Khóa luận Bước đầu xây dựng quy trình định lượng các sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp real-Time pcr

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐƠN NGUYỄN HỮU TRƢỞNG Th.S NGUYỄN THÁI THỦY Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 – 2005 iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cơ đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Thầy Lê Đình Đơn đã tận tình hướng dẫn, nhận xét và giúp đỡ em hồn thành khĩa luận này. Em xin cảm ơn thầy Nguyễn Thái Thủy đã hết lịng hướng dẫn, giúp đỡ em rất nhiều, cũng như đã cho em những lời khuyên quý giá để hồn thành khĩa luận. Em xin gửi đến thầy lời biết ơn chân thành nhất. Thầy Phương, chị Kim Anh, anh Luân (cơng ty Bio-Rad) đã giúp đỡ em thực hành và nắm vững phương pháp Real-Time PCR. Em xin gởi lời cám ơn đến thầy Bùi Văn Lệ, anh Vũ, chị Liên, anh Nam cùng với các anh chị và các bạn đang làm việc tại phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh đã nhiệt tình hướng dẫn và dành cho em những tình cảm quý giá trong suốt quá trình thực hiện khĩa luận này. Con xin gửi lịng tri ân đến Ba, Mẹ, em Thành và những người thân trong gia đình đã luơn ủng hộ, nâng đỡ và dành cho con tình thương sâu sắc nhất. Xin cảm ơn tất cả bạn bè thân yêu lớp Cơng nghệ Sinh học K27 đã cùng tơi chia sẻ biết bao buồn vui cũng như đã hết lịng giúp đỡ, hỗ trợ tơi trong suốt những năm tháng dưới mái trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. Xin chân thành cảm ơn bạn Khánh Đan đã luơn động viên, giúp đỡ và dành cho tơi những tình cảm tốt đẹp nhất. Xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người Sinh viên Nguyễn Hữu Trưởng iv TĨM TẮT Nguyễn Hữu Trƣởng, Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. BƢỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC SẢN PHẨM BIẾN ĐỔI GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP REAL-TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn: TS. Lê Đình Đơn và Th.S Nguyễn Thái Thủy. Đề tài được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử (lab B), Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S bằng phương pháp Real-Time PCR. Đánh giá khả năng định lượng và hiệu quả của phương pháp. Định lượng một số mẫu bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và phụ cận. Đề tài đã cĩ những kết quả sau: Quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen: - Bước 1: Ly trích DNA mẫu bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp. Quy trình đề nghị: dung dịch phá màng tế bào: CTAB 2%; dung dịch biến tính protein: phenol/chloroform; dung dịch tủa DNA: isopropanol. - Bước 2: Sàng lọc bắp biến đổi gen dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I. Kết quả thí nghiệm sàng lọc: sản phẩm cĩ promoter 35S cho vạch khuếch đại cĩ kích thước 123 bp với nhiệt độ nĩng chảy 86-86,5oC. - Bước 3: Định lượng mẫu bắp biến đổi gen cĩ kết quả sàng lọc dương tính, dựa trên promoter 35S. Phương pháp đề nghị: Real-Time PCR với mẫu dị Taqman. Kết quả đánh giá: phương pháp Real-Time PCR cĩ khả năng phát hiện và định lượng 1 copy gen đích trong mẫu thí nghiệm, định lượng chính xác một mẫu cĩ tỷ lệ phần trăm chuyển gen biết trước. - Khảo sát một số mẫu sản phẩm cho thấy, trên thị trường Việt Nam cĩ sản phẩm chuyển gen ở các dạng thực phẩm và thức ăn khác nhau. v SUMMARY NGUYEN HUU TRUONG, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, VietNam. Aug 2005. ESTABLISHING A PROCESS OF GMOs (Genetically Modified Organisms) QUANTIFICATION BY REAL-TIME PCR METHOD Instructors: Le Dinh Don and Nguyen Thai Thuy. Recently, GMO is a controversial problem in the world. Because its advantages and disadvantages cannot be considered correctly, control methods are needed to limit its affects to environment and human health. For this purpose, methods for GMOs detection and quantification in order to determine the percentage ratio of GMO presentation in food and feed need to be developed. So, in this thesis, a process for GMO quantification will be researched and established by Real-Time PCR method, one of the most exactly methods for GMO quantification now. Purpose: Establishing a process of GM maize quantification based on CaMV 35S promoter by Real-Time PCR method. Evaluating quantification ability and efficiency of method. Applying it for quantification some of food and feed derived from maize in Ho Chi Minh City. Results: A process of GM maize quantification by Real-Time PCR method: - Step 1: DNA extraction: Cell wall destruction solution: CTAB 2%. Protein denaturalization solution: phenol/chloroform. DNA precipitation solution: Isopropanol - Step 2: GM maize screening based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with SYBR Green I dye. Results: Detection GM maize with p35S PCR amplifiers (123 bp and Tm 86- 86,5 o C). - Step 3: GM maize quantification based on 35S promoter. Method: Real-Time PCR with hybridization probe Taqman. Quantification ability: Detection and quantification 1 copy of p35S in a experiment template, exactly quantification a template which percentage ratio of GMO presentation has known. - Detection and quantification some food and feed in Ho Chi Minh City has GMO in its ingredients. Conclusion: A GM maize quantification process by Real-Time PCR has been established and can be applied to many other species. vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TĨM TẮT .................................................................................................................. iv MỤC LỤC ................................................................................................................. vi CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................................... xi DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. xii DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. xiv PHẦN I: MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2.Mục đích và yêu cầu .............................................................................................. 2 2.1.Mục đích ...............................................................................................................2 2.2.Yêu cầu .................................................................................................................2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 3 1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) ......... 3 2. Quá trình tạo sinh vật GMO .................................................................................. 3 2.1.Quá trình cơ bản ...................................................................................................3 2.2.Promoter CaMV 35S ............................................................................................4 3.Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen ......................................................... 6 3.1.Ứng dụng ..............................................................................................................6 3.1.1. Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] ...................................................... 6 3.1.2. Thực vật khơng sử dụng làm thực phẩm [17]........................................... 7 3.2.Tác động cĩ lợi của thực vật chuyển gen .............................................................8 4.Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới ......................................................... 9 4.1.Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới ................................................................11 5.Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .................. 12 5.1.Các rủi ro cĩ thể gặp [34] .....................................................................................12 5.2.Tác động cĩ hại ....................................................................................................12 5.2.1. Mơi trường .............................................................................................. 13 5.2.2. Sức khoẻ người tiêu dùng ....................................................................... 13 5.2.3. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể ...................................................... 14 vii 5.3.Dư luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen .....................................................14 6. .. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới .......................................... 16 6.1.Quy định tại châu Âu [33]: ...................................................................................17 6.1.1. Nguyên tắc định lượng dựa trên DNA ................................................... 18 6.1.2. Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu ..................... 19 6.1.2.1. Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................... 19 6.1.2.2. Quá trình định lượng sản phẩm biến đổi gen ................................. 19 7. .. Tình hình Việt Nam ............................................................................................... 21 7.1.Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen ....................................................21 7.2.Vấn đề thương mại hĩa và kiểm sốt sinh vật biến đổi gen .................................21 8. .. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen ......................................... 22 8.1.Phương pháp ELISA ............................................................................................23 8.2.Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] ....................................................23 8.3.Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR .....................................................................24 8.3.1. Hĩa chất định lượng ............................................................................... 24 8.3.1.1. SYBR Green I ................................................................................ 25 8.3.1.2. Mẫu dị phân hủy (Taqman probe) ................................................. 25 8.3.2. Cơng cụ phát hiện ................................................................................... 27 8.4.Nguyên tắc định lượng bằng kĩ thuật Real-time PCR ..........................................28 8.4.1. Quan hệ định lượng ................................................................................ 28 8.4.2. Thiết kế thí nghiệm ................................................................................. 29 8.4.3. Phân tích dữ liệu Real-time PCR ............................................................ 30 8.4.4. Tính tốn hàm lượng GMO .................................................................... 31 8.5.Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen [9][44]32 8.6.Một số cơng trình nghiên cứu về phát hiện và định lượng GMO dựa trên promoter 35S. .............................................................................................................34 8.6.1. Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S. .............................. 34 8.6.2. Định lượng GMO đựa trên promoter 35S .............................................. 35 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ................................ 36 1.Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 36 2.Điều kiện tiến hành thí nghiệm ............................................................................... 36 viii 2.1.Địa điểm thực hiện thí nghiệm .............................................................................36 2.2.Thời gian thực hiện ...............................................................................................36 3.Tiến trình thí nghiệm: ............................................................................................. 36 4.Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................... 37 5.Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA ............................................ 38 5.1.Mục tiêu ................................................................................................................38 5.2.Vật liệu .................................................................................................................38 5.3.Phương pháp thực hiện .........................................................................................38 5.4.Phương pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích...................................................41 6.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 41 6.1.Mục tiêu ................................................................................................................41 6.2.Nguyên tắc ............................................................................................................41 6.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................42 6.4.Trang thiết bị ........................................................................................................42 6.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................43 6.5.1. Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR ..................................... 43 6.5.2. Chương trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại ........................................ 43 6.5.3. Phát hiện sản phẩm khuếch đại............................................................... 44 6.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 45 7.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen ........ 46 7.1.Mục tiêu ................................................................................................................46 7.2.Nguyên tắc ............................................................................................................46 7.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................46 7.4.Trang thiết bị ........................................................................................................46 7.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................46 7.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 46 7.5.1.1. Xây dựng đường chuẩn định lượng p35S ...................................... 47 7.5.1.2. Đánh giá kết quả định lượng .......................................................... 48 7.5.2. Thành phần phản ứng PCR ..................................................................... 48 7.5.2.1. Đặc điểm 35S master mix .............................................................. 49 7.5.2.2. Đặc điểm SYBR Green I Supermix ............................................... 49 7.5.3. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 49 ix 7.5.4. Cài đặt phần mềm điều khiển ................................................................. 50 7.5.5. Phân tích kết quả thí nghiệm .................................................................. 51 8.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR. ..... 54 8.1.Mục tiêu ................................................................................................................54 8.2.Nguyên tắc ............................................................................................................54 8.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................54 8.4.Trang thiết bị ........................................................................................................54 8.5.Hĩa chất ................................................................................................................54 8.5.1. Đặc điểm 35S và corn-reference master mix ......................................... 55 8.5.2. Đặc điểm chuẩn 35S và gen tham chiếu (35S và corn reference calibration DNA standards) ............................................................................... 55 8.6.Phương pháp thực hiện .........................................................................................55 8.6.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 56 8.6.1.1. Độ nhạy phản ứng .......................................................................... 56 8.6.1.2. Độ chính xác:.................................................................................. 56 8.6.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 56 8.6.3. Thành phần phản ứng Real-Time PCR ................................................... 57 8.6.4. Chương trình nhiệt thiết lập trên máy Real-Time PCR .......................... 57 8.6.5. Phân tích kết quả ..................................................................................... 58 9.Ứng dụng phƣơng pháp Real-Time PCR khảo sát một số mẫu trên thị trƣờng 58 9.1.Mục tiêu ................................................................................................................58 9.2.Nguyên tắc ............................................................................................................58 9.3.Vật liệu thí nghiệm ...............................................................................................58 9.4.Trang thiết bị và hĩa chất .....................................................................................58 9.5.Phương pháp thực hiện .........................................................................................59 9.5.1. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................... 59 9.5.2. Thiết kế phản ứng định lượng ................................................................ 59 9.5.3. Thành phần phản ứng và chương trình nhiệt thiết lập ............................ 59 9.5.4. Phân tích kết quả ..................................................................................... 59 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 60 x 1.Khảo sát các quy trình ly trích DNA ..................................................................... 60 2.Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen ..................................................... 63 2.1.Phương pháp 1: PCR truyền thống .......................................................................63 2.2.Phương pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green .......65 3.Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO .................................... 71 3.1.Xây dựng đường chuẩn: .......................................................................................71 3.2.Đánh giá kết quả định lượng ................................................................................74 4.Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng của phƣơng pháp Real-Time PCR ..... 76 4.1.Độ nhạy của phương pháp: ...................................................................................76 4.2.Độ chính xác của phương pháp ............................................................................78 5.Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR ................. 79 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 85 1.Kết luận ..................................................................................................................... 85 2.Đề nghị ...................................................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 87 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 92 xi CHỮ VIẾT TẮT 35S: 35S promoter Bp: Base pair Bt: Bacillus thringensis CaMV: Cauliflower mosaic virus CCD: Charged coupled device CT : Threshold cycle CTAB: Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide DNA: Deoxyribonucleic acid dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates EC: European Community ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay FAO: Food and Agriculture Organization GMOs: Genetically modified organisms GMP: Genetically modified plant N/A: Not available NTC: No template control OD: Optical density PCR : Polymerase chain reaction QC-PCR : Quantitative competitive PCR RNA: Ribonucleic acid SD: Standard Deviation SDS: Sodium dodecyl sulfate TAE: Tris,Acetic acid, EDTA Taq : Thermus aquaticus Tm : Melting Temperature Tnos: Terminator nopaline synthetase U: Unit UV: Ultra violet xii DANH MỤC HÌNH TRANG Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17] .............................................................................. 4 Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] ......................................................................... 5 Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16] ................................................................... 5 Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17] ............................................................. 9 Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen tồn cầu [20] .............................................. 10 Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] .................................. 10 Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19]........................................... 11 Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] ................................................... 15 Hình 2.9: Khơng yêu cầu dán nhãn [42] ....................................................................... 19 Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] ....................................................................... 19 Hình 2.11: Quy trình kiểm sốt GMO tại châu Âu [13] ............................................... 20 Hình 2.12 : QC-PCR ..................................................................................................... 23 Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] ....................................................... 25 Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dị Taqman [43] ............................................... 26 Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] ............................................................................. 27 Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] ........................ 28 Hình 2.17: Đường chuẩn cho phản ứng định lượng [14] .............................................. 30 Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] ......................................................... 31 Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lượng GMO [44].................. 34 Hình 3.1: Màn hình Melt Curve.................................................................................... 45 Hình 3.2: Màn hình Edit Protocol ................................................................................. 50 Hình 3.3: Màn hình Edit Plate Setup ............................................................................ 51 Hình 3.4: Màn hình View Quantities/Identifiers .......................................................... 51 Hình 3.5: Màn hình View Post-Run Data ..................................................................... 52 Hình 3.6: Màn hình PCR Quantification ...................................................................... 53 Hình 3.7: Màn hình PCR Standard Curve .................................................................... 53 Hình 4.1: Kết quả điện di của 3 quy trình ly trích ........................................................ 60 Hình 4.2: Kết quả điện di các mẫu sản phẩm ............................................................... 61 Hình 4.3: Kết quả điện di thí nghiệm 2 phương pháp 1 ............................................... 64 Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification của các mẫu đối chứng ..................................... 65 Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification của các mẫu thí nghiệm .................................... 66 Hình 4.6: Đồ thị Melt curve của mẫu đối chứng .......................................................... 67 Hình 4.7: Đồ thị Melt curve của mẫu thí nghiệm ......................................................... 67 Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S của hai phương pháp ............................................... 71 Hình 4.9: Đường chuẩn được xây dựng từ các mẫu chuẩn 35S ................................... 72 xiii Hình 4.10: Đồ thị Melt curve các mẫu chuẩn 35S của phương pháp 1 ........................ 73 Hình 4.11: Đồ thị Melt curve của phương pháp SYBR Green I ở thí nghiệm 3 .......... 75 Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification của mẫu 1 copy ................................................ 76 Hình 4.13: Đồ thị định lượng p35S của các mẫu thí nghiệm ....................................... 78 Hình 4.14: Đường chuẩn phản ứng định lượng p35S ................................................... 79 Hình 4.15: Đồ thị định lượng gen tham chiếu của các mẫu thí nghiệm ....................... 79 Hình 4.16: Đường chuẩn phản ứng định lượng gen tham chiếu................................... 79 xiv DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 2.1: Một số giống bắp được cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) ......... 11 Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen .............. 17 Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm ............................................................................................ 38 Bảng 3.2: Các quy trình ly trích .................................................................................... 39 Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Cơng ty Proligo) [31] .............................. 42 Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 ........................................................................... 42 Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 .................................... 43 Bảng 3.6: Chương trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 ......................................... 43 Bảng 3.7: Phương pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 ........................................ 44 Bảng 3.8: Chương trình nhiệt phân tích Melt curve ..................................................... 44 Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] ............................................................................................. 47 Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 .................................. 48 Bảng 3.11: Chương trình nhiệt của 2 phương pháp ...................................................... 49 Bảng 3.12: Lượng lý thuyết (Số lượng phân tử) của hai chuẩn.................................... 55 Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phương pháp Real-Time PCR ....................................... 56 Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 ....................... 57 Bảng 3.15: Chương trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dị Taqman) ........ 57 Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA ..................................................... 60 Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu ................................................................. 62 Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt ................................................................... 63 Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 1 ....................................... 64 Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 .... 65 Bảng 4.6: Kết quả sàng lọc các mẫu thí nghiệm trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 ... 66 Bảng 4.7: Nhiệt độ nĩng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu thí nghiệm............. 68 Bảng 4.8: So sánh hiệu quả kinh tế của 2 phương pháp trong thí nghiệm 2 ................ 69 Bảng 4.9: Chu kỳ phát hiện mẫu chuẩn của 2 phương pháp ........................................ 71 Bảng 4.10: Các thơng số xây dựng đường chuẩn ......................................................... 72 Bảng 4.11: Kết quả thu nhận từ 2 phương pháp trong thí nghiệm 3 ............................ 74 Bảng 4.12: Kết quả định lượng mẫu 1 copy ................................................................. 77 Bảng 4.13: Kết quả định lượng mẫu Bt 176 1% ........................................................... 78 Bảng 4.14: Các thơng số kết quả của thí nghiệm ......................................................... 80 Bảng 4.15: Chu kỳ phát hiện của các mẫu thí nghiệm ................................................. 81 Bảng 4.16: Độ lệch tiêu chuẩn chu kỳ phát hiện của mẫu (CT Standard Deviation) .... 81 Bảng 4.17: Kết quả định lượng các mẫu thí nghiệm (2 lần lặp lại) .............................. 82 1 PHẦN I: MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Hiện nay, cùng với xu thế hồ nhập vào nền kinh tế thế giới, việc xuất nhập khẩu các sản phẩm nơng sản đã trở nên phổ biến ở nước ta. Điều này giúp cho nguồn thực phẩm cung cấp trong nước trở nên phong phú hơn, cho phép người dân lựa chọn và sử dụng nhiều loại thực phẩm mới cĩ chất lượng cao, phẩm chất tốt, gĩp phần nâng cao dinh dưỡng trong bữa ăn của người Việt Nam. Bên cạnh đĩ, nơng sản cũng là một mặt hàng xuất khẩu chính, đem lại nguồn thu ngoại tệ đáng kể cho nước ta trong thời gian qua. Trong quá trình xuất nhập khẩu các mặt hàng này, các biện pháp quản lý cũng như các phương pháp giúp xác định nguồn gốc nơng sản nhằm đảm bảo các chỉ tiêu an tồn về sức khỏe và mơi trường là rất quan trọng. Điều này xuất phát từ một thực tế là sự phát triển ngày càng cao của cơng nghệ sinh học và cơng nghệ gen cho phép ta cĩ thể dễ dàng biến đổi, cải tạo vật chất di truyền sinh vật, bổ sung các tính trạng mới theo ý muốn nhằm mục đích làm cho cây trồng, vật nuơi ngày càng cĩ phẩm chất và chất lượng tốt hơn. Tuy nhiên việc các sinh vật biến đổi gen (GMOs) này cĩ thể gây ra các tác động xấu đến mơi trường và sức khoẻ người tiêu dùng khi sử dụng chúng hay khơng là việc ta khơng thể nào kiểm sốt được. Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt là tại Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kĩ thuật nhằm phát hiện và định lượng được những biến đổi trên vật chất di truyền (DNA) cây trồng, vật nuơi do tác động của các kĩ thuật cơng nghệ sinh học. Mục đích là kiểm sốt và ngăn ngừa các tác động xấu cĩ thể cĩ của các sản phẩm biến đổi gen đồng thời cho phép người tiêu dùng lựa chọn sử dụng các nơng sản truyền thống (khơng biến đổi vật chất di truyền) hay các nơng sản đã được biến đổi di truyền. Trong số các kĩ thuật đã được các nước trên thế giới ứng dụng, cĩ thể nĩi Real-time PCR là một trong những kĩ thuật cho phép phát hiện và định lượng được những thay đổi trên DNA sinh vật một cách chính xác nhất. Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới và gần như là một qui trình bắt buộc phải thực hiện trong việc phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO trước khi cấp phép lưu hành trên thị trường, đặc biệt là tại các quốc gia Châu Âu. Do tác động của các qui định này, các sản phẩm nơng nghiệp của nước ta trong tương lai khi tham gia vào thị trường thế giới, bắt buộc phải trải qua bước kiểm tra GMO 2 trước khi được cấp phép. Thực tế này địi hỏi nước ta phải sớm xây dựng được một qui trình kiểm tra, phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO xuất nhập khẩu ở nước ta. Mặc dù đây là một vấn đề cịn mới mẻ nhưng thiết nghĩ điều này sẽ rất cần thiết trong tương lai một khi nước ta hồ nhập vào nền kinh tế tồn cầu, đặc biệt là Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO). Vì lý do đĩ, được sự cho phép của thầy Lê Đình Đơn và thầy Nguyễn Thái Thủy, em quyết định chọn đề tài khố luận tốt nghiệp là: Bước đầu xây dựng quy trình định lượng sản phẩm biến đổi gen bằng phương pháp Real-Time PCR. 2. Mục đích và yêu cầu Mục đích - Xây dựng quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên trình tự promoter 35S. - Định lượng promoter 35S trên một số sản phẩm bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp hiện diện trên thị trường. Yêu cầu - Nắm vững kĩ thuật Real-time PCR: thao tác chính xác, hạn chế sai sĩt trong thực hiện. - Sàng lọc được các mẫu bắp biến đổi gen dựa trên các vạch điện di (123 bp) cĩ nhiệt độ nĩng chảy (86oC). - Tính tốn được tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một số mẫu bắp và thực phẩm chứa bắp lưu hành trên thị trường dựa trên định lượng promoter 35S và gen tham chiếu. 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism) Vào thế kỷ 20, sinh học đã cĩ những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu sinh học phân tử ở mức độ DNA và protein. Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào thực tiễn và phát triển thành một cơng nghệ mới, đĩ là cơng nghệ gen, bao gồm: các kỹ thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen. Chúng thật sự là những bước đột phá của nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở ra những chân trời mới với những khám phá và ứng dụng vơ tận cho cuộc sống và lợi ích của con người. Một trong các ứng dụng đĩ chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen (GMO- genetically modified organism), đặc biệt là cây trồng biến đổi gen (GMP-genetically modified plant). Với các ưu điểm nổi bật, các giống thực vật này khi ra đời đã gĩp phần nâng cao chất lượng và sản lượng lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của nhân loại. Hiện nay, trên thế giới cĩ nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen (GMO). Tuy nhiên, hầu hết chúng được định nghĩa là những sinh vật mà vật chất di truyền của chúng đã được biến đổi theo những cách khơng xảy ra trong tự nhiên như các quá trình lai chéo hay biến đổi tự nhiên. Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kĩ thuật chuyển nạp gen và trong đa số trường hợp các gen này được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng (protein) [33]. 2. Quá trình tạo sinh vật GMO Quá trình cơ bản Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kĩ thuật tiên tiến nhất của con người trong cơng nghệ sinh học thực vật. Mặc dù các kĩ thuật tạo ra chúng khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn cĩ những bước tiến hành chung để đạt được kết quả cuối cùng. Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý, sinh hĩa, sự điều hịa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đĩ tạo ra cần phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành cơng của quá trình. 4 Hình 2.1: Quy trình chuyển gen [17] Các bước cơ bản bao gồm: - Ly trích acid nucleic (DNA/RNA) - Dịng hĩa gen - Thiết kế gen cho quá trình chuyển gen - Chuyển gen - Lai backcross Đây thật sự là một quá trình khá phức tạp và tốn kém. Thời gian cần thiết cho việc phát triển một giống cây trồng chuyển gen mới phụ thuộc vào gen mong muốn, giống thực vật, nguồn gen và sự phê chuẩn của cơ quan quản lý. Nĩ kéo dài khoảng từ 6-15 năm trước khi một dịng lai chuyển gen mới được phép thương mại hĩa trên thị trường [17]. Promoter CaMV 35S Để tạo cây chuyển gen cĩ hiệu quả cao trong sản xuất và thương mại, việc điều hịa sự biểu hiện gen hữu ích được chèn vào trong bộ gen của cây trồng rất quan trọng. Điều này được thực hiện nhờ gắn vào gen hữu ích một promoter và terminator nhằm điều khiển sự biểu hiện của gen đĩ. Hiện nay, trên thế giới cĩ rất nhiều promoter được 5 sử dụng, tuy nhiên trong số đĩ promoter CaMV 35S được sử dụng nhiều nhất do một số ưu điểm nổi bật của nĩ và đây cũng là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài này [16]. Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46] Vào đầu thập niên 80, GS. Chua và các cộng sự tại trường Đại Học Rockefeller đã phân lập được một promoter cho phép phiên mã tồn bộ bộ gen của Cauliflower mosaic virus (CaMV) xâm nhiễm vào củ cải. Promoter này được đặt tên là CaMV 35S promoter do hệ số lắng của tồn bộ bản sao promoter là 35S. Nĩ là một promoter cơ bản (constitutive promoter) được sử dụng rộng rãi nhất cho nhiều ứng dụng. Promoter 35S là một promoter cơ bản rất mạnh, cĩ thể hoạt hĩa phiên mã trong mọi lồi thực vật và cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao trong cây hai lá mầm. Tuy nhiên, nĩ kém hiệu quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc. Sự khác biệt này cĩ lẽ do những khác biệt về chất lượng, số lượng các yếu tố điều hịa [16]. Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16] Nhằm khắc phục khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu quả hoạt động bằng cách thêm vào các trình tự enhancer. Trình tự này dài 162 bp, từ - 208 bp đến -46 bp. Các nghiên cứu cho thấy, hiệu quả hoạt động phiên mã gia tăng từ 3 đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer [16]. 6 Về sự liên quan của promoter 35S trong việc phát hiện GMO, theo GS.TS. Phạm Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển gen” do hội các phịng thí nghiệm Việt Nam (VINATEST) tổ chức ngày 5/5/2005, cho biết 95% cây chuyển gen tại châu Âu cĩ mang promoter 35S (p35S) và/hoặc terminator nos (Tnos) kiểm sốt trình tự gen được chuyển vào trong cây chuyển gen. Khi mẫu phân tích cĩ một trong hai trình tự này thì mẫu đĩ 95% là cĩ chuyển gen, ngược lại khi kết quả mẫu phân tích khơng cĩ cả hai trình tự này thì ta cũng cĩ thể kết luận mẫu 95% khơng cĩ chuyển gen. Bên cạnh đĩ, một nghiên cứu khác cũng cho thấy, nếu chỉ phát hiện cĩ promoter 35S thì 70% đĩ là sản phẩm chuyển gen. Điều này chứng tỏ promoter 35S cĩ thể được sử dụng làm mục tiêu cho việc phát hiện và định lượng sinh vật biến đổi gen do sự hiện diện ở mức độ cao của nĩ. Hiện nay, promoter 35S đang thuộc bản quyền của Đại Học Rockefeller và cơng ty Monsanto (Mỹ) [9] [15] [16] [29]. 3. Ứng dụng và lợi ích của thực vật chuyển gen Từ buổi ban đầu, thực vật chuyển gen được tạo ra nhằm phục vụ cho những lợi ích thiết thực và mục tiêu hết sức đa dạng của con người. Ứng dụng Thực vật sử dụng làm thực phẩm [17] Các ứng dụng này chủ yếu tập trung vào việc giảm lượng thuốc trừ sâu sử dụng, tăng năng suất và biến đổi các đặc tính cho phù hợp với quá trình sản xuất thực phẩm. Mục đích là nâng cao độ an tồn cho các loại thực phẩm mà con người sử dụng đồng thời tạo ra các loại thực phẩm cĩ chất lượng ngày một tốt hơn. Các ứng dụng chính bao gồm: - Chống chịu thuốc diệt cỏ: Tính trạng được ứng dụng phổ biến nhất, giúp giảm lượng thuốc diệt cỏ sử dụng và tồn dư thuốc trong cây và mơi trường [17]. - Kháng sâu bọ: Cho phép cây trồng kháng sâu bọ bằng cách tạo ra các chất độc giết chết cơn trùng. Được ứng dụng nhiều nhất là các gen tạo độc tố Bt từ vi khuẩn Bacillus thringensis. Ưu điểm của chúng là khơng gây ơ nhiễm mơi trường, con người và động vật bậc cao [17]. 7 - Cây trồng bất thụ đực: Giúp sản xuất các giống nơng sản lai năng suất cao [17]. - Kháng bệnh: Mục tiêu của các giống cây trồng chuyển gen này là ngăn chặn sự phát sinh bệnh do virus và nấm trên cây trồng [17]. - Ngăn chặn sự chín sớm của trái cây: Kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp cho sản xuất thực phẩm [17]. - Các đặc tính chất béo được thay đổi: Ứng dụng chủ yếu cho tiêu dùng và chế biến thực phẩm. Mục tiêu là tăng hàm lượng các loại acid béo khơng bão hịa đơn và giảm acid béo khơng bão hịa đa trong các loaị cây lấy dầu như canola, đậu nành, hoa hướng dương [17]. - Cố định đạm: Ứng dụng cho các giống thực vật khơng cĩ khả năng cố định đạm [17]. - Nâng cao giá trị dinh dưỡng : Mục tiêu là chuyển nạp các gene mã hĩa các protein cĩ chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu: lysine, tyrosine, tryptophan vào cây trồng giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng [17]. - Thực phẩm chức năng: Đây là một hướng nghiên cứu tuy cịn khá mới mẻ nhưng đã hứa hẹn thành cơng rực rỡ trong tương lai. Mục tiêu là chuyển nạp gene biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như: viêm gan B, cúm… tạo ra các loại vaccine cĩ thể ăn được (edible vaccine). Một hướng nghiên cứu khác là chuyển nạp gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp quý như: dược phẩm, chất dẻo. Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức năng đĩ là gạo vàng (Golden rice). Đây là loại gạo cĩ hàm lượng vitamin A được tăng cao bằng cách chuyển nạp 3 gen mã hĩa quá trình sinh tổng hợp carotene. Các nhà khoa học hy vọng gạo vàng sẽ gĩp phần xố bỏ các chứng bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các nước đang phát triển [17]. Thực vật khơng sử dụng làm thực phẩm [17] - Hoa với nhiều màu sắc và kéo dài thời gian trưng bày. - Cây trồng kháng các yếu tố mơi trường: Bên cạnh cây chuyển gen kháng tác nhân gây bệnh, các cơ chế kháng các tác nhân gây stress của mơi trường như: chịu lạnh, chịu hạn, chịu muối và các ion kim loại nặng cũng được nghiên cứu và bước đầu phát triển. 8 - Cây trồng giúp chuyển hĩa tại các vùng ơ nhiễm. Như vậy, hiện nay các ứng dụng của thực vật chuyển gen là khá đa dạng và trong tương lai các ứng dụng này hứa hẹn sẽ được tiếp tục mở rộng hơn nữa [17] [24]. Tác động cĩ lợi của thực vật chuyển gen Với những ưu điểm nổi bật và ứng dụng khá đa dạng như trên, cây trồng chuyển gen đã đem lại một số lợi ích đối với nơng nghiệp và đời sống con người: - Lợi ích kinh tế: Nâng cao hiệu quả lao động: giảm tiền cơng lao động trong việc phun xịt các loại thuốc diệt cỏ, trừ sâu và việc cày cấy. Nâng cao năng suất: giảm được thất thốt do cơn trùng và bệnh tật, do đĩ làm giảm áp lực cho đất trồng. Tạo ra các đặc tính biến đổi phù hợp với quá trình sản xuất, ví dụ: cà chua khơng bị mềm quá sớm, do đĩ giảm lượng nước cần trong quá trình sản xuất thực phẩm. Làm chủ năng suất: nâng cao độ tinh sạch của hạt giống giúp nâng cao năng suất. Cho phép canh tác trên những vùng đất trước đây khơng thể sử dụng. - Mơi trường: Giảm dư lượng phân bĩn nhờ cố định đạm, giảm áp lực đất trồng. Giảm sử dụng thuốc trừ sâu. Chỉ thị và chuyển hĩa ơ nhiễm. Bảo vệ mơi trường sinh thái. - Sức khỏe con người: Giảm các tác động độc hại do thuốc trừ sâu gây ra với sức khỏe. Tạo ra được các loại thực phẩm mới cĩ chất lượng tốt hơn, cĩ khả năng chữa bệnh phục vụ cho con người. Nâng cao dinh dưỡng cho con người. Những tác động cĩ lợi này đã giúp cho cây trồng chuyển gen được sản xuất và thương mại hĩa ngày càng rộng rãi trên thế giới [17] [24]. 9 4. Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới Lịch sử phát triển và thương mại hĩa cây trồng biến đổi gen là một lịch sử phát triển khá nhanh. Từ một sản phẩm cà chua Flavr Savr biến đổi gen làm chậm quá trình chín được trồng và thương mại hạn chế tại Mỹ năm 1994, đến nay, cây trồng biến đổi gen đã được trồng và thương mại hĩa tại nhiều quốc gia trên thế giới. Chúng khơng ngừng được bổ sung các chủng loại, giống cây mới cũng như những tính trạng, chức năng hữu ích mới làm phong phú thêm bộ sưu tập cây trồng chuyển gen. Đồng thời, việc ngày càng nhiều quốc gia trên thế giới cũng như số lượng người nơng dân tham gia trồng trọt cây chuyển gen ngày càng tăng cho thấy một số tác động tích cực do chúng mang lại. Hình 2.4: Cà chua biến đổi gen Flavr Savr [17] Hiện nay, theo số liệu mới nhất vào năm 2004, diện tích cây chuyển gen trên tồn thế giới ước đạt 81,0 triệu ha, tăng 13,3 triệu ha so với năm 2003 (67,7 triệu ha). Như vậy chỉ trong 9 năm, từ năm 1996 đến năm 2004, diện tích cây trồng chuyển gen đã tăng hơn 47 lần, từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên đến 81,0 triệu ha năm 2004. Trong thời gian này, tỷ lệ gia tăng diện tích trồng bao giờ cũng ở mức tăng hai chữ số hàng năm, riêng năm 2004 đã là 20%, cho thấy sự phát triển hết sức nhanh chĩng diện tích cây chuyển gen trên thế giới. Bên cạnh đĩ, số quốc gia tham gia trồng cũng như số lượng người nơng dân tham gia cũng đã gia tăng hết sức nhanh chĩng. Từ những nước khởi xướng ban đầu là các quốc gia phát triển (Mỹ, Canada) với số lượng người trồng hạn chế, đến nay số quốc gia tham gia trồng cây chuyển gen đã lên đến 17 nước với 8,25 triệu nơng dân (so với 7 triệu vào năm 2003). Con số này cĩ sự gĩp mặt đơng đảo các quốc gia đang phát triển trên thế giới (11 quốc gia đang phát triển và 6 quốc gia phát triển). Một con số khác cũng rất đáng chú ý đĩ là số lượng các quốc gia cĩ diện tích 10 trồng lớn (trên 50.000 ha) cũng đã tăng lên 14 nước, với 9 nước đang phát triển và 5 nước phát triển. Sự tham gia ngày càng đơng đảo của các quốc gia đang phát triển (Trung Quốc, Ấn Độ, Argentina, Brasil và Nam Phi), chiếm đến 34% tổng diện tích trồng với tỷ lệ tăng hàng năm cao hơn cả các quốc gia phát triển, đã cĩ tác động mạnh mẽ đến tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới [3][4][21]. Hình 2.5: Diện tích cây trồng chuyển gen tồn cầu [20] Diện tích cây chuyển gen hiện nay tại các quốc gia trồng lớn như sau: Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18] 11 Với tỷ lệ gia tăng rất nhanh, trong tương lai, cây trồng biến đổi gen cĩ thể sẽ chiếm tỷ lệ lớn trong cơ cấu cây trồng hiện đại. Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19] Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới Bảng 2.1: Một số giống bắp đƣợc cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) [41] Tên giống Đặc tính Cơng ty - MON810 - MON863 - NK 603 - GA 21 - NK 603 X MON 810 - GA21 X MON 810 - MON863 X MON603 - Bt176 maize - Bt 11 - DAS1507 - T25 Kháng cơn trùng Kháng sâu hại Chống chịu thuốc diệt cỏ - Chống chịu thuốc diệt cỏ và kháng sâu hại - - Bắp chuyển gen Bt và chống chịu thuốc diệt cỏ - Kháng sâu hại và chống chịu thuốc diệt cỏ Chống chịu thuốc diệt cỏ Monsanto - - - - - - Syngenta - Pioneer Bayer Theo báo cáo năm 2004 thì hiện nay, diện tích trồng bắp chuyển gen là 19,3 triệu ha, chiếm 23% diện tích cây trồng chuyển gen trên tồn thế giới. Diện tích trồng 12 bắp đã liên tục tăng trưởng trong những năm gần đậy, đạt tỷ lệ 27% trong năm 2003 và 25% trong năm 2004. Dự đốn diện tích này sẽ tiếp tục tăng mạnh trong thời gian tới do nhu cầu về bắp đang ngày càng tăng và cĩ nhiều giống bắp mới đã được cấp phép. Như vậy liệu trong tương lai, cây trồng biến đổi gen cĩ thể thay thế các loại cây trồng truyền thống để phục vụ cho nhu cầu lương thực của con người hay khơng? Và cĩ thật sự là cây trồng chuyển gen chỉ mang lại những hiệu quả và tác động cĩ lợi “thần kỳ” hay khơng? [3] [21]. 5. Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen Các rủi ro cĩ thể gặp [34] Quả thật, sự phát triển của cây trồng chuyển gen được thể hiện qua những con số rất đáng kể. Tuy nhiên, vấn đề nào cũng cĩ mặt trái của nĩ. Việc được trồng và thương mại hĩa ngày càng tăng tại nhiều quốc gia trên thế giới khơng cĩ nghĩa là các sinh vật biến đổi gen này hồn tồn khơng cĩ một rủi ro hay tác hại nào đối với mơi trường và sức khỏe con người. Theo nhiều nhà khoa học trên thế giới, những rủi ro và tác hại cĩ thể cĩ của thực vật chuyển gen cĩ thể do những nguyên nhân sau: - Gen chuyển nạp chèn vào vị trí ngẫu nhiên, phá vỡ trình tự gen hiện hữu. - Thiếu kiểm sốt thơng thường đối với gen chuyển nạp dẫn đến các gen chuyển nạp thường biểu hiện liên tục trong mọi tế bào, kể cả sau khi được mua bán và tiêu dùng. - Hầu hết gen cĩ nhiều chức năng và tương tác chặt chẽ. Vì vậy, làm sao ta cĩ thể kiểm sốt hết tất cả các tác dụng do gen chuyển nạp tạo ra. - Sự chuyển gen ngang: Trong cơng nghệ gen, các gen hữu ích chuyển nạp vào cây trồng thường kèm với các vật liệu di truyền cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn hay virus: vector, promoter, marker. Điều này gây lo ngại rằng các gen chèn vào cĩ thể thốt khỏi sinh vật biến đổi gen và chuyển nạp vào các vi sinh vật, thậm chí là tế bào động vật cĩ vú, gây ra các tác hại khơng lường được đối với sức khỏe con người. Các khuyết điểm này cĩ thể dẫn đến những tác động cĩ hại đến mơi trường và sức khoẻ con người được liệt kê ở phần sau đây: 13 Tác động cĩ hại Mơi trƣờng Sự chuyển gen từ các thực vật biến đổi gen cho các lồi thực vật tự nhiên khác gây ra các biến đổi di truyền bất thường trên các lồi thực vật này [34]. Tác động xấu đến các lồi khơng mục tiêu: các lồi thực vật chuyển gen kháng sâu hại cĩ thể tác động xấu đến các lồi sinh vật và cơn trùng cĩ lợi khác [34]. Gia tăng việc sử dụng thuốc hĩa học trong nơng nghiệp: Trái với mong đợi, báo cáo năm 1999 tại Mỹ cho thấy, nơng dân trồng đậu nành biến đổi gen Roundup Ready gia tăng sử dụng thuốc hĩa học từ 2 đến 5 lần so với nơng dân trồng đậu nành thơng thường. Trong năm 2001-2002, lượng thuốc hĩa học sử dụng đã tăng 70 tỷ pound tại Mỹ. Điều này gây ra lo ngại về dư lượng thuốc hĩa học trong các sản phẩm nơng nghiệp [12]. Sự hình thành “siêu cỏ dại”: các nghiên cứu cho thấy, các gen kháng thuốc diệt cỏ cĩ thể phĩng thích khỏi cây trồng biến đổi gen và chuyển vào các loại cây trồng, cỏ dại khác tạo nên một loại “siêu cỏ dại” cĩ khả năng kháng một hay nhiều loại thuốc diệt cỏ. Điều này sẽ gây ra rất nhiều khĩ khăn trong việc phịng trừ cỏ dại trong thời gian tới [34]. Sự hình thành “siêu cơn trùng” kháng lại các tác nhân biến đổi gen gây độc được tạo ra (Bt). Điều này cĩ thể gây ra rất nhiều khĩ khăn trong việc phịng trừ sâu hại [23][34]. Sức khoẻ ngƣời tiêu dùng Các tác nhân dị ứng mới: Cơng nghệ gen cho phép biểu hiện các gen chuyển nạp bắt nguồn từ nhiều loại sinh vật khác lồi: virus,vi khuẩn. Các loại protein mới này cĩ thể gây ra các triệu chứng dị ứng trên con người. Dư lượng thuốc bảo vệ thực vật: Việc tạo ra cây trồng kháng thuốc trừ cỏ cho phép sử dụng thuốc trừ cỏ trên cây đang trong giai đoạn phát triển. Điều này vốn bị cấm trước đây do người tiêu dùng cĩ thể bị ảnh hưởng bởi dư lượng thuốc trừ cỏ trong thực phẩm họ sử dụng. Điều khơng thể phủ nhận là tỷ lệ hồi chuyển từ dạng thuốc trừ cỏ bị phân hủy về dạng độc nguyên thủy đã lên đến 10% trong hệ tiêu hĩa. 14 Các gen kháng kháng sinh làm marker trong thực phẩm biến đổi gen cĩ thể chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột gây ra những vấn đề nghiêm trọng với các tác nhân gây bệnh kháng kháng sinh. Tạo ra các loại chất độc mới do các tương tác khơng kiểm sốt được giữa các sản phẩm biến đổi gen và các phần tử khác [24][34]. Các nghiên cứu và dẫn chứng cụ thể - Cà chua Flavr Savr: Gây ra những thương tổn cho chuột (7 trong số 40 con chuột thí nghiệm đã chết sau 15 ngày). Chúng đã bị cấm bán trên thị trường. - Khoai tây biến đổi gen: thí nghiệm của Dr Arpad Pusztai (Viện nghiên cứu Rowett) cho thấy thương tổn trong hệ tiêu hĩa chuột khi ăn khoai tây biến đổi gen chứa gen sản xuất lectin. Các con chuột này khơng bị ảnh hưởng khi chỉ ăn khoai tây khơng biến đổi gen hay ăn lectin. - Bắp biến đổi gen (Chardon LL): Trong nghiên cứu của cơng ty, số gà chết khi ăn bắp này gấp đơi số gà chết khi ăn thức ăn khơng biến đổi gen (10 con so với 5 con). - Nghiên cứu của Đại học Newcastle về chuyển nạp gen: Kết quả cho thấy khi ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen cĩ hiện tượng gen chuyển nạp thốt ra và chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột. - L-tryptophan: Thực phẩm biến đổi gen bổ sung chất này đã gây ra 37 trường hợp tử vong và ít nhất 1500 trường hợp tàn tật tại Mỹ do một chất độc khơng xác định được. Cơng ty sản xuất đã bồi thường 2 tỷ USD cho trên 2000 nạn nhân [34]. Dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen Bên cạnh những ý kiến tranh cãi hết sức gay gắt của các nhà khoa học, dư luận xã hội về vấn đề cây trồng biến đổi gen cũng hết sức phức tạp do lương thực, thực phẩm là một vấn đề cĩ tác động to lớn đối với đời sống con người. Cĩ nhiều ý kiến ủng hộ nhưng cũng khơng thiếu những ý kiến phản đối hết sức gay gắt. 15 Hình 2.8: Biểu tình phản đối GMO tại châu Âu [27] Hiện nay, các Tổ chức bảo vệ mơi trường (Greenpeace, Friends of the Earth…) và người dân tại nhiều quốc gia trên thế giới đã phản đối hết sức gay gắt cây trồng biến đổi gen và các cơng ty nơng nghiệp. Sự phản đối này bắt nguồn từ các nguyên nhân sau: - Các tác động xấu tiềm năng do thực vật biến đổi gen gây ra cho mơi trường và sức khoẻ con người. - Các cơng ty thiếu trách nhiệm trong việc nghiên cứu những ảnh hưởng của chúng lên con người. - Cây trồng biến đổi gen sẽ gây ra tình trạng lệ thuộc vào hạt giống và thuốc hĩa học của các cơng ty nơng nghiệp [27]. Tại châu Âu, những phản đối này đã dẫn đến việc thành lập những khu vực „Khơng GMO„ (GMO free zone) tại nhiều quốc gia châu Âu (22 khu vực vào năm 2003) và các cơng ty thực phẩm tại châu Âu đã tuyên bố khơng sử dụng sản phẩm biến đổi gen làm nguyên liệu thực phẩm. Thái độ của người dân châu Âu cũng được thể hiện rõ qua cuộc thăm dị dư luận do Eurobarometer thực hiện vào tháng 12 năm 2001: - 94,6 % muốn cĩ quyền lựa chọn sản phẩm truyền thống hay sản phẩm biến đổi gen. - 85,9 % muốn được thơng tin nhiều hơn trước khi sử dụng GMO. - 70,9 % khơng muốn sử dụng thực phẩm biến đổi gen. Trước đĩ, một nghiên cứu vào năm 1996 cũng cho thấy: - 74% cơng dân châu Âu ủng hộ việc dán nhãn thực phẩm biến đổi gen. 16 - 53% tin rằng các biện pháp quản lý khơng đủ để bảo vệ người tiêu dùng khỏi các rủi ro do thực phẩm biến đổi gen mang lại. Các kết quả trên cho thấy người dân tại châu Âu và nhiều quốc gia trên thế giới địi hỏi chính phủ phải cĩ các biện pháp quản lý thích hợp các sản phẩm biến đổi gen vì lợi ích của cộng đồng [27][28]. 6. Vấn đề quản lý sản phẩm biến đổi gen trên thế giới Hiện nay, việc quản lý các sinh vật biến đổi gen trên tồn cầu được qui định bằng Nghị định thư An tồn sinh học Cartagena (Liên Hiệp Quốc ban hành và cĩ hiệu lực từ ngày 11/9/2003). Đây là văn bản đầu tiên trên thế giới xác định các sinh vật biến đổi gen là khác biệt so với các sinh vật thơng thường khác, vì vậy cần cĩ các biện pháp quản lý riêng biệt. Một trong những điểm chính của Nghị định là việc quản lý sự lưu hành của sinh vật biến đổi gen trên thế giới, qua đĩ kiểm sốt việc phĩng thích vào mơi trường và thương mại hĩa các sinh vật đặc biệt này. Dù cịn nhiều hạn chế, đây là một tiến bộ của thế giới trong việc đạt sự đồng thuận về vấn đề sinh vật biến đổi gen [26]. Bên cạnh Nghị định thư, các nước cịn ban hành các văn bản quản lý vấn đề sinh vật biến đổi gen. Hiện nay, qui định của các quốc gia trên thế giới rất đa dạng và khác biệt tùy theo tình hình thực tế tại mỗi nước. Hầu hết các nước đều ban hành những quy định cụ thể nhằm quản lý việc xuất nhập khẩu và thương mại hĩa các sản phẩm biến đổi gen. Một điểm chính trong các quy định là yêu cầu dán nhãn các sản phẩm biến đổi gen được thương mại hĩa. Bên cạnh việc quản lý, quy định này cịn giúp người tiêu dùng phân biệt được sản phẩm biến đổi gen với các sản phẩm truyền thống khơng biến đổi gen khác, qua đĩ cho phép họ lựa chọn việc sử dụng sản phẩm nào là thích hợp nhất. Trong việc dán nhãn, điều quan trọng nhất là việc xác định mức ngưỡng. Mức ngưỡng này biểu thị sự hiện diện của thành phần biến đổi gen (do ngẫu nhiên hay khơng thể loại bỏ được) trong một loại thực phẩm hay thức ăn được thương mại hĩa. Nếu thành phần biến đổi gen này vượt quá mức ngưỡng cho phép, sản phẩm đĩ phải được dán nhãn. Tuy nhiên, mức ngưỡng quy định và yêu cầu dán nhãn rất khác biệt ở các nước. Ta cĩ thể điểm qua một số quốc gia sau đây: 17 Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen [10] Quốc gia Qui định về dán nhãn Mức ngƣỡng cho sự hiện diện vật liệu chuyển gen trong thực phẩm (%) Châu Âu Bắt buộc 0,9 Úc & New Zealand Bắt buộc 1 Nhật Bản Bắt buộc 5 Hàn Quốc Bắt buộc 3 Mỹ Khơng bắt buộc Khơng cĩ Canada Khơng bắt buộc 5 Argentina Khơng bắt buộc Khơng cĩ Nhìn vào bảng thống kê trên ta thấy, ngoại trừ 3 quốc gia Mỹ, Canada và Argentina là khơng bắt buộc dán nhãn sản phẩm biến đổi gen cũng như khơng quy định mức ngưỡng cụ thể, hầu hết các quốc gia trên thế giới đều cĩ quy định cụ thể về mức ngưỡng và việc dán nhãn bắt buộc (cịn cĩ Brazil, Trung Quốc, Ấn Độ, Nga, Phillipines, Ả rập Saudi, Đài Loan, Thái Lan…). Trong đĩ, khắt khe nhất là châu Âu [10]. Quy định tại châu Âu [33]: Châu Âu là nơi đã ban hành những quy định sớm nhất và chặt chẽ nhất về vấn đề sinh vật biến đổi gen (từ năm 1990) nhằm bảo vệ người tiêu dùng và mơi trường. Hiện nay, các văn bản quy định hiện hành bao gồm: - Chỉ thị 2001/18/EC (Directive 2001/18/EC) - Chỉ thị 98/81/EC (Council Directive 98/81/EC) - Quy định 258/97 (EC) (Regulation (EC) No 258/97) - Quy định 1829/2003 (EC) (Regulation (EC) 1829/2003) - Quy định 1830/2003 (EC) (Regulation (EC) 1830/2003) 18 Các văn bản này quản lý và quy định việc thử nghiệm và cấp phép thương mại các sinh vật biến đổi gen rất chặt chẽ, đặc biệt những mức ngưỡng mới, nhỏ hơn cho việc dán nhãn đã được qui định trong thời gian gần đây. Mức ngưỡng 1% cũ cho tỷ lệ gen chuyển nạp của những sản phẩm GMO đã được cấp phép đã giảm xuống ở mức 0,9%. Thêm vào đĩ, đối với những sản phẩm biến đổi gen chuẩn bị được cấp phép, tỷ lệ gen chuyển nạp được qui định là 0,5%. Cộng đồng châu Âu xác định người tiêu dùng cĩ quyền được thơng tin và việc dán nhãn như là một cơng cụ để cĩ sự lựa chọn chính xác. Từ năm 1997, việc dán nhãn để thơng báo sự hiện diện của GMO hay thực phẩm biến đổi gen là bắt buộc. Vì những lý do đĩ, châu Âu xác định sự cần thiết phải phát triển các phương pháp phân tích. Chúng khơng chỉ phát hiện sự hiện diện cĩ thể xảy ra của GMO trong thực phẩm mà cịn giúp xác định một sản phẩm biến đổi gen đặc biệt và định lượng hàm lượng của GMO trong những thành phần thực phẩm và thức ăn khác nhau. Nguyên tắc định lƣợng dựa trên DNA Theo quy định châu Âu, những sản phẩm được phát hiện cĩ thành phần biến đổi gen sẽ phải trải qua bước định lượng để xác định tỷ lệ phần trăm thành phần biến đổi gen hiện diện trong đĩ. Tỷ lệ phần trăm được tính bằng cách chia số lượng trình tự đặc trưng của GMO cho số lượng một gen đặc trưng của lồi thực vật đĩ (ví dụ: gen lectin ở đậu nành; gen invertase, zein ở bắp). Cơng thức này cĩ thể biểu diễn như sau: GMO(%)= (số lượng trình tự GMO/số lượng gen đối chiếu) x 100 Việc dán nhãn khơng bắt buộc đối với những sản phẩm cĩ chứa nguyên liệu từ GMO chiếm tỷ lệ khơng hơn 0,9% thành phần nguyên liệu đĩ. Tất cả các thành phần (bột, dầu, bơ…) bắt nguồn từ một lồi (ví dụ: bắp, đậu nành…) được gộp lại và xem là một thành phần đơn [42]. Ví dụ, hình 2.9 khơng yêu cầu phải dán nhãn do tỷ lệ bắp chuyển gen chỉ chiếm 0,6% trên tổng thành phần bắp, tương tự như đậu nành. Tuy nhiên, trong hình 2.10 ta thấy tổng tỷ lệ phần trăm 2 loại bắp chuyển gen là Bt11 và Bt 176 là 0,6%+0,6% =1,2% lớn hơn mức ngưỡng 0,9%. Vì vậy loại thực phẩm này bắt buộc phải dán nhãn. 19 Hình 2.9: Khơng yêu cầu dán nhãn [42] Hình 2.10: Bắt buộc phải dán nhãn [42] Quy trình xét nghiệm sản phẩm biến đổi gen tại châu Âu Quá trình sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu của quá trình này là phát hiện định tính sản phẩm biến đổi gen trong các loại nơng sản, thực phẩm khác nhau. Các sản phẩm được phát hiện dương tính sẽ trải qua quá trình định lượng, các sản phẩm âm tính sẽ bị loại bỏ. Quá trình này dựa trên độ nhạy của phản ứng PCR để phát hiện tất cả các thành phần biến đổi gen trong mẫu thí nghiệm. Trong số này, promoter 35S và terminator nos là hai đối tượng được kiểm tra nhiều nhất do chúng hiện diện phần lớn trong các sản phẩm biến đổi gen [31][32][37]. Quá trình định lƣợng sản phẩm biến đổi gen Quá trình định lượng nhằm xác định chính xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen của một mẫu sản phẩm, đây là cơ sở cho việc áp dụng các quy định dán nhãn cho mẫu sản phẩm. Các đối tượng được định lượng cĩ thể là p35S, tnos hay chính xác gen chuyển 20 nạp. Việc định lượng p35S và tnos trong các mẫu sản phẩm hỗn hợp nhiều thành phần cĩ thể khơng chính xác do chúng hiện diện trong rất nhiều sản phẩm biến đổi gen khác nhau, do đĩ kết quả định lượng chỉ là kết quả tổng. Vì vậy, việc định lượng thường được tiến hành trên những đối tượng riêng biệt cho mẫu sản phẩm đĩ, như: gen chuyển nạp, trình tự nối giữa promoter và gen chuyển nạp. Tại châu Âu, gen chuyển nạp đã đăng ký và chưa đăng ký được áp dụng 2 mức ngưỡng khác nhau (0,9 % và 0,5%) [37][42]. Hình 2.11: Quy trình kiểm sốt GMO tại châu Âu [13] Như vậy, nhìn trên Hình 2.11 ta thấy quy trình quản lý và kiểm tra này được thực hiện khá hồn chỉnh và chặt chẽ từ khâu đầu đến khâu cuối, áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm và thức ăn được sản xuất và xuất nhập khẩu tại châu Âu (ở đây chỉ là ví dụ ở bắp và đậu nành, hai loại nơng sản chuyển gen chính). Điều này cũng đặt ra những thách thức và rào cản đối với nơng sản của các nước khi muốn tham gia vào thị 21 trường rộng lớn này. Đồng thời, xu hướng quản lý chặt chẽ các sản phẩm biến đổi gen ngày càng được chú trọng trên thế giới. Đây là một vấn đề mà các quốc gia xuất khẩu nơng sản chính, trong đĩ cĩ Việt Nam cần phải quan tâm. 7. Tình hình Việt Nam Nghiên cứu và phát triển sinh vật biến đổi gen Là một phần quan trọng trong chiến lược phát triển cơng nghệ sinh học của nước ta, chính phủ đã đầu tư khá lớn (1,5-2 triệu USD hàng năm) cho việc nghiên cứu phát triển các giống cây trồng biến đổi gen. Các cơ quan tham gia nghiên cứu và phát triển cĩ thể kể đến là: Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Di truyền nơng nghiệp, Viện lúa đồng bằng sơng Cửu Long. Các giống cây trồng đã được quan tâm nghiên cứu cĩ thể kể đến như: gạo, bắp, đu đủ, bơng vải, hoa và một số cây lấy gỗ khác. Với sự đầu tư lớn và tập trung nghiên cứu, nước ta đã đạt được một số thành quả nhất định trong chuyển gen: gạo, bắp mang gen Bt, đu đủ kháng virus. Mặc dù các thành tựu cịn khá khiêm tốn, nhưng hứa hẹn khả năng ứng dụng to lớn trong tương lai [38]. Vấn đề thƣơng mại hĩa và kiểm sốt sinh vật biến đổi gen Tại nước ta chính thức thì chưa cĩ một loại cây trồng biến đổi gen nào được thương mại hĩa. Tuy nhiên, các giống nơng sản được trồng hiện nay như: bắp, đậu nành, bơng vải, đa phần là các giống nước ngồi. Hầu hết chúng đều cĩ năng suất cao, chất lượng tốt nhưng chúng cũng mang một số tính trạng nghi ngờ là chuyển gen như: kháng thuốc diệt cỏ, hạt giống khơng sử dụng được cho vụ sau. Vấn đề là do chưa cĩ một văn bản pháp luật kiểm sốt chính thức nên vấn đề quản lý gặp rất nhiều khĩ khăn. Mặc khác, do khơng cĩ sự thơng tin đầy đủ dẫn đến hiện tượng người nơng dân trồng tràn lan các giống nơng sản gây ra tình trạng lẫn lộn giữa các giống chuyển gen và khơng chuyển gen. Đây là vấn đề nghiêm trọng, cĩ thể gây ra các tác hại khơng lường được đối với mơi trường và sức khỏe người tiêu dùng khi ta sử dụng các giống này. Đồng thời, việc thiếu một văn bản pháp lý hồn chỉnh cũng gây ra khơng ít khĩ khăn khi ta muốn xuất khẩu nơng sản sang các nước khác, đặc biệt là thị trường châu Âu, vốn địi hỏi rất khắt khe về vấn đề này. 22 Nhận thức được điều đĩ, nước ta đã tích cực hợp tác với quốc tế trong vấn đề an tồn sinh học và xây dựng bộ luật riêng ở Việt Nam. Vào tháng 2/2002, nước ta là một trong 10 nước tham gia vào dự án: “Xây dựng năng lực an tồn sinh học cho các giống cây trồng biến đổi di truyền (GM) tại châu Á” do chính phủ Nhật Bản tài trợ chính thơng qua tổ chức Lương Nơng Liên Hiệp Quốc (FAO). Đồng thời, vào năm 2003, nước ta cũng đã chính thức tham gia vào Nghị định thư An tồn sinh học Cartagena. Từ năm 1999, nước ta cũng đã bắt đầu xây dựng quy chế nhằm kiểm sốt, quản lý cây trồng biến đổi gen. Tuy nhiên, đến năm 2004, quy chế này vẫn chưa hồn thành. Bên cạnh đĩ, nhằm phục vụ cho nhu cầu kiểm tra các sản phẩm biến đổi gen sản xuất và xuất khẩu, một số trung tâm nghiên cứu cũng đã trang bị các loại máy mĩc hiện đại (Real-time PCR) phục vụ cho việc định lượng GMO, như: Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3 (Quatest3), Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm (số 2, Nguyễn Văn Thủ), ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh, ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. Điều này cho thấy nhu cầu phát hiện và định lượng GMO đã xuất hiện ở nước ta xuất phát từ yêu cầu khắt khe của các đối tác nước ngồi trong việc nhập khẩu nơng sản Việt Nam sản xuất. Tình hình đĩ địi hỏi việc tập trung nghiên cứu và phát triển các phương pháp xét nghiệm theo tiêu chuẩn quốc tế. Vì vậy, Khĩa luận tốt nghiệp này xuất phát từ yêu cầu đĩ [2][5][6]. 8. Các phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm chuyển gen Việc xác định mức ngưỡng cho các sản phẩm biến đổi gen đặt ra yêu cầu xây dựng các phương pháp định lượng thật chính xác làm cơ sở cho việc dán nhãn các sản phẩm này. Hiện nay, các phương pháp này được chia thành 2 nhĩm sau: Nhĩm 1: Phương pháp dựa trên việc khuếch đại nucleotide (PCR-based method) - Quantitative competitive PCR (QC-PCR) - Real-time PCR Nhĩm 2: Phương pháp dựa trên protein (Protein-based method) - Kĩ thuật ELISA 23 Phƣơng pháp ELISA Kỹ thuật này sử dụng một kháng thể để phát hiện các protein mục tiêu. Protein được liên kết chặt chẽ với một tấm plastic. Kháng nguyên liên kết với kháng thể và tạo thành một phức hợp ổn định, cĩ thể được hình dung là liên kết với một kháng thể thứ hai với một enzyme. Thuận lợi của phương pháp này là cĩ khả năng phân tích dựa vào đường chuẩn [24]. Quantitative competitive PCR (QC-PCR) [42] Đây là kỹ thuật căn bản dựa trên sự đồng khuếch đại gen mục tiêu và một mẫu thứ hai – tác nhân cạnh tranh. Sản phẩm khuếch đại sẽ cĩ cường độ phát quang tương ứng với số lượng DNA được khuếch đại và chúng sẽ xuất hiện hai dãy khác nhau trên gel agarose với cường độ khác nhau. Vì thế, các dãy thu được cĩ thể xác định được số lượng ban đầu của DNA mục tiêu. Phương pháp này cĩ khả năng phát hiện một cách đơn giản và bán định lượng được sản phẩm biến đổi gen trong thực phẩm [42]. Hình 2.12 : QC-PCR Tuy vậy, hai phương pháp này đều cĩ ưu khuyết điểm riêng. Kỹ thuật ELISA cĩ thể cho phép định lượng sự hiện diện sản phẩm biến đổi gen với tỷ lệ từ 0,3% đến 5%, tuy nhiên khuyết điểm lớn nhất của nĩ là kĩ thuật này chỉ áp dụng được cho các mẫu sản phẩm thơ, chưa chế biến do protein cĩ thể bị biến tính ở nhiệt độ cao. Nghiên cứu cho thấy kĩ thuật này chỉ cĩ hiệu quả khi mẫu sản phẩm chế biến ở nhiệt độ nhỏ hơn 65oC trong thời gian dưới 60 phút, đây là giới hạn giữ cho protein khơng bị biến tính. Tuy nhiên, đối tượng chính của việc định lượng lại là các sản phẩm thực phẩm và thức ăn đã chế biến. Hầu hết chúng đều trải qua quá trình chế biến với nhiệt độ cao trong thời gian khá dài (đặc biệt là các sản phẩm tinh luyện) nhằm diệt khuẩn và giữ chất lượng sản phẩm. Chính điều này đã hạn chế khá lớn phạm vi áp dụng của kĩ thuật ELISA. Đồng thời, các nghiên cứu cho thấy DNA cĩ độ bền vững cao, cĩ thể tồn tại 24 qua quá trình chế biến khắc nghiệt, giúp cho việc định lượng chúng. Trong các kĩ thuật định lượng bằng PCR, kĩ thuật QC-PCR xuất hiện từ sớm, tuy nhiên chúng mang nhiều khuyết điểm như độ chính xác khơng cao, khĩ khăn trong thiết kế. Trong khi đĩ, kĩ thuật Real-time PCR với các ưu điểm là độ chính xác cao, cĩ thể xác định sự hiện diện GMO trong thực phẩm ở tỷ lệ thấp, đồng thời kĩ thuật này được tiến hành khá đơn giản, trong thời gian ngắn. Những ưu điểm này giúp Real-time PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi trên thế giới [42]. Nguyên tắc kĩ thuật Real-time PCR Real-Time PCR được xem là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu thí nghiệm. Khác với việc định lượng khi quá trình khuếch đại đã hồn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm sốt và định lượng số lượng DNA ngay khi phản ứng đang xảy ra (đây là ý nghĩa của từ ”Real- Time”). Trong kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu huỳnh quang nhất định. Nĩi cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỷ lệ thuận với mỗi chu kỳ khuếch đại thành cơng của phản ứng Real-Time PCR. Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu kỳ, ta cĩ thể kiểm sốt phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của chúng. Và sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA ban đầu của mẫu. Hiệu quả của kỹ thuật Real-Time PCR dựa trên cả hĩa chất dùng để định lượng và kiểm sốt phản ứng khuếch đại và cơng cụ để phát hiện các tín hiệu huỳnh quang [42]. Hĩa chất định lƣợng Cĩ nhiều loại hĩa chất được sử dụng trong phản ứng Real-Time PCR cho việc định lượng DNA. Chúng cĩ thể chia thành 2 loại chính: - Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I. - Mẫu dị lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons, Scorpions và Taqman Minor Groove Binder. 25 SYBR Green I Hình 2.13: Thuốc nhuộm SYBR Green I [43][45] Thuốc nhuộm SYBR Green I gắn với DNA mạch đơi, mà khơng gắn với DNA mạch đơn. Kết quả là tín hiệu huỳnh quang (bước sĩng kích thích khoảng 488 nm và 254 nm; bước sĩng phát quang 560 nm) được gia tăng rất nhiều (khoảng 800 đến 1000 lần). Khi phản ứng PCR bắt đầu, sự gia tăng số lượng trình tự DNA mới được tổng hợp sẽ làm tăng lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra. Một điểm hạn chế của việc định lượng bằng SYBR Green I là hĩa chất này liên kết khơng đặc hiệu với DNA mạch đơi. Vì vậy, mọi trình tự DNA mạch đơi trong phản ứng đều được định lượng, cho dù đĩ là sản phẩm PCR khơng đặc hiệu hay primer-dimer. Để giải quyết vấn đề này, việc phân tích một đường cong nhiệt độ nĩng chảy cần được thực hiện. Khi chu kỳ cuối kết thúc, sản phẩm khuếch đại được nung biến tính thành mạch đơn từ từ và tín hiệu huỳnh quang được thu nhận. Do mỗi chuỗi DNA mạch đơi đều cĩ một nhiệt độ nĩng chảy khác nhau, ta cĩ thể xác định các thành phần cĩ nhiệt độ nĩng chảy khác nhau trong phản ứng và do đĩ, cĩ thể loại bỏ các kết quả khơng đặc hiệu khi định lượng [42]. Mẫu dị phân hủy (Taqman probe) Vấn đề về sự đặc hiệu của phản ứng định lượng đã được giải quyết bằng cách sử dụng các mẫu dị cĩ trình tự đặc hiệu gắn với chất phát quang được thiết kế bên trong cặp mồi của phản ứng PCR. Quá trình liên kết và phân hủy của các mẫu dị này 26 thường khơng gây trở ngại cho việc khuếch đại DNA. Cĩ nhiều cách khác nhau, tuy nhiên ta sẽ tìm hiểu một phương pháp khá đơn giản. Đĩ là mẫu dị Taqman. Hình 2.14: Cơ chế hoạt động của mẫu dị Taqman [43] Phương pháp Taqman dựa trên khả năng 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase để cắt đứt một mẫu dị trong phản ứng PCR. Taqman thơng thường là một chuỗi oligonucleotide dài khoảng 20-30 base (thường nĩ cĩ nhiệt độ nĩng chảy cao hơn 10oC so với nhiệt độ nĩng chảy của mồi) cĩ gắn thuốc nhuộm phát huỳnh quang ở đầu 5‟ và một thuốc nhuộm hấp thu ở đầu 3‟. Do đầu 3‟ bị khĩa, mẫu dị khơng thể được kéo dài như một mồi. Trong phản ứng PCR, với sự hiện diện của gen đích, mẫu dị liên kết đặc hiệu ở giữa hai mồi xuơi và ngược. Khi mẫu dị cịn nguyên vẹn, thuốc nhuộm hấp thu ở gần thuốc nhuộm phát huỳnh quang làm cho tín hiệu huỳnh quang bị triệt tiêu chủ yếu do hiệu ứng chuyển năng lượng kiểu Forster. Khi phản ứng PCR xảy ra, hoạt động 5‟-3‟ exonuclease của Taq DNA Polymerase sẽ phá hủy trình tự mẫu dị khi và chỉ khi mẫu dị này liên kết với gen đích. Lúc này, thuốc nhuộm phát huỳnh quang sẽ cách xa thuốc nhuộm hấp thu và chúng sẽ phát quang. Vì vậy, lượng DNA được tích lũy sẽ được phát hiện qua sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang. Quá trình này xảy ra trong mỗi chu kỳ và khơng gây cản trở việc khuếch đại DNA. Trong phương pháp này, mẫu dị Taqman phĩng thích chất phát quang cộng thêm vào chất phát quang đã được phĩng thích trong các chu kỳ trước đĩ. Vì vậy lượng tín hiệu huỳnh quang gia tăng rất nhiều sau mỗi chu kỳ. Phương pháp này sử dụng các chương 27 trình nhiệt của một phản ứng PCR bình thường. Một yêu cầu đặc biệt đối với mẫu dị là nĩ khơng được cĩ base G ở đầu 5‟. Vì base G cĩ thể triệt tiêu thuốc nhuộm phát huỳnh quang ngay cả khi mẫu dị đã bị phá hủy [42]. Cơng cụ phát hiện Việc phát hiện sự gia tăng tín hiệu huỳnh quang để định lượng DNA địi hỏi các cơng cụ khá phức tạp. Cĩ nhiều cơng ty trên thế giới đã phát triển các loại phương pháp phục vụ cho việc này. Trong khĩa luận này, chúng tơi sẽ mơ tả sơ lược về nguyên lý và nguyên tắc hoạt động của máy My iQTM Single Color Real-Time PCR Detection System của cơng ty Bio-Rad. Đây là cơng cụ chính của khĩa luận này và nguyên tắc hoạt động của nĩ cũng tương đồng với khá nhiều hệ máy trên thế giới. Hình 2.15: Máy Real-Time PCR [8] Máy My iQTM bao gồm hai phần: - Máy luân nhiệt: Nằm phía dưới, cĩ tác dụng như một máy PCR bình thường, cĩ 96 giếng thí nghiệm. - Bộ phận quang học: Nằm phía trên, cơng dụng định lượng DNA. Bộ phận quang học của máy chứa hệ thống kích thích và hệ thống phát hiện. Hệ thống kích thích là một đèn halogen tungsten 50W, được làm mát bằng quạt; một bộ lọc nhiệt (kính hấp thụ tia hồng ngoại), một kính lọc ánh sáng kích thích cĩ màn chớp, và một hệ thống 2 tấm kính cho phép rọi sáng đồng thời bản chứa mẫu. Hệ thống kích thích được đặt ở gĩc phải phía trước của bộ phận quang học, với chiếc đèn chiếu sáng từ phải sang trái, vuơng gĩc với trục máy. Ánh sáng bắt nguồn từ chiếc đèn, qua bộ lọc nhiệt và kính lọc kích thích (nếu mở) và phản chiếu lên 96 giếng trong máy luân nhiệt 28 bằng một hệ thống các tấm kính. Ánh sáng này sẽ kích thích các phân tử huỳnh quang trong giếng [14]. Hình 2.16: Cấu tạo bộ phận quang học của máy Real-Time PCR [14] Hệ thống phát hiện chiếm 2 phần 3 phía sau bộ phận quang học. Các phần chính trong hệ thống phát hiện này bao gồm 1 kính lọc quang học đơn cho tín hiệu huỳnh quang phát ra và một đầu đọc CCD (charged coupled device). Đầu đọc này cĩ độ phân giải 350.000 pixel cho phép định lượng riêng biệt tín hiệu huỳnh quang ở mỗi giếng. Ánh sáng huỳnh quang phát ra từ giếng thí nghiệm sẽ đi qua tấm kính lọc và được phát hiện bằng đầu đọc CCD [14]. Nguyên tắc định lƣợng bằng kĩ thuật Real-time PCR Quan hệ định lƣợng Hàm lượng GMO trong một mẫu thực phẩm được biểu diễn bằng lượng thành phần biến đổi gen trong tổng lượng thành phần. Để xác định giá trị này, ta cần đo lường số lượng trình tự một gen đối chiếu cũng như số lượng trình tự đặc trưng cho GMO. Gen đối chiếu được lựa chọn phải: - Đặc trưng cho lồi - Hiện diện với số lượng một copy trong bộ gen đơn bội - Hiện diện ổn định trong các giống khác nhau của cùng một lồi 29 - Nĩ cĩ thể được khuếch đại trong phản ứng tương đương với tính trạng biến đổi gen (mặc dù điều này phụ thuộc nhiều vào việc thiết kế primer và probe). Một vấn đề nữa trong việc định lượng mà ta cần chú ý. Đĩ là, hàm lượng GMO (phần trăm) cĩ thể được hiểu là trọng lượng của thành phần biến đổi gen trên tổng trọng lượng thành phần đĩ (ví dụ: trọng lượng bắp biến đổi gen trên tổng trọng lượng bắp trong mẫu thí nghiệm). Vì vậy, ta cĩ thể tính tốn phần trăm GMO bằng số lượng trình tự DNA biến đổi gen trên số lượng trình tự gen đối chiếu. Tuy nhiên, cây trồng biến đổi gen cĩ một số khác biệt quan trọng, đĩ là: - Mức độ bội thể của giống: Cĩ khả năng các giống cây trồng biến đổi gen cĩ độ bội thể khác với giống thơng thường (ví dụ: tứ bội thay vì đơn bội) - Mức độ dị hợp của giống: Tính trạng biến đổi gen cĩ thể là đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. - Số lượng bản sao gen đơn bội của một cấu trúc nhân tạo. Gen cĩ thể được chèn thành một bản sao trên bộ gen đơn bội hay thành nhiều bản sao. Vấn đề 3 cĩ thể khắc phục bằng cách thiết kế hệ thống primer và probe trên đường biên giữa gen chuyển nạp và trình tự bộ gen. Trình tự đường biên độc nhất giúp ta cĩ hai lợi thế, đĩ là phản ứng đặc hiệu và loại trừ việc chèn nhiều bản sao của cùng một cấu trúc cĩ thể gây sai lệch kết quả định lượng. Vấn đề 1 và 2 cĩ thể khắc phục dựa trên kinh nghiệm sử dụng những vật liệu đối chiếu tương đồng với mẫu thí nghiệm (ví dụ: sử dụng mẫu đối chiếu là bột bắp để định lượng bột bắp). Mặc khác, việc định lượng những mẫu chuẩn (trình tự DNA dịng hĩa, hỗn hợp DNA ) khác các mẫu đối chiếu được cấp phép cĩ thể giúp chỉnh lý những điểm khơng nhất quán trong định lượng. Một cách khác được chấp nhận rộng rãi để giải quyết vấn đề 1 và 2 đĩ là biểu thị phần trăm GMO trên bộ gen đơn bội [42]. Thiết kế thí nghiệm Một thí nghiệm Real-time PCR được thiết kế như sau: - Một phản ứng PCR dùng phát hiện và định lượng gen đích (trình tự DNA đặc trưng cho GMO). 30 - Phản ứng PCR thứ hai được thiết kế để phát hiện và định lượng trình tự một gen đối chiếu, đặc trưng cho lồi và thường sử dụng cho định lượng GMO. - Đường chuẩn cho gen đích và gen đối chiếu. Trong mỗi thí nghiệm, lượng gen đích và gen đối chiếu được xác định từ đường chuẩn này. Sau đĩ, lượng gen đích được chia cho lượng gen đối chiếu để xác định phần trăm hiện diện của GMO trong mẫu. Để đạt yêu cầu thống kê, đường chuẩn phải cĩ từ 3 - 4 nồng độ khác nhau. Hình 2.17: Đƣờng chuẩn cho phản ứng định lƣợng [14] Thêm vào đĩ, một đối chứng âm (NTC - no template control) cần được thêm vào trong mỗi thí nghiệm. Những đối chứng khác cũng cĩ thể được sử dụng. Cuối cùng, thí nghiệm định lượng gen đối chiếu và gen đích phải được thực hiện trong cùng một lần chạy phản ứng PCR, điều này nhằm tránh những sai lệch thống kê giữa các thí nghiệm [42]. Phân tích dữ liệu Real-time PCR Khi phản ứng Real-time PCR hoạt động, tín hiệu huỳnh quang (Rn value) được thu nhận để tạo ra một đồ thị các tín hiệu tương ứng với số chu kỳ (trong cùng thời gian). Thơng thường, đồ thị này cĩ dạng bán-logarit, gồm 3 giai đoạn: Đầu tiên là pha “lag” với những dao động nhỏ tương ứng với tín hiệu nền, giai đoạn hai là hàm mũ với các đường biểu đồ song song, cuối cùng là giai đoạn bão hịa . Khả năng của phản ứng Real-time PCR là nĩ cho phép định lượng ngay trong giai đoạn DNA khuếch đại gia tăng theo hàm mũ, mà khơng ở giai đoạn cuối cùng khi lượng DNA bão hịa. Điều này nâng cao độ chính xác của việc định lượng do cĩ sự 31 tương quan trực tiếp giữa lượng DNA ban đầu và giai đoạn mà tại đĩ tồn bộ DNA được nhân đơi sau mỗi chu kỳ. Hình 2.18: Đồ thị phản ứng Real-time PCR [14] Trong phản ứng Real-time PCR, chu kỳ ngưỡng (threshold cycle, CT) được định nghĩa là chu kỳ mà tại đĩ tín hiệu huỳnh quang cĩ giá trị cao hơn đáng kể so với tín hiệu nền nhưng vẫn nằm trong giai đoạn log tuyến tính. Thơng thường đĩ là giá trị trung bình của các tín hiệu huỳnh quang từ chu kỳ 3 đến 15 cộng với 10 độ lệch chuẩn. Lượng DNA ban đầu càng nhiều thì lượng DNA khuếch đại được phát hiện càng sớm và giá trị CT càng thấp. Do vậy, CT được sử dụng làm cơng cụ để tính tốn lượng DNA ban đầu trong mỗi phản ứng. Chu kỳ ngưỡng này cần được thiết lập phía trên đường tín hiệu nền và nằm trong pha tăng trưởng hàm mũ, tại nơi mà đồ thị khuếch đại giống nhau nhất. Thơng thường, với hệ máy của cơng ty Bio-Rad, giá trị chu kỳ ngưỡng do máy tự động thiết lập, đều này giúp ta tránh những sai sĩt chủ quan cĩ thể xảy ra khi ta tự thiết lập chu kỳ. Tuy nhiên, máy vẫn cho phép ta cĩ thể thiết lập chu kỳ ngưỡng trong những trường hợp đặc biệt [42]. Tính tốn hàm lƣợng GMO Kết quả của phản ứng Real-time PCR là giá trị ΔRn, biểu thị sự khác biệt giữa giá trị Rn+ (tín hiệu huỳnh quang của tất cả các mẫu) và Rn- (tín hiệu nền của phản ứng - tín hiệu huỳnh quang ban đầu hay tín hiệu của đối chứng âm). 32 Hàm lượng GMO của một mẫu cĩ thể được tính bằng phương pháp dựng đường chuẩn dựa trên các nồng độ khác nhau của DNA - Đường thứ nhất dùng để định lượng gen đối chiếu - Đường thứ hai dùng định lượng trình tự mục tiêu của GMO Ở mỗi mẫu thí nghiệm, hàm lượng gen đối chiếu và gen mục tiêu được xác định bằng cách nội suy trên đường cong chuẩn. Từ đĩ, tỷ lệ hiện diện của GMO (phần trăm) sẽ được tính bằng thương số của lượng gen GMO trên lượng gen đối chiếu. Tuy nhiên, một điều cần chú ý là giá trị mẫu thí nghiệm cần phải nằm trong giá trị cao nhất và thấp nhất của cả hai đường cong chuẩn. Các giá trị nằm ngồi cĩ thể là kết quả định lượng sai [42]. Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lƣợng cây trồng biến đổi gen [9][44] Dựa vào cấu trúc cơ bản của các gen chuyển vào thực vật, người ta chia thành các mức độ chuyên biệt để phát hiện và định lượng cây trồng biến đổi gen như sau: - Phương pháp đại trà (Screening): Phương pháp này phát hiện các đoạn trình tự promoter hoặc terminator đặc biệt chỉ cĩ ở cây đã được chuyển gen. Hai đối tượng chính của phương pháp này là promoter CAMV 35S và terminator nos do chúng hiện diện trong phần lớn cây trồng biến đổi gen trên thế giới.Tuy nhiên, khuyết điểm của chúng là các promoter va terminator mà ta phát hiện và định lượng cĩ thể bắt nguồn từ virus hay vi khuẩn hiện diện trong các loại ngũ cốc tự nhiên hay tại khu vực trồng trọt. Vì vậy, chúng cĩ thể gây ra hiện tượng dương tính sai khi phát hiện và định lượng chúng. Mặc khác, một khuyết điểm nữa là phương pháp này chỉ cĩ thể định lượng tổng thành phần chuyển gen trong một mẫu thực phẩm hỗn hợp mà khơng thể chỉ ra chính xác thành phần nguyên liệu nào đã được biến đổi gen. - Phương pháp chuyên biệt gen (gene specific): đối tượng của phương pháp này là đoạn trình tự nằm trong gen mục tiêu, đĩ là gen chuyển nạp vào thực vật. điều này cĩ nghĩa là, khi phát hiện được đoạn gen này thì chắc chắn đĩ là cây chuyển gen, ví dụ như khuếch đại một đoạn gen Cry IA(b). Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này là nĩ chỉ cho phép xác định một 33 nhĩm sản phẩm biến đổi gen mà khơng cho phép ta xác định chính xác đĩ là sản phẩm nào. Một ví dụ là: Nếu ta phát hiện cĩ trình tự gen Cry IA (b) trong mẫu hỗn hợp bắp và đậu nành đã chuyển gen Bt thì ta cũng khơng thể xác định chính xác thành phần nào đã được chuyển gen và tỷ lệ chuyển gen là bao nhiêu phần trăm. . - Phương pháp chuyên biệt xây dựng (construct specific): đối tượng củ phương pháp này là đoạn trình tự nằm giữa vùng promoter với vùng enhancer, vùng enhancer với vùng gen mục tiêu hay giữa vùng gen mục tiêu với vùng terminator. So với hai phương pháp trên, phương pháp này cĩ thể cho ta biết chính xác hơn thành phần nào đã được chuyển gen do chúng cĩ thể cĩ sự kết hợp khác nhau giữa các trình tự nĩi trên. Tuy nhiên, trong tương lai, nếu một cấu trúc gen chuyển nạp (gồm: promoter, enhancer, gen và terminator) được sử dụng cho nhiều đối tượng khác nhau thì phương pháp này cũng khơng cịn chính xác nữa. - Phương pháp chuyên biệt sự kiện chuyển gen (event specific). Đối tượng của phương pháp này là đoạn trình tự giữa vùng promoter và vúng gen thực vật hay giữa vùng terminator với vùng gen thực vật. Do đoạn trình tự này là độc nhất cho mỗi sự kiện chuyển gen, chúng khơng chỉ cho phép ta xác định chính xác thành phần nào đã được biến đổi gen trong mẫu hỗn hợp mà cịn chính xác trong từng sự kiện chuyển gen khi một cấu trúc được chuyển nạp nhiều lần vào trong cùng một đối tượng. tuy nhiên, phương pháp này vẫn cịn trong giai đoạn phát triển và chưa được ứng dụng rộng rãi. Trong phạm vi khĩa luận này, chúng tơi sử dụng phương pháp đại trà để định lượng promoter 35S trong mẫu bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp. Hạn chế của phương pháp này là tính chuyên biệt và chính xác khơng cao bằng 3 phương pháp cịn lại. 34 Hình 2.19: Mức độ chuyên biệt trong phát hiện và định lƣợng GMO [44] Một số cơng trình nghiên cứu về phát hiện và định lƣợng GMO dựa trên promoter 35S Phát hiện và sàng lọc GMO dựa trên promoter 35S - Trong nước: Vương Nguyễn Phương Lâm, 2003. Xây dựng phương pháp chuẩn đốn đậu nành chuyển gen và nghiên cứu hiện trạng các sản phẩm đậu nành chuyển gen nhập khẩu vào Việt Nam. Luận văn tốt nghiệp khoa Nơng học, Trường ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. Hồ Bích Liên, 2003. Xây dựng phương pháp chuẩn đốn bắp chuyển gen và nghiên cứu hiện trạng các sản phẩm bắp chuyển gen nhập khẩu vào Việt Nam. Luận văn tốt nghiệp khoa Nơng học, Trường ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. Trương Minh Mẫn, 2005. Bước đầu thiết lập quy trình phát hiện sản phẩm cĩ nguồn gốc từ cây trồng biến đổi gen dựa vào promoter 35S và terminator nos. Luận văn tốt nghiệp khoa Cơng Nghệ Sinh Học, Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh. Nguyễn Hồng Minh Ngọc, 2004. Hồn thiện phương pháp chuẩn đốn nơng sản chuyển gen dựa trên kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp khoa Nơng học, Trường ĐH Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh. 35 - Ngồi nước: Brunnert Hans-Josef , Spener Friedrich and Bưrchers Torsten, 2001 . PCR- ELISA for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified Roundup Ready soybeans. Eur Food Res Technol (2001) 213:366–371. Fukuta Shiro, Mizukami Yuko , et al., 2004. Real-time loop-mediated isothermal amplification for the CaMV-35S promoter as a screening method for genetically modified organisms. Eur Food Res Technol (2004) 218:496–500. Định lƣợng GMO đựa trên promoter 35S M. Hardegger 7 P. Brodmann 7 A. Herrmann, 1999. Quantitative detection of the 35S promoter and the NOS terminator using quantitative competitive PCR. Eur Food Res Technol (1999) 209 :83–87. 36 36 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 1. Nội dung nghiên cứu Trong phạm vi khĩa luận này, các nội dung nghiên cứu của chúng tơi bao gồm các mục sau: - Xác định quy trình ly trích tốt nhất trong điều kiện thí nghiệm cho mẫu bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp. - So sánh phương pháp sàng lọc sản phẩm biến đổi gen bằng Real-Time PCR với phương pháp PCR truyền thống. - Xác định phương pháp định lượng bằng kĩ thuật Real-Time PCR với hĩa chất là thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dị Taqman. - Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp Real-Time PCR. - Định lượng promoter 35S trên một số sản phẩm bắp và thực phẩm cĩ chứa bắp hiện diện trên thị trường. Các vấn đề nghiên cứu này sẽ giúp chúng tơi xây dựng được một quy trình định lượng bắp biến đổi gen dựa trên trình tự promoter 35S và mở rộng sang các đối tượng khác. 2. Điều kiện tiến hành thí nghiệm Địa điểm thực hiện thí nghiệm Các thí nghiệm được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Phân tử (Lab B), Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện Thời gian thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3. Tiến trình thí nghiệm: Trong khĩa luận này, các thí nghiệm được tiến hành theo tiến trình như sau: 37 37 4. Vật liệu thí nghiệm Vật liệu thí nghiệm trong khĩa luận này được chọn như sau: - Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 với hàm lượng thành phần chuyển gen là 1% cấp bởi GeneScan. - Đối chứng âm: nước siêu sạch. Các mẫu thí nghiệm được chọn lọc và mua ngẫu nhiên trên thị trường Tp Hồ Chí Minh và Đồng Nai: Phƣơng pháp 1: Định lượng bằng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Kiểm tra sự hiện diện của promoter 35S Phƣơng pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA Phƣơng pháp 1: PCR truyền thống Quy trình ly trích đề nghị Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO Thử nghiệm các phương pháp định lượng Kết luận Phương pháp định lượng đề nghị Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng định lƣợng Các chỉ tiêu định lượng Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng khảo sát một số mẫu thị trƣờng Phương pháp sàng lọc đề nghị Phƣơng pháp 2: Định lượng bằng Real-Time PCR với mẫu dị Taqman 38 38 Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm STT Tên và đặc điểm của mẫu Kí hiệu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Bắp giống 1 Bắp giống 2 Bắp giống 3 Bắp giống 4 Bắp giống 5 Bắp trái ăn tươi Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc Bánh bắp Thức ăn gia súc 1 Thức ăn gia súc 2 Bột ngũ cốc dinh dưỡng 1 Bột ngũ cốc dinh dưỡng 2 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 5. Thí nghiệm 1: Khảo sát các quy trình ly trích DNA Mục tiêu Thơng qua việc so sánh các bước thực hiện, hĩa chất sử dụng để xác định một quy trình ly trích DNA tốt nhất phục vụ cho các thí nghiệm sau. Vật liệu Hạt bắp giống (B1). Phƣơng pháp thực hiện Dựa vào các tài liệu trong và ngồi nước chúng tơi tiến hành khảo sát 3 quy trình ly trích DNA như sau: - Qui trình 1: Tách chiết DNA bằng phương pháp đơn giản [36]. - Qui trình 2: Tách chiết DNA bằng phương pháp CTAB [38]. 39 39 - Qui trình 3: Phương pháp biến đổi. Bảng 3.2: Các quy trình ly trích Quy trình Bƣớc 1 2 3 1. Phá vỡ màng tế bào, màng nhân. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 1,2 ml đệm trích 1. - Ủ 45 phút ở 65oC. - Ly tâm 5000 vịng/phút trong 30 phút, thu dịch nổi. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 300 µl nước cất và 500 µl đệm trích CTAB 2%. - Ủ 45 phút ở 65oC. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Đồng nhất mẫu. - Bổ sung 1,2 ml đệm trích CTAB 2%. - Ủ 45 phút ở 65oC. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. 2. Loại bỏ thành phần khơng mong muốn. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol, đảo nhẹ. - Ly tâm 5000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 5000 vịng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 500 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 500 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 1 lần thể tích phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. 3.Tủa DNA - Bổ sung 0,1 lần thể tích dung dịch potassium acetate 3M và 2,5 lần thể tích ethanol tuyệt đối. - Bổ sung 2 lần dung dịch CTAB tủa. - Ủ 60 phút ở nhiệt độ phịng. - Ly tâm16000 - Bổ sung 2 lần dung dịch CTAB tủa. - Ủ 60 phút ở nhiệt độ phịng. - Ly tâm 16000 40 40 - Ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 o C. - Ly tâm 10000 vịng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC, thu tủa. vịng/phút trong 10 phút, thu tủa. - Hịa tủa trong 350 µl NaCl 1,2M. - Bổ sung 350 µl chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu tủa. - Bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol. - Ủ 30 phút hay qua đêm ở - 20oC. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu tủa. vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Hịa tan tủa trong 350 µl NaCl 1,2M. - Bổ sung 350 µl phenol/chloroform, đảo nhẹ. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi. - Bổ sung 0,6 lần thể tích isopropanol. - Ủ 30 phút hay qua đêm ở - 20oC. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 10 phút ở 4oC, thu tủa. 4.Rửa DNA - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 10000 vịng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC, thu tủa. - Để khơ DNA. - Hịa tan tủa bằng 100 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37oC. - Bảo quản DNA ở -20 o C - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC, thu tủa. - Để khơ DNA. - Hịa tan tủa bằng 30 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37oC - Bảo quản DNA ở -20 o C - Bổ sung 500 µl dung dịch ethanol 70%. - Ly tâm 16000 vịng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ 4oC, thu tủa. - Để khơ DNA. - Hịa tan bằng 30 µl nước cất siêu sạch. - Bổ sung 2 µl RNase, ủ 1 giờ ở 37oC - Bảo quản DNA ở -20 o C 41 41 Phƣơng pháp phân tích sản phẩm DNA ly trích DNA thu được từ quy trình ly trích được phân tích dựa trên các chỉ tiêu: - Độ tinh sạch của DNA: Đo độ hấp thu ánh sáng của mẫu ở bước sĩng 260 nm (OD260nm) và 280 nm (OD280nm). Tính tỷ lệ OD260nm /OD280nm để xác định độ tinh sạch của mẫu. DNA thu được tinh sạch khi tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. - Lượng DNA: Từ chỉ số OD260nm của các mẫu tinh sạch cĩ thể suy ra nồng độ DNA trong mẫu theo tương quan: 1 đơn vị OD260nm tƣơng ứng với nồng độ 50 ng/µl DNA mạch đơi trong dung dịch - Độ nguyên vẹn của mẫu DNA: Điện di sản phẩm ly trích trên gel agarose và so sánh các kết quả trên bảng điện di. Mẫu DNA cĩ độ nguyên vẹn cao khi bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn. Kết quả thí nghiệm là chúng tơi xác định được một quy trình ly trích tốt nhất phục vụ cho ly trích DNA các mẫu thí nghiệm. 6. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu Phát hiện được mẫu sản phẩm biến đổi gen thơng qua promoter 35S (123 bp) bằng 2 phương pháp: PCR thơng thường (đang được sử dụng) và phương pháp Real- Time PCR (đề nghị). Đánh giá khả năng sử dụng phương pháp Real-Time PCR ở giai đoạn sàng lọc mẫu so với phương pháp thơng thường. Nguyên tắc Vùng promoter 35S được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3/cr4 [33] . Sau đĩ, sản phẩm khuếch đại sẽ được phát hiện và phân tích. Sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S sẽ cĩ đặc điểm như sau [33]: - Kích thước: 123 bp - Nhiệt độ nĩng chảy: 86,5oC Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp: - Phương pháp 1: PCR truyền thống (đang được sử dụng rộng rãi). Sản phẩm được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose. 42 42 - Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (đề nghị). Sản phẩm được kiểm tra bằng phân tích Melt curve. Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Cơng ty Proligo) [31] p35S-cf3 p35S-cr4 Trình tự 3‟ - CCACGTCTTCAAAGCA AGTGG - 5‟ 3‟ - TCCTCTCCAAATGAAAT GAACTTCC - 5‟ Chiều dài 21 25 Trọng lượng phân tử (g/mol) 6414,5 7544,2 Nhiệt độ nĩng chảy (G/C) 57,4 56,3 Vật liệu thí nghiệm - Đối chứng dương: Bắp chuyển gen Bt 176 1% cấp bởi GeneScan (Đức) - Đối chứng âm: Nước cất siêu sạch - Các mẫu cĩ kết quả ly trích DNA đạt chất lượng tốt bằng quy trình ly trích đề nghị ở thí nghiệm 1. Trang thiết bị Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 - Máy luân nhiệt TECHNE TC-312. - Bộ điện di - Máy chiếu tia UV - Hệ thống Real-Time PCR iCycler MyiQTM (Bio-Rad) - Máy vi tính - Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad) 43 43 Phƣơng pháp thực hiện Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 Thành phần Nồng độ cuối Thành phần Nồng độ cuối - PCR buffer 10X - MgCl2 50 mM - dNTPs 2mM - Mồi xuơi - Mồi ngược - Taq polymerase 5U/µl - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 2 mM 0,2 mM 0,5 µM 0,5 µM 1,0 U 10 - 50 ng - SYBR Green Supermix Sample 2X - Mồi xuơi - Mồi ngược - DNA mẫu - Nước cất siêu sạch 1X 0,5 µM 0,5 µM 10 - 50 ng Tổng thể tích 25 μl Tổng thể tích 25 μl Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian Biến tính ban đầu 95oC 3 phút Biến tính Bắt cặp Kéo dài Số chu kỳ 95 o C 62 o C 72 o C 50 25 giây 30 giây 45 giây Kéo dài cuối cùng 72 o C 4 o C 7 phút 44 44 Phát hiện sản phẩm khuếch đại Bảng 3.7: Phƣơng pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 Phƣơng pháp 1 Phƣơng pháp 2 Điện di trên gel agarose 2% với thang 100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad) Nguyên tắc: Khác biệt kích thước sản phẩm khuếch đại Phân tích Melt curve Nguyên tắc: Khác biệt nhiệt độ nĩng chảy sản phẩm khuếch đại Phương pháp 1: Điện di trên gel agarose - Chuẩn bị gel agarose 2%. - Bơm sản phẩm PCR vào giếng với đối chứng dương, âm và thang 100 bp Molecular Ruler. - Điện di 100V trong 25 phút. - Ngâm bản gel trong dung dịch TAE 1X cĩ chứa ethidium bromide (nồng độ 0,01 mg/ml) trong 15 phút. - Soi dưới đèn UV và đọc kết quả bằng mắt thường. Phương pháp 2: Phân tích Melt curve Bước này được thiết lập trên máy vi tính cùng với chương trình chạy PCR và tự động thực hiện ngay sau khi phản ứng khuếch đại DNA hồn tất. Sản phẩm khuếch đại được nung biến tính từ từ. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận sẽ được máy tính phân tích. Chương trình nhiệt được thiết lập như sau: Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt phân tích Melt curve Nhiệt độ ban đầu Nhiệt độ cuối Nhiệt độ tăng mỗi chu kỳ Thời gian mỗi chu kỳ Số chu kỳ 55 o C 95 o C 0,5 o C 10 giây 80 45 45 Phân tích kết quả Phương pháp 1 : Điện di trên gel agarose Sản phẩm được so sánh với thang chuẩn và các mẫu đối chứng dương, đối chứng âm nhằm xác định chính xác vạch khuếch đại đặc hiệu của vùng promoter 35S (123bp). Phương pháp 2: Phân tích Melt curve - Kết quả thí nghiệm được hiển thị ở mục Data Analysis. - Phân tích kết quả trên màn hình DNA Quantification (2 chế độ Normal View, Log View). - Mục Melt Curve: Phân tích nhiệt độ nĩng chảy của sản phẩm PCR , các chỉ tiêu phân tích gồm cĩ: Phân tích các đỉnh nhiệt độ nĩng chảy trên biểu đồ –dF/dT so với nhiệt độ (-dF/dT vs Temperature) Xác định sự hiện diện của đỉnh nhiệt độ nĩng chảy ở 86,5oC tương ứng với đoạn khuếch đại đặc hiệu vùng promoter 35S. Hình 3.1: Màn hình Melt Curve Kết quả thí nghiệm 2 giúp chúng tơi so sánh hiệu quả của 2 phương pháp sáng lọc sản phẩm biến đổi gen hiện nay, đĩ là phương pháp PCR truyền thống và phương pháp Real-Time PCR và đề nghị một phương pháp cho quy trình sàng lọc các sản phẩm biến đổi gen.. 46 46 7. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen Mục tiêu So sánh phương pháp định lượng promoter 35S bằng kỹ thuật Real-time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I và với mẫu dị Taqman. Xác định độ chính xác của 2 phương pháp ở các lần lặp lại và nồng độ pha lỗng khác nhau. Xác định khả năng ứng dụng của 2 phương pháp này. Nguyên tắc Vùng promoter 35S của mẫu thí nghiệm được khuếch đại đặc hiệu. Tín hiệu huỳnh quang của mẫu (từ thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dị Taqman) sẽ được máy thu nhận và phân tích. Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp: - Phương pháp 1: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I và mồi đặc hiệu được sử dụng từ thí nghiệm 2 [31]. - Phương pháp 2: Real-Time PCR với mẫu dị Taqman và mồi đặc hiệu được tổng hợp thành bộ kit của cơng ty GeneScan. Vật liệu thí nghiệm - Đối chứng dương: bắp chuyển gen Bt 176 1% (GeneScan, Đức). - Đối chứng âm: Nước cất siêu