗi mới nhờ enzyme polymerase. Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần, để tạo nhiều sản phẩm khuếch đại. Ba giai đoạn này xảy ra trong điều kiện nhiệt độ khác nhau (ví dụ: 94oC, 55oC, 72oC) với sự trợ giúp của enzyme polymerase. Sự lặp lại theo chu kỳ thƣờng xảy ra khoảng 30 lần để làm tăng các DNA muốn có khoảng 100 triệu lần, đủ để tăng hoạt một gen thành một khối lớn hơn rất 38 nhiều lần so với tổng số DNA ban đầu. Độ dài của DNA đƣợc khuếch đại tùy thuộc vào số đoạn và chiều dài của primer trong phản ứng, điều kiện chất buffer, nhiệt độ bắt cặp của primer. Thêm vào sự phát hiện virus, thuận lợi của phƣơng pháp này là sản phẩm khuếch đại có để đƣợc đọc trình tự để cung cấp dữ liệu xa hơn về kiểu của các dòng virus (strain type). Reverse transcriptase, là một DNA polymerase phụ thuộc vào RNA làm khuôn mẫu. Hiện có hai loại Reverse transcriptase đƣợc giới thiệu trên thị trƣờng : - AMV (Avian myeloblastosis virus) Reverse Transcriptase. - Mo - MLV Reverse Transcriptase (Moloney murine leukemia virus). Mo - MLV Reverse Transcriptase đƣợc dùng nhiều hơn đối với thực vật. Để tổng hợp DNA cần một đoạn primer gắn trên mẫu RNA làm chỗ khởi động. Chú ý, khi làm việc với RNA cần cẩn thận để tạo môi trƣờng không có ribonuclease. Ribonuclease hay RNAse có thể ở mọi nơi. RNAse rất bền và khó bị bất hoạt. Cần duy trì môi trƣờng không có RNAse từ giai đoạn tinh sạch RNA cho đến suốt quá trình phân tích. Phƣơng pháp nested - PCR Phƣơng pháp này sử dụng hai cặp primer gọi là primer ngoài và primer trong. Phƣơng pháp gồm 2 lần PCR. Lần 1 là PCR với cặp primer ngoài. Lần 2 là PCR sử dụng khuôn mẫu là sản phẩm của lần PCR 1. Mục đích của phƣơng pháp này là nhằm tăng số khuôn mẫu đúng ban đầu nếu khuôn mẫu ban đầu quá ít, đồng thời tăng độ đặc hiệu của sản phẩm thu đƣợc lên nhiều lần. 2.5 Một số kết quả nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về bệnh do CMV, TMV và TSWV gây ra trong thời gian gần đây 2.5.1 Ở nƣớc ngoài Có rất nhiều công trình nghiên cứu về ba bệnh do virus này gây ra: - R.T. Folkertsma, R.W. Goldbach, J. Hille vào năm 2001 đã Cloning và mô tả gen SW-5 của Lycopersicon peruvianum tạo ra tính kháng TSWV. 39 - M. T. Momol, J. E. Funderburk, S. Olson và J. Stavisky vào năm 2002 đã sử dụng lớp phủ phản chiếu tia UV để làm giảm số lƣợng bọ trĩ và do đó giảm sự truyền TSWV đồng thời sử dụng Acibenzolar - S methyl nhằm giảm tác động của TSWV khi áp lực nhiễm tự nhiên cao. - Ricardo B. Medeiros, Renato de O. Resende, và Antonio Carlos de Ávila vào năm 2004 đã chứng minh đƣợc Tomato Spotted Wilt Tospovirus kích hoạt hệ thống miễn nhiễm của vectơ Frankliniella occidentalis của nó. - Harald Jockusch, Christiane Wiegand, Birgit Mersch, và Daniela Rajes vào năm 2001 đã cho biết thể đột biến của TMV có protein vỏ nhạy cảm với nhiệt độ cảm ứng phản ứng sốc nhiệt (heat shock) ở lá thuốc lá. - F. L. Erickson, S. P. Dinesh - Kumar, S. Holzberg, C. V. Ustach, M. Dutton, V. Handley, C. Corr và B. J. Baker đã tìm hiểu về tƣơng tác giữa gen N của thuốc lá và TMV. Gen N của thuốc lá tạo phản ứng siêu nhạy cảm khi TMV xâm nhập vào cây thuốc lá. - Steve Whitham, Sheila Mccormick và Barbara Baker vào năm 1996 đã chuyển gen N của thuốc lá vào cà chua, tạo tính kháng TMV cho cà chua chuyển gen. - Ki Hyun Ryu, Chung - Ho Kim và Peter Palukaitis vào năm 1998 đã chứng minh rằng protein vỏ của CMV quy định dãy kí chủ của CMV khi nhiễm vào lúa mì. - Tomas Canto và Peter Palukaitis vào năm 1999 đã chứng minh rằng tính kháng CMV có trung gian là replicase không ức chế sự di chuyển của protein di chuyển của CMV. - Liang - Hui Ji và Shou - Wei Ding vào năm 2001 đã phát hiện rằng suppressor của RNA chuyển gen đƣợc mã hóa bởi CMV bị cản trở bởi tính kháng có trung gian là Salicylic Acid. 2.5.2 Ở Việt Nam Các nghiên cứu về bệnh virus còn khá mới, chỉ có một số nghiên cứu của trƣờng Đại học Nông Lâm trong những năm gần đây. - Nguyễn Ngọc Bích, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM vào năm 2003 đã bƣớc đầu nghiên cứu một số bệnh virus chính trên vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. Dùng DAS - 40 ELISA để chẩn đoán một số virus trên thuốc lá nhƣ TSWV, CMV, TMV đồng thời điều tra tình hình bệnh virus trên địa bàn tỉnh Tây Ninh. Kết quả cho thấy các virus này đang phát triển khá mạnh ở vùng thuốc lá tỉnh Tây Ninh. - Trần Thị Thu Hà, trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. HCM vào năm 2005 điều tra bệnh ne ngọn (TSWV) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) trong vƣờn nhân cây con tại tỉnh Tây Ninh. 41 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 3.1.1 Thời gian thực hiện đề tài Đề tài đƣợc tiến hành từ 15/02/2005 đến 30/08/2005. 3.1.2 Địa điểm thực hiện đề tài Điều tra lấy mẫu ở hai huyện Đơn Dƣơng (gồm 16 thôn thuộc 4 xã Lạc Lâm, Lạc Xuân, Thạnh Mỹ, KaĐô và thị trấn Dran) và huyện Đức Trọng (gồm thị trấn Liên Nghĩa, thôn Trung Hiệp xã Hiệp An, thôn Quảng Hiệp xã Hiệp Thạnh, thôn Tân Hiệp, thôn Nghĩa Hiệp xã Liên Hiệp và thôn Hạ) thuộc tỉnh Lâm Đồng. Đề tài đƣợc tiến hành ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật, trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.2 Vật liệu 3.2.1 Dụng cụ - Dụng cụ thu mẫu và điều tra gồm: Bảng mẫu câu hỏi điều tra, viết, nhãn, bao nylon, máy chụp ảnh, thùng giữ lạnh, đá khô, tủ âm. - Dụng cụ nghiền mẫu gồm: Cối, chày, nitơ lỏng. - Dụng cụ dùng cho ELISA, RT - PCR gồm: Đĩa ELISA 96 giếng, máy rửa đĩa ELISA, máy đọc kết quả ELISA, đĩa Petri, máy ly tâm, eppendorf, đầu tip, pipet man, petcher, máy PCR, tủ mát, tủ âm, tủ laminar, bồn ủ nhiệt, tủ ủ nhiệt, tủ sấy, tủ hấp (autoclave), máy điện di, bồn nhuộm Ethidium Bromide, máy chụp hình gel, máy in nối với máy ELISA. 3.2.2 Hóa chất - Bộ kit ELISA với đầy đủ các thành phần cần cho ELISA nhƣ buffer chiết mẫu, buffer load mẫu, buffer cho kháng thể, buffer cho conjugate (kháng thể gắn enzyme), buffer rửa, và substract buffer, kháng thể đa dòng tƣơng ứng cho từng loại virus, conjugate, dNPP (p - Nitrophenyl phosphate) do công ty BioRad cung cấp. 42 - Hóa chất cho RT - PCR gồm: lysis solution, low stringency wash solution, high stringency wash solution, elution solution, DNase dilution solution, DEPC (diethyl pyrocabonate), - mercaptoethanol, polyvinylpyrrolidone (PVP), ethanol, NaOH, EDTA, 5X iScript creaction mix, iScript reverve transcriptase, dNTP (deoxy nucleotide triphosphate), MgCl2, Taq polymerase, Taq 10X buffer, nƣớc không có nuclease, agarose, TAE 0,5X, ladder 100 do công ty BioRad cung cấp. 3.3 Phƣơng pháp 3.3.1 Điều tra và lấy mẫu - Công tác điều tra tình hình bệnh virus cà chua ở Lâm Đồng tiến hành nhƣ sau: + Liên hệ Phòng Nông Nghiệp, Chi Cục Bảo Vệ Thực Vật và Trung tâm Nông Nghiệp huyện để điều tra tình hình phân bố, diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên cà chua. Từ đó xác định địa bàn cần điều tra. + Điều tra tại các hộ nông dân có trồng cà chua theo mẫu điều tra đã chuẩn bị sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Chủng loại giống, kỹ thuật canh tác, tình hình sâu bệnh… - Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau: + Lấy 5 mẫu trên một ruộng dựa vào triệu chứng bệnh virus. Mẫu lá cà chua có biểu hiện triệu chứng, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận. + Mẫu đƣợc giữ lạnh trong khoảng 2 ngày và đem về phòng thí nghiệm bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi phân tích. 3.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.2.1 Chẩn đoán bằng DAS - ELISA: - Bƣớc 1. Cân 0,5 gam mẫu cho vào cối và cho vào 2,5 ml dịch trích mẫu. Chuyển mẫu đã nghiền vào eppendorf 1,5ml. Ly tâm 5000 vòng, 3 phút ở 4oC. Trữ trong tủ mát và tiến hành phản ứng ELISA trong vòng 24 giờ. - Bƣớc 2. Pha coating buffer vào kháng thể theo tỷ lệ cho sẵn. Cho vào mỗi giếng 100µl kháng thể đã pha với coating buffer. Cho vào hàng ngoài cùng 100µl nƣớc cất cho mỗi giếng. Ủ trong 2 giờ ở 37oC. - Bƣớc 3. Rửa 3 lần với nƣớc rửa bằng máy rửa ELISA. 43 BF: dị ch chiế t. PC: đố i chứ ng dư ơ ng. NC: đố i chứ ng âm. Không sử dụ ng. Nư ớ c cấ t. Vùng load mẫ u (số từ 1 đế n 27) - Bƣớc 4. Cho vào mỗi giếng 100µl mẫu theo sơ đồ. Mỗi mẫu 2 giếng (lặp lại thêm 1 lần). Cho đối chứng âm, đối chứng âm, và dịch trích vào vị trí quy định trên đĩa. Ủ qua đêm ở 4oC. - Bƣớc 5. Rửa 3 lần với nƣớc rửa bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 6. Pha conjugate buffer X1 vào kháng thể đã đƣợc gắn enzyme theo tỷ lệ cho sẵn trong kit. Cho vào mỗi giếng 100µl kháng thể đã pha với coating buffer. Ủ 2 giờ ở 37oC. - Bƣớc 7. Rửa 3 lần với nƣớc rửa bằng máy rửa ELISA. - Bƣớc 8. Pha Subtract buffer X1với pNPP. Cho vào mỗi giếng 100 l. - Bƣớc 9. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA và đọc giá trị OD sau 30 phút và sau 1 giờ 30 phút. Sơ đồ bố trí thí nghiệm: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 C Substrate BF 1 4 7 10 13 16 19 22 25 D Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 E Substrate PC 2 5 8 11 14 17 20 23 26 F Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 G Substrate NC 3 6 9 12 15 18 21 24 27 F Chú thích: 3.3.2.2 RT - PCR  Ly trích RNA Quá trình ly trích RNA thực hiện theo protocol ly trích của AurumTM total RNA mini Kit. Quy trình gồm có 15 bƣớc nhƣ sau: 1. Cắt mô thành những mảnh nhỏ (< 5mm), và nghiền thành bột mịn trong nitơ lỏng. 44 2. Chuyển khoảng 60 mg mô đã nghiền vào ống ly tâm 2 ml có nắp đậy. 3. Thêm 700 µl dung dịch ly giải (lysis solution) vào ống, và hút lên xuống bằng pipete để phá vỡ mẫu. Tạo hỗn hợp dung dịch ly giải nhƣ sau: Hút 500 l -mercaptoethanol cho vào 50 ml dung dịch ly giải. Hút 700 l dung dịch ly giải đã có - mercaptoethanol cho vào eppendorf mới, thêm 14 l PVP vào. 4. Ly tâm 3 phút và chuyển dịch nổi vào ống 2 ml có nắp. 5. Thêm 700 l ethanol 70%. Trộn kĩ bằng pipette cho đều. 6. Đặt dung dịch rửa trôi (elution solution) vào bồn ủ 70oC để làm ấm, chuẩn bị cho bƣớc 15. Đặt cột gắn kết RNA RNA vào ống rửa 2 ml không có nắp. 7. Hút 700µl dịch cho vào cột gắn kết RNA RNA, ly tâm 60 giây. Loại bỏ dịch trong ống rửa và đặt cột gắn kết RNA lại. Cho dịch còn lại vào cột, ly tâm 60 giây. Làm tiếp tục cho đến khi hết dịch. 8. Thêm 80 ml ethanol 95% vào dung dịch low stringency wash (20ml) có nồng độ 5X trƣớc khi dùng. 9. Thêm 700 l dung dịch low stringency vào cột gắn kết RNA RNA. Ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch trong ống rửa và đặt cột gắn kết RNA lại. 10. Thêm 250 l Tris 10mM, pH 7.5 vào DNAse I (đang ở dạng bột mịn) trộn nhẹ. 11. Hút 5 l DNAse vào 75 l dung dịch pha loãng DNAse trong tube 1,5 ml. Thêm 80 µl DNAse đã pha loãng vào đáy cột, ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch trong ống rửa và đặt cột gắn kết RNA lại. 12. Thêm 700 l dung dịch high stringency vào cột. ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch trong ống rửa và đặt cột gắn kết RNA lại. 13. Thêm 700 l dung dịch low stringency vào cột. Ly tâm 30 giây. Loại bỏ dịch trong ống rửa và đặt cột gắn kết RNA lại. 14. Ly tâm 1 phút để bỏ hết dung dịch rửa còn sót. 15. Chuyển cột vào tube ly tâm 1,5 ml có nắp. Hút 80 l dung dịch rửa trôi (elution solution) cho trực tiếp vào màng ở đáy cột, ủ 1 phút cho dung dịch thấm. Ly tâm 2 phút để rửa trôi RNA tổng số. 45 RNA tổng số có thể sử dụng ngay cho RT - PCR hay trữ ở 4oC.  Phản ứng reverse transcriptase (RT) tạo cDNA - Thành phần phản ứng RT: 5x iScript Reation Mix 4 µl iScript Reverse Transcriptase 1 µl RNA tổng số 5 µl Nƣớc không có nuclease 10 µl Thể tích tổng 20 l 46 - Chƣơng trình nhiệt: 5 phút 25oC 45 phút 42oC 5 phút 85oC Giữ ở 4oC Phản ứng PCR Sử dụng cặp primer bắt cặp trên trình tự base từ 4324 - 4768 là một phần trong gen mã hóa cho polymerase của TMV, có trình tự nhƣ sau: Sợi antisense 5’-TCA ACG AAA CAG CAA CAT CAC AAA-3’. Tm=57oC Sợi sense 5’-GGA AAC AAG GGC ATA GAA AGA CCA-3’. Tm=57oC (1) - Thành phần phản ứng PCR (các lần PCR chỉ thay đổi lƣợng cDNA). Thành phần Thể tích Nồng độ cuối 10x iTaq buffer 5 l 1X Primer xuôi 1 µl 400nM Primer ngƣợc 1 µl 400nM DMSO (dimethyl sµlfoxide) 1 µl 2% (V/V) dNTP 1 µl 200µM/ mỗi dNTP MgCl2 2,5 l 1,25mM cDNA (chạy 2 mẫu 1 và 2) 3/5 µl - iTaq DNA polymerase 0,5 µl 2,5U H20 33/35 l - Thể tích tổng 50 l - Các biến đổi về thành phần phản ứng giữa các lần PCR Lƣợng cDNA Thành phần khác Lần 1 5 l Không đổi Lần 2 5 l Không đổi Lần 3 5 l Không đổi Lần4 2 nghiệm thức: 3 l và 5 l Không đổi 47 Lần 5 2 nghiệm thức: 3 l và 5 l Không đổi Lần 6 5 l (cDNA từ RNA tách chiết lần 2) - Hóa chất mới - PCR trên cùng máy với lần PCR 3 - Chƣơng trình nhiệt: PCR Nhiệt độ (oC) Thời gian (phút, giây) Số chu kỳ Lần 1 94 94 68 68 68 4 3 phút 45 giây 30 giây 30 giây 7 phút 10 phút 1 30 1 1 Lần 2 94 94 54 68 3 phút 45 giây 30 giây 45 giây 1 15 94 52 68 45 giây 30 giây 45 giây 15 94 50 68 68 4 45 giây 30 giây 45 giây 7 phút 10 phút 15 1 1 Lần 3, lần 5, lần 6 94 94 54 68 3 phút 45 giây 30 giây 30 giây 1 15 48 94 52 68 45 giây 30 giây 30 giây 15 94 50 68 68 4 45 giây 30 giây 30 giây 7 phút 10 phút 15 1 1 Lần 4 94 94 54 65 3 phút 45 giây 30 giây 30 giây 1 15 94 52 65 45 giây 30 giây 30 giây 15 94 50 65 65 4 45 giây 30 giây 30 giây 7 phút 10 phút 15 1 1 Sử dụng 2 cặp primer khác để khuếch đại vùng chứa gen mã hóa cho protein vỏ của TMV, có trình tự nhƣ sau: Cặp primer ngoài (2): 5’CCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGG 3’ (bắt cặp với trình tự base từ 82 đến 106). Tm=64 o C. 5’CCCTCGCTTTATTACGTGCCTGCG 34’ (bắt cặp với trình tự base từ 1057 đến 1080). Tm=64 o C. Cặp primer trong (3): 49 5’ TACAAACGTGAGAGACGGAGGGC 3’ (bắt cặp với trình tự base từ 156 đến 178). Tm=64 o C. 5’ CGCGATCCAAGACACAACCC 3’ (bắt cặp với trình tự từ base từ 1007 đến 1026). Tm=59 o C. 50 - Thành phần phản ứng: T h ể tí ch tổ n g l) 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 2 5 2 5 cD N A h a y sả n p h ẩ m P C R ( l) 5 ( cD N A ) 2 ( P C R ) 5 ( cD N A ) 2 ( P C R ) 5 ( cD N A ) 5 ( cD N A ) 5 ( cD N A ) 2 ,5 ( cD N A ) 2 ,5 ( cD N A ) M g C l 2 ( l) 2 ,5 2 ,5 3 3 3 3 3 2 2 T a q ( l) 0 ,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5 0 ,3 0 ,3 D M S O ( l) 0 0 0 0 0 1 1 0 ,5 0 ,5 P ri m er n g ƣ ợ c ( l) 1 ( N g o ài ) 1 ( T ro n g ) 1 ,2 5 (N g o ài ) 1 ,2 5 (T ro n g ) 1 ,2 5 (T ro n g ) 1 (