Khóa luận Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN NGUYỄN NGỌC THANH THẢO BSTY. HOÀNG THANH HẢI BSTY. LÊ HỒNG PHONG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN  Với tất cả lòng kính trọng và yêu thƣơng, con xin cảm ơn Ba Mẹ, Ngƣời đã cho con có ngày hôm nay.  Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô các Khoa, Bộ môn đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua.  Xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Liên đã tận tình dạy bảo, động viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng nhƣ trong việc thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.  Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hoàng Thanh Hải, ngƣời đã luôn bên cạnh, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.  Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa luận.  Xin cảm ơn các bạn, những ngƣời đã chia sẽ mọi buồn vui với Thảo trong suốt 4 năm qua.  Em cảm ơn Anh…! Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2007 Nguyễn Ngọc Thanh Thảo iv TÓM TẮT Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO XƠ PHÔI GÀ”, đƣợc thực hiện tại Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Nội dung: Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi và xác định tuổi phôi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất. Nuôi cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ cấp. Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng. Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản. Các kết quả thu đƣợc: Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau và cao hơn số tế bào tách đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi. Số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao hơn số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 106). Độ tuổi phôi và quy trình tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào in vitro. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao hơn tế bào sơ cấp. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy. v SUMMARY Graduating thesis topic: “IMPROVE THE PROCEDURE OF HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS”. The thesis was carried out at Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and Veterinary, Nong Lam university Ho Chi Minh city from 4/2007 to 8/2007. Contents of research: Trying 2 trypsin process for the culture of primary cells from embryonated eggs at 8 th , 9 th , 10 th day then define a trypsin process and an age of embryo for primary culture. Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary cells. Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen. Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected. Result: The number of CEF cells were removed from 9th day embryo tantamount to those from 10 th day embryo and more than those from 8 th day embryo . The number of CEF cells were removed by cool trypsin process (49,73x106) more than those by warm trypsin process (25,51 x 10 6 ). The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro cells. The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in vitro. 5th day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the substrate and grow. vi MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang bìa 1 ........................................................................................................... i Trang bìa 2 .......................................................................................................... ii Lời cảm ơn ......................................................................................................... iii Tóm tắt tiếng Việt .............................................................................................. iv Tóm tắt tiếng Anh ............................................................................................... v Mục lục ............................................................................................................... vi Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................. ix Danh sách các hình .............................................................................................. x Danh sách các bảng ............................................................................................ xi Danh sách các biểu đồ ........................................................................................ xi Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xi 1. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................... 1 1.2. Mục đích ................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................... 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật ....... 3 2.2. Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào ...... 5 2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất ................................................................ 6 2.2.2. Tính chất cơ học yếu ...................................................................... 7 2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trƣởng rất chậm ..................... 7 2.2.4. Cần giá đỡ trong quá trình phát triển và nhân đôi ......................... 8 2.2.5. Chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng ............................................................................................. 8 2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ ............................................................ 8 2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo ................................. 8 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật ................................................... 9 vii 2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp .............................................................................. 9 2.3.2. Sự cấy chuyển ................................................................................ 9 2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào.............................................................. 10 2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn ................................................................. 10 2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù ............................................................ 10 2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật ............................ 11 2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy.......................... 12 2.3.6. Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật ....................... 13 2.3.7. Vấn đề cần lƣu ý khi nuôi cấy tế bào động vật ............................ 19 2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật ..................................... 19 2.3.8.1. Pha ức chế ........................................................................... 19 2.3.8.2. Pha phát triển ....................................................................... 19 2.3.8.3. Pha ổn định .......................................................................... 20 2.3.8.4. Pha suy giảm ....................................................................... 20 2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy ............................................................... 20 2.4.1. Những ƣu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy .................... 20 2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào .................................................... 21 2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản ............... 22 2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật ................................................ 22 2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình .......................................................... 23 2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào ................................................................. 23 2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ ...................................................................... 23 2.5.4. Virus học ...................................................................................... 23 2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào .............................................. 23 2.5.6. Chẩn đoán di truyền ..................................................................... 24 2.5.7. Kỹ thuật di truyền ........................................................................ 24 2.5.8. Liệu pháp gene ............................................................................. 25 2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc ......................................................... 25 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 26 viii 3.1. Thời gian và địa điểm ............................................................................ 26 3.1.1. Thời gian ...................................................................................... 26 3.1.2. Địa điểm ....................................................................................... 26 3.2. Vật liệu và hóa chất ............................................................................... 26 3.2.1. Đối tƣợng ..................................................................................... 26 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .................................................... 26 3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng ......................................................... 27 3.3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 27 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 28 3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà ....................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp..................................................... 28 3.4.3. Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer ................. 29 3.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào................................................... 30 3.4.5. Phƣơng pháp bảo quản tế bào ...................................................... 31 3.4.6. Phƣơng pháp hồi phục tế bào ....................................................... 31 3.5. Chỉ tiêu theo dõi ..................................................................................... 31 3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu ..................................................................... 31 3.7. Quy trình tiến hành thí nghiệm .............................................................. 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 33 4.1. Xác định tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào thích hợp ................... 33 4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ..................................... 35 4.3. Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản .......................................................................... 37 4.3.1. Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ................... 37 4.3.2.Xác định khả năng sống của tế bào sau bảo quản ......................... 39 4.4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam .......... 41 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 43 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 44 7. PHỤ LỤC ...................................................................................................... 46 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CEF: Chicken Embryo Fibroblast. DMSO: dimethyl sulfoxide. EMEM: Eagle’s minimum essential medium. FBS: Fetal bovine serum. HEPES: N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid. MEM: Minimum essential medium. PBSA: Phosphate bufferd saline solution A. x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Mô hình một tế bào động vật điển hình .............................................. 5 Hình 2.2: Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn ................................................ 10 Hình 2.3: Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào ........................................... 11 Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào.......................................................................... 21 Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào ........................................................ 22 Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer........................................................................ 29 Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm ........................................................... 30 Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy .................................................... 36 Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp ................................................ 36 Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp .............................................. 38 Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục ....................................... 40 Hình 4.5: Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục ..................................... 40 xi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu đƣợc từ các tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ................................................................... 34 Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp (giờ) .................................................................................................. 35 Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp (giờ) .................................................................................................. 37 Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi ................................................... 37 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1: Số lƣợng tế bào thu đƣợc từ các độ tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào ............................................................. 33 Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp ............. 35 Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp ......................................................................................... 38 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3: Quy trình thực hiện thí nghiệm ........................................................... 32 Sơ đồ 4: Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà .................................................. 42 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Động vật cũng nhƣ nhiều loại sinh vật đa bào khác đƣợc cấu tạo từ các loại mô khác nhau. Các mô đƣợc cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Nhƣ vậy, tế bào là đơn vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống. Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các nghiên cứu sinh học, y học nhƣ: nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đƣờng trao đổi chất, kiểm tra ảnh hƣởng của các chất lên từng tế bào riêng biệt, nghiên cứu sản xuất mô nhân tạo, tổng hợp các chất sinh học nhƣ vaccine, hormone… Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hƣớng đi về kỹ thuật, tìm môi trƣờng tƣơng ứng và đang bƣớc vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chƣa phát triển, đa số tế bào nuôi cấy đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài. Tế bào phôi gà là loại tế bào có khả năng phát triển và sinh sản rất cao, dễ dàng bám vào bề mặt bình nuôi cấy và môi trƣờng nuôi không cần nồng độ huyết thanh cao nhƣ các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phôi chuột, các dòng tế bào ung thƣ…) (Phan Kim Ngọc, 2002). Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phôi gà trong điều kiện ở Việt Nam là hoàn toàn có khả năng thực hiện đƣợc nhằm phục vụ cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng nhƣ làm nền tảng cho những nghiên cứu sau này. 2 Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, đƣợc sự phân công của bộ môn Vi sinh- Truyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Trần Thị Bích Liên, BSTY Hoàng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà”. 1.2. Mục đích Xây dựng quy trình nuôi cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phôi gà trong nghiên cứu, chẩn đoán bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm. 1.3. Yêu cầu - Tiến hành tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi bằng cách sử dụng hai quy trình trypsin ấm và trypsin lạnh. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 6 lần. - Khảo sát số lƣợng tế bào thu đƣợc, thời gian tạo một lớp tế bào và khả năng sống của tế bào sau thời gian bảo quản tronng Nitơ lỏng. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho nhiều nhà khoa học về thực vật và động vật bắt đầu nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc (tế bào mầm). Mặt khác, thực tế cuộc sống đòi hỏi vấn đề nuôi tế bào động vật ngày càng trở nên cấp bách. Trƣớc đây, ngƣời ta nuôi cấy virus trong cơ thể một sinh vật chủ. Từ đó, ngƣời ta thu nhận virus và dùng nó để sản xuất vaccine. Việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này đã có những kết quả rất tốt và đóng vai trò rất quan trọng trong phòng và chữa bệnh hàng chục năm qua. Hiện nay, ngƣời ta vẫn áp dụng có hiệu quả phƣơng pháp này để sản xuất vaccine cho ngƣời và gia súc. Tuy nhiên, việc sản xuất vaccine theo phƣơng pháp này vẫn có những hạn chế cần khắc phục. Trong đó, khó khăn nhất là phải sử dụng một số lƣợng lớn động vật cho quá trình nuôi virus. Điều đó không chỉ khó khăn về mặt kỹ thuật mà còn khó khăn về tài chính. Việc nuôi cấy tế bào động vật đặt ra cho các nhà khoa học những thách thức không nhỏ. Bởi lẽ, nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nhiều so với nuôi cấy vi sinh vật và nuôi cấy tế bào thực vật. Kiến thức tổng quát cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật đƣợc đƣa ra từ thế kỷ 19. Năm 1855, Roux chứng minh đƣợc khả năng giữ toàn vẹn đặc tính sinh học của tế bào phôi gà trong dung dịch nƣớc muối sinh lý. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong nhận thức về sự sống của tế bào ngoài cơ thể, nó mở ra khả năng phát triển sự sống bên ngoài cơ thể đa bào. 4 Đến năm 1907, Ross Harrison đã tách thành công tế bào thần kinh ếch để làm thí nghiệm thử nuôi chúng ngoài cơ thể. Nhƣng cho đến đầu những năm 1950, chỉ có vài công trình nhằm tăng cƣờng khả năng nuôi cấy tế bào đƣợc nghiên cứu. Đầu tiên là sự phát triển của thuốc kháng sinh để tránh các tác nhân gây nhiễm trong giai đoạn đầu nuôi cấy tế bào. Thứ hai là sự phát triển các kỹ thuật, nhƣ dùng trypsin để tách tế bào từ bình nuôi cấy. Kỹ thuật này rất quan trọng khi cần thu hoạch các dòng tế bào đang phát triển liên tục. Thứ ba là thông qua việc nuôi cấy tế bào với các loại môi trƣờng khác nhau để tìm ra thành phần môi trƣờng thích hợp nhất cho dòng tế bào đó. Một đột phá có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động vật thuộc về những nghiên cứu của Carrel (1913). Ông đã làm rất nhiều thí nghiệm và cuối cùng ông đã đƣa ra một kết luận có tính chất mở đƣờng cho những thí nghiệm tiếp theo của rất nhiều tác giả đƣơng thời: tế bào động vật hoàn toàn có thể sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro nếu ta thƣờng xuyên cung cấp các chất dinh dƣỡng vô trùng cần thiết. Đến năm 1948, bằng những kỹ thuật mới, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trƣờng đặc biệt, tác giả đã thu nhận đƣợc những dòng tế bào biệt lập. Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng loại mô và phát triển chúng trong những môi trƣờng nhân tạo. Năm 1952, Gey đã tách tế bào ung thƣ ở ngƣời và nuôi chúng thành công. Sau đó hai năm (1954), Levi – Moutalcini đã đi xa hơn trong nghiên cứu bằng cách tìm hiểu ảnh hƣởng của những chất điều hòa sinh trƣởng lên sự phát triển của tế bào trong nuôi cấy in vitro. Ông dùng yếu tố tăng trƣởng thần kinh (NGE – Nerve Growth Factor) để kích thích sự tăng trƣởng của tế bào thần kinh khi nuôi chúng in vitro. Những nghiên cứu sau này của Eagle (1955), Puck (1956), Temin và Rubin (1958), Hayflick (1961), Littlefield (1964), Ham (1965), Kohler (1975), Sato (1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau: 5 - Tìm ra đƣợc nhiều loại môi trƣờng thích hợp cho sự phát triển in vitro của nhiều loại mô khác nhau của ngƣời và động vật. - Hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô động vật. - Tạo ra đƣợc một số đột biến có ích. Những nghiên cứu liên tục từ năm 1950 đến nay đã có ý nghĩa thực tế rất lớn trong kỹ thuật sản xuất vaccine cho ngƣời và gia súc. Nhƣ vậy, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất dài tìm hƣớng đi về kỹ thuật, tìm môi trƣờng tƣơng ứng và đang bƣớc vào giai đoạn sản xuất theo quy mô công nghiệp ở dạng vừa và nhỏ. Tƣơng lai, hƣớng nghiên cứu này sẽ đem lại những thành tựu khoa học cũng nhƣ lợi ích kinh tế rất lớn. Trƣớc mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật sẽ phục vụ cho hai ngành: ngành y và ngành chăn nuôi. Hai ngành này đang cần những kỹ thuật hiện đại để phát triển. 2.2. Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào Hình 2.1. Mô hình một tế bào động vật điển hình Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lƣới nội chất (ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung xƣơng tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể, (10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể. (Nguồn: 2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của cơ thể đƣợc tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống. 6 Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trƣờng sống. Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hƣởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất dinh dƣỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động của enzyme. Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tác động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào. Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào nhƣ ở thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp. Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dƣỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình dinh dƣỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật đƣợc thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng nhƣ khả năng phân chia tế bào. Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hƣởng quyết định đến kết quả: - Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào. - Những yếu tố môi trƣờng quyết định đặc trƣng riêng biệt của tế bào. Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hƣớng sản phẩm cuối, còn sự hiểu biết về đặc trƣng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng đó đƣợc biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy. Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in 7 vitro là những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi tác động của môi trƣờng đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào đƣợc nuôi cấy. 2.2.2. Tính chất cơ học yếu Ở tế bào vi sinh vật, tế bào đƣợc bao bọc bởi thành tế bào – đƣợc cấu tạo từ những hợp chất hữu cơ khá bền, khó bị phân hủy khi tế bào còn đang phát triển. Ở tế bào thực vật, thành tế bào còn đƣợc cấu tạo bởi hợp chất lignocellulose hay pectinocellulose, các hợp chất này tạo ra tính chất cơ học, hóa học, vật lý khó bị phân hủy hơn rất nhiều so với cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật. Tế bào động vật hoàn toàn không có thành tế bào, mà chúng chỉ đƣợc bao bọc bởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác trong mô. Mặt khác, kích thƣớc tế bào động vật thƣờng rất lớn, trung bình khoảng 10 μm, lại không có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào, trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào cần khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút) (Phan Kim Ngọc, 2002). 2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trƣởng rất chậm Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thƣờng phân chia với tốc độ rất nhanh, khoảng 20-50 phút. Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thƣờng kéo dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lƣợng một cách bất thƣờng, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý. 2.2.4. Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào nhƣ tế bào ung thƣ hoặc dòng tế bào kiên tục từ mô bình 8 thƣờng (sau khi đƣợc thuần hóa) có thể sinh trƣởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc, 2002). 2.2.5. Chịu ảnh hƣởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng Đây là cơ chế kiềm hãm ngƣợc bởi sản phẩm cuối (negative feed – back). Bất kỳ tế bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thƣờng thì các sản phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm. 2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật đƣợc xem nhƣ một loại tế bào trần tự nhiên. Chúng đƣợc bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trƣờng hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tƣợng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai. 2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải đƣợc bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ đƣợc những đặc tính riêng của nó. Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-1960C), tế bào động vật vẫn duy trì đƣợc đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Phƣơng pháp này đƣợc áp dụng nhiều ở các ngân hàng giống động vật trên thế giới. Khi sử dụng, tế bào động vật đƣợc tiến hành giải đông và đƣợc hoạt hóa để phục hồi khả năng tăng trƣởng và phân chia nhƣ trƣớc khi đem bảo quản. Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trƣờng, rất nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trƣờng nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone. 2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật 2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp Định nghĩa: nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002). 9 Việc nuôi cấy đƣợc bắt đầu tiến hành khi các tế bào đƣợc tách ra từ mô bằng phƣơng pháp cơ học hay bằng phƣơng pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trƣởng trong môi trƣờng thích hợp. Có nhiều loại enzyme để tách tế bào nhƣ collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… nhƣng trypsin đƣợc dùng nhiều nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá thành rẻ. Trypsin (và pronase) có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các tế bào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002). Dù tế bào đƣợc tách ra bằng bất kỳ phƣơng pháp nào thì đây vẫn là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tƣơng đối đồng dạng. Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào nhƣ dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại đƣợc trong dịch huyền phù. Những tế bào đó là đối tƣợng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ cấp. Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần với mô cha mẹ nhất. 2.3.2. Sự cấy chuyển Khi những tế bào trong bình nuôi cấy sơ khởi phát triển và làm đầy bề mặt bình nuôi cấy, chúng cần đƣợc cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển. Qua mỗi lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ƣu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ chết dƣới tác động của trypsin và thao tác cấy chuyền. Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và tiến triển về hình thái, nhƣng từ lần cấy chuyển thứ ba, tế bào trở nên ổn định hơn, có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế bào từ bình nuôi cấy bằng enzyme (tƣơng tự enzyme đã dung khi tách tế bào để nuôi cấy sơ khởi), enzyme này phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất. Ngay sau khi tế bào đƣợc tách rời, enzyme đƣợc bất hoạt nhờ môi trƣờng nuôi cấy (có chứa huyết thanh), huyền phù tế bào đƣợc chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới. 10 2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào 2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn Thƣờng sử dụng các dụng cụ nhƣ đĩa, bình T – flask, hệ thống trục xoay hay vĩ nhiều giếng đƣợc xử lý cho nuôi cấy mô. Các dụng cụ này đƣợc chọn tùy vào số lƣợng tế bào, bản chất môi trƣờng nuôi cấy, giá thành và thói quen của ngƣời sử dụng. Đĩa Bình T - flask Trục xoay Vĩ nhiều giếng Hình 2.2. Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn (Nguồn: www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_ culture.pdf) 2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù Thƣờng đƣợc tiến hành trong: - Bình có cánh quạt xoay từ hoặc bình lắc Erlenmeyer. Trong đó, tế bào đƣợc giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trƣờng. 11 Bình Erlenmeyer Bình có cánh quạt xoay Hình 2.3. Các dụng cụ nuôi cấy huyền phù tế bào (Nguồn: www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_ culture.pdf) - Bình nuôi cấy tĩnh nhƣ bình T – flask hoặc chai, mặc dù tế bào không đƣợc giữ ở trạng thái chuyển động nhƣng chúng không thể nào bám vào bề mặt bình nuôi cấy đƣợc. Nhiều dòng tế bào, đặc biệt là những dòng từ mô bình thƣờng đƣợc xem là dòng phụ thuộc chỗ bám (Anchorage – Dependent), chúng chỉ có thể phát triển khi bám vào một chất nền thích hợp. Vài dòng tế bào không đƣợc xem là tế bào bình thƣờng (Transformed Cells) có thể phát triển nhanh mà không cần bám vào bề mặt hoặc di chuyển tự do trong dịch huyền phù (ví dụ: tế bào máu). 2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật Những tế bào nuôi cấy thƣờng đƣợc mô tả dựa trên hình thái (hình dạng và biểu hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng. Có 5 dạng hình thái cơ bản: - Dạng biểu mô (Epithelial – like): những tế bào này bám trên bề mặt có dạng đa giác và dát mỏng. - Lympho bào (Lymphoblast – like): là những dòng tế bào thƣờng không bám lên bề mặt nhƣng tồn tại trong dịch huyền phù dƣới dạng hình cầu. - Nguyên sợi bào (Fibroblast – like): những tế bào bám trên bề mặt và có biểu hiện thon dài, có hai đầu, thƣờng có dạng xoáy khi nuôi cấy với mật độ dày đặc. 12 - Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc trƣng, ít quan sát đƣợc sự phân chia trong môi trƣờng. - Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa thành dạng ống trong quá trình nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc xác định hình dạng và nuôi cấy nhiều tế bào có khả năng biểu hiện sự đa dạng về hình thái. Sử dụng kỹ thuật đồng nhất tế bào cũng có thể lai các tế bào với nhau bằng cách kết hợp những tế bào từ bố mẹ khác nhau, cho biểu hiện đặc điểm của cha hoặc mẹ hoặc cả cha và mẹ. Kỹ thuật này đƣợc sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng theo mong muốn. Những tế bào lai này gọi là Hybridomas đƣợc kết hợp từ hai tế bào khác nhau. Thứ nhất là một lympho bào lách (có khả năng sản xuất kháng thể mong muốn). Thứ hai là một tế bào myeloma đang phân chia nhanh (một loại tế bào ung thƣ). Kết quả, thể lai có thể sản xuất số lƣợng lớn kháng thể mong muốn. Những kháng thể này gọi là kháng thể đơn dòng bởi sự tinh sạch của nó, ứng dụng nhiều trong điều trị, chẩn đoán bệnh, và công nghiệp với giá trị hằng năm trên một tỉ đô la. 2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc (gan, tim…) và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện môi trƣờng. Những marker hóa sinh đƣợc sử dụng để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng có trong cơ thể sống hay không (ví dụ: tế bào gan tiết albumin). Những dấu hiệu hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể đƣợc xác định (chẳng hạn sự đập của tế bào tim). Thông thƣờng, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế bào trong điều kiện nhân tạo. Sau một số lần cấy chuyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và biểu hiện sự hóa già. Những dòng tế bào này đƣợc gọi là “có hạn” (Finite); tế bào CEF là một dòng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16 – 18 lần (Christman và ctv, 2006). Những dòng tế bào khác có thể phân chia không giới hạn (hoặc trở thành bất tử) và đƣợc gọi là dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Line). 13 Khi một dòng tế bào “có hạn” bình thƣờng trở thành bất tử, nó trải qua một sự thay đổi không thể đảo ngƣợc (Transformation). Nó có thể xảy ra tự phát hay do sử dụng thuốc, bức xạ hay virus có chủ định. Những tế bào biến đổi thƣờng phát triển dễ hơn và nhanh hơn, thƣờng có Chromosome lớn hoặc không bình thƣờng và có thể phát triển trong dịch huyền phù. 2.3.6. Điều kiện thích hợp cho nuôi cấy tế bào động vật Một điều kiện thích hợp (“happy”) là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho phép tế bào tồn tại trong nuôi cấy. Thông thƣờng, nó là điều kiện cho phép những tế bào - ở số lƣợng rất ít – tăng số lƣợng thông qua sự phân chia. Đúng hơn là, khi có những điều kiện xác định, tế bào nuôi cấy sẽ biểu hiện sự thích hợp của chúng với điều kiện sống, nhƣ mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng nhƣ trong cơ thể sống, chẳng hạn sự co cơ hay sự tiết hormone và enzyme. Để có điều kiện sống này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám tốt và môi trƣờng nuôi cấy chuẩn xác.  Nhiệt độ thƣờng là tƣơng tự nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào đƣợc tách ra. Với sinh vật máu lạnh, nhiệt độ thƣờng thay đổi từ 18 – 250C, hầu hết động vật hữu nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36 – 370C. Phạm vi nhiệt độ này đƣợc bảo đảm bằng nhiệt kế và tủ ấm phải đƣợc kiểm tra thƣờng xuyên.  Những tế bào phụ thuộc chỗ bám cũng đòi hỏi một chất nền tốt để bám và phát triển. Thủy tinh và plastic (đƣợc xử lý đặc biệt) thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Tuy nhiên, những yếu tố bám nhƣ collagen, gelatin, fibronectin cũng có thể đƣợc sử dụng nhƣ “áo khoác” cho bề mặt bám để cải tiến sự phát triển và chức năng của những tế bào lấy từ não, máu, thận, gan, da… Thƣờng thì những tế bào phụ thuộc chỗ bám bình thƣờng sẽ có chức năng tốt hơn nếu chúng đƣợc phát triển trên một chất nền xốp hay có dạng tổ ong. Tế bào cũng có thể phát triển trên các hạt trong huyền phù (hạt thủy tinh, plastic, polyacrylamide và hệ thống các phân tử dextrin). Bằng cách này, các tế bào phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển trong hệ thống nuôi cấy huyền phù và làm tăng khả năng sản xuất tế bào bằng phƣơng pháp sinh học. 14  Môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả năng làm tế bào phát triển tốt. Bên cạnh những đòi hỏi dinh dƣỡng cơ bản của tế bào, môi trƣờng nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH và áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O2 và CO2). Thành phần dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate. Chúng cho phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát triển và các hoạt động chức năng – tƣơng tự nhƣ sự cung cấp năng lƣợng cho trao đổi chất. Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không đƣợc tổng hợp trong cơ thể nên cần phải đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Nhu cầu về cysteine và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dòng tế bào. Các amino acid không cần thiết khác cũng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng để bù đắp cho những dòng tế bào không có khả năng tổng hợp. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, hiện nay, một số bằng chứng cho thấy glutamine đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào nhƣ nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lƣợng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Vitamine: môi trƣờng MEM của Eagle (EMEM) chỉ có các vitamine thuộc nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ đƣợc bổ sung từ huyết thanh. Khi tăng thành phần môi trƣờng lên (mục đích để giảm lƣợng huyết thanh xuống) thì danh sách các vitamine trong môi trƣờng cũng phải tăng theo. Khi giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng thì việc bổ sung các vitamine khác ngoài những vitamine đã có sẳn trong môi trƣờng là rất cần thiết. Khi mật độ tế bào trong môi trƣờng nuôi cấy thấp (trong giai đoạn nhân dòng tế bào) thì cần phải tăng lƣợng vitamine cho dù trong môi trƣờng đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về vitamine có ảnh hƣởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trƣởng của tế bào hơn là trên mật độ tế bào. Muối: các loại muối chủ yếu nhƣ Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO3 2- , PO4 3- và HCO3 - là thành phần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trƣờng. Trong huyền 15 phù tế bào, lƣợng Ca2+ thƣờng đƣợc giảm xuống để hạn chế sự kết cụm của tế bào. Nồng độ của HCO3 - đƣợc xác định bởi nồng độ CO2 ở dạng khí. Glucose: glucose đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp năng lƣợng. Glucose đƣợc chuyển hóa chủ yếu bởi quá trình đƣờng phân (glycolyse) tạo ra acid lactic để đi qua chu trình Krebs giải phóng CO2. Nghiên cứu lƣợng acid lactic tích tụ trong môi trƣờng, đặc biệt là khi nuôi các tế bào phôi và các tế bào biến đổi, ngƣời ta thấy rằng chu trình Krebs ở đây hoạt động không trọn vẹn nhƣ in vivo, và carbon trong acid lactic chủ yếu là chuyển hóa từ glutamine, chỉ một phần nhỏ là từ glucose. Điều này giải thích cho nhu cầu về glutamine và glutamate của tế bào nuôi cấy. Khoáng chất: cũng nhƣ một vài loại vitamine, hầu hết các khoáng chất cần thiết cho tế bào đƣợc cung cấp bởi huyết thanh. Việc bổ sung các chất này vào môi trƣờng nói chung không cần thiết lắm, trừ khi có sự giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng. Trong môi trƣờng có hàm lƣợng huyết thanh thấp hoặc hoàn toàn không có huyết thanh thì lúc đó cần phải bổ sung sắt, đồng, kẽm, selenium và các nguyên tố khác vào môi trƣờng nuôi cấy. Các chất hữu cơ khác: các hợp chất khác nhau nhƣ nucleoside, các chất trung gian của chu trình Krebs, pyruvate và lipid cũng có mặt trong các môi trƣờng nuôi cấy phức tạp. Những hợp chất này cần thiết khi giảm lƣợng huyết thanh trong môi trƣờng nuôi cấy. Các chất này có vai trò trong nhân dòng và duy trì các dòng tế bào chuyên biêt. Trong hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật đều cần đến huyết thanh vì nó có những vai trò quan trọng nhƣ sau (Phan Kim Ngọc, 2002): - Cung cấp chất dinh dƣỡng quan trọng cho tế bào nhƣ các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lƣợng… - Cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, kích thích cho tế bào tăng trƣởng và phân chia. - Kích thích sự phục hồi các tổn thƣơng của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thƣơng tế bào. 16 - Cải thiện tính tan của các chất dinh dƣỡng. - Cải thiện tính dích của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ. - Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy. Huyết thanh đƣợc sử dụng trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy mô là huyết thanh bê, huyết thanh phôi bò, huyết thanh ngựa và huyết thanh ngƣời. Huyết thanh bê thƣờng đƣợc sử dụng nhiều nhất, kế đến là huyết thanh bò (tùy theo nhu cầu của dòng tế bào) và huyết thanh ngƣời đƣợc sử dụng trong nuôi cấy một số dòng tế bào của ngƣời. Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều. Ngoài ra, huyết thanh còn dể bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lƣợng của những lô môi trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp, không chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy). Hormone: hormone có những ảnh hƣởng khác nhau trên tế bào và thƣờng khó có thể nhận ra đƣợc tác động chính của chúng. Insulin kích thích sự hấp thu glucose và amino acid và có lẽ khả năng kích thích sự phân chia tế bào của nó đã ảnh hƣởng đến thuộc tính này. Một vài yếu tố tăng trƣởng kết hợp với chất nhận của insulin trên bề mặt của tế bào và có những hoạt động tƣơng tự. Các hormone tăng trƣởng có thể có mặt trong huyết thanh, đặc biệt là trong huyết thanh bò và cùng với somatomedine ảnh hƣởng trên sự phân bào. Hydrocortisone cũng có trong huyết thanh với hàm lƣợng thay đổi. Chất này có thể kích thích sự bám dính của tế bào và sự tăng sinh của tế bào. Nhƣng trong những điều kiện nhất định (nhƣ khi mật độ tế bào cao) thì cản sự phân bào và có thể cảm ứng sự biệt hóa tế bào. Trong các thí nghiệm giảm hoặc bỏ hẳn huyết thanh trong môi trƣờng nuôi cây cho thấy các hormone cần thiết cho sự nuôi cấy có thể cũng có mặt trong thành 17 phần của huyết thanh nên việc bổ sung huyết thanh vào môi trƣờng nuôi cấy là cần thiết. Các chất biến dưỡng và các dưỡng chất: trong huyết thanh cũng có các amino acid, glucose, ketoacid và một số các dƣỡng chất, các chất biến dƣỡng trung gian. Những chất này quan trọng trong các môi trƣờng đơn giản, nhƣng ít quan trọng hơn trong các môi trƣờng phức tạp, đặc biệt là những môi trƣờng có ít các chất bổ sung khác và các amino acid với nồng độ cao. Các yếu tố kiềm hãm: huyết thanh có thể có chứa những cơ chất có tác dụng kiềm hãm sự tăng sinh của tế bào. Một số chất có thể đƣợc tạo ra trong quá trình chuẩn bị môi trƣờng nhƣ độc tố của các loại vi khuẩn nhiễm vào môi trƣờng trƣớc khi qua lọc vô trùng, các phân đoạn của γ – globulin có thể chứa các loại kháng sinh gây trở ngại cho việc nuôi cấy. Hơi nóng có thể làm phân hủy một vài phức chất trong huyết thanh và làm giảm tính độc của immunoglobulin mà không gây hại đến các yếu tố tăng trƣởng là polypeptide, hơi nóng có thể làm phân hủy một số chất dễ bị biến tính bởi nhiệt và thành phần của huyết thanh sẽ không còn giống nhƣ trƣớc khi xử lý. Sự tác động của những yếu tố kiềm hãm chuyên biệt trong mô lên sự tăng sinh của tế bào hoặc những hormone ức chế ở trong huyết thanh chƣa thể xác định đƣợc, mặc dù một số hormone có thể ức chế theo cách không chuyên biệt. Môi trƣờng cũng góp phần kiểm soát pH và là chất đệm cho tế bào tránh sự thay đổi pH đột ngột. Chất đệm trong môi trƣờng thƣờng là CO2 – bicarbonate hay là đệm hữu cơ nhƣ HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulphonic acid), đƣợc sử dụng để giữ pH môi trƣờng trong khoảng 7,0 – 7,4 tùy loại tế bào nuôi cấy. Đệm CO2 – bicarbonate điều chỉnh lƣợng CO2 hòa tan trong môi trƣờng, thƣờng đƣợc sử dụng khi dùng tủ ấm kiểm soát CO2 và đƣợc cung cấp từ 2 – 10% CO2 (với đệm của Earle), còn môi trƣờng sử dụng đệm CO2 – bicarbonate của Hank không đòi hỏi CO2, nhƣng phải đƣợc đặt trong bình kín. Cuối cùng, áp suất thẩm thấu rất quan trọng với việc điều chỉnh dòng chất trong và ngoài tế bào. Nó đƣợc kiểm soát bởi sự thêm hay bớt một lƣợng muối 18 trong môi trƣờng nuôi cấy. Sự bay hơi của môi trƣờng ở hệ thống nuôi cấy hở (đĩa…) sẽ làm tăng nhanh áp suất, làm cho tế bào bị stress, biến dạng hoặc chết. Với hệ thống nuôi cấy hở, cần có tủ ấm với ẩm độ cao để hạn chế sự bay hơi của môi trƣờng. Đánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy Ƣớc lƣợng trạng thái sức khỏe nói chung hay sự “happy” của tế bào nuôi cấy thƣờng dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện chức năng đặc biệt.  Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất nhƣng thƣờng ít đƣợc sử dụng nhất. Tuy đặc điểm này đƣợc theo dõi thƣờng xuyên khi nuôi cấy nhƣng rất khó đƣa ra kết luận dựa vào những quan sát này. Ngoài ra, đặc điểm này không thể hiện một số lƣợng hay đo lƣờng chính xác nào. Phƣơng pháp này thỉnh thoảng sai khi quan sát tế bào bằng kính hiển vi và vi trƣờng quan sát xấu hay có biểu hiện bất thƣờng. Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tế bào đó với crystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác định vấn đề bất thƣờng.  Đếm tế bào để ƣớc lƣợng số lƣợng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển – tỷ lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy. Dựa vào đó để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trƣờng, chất nền, huyết thanh…) tốt hơn cho tế bào.  Năng suất che phủ là phƣơng pháp kiểm tra dựa trên số lƣợng nhỏ tế bào (từ 20 – 200) bám trên bình nuôi cấy và số lƣợng các cụm tế bào đặc trƣng đƣợc xác định. Phần trăm các cụm tế bào đặc trƣng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trong khi kích thƣớc cụm tế bào đặc trƣng cho tỷ lệ phát triển. Phƣơng pháp này tƣơng tự phƣơng pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhƣng nhạy cảm hơn với sự khác biệt nhỏ của điều kiện nuôi cấy.  Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thƣờng khó quan sát và đo lƣờng nhất, đƣợc xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch. Những tế bào đƣợc nuôi cấy có thể phát triển rất tốt trong điều kiện gần tối ƣu, 19 trong khi chức năng đặc biệt thƣờng đòi hỏi điều kiện nuôi cấy hoàn chỉnh và thƣờng nhanh chóng mất đi khi tế bào bám lên bề mặt bình nuôi cấy. 2.3.7. Vấn đề cần lƣu ý khi nuôi cấy tế bào động vật Tránh sự tạp nhiễm: sự tạp nhiễm trong nuôi cấy tế bào có hai loại chính là nhiễm hóa học và nhiễm sinh học. Nhiễm hóa học là khó phát hiện nhất, nó gây ra bởi nhiều tác nhân nhƣ: endotoxin, ion kim loại hoặc thuốc tẩy hóa học - những chất này không thể nhìn thấy đƣợc. Nhiễm sinh học: nấm, vi khuẩn phát triển nhanh và thƣờng có thể thấy biểu hiện trong nuôi cấy (thay đổi pH hoặc đục môi trƣờng) và do đó dễ phát hiện (thƣờng xảy ra nếu thiếu kháng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy). Tuy nhiên, hai dạng khác của nhiễm sinh học là mycoplasma và virus thì không dễ phát hiện và đòi hỏi những phƣơng pháp xác định đặc biệt. Hai yêu cầu chính để tránh tạp nhiễm: thứ nhất là đảm bảo vô trùng tốt trong khu vực làm việc, thứ hai là môi trƣờng, dụng cụ phải đƣợc tiệt trùng, cất giữ và sắp xếp hợp lý. Sử dụng kháng sinh cẩn thận và có giới hạn trong nuôi cấy mô có thể giúp tránh tổn thất do tạp nhiễm sinh học. 2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật 2.3.8.1. Pha ức chế Pha ức chế là pha đầu tiên, nó phụ thuộc rất nhiều yếu tố nhƣ thành phần, mật độ, trạng thái ban đầu của tế bào... Pha này xảy ra sớm, không tăng về số lƣợng tế bào (số lƣợng tế bào có thể giảm). Nếu mật độ nuôi cấy và khả năng sống của tế bào nuôi cấy thấp thì pha này sẽ kéo dài hơn. 2.3.8.2. Pha phát triển Sau 3 – 4 ngày nuôi cấy, số lƣợng tế bào sẽ bắt đầu tăng lên nhanh chóng. Trong chẩn đoán, thƣờng sử dụng bình tế bào đã phủ 80% bề mặt bình (ở pha phát triển). 20 2.3.8.3. Pha ổn định Mật độ tế bào không tăng, tốc độ chết bằng tốc độ sinh trƣởng. Sự sinh trƣởng của tế bào bị hạn chế do: Hết dinh dƣỡng. Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất có thể ức chế sự phát triển của tế bào. Tế bào đã phủ kín trên chất nền, nên không còn chỗ bám và không thể sinh sản tiếp đƣợc. 2.3.8.4. Pha suy giảm Số lƣợng tế bào chết tăng, mật độ tế bào sống giảm. 2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy Để bảo đảm sức khỏe nói chung hay sự phát triển của tế bào nuôi cấy nói riêng cần chú ý giảm thiểu khả năng rủi ro và sự tạp nhiễm. Bên cạnh đó, khả năng phát triển nhanh của tế bào sẽ thay đổi, nhƣ tất cả mọi sinh vật, những biến đổi do tuổi tác hay sự thay đổi môi trƣờng có thể làm giảm khả năng và sự phát triển liên tục của tế bào. Có thể giải quyết những vấn đề này bằng cách bảo quản lạnh để dừng hoạt động sinh học tế bào, đặt chúng vào trong điều kiện ngừng hoạt động thật sự. Trong một thời gian dài, ý tƣởng này đƣợc xem là giả tƣởng cho đến năm 1949, Polge, Smith và Parkes phát hiện rằng glycerol ngăn chặn đƣợc sự phá hủy tế bào khi đông lạnh (John A. Ryan, 2004). Và từ đó, ngƣời ta đƣa ra nhiều quy trình đông lạnh tế bào, và đạt dƣợc kết quả rất tốt. 2.4.1. Những ƣu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy - Tiết kiệm thời gian và tiền của. - Có nguồn để đáp ứng ngay khi cần. - Cung cấp một loại tế bào thuần nhất và giảm thiểu sự phát triển và hóa già của tế bào nuôi cấy. 21 2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào 2.4.2.1. Lựa chọn tế bào Chọn bình tế bào nuôi cấy ở gần cuối giai đoạn log phase (đầy 90%) và thay môi trƣờng phát triển mới trƣớc thu hoạch 24 giờ. Kiểm tra sự nhiễm (đặc biệt là Mycoplasma), kiểm tra sự đồng nhất của tế bào và cả một vài biểu hiện đặc biệt. 2.4.2.2. Thu hoạch tế bào Phải tiến hành đúng cách và thao tác thật nhẹ nhàng. 2.4.2.3. Đƣa vào chất bảo quản lạnh: Các chất có tác dụng bảo quản lạnh là methyl acetamide, methyl alcohol, ethylene glycol và polyvinyl pyrrolidone… Tuy nhiên, DMSO (dimethylsulfoxide) và glycerol là thuận tiện và đƣợc sử dụng nhiều nhất. Cần chú ý, DMSO là chất phân cực mạnh, dễ dàng thấm qua da và mang theo các chất có độc tính hay chất gây ung thƣ. 2.4.2.4. Đƣa vào ốngbảo quản. Hình 2.3. Ống bảo quản tế bào (Nguồn: cc.pdf). 2.4.2.5. Dán nhãn và ghi sổ. 2.4.2.6. Đƣa vào bình bảo quản lạnh: 22 (Nguồn: cc.pdf). Tốc độ làm lạnh thích hợp với hầu hết các dòng tế bào là giảm từ 1 đến 30C trong 1 phút. Bảo quản dƣới -1300C, giám sát lƣợng Nitơ lỏng thƣờng xuyên, và cần phải ghi chép vào sổ đầy đủ. 2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hƣởng đến kết quả bảo quản (John A. Ryan, 2004) 2.4.3.1. Quá trình thu hoạch và thao tác trên tế bào Thừa tác nhân tách tế bào, sử dụng chất bảo quản có chứa độc tính, đặt tế bào quá lâu ở nhiệt độ phòng hoặc pH không thích hợp… 2.4.3.2. Tiến trình làm lạnh Tế bào bị hƣ hỏng nhiều và khả năng sống giảm thƣờng do tốc độ làm lạnh quá nhanh hoặc quá chậm, hoặc tiến trình làm lạnh bị gián đoạn. Chất làm lạnh ở nồng độ không thích hợp cũng ảnh hƣởng khả năng sống của tế bào. 2.4.3.3. Quá trình trữ lạnh Khả năng sống của tế bào giảm khi nhiệt độ ấm lên lúc vận chuyển hoặc khi nhiệt độ bình chứa không ổn định. 2.4.3.4. Quá trình rã đông và hoạt hóa Rã đông quá lâu hoặc phƣơng pháp tách chất bảo quản không chính xác. 23 2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vẫt Nuôi cấy tế bào đã trở thành một trong những công cụ cơ bản trong sinh học tế bào và sinh học phân tử. Một số ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật: 2.5.1. Thiết lập hệ thống mô hình Nuôi cấy tế bào cung cấp một hệ thống mô hình thích hợp cho nghiên cứu: 1- Sinh lý và sinh hóa tế bào, 2- Tƣơng tác giữa tác nhân gây bệnh và tế bào, 3- Tác dụng của thuốc đối với tế bào, 4- Tiến trình và sự hóa già, 5- Những nghiên cứu về dinh dƣỡng. 2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào Những tế bào nuôi cấy đƣợc sử dụng riêng hay kết hợp với các xét nghiệm trên cơ thể động vật để nghiên cứu hiệu của của thuốc, dƣợc phẩm và các hóa chất mới đối với sự tồn tại và phát triển của các loại tế bào khác nhau. Ứng dụng quan trọng là nuôi cấy tế bào gan và thận. 2.5.3. Nghiên cứu ung thƣ Từ khi phát hiện những tế bào bình thƣờng và những tế bào ung thƣ có thể phát triển trong điều kiện nuôi cấy, sự khác biệt của chúng đã đƣợc nghiên cứu một cách tỉ mỉ. Trong đó, ngƣời ta sử dụng hóa chất, virus và phóng xạ để làm biến đổi những tế bào đƣợc nuôi cấy bình thƣờng thành những tế bào ung thƣ. Từ đó nghiên cứu những nhân tố gây ra sự biến đổi. Những tế bào ung thƣ đƣợc nghiên cứu cũng đƣợc cung cấp cho các hệ thống xét nghiệm để xác định phƣơng pháp và thuốc điều trị thích hợp cho các loại ung thƣ khác nhau. 2.5.4. Virus học Một trong những ứng dụng cơ bản và sớm nhất của nuôi cấy tế bào là khả năng nhân lên của virus trong nuôi cấy tế bào (động vật) để sử dụng trong điều chế vaccine. Nuôi cấy tế bào cũng đƣợc sử dụng rộng rãi trong định danh và phân lập virus cũng nhƣ các nghiên cứu cơ bản nhƣ cách thức virus xâm nhập và phát triển trong cơ thể. 24 2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào Từ khi nhận thấy những tế bào nuôi cấy có thể sản xuất nhiều sản phẩm quan trọng, có 3 vấn đề đƣợc đặc biệt quan tâm: - Thứ nhất là sản xuất một lƣợng lớn virus để sản xuất vaccine, bao gồm vaccine bại liệt, dại, đậu gà, viêm gan B và sởi. - Thứ hai là sản xuất một lƣợng lớn tế bào dựa trên sự di truyền để sản xuất các protein có giá trị trong y học và thƣơng mại, bao gồm kháng thể đơn dòng, insulin, hormone… - Thứ ba là sử dụng tế bào ở dạng mô và cơ quan thay thế. Da nhân tạo sử dụng trong điều trị bỏng và loét là sản phẩm có giá trị thƣơng mại đầu tiên. Tuy nhiên, các cơ quan nhân tạo nhƣ gan, thận, lách thì đang trong giai đoạn thử nghiệm. Khả năng cung cấp các tế bào và mô thay thế có thể tiến xa hơn với những nghiên cứu về phôi và tế bào gốc trƣởng thành. Đây là loại tế bào có khả năng biến đổi thành những loại tế bào khác nhau. Điều quan trọng là cần có những nghiên cứu để kiểm soát sự phát triển cũng nhƣ chiều hƣớng phát triển của các tế bào này. 2.5.6. Chẩn đoán di truyền Chọc màng ối là kỹ thuật mà bác sĩ thu và nuôi cấy những tế bào phôi từ thai phụ, đây là một biện pháp quan trọng để chẩn đoán sớm những rối loạn của phôi. Những tế bào này đƣợc kiểm tra sự bất thƣờng của gene và chromosome dựa trên kiểu nhân, dự nhuộm màu chromosome và các lỹ thuật phân tử khác. 2.5.7. Kỹ thuật di truyền Khả năng chuyển nhiễm hoặc tái lập chƣơng trình của tế bào với vật liệu di truyền mới (DNA và gene) là công cụ quan trọng cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu sự biểu hiện của các gene này (thông qua những protein mới). Kỹ thuật này cũng đƣợc dùng để sản xuất những protein mới với số lƣợng lớn thông qua nuôi cấy tế bào (phục vụ cho những nghiên cứu sâu hơn). Côn trùng đƣợc sử dụng nhƣ một nhà máy tế bào nhỏ để tạo ra một lƣợng lớn protein – các protein này đƣợc sản 25 xuất sau khi gây nhiễm côn trùng với baculovirus đã đƣợc xử lý bằng kỹ thuật di truyền. 2.5.8. Liệu pháp gene Có khả năng các tế bào qua xử lý kỹ thuật di truyền đƣợc sử dụng cho điều trị gene. Tế bào đƣợc lấy ra từ bệnh nhân thiếu một gene chức năng và gene thiếu (hay bị hƣ hỏng) đó đƣợc đƣa vào tế bào. Những tế bào này đƣợc nuôi cấy rồi đƣa trở vào cơ thể bệnh nhân. Phƣơng pháp khác là đặt gene thiếu vào một vector virus và “gây nhiễm” vào bệnh nhân với hy vọng gene thiếu sẽ biểu hiện đƣợc trong các tế bào của bệnh nhân. 2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc Xét nghiệm dực trên tế bào ngày càng quan trọng hơn đối với công nghiệp dƣợc phẩm, xét nghiệm độc tố tế bào, chọn lọc những chất có khả năng sử dụng nhƣ thuốc. 26 Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm 3.1.1. Thời gian Từ tháng 4 năm 2007 đến tháng 8 năm 2007. 3.1.2. Địa điểm Phòng nuôi cấy mô tế bào động vật, khoa Chăn nuôi - Thú y, trƣờng ĐH Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu và hóa chất 3.2.1. Đối tƣợng 45 quả trứng có phôi 8, 9 và 10 ngày tuổi (9 quả cho mỗi độ tuổi phôi), không mang mầm bệnh (đƣợc cung cấp từ trại Gà giống Hồng Sanh, huyện Dĩ An, tỉnh Bình Dƣơng). 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm - Thiết bị: Microflow (hoods cấy). Máy ly tâm. Tủ ấm CO2 (37 0 C, 5% CO2). Máy khuấy từ. Máy đo pH. Đèn soi trứng. Kính hiển vi soi ngƣợc. Autoclave… 27 - Dụng cụ: Bông gòn. Becher nhỏ. Pince. Kéo. Ống tiêm vô trùng. Ống ly tâm. Bình nuôi cấy tế bào (T - flask). Pipetteman. Đầu cone. Buồng đếm tế bào (Neubauer). Màng lọc. Găng tay, khẩu trang. Quần áo bảo hộ vô trùng… 3.2.3. Các hóa chất và môi trƣờng - Cồn 70%. - Dung dịch trypsin 0,25%. - Dung dịch PBSA. - Môi trƣờng nuôi cấy tế bào xơ phôi gà: EMEM + 10% FBS. - Huyết thanh (FBS). - DMSO 5%. - Thuốc nhuộm trypan blue 0,22%. 3.3. Nội dung nghiên cứu - Xác định tuổi phôi thích hợp cho điều chế tế bào và xác định quy trình tách tế bào phù hợp (quy trình Trypsin ấm hay Trypsin lạnh). - Khảo sát khả năng bảo quản và hồi phục tế bào sau bảo quản. - Xây dựng quy trình sản xuất và bảo quản tế bào xơ phôi gà. 28 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà - Dùng bông gòn thấm cồn 70% lau trứng. Đặt trứng vào becher nhỏ sao cho đầu to của trứng quay lên trên. - Dùng kéo vô trùng làm vỡ đỉnh của vỏ và bóc dần vỏ đến rìa của buồng khí. - Dùng pince vô trùng bóc bỏ màng trắng của vỏ, để lộ màng đệm bên dƣới cùng với các mạch máu. Chọc thủng màng đệm bằng pince cong vô trùng và kẹp nhẹ phần bên dƣới đầu để nhấc phôi ra. - Chuyển phôi vào đĩa petri có chứa sẳn PBS. Rửa phôi rồi chuyển phôi sang một đĩa petri khác có chứa PBS. - Dùng kéo cắt bỏ đầu và các chi, mở lồng ngực vào loại bỏ nội quan, lột bỏ phần da (loại lông), chuyển sang đĩa petri khác đã chứa sẳn PBS. - Cắt mô thành những khối nhỏ. 3.4.2. Phƣơng pháp tạo tế bào sơ cấp 3.4.2.1. Quy trình trypsin ấm - Dùng pince chuyển mô vào erlen đã chứa sẳn PBS, rửa lại các mãnh mô trong PBS nhiều lần (đến khi nƣớc rửa trong). - Cho các mãnh phôi vào ống tiêm vô trùng, ấn xylanh ép tế bào vào một bình tam giác chứa 10 ml trypsin 0,25%. - Lắc đều bình tam giác nhiều lần rồi đặt vào tủ ấm 370C, để trong 30 phút. - Để các mãnh mô ổn định lại, thu lấy phần dịch nổi và đem ly tâm với tốc độ 1000vòng/phút trong 10 phút. Bỏ dịch bên trên đi, hòa tế bào (phần cặn sau ly tâm) với 1ml môi trƣờng và trữ các tế bào ở 40C (trên nƣớc đá). - Thêm 10ml trypsin 0,25% vào các mãnh mô còn lại trong bình tam giác và tiếp tục lắc và ủ trong 30 phút. Lặp lại nhƣ trên. - Trộn chung huyền phù tế bào thu đƣợc ở các đợt lại với nhau. Tiến hành đếm số lƣợng tế bào bàng buồng đếm hồng cầu. Xác định mật độ tế bào / ml. - Chuẩn bị bình flask có chứa sẵn 4 ml môi trƣờng nuôi cấy. 29 - Chuyển tế bào vào bình nuôi cấy sao cho mật độ tế bào ban đầu là 4*106 tế bào/4ml môi trƣờng (106 tế bào/ml). - Ủ ở 370C 5%CO2. Quan sát dƣới kính hiển vi soi ngƣợc và ghi nhận kết quả. 3.4.2.2. Quy trình trypsin lạnh - Rửa các mẫu mô nhỏ bằng PBS vô trùng nhiều lần - Cho các mẫu mô vào bình tam giác chứa sẳn 10 ml trypsin 0,25%. - Đặt mẫu ở 40C trong vòng 6 – 18 giờ. - Cẩn thận loại bỏ trypsin sao cho lƣợng trypsin còn lại ít nhất. - Ủ ống chứa mô ở 370C trong 20 – 30 phút. - Thêm vào 2 ml môi trƣờng đã đƣợc ủ ấm, dùng pipette nhẹ nhàng sục lên xuống cho đến khi mô hoàn toàn rời ra. - Thu dịch chứa tế bào và xác định mật độ tế bào bằng buồng đếm hồng cầu.Tiến hành nuôi cấy sao cho mật độ tế bào ban đầu là 106 tế bào/ml. 3.4.3. Phƣơng pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer - Trộn 100µl huyễn dịch tế bào và 900µl thuốc nhuộm trypan blue 0,22% (tỷ lệ pha là 1/10). Trộn kỹ hỗn hợp trong 2 – 3 phút. - Đƣa hỗn hợp thuốc nhuộm và tế bào này lên buồng đếm bằng cách chạm đầu hút có chứa hỗn hợp vào chỗ tiếp giáp giữa buồng đếm và lamella. - Chỉ đếm những tế bào còn sống (màu vàng nhạt), không đếm những tế bào chết (bắt màu xanh). Vùng đếm là 4 ô vuông lớn (ký hiệu A, B, C, D). Hình 3.1. Buồng đếm Neubauer (Nguồn : www.pharma.ethz.ch/.../protocols/Hemato.gif) 30 Hình 3.2. Tế bào CEF trong buồng đếm ▫ Cách tính kết quả: Trong đó: C: số tế bào trong 1ml. n: số tế bào trong 4 ô vuông. d: nồng độ pha loãng. 3.4.4. Phƣơng pháp cấy chuyền tế bào - Đổ bỏ môi trƣờng trong bình nuôi cấy có tế bào. - Dùng pipette hút 3 ml PBS cho bào bình, lắc nhẹ để rữa sạch tế bào chết và huyết thanh, đổ bỏ PBS. - Dùng pipette khác hút 2 ml trypsin 0,25% cho vào bình, ủ ở 370C trong 4 – 5 phút. - Cầm bình nuôi cấy bằng tay phải, vỗ nhẹ vào lòng bàn tay trái để các tế bào tách rời hoàn toàn. - Hút 2 ml môi trƣờng nuôi cấy cho vào bình, tráng đều môi trƣờng khắp bình. - Hút dịch huyền phù tế bào cho vào ống falcon 15 ml. Số tế bào trong 1ml: C = n*d*10 4 4 31 - Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ dịch nổi. - Cho vào ống falcon 1 ml môi trƣờng, vortex để huyền phù tế bào. Lấy ra 100 μl để đếm tế bào. - Chuẩn bị các bình tế bào chứa sẳn môi trƣờng, cho huyền phù tế bào vào. Lắc nhẹ, ủ trong tủ nuôi 370C. - Sau 24 giờ, đổ bỏ môi trƣờng cũ, cho môi trƣờng mới vào bình (loại trypsin và những tế bào chết). 3.4.5. Phƣơng pháp bảo quản tế bào - Tách tế bào và đếm tƣơng tự nhƣ trên. - Chuẩn bị sẳn một tuýp bảo quản tế bào, hút 800 μl dịch huyền phù tế bào cho vào tuýp, bổ sung thêm 100 μl FBS và 100 μl DMSO, trộn đều bằng pipetman, đậy kín nắp và ghi ký hiệu. - Để tuýp bảo quản vào hộp xốp, cho vào tủ lạnh -700C qua đêm. - Bảo quản tuýp tế bào trong Nitơ lỏng. 3.4.6. Phƣơng pháp hồi phục tế bào - Ống tế bào lấy từ Nitơ lỏng đƣợc cho vào bồn ủ nhiệt 370C để giải đông. - Hút dịch tế bào cho vào ống ly tâm 15 ml. Dùng pipette hút 2 ml môi trƣờng nuôi cấy, nhỏ từng giọt vào ống ly tâm, vừa nhỏ vừa lắc để hòa đều tế bào. - Ly tâm 1000 vòng/phút trong 10 phút. Đổ bỏ dịch nổi. - Dùng tay bún vào đáy ống ly tâm để tách rời tế bào, cho vào ống ly tâm 1 ml môi trƣờng, huyền phù tế bào. Hút dịch huyền phù cho vào một bình nuôi cấy đã chứa sẳn môi trƣờng. - Ủ ở 370C. Sau 24 giờ thay môi trƣờng cũ bằng môi trƣờng mới để loại bỏ tế bào chết và DMSO. 3.5. Chỉ tiêu theo dõi - Đếm số lƣợng tế bào tách đƣợc từ mỗi phôi. - Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp (P1) và tế bào thứ cấp (P2). 3.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu Xử lý số liệu bằng trắc nghiệm F trong phần mềm Minitab. 32 3.7. Quy trình tiến hành thí nghiệm Chúng tôi tiến hành thí nghiệm dựa vào quy trình Tách tế bào từ phôi gà và nuôi cấy sơ cấp của Phan Kim Ngọc (2002) và quy trình Điều chế tế bào xơ phôi gà của trƣờng Đại Học Karsesart (Thai Lan) Sơ đồ 3. Quy trình thực hiện thí nghiệm Nhận định kết quả và đƣa ra quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà Trứng gà có phôi: 8, 9, 10 ngày tuổi Xử lý, tách mô từ phôi gà Tạo tế bào sơ cấp Đếm số lƣợng tế bào Nuôi cấy sơ cấp Cấy chuyển Bảo quản Hồi phục Trypsin ấm Trypsin lạnh Chọn đƣợc tuổi phôi và quy trình trypsin Thời gian đầy một lớp 33 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào thích hợp Với 45 quả trứng có phôi bao gồm 3 nhóm tuổi (phôi 8, 9 và 10 ngày); sử dụng 2 phƣơng pháp tách tế bào là quy trình trypsin ấm và quy trình trypsin lạnh. Chúng tôi tiến hành đếm số lƣợng tế bào sống thu đƣợc từ mỗi nhóm tuổi phôi. Kết quả đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1 6,9 7 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 tế b ào (t ín h th eo lg ) 8 9 10 tuổi phôi (ngày tuổi) trypsin ấm trypsin lạnh Biểu đồ 4.1. Số lƣợng tế bào thu đƣợc từ các độ tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào. 34 Bảng 4.1. Số tế bào sống trung bình thu đƣợc từ các tuổi phôi và các phƣơng pháp tách tế bào Tuổi phôi Số tế bào trung bình Trypsin lạnh Trypsin ấm 8 ngày (n = 6) 33,73 x 106 17,00 x 106 9 ngày (n = 6) 57,17 x 106 27,18 x 106 10 ngày (n = 6) 58,29 x 106 32,35 x 106 Trung bình 49,73 x 106 25,51 x 106 ANOVA P < 0,05 Ghi chú: 3 quả trứng 8 ngày, 1 quả 9 ngày và 5 quả 10 ngày có phôi chết. Dựa vào Bảng 4.1 và Biểu đồ 4.1, chúng tôi nhận thấy: Khi tách tế bào từ phôi trứng bằng quy trình trypsin ấm, số lƣợng tế bào trung bình từ phôi 10 ngày là cao nhất (32,35 x 106), kế đến là phôi 9 ngày (27,18x 10 6) và thấp nhất là số tế bào từ phôi 8 ngày (17,00 x 106). Tuy nhiên, sự khác biệt về số lƣợng tế bào thu đƣợc từ phôi 9 ngày tuổi và phôi 10 ngày tuổi là không có ý nghĩa (P > 0,05). Ngƣợc lại, có sự khác biệt có ý nghĩa (P < 0,05) khi so sánh số lƣợng tế bào trung bình thu đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi so với phôi 9 và 10 ngày tuổi khi tách bằng trypsin ấm. Việc sử dụng trypsin lạnh để tách tế bào từ phôi gà, số lƣợng tế bào trung bình thu đƣợc từ phôi 10 ngày là 58,29 x 106, cao hơn so với phôi 9 ngày (57,17 x 10 6), nhƣng không có sự khác biệt về thống kê (P > 0,05). Số tế bào thu đƣợc trung bình từ phôi 8 ngày (33,73 x 106) thấp hơn từ phôi 9 và 10 ngày. Sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa (P < 0,05). Nếu so sánh giữa 2 phƣơng pháp tách tế bào thì số lƣợng tế bào trung bình thu đƣợc từ quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao hơn nhiều so với quy trình trypsin ấm (25,51 x 106). Và sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa xét về mặt thống kê (P < 0,05). Nguyên nhân có thể do ở phƣơng pháp trypsin ấm, tế bào đƣợc tách bằng trypsin ở nhiệt độ 370C nên có một số tế bào bị chết dƣới tác động của trypsin; còn ở phƣơng pháp trypsin lạnh (40C) tế bào ít bị ảnh hƣởng hơn. Bên cạnh đó, quy trình trypsin lạnh có ƣu điểm là tiết kiệm đƣợc một lƣợng trypsin và môi trƣờng (để 35 bất hoạt trypsin) trong qua trình tách tế bào (lƣợng trypsin và môi trƣờng sử dụng trong quy trình trypsin lạnh chỉ bằng một nữa so với quy trình trypsin ấm). Chúng tôi chọn trứng có phôi 9 – 10 ngày tuổi và sử dụng quy trình trypsin lạnh để tách tế bào xơ phôi gà. 4.2. Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp Sau khi tách tế bào từ phôi trứng, chúng tôi tiến hành nuôi cấy sơ cấp trong các bình tế bào (T – flask) có kích thƣớc 25 cm2 với số lƣợng tế bào cho vào mỗi bình nuôi cấy là 4 x 106 tế bào. Thời gian tế bào phát triển làm đầy một lớp trên bề mặt bình nuôi cấy đƣợc ghi nhận ở Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2 0 5 10 15 20 25 30 35 th ời g ia n (g iờ ) 8 9 10 tuổi phôi (ngày tuổi) trypsin ấm trypsin lạnh Biểu đồ 4.2. Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp. Bảng 4.2. Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp (giờ) Tuổi phôi Thời gian (giờ) Trypsin lạnh Trypsin ấm 8 ngày 22,33 23,67 9 ngày 30,00 25,67 10 ngày 30,67 28,00 Trung bình 27,67 25,78 Chỉ số P P > 0,05 36 Hình 4.1. Tế bào sơ cấp sau 15 giờ nuôi cấy Hình 4.2. Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp Qua Bảng 4.2 và Biểu đồ 4.2, chúng tôi nhận thấy: Khi nuôi cấy tế bào sơ cấp đƣợc tách bằng quy trình trypsin lạnh, thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thu đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi ngắn nhất 37 (23,67 giờ), kế đến là từ phôi 9 ngày (25,67 giờ) và tế bào từ phôi 10 ngày tuổi có thời gian phát triển đầy một lớp dài nhất (28 giờ). Tuy nhiên, không có sự khác biệt về thống kê (P > 0,05). Khi dùng quy trình trypsin ấm để tách tế bào, thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào tách từ phôi 8 ngày tuổi là 22,33 giờ, ngắn hơn so với tế bào tách từ phôi 9 ngày tuổi (30 giờ) và 10 ngày tuổi (30,67 giờ). Sự khác biệt về thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào tách từ phôi 8, 9, 10 ngày tuổi không có ý nghĩa xét về thống kê (P > 0,05). So sánh thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào đƣợc tách bằng trypsin lạnh và tế bào đƣợc tách bằng trypsin ấm, cho thấy tế bào đƣợc tách bằng trypsin lạnh phát triển đầy một lớp trong thời gian trung bình là 27,67 giờ, chậm hơn so với trypsin ấm (25,78 giờ). Nhƣng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Nhƣ vậy, độ tuổi phôi và quy trình tách tế bào dùng trypsin không ảnh hƣởng đến thời gian phát triển tạo một lớp tế bào của tế bào sơ cấp. 4.3. Khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản 4.3.1. Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp Để so sánh thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp, tiến hành cấy chuyền tế bào sơ cấp. Thời gian tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp đƣợc trình bày ở Bảng 4.3 Bảng 4.3. Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp (giờ) Tuổi phôi Thời gian (giờ) Trypsin lạnh Trypsin ấm 8 ngày 23,00 22,00 9 ngày 23,33 21,67 10 ngày 23,67 23,00 Trung bình 23,33 22,22 Chỉ số P P > 0,05 38 Hình 4.3. Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp 19 20 21 22 23 24 25 26 th ời g ia n (g iờ ) 8 9 10 tuổi phôi (ngày) Trypsin ấm trypsin ấm Biểu đồ 4.3. Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp Dựa vào Bảng 4.3 và Biểu đồ 4.3, chúng tôi nhận thấy: Tế bào sơ cấp đƣợc điều chế bằng quy trình trypsin lạnh cho ra tế bào thứ cấp có thời gian phát triển đầy một lớp là 23,33 giờ, chậm hơn so với quy trình trypsin 39 ấm (22,22 giờ). Nhƣng sự khác biệt này hoàn toàn không có ý nghĩa (P > 0,05). So sánh thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp có nguồn gốc từ phôi 8, 9, 10 ngày tuổi, chúng tôi nhận thấy: với các tế bào đƣợc tách bằng trypsin lạnh, thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp từ phôi 8, 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau (tƣơng ứng là 23,00; 23,33 và 23,67 giờ), sự khác biệt này không có ý nghĩa xét về thống kê (P > 0,05). Khi tách tế bào bằng trypsin ấm, thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp từ phôi 10 ngày tuổi dài nhất (23 giờ), kế tiếp là phôi 8 ngày tuổi (22 giờ) và phôi 9 ngày tuổi cho thời gian phát triển của tế bảo thứ cấp ngắn nhất (21,67 giờ); tuy nhiên, xét về mặt thống kê thì sự khác biệt về thời gian này không có ý nghĩa (P > 0,05). Tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào thứ cấp. Ngoài ra, khi so sánh thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp và thứ cấp dựa vào Bảng 4.2 và Bảng 4.3, chúng tôi nhận thấy thời gian làm đầy một lớp tế bào thứ cấp ngắn hơn so với tế bào sơ cấp mặc dù số lƣợng tế bào đƣa vào nuôi cấy thứ cấp (2,5 x 106) thấp hơn so với khi nuôi cấy sơ cấp (4x10 6). Kết quả này cho thấy qua lần cấy chuyển đầu tiên, tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển in vitro cao hơn tế bào sơ cấp. 4.3.2. Khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản Để xác định khả năng sống của tế bào xơ phôi gà sau thời gian bảo quản, chúng tôi sử dụng tế bào sơ cấp và tế bào thứ cấp (cấy chuyển 2 lần) bảo quản ở nhiệt độ -1960C với cùng số lƣợng 6 x 106 tế bào/ống bảo quản. Sau 5 ngày bảo quản trong bình Nitơ lỏng, tế bào đƣợc hồi phục và xác định khả năng sống của tế bào trên môi trƣờng nuôi cấy. Đếm số lƣợng tế bào sống sau hồi phục chúng tôi thu đƣợc kết quả ở Bảng 4.4 Bảng 4.4. Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi Tế bào Tỷ lệ tế bào sống (%) Tế bào sơ cấp 0 Tế bào thứ cấp 65 40 Tế bào xơ phôi gà sơ cấp đƣợc phục hồi sau khi bảo quản trong bình Nitơ lỏng không có khả năng bám và phát triển (Hình 4.4), còn tế bào thứ cấp có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy (Hình 4.5). Hình 4.4. Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục Hình 4.5. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi hồi phục 41 Kết quả này theo chúng tôi có thể do tế bào sơ cấp mới đƣợc tách ra từ phôi gà nên khả năng thích nghi với điều kiện sống in vitro chƣa cao, tính ổn định chƣa hoàn thiện nên tế bào không thể bám và phát triển nhƣ tế bào thứ cấp. Khi bảo quản tế bào xơ phôi gà, ngoài việc đảm bảo những nhu cầu cho sự sống của tế bào nhƣ bổ sung huyết thanh, DMSO… nên chọn tế bào xơ phôi gà thứ cấp để tiến hành bảo quản. 4.4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam Sau khi tiến hành theo quy trình thể hiện ở Sơ đồ 3, chúng tôi xây dựng đƣợc cơ bản quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam. Quy trình điều chế đƣợc trình bày ở Sơ đồ 4: 42 Sơ đồ 4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà Trứng gà có phôi 9 (hoặc 10) ngày tuổi Xử lý và tách mô Tách tế bào bằng phƣơng pháp trypsin lạnh Đếm số lƣợng tế bào Nuôi cấy sơ cấp: 4*10 6 tế bào/ bình 25 cm2 Cấy chuyển 2 lần Thu hoạch, đếm tế bào và bảo quản -1960C trong 5 ngày Hồi phục tế bào Theo dõi sự phát triển của tế bào Phục vụ nhu cầu sử dụng 43 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Số lƣợng tế bào tách đƣợc từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tƣơng đƣơng nhau và cao hơn số tế bào tách đƣợc từ phôi 8 ngày tuổi. Số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 106) cao hơn số tế bào tách đƣợc bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 106). Tuổi phôi và phƣơng pháp tách tế bào không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tế bào in vitro. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao hơn tế bào xơ phôi gà sơ cấp. Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả năng bám và phát triển trên bề mặt bình nuôi cấy. 5.2. Đề nghị Nuôi cấy tế bào CEF trong nhiều loại môi trƣờng khác nhau và mật độ khác nhau để xác định môi trƣờng thích hợp nhất. Cấy chuyển tế bào nhiều lần để khảo sát khả năng phát triển của tế bào ở các thế hệ khác nhau. Bảo quản tế bào CEF trong thời gian lâu hơn để kiểm tra khả năng sống và phát triển của tế bào sau bảo quản. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả nuôi cấy nhƣ: nồng độ CO2, thời gian thay môi trƣờng, thời điểm tiến hành cấy chuyển… 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Văn Hanh, 1978. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật. Tủ sách Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. 2. Phan Kim Ngọc, 2002. Giáo trình thực tập cơ sở Công Nghệ Sinh Học Động Vật. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 3. Nguyễn Đức Lƣợng, Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Công Nghệ Tế Bào. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU TỪ INTERNET 4. Bonnie L. Wallace, Felicia F. Piel, William J. Hillegas, James Varani, 2001. Growth Kinetics of Primary CEF Cells on Hillex Microcarriers in Sigma's TiterHigh™ CEF Basal Medium with 2% Bovine Calf Serum. SoloHill Engineering Inc. and The University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA. rterly/January_2001.html 5. John A. Ryan, 2004. General Guide for Cryogenically Storing Animal Cell Cultuers, Corning Incorporated – Life Sciences, Acton, MA 01720. malcc.pdf 6. John A. Ryan, 2004. Introduction to Animal Cell Culture, Corning Incorporated – Life Sciences, Acton, MA 01720. www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_c ell_culture.pdf 7. www.pharma.ethz.ch/.../protocols/Hemato.gif 8. 9. ination.pdf 10. 11. rterly/January_2001/Jan_01_CEF_Cells.html 45 12. 13. up_guide.pdf 14. 46 PHỤ LỤC 1. Thành phần và cách pha hóa chất, môi trƣờng  Pha môi trƣờng EMEM (pha một lít). Cho 500 ml nƣớc cất khử ion vào bình thuỷ tinh. Cho một gói EMEM dạng bột (9,6g một gói) vào bình sao cho bột không dính vào thành, lắc kĩ để bột tan. Khuấy từ tối thiểu một giờ để bột tan hoàn toàn. Làm đầy thành một lít. Lọc tiệt trùng môi trƣờng với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không trong tủ cấy vô trùng. Chắt ra một lọ nhỏ để ở 370C trong 48 giờ để kiểm tra sự tiệt trùng. Phần còn lại trữ trong ngăn dƣới của tủ lạnh  Phƣơng pháp pha glutamine (pha một lít). Cân 29,2g glutamine và cho vào một lít, không cho bột dính vào thành lọ. Đong một lít nƣớc khử ion và cho vào lọ sao cho tan hết bột ở thành lọ. Trộn tối thiểu 15 phút để hoà tan. Khi tan hết, lọc với lƣới lọc 0,22 m và máy hút chân không. Khi lọc xong chiết ra lọ 5ml. Trữ lạnh đông.  Phƣơng pháp pha dung dịch P/S (Penicillin/Streptomycine) để pha 500ml (trong 1ml có 40000UI Penicillin và 40000 g Streptomycine). Lấy 20 lọ benzylpenicillin 1000000UI và 20 lọ Streptomycine Sulfate 1g. Bóc bỏ lớp vỏ để lộ phần cao su. Lấy xilanh hút 10ml nƣớc khử ion vào mỗi lọ Penicillin, 5ml vào mỗi lọ Streptomycine. Khi bột tan hút Penicillin và Streptomycine từ lọ cho vào lọ 500ml. Rửa lại các lọ nhƣ trên. Làm đầy thành 500ml với nƣớckhử ion. Chia nhỏ ra lọ 1ml và 4ml. 47 Trữ -200C.  Pha dung dịch kháng nấm FU (Fungizone): pha 50ml dung dịch trong đó có 500 g Amphotericine B/ml. Lấy một lọ kháng nấm Amphotericine B (25mg/lọ), dùng xilanh bơm 10ml nƣớc cất khử ion vào lọ thuốc, lắc cho tan. Sau khi bột tan hút dung dịch từ lọ vào lọ 100ml. Bơm 10ml nƣớc cất để tráng sạch. Làm đầy thành 50ml Chia thành lọ nhỏ 2ml. trữ -200C.  Môi trƣờng nuôi cấy tế bào xơ phôi gà: EMEM + 10% FBS EMEM tổng hợp 100 ml FBS 10 ml Glutamine 2,92% 1 ml HEPES 1M 1 ml Sodium bicarbonate 7% 1,5 ml P/S 0,25 ml FU 0,5 ml  Quy trình pha trypan blue 0.22% Cho 1l nƣớc cất khử ion vào chai thủy tinh. Cho 8,5g NaCl vào, khuấy cho NaCl tan đều. Cân 2,2g trypan blue cho vào chai, khuấy từ trong khoảng 1 giờ. Chia vào các ống 10 ml. Bảo quản ở 40C.  Dung dịch trypsin 0,25% Stock trypsin 0,5% 10X 0,5 ml BPS đã khử trùng 9,5 ml Bảo quản ở 40C  Quy trình pha PBSA (phosphate bufferd saline solution A) pha 200ml. Cho 200ml nƣớc cất khử ion vào chai thuỷ tinh có nắp. Cho 2 viên PBSA vào. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Lƣu ý không đƣợc vặn nắp quá chặt. Sau khi hấp xong vặn chặt nắp, trữ lạnh 40C. 48 2. Bảng xử lý thống kê 2.1. Số lƣợng tế bào tách từ phôi  Trypsin ấm One-way ANOVA: SO TE BAO 8 - 9 versus TUOI PHOI 8 - 9 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,11130 0,11130 11,97 0,006 Error 10 0,09296 0,00930 Total 11 0,20426 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+--------- 8 6 7,2277 0,0576 (--------*--------) 9 6 7,4203 0,1236 (--------*--------) -------+---------+---------+--------- Pooled StDev = 0,0964 7,20 7,30 7,40 One-way ANOVA: SO TE BAO 9 - 10 versus TUOI PHOI 9 - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,0168 0,0168 1,12 0,316 Error 10 0,1506 0,0151 Total 11 0,1673 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----------+---------+---------+------ 9 6 7,4203 0,1236 (----------*----------) 10 6 7,4951 0,1218 (-----------*----------) ----------+---------+---------+------ Pooled StDev = 0,1227 7,40 7,50 7,60 One-way ANOVA: SO TE BAO 8 - 10 versus TUOI PHOI 8 - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,21454 0,21454 23,63 0,001 Error 10 0,09078 0,00908 Total 11 0,30532 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+- 8 6 7,2277 0,0576 (------*-------) 10 6 7,4951 0,1218 (-------*------) -----+---------+---------+---------+- Pooled StDev = 0,0953 7,20 7,32 7,44 7,56 49  Trypsin lạnh One-way ANOVA: SO TE BAO 8 - 9 versus TUOI PHOI 8 - 9 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,1596 0,1596 14,09 0,004 Error 10 0,1133 0,0113 Total 11 0,2729 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 8 6 7,5159 0,1082 (-------*-------) 9 6 7,7466 0,1046 (--------*-------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 0,1064 7,44 7,56 7,68 7,80 One-way ANOVA: SO TE BAO 9 - 10 versus TUOI PHOI 9 - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,0009 0,0009 0,04 0,852 Error 10 0,2522 0,0252 Total 11 0,2531 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 9 6 7,7466 0,1046 (--------------*-------------) 10 6 7,7291 0,1987 (--------------*-------------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 0,1588 7,60 7,70 7,80 7,90 One-way ANOVA: SO TE BAO 8 - 10 versus TUOI PHOI 8 - 10 Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,1363 0,1363 5,32 0,044 Error 10 0,2560 0,0256 Total 11 0,3923 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 8 6 7,5159 0,1082 (---------*---------) 10 6 7,7291 0,1987 (--------*---------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 0,1600 7,50 7,65 7,80 -0,0073 50  So sánh trypsin ấm và trypsin lạnh One-way ANOVA: SO TE BAO versus QUY TRINH Analysis of Variance for SO TE BA Source DF SS MS F P QUY TRIN 1 0,7201 0,7201 27,08 0,000 Error 34 0,9042 0,0266 Total 35 1,6243 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 1 18 7,3810 0,1525 (-----*------) 2 18 7,6639 0,1730 (------*-----) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 0,1631 7,32 7,44 7,56 7,68 Ghi chú: 1 – Trypsin ấm 2 – Trypsin lạnh 2.2. Thời gian làm đầy một lớp tế bào sơ cấp  Trypsin ấm One-way ANOVA: THOI GIAN 8,9 versus TUOI PHOI 8,9 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 6,0 6,0 0,58 0,489 Error 4 41,3 10,3 Total 5 47,3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+-------- 8 3 23,667 3,215 (--------------*-------------) 9 3 25,667 3,215 (-------------*--------------) --------+---------+---------+-------- Pooled StDev = 3,215 21,0 24,5 28,0 One-way ANOVA: THOI GIAN 9, 10 versus TUOI PHOI 9, 10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 8,2 8,2 0,56 0,497 Error 4 58,7 14,7 Total 5 66,8 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+---- 9 3 25,667 3,215 (--------------*---------------) 10 3 28,000 4,359 (--------------*--------------) --+---------+---------+---------+---- Pooled StDev = 3,830 20,0 24,0 28,0 32,0 51 One-way ANOVA: THOI GIAN 8,10 versus TUOI PHOI 8,10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 28,2 28,2 1,92 0,238 Error 4 58,7 14,7 Total 5 86,8 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+- 8 3 23,667 3,215 (-----------*------------) 10 3 28,000 4,359 (-----------*-----------) -----+---------+---------+---------+- Pooled StDev = 3,830 20,0 25,0 30,0 35,0  Trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN 8, 9 versus TUOI PHOI 8, 9 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 88,2 88,2 3,89 0,120 Error 4 90,7 22,7 Total 5 178,8 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 8 3 22,333 3,055 (----------*----------) 9 3 30,000 6,000 (----------*----------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 4,761 21,0 28,0 35,0 One-way ANOVA: THOI GIAN 9,10 versus TUOI PHOI 9, 10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 0,7 0,7 0,03 0,872 Error 4 90,7 22,7 Total 5 91,3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+ 9 3 30,000 6,000 (--------------*--------------) 10 3 30,667 3,055 (--------------*---------------) ------+---------+---------+---------+ Pooled StDev = 4,761 25,0 30,0 35,0 40,0 52 One-way ANOVA: THOI GIAN 8, 10 versus TUOI PHOI 8,10 Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TUOI PHO 1 88,2 88,2 3,89 0,120 Error 4 90,7 22,7 Total 5 178,8 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 8 3 22,333 3,055 (----------*----------) 9 3 30,000 6,000 (----------*----------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 4,761 21,0 28,0 35,0  So sánh trypsin ấm và trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN versus TRYPSIN Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P TRYPSIN 1 16,1 16,1 0,74 0,401 Error 16 345,6 21,6 Total 17 361,6 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+----- 1 9 25,778 3,667 (------------*------------) 2 9 27,667 5,454 (------------*------------) -+---------+---------+---------+----- Pooled StDev = 4,647 22,5 25,0 27,5 30,0 Ghi chú: 1 – Trypsin ấm 2 – Trypsin lạnh 2.3. Thời gian làm đầy một lớp tế bào thứ cấp  Trypsin ấm One-way ANOVA: Thoi Gian 8 - 9 versus Tuoi Phoi 8 - 9 Analysis of Variance for TG89 Source DF SS MS F P 8 VA 9 1 0,17 0,17 0,02 0,893 Error 4 32,67 8,17 Total 5 32,83 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 8 3 22,000 2,000 (--------------*---------------) 9 3 21,667 3,512 (--------------*--------------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 2,858 18,0 21,0 24,0 27,0 53 One-way ANOVA: Thoi Gian 9 - 10 versus Tuoi Phoi 9 - 10 Analysis of Variance for TG9 10 Source DF SS MS F P 9 VA 10 1 2,7 2,7 0,25 0,643 Error 4 42,7 10,7 Total 5 45,3 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ----+---------+---------+---------+-- 9 3 21,667 3,512 (--------------*--------------) 10 3 23,000 3,000 (--------------*--------------) ----+---------+---------+---------+-- Pooled StDev = 3,266 17,5 21,0 24,5 28,0 One-way ANOVA: Thoi Gian 8 - 10 versus Tuoi Phoi 8 - 10 Analysis of Variance for TG8 10 Source DF SS MS F P 8 VA 10 1 1,50 1,50 0,23 0,656 Error 4 26,00 6,50 Total 5 27,50 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+------- 8 3 22,000 2,000 (---------------*---------------) 10 3 23,000 3,000 (---------------*---------------) ---------+---------+---------+------- Pooled StDev = 2,550 20,0 22,5 25,0  Trypsin lạnh One-way ANOVA: Thoi gian 8, 9 versus Tuoi phoi 8, 9 Analysis of Variance for T89 Source DF SS MS F P 89 1 0,17 0,17 0,03 0,866 Error 4 20,67 5,17 Total 5 20,83 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+--- 8 3 23,000 1,000 (--------------*--------------) 9 3 23,333 3,055 (-------------*--------------) ---+---------+---------+---------+--- Pooled StDev = 2,273 20,0 22,5 25,0 27,5 4,820 54 One-way ANOVA: Thoi gian 9, 10 versus Tuoi phoi 9, 10 Analysis of Variance for T910 Source DF SS MS F P 910 1 0,17 0,17 0,03 0,874 Error 4 23,33 5,83 Total 5 23,50 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+--- 9 3 23,333 3,055 (--------------*---------------) 10 3 23,667 1,528 (---------------*--------------) ---+---------+---------+---------+--- Pooled StDev = 2,415 20,0 22,5 25,0 27,5 One-way ANOVA: Thoi gian 8, 10 versus Tuoi phoi 8, 10 Analysis of Variance for T810 Source DF SS MS F P 810 1 0,67 0,67 0,40 0,561 Error 4 6,67 1,67 Total 5 7,33 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+----- 8 3 23,000 1,000 (------------*-------------) 10 3 23,667 1,528 (-------------*-------------) -+---------+---------+---------+----- Pooled StDev = 1,291 21,0 22,5 24,0 25,5  So sánh trypsin ấm và trypsin lạnh One-way ANOVA: THOI GIAN versus QUY TRINH Analysis of Variance for THOI GIA Source DF SS MS F P QUY TRIN 1 5,56 5,56 1,12 0,306 Error 16 79,56 4,97 Total 17 85,11 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+-------- 1 9 22,222 2,587 (------------*------------) 2 9 23,333 1,803 (------------*-------------) --------+---------+---------+-------- Pooled StDev = 2,230 21,6 22,8 24,0 Ghi chú: 1 – trypsin ấm 2 – trypsin lạnh