Khóa luận Đánh giá hiệu quả tác dụng của một vài hợp chất tự nhiên chiết xuất từ thảo mộc trong điều trị bệnh phát sáng do vibrio harveyi trên tôm sú (penaeus monodon)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÝ THỊ THANH LOAN NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt bốn năm đại học giúp tôi có đủ khả năng để hoàn thành khóa luận này. Tiếp theo, tôi vô cùng cảm ơn cô Lý Thị Thanh Loan đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Uyên cán bộ nghiên cứu trong phòng Vi khuẩn của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã tận tình hướng dẫn tôi trong phần tiến hành các thí nghiệm. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các anh chị trong phòng Vi khuẩn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. Sau cùng, tôi xin cảm ơn các bạn của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như đã động viên, khuyến khích tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận. TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH NGHI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 7/2005. “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).” Hội đồng hướng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN Đề tài được thực hiện trên đối tượng là vi khuẩn Vibrio harveyi, được xem là một mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở tôm. Chúng thường gây ra tỷ lệ chết cao đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng của tôm, có thể lên đến 100%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp làm kháng sinh đồ để sàng lọc, tìm ra một hợp chất thảo dược có hiệu quả chống lại V. harveyi trong phòng thí nghiệm, kết hợp với việc bố trí thí nghiệm để kiểm tra tính hiệu quả thực tế của các loại hợp chất thảo dược này ngay trên tôm nuôi. Những kết quả đạt được: Sàng lọc và chọn ra được một hợp chất có hiệu quả chống lại V. harveyi tốt nhất trong bốn hợp chất thảo dược thử nghiệm (B2, L, L2 và M) là M. Hợp chất M cho hiệu quả tốt kháng được V. harveyi và giúp giảm tỷ lệ chết ở tôm khi cho tôm bệnh ăn thức ăn có trộn với hợp chất M ở nồng độ 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Quan sát kết quả bước đầu cho thấy hợp chất này không ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của tôm. ABSTRACT NGUYEN DINH NGHI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, July/2005. “EVALUATE THE EFFECT OF NATURAL SUBSTANCES EXTRACTED FROM HERBS IN CURING VIBRIOSIS (Vibrio harveyi) ON BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon). Guiding council: Dr. LY THI THANH LOAN The subject was studied on V. harveyi, has recognized as a devastating pathogen of shrimp. V. harveyi usually result in up to 100% mortality in larvae and postlarvae of Penaeus shrimp. In this research, A antibiogram method was used to screen herbal compounds possess antimicrobial activity against V. harveyi in vitro, combine with disposing experiments to test effectivity of herbal compounds on shrimp in vivo. Results: M compound was found out a highest effective compound against V. harveyi among 4 herbal compounds (L, L2, M and B2 compounds). M herbal compound showed activity against V. harveyi and decreased mortality of shrimp when shrimp fed on diets supplemented with 500 and 750 mg/kg body weight/day of M compound. And this compound didn’t have any damaging effect to the growing of shrimp. MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT .................................................................................................................. iv ABSTRACT ................................................................................................................. v MỤC LỤC .................................................................................................... vi, vii, viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................ ix DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ x DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... xi Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2 1.3. Nội dung ............................................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nuôi tôm ............................................................................................... 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới ............................................................... 3 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam ................................................................ 6 2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra ...................................... 9 ở tôm trên thế giới và tại Việt Nam 2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm ............................................. 10 2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi ................................................................... 10 2.2.2. Dấu hiệu bệnh .......................................................................................... 13 2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh ......................................................................... 14 2.2.4. Khu vực phân bố bệnh ............................................................................ 14 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm ....................................... 15 2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học ...................................................................... 15 2.3.2. Phương pháp mô học ............................................................................... 15 2.3.3. Phương pháp miễn dịch học .................................................................... 15 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .……........................... 15 2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị ...................................... 16 bệnh phát sáng trên tôm 2.4.1. Nhục đậu khấu ........................................................................................ 17 2.4.2. Cây Neem ................................................................................................ 18 2.4.3. Hương nhu tía .......................................................................................... 18 2.4.4. Cây sả ...................................................................................................... 19 2.4.5. Cây ổi ...................................................................................................... 20 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ................................... 21 ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn ................................ 22 đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ................................... 22 ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................... 26 3.1.1. Thời gian ................................................................................................. 26 3.1.2. Địa điểm .................................................................................................. 26 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu ....................................................................... 26 3.2.1. Vật liệu .................................................................................................... 26 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 26 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất ................................................................................ 26 3.2.3.1. Dụng cụ ........................................................................................ 26 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất ................................................................ 27 3.3. Phương pháp tiến hành ....................................................................................... 27 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm ........................................ 27 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi ............................................ 28 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ ......................................................... 29 theo phương pháp Mc Farland 3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab .................................................... 30 3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá ...................................... 32 lý của nước nuôi 3.3.2.5. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn ..................................... 33 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê ................................................. 34 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm .......................................... 36 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi ................................ 36 4.1.2. Kết quả thí nghiệm kháng sinh đồ ............................................... 37 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M .................................................. 37 4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab .............................................. 40 4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi ......................... 40 4.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm ............................................................. 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 43 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 45 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 50 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHIA: Brain Heart Infusion Agar COD: Chemical Oxygen Demand Ctv: cộng tác viên DMSO: Dimethyl Sulphoxide DNA: Deoxyribonucleic acid DO: Dissolved Oxygen ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays FAO: Food and Agriculture Organization MBV: Penaeus monodon Baculovirus MHA: Mueller Hinton Agar O/F: Oxidation/Fermentation test PCR: Polymerase Chain Reaction TCBS: Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar TSB: Tryptone Soya Broth VP: Voges Proskauer WSSV: White Spot Syndrome Virus YHV: Yellow Head Virus LD: Lethal Dose DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi ...................................................... 12 Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí ............................... 29 nghiệm Mc Farland Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh Vibrio harveyi ....................... 36 Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian ...................... 37 Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời ............................ 38 gian ở từng nồng độ thử nghiệm Bảng 4.4. So sánh hiệu quả giữa các nồng độ sau các khoảng thời .......................... 39 gian đối với V. harveyi Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm ........................ 40 Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm ................................................... 41 Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí ........................... 42 nghiệm DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối .................................................. 11 Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem ................................................................................... 18 Hình 2.3. Cây sả ........................................................................................................ 19 Hình 2.4. Cành và quả ổi ........................................................................................... 20 Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M ..................................................... 40 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nghề nuôi tôm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng nghề nuôi tôm hiện đại chỉ thực sự ra đời kể từ những năm 1930, khi các nhà khoa học Nhật Bản sản xuất được tôm giống nhân tạo. Nghề nuôi tôm cũng chỉ thực sự bùng nổ từ những năm 80 khi tôm giống đã được sản xuất ra với một số lượng lớn để cung cấp cho người nuôi (Trần Văn Vỹ và ctv, 1993). Nhưng hiện nay nhiều nơi trên thế giới, nghề nuôi tôm đang bị gây trở ngại bởi nạn dịch bệnh lay lan khắp nơi. Các dịch bệnh thường hay xảy ra đối với tôm là bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh MBV, bệnh do Vibrio, nấm… gây thiệt hại nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm. Một trong các bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do vi khuẩn phát sáng thuộc nhóm Vibrio, trong đó đáng chú ý là Vibrio harveyi. Chúng có thể gây bệnh qua tất cả các giai đoạn của tôm nuôi và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên tôm giống ở các trại sản xuất. Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện ở Australia, Ecuador, Ấn Độ, Indonesia, Philippines, Đài Loan và Thái Lan trên nhiều giống tôm khác nhau. Các sự giảm sút gần đây trong nghề nuôi tôm ở Việt Nam, Ấn Độ, Bangladesh, Philippines và Trung Quốc chủ yếu là do sự tác động của Vibrio (Fraser, 2005). Tôm nhiễm bệnh phát sáng do V. harveyi thường có các dấu hiệu biến ăn, bơi yếu, cơ thể chuyển sang màu trắng đục, có thể phát sáng và xuất hiện những vùng thoái hóa mô gan. Mật độ tôm thả nuôi cao, thức ăn giàu protein, môi trường ương trứng dưới mức thuận lợi đã tạo môi trường lý tưởng cho V. harveyi và gây ra tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100% (Fraser, 2005). Hiện nay có nhiều cách để ngăn chặn bệnh phát sáng trên tôm như sử dụng kháng sinh, dùng hoá chất để xử lý ao nuôi và sử dụng chế phẩm sinh học. Tuy nhiên do các mặt hạn chế và hiệu quả sử dụng của chúng không cao nên để giảm thiệt hại của bệnh phát sáng, người nuôi vẫn sử dụng các biện pháp phòng ngừa là chủ yếu. Nhiều nghiên cứu để tìm ra các biện pháp mới ngăn chặn bệnh phát sáng đã được tiến hành, trong đó người ta đã tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc sinh học hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Tuy nhiên các hợp chất này vẫn đang còn trong giai đoạn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Để có thể đưa vào ứng dụng trong sản xuất cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của chúng trong việc điều trị bệnh trên tôm. Hiện tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II, các cán bộ nghiên cứu đã tìm ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Bước tiếp theo trong nghiên cứu là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong việc điều trị trước khi đưa ra ứng dụng thực tế trong sản xuất. Đây cũng chính là nội dung thực hiện đề tài khóa luận, “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).” 1.2. Mục tiêu đề tài Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio harveyi gây ra trên tôm sú (Penaeus monodon). 1.3. Nội dung Phân lập dòng V. harveyi thuần trên mẫu tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối với vi khuẩn V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất thử nghiệm đối với V. harveyi gây bệnh trên tôm. Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nuôi tôm 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới Lịch sử nuôi cá và các loại thủy sản đã có từ rất lâu. Những tài liệu sớm nhất ghi chép về hoạt động nuôi trồng thủy sản ở Trung Quốc vào thế kỷ XII trước Công nguyên. Vào thế kỷ XV, cá Măng và các loài thủy sản khác bao gồm cả tôm biển được nuôi phổ biến trong những đầm nước lợ diện tích lớn tại Indonesia (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Nhưng nhìn chung nghề nuôi tôm chỉ mới bắt đầu phát triển nhanh từ những năm đầu thập kỷ 80 của thế kỷ XX và có thể chia nghề nuôi tôm trên thế giới thành 3 giai đoạn chính như sau (Nguyễn Thanh Phương, 2004): - Giai đoạn 1: Giai đoạn nghiên cứu và phát triển sau đó là sự phát triển nhảy vọt (từ những năm 60 đến những năm 80). Trong giai đoạn này tôm chủ yếu được nuôi quãng canh ven biển hoặc có thể là sản phẩm phụ của các ao nuôi cá măng, cá đối như ở Đài Loan, Philippines, Indonesia… Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành để cải tiến các kỹ thuật nuôi làm cơ sở phát triển cho nghề nuôi tôm sau này. - Giai đoạn 2: Nghề nuôi tôm gặp nhiều khó khăn (từ những năm 80 đến những năm 90). Giai đoạn này có nhiều trở ngại xảy ra liên quan đến bệnh tật, suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trường và mâu thuẫn về kinh tế xã hội. - Giai đoạn 3: Nghề nuôi tôm hiện nay và tương lai. Do những trở ngại trên, xu hướng hiện nay và trong thời gian tới là nuôi tôm theo hướng bền vững với sự đa dạng hóa đối tượng nuôi, cải thiện qui hoạch và quản lý trong phát triển. Dựa vào quy mô và kỹ thuật nuôi có thể chia các hình thức nuôi tôm thành 3 loại hình chính: quãng canh, bán công nghiệp và công nghiệp. Hình thức nuôi tôm quãng canh có trước tiên, hình thức nuôi này dựa hoàn toàn vào nguồn tôm giống và thức ăn có trong tự nhiên trong diện tích đầm nuôi lớn để thu sản phẩm. Đây là hình thức nuôi đạt năng suất thấp nhất. Do nhu cầu thị trường của con tôm tăng và những tiến bộ đạt được trong sản xuất giống tôm, hình thức nuôi tôm bán công nghiệp có thả giống và cho ăn bổ sung được hình thành vào khoảng hai thập niên qua, đạt được năng suất cao hơn. Gần đây, nuôi tôm công nghiệp được sự hổ trợ của công nghệ sinh học, trở thành nguồn cung cấp tôm chủ yếu cho thị trường xuất khẩu (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trên thế giới có hai khu vực nuôi tôm lớn: Tây bán cầu gồm các nước châu Mỹ La Tinh và ở Đông bán cầu gồm các nước Nam và Đông Nam Á. Năm 1997 khu vực Tây bán cầu, Ecuador đạt 130.000 tấn (diện tích nuôi là 180.000 ha), chiếm 66% tổng lượng tôm nuôi của khu vực. Cũng trong năm này, sản lượng tôm nuôi của khu vực Đông bán cầu đạt 462.000 tấn chiếm 70% tôm nuôi trên thế giới. Thái Lan là nước đứng đầu với sản lượng 150.000 tấn (diện tích nuôi 70.000 ha) chiếm 32,5% sản lượng của khu vực, kế đến là Indonesia, Trung Quốc, Ấn Độ, Bangladesh và Việt Nam (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Mặc dù bắt đầu muộn nhưng có thể nói nghề nuôi tôm đã phát triển khá nhanh và dần dần đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng ở vùng ven biển của nhiều quốc gia. Nhìn chung, ở các quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển, diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng. Một ví dụ điển hình là tại Trung Quốc, năm 1991, tổng diện tích nuôi là 140.000 ha, năm 1997 diện tích nuôi tăng lên 160.000 ha (Nguyễn Văn Hảo, 2000) và đến năm 2001 diện tích nuôi của Trung Quốc là 230.000 ha (Shenzhen, 2002). Theo số liệu của FAO, năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi của châu Á đạt 1,35 triệu tấn, chiếm khoảng 86% sản lượng toàn cầu, trong đó dẫn đầu là Trung Quốc với sản lượng đạt 390.000 tấn. Điều này cho thấy châu Á là khu vực có nghề nuôi tôm phát triển khá mạnh (Huỳnh Hữu Đức, 2004). Nhìn chung sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới không tăng đáng kể trong khoảng 10 năm qua từ 686.000 tấn vào năm 1993 lên 804.000 tấn vào năm 2000. Các số liệu thống kê của FAO cho thấy có sự tăng giảm không theo qui luật về sản lượng tôm nuôi trên toàn thế giới. Năm 1993 sản lượng giảm đến 24 % nhưng năm 1994 tăng đến 17%. Tuy nhiên, sản lượng tôm nuôi ở một số quốc gia lại tăng đáng kể. Việt Nam là một ví dụ điển hình về sự gia tăng sản lượng nuôi, từ năm 2001 đến 2003 thì tăng xấp xỉ 2 lần trong khi diện tích nuôi chỉ tăng 1,5 lần. Những quốc gia đứng đầu về sản lượng tôm nuôi là Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ, Ecuador, Indonesia và Trung Quốc. Những quốc gia này chắc chắn sẽ giữ vị trí đầu trong nhiều năm tới bởi lẽ họ vẫn giữ tốc độ phát triển về nuôi tôm. Tuy nhiên, cũng cần thấy rằng sản lượng tôm nuôi có thể bị biến động lớn vào bất kỳ thời điểm nào mà yếu tố dịch bệnh chi phối lớn nhất (Nguyễn Thanh Phương, 2004). Cho tới nay các loại giống tôm được đưa vào sản xuất ngày càng trở nên phong phú. Nhưng nhìn chung các nhà nuôi tôm tập trung chủ yếu vào các giống tôm sú và tôm thẻ chân trắng vì thị trường tiêu thụ các loại tôm này khá lớn. Tôm sú (P. monodon) chiếm hơn 50 % tổng sản lượng. Ở một số quốc gia như Thái Lan thì sản lượng tôm sú không tăng nhưng tôm thẻ chân trắng (P. vannamei) đang được đưa vào nuôi và sẽ đạt sản lượng lớn trong những năm tới đây. Những đối tượng tôm khác cũng có sản lượng đáng kể là tôm thẻ Trung Quốc (P. chinensis) và tôm thẻ Nhật Bản (P. japonicus) (Nguyễn Thanh Phương, 2004). Tổng thể trong những năm hiện nay thì nghề nuôi tôm đã có sự phát triển chậm lại mà chủ yếu là do sự bộc phát và lây lan của dịch bệnh, nhất là bệnh virus và vấn đề môi trường ở một số quốc gia. Ở một số quốc gia nuôi tôm phát triển khá nhanh trong các năm qua (Việt Nam), trong khi đó một số khác thì không phát triển, thậm chí còn giảm (Đài Loan, Trung Quốc,…) (Nguyễn Thanh Phương, 2004). Trong xu hướng phát triển bền vững nghề nuôi tôm thì diện tích nuôi tôm toàn thế giới sẽ không biến động lớn nhưng ở các quốc gia đang phát triển sẽ tiếp tục tăng (Việt Nam, Ấn Độ,…), do nhiều quốc gia đang phát triển xem sản xuất tôm là một ngành sản xuất quan trọng và mang lại hiệu quả kinh tế cao. Việt Nam là một ví dụ cho sự tiếp tục về phát triển nuôi tôm (Nguyễn Thanh Phương, 2004). Nuôi tôm trong xu hướng tới sẽ tập trung cải thiện kỹ thuật nuôi, nuôi tôm phát triển theo hướng bền vững và nuôi sản phẩm chất lượng cao. Hầu hết các quốc gia đều hướng tới xây dựng các qui trình nuôi tốt và vùng nuôi an toàn nhằm tạo sản phẩm phù hợp với yêu cầu thị trường ngày càng đòi hỏi chất lượng nghiêm ngặt. 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quãng Ninh ở phía Bắc đến Kiên Giang ở phía Nam, đây là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Nghề nuôi tôm ở nước ta đã có từ lâu đời nhưng trước đây chủ yếu nuôi theo hình thức dân gian quãng canh nên năng suất đạt được không cao. Về sau nhờ áp dụng những kỹ thuật tiến bộ, đặc biệt là những kỹ thuật về sản xuất giống, đã tạo ra cho nghề nuôi tôm ở nước ta có những bước tiến mạnh mẽ (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Dựa vào điều kiện sinh thái và khí hậu có thể chia các tỉnh có thể nuôi tôm sú ở nước ta thành 3 khu vực chính (Nguyễn Văn Hảo, 2000): Khu vực phía Bắc Khu vực này có mùa đông lạnh kéo dài, nhiệt độ nước thấp (thấp hơn 200C) nằm ngoài khoảng thích nghi của tôm sú (22 – 350C); cùng với sự biến động nhiệt độ lớn giữa các mùa đã hạn chế sự phát triển nuôi tôm sú ở các tỉnh phía Bắc. Năm 2003, tổng diện tích nuôi tôm của toàn khu vực là 41.372 ha (Bộ Thuỷ sản, 2004). Tại Hải Phòng, tôm sú đã được nuôi thử nghiệm đầu tiên vào năm 1989 nhưng hiệu quả đạt rất thấp. Năm 1991 – 1993 các mô hình thử nghiệm đã đạt hiệu quả nhất định và từ năm 1995 đến nay phong trào nuôi tôm sú ở Hải Phòng được nhân lên rộng rãi và mở ra triển vọng trở thành nghề nuôi chính. Quãng Ninh là một vùng đất có tiềm năng lớn để phát triển nghề nuôi tôm, với 22.300 ha diện tích mặt nước. Năm 2003, toàn tỉnh có 14.820 ha diện tích nước mặt đã được sử dụng nuôi thuỷ sản nước lợ, trong đó nuôi tôm chiếm 10.440 ha. Sản lượng tôm nuôi năm 2003 của toàn tỉnh đạt 17.260 tấn (Đào Văn Trí, 2004). Khu vực miền Trung Bờ biển miền Trung có mực nước ven bờ sâu, nền đáy cát và có ít sông lớn so với miền Bắc và miền Nam, do đó nước biển trong và ít bị ô nhiễm hơn bởi các chất thải công nghiệp, nông nghiệp và các loại khác. Tuy nhiên, hiện tượng bão lũ xảy ra vào những tháng cuối năm (tháng 9 – tháng 12) là hạn chế lớn cho nuôi trồng thủy sản tại vùng này. Năm 1988 – 1990, phong trào nuôi tôm mới bước vào thời kỳ chuyển từ nuôi quãng canh cải tiến đến nuôi bán công nghiệp. Miền trung là khu vực đi đầu trong lĩnh vực phát triển công nghệ nuôi tôm ở nước ta. Năm 1995 năng suất tôm nuôi trung bình mới đạt 415 - 1.144 kg/ha/năm. Năm 1996, một số mô hình nuôi công nghiệp ở Ninh Hòa, Nha Trang và Cam Ranh đã được triển khai và đạt được năng suất trên 5 tấn/ha/vụ. Năm 1997, mô hình nuôi công nghiệp của Thái Lan cũng đã được thử nghiệm thành công tại Ninh Thuận, Bình Thuận và đang có xu hướng nhân rộng ở khu vực miền Trung. Nuôi tôm sú bán công nghiệp đã được hầu hết các hộ nuôi tôm áp dụng góp phần tăng nhanh năng suất bình quân của khu vực. Khu vực phía Nam Đây là khu vực có vị trí địa lý, điều kiện thời tiết khí hậu và thổ nhưỡng thuận lợi cho phát triển nông nghiệp nói chung và cho nuôi trồng, khai thác thủy sản nói riêng. Thực tế khu vực phía Nam đã đóng góp hơn 80% vào sản phẩm thủy sản chung của toàn ngành hàng năm. Cà Mau là một trong các tỉnh có nghề nuôi tôm khá phát triển, trong những năm gần đây luôn là tỉnh đi đầu trong phát triển nghề nuôi tôm của cả nước. Năm 2003, diện tích nuôi tôm của toàn tỉnh Cà Mau đạt 224.000 ha chiếm gần 41% diện tích nuôi tôm của cả nước (Đào Văn Trí, 2004). Ðồng bằng sông Cửu Long là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển mạnh, tỷ lệ sản lượng tôm nuôi chiếm hơn 50% của cả nước. Năm 2003, tổng diện tích nuôi tôm của ĐBSCL là 476.582 ha chiếm 87,2% tổng diện tích nuôi tôm nước lợ của cả nước, chủ yếu ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Kiên Giang, Sóc Trăng và Bến Tre. Sản lượng tôm sú đạt được trong năm 2003 của cả vùng là 153.000 tấn chiếm 76,5% tổng sản lượng tôm nuôi của cả nước (Đào Văn Trí, 2004). Trong những năm qua, nghề nuôi tôm ở nước ta phát triển mạnh. Diện tích nuôi tôm gia tăng nhanh chóng từ 50.000 ha năm 1985 lên đến 295.000 ha năm 1998 với 30 tỉnh có nuôi tôm sú (Bộ Thủy sản, 1999). Năm 2003, tổng diện tích nuôi tôm của cả nước đã đạt 546.757 ha (Đào Văn Trí, 2004). Theo đó sản lượng hàng năm cũng có sự gia tăng đáng kể, năm 2003 tổng sản lượng tôm nuôi Việt Nam đạt 224.000 tấn tăng 11% so với năm 2002 (Huỳnh Hữu Đức, 2004). Hiện nay, về sản lượng các mặt hàng xuất khẩu, tôm chiếm khoảng 1/4, nhưng về giá trị lại chiếm tới 50% (Thái Thị Thanh Dương, 2004). Rõ ràng trong kim ngạch xuất khẩu của ngành thuỷ sản, tôm vẫn đang giữ một vị trí rất quan trọng. Và vì thế nghề nuôi tôm vẫn là một nghề khá hấp dẫn mang lại giá trị kinh tế khá cao. Năm 2004, xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam đã gặp rất nhiều khó khăn, từ vụ kiện chống bán phá giá tôm tại Mỹ đã tác động mạnh tới kim ngạch xuất khẩu chung của toàn ngành cũng như đe dọa tới sự phát triển của nghề nuôi tôm ở nước ta vì thị trường Mỹ chiếm tới 65% giá trị tôm xuất khẩu của Việt Nam. Bên cạnh đó, mặc dù Nhật Bản có nhu cầu nhập khẩu thuỷ sản, nhưng giá tôm sú xuất sang thị trường này đang giảm mạnh (Hà Yên, 2004). Do vậy, các doanh nghiệp xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam đã chuyển hướng sang thị trường châu Âu, Trung Quốc. Hiện Anh và Bỉ là hai thị trường nhập khẩu tôm chính của Việt Nam tại châu Âu, chiếm khoảng 40% tổng kim ngạch xuất khẩu sang thị trường châu Âu. Việc mở rộng thị trường tại châu Âu về phía Đông không chỉ đơn thuần gia tăng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam mà còn tạo ra thị trường mới cho các mặt hàng thuỷ sản giá thấp. Thị trường này cũng được đánh giá là nơi tiêu thụ cá nước ngọt tiềm năng. Tuy nhiên, hạn chế của thị trường mới là mức giá nhập khẩu thấp (Hà Yên, 2004). Bên cạnh khó khăn về thị trường tiêu thụ, đối với một quốc gia đang phát triển nghề nuôi tôm như Việt Nam thì các đòi hỏi của thị trường về sản phẩm chất lượng cao, phát triển bền vững, quản lý dịch bệnh, môi trường, giống chất lượng cao… sẽ là những khó khăn gặp phải trong quá trình phát triển. Trong đó đáng lo là vấn đề dịch bệnh lay lan đã kiềm hãm sự phát triển của nghề nuôi ở một số nơi trong nước. Vấn đề kỹ thuật thuật nuôi trong đó quản lý dịch bệnh, quản lý môi trường theo hướng sinh học, giống sạch bệnh hay giống kháng bệnh… là những hướng mà nghề nuôi tôm nước ta sẽ phải thực hiện trong tương lai. Việc giải quyết hiệu quả các vấn đề này đòi hỏi cần phải có thời gian cùng với những biện pháp chiến lược đúng đắn của nhà nước. Trong xu thế phát triển nghề nuôi tôm bền vững trong tương lai thì vấn đề chất lượng tôm sạch sẽ đặt lên hàng đầu. Việc đầu tư nghiên cứu và áp dụng các kỹ thuật tiến bộ đặc biệt là các thành tựu trong lĩnh vực công nghệ sinh học nên cần được tiến hành một cách hợp lý để góp phần ổn định sự phát triển của nghề nuôi tôm nhằm nâng cao chất lượng và sản lượng của tôm nuôi ở nước ta. 2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra ở tôm trên thế giới và tại Việt Nam Nghề nuôi tôm ngày nay đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng đem lại thu nhập khá cao cho nông dân. Có thể nói diện tích nuôi tôm hàng năm càng gia tăng, tuy nhiên khi diện tích nuôi càng mở rộng thì rủi ro trong nghành nuôi tôm càng gia tăng, điển hình là sự gia tăng của các mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất. Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. Tại Việt Nam trong hai năm 1994 – 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Báo cáo kết quả nuôi trồng thuỷ sản năm 2003 của ngành đã đưa ra vài con số: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh, thành ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều, chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước (Hà Anh, 2004). Bệnh truyền nhiễm được xem là yếu tố quan trọng nhất góp phần làm giảm sút sản lượng tôm nuôi. Việc khống chế các mầm bệnh bằng cách dùng hóa chất theo phương pháp truyền thống cho thấy ngày càng mang lại hiệu quả thấp đối với các mầm bệnh mới xuất hiện. Ngược lại công nghệ sinh học ngày càng gia tăng vai trò hữu hiệu của mình trong chẩn đoán các mầm bệnh, giải thích rõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh. Hiện nay bệnh truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn phát sáng và nhóm virus MBV, YHV và WSSV được xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm nhất làm ảnh hưởng đến sản lượng tôm nuôi hàng năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Trước đây, nhóm Vibrio được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội. Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra cho thấy loài này dường như được xem là vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải là vi khuẩn cơ hội. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100% (Lightner và ctv, 1988). Trong năm 2003, thiệt hại do V. harveyi gây ra cho nghề nuôi tôm của toàn thế giới là 800 triệu USD, trong đó chỉ tính riêng ở Thái Lan, thiệt hại đã là 160 triệu USD (Fraser, 2005). Trong 30 chủng nghi ngờ thu được từ ấu trùng bị bệnh phát sáng tại Khánh Hòa, người ta nhận thấy V. harveyi chiếm ưu thế với tần số bắt gặp là 14/30 (46,67%), sau đó đến V. parahaemolyticus 6/30, chiếm 20%. Ngoài ra còn gặp V. vulnificus 3/30 (10%), đây cũng chính là những loài vi khuẩn đã được nhiều tài liệu thông báo là tác nhân gây bệnh phát sáng ở tôm sú ấu trùng (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2002). 2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm 2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi Nhóm Vibrio phát sáng là 1 phần của hệ vi sinh vật tự nhiên khu trú ở vùng biển ven bờ, được tìm thấy trên bề mặt và cả bên trong ruột của các động vật sống ở biển. V. harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên V. harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm (Lý Thị Thanh Loan, 1999). V. harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae. Đặc điểm chung của V. harveyi là: vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển. V. harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển nào, nó di chuyển bằng roi (Sung và ctv, 2001). Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V. harveyi trên môi trường BHIA thấy khuẩn lạc phát ra các ánh sáng xanh nhạt. Hình 2.1. Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối (Zhang, 2001) V. harveyi có khả năng kháng chịu rất nhiều loại kháng sinh thông thường như erythromycin, penicillin, streptomycin và sulfadiazine (Nguyễn Phương Lan, 1992). V. harveyi có khả năng tổng hợp enzyme catalase nên không bị tiêu diệt bởi H2O2 (Vattanaviboon và Mongkolsuk, 2001). Các đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi được trình bày trong bảng sau: Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi (John và ctv, 1994) Đặc điểm V. harveyi Nhuộm gram - Di động + Thử Oxydase + Phát sáng + Phát triển ở 40C - Phát triển ở 300C + Phát triển ở môi trường 0%NaCl - Phát triển ở môi trường 3%NaCl + Phát triển ở môi trường 7%NaCl + Phát triển trên TCBS xanh Thử O/F Glucose +/+ Thủy phân Arginine - Thủy phân Lysine + Thủy phân Orinithine - Sử dụng Citrate - Urease - Khử Nitrate + Indol + Sinh H2S - Methyl red + Vosges – Proskauer - Dịch hóa Gelatin + Acid hóa Glucose + Acid hóa Inositol - Acid hóa Mannitol + Acid hóa Sucrose - Hiện nay vẫn chưa biết rõ về cơ chế gây bệnh của V. harvaeyi, Liu (1997) cho rằng protease, phospholipase hoặc hemolysin có thể giữ vai trò quan trọng trong việc gây bệnh, trong đó protease cystein giữ vai trò là ngoại độc tố chính đối với tôm. Montero và Austin (1999 ) cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên độc tố gây chết của V. harveyi dòng E2 đối với tôm. Nhìn chung hemolysin của vi khuẩn đã được coi là yếu tố quan trọng của các Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ (Zhang, 2001). 2.2.2. Dấu hiệu bệnh Cần phân biệt rõ sự phát triển bệnh trên tôm. Nếu trong bể tôm có các đốm sáng lớn trên những con tôm chết, đó là do các tập đoàn Coccobacilli tấn công vào các con gây chết phát sáng, hiện tượng lâm sàng này không quan trọng. Khi nước biển xử  lý không tốt sẽ thường gặp hiện tượng này. Nếu  phát sáng trên các con sống, đốm sáng rất nhỏ bên trong cơ thể của tôm thì đó là bệnh do V. harveyi và V. splendidus gây nên (Phạm Văn Tình, 2000). Dầu hiệu bên ngoài Dấu hiệu để nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi hoặc bỏ ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu hồng. Tôm bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân (quan sát đuợc trong bóng tối), có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và vỏ, gan tôm bị teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%) và có thể tăng lên nếu trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001). Khi tôm nhiễm khuẩn toàn thân, thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Lý Thị Thanh Loan, 1999). Ấu trùng có thể chết từ rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn tiền ấu trùng (Zoae, Mysis) (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001). Dấu hiệu mô học Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột thấy dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy (Lý Thị Thanh Loan, 1999). Tôm giống dưới 45 ngày nuôi bị nhiễm bệnh phát sáng có biểu hiện tế bào ống bên trong gan tụy bị phá hủy. Chỗ lõm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch cầu và các tế bào sợi. Tế bào biểu mô bị hoại tử và vi khuẩn tập trung từng đám trong Lumen. Quan sát ở những tôm nhỏ hơn thì thấy sự phá hủy ở các mô nhiều hơn (Lý Thị Thanh Loan, 1999). 2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh Bệnh phát sáng trên tôm thường xảy ra trong tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).  Vibrio phát sáng xâm nhập vào bể ương qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn và dụng cụ sản xuất. Bệnh có thể lây nhiễm từ các trại giống, ao ương sang ao nuôi thịt. Phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, chất thải đáy ao tích tụ nhiều. Thường thấy ở những vùng có độ mặn cao, phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30 – 35‰. Ở dưới 5‰ hầu như không thấy bệnh này xuất hiện. Bệnh có thể xuất hiện ở pH từ 7,5 – 9, bệnh có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động mạnh... Các vi khuẩn gây bệnh có thể có trong nguồn nước cấp vào ao nuôi (Harris và ctv, 1996). 2.2.4. Khu vực phân bố bệnh Bệnh phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới. Đặc biệt tại các trại sản xuất tôm giống. Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông và vùng nước lợ. Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn của các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Fraser, 2005). Theo một số tài liệu của Phillipine, Thái Lan và Indonesia, Vibrio gây bệnh phát sáng cũng được tìm thấy trong nước biển vùng ven bờ, nhất là những nơi có hàm lượng chất hữu cơ cao và có nhiều xác động thực vật chết sau chu kỳ “nở hoa”. Số lượng vi khuẩn Vibrio thường tăng vọt trong và sau mùa mưa, nhất là các tháng 10 – 12. Vì vậy vùng gần bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla – Pitogo và ctv, 1998). 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm 2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học Nuôi cấy tăng sinh khối trong môi trường canh TSB, phân lập giống thuần trên môi trường TCBS, quan sát chọn những khuẩn lạc phát sáng trên đĩa cấy, cấy tăng sinh các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường BHIA, sau đó định danh vi khuẩn bằng các phản ứng sinh hóa theo khóa phân loại Bergey (Jonh và ctv, 1994). Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản, dễ thực hiện và ít tốn kém. Tuy nhiên nó có nhược điểm là mất nhiều thời gian để thực hiện. 2.3.2. Phương pháp mô học Tìm thấy các vi khuẩn hình que trong các mẫu mô tôm bệnh khi quan sát dưới kính hiển vi. Phương pháp này đòi hỏi người thực hiện phải có chuyên môn và kỹ thuật cao (Lý Thị Thanh Loan, 1999). 2.3.3. Phương pháp miễn dịch học Kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assays) có thể được sử dụng để phát hiện bệnh phát sáng do V. harveyi trên tôm. Phương pháp này được thực hiện dựa trên nguyên tắc bắt dính đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể. Phương pháp này có thể xác định nhanh V. harveyi từ mẫu tôm, mẫu nước và có thể xác định tất cả các dòng V. harveyi (Robertson và ctv, 1998). 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) Hiện nay có thể dùng kỹ thuật khuếch đại DNA để chẩn đoán nhanh bệnh do Vibrio trong vài giờ mà không phải mất nhiều thời gian để phân lập vi khuẩn. Nguyên tắc của phương pháp này là phát hiện một đoạn DNA đặc hiệu cho V. harveyi (Ruiz và Smith, 2005) Tuy phương pháp này cho phép xác định nhanh tác nhân gây bệnh nhưng chi phí để thực hiện lại quá tốn kém và đòi hỏi phải đầu tư trang thiết bị cao. 2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm Ngày nay, việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm đã kéo theo các tác động xấu ảnh hưởng đến môi trường và sức khỏe của con người. Theo xu thế phát triển nghề nuôi tôm trong tương lai, vấn đề chất lượng sạch của tôm nuôi ngày càng được quan tâm đến, kéo theo là việc người ta phải tìm ra các phương pháp mới để thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh trong việc điều trị bệnh cho tôm. Từ rất lâu, ông cha ta đã biết sử dụng nhiều loại thực vật thuộc các loài thảo dược trong thiên nhiên trong việc trị bệnh cho người và các loài vật nuôi. Đây được xem là một nguồn cung cấp dược liệu quý và phong phú cho nền y học của nhân loại. Nhận thấy được tiềm năng của các cây thảo dược, nhiều nhà khoa học đã tập trung vào nghiên cứu các hợp chất chiết suất từ thảo dược với hy vọng tìm ra các bài thuốc mới dùng trong việc điều trị bệnh cho tôm. Thấy được tiềm năng thay thế cho các loại hóa chất và kháng sinh của thảo dược, nhiều công trình nghiên cứu bước đầu đã được tiến hành nhằm tìm ra các hợp chất thảo dược có khả năng ngăn chặn được bệnh phát sáng trên tôm do Vibrio. Năm 2003, Wijayati bước đầu đã sàng lọc và kiểm tra hoạt tính diệt khuẩn của các dịch chiết bằng methanol từ một số loài cây thảo dược đối với 2 loài V. paraheamotilicus và V. harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ. Kết quả cho thấy các dịch chiết bằng methanol của 3 loại thảo dược là cây sả (Cymbopogon citrates), cây Neem (Azadirachta Indica) và cây ổi (Psidium guajava) đều có hoạt tính kháng khuẩn chống lại các mầm bệnh kể trên. Nồng độ tối thiểu chống lại V. harveyi của các dịch chiết từ lá của cây sả, cây Neem và cây ổi là 128 ppm, 512 ppm và 2,048 ppm. Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy cây sả, Neem và ổi có thể được sử dụng để điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Cũng trong năm này (2003), Sivaram và ctv đã tiến hành sàng lọc và đánh giá hiệu quả của một số dịch chiết bằng methanolic từ các loại thảo dược (như xuyên tâm liên (Andrographus panicullata), nhục đậu khấu (Myristica fragrans), hương nhu tía (Ocimum sanctum), cà dại quả đỏ (Solanum surattense), bàng hôi (Terminalia bellirica), sầu đâu (Azadirachta indica) và một số cây thảo dược khác) trong việc chống lại V. harveyi. Và kết quả đã cho thấy các dịch chiết từ hương nhu tía và nhục đậu khấu cho các vòng kháng khuẩn có thể so sánh với các chất kháng sinh thông dụng. Từ các kết quả nghiên cứu ban đầu, thảo dược trong tương lai có thể được xem là một trong những giải pháp hiệu quả và bền vững cho việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Tuy nhiên, đây chỉ là những kết quả ban đầu, để có thể đưa chúng vào sử dụng trong thực tế cần phải có những nghiên cứu khác kỹ hơn để đánh giá hiệu quả tác động của chúng trong thực tiễn sản xuất, cũng như nắm được cơ chế tác dụng và kiểm tra tính an toàn của chúng đối với tôm. Sau đây là đặc điểm của vài loài thảo dược mà bước đầu đã được nghiên cứu và xác định là có khả năng điều trị bệnh phát sáng trên tôm: 2.4.1. Nhục đậu khấu Nhục đậu khấu còn gọi là nhục quả, muscade (Pháp), nutmeg (Anh). Tên khoa học là Myristica fragrans thuộc họ Myristicaceae. Nhục đậu khấu thuộc loại cây to, cao 8-10m. Toàn thân nhẵn. Lá mọc so le, xanh tươi quanh năm. Màu hoa vàng trắng. Quả hạch, hình cầu hay quả lê, màu vàng, đường kính 5-8cm, khi chín nở theo chiều dọc thành 2 mảnh, trong chứa một hạt có vỏ dày cứng, bao bọc bởi một áo hạt bị rách màu hồng. Nhục đậu khấu là loại cây ưa khí hậu nóng ẩm, được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới. Trong cây có chứa một loại tinh dầu thơm, dễ bay hơi, trong đó Myristicin (C11H12O3) chiếm 4% thành phần hóa học của tinh dầu này. Về mặt cấu trúc hóa học, Myristicin giống tương tự 3 loại ether thơm khác là eugenol, isoeugenol và safrol. Hợp chất này được xem là một chất dược liệu quý trong y học Trong y học nhân gian, cây nhục đậu khấu được dùng làm thuốc chống nôn mửa, điều hòa hoạt động của ruột, dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn, lao và sốt (Gotke và Maeshwari, 1990) 2.4.2. Cây Neem Cây Neem có tên khoa học là Azadirachta Indica, thuộc họ Meliaceae, có nguồn gốc từ Ấn Độ. Do khả năng chịu hạn cực kỳ tốt nên nó thường được trồng ở một số quốc gia nằm cận xích đạo, như Senegal chẳng hạn. Hình 2.2. Lá và hạt cây Neem (Ranajit và ctv, 2002) Trong thành phần hóa học của tinh dầu thu từ hạt Neem có chứa các chất có hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm như: Nimbin, Nimbolide, Azad irachtin và Mahmoodin. Theo một số tài liệu khoa học, toàn thân cây Neem là nguồn dược liệu quý, cây càng già thì dược tính càng cao (tuổi thọ của Neem có thể đến 200 năm) có thể bào chế để chữa nhiều chứng bệnh như thủy đậu, tiểu đường, loét dạ dày, lao, phong (Ranajit và ctv, 2002)… 2.4.3. Hương nhu tía Hương nhu tía, É tía, tên khoa học là Ocimum sanctum, thuộc họ Hoa môi - Lamiaceae. Là loại cây thảo cao gần 1 mét. Thân cành màu đỏ tía, có lông. Lá mọc đối, mép khía răng, thường có màu nâu đỏ, có lông ở cả hai mặt; cuống lá dài. Cụm hoa là chùm đứng gồm nhiều hoa màu trắng hay tím, có cuống dài, xếp thành vòng 6 – 8 chiếc. Quả bế nhỏ. Toàn cây có mùi thơm dịu. Đây là một loài cây cổ sống ở nhiệt đới, thường được trồng lấy lá làm rau ăn, nhưng chủ yếu để làm thuốc. Thành phần hóa học có tinh dầu với tỷ lệ 0,2 – 0,3% ở cây tươi và 0,5% ở cây khô; thành phần chính của tinh dầu là eugenol (trên 70%), methyleugenol (trên 12%) và b- caryophyllen. Trong y học, eugenol được dùng làm thuốc tê tại chỗ, thuốc sát trùng chống bệnh hoại thư và bệnh lao phổi. Eugenol rất thông dụng trong nha khoa (làm chất hàn răng tạm eugenat, làm thuốc điều trị viêm ngà, viêm xương ổ răng, làm toả bạc khi tráng bạc trên răng), trong việc điều trị răng mòn, tê buốt (Chatterjee và ctv, 1982). 2.4.4. Cây sả Sả hay còn gọi là Mao hương có tên khoa học là Cymbopogon citratus, thuộc họ Lúa - Poaceae. Sả là cây thảo sống lâu năm, mọc thành bụi, phân nhánh nhiều, cao khoảng 1,5m. Thân rễ trắng hoặc hơi tím. Lá dài đến 1m, hẹp, mép hơi ráp; bẹ trắng, rộng. Cụm hoa gồm nhiều bông nhỏ không cuống. Là một loài liên nhiệt đới mọc hoang và được trồng lấy củ, lá làm gia vị và làm thuốc. Hình 2.3. Cây sả (Shahi và ctv, 2005) Thành phần hoá học: Củ Sả chứa 1 – 2% tinh dầu màu vàng nhạt, thơm mùi chanh, mà thành phần chủ yếu là citral (65 – 85%), geraniol (40%). Ngoài công dụng dùng làm gia vị, Sả đã được dùng làm thuốc trong nhân dân. Sả được dùng để chữa: cảm mạo, nóng sốt đau đầu, đau dạ dày, ỉa chảy, phong thấp tê đau, đòn ngã tổn thương… Người ta còn dùng toàn cây Sả chưng cất tinh dầu; tinh dầu Sả dùng khử mùi hôi tanh, xua ruồi muỗi. Dùng xoa ngoài chữa cúm và phòng bệnh truyền nhiễm (Shahi và ctv, 2005). 2.4.5. Cây ổi Ổi có tên khoa hoc là Psidium guajava, thuộc họ Sim - Myrtaceae. Cây cao khoảng 5 – 10m. Vỏ nhẵn, mỏng, khi già bong từng mảng lớn. Cành non vuông, có nhiều lông mềm, về sau hình trụ và nhẵn. Lá mọc đối, thuôn hay hình trái xoan, gốc tù hay gần tròn, gân lá nổi rõ ở mặt dưới. Hoa trắng, mọc đơn độc hay tập trung 2 – 3 cái thành cụm ở nách lá. Quả mọng hình cầu, chứa rất nhiều hạt hình bầu dục. Ðài hoa tồn tại trên quả. Hình 2.4. Cành và quả ổi (Arima, 2002) Cây ổi có gốc ở châu Mỹ nhiệt đới được trồng rộng rãi ở nhiều nơi. Có khi gặp ở trạng thái hoang dại. Thu hái các bộ phận của cây quanh năm và phơi khô. Thành phần hoá học: Lá ổi chứa tinh dầu (0,31%) trong đó có dl-limonen. Còn có sitosterol, acid maslinic (acid cratagolic), acid guijavalic. Trong lá ổi non và búp non còn có 7 – 10% tanin pyrogalic, khoảng 3% nhựa. Nhựa cây ổi chứa acid d-galacturonic (72,03%), d-galactose (12,05%) và l-arabinose (4,40%). Cây, quả ổi có pectin, vitamin C; trong hạt có tinh dầu với hàm lượng cao hơn trong lá. Vỏ thân chứa acid ellagic. Ổi có vị ngọt và chát, tính bình; có tác dụng cầm ỉa chảy, tiêu viêm, cầm máu. Vỏ ổi cũng có vị chát, lá cũng vậy. Do có nhiều chất tanin nên nó làm săn niêm mạc ruột, làm giảm tiết dịch ruột, giảm nhu động ruột, còn có tác dụng kháng khuẩn (Arima, 2002) 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai Ngày nay, với những thành tựu vượt bậc của mình, công nghệ sinh học đang dần dần chiếm lĩnh một vị trí quan trọng trong thế giới loài người. Có thể nói vai trò của công nghệ sinh ngày càng trở nên không thể thiếu, nó chính là một công cụ đắc lực giúp cho con người tìm hiểu và khám phá ra được những điều bí mật trong thế giới sinh học nhằm cải thiện chất lượng cuộc sống và hoạt động sản xuất của con người ngày càng tốt hơn. Những lĩnh vực như nông nghiệp, y tế, thực phẩm… có sự tham gia của công nghệ sinh học đang từng bước được hoàn thiện. Chính vì thế, trong tương lai, đây sẽ là một lĩnh vực được con người chú ý đến nhiều nhất, thế kỷ XXI sẽ là một thế kỷ của công nghệ sinh học. Trong lĩnh vực nông nghiệp nói chung, cũng như hoạt động sản xuất thủy sản nói riêng, công nghệ sinh học đã và đang thể hiện vai trò của mình trong việc nghiên cứu và ứng dụng các thành tựu nghiên cứu vào các vấn đề như kỹ thuật sản xuất, chất lượng giống, việc kiểm soát dịch bệnh… nhằm cải thiện việc sản xuất cũng như chất lượng của sản phẩm, góp phần thúc đẩy nền kinh tế của xã hội loài người phát triển đi lên một cách bền vững. Từ khi dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm bùng nổ, đã có nhiều công trình nghiên cứu được tiến hành nhằm kiểm soát và ngăn chặn dịch bệnh này, trong đó đã có nhiều kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng vào trong hoạt động sản xuất thực tiễn. Các nhà khoa học nhìn nhận trong thời gian sắp tới việc ứng dụng của công nghệ sinh học vào việc giải quyết vấn đề bệnh phát sáng trên tôm sẽ tập trung vào hai hướng chính đó là: các phương pháp chẩn đoán phát hiện bệnh và các sản phẩm để ngăn chặn, kiểm soát dịch bệnh. 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Các kỹ thuật chẩn đoán phát hiện bệnh trên tôm ngày nay đã có nhiều tiến bộ nhờ việc áp dụng các thành tựu nghiên cứu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh học phân tử. Việc sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện bệnh trên tôm đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nơi. Các kỹ thuật như ELISA và PCR đã được sử dụng để phát hiện các bệnh phổ biến trên tôm, đặc biệt là các bệnh do virus như bệnh đốm trắng do WSSV, bệnh đầu vàng… Ưu điểm của các phương pháp này là tính chính xác và rút ngắn được thời gian phát hiện. Đã có mhiều đề xuất về sử dụng các kỹ thuật như ELISA và PCR cho việc phát hiện nhanh bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm. Việc tìm các đoạn DNA và tạo ra các kháng thể bắt dính kháng nguyên đặc trưng của Vibrio đã được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Năm 1998, Robertson và ctv đã nghiên cứu tạo ra một kháng thể đa dòng từ thỏ có thể dùng để phát hiện nhiều dòng V. harveyi. Theo các phương pháp này thời gian phát hiện bệnh được rút ngắn rất nhiều. Tuy nhiên, hiện nay tại nhiều nơi trên thế giới, người ta vẫn chủ yếu sử dụng phương pháp phân lập vi khuẩn để phát hiện bệnh phát sáng do chi phí để thực hiện phương pháp này thấp hơn các phương pháp ELISA và PCR. Do hạn chế về tính kinh tế nên đây sẽ là một hướng không khả thi trong thời gian sắp tới. 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Kinh nghiệm nuôi tôm cho thấy việc phòng ngừa bệnh là một giải pháp hữu hiệu nhất giúp phát triển bền vững nghề nuôi tôm. Vì thế đây sẽ là một hướng hứa hẹn có nhiều triển vọng trong tương lai, chủ yếu tập trung vào việc nghiên cứu tìm ra các vaccine và chế phẩm sinh học để ngăn chặn dịch bệnh. Theo những hiểu biết từ trước đến nay, tôm sú là động vật bậc thấp có hệ miễn dịch không đặc hiệu. Điều này có nghĩa là việc sử dụng vacxin ở tôm sẽ không hiệu quả (Đào Văn Trí và ctv, 2001). Một đối tượng khác trong hướng nghiên cứu này là chế phẩm sinh học. Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại chế phẩm sinh học có khả năng ức chế các loài Vibrio như Zymetin, Dikaku, Biodream… Sự ra đời của các chế phẩm sinh học sẽ giúp hạn chế được việc sử dụng các loại hóa chất và kháng sinh trong nuôi tôm. Trong chế phẩm sinh học, tính cạnh tranh ức chế của các loài sinh vật giữ một vai trò rất quan trọng quyết định tới hiệu quả của loại chế phẩm đó. Điều này đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tập trung tìm ra các loài sinh vật có khả năng ức chế Vibrio. Và hiện nay, đối tượng nghiên cứu đang được tập chung vào các sinh vật sống ở biển có khả năng ức chế Vibrio gây hại. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng có một dòng vi khuẩn ở biển là Pseudomonas I-2 có thể tạo ra các hợp chất ức chế chống lại các Vibrio gây bệnh trên tôm bao gồm V. harveyi, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. damsela và V. vulnificus. Đây là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, bền với nhiệt, có thể hòa tan trong chloroform và chịu được các enzyme phân giải protein. Người ta tiến hành tách chiết chất này từ vi khuẩn bằng chloroform và tiến hành thử nghiệm, kết quả cho thấy dịch chiết đã làm giảm mật độ V. harveyi trong nước xuống khi dùng ở nồng độ 20 µg/µl và không ảnh hưởng tới ấu trùng của tôm thậm chí ở nồng độ 50 µg/µl. Vì vậy dòng Pseudomonas I-2 này sẽ có tiềm năng ứng dụng vào việc kiểm soát các Vibrio gây bệnh trên tôm trong các hệ thống sản xuất thủy sản (Karunasagar, 2001). Alteromonas sp. P7 là một vi khuẩn gram âm, di động, hình que, có cytochrome oxidase, có khả năng tổng hợp chất sắc tố trong môi trường nước biển. Chúng có khả năng phát triển ở nồng độ muối NaCl 6% và không phát triển trên môi trường agar có chứa sucrose, muối mật, thiosulphate citrate, trên môi trường Mac Conkey, hoặc trên môi trường không có NaCl. Vi khuẩn này không có khả năng phát sáng, không có enzyme amylase, gelatinase, catalase, urease và không khả năng tạo vòng indole cũng như biến đổi nitrate. Alteromonas sp. P7 có thể sử dụng citrate như nguồn carbon duy nhất và không có khả năng sử dụng các nguồn carbon khác như là arabinose, dextrose, galactose, lactose, mannitol, sorbitol và sucrose. Với những đặc điểm này, người ta đã xếp vi khuẩn này vào loài Alteromonas và được chỉ định là Alteromonas sp. P7 (Abraham, 2004). Người ta đã phân lập Alteromonas sp. P7 từ các ấu trùng Fabricius của tôm sú và nhận thấy chúng có khả năng chống lại V. harveyi. Tất cả các dòng V. harveyi phân lập được bị ức chế theo các mức độ khác nhau bởi Alteromonas sp. P7 ở trong phòng thí nghiệm. Hợp chất kháng khuẩn được tạo ra bởi Alteromonas sp. P7 có thể hòa tan trong dung môi hữu cơ và bám dính chặt lên bề mặt của các tế bào vi khuẩn và hợp chất này không bị phân hủy khi xử lý bằng trypsin (Okereke và Montville, 1991). Từ đó, người ta cho rằng hợp chất này có thể không phải là các protein có trong tự nhiên mặc dù các dòng Alteromonas xác định đã được báo cáo là sản xuất các hợp chất protein kháng khuẩn (Mc Carthy, 1994). Các chất kháng khuẩn được thải ra ngoài là sản phẩm của quá trình biến dưỡng thứ cấp. Người ta cho rằng các chất kháng khuẩn này có thể là một pyrole hoặc quinolinol hoặc tyrosol và isatin hoặc là một đường đa có khả năng tan trong ethyl acetate (T. J. Abraham, 2004). Các thí nghiệm được tiến hành đã chỉ ra rằng Alteromonas sp. P7 giúp giảm rõ rệt tỷ lệ chết ở ấu trùng tôm sú in vivo từ V. harveyi M3 bằng cách ngăn chặn sự phát triển và sinh sản của các vi khuẩn gây bệnh (Abraham, 2004). Gần đây, tại nhiều nơi trên thế giới đã nổi lên các đề tài nghiên cứu về khả năng ứng dụng của phage trong lĩnh vực thủy sản. Fraser (2003) và một số nhà khoa học khác đã nghiên cứu và phát hiện một loại phage có khả năng gây sinh tan chuyên biệt cho V. harveyi. Việc sử dụng các bacteriaphage chuyên biệt chống lại V. harveyi ngay từ đầu trong quy trình sản xuất sẽ giúp giảm tối thiểu mật độ hiện diện của V. harveyi trong nước, chất cặn và trong ruột vật nuôi và như thế sẽ ngăn chặn được sự phát sinh của dịch bệnh. Tuy nhiên việc sử dụng phage có các mặt hạn chế như tạo ra các dòng vi khuẩn mới kháng lại phage, hoặc bản thân các phage đó khó có thể kiểm soát được, cũng như tính độc của các phage đó cần phải xác định rõ ràng. Trước khi đưa vào ứng dụng trong thực tiễn, chúng ta cần phải tiếp tục tiến hành nhiều nghiên cứu khác để bảo đảm tính hiệu quả và an toàn của phage trong sản xuất. Tóm lại, hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc sản xuất ra các loại chế phẩm dùng để ngăn chặn dịch bệnh phát sáng sẽ có nhiều triển vọng trong thời gian tới. Tuy nhiên vẫn còn tồn tại một mặt hạn chế của các loại chế phẩm này, đó là giá thành của nó quá cao, điều này giải thích vì sao hiện nay nhiều hộ nông dân nuôi tôm vẫn còn cử dụng hóa chất và kháng sinh để xử lý bệnh tôm. Điều này thúc đẩy các nhà sản xuất nghiên cứu, tìm ra một kỹ thuật, một quy trình sản xuất mới để có thể sản xuất đại trà với số lượng lớn nhằm hạ giá thành sản phẩm, đáp ứng được nhu cầu và nguyện vọng của người nuôi tôm. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Từ 21/03/2005 đến 26/06/2005. 3.1.2. Địa điểm Phòng Bệnh học Thủy sản – Trung tâm Quan trắc – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Trại Thực nghiệm nuôi Thủy sản Thủ Đức – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 3.2.1. Vật liệu Hợp chất chiết xuất từ các thảo dược ký hiệu là B2 thuộc họ Fabaceae, L, L2 và M thuộc họ Asteraceae. 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu Tôm sú không mang các mầm bệnh để bố trí thí nghiệm, trọng lượng bình quân từ 15 – 20 g/con. Giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng, phân lập từ tôm bệnh. 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 3.2.3.1. Dụng cụ Dụng cụ bố trí thí nghiệm: bể nuôi, hệ thống sục khí, vợt thùng, thau... Dụng cụ thu mẫu: kim tiêm (1 ml), đèn cồn, que cấy, bông thấm, găng tay, bao thùng xốp, chai lọ. Dụng cụ phân tích vi khuẩn: ống nghiệm các loại, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, pipet, đầu típ, tủ lạnh, tủ ấm, tủ cấy, nồi hấp autoclave... Dụng cụ quan sát, thử nghiệm kháng sinh đồ: thước đo vòng kháng khuẩn, đĩa giấy tẩm hợp chất chiết xuất làm kháng sinh đồ. Dụng cụ kiểm tra chất lượng nước: nhiệt kế thủy ngân 0 – 1000C, pH kế, bộ test NH3, DO, COD... 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất Đĩa giấy tẩm các hợp chất cần thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar): môi trường đặc trưng dùng để chọn lọc V. harveyi. TSB (Tryptone Soya Broth): môi trường tăng sinh, phục hồi cho vi khuẩn. Môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar): môi trường dùng để tăng sinh, làm thuần vi khuẩn. Môi trường MHA (Mueller Hinton Agar): môi trường đặc trưng dùng làm kháng sinh đồ khảo sát tác dụng kháng khuẩn của hợp chất thử nghiệm. Các môi trường và hóa chất thử nghiệm đặc tính sinh hóa của vi khuẩn. Ngoài ra còn có nước biển (15‰) và một số hóa chất khác dùng trong thí nghiệm. 3.3. Phương pháp tiến hành Nội dung tiến hành đề tài có thể chia thành 2 giai đoạn thử nghiệm: 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm Tiến hành thử nghiệm tác dụng của các hợp chất B2, L, L2 và M theo phương pháp kháng sinh đồ. Mục tiêu là sàng lọc các chất có hiệu quả và xác định các mức nồng độ có ý nghĩa của chất đó đối với vi khuẩn V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Gồm các bước sau: Phân lập dòng thuần V. harveyi từ tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn Thử nghiệm sinh hóa để xác định V. harveyi Thử nghiệm tác dụng của các chất bằng phương pháp kháng sinh đồ Xác định nồng độ có hiệu quả kháng vi khuẩn Sơ đồ 1. Bố trí thử nghiệm tác dụng của các hợp chất 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi Lấy mẫu: chọn ngẫu nhiên 2-3 con tôm nuôi ao có dấu hiệu nhiễm khuẩn. Lấy máu tôm: mỗi con 0,1 ml, sau đó nhỏ lên các đĩa cấy chứa môi trường TCBS, dàn đều khắp bề mặt môi trường, mỗi con cấy lên 1 đĩa. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Chọn khuẩn lạc phát sáng trên môi trường TCBS cấy chuyền sang môi trường BHIA (có bổ sung 2% NaCl). Ủ trong tủ ấm ở 300C, 24 giờ để thuần hóa và tăng sinh V. harveyi. Tiến hành thử nghiệm các đặc tính sinh hoá của V. harveyi: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, malnose, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose, kiểm tra khả năng lên men và oxy hoá; khả năng phân giải Gelatin; khả năng sử dụng Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin (Jonh, 1994). 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ theo phương pháp Mc Farland (Bauer và Kirby, 1997) Nguyên tắc Khả năng ức chế của các hợp chất thảo dược được xác định dựa vào đường kính vòng vô khuẩn hình thành do sự khuếch tán các hợp chất xung quanh đĩa giấy tẩm hợp chất. Hiệu quả kháng khuẩn được xác định dựa vào đường kính của các vòng ức chế vi khuẩn. Cách tiến hành Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn theo phương pháp Mc Farland. Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí nghiệm Mc Farland Ống số 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BaCl2 1%(ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 H2SO4 1%(ml) 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 Tb/ml(x 108) 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 Chuẩn bị vi khuẩn để thử nghiệm kháng sinh đồ: giống vi khuẩn V. harveyi thuần chủng. Vi khuẩn được cấy tăng sinh trên môi trường BHIA + 2% NaCl, thu tế bào vi khuẩn và huyền phù với nước muối sinh lý 2% vô trùng. Pha hỗn hợp dịch tế bào của vi khuẩn sao cho dung dịch huyền phù có cùng độ đục với ống số 3 theo Mc Farland. Chuẩn bị các đĩa giấy (đường kính = 6mm) trong điều kiện vô trùng. Hòa tan các hợp chất thảo dược trong dung môi DMSO với các nồng độ dự kiến thử nghiệm tùy vào mức độ tan của các hợp chất trong dung môi. Cụ thể, các nồng độ cho từng hợp chất là: + Hợp chất B2: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 và 100 µg/µl. + Hợp chất L: 600, 700, 800, 900, và 1000 µg/µl. + Hợp chất L2: 600, 700, 800, 900 và 1000 µg/µl. + Hợp chất M: 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl. Dùng pippet hút 5 µl các hợp chất cần thử nghiệm tẩm vào các đĩa giấy. Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA để thử kháng sinh đồ. Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch vi khuẩn cho vào môi trường MHA trong đĩa petri, dàn đều dịch vi khuẩn lên đĩa thạch. Sau đó dùng pipet hút hết phần dung dịch vi khuẩn thừa trên mặt thạch. Dùng kẹp vô khuẩn lấy các đĩa giấy đã tẩm các hợp chất hợp chất thử nghiệm đặt lên bề mặt thạch, cách mép đĩa petri khoảng 2,5 cm, đảm bảo mặt đĩa giấy tẩm hợp chất tiếp xúc phẳng với bề mặt thạch. Ủ các đĩa petri trong tủ ấm ở 300C sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ kiểm tra và đo vòng vô khuẩn. 3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab Sau giai đoạn thử nghiệm trong phòng thí nghiệm, bước đầu đánh giá hợp chất M là có hiệu quả nhất đối với V. harveyi. Giai đoạn tiếp theo là tiến hành thí nghiệm đánh giá hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với tôm đã cho nhiễm V. harveyi trong bể nuôi trong phòng Wet-lab. Hai nồng độ của hợp chất M được chọn để thử nghiệm là 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Sơ đồ tiến hành thử nghiệm được trình bày như sau: Tôm không mang các mầm bệnh Lô đối chứng âm, 15 con Lô đối chứng dương, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 500 mg/kg, 15 con Lô thử nghiệm nồng độ 750 mg/kg, 15 con Tiêm 0,05 ml nước muối sinh lý Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Tiêm 0,05 ml dịch vi khuẩn Theo dõi biểu hiện của tôm Chăm sóc, theo dõi, đánh giá hiệu quả của thuốc đối với vi khuẩn Cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 750 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc nồng độ 500 mg/kg Cho tôm ăn thức ăn thường Cho tôm ăn thức ăn thường Sơ đồ 2. Bố trí thử nghiệm trong phòng Wet-lab Chuẩn bị 15 bể thí nghiệm, nước biển sau khi kiểm tra các tính chất hóa lý được cho vào mỗi bể 50 lít. Thí nghiệm bố trí thành 4 lô: Lô đối chứng âm: bố trí 3 bể, không gây cảm nhiễm, chỉ tiêm 0,05 ml dung dịch nước muối sinh lý và cho ăn thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm. Lô đối chứng dương: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và sử dụng thức ăn tổng hợp không tẩm hợp chất thử nghiệm. Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 500 mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 500 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Lô thử nghiệm tác dụng của thuốc ở nồng độ 750 mg/kg: bố trí 3 bể, các con tôm được gây cảm nhiễm 0,05 ml dung dịch vi khuẩn (106 CFU/ml) và cho ăn thức ăn tổng hợp có tẩm hợp chất M với nồng độ 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Các con tôm sau khi tiêm được thả lại bể theo đúng bố trí. Chăm sóc và quan sát các dấu hiệu biểu hiện bệnh bằng cách so sánh với đối chứng âm và đối chứng dương. Quan sát theo dõi các biểu hiện của tôm, bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có tẩm thuốc ngay khi có biểu hiện bệnh. 3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi Trong kỹ thuật nuôi tôm, vấn đề chất lượng nước nuôi rất quan trọng. Nước nuôi tôm phải có các tính chất hoá lý phù hợp với tôm, nếu không có thể làm tôm bị sốc và chết. Vì vậy trước khi thả tôm, cần phải tiến hành kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá lý của nước: Đo độ mặn của nước biển bằng máy đo độ mặn. Đo pH: dùng pH meter cầm tay để đo pH. NH3/: sử dụng bộ test NH3 của Sera. Đo COD: dùng KMnO4 để oxy hóa các chất hữu cơ, sau đó dùng KI trung hòa KMnO4 dư và chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột. Đo DO: dùng MnCl2 và KI/NaOH để cố định mẫu nước và chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N với chỉ thị hồ tinh bột. Trong quá trình nuôi phải thường xuyên theo dõi và kiểm tra để đảm bảo chất lượng của nước nuôi tôm. 3.3.2.2. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn Tiến hành lấy mẫu nước và mẫu tôm tại các thời điểm: Trước khi gây cảm nhiễm. Khi gây cảm nhiễm. Sau 7 ngày dùng thuốc. Sau 10 ngày dùng thuốc. Sau 14 ngày dùng thuốc. Kiểm tra vi khuẩn trong mẫu nước Lấy mỗi bể khoảng 25 ml nước, các mẫu nước của các bể cùng lô thị nghiệm được trộn lại đựng trong bình nhựa để mang về phân tích. Mẫu nước đem về phòng thí nghiệm sẽ được kiểm tra bằng cách trải cho thật khô trên các đĩa thạch chứa môi trường TCBS, mỗi lô sẽ cấy 3 đĩa: 2 đĩa cấy với 50 µl mẫu nước và một đĩa cấy với 100 µl mẫu nước. Kiểm tra vi khuẩn trong tôm Mỗi lần lấy mẫu bắt khoảng 3 con ở mỗi bể. Tiến hành lấy mẫu máu tôm của từng con (0,1 ml). Sau đó mẫu máu của từng con sẽ được cấy trải lên 1 đĩa thạch chứa môi trường TCBS. Ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ. Xác định các khuẩn lạc nghi ngờ là các khuẩn lạc màu lục, khi quan sát trong tối thấy phát sáng. Cấy vi khuẩn sang môi trường BHIA + 2% NaCl, ủ trong tủ ấm ở 300C trong 24 giờ để tăng sinh khối vi khuẩn. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn: khả năng sử dụng các đường glucose, sorbitol, manitol, sucrose, lactose, galactose; khả năng sử dụng citrate như nguồn carbone duy nhất trên môi trường Simons Citrate Agar; khả năng sinh gas từ glucose; khả năng phân giải Gelatin; khả năng khử Nitrate; phản ứng Indol hoá; khả năng sử dụng các acid amin như arginine, lysine, ornitine; phản ứng với esculine; khả năng sử dụng tinh bột; phản ứng VP và phản ứng O/F (Jonh, 1994). 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê Các số liệu thí nghiệm được xử lý sử dụng phần mềm thống kê SPSS và EXCEL. SPSS là một chương trình phân tích số liệu tự động do máy tính thực hiện dựa trên các công thức toán học đã được lập trình. Các công thức toán học thường dùng trong phân tích thống kê (Nguyễn Văn Đức, 2001): ∑ n i=1 Xi X = n 1 X Trung bình (Mean): (Xi – X)2 ∑ n i=1 n-1 1 S2 = Phương sai (Variance): S2 Độ lệch chuẩn (Standard deviation): S Trong thí nghiệm này: Xi là giá trị của các vòng kháng khuẩn ở các nồng độ thí nghiệm (mm). n là số lần lập lại thí nghiệm. Phương pháp so sánh 2 giá trị nghiệm thức (Nguyễn Văn Đức, 2001): Ở đây mỗi nghiệm thức là các giá trị vòng kháng khuẩn ở mỗi nồng độ ở mỗi điểm thời gian. Cách tiến hành: Đặt giả thiết H0: m1 = m2 ∑ n i=1 Xi X = n 1 Xi = X1i – X2i (Xi – X)2 ∑ n i=1 n-1 1 S2 = √S2/n |X| t(n-1) = Từ giá trị của phân phối Student t suy ra p là mức độ sai khác ý nghĩa dựa vào bảng phân bố t. Nếu p > 0,05, chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị không khác nhau về mặt thống kê. Nếu p ≤ 0,05, không chấp nhận giả thuyết H0 tức là hai giá trị khác nhau về mặt thống kê. Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi Kết quả phân lập từ các mẫu máu của các con tôm nghi ngờ bệnh thấy xuất hiện các khuẩn lạc nghi ngờ và kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa đã xác định đây là V. harveyi. Vi khuẩn này được dùng cho các thí nghiệm về sau. Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh V. harveyi Đặc điểm sinh hóa V. harveyi Màu khuẩn lạc Vàng Gram - Đối chứng - Arginine - Lysine + Ornitine + Glucose + Gasglucose - Galactose - Lactose - Sucrose + Sorbitol - Manitol + Gelatin + Indol - VP - O/F +/+ Esculine + Citrate + Tinh bột + Khử Nitrate + 4.1.2. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ Qua bước đầu sàng lọc với độ lập lại 5 lần, kết quả ghi nhận như sau (Bảng 4.2): Cả 3 hợp chất L, L2 và M đều có tác dụng kháng khuẩn đối với V. harveyi ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, trong đó hợp chất M có hiệu quả cao hơn so với L và L2 ở các khoảng thời gian sau 4, 8 và 12 giờ. Hợp chất B2 không có tác dụng đối với V. harveyi. Dung môi hòa tan DMSO không có tác dụng đối với V. harveyi. Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian Khoảng thời gian B2 L L2 M 4 giờ - + ++ +++ 8 giờ - + ++ +++ 12 giờ - + ++ +++ Ghi chú: (+): hiệu quả thấp; (++): hiệu quả vừa; (+++): hiệu quả cao; (-): không có hiệu quả. 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M Sau khi sàng lọc, hợp chất M có hiệu quả nhất. Vì thế, bước thử nghiệm tiếp theo là lập lại thí nghiệm kháng sinh đồ cho hợp chất M với số lần lập lại 25 lần. Và kết quả được trình bày trong Bảng 4.5. Kết quả cho thấy tất cả các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M đều có tác dụng đối với V. harveyi. Tuy nhiên hiệu quả tác dụng ở mỗi nồng độ có sự sai khác ý nghĩa (p < 0,05) sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ, nhìn chung đường kính vòng vô khuẩn ở mỗi nồng độ tăng sau các khoảng thời gian 4 giờ, 8 giờ và 12 giờ (Bảng 4.4). Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời gian ở từng nồng độ thử nghiệm Nồng độ (µg/µl) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) Sau 4 giờ (1) Sau 8 giờ (2) Sau 12 giờ (3) 200 12,95 ± 0,44 13,30 ± 0,48 14,75 ± 1,36 p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 300 14,02 ± 0,44 14,67 ± 0,48 15,41 ± 1,16 p(1)&(2) = 0,000; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,020 400 14,82 ± 0,38 15,18 ± 0,50 15,91 ± 0,50 p(1)&(2) = 0,006; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,000 500 14,89 ± 0,50 15,27 ± 0,64 15,93 ± 0,76 p(1)&(2) = 0,049; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,005 600 14,98 ± 0,45 15,37 ± 0,54 16,12 ± 0,77 p(1)&(2) = 0,008; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,001 700 15,28 ± 0,48 15,90 ± 0,50 16,41 ± 0,83 p(1)&(2) = 0,010; p(1)&(3) = 0,000; p(2)&(3) = 0,004 Sự khác biệt về hiệu quả giữa các nồng độ được trình bày trong Bảng 4.5: Sau 4 giờ: so sánh đường kính vòng kháng khuẩn ở 2 nồng độ 200 và 300 µg/µl các nồng từ 400 µg/µl, 500 µg/µl, 600 µg/µl và 700 µg/µl cho tác dụng không khác biệt nhau lắm (p(400)&(500) = 0,558 > 0,05, p(400)&(600) = 0,295 > 0,05, p(500)&(600) = 0,562 > 0,05, p(600)&(700) = 0,053 > 0,05). Sau 8 giờ: có sự khác biệt về đường kính của các vòng vô khuẩn ở các nồng độ 200, 300 và 700 µg/µl so với các nồng độ khác, nhưng giữa các nồng độ 400 µg/µl, 500 µg/µl và 600 µg/µl cho thấy không có sự khác biệt đáng kể của các vòng kháng khuẩn (p(400)&(500) = 0,529 > 0,05, p(400)&(600) = 0,208 > 0,05, p(500)&(600) = 0,611 > 0,05). Sau 12 giờ: nhìn chung tác dụng của các nồng độ không còn khác biệt nhiều (p > 0,05), riêng chỉ thấy ở nồng độ 200 µg/µl có sự khác biệt ý nghĩa so với các nồng độ khác (p(200)&(400) = 0,000 < 0,05, p(200)&(500) = 0,004 < 0,05, p(200)&(600) = 0,000 < 0,05, p(200)&(700) = 0,000 < 0,05), đường kính của các vòng kháng khuẩn ở nồng độ 200 µg/µl nằm trong khoảng 14,75 ± 1,36mm. Thử nghiệm hiệu quả của hợp chất M ở các nồng độ 200, 300, 400, 500, 600 và 700 µg/µl đều tạo ra các vòng vô khuẩn lớn hơn 12 mm (tức lớn hơn hai lần đường kính đĩa giấy kháng sinh). Kết quả này cho thấy đường kính của các vòng vô khuẩn được tạo ra từ hợp chất M ở các nồng độ thử nghiệm đều có ý nghĩa, tức các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M đều có hiệu quả đối với V. harveyi (Lý Thị Thanh Loan và ctv, 2004). Trong các nồng độ thử nghiệm của hợp chất M, nồng độ 700 µg/µl cho các vòng vô khuẩn lớn nhất (sau 4, 8 và 12 giờ lần lượt là 15,28 ± 0,48, 15,90 ± 0,50 và 16,41 ± 0,83 mm) và có sự gia tăng đường kính vòng vô khuẩn từ nồng độ 200 đến nồng độ 700 µg/µl. Nhưng nhìn chung ở các nồng độ 400, 500, 600 và 700 µg/µl của hợp chất M không có sự khác biệt đáng kể về đường kính vòng vô khuẩn sau các khoảng thời gian thử nghiệm (p > 0,05), tức các nồng độ này cho hiệu quả tác dụng với vi khuẩn gần như nhau và như thế có thể xem nồng độ 400 µg/µl là mức nồng độ có ý nghĩa đối với V. harveyi. Bảng 4.4. So sánh đường kính vòng vô khuẩn giữa các nồng độ sau các khoảng thời gian đối với V. harveyi Thời gian Đường kính vòng vô khuẩn (mm) 200 µg/µl (1) 300 µg/µl (2) 400 µg/µl (3) 500 µg/µl (4) 600 µg/µl (5) 700 µg/µl (6) 4 giờ 12,95 ± 0,44 14,02 ± 0,44 14,82 ± 0,38 14,89 ± 0,50 14,98 ± 0,45 15,28 ± 0,48 p(1)&(2) = 0,000 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,000 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,000 p(2)&(4) = 0,000 p(2)&(5) = 0,000 p(2)&(6) = 0,000 p(3)&(4) = 0,558 p(3)&(5) = 0,295 p(3)&(6) = 0,003 p(4)&(5) = 0,562 p(4)&(6) = 0, 007 p(5)&(6) = 0,053 8 giờ 13,30 ± 0,48 14,67 ± 0,48 15,18 ± 0,50 15,27 ± 0,64 15,37 ± 0,54 15,90 ± 0,50 p(1)&(2) = 0,000 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,000 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,008 p(2)&(4) = 0,001 p(2)&(5) = 0,000 p(2)&(6) = 0,000 p(3)&(4) = 0,529 p(3)&(5) = 0,208 p(3)&(6) = 0,000 p(4)&(5) = 0,611 p(4)&(6) = 0,002 p(5)&(6) = 0,004 12 giờ 14,75 ± 1,36 15,41 ± 1,16 15,91 ± 0,50 15,93 ± 0,76 16,12 ± 0,77 16,41 ± 0,83 p(1)&(2) = 0,132 p(1)&(3) = 0,000 p(1)&(4) = 0,004 p(1)&(5) = 0,000 p(1)&(6) = 0,000 p(2)&(3) = 0,056 p(2)&(4) = 0,127 p(2)&(5) = 0,064 p(2)&(6) = 0,011 p(3)&(4) = 0,922 p(3)&(5) = 0,328 p(3)&(6) = 0,038 p(4)&(5) = 0,413 p(4)&(6) = 0,098 p(5)&(6) = 0,236 700 µg/µl 600 µg/µl 500 µg/µl 200 µg/µl 300 µg/µl 400 µg/µl ĐC Hình 4.1. Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M 4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab 4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi Kết quả kiểm tra các tính chất hoá lý của nước nuôi tôm được trình bày trong bảng 4.6: Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm Chỉ tiêu Kết quả pH 8,2 Độ mặn 15 (‰) NH3 0,03 Độ kiềm 60 COD 11,32 mg/l DO 3,7 mg/l Kết luận các tính chất này phù hợp cho nuôi tôm. 4.1.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm Sau khi cảm nhiễm, thả tôm trở lại bể, quan sát sau một ngày thì thấy tôm có dấu hiệu yếu lờ đờ, ăn kém, đuôi và chủy bị lỡ, một số con bơi lượn trên mặt nước, khi quan sát vào ban đêm thì thấy một số con tôm ở phần đầu và ngực phát ra ánh sáng màu xanh nhạt (trừ các bể đối chứng âm). Các bể cảm nhiễm đều có tôm bị chết. Sau một ngày, bắt đầu tiến hành cho tôm ăn thức ăn có tẩm hợp chất đã sàng lọc có hiệu quả qua thử nghiệm kháng sinh đồ là hợp chất M, ghi nhận: Lô đối chứng âm: tôm vẫn khỏe mạnh hoạt động bình thường, không có tôm chết. Lô đối chứng dương: tôm vẫn còn yếu, kém ăn, hay bơi lượn trên mặt nước và thấy phát sáng ở phần đầu khi quan sát trong tối. Tỷ lệ chết của lô đối chứng dương sau khi kết thúc thí nghiệm là khá cao trên 77,8%. Lô thử nghiệm: đối với các bể thí nghiệm cho tôm ăn thức ăn có trộn hợp chất M ở 2 nồng độ 500 mg/kg và 750 mg/kg, kết quả sau 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày tôm vẫn phát triển bình thường, quan sát thấy tôm trở lại hoạt động bình thường, không còn bơi lượn trên mặt nước và trong tối quan sát không còn thấy tôm phát sáng ở phần đầu. Tỷ lệ tôm chết đã giảm một cách rõ rệt so với các bể đối chứng dương (Bảng 4.7). Sau khi bắt đầu cho tôm ăn thức ăn có trộn hợp chất M thì không còn thấy tôm chết. Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm Lô thí nghiệm Trước khi cảm nhiễm Sau 1 ngày cảm nhiễm Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Lô đối chứng âm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Lô đối chứng dương 0,0 20,0 37,8 53,4 77,8 Lô thử nghiệm 500 mg/kg 0,0 22,2 22,2 22,2 22,2 Lô thử nghiệm 750 mg/kg 0,0 20,0 20,0 20,0 20,0 Sau khi dùng thuốc, đối với các lô thử nghiệm tác dụng của thuốc, kết quả kiểm tra mẫu tôm sau 7 ngày, 10 ngày và 14 ngày cho thấy không còn sự hiện diện của vi khuẩn, tuy nhiên đối với mẫu nước kết quả kiểm tra sau 7 ngày vẫn thấy có vi khuẩn nhưng đến 10 ngày và 14 ngày kiểm tra không còn phát hiện vi khuẩn. Kết quả kiểm tra vi khuẩn ở các mẫu nước và mẫu tôm của các lô thí nghiệm được trình bày trong Bảng 4.8: Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra V. harveyi trong các mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí nghiệm (số mẫu dương tính/ số mẫu kiểm tra) Lô thí nghiệm Trước khi cảm nhiễm Sau cảm nhiễm 1 ngày Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Mẫu tôm Mẫu tôm Mẫu nước Mẫu tôm Lô đối chứng dương Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Bể 2 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Bể 3 0/3 3/3 3/3 3/3 3/3 Lô đối chứng âm Bể 1 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Lô thử nghiệm 500 mg/kg Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Lô thử nghiệm 750 mg/kg Bể 1 0/3 0/3 3/3 3/3 3/3 0/3 0/3 0/3 0/3 0/3 Bể 2 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Bể 3 0/3 3/3 0/3 0/3 0/3 Như vậy ở các bể tôm được ăn thức ăn có trộn hợp chất M ở cả hai nồng độ là 500 mg/kg và 750 mg/kg làm tăng khả năng chống lại mầm bệnh V. harveyi cho tôm và giảm tỷ lệ tôm chết rõ rệt, điều này chứng tỏ cả hai nồng độ thử nghiệm 500 mg/kg và 700 mg/kg của hợp chất M đều có tác dụng điều trị bệnh cho tôm, như vậy có thể xem nồng độ 500 mg/kg là liều điều trị có hiệu quả bệnh do V. harveyi trên tôm. Và qua theo dõi ban đầu nhận thấy hợp chất M không ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của tôm, tôm được điều trị bằng hợp chất M vẫn phát triển bình thường, quan sát tôm vẫn lột xác bình thường. Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy: Hợp chất M chiết xuất từ thảo dược thuộc họ Asteraceae có tác dụng hiệu quả đối với V. harveyi trong phòng thí nghiệm. Hợp chất M có hiệu quả điều trị bệnh phát sáng do V. harveyi gây ra trên tôm, giúp giảm tỷ lệ tôm chết do bệnh. 400 µg/µl là nồng độ trên đĩa giấy kháng sinh có ý nghĩa về hiệu quả đối với V. harveyi. Liều điều trị hiệu quả của hợp chất M trong phòng Wet – lab đối với bệnh do V. harveyi trên tôm là 500 mg/kg. 5.2. Đề nghị Để đề tài này đạt hiệu quả cao hơn, chúng tôi xin có một số đề xuất: Cần nghiên cứu tìm hiểu thành phần và cấu trúc hóa học của thuốc để hiểu rõ cơ chế tác dụng của thuốc từ đó có thể đề xuất ra các biện pháp sử dụng thuốc có hiệu quả hơn. Cần tiến hành thử nghiệm hiệu quả của thuốc trên đối tượng là các ấu trùng của tôm vì đây là đối tượng bị thiệt hại nặng nhất do bệnh do V. harveyi. Nên tiến hành thử nghiệm hiệu quả điều trị của hợp chất M đối với bệnh do vi khuẩn V. harveyi trên tôm ở quy mô nồng hộ để đánh giá hiệu quả điều trị bệnh của hợp chất M trong sản xuất thực tiễn. Cần nghiên cứu để xác định LD50 (liều gây chết 50%) của hợp chất M đối với tôm để đưa ra các khuyến cáo cho các nhà nuôi tôm sử dụng thuốc có hiệu quả không gây hại đến tôm. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Hà Anh, 2004. Bệnh ở tôm nuôi và đôi lời bàn. Tạp chí Thủy sản, số 3/2004: tr. 33 – 35, Bộ Thủy sản, Hà Nội. Baticados C. L., 1992. Bệnh tôm sú (Nguyễn Phương Lan dịch). Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội, Việt Nam. 50 trang. Thái Thị Thanh Dương, 2004. Về tiêu thụ tôm của Việt Nam. Tạp chí Thủy sản, số 2/2004: tr. 8 – 9, Bộ Thủy sản, Hà Nội. Huỳnh Hữu Đức, 2004. Nuôi tôm ở các nước châu Á. Báo Con Tôm, số 104: tr. 30, Bản tin của Hội Nghề cá Việt Nam, TP. Hồ Chí Minh. Nguyễn Văn Đức, 2001. Phương pháp kiểm tra thống kê sinh học, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, 978 – 19. 268 trang. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề kỹ thuật nuôi tôm sú công nghiệp, Nhà Xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 7 – 24. Nguyễn Văn Hảo, 2003. Hệ thống một số bệnh thường gặp trên ấu trùng tôm sú tại Khánh Hoà và các tỉnh phía Nam, Một số bệnh thường gặp trên tôm sú (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II). Nhà xuất bản nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 108 – 122. Đỗ Thị Hoà, Võ Khả Tâm, Trần Thị Lan Hương, 2001. Nghiên cứu bệnh đỏ mang trên tôm mẹ và bệnh đục thân, bệnh phát sáng trên ấu trùng tôm sú, Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II , TP. Hồ Chí Minh. Đỗ Thị Hoà, 1992. Một số bệnh thường gặp ở tôm, Bài giảng về bệnh cá tôm (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II ), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 43 – 53. Lý Thị Thanh Loan, 1999. Các bệnh thường gặp trên Thủy sản nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu Long, Giáo Trình hướng dẫn ôn tập thi tuyển công chức, Ngạch nghiên cứu viên nuôi trồng thủy sản (Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II), Bộ Thủy sản, TP. Hồ Chí Minh. tr. 197 – 228. Lý Thị Thanh Loan, Phạm Võ Ngọc Ánh, Mã Tũ Lan, Trương Hồng Việt và Phạm Văn Điền, 2004. Hiệu quả của một vài loại kháng sinh có thể thay thế Chloramphenicol và Nitrofurans trong điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên cá nuôi nước ngọt ở Đồng bằng sông Cửu Long, Tuyển tập Nghề cá sông Cửu Long (Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II), Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 331 – 342. Nguyễn Thanh Phương, Kỹ thuật nuôi thủy sản ven biển nhiệt đới, khoa thủy sản, Đại học Cần Thơ, 2004. Bộ Thủy sản, 2004. Báo cáo Bộ Thủy sản từ 1990-2003, Báo cáo tại VINAFISH 2004. Phạm Văn Tình, 2000. Kỹ thuật sản xuất giống tôm sú chất lượng cao, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 76 trang. Đào Văn Trí, Võ Văn Nha, Lê Minh Hải, Trần Huỳnh Cường và Phạm Vũ Hải, 2001. Thử nghiệm sử dụng Vaccine Norvax Shrimp Vib®, Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1984 – 2004), Trung tâm nghiên cứu thủy sản III, Nha Trang. Tr. 463 – 474. Đào Văn Trí, 2005. Sản xuất và nuôi thương phẩm các loài tôm biển ở Việt Nam trong thời gian qua, định hướng nghiên cứu và sản xuất trong thời gian tới, Tuyển tập hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, (Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản III), Vũng Tàu, 22 – 23/12/2004, Nhà xuất bản Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. tr. 551 – 559. Trần Văn Vỹ, Phạm Văn Trang và Nguyễn Duy Khoát, 1993. Nuôi tôm nước ngọt và nước lợ xuất khẩu, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. tr. 9 – 13. Hà Yên, Canh canh nỗi lo thị trường, 1 – 2004, Vietnamnet. TIẾNG ANH Abraham T. J., 2004. Antibacterial marine bacterium deter luminous vibriosis in shrimp larvae. Vol. 27, NAGA, WorldFish Center Quarterly. p. 3 – 4. Arima H., 2002. Isolation of antimicrobial compounds from guava (Psidium guajava L.) and their structural elucidation. Biosci. Biotechnol. Biochem, 66: 1727 – 1730. American Chemical Society, Washington, USA. Bauer and Kirby, 1997. Methods for dilution antimicrobial susceptibility test for bacteria that grow aerobically, fourth edition, approed standard, NCCLS document M7 – A4 (ISBN 1 – 56238 – 309 – 4). Chatterjee A., Sukul N., Laskar S., Ghoshmajumdar S., 1982. Nematicidal principles from two species of Lamiaceae Ocimum sanctum and Ocimum basilicum. J Nematol, 14: 118 – 122. W. Bengal 731235, India. Eleonor A. T., Milagros R. P., Armando C. F., Gilda L. P., Casiano H. C. J., Yasuo I., 2003. Antibacterial activity of tilapia Tilapia hornorum against Vibrio harveyi. Aquaculture, 232: 145 – 152, Aquaculture Department, Southeast Asian Fisheries Development Center, Philippines. Fraser S., A novel anti-bacterial agent addressing a critical need in a large and growing market, Centex Shrimp, 12 – 2005, Mahidol University, Bangkok  10400, Thailand. Gotke N., Maeshwari M. L., 1990. Nematicidal activity of Myristica fragrans against Meloidogyne incognita. Indian Perfumer, 34: 105 – 107. India. Gregory M. R. and George S., 2005. Biological Study of Container Vessels at the Port of Oakland, Smithsonian Environmental Research Center, The Port of Oakland, Oakland, CA 94607. p. 49 – 51. Harris L., Owens L. and Smith S.,1996. A selective and differential medium for Vibrio harveyi. Appl. Environ. Microbiol, 62: 3548 – 3550. Department of Biomedical and Tropical Veterinary Sciences, James Cook University of North Queensland, Townsville, Australia. Jonh G. H., Noel R. K., Peter H. A. S., James T. S. and Stanley T. W., 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Universiteit, Lab. Voor microbiologie, K. L. Ledeganeke, Belgium. p. 194 – 196. Karunasagar I., Chythanya R., Iddya K, 2001. Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain. Aquaculture, 208: 1 – 10. Department of Fishery Microbiology, University of Agricultural Sciences, College of Fisheries, Mangalore-575 002, India. Lavilla – Pitogo C.R., Lean˜o E. M., Paner M. G., 1998. Mortalities of pond-cultured juvenile shrimp, Penaeus monodon, associated with dominance of luminescent vibrios in the rearing environment. Aquaculture, 164: 337 – 349. Elsevier Science, Philippines. Lightner, D.V. 1988. Vibrio disease of penaeid shrimp. Developments in Aquaculture and Fisheries Science, 17: 42 – 47. Elsevier, Amsterdam. Liu P. C., Lee K. K., Tu C. C. and Chen S. N.,1997. Purification and characterization of a cysteine protease produced by pathogenic luminous Vibrio harveyi, Curr Microbiol, 35: p. 32 – 39. Department of Aquaculture, National Taiwan Ocean University, Keelung, Taiwan. McCarthy S. A., Johnson R. M. and Kakimoto D., 1994. Characterization of an antibiotic produced by Alteromonas luteoviolacea. J. Appl. Bacteriol, 77: 426 – 432. Japan. Montero A. B., Austin B., 1999. Characterization of extracellular products from an isolate of Vibrio harveyi recovered from diseased post-larval Penaeus vannamei (Bonne). J Fish Dis, 22: 377 – 386. Edinburgh EH14 4AS, Scotland Okereke A. and Montville T. J., 1991. Bacteriocin inhibition of Clostridium botulinum spores by lactic acid bacteria. J. Food Prot, 54: 349 – 353. Department of Food Science, Rutgers State University of New Jersey, New Brunswick 08903-0231. Ranajit K. B., Kausik B., Ishita C.and Uday B., 2002. Biological activities and medicinal properties of neem (Azadirachta indica), Vol. 82, Current science, Department of Physiology, Indian Institute of Chemical Biology, Kolkata 700 032, India. Robertson P. A. W., Xu H. S. and Austin B.,1998. An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of Vibrio harveyi in penaeid shrimp and water. Journal of Microbiological Methods, 34: 31 – 39. Department of Biological Sciences , Heriot-Watt University , Riccarton , Edinburgh EH 14 4AS , Scotland ,UK. Shahi A. K., Kaul M. K., Renu G., Prabhu D., Suresh C. and Gulam N. Q., 2005. Determination of essential oil quality index by using energy summation indices in an elite strain of Cymbopogon citrates. Flavour and Fragrance Journal, 20: 118 – 121. Regional Research Laboratory, Jammu Tawi - 180 001, India. Shenzhen, 2002. China International Recreational Fisheries and Aquaria Congress and Exhibition 2001, Sea World, China. p.20-23. Sivarama V., Babua M. M., Immanuela G., Murugadassa S., Citarasub T. and Mariana M. P., 2004. Growth and immune response of juvenile greasy groupers (Epinephelus tauvina) fed with herbal antibacterial active principle supplemented diets against Vibrio harveyi infections. Aquaculture, 237: 9 – 20. Center for Marine Science and Technology, Manonmaniam Sundaranar University, Tamil Nadu, India. Sung H. H., Hsu S. F., Chen C. K., Ting Y. Y. and Chao W. L., 2001. Relationships between disease outbreak in cultured tiger shrimp (Penaeus monodon) and the composition of Vibrio communities in pond water and shrimp hepatopancreas during cultivation. Aquaculture. 192:101 – 110. Elsevier Science, Tawain. Vattanaviboon P. and Mongkolsuk S., 2001. Unusual adaptive, cross protection responses and growth phase resistance against peroxide killing in a bacterial shrimp pathogen, Vibrio harveyi. FEMS Microbiology Letters, 200: 111-116, Laboratory of Biotechnology, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand. Wijayati D. A., 2003. Efficacy of some herbs on controlling Vibrio sp and their toxicity to black tiger-shrimp (Penaeus monodon Fabricius) post larvae, Kasetsart University, Assistant Professor Nontawith Areechon, PhD. 98 pages Zhang X. H., Meaden P. G. and Austin B., 2001. Duplication of Hemolysin Genes in a Virulent Isolate of Vibrio harveyi. Appl. Environ. Microbiol, 67(7): 3161 – 3167. American Society for Microbiology, Department of Biological Sciences, Heriot-Watt University, Riccarton, Edinburgh EH144AS, Scotland. PHỤ LỤC Bảng 1. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 4 giờ Đĩa Nồng độ 200 300 400 500 600 700 1 12,18 13,28 13,98 14,34 15,22 14,78 2 13,06 13,46 14,26 14,84 15,00 15,80 3 12,58 13,86 16,00 14,90 14,38 15,42 4 13,48 14,96 15,08 14,58 14,68 15,16 5 12,56 14,08 14,72 15,16 15,24 15,74 6 13,78 13,28 14,86 14,26 14,46 15,06 7 12,12 13,46 14,52 14,72 14,68 14,98 8 13,62 14,16 13,82 14,12 14,16 14,52 9 13,48 13,82 15,54 15,62 14,22 15,82 10 12,72 13,64 15,12 15,02 13,64 15,02 11 13,74 14,52 15,28 15,12 15,20 15,62 12 12,12 13,36 14,42 14,28 14,26 15,52 13 12,04 12,48 14,68 15,18 15,08 15,28 14 13,44 14,14 14,98 15,84 14,82 16,48 15 12,66 13,92 14,88 14,76 14,88 15,32 16 13,14 14,28 15,18 14,14 15,46 15,94 17 12,64 14,06 15,26 15,04 15,08 16,48 18 12,78 15,22 15,66 15,86 16,00 16,92 19 12,62 14,78 14,62 15,06 15,88 16,54 20 13,06 14,22 15,78 14,38 14,92 14,64 21 13,22 14,34 14,88 14,30 14,28 15,54 22 13,42 13,96 14,68 14,68 15,14 16,24 23 12,84 13,44 14,44 14,26 16,04 15,38 24 13,26 14,62 15,84 14,06 15,24 15,80 25 12,14 14,28 15,02 14,10 14,22 15,58 Bảng 2. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 8 giờ Đĩa Nồng độ (mg/ml) 200 300 400 500 600 700 1 12,52 13,88 14,14 14,32 15,54 14,96 2 13,48 13,82 14,32 15,16 16,42 15,82 3 13,84 14,88 16,74 15,04 14,48 15,76 4 13,54 15,06 15,44 15,00 15,08 15,52 5 13,06 14,74 15,18 16,52 15,56 16,08 6 13,14 15,48 15,32 14,78 14,76 15,14 7 12,52 14,02 14,66 14,24 14,64 15,34 8 13,24 13,86 14,06 14,56 14,36 15,64 9 14,44 15,06 15,66 15,82 14,34 15,48 10 12,22 14,66 15,44 15,00 13,84 14,46 11 14,72 14,96 15,54 15,36 15,46 16,08 12 12,36 13,94 15,76 15,64 14,96 15,82 13 12,12 12,92 15,24 15,32 15,38 15,48 14 13,16 14,56 15,48 16,44 15,42 16,84 15 13,06 14,54 15,66 15,06 14,82 14,78 16 13,28 14,72 15,86 14,42 15,76 16,44 17 12,34 14,12 15,88 15,76 15,30 16,92 18 13,72 15,36 15,42 16,26 16,62 17,88 19 13,38 15,22 15,50 15,28 16,22 16,28 20 13,14 14,58 15,62 14,38 15,52 15,02 21 13,24 14,94 15,46 14,34 14,86 16,04 22 13,66 14,60 15,38 15,14 15,56 16,00 23 13,32 14,12 14,92 14,66 16,52 16,06 24 13,06 15,64 15,72 14,44 16,00 16,18 25 12,82 14,82 15,22 14,20 14,34 15,36 Bảng 3. Bảng kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ lần lập lại 25 lần của hợp chất M sau 12 giờ Đĩa Nồng độ 200 300 400 500 600 700 1 13,66 15,28 15,30 14,90 16,44 17,24 2 14,24 13,70 15,48 15,66 17,54 15,82 3 14,34 16,56 16,16 16,74 13,56 15,90 4 16,98 17,04 16,00 15,02 16,18 15,72 5 13,48 14,00 15,22 16,08 14,88 15,42 6 14,06 17,02 15,94 14,32 14,46 15,26 7 13,68 14,66 14,88 16,38 16,48 17,34 8 13,52 13,78 15,84 15,16 15,58 15,34 9 14,36 17,26 16,52 16,38 15,16 15,48 10 14,36 15,88 16,28 15,38 14,72 15,22 11 16,38 16,72 16,10 15,88 16,28 16,84 12 15,64 15,56 16,64 16,48 15,56 16,94 13 12,06 13,84 16,86 16,82 16,22 17,62 14 15,32 14,72 15,74 17,34 17,10 17,36 15 15,44 17,50 15,72 14,76 15,66 14,42 16 17,78 15,64 15,58 14,38 16,84 16,42 17 16,56 16,08 17,08 16,06 16,42 16,00 18 17,24 17,04 16,92 17,28 16,96 18,00 19 15,84 15,96 15,56 15,34 16,78 17,08 20 14,28 14,04 15,72 14,02 15,44 14,22 21 14,72 16,66 16,72 15,24 14,34 14,76 22 16,24 17,00 16,54 15,90 16,66 17,14 23 16,38 14,74 16,34 15,86 18,16 17,22 24 18,38 19,96 17,42 14,70 18,04 16,78 25 15,02 16,44 17,44 14,06 14,08 15,62 Bảng 4. Thành phần các môi trường trong bộ test sinh hoá định danh Vibrio harveyi STT Tên môi trường Thành phần môi trường 1 Đối chứng (+) NaCl: 2,5 g Glucose: 0,1 g Trypton: 1 g Bromocrezol: 0,002 g pha trong 100 ml nước cất 2 Arginine 0,5 g Arginine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 3 Lysine 0,5 g Lysine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 4 Ornitine 0,5 g Ornitine 2 g NaCl pha trong 100 ml dung dịch đối chứng 5 Đường 0,5 g đường 1,5 g phenol red 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 6 VP MR – VP: 1,7 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 7 Indol Tryptone wasser: 1,5 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 8 Gelatin Tryptone: 1,0 g BE: 0,5 g Gelatin: 12 g NaCl: 2,5 g pha trong 100 ml nước cất 9 Manitol 2,2 g Manitol 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 10 Tinh bột Tinh bột: 0,2 g TSB: 3 g Agar: 1,5 g 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 11 Citrate 2,43 g Citrate 2 g NaCl pha trong 100 ml nước cất 12 O/F (200ml) NaCl: 3 g Glucose: 2 g Tryptone: 1 g BE: 0,6 g Agar: 3 g K2HPO4: 0,06 g Bromomethyl blue: 0,016 g pha trong 200 ml nước cất Bảng 5. Paired Samples Test Sig. (2-tailed) Pair 1 200 (4g) - 200 (8g) 0,010 Pair 2 200 (4g) - 200 (12g) 0,000 Pair 3 200 (8g) - 200 (12g) 0,000 Pair 4 300 (4g) - 300 (8g) 0,000 Pair 5 300 (4g) - 300 (12g) 0,000 Pair 6 300 (8g) - 300 (12g) 0,020 Pair 7 400 (4g) - 400 (8g) 0,006 Pair 8 400 (4g) - 400 (12g) 0,000 Pair 9 400 (8g) - 400 (12g) 0,000 Pair 10 500 (4g) - 500 (8g) 0,049 Pair 11 500 (4g) - 500 (12g) 0,000 Pair 12 500 (8g) - 500 (12g) 0,005 Pair 13 600 (4g) - 600 (8g) 0,008 Pair 14 600 (4g) - 600 (12g) 0,000 Pair 15 600 (8g) - 600 (12g) 0,001 Pair 16 700 (4g) - 700 (8g) 0,000 Pair 17 700 (4g) - 700 (12g) 0,000 Pair 18 700 (8g) - 700 (12g) 0,004 Pair 19 200 (4g) - 300 (4g) 0,000 Pair 20 200 (4g) - 400 (4g) 0,000 Pair 21 200 (4g) - 500 (4g) 0,000 Pair 22 200 (4g) - 600 (4g) 0,000 Pair 23 200 (4g) - 700 (4g) 0,000 Pair 24 300 (4g) - 400 (4g) 0,000 Pair 25 300 (4g) - 500 (4g) 0,000 Pair 26 300 (4g) - 600 (4g) 0,000 Pair 27 300 (4g) - 700 (4g) 0,000 Pair 28 400 (4g) - 500 (4g) 0,558 Pair 29 400 (4g) - 600 (4g) 0,295 Pair 30 400 (4g) - 700 (4g) 0,003 Pair 31 500 (4g) - 600 (4g) 0,562 Pair 32 500 (4g) - 700 (4g) 0,007 Pair 33 600 (4g) - 700 (4g) 0,053 Pair 34 200 (8g) - 300 (8g) 0,000 Pair 35 200 (8g) - 400 (8g) 0,000 Pair 36 200 (8g) - 500 (8g) 0,000 Pair 37 200 (8g) - 600 (8g) 0,000 Pair 38 200 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 39 300 (8g) - 400 (8g) 0,008 Pair 40 300 (8g) - 500 (8g) 0,001 Pair 41 300 (8g) - 600 (8g) 0,000 Pair 42 300 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 43 400 (8g) - 500 (8g) 0,529 Pair 44 400 (8g) - 600 (8g) 0,208 Pair 45 400 (8g) - 700 (8g) 0,000 Pair 46 500 (8g) - 600 (8g) 0,611 Pair 47 500 (8g) - 700 (8g) 0,002 Pair 48 600 (8g) - 700 (8g) 0,004 Pair 49 200 (12g) - 300 (12g) 0,132 Pair 50 200 (12g) - 400 (12g) 0,000 Pair 51 200 (12g) - 500 (12g) 0,004 Pair 52 200 (12g) - 600 (12g) 0,000 Pair 53 200 (12g) - 700 (12g) 0,000 Pair 54 300 (12g) - 400 (12g) 0,056 Pair 55 300 (12g) - 500 (12g) 0,127 Pair 56 300 (12g) - 600 (12g) 0,064 Pair 57 300 (12g) - 700 (12g) 0,011 Pair 58 400 (12g) - 500 (12g) 0,922 Pair 59 400 (12g) - 600 (12g) 0,328 Pair 60 400 (12g) - 700 (12g) 0,038 Pair 61 500 (12g) - 600 (12g) 0,413 Pair 62 500 (12g) - 700 (12g) 0,098 Pair 63 600 (12g) - 700 (12g) 0,236 Bảng 6. Số tôm chết ở các bể thí nghiệm sau các khoảng thời gian Lô thí nghiệm Bể Sau 1 ngày cảm nhiễm Sau 7 ngày dùng thuốc Sau 10 ngày dùng thuốc Sau 14 ngày dùng thuốc Đối chứng dương 1 4 7 9 13 2 3 5 9 12 3 2 5 6 10 Đối chứng âm 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 3 0 0 0 0 Lô thử nghiệm 500 mg/kg 1 3 3 3 3 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 Lô thử nghiệm 750 mg/kg 1 2 2 2 2 2 4 4 4 4 3 3 3 3 3