Khóa luận Bước đầu nghiên cứu sản xuất bột ca cao bằng phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT CACAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÓ BỔ SUNG VI SINH VẬT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: HOÀNG VĂN TIẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************* BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT CACAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÓ BỔ SUNG VI SINH VẬT Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG HOÀNG VĂN TIẾN Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠ Cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM và tất cả các Giảng Viên trong và ngoài Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt bốn năm học tại trường. Chân thành biết ơn thầy hướng dẫn đã tận tình giúp đỡ tôi hết mình trong những lúc gặp khó khăn khi làm luận văn. PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Chân thành nhớ ơn các thầy cô và anh chị tại Bô môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Bách Khoa TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong lúc tôi thực tập tại trường. Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của quí thầy cô và của các bạn. TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08/2005 HOÀNG VĂN TIẾN iii TÓM TẮT HOÀNG VĂN TIẾN, Đại học Nông lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT CA CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÓ BỔ SUNG VI SINH VẬT”. Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG. Trong thành phần hạt ca cao tươi, hàm lượng pectin và cellulose chiếm tỷ lệ cao (11% và 16%). Hai thành phần khó phân giải này làm cản trở chiết chất hòa tan của bột ca cao. Do đó, chúng tôi sử dụng phương pháp lên men bổ sung nấm mốc Asp. niger có khả năng sinh pectinase và cellulase cao để phân giải hai thành phần trên giúp làm tăng lượng chất hòa tan của bột ca cao. Những kết quả đạt được: ¾ Tuyển chọn được giống Asp. niger lấy từ phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa TP.HCM có khả năng sinh pectinase (650 đvht/g MT) và cellulase (2.3 UI/g MT) thích hợp sử dụng để lên men. ¾ Chế phẩm sinh học sử dụng lên men tối ưu có tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang là 1 : 3 ¾ Lượng chế phẩm sử dụng tối ưu là 1% khối lượng hạt lên men, độ ẩm khối lên men là 60 %, thời gian lên men 96 giờ ¾ Độ hòa tan của bột ca cao được lên men có bổ sung Asp. niger (4.3) cao hơn độ hòa tan của bột ca cao được lên men không bổ sung vi sinh vật (2.1). iv v MỤC LỤC TRANG Bìa....................................................................................................................................i Trang tựa........................................................................................................................ ii Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii Tóm tắt...........................................................................................................................iv Mục lục ...........................................................................................................................v Danh sách chữ viết tắt ................................................................................................ viii Danh sách các bảng .......................................................................................................ix Danh sách các hình.........................................................................................................x PHẦN 1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................1 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.............................................................................3 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CA CAO........................................................................3 2.1.1 Lịch sử .......................................................................................................3 2.1.2 Các đặc điểm của cây cacao......................................................................5 2.1.2.1 Thực vật học ....................................................................................................5 2.1.2.2 Đặc điểm hình thái...........................................................................................5 2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái ...........................................................................................6 2.1.2.4 Thành phần hóa học của trái ca cao.................................................................7 2.1.3 Tình hình trồng và sản xuất ca cao tại Việt Nam......................................7 2.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT CA CAO .....................................................10 2.2.1 Công nghệ ca cao thô ..............................................................................10 2.2.1.1 Ủ hạt ca cao ...................................................................................................10 2.2.1.2 Các phương pháp ủ hạt ca cao.......................................................................12 2.2.1.3 Phơi và sấy ca cao .........................................................................................13 2.2.2 Qui trình sản xuất bột cacao....................................................................14 2.2.2.1 Loại bỏ tạp chất .............................................................................................14 2.2.2.2 Xử lý nhiệt .....................................................................................................14 2.2.2.3 Rang...............................................................................................................14 2.2.2.4 Nghiền thô và phân ly....................................................................................16 2.2.2.5 Kiềm hoá .......................................................................................................17 2.2.2.6 Sấy bột kiềm ..................................................................................................18 2.2.2.7 Nghiền mảnh nhân.........................................................................................18 2.2.2.8 Ép...................................................................................................................18 2.2.2.9 Xay bánh dầu.................................................................................................18 2.2.2.10 Sàng ..............................................................................................................19 2.3 GIỚI THIỆU VỀ CELLULOSE, PECTIN, CELLULASE, PECTINASE.......19 2.3.1 Giới thiệu cellulose .................................................................................19 2.3.2 Giới thiệu enzyme cellulase ....................................................................20 2.3.3 Giới thiệu về pectin .................................................................................21 2.3.4 Giới thiệu enzyme pectinase ...................................................................22 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................25 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI........................................25 3.2 NGUYÊN LIỆU ................................................................................................25 3.2.1 Trái cacao ................................................................................................25 vi 3.2.2 Giống vi sinh vật .....................................................................................25 3.2.3 Nguyên liệu làm môi trường ...................................................................26 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT ....................................................26 3.3.1 Môi trường thạch malt.............................................................................26 3.3.2 Môi trường nhân giống............................................................................27 3.3.3 Chế phẩm sinh học ..................................................................................28 3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ..........................................................29 3.4.1 Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................29 3.4.2 Hóa chất cho phân tích ............................................................................30 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................31 3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm ............................................................31 3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên men ............31 3.5.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ: giống Asp. niger/bột mì rang của chế phẩm lên men đến độ hòa tan và cường độ màu .....................................................31 3.5.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme sử dụng để lên men đến độ hòa tan và cường độ màu..........................................................................31 3.5.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm của khối lên men đến độ hòa tan và cường độ màu ...........................................................................................................32 3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và cường độ màu ................................................................................................................32 3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật.32 3.5.2 Phương pháp vi sinh vật ..........................................................................32 3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống...........................................................32 3.5.2.2 Phương pháp nhân giống ...............................................................................33 3.5.3 Phương pháp hóa lý.................................................................................33 3.5.3.1 Xác định độ ẩm..............................................................................................33 3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung dịch ca cao ..33 3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu mạnh nhất .34 3.5.4 Phương pháp hóa sinh .............................................................................34 3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt cacao ...............34 3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger .......................39 3.5.5 Qui trình sản xuất bột ca cao trong phòng thí nghiệm ............................42 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................43 4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA HẠT CA CAO..............43 4.2 TUYỀN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO.........................................................................................44 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA GIỐNG VI SINH VẬT VỚI BỘT MÌ RANG ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO.........45 4.3.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan ......................................................................45 4.3.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu ................................................................46 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG ĐỂ LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO ...........47 4.4.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan ......................................................................48 4.4.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu ................................................................49 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHỐI LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO.........................................................50 4.5.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan ......................................................................50 4.5.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu. ...............................................................51 vii 4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO ........................................................................52 4.6.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan ......................................................................52 4.6.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu ................................................................53 4.7 SO SÁNH ĐỘ HÒA TAN VÀ CƯỜNG ĐỘ MÀU GIỮA BỘT CA CAO ĐƯỢC LÊN MEN CÓ VÀ KHÔNG BỔ SUNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN ............................................................................................54 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ.........................................................................56 5.1 KẾT LUẬN .......................................................................................................56 5.2 KIẾN NGHỊ.......................................................................................................56 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................57 Danh sách các chữ viết tắt ACDI: Agricultural Cooperative Development International VOCA: Volunteers in Overseas Cooperative Assistance USDA: United States Department of Agriculture USAID: United States Agency for International Development PSOM: Programme for Co-operation with Emerging Markets FAO: Food and Agriculture Organization viii ix Danh sách các bảng TRANG Bảng 2.1: Sản lượng ca cao trên thế giới trong các năm (đơn vị ngàn tấn) ....................4 Bảng 2.2: Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi..................7 Bảng 2.3: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam...................................................................9 Bảng 4.1: Các thành phần chủ yếu có trong hạt ca cao tươi .........................................43 Bảng 4.2:So sánh hoạt tính enzyme cellulase và pectinase do hai giống Asp. niger lấy từ trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Đại Học Bách Khoa tạo ra........44 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến độ hòa tan45 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến cường độ màu................................................................................................................46 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan............................48 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến cường độ màu......................49 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan ....................................50 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của khối lên men đến cường độ màu .........................................51 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan ........................................52 Bảng 4.10: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu................................53 Bảng 4.11: So sánh độ hòa tan và cường độ màu của hai mẫu ca cao có và không bổ sung vi sinh vật trong quá trình lên men.......................................................54 x Danh sách các hình TRANG Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose....................................................................................19 Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese .......21 Hình 2.3: Cấu trúc của axit polygalacturonic................................................................22 Hình 2.4: Sơ đồ phân cắt của enzym pectinesterase. ....................................................22 Hình 2.5: Sơ đồ phân cắt của enzym transeliminase.....................................................23 Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến độ hòa tan..............................45 Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến cường độ màu........................47 Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan ..........................48 Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm đến cường độ màu ..................................49 Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan...................................50 Đồ thị 4.6: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến cường độ màu ............................51 Đồ thị 4.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan.......................................52 Đồ thị 4.8: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu ................................53 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU Trên thế giới, cây ca cao (Theobroma cacao) và những sản phẩm từ nó đã có lịch sử lâu đời. Những sản phẩm từ cây ca cao luôn mang lại hiệu quả kinh tế cao. Sản phẩm chính của cây ca cao là hạt ca cao được sử dụng làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến và thực phẩm và là sản phẩm hoàn chỉnh hay bán hoàn chỉnh trong các ngành công nghiệp khác. Hiện nay, tại Việt Nam trong chiến lược phát triển cây công nghiệp của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, cây ca cao đang rất được chú trọng. Cây ca cao được khuyến khích trồng ở nhiều địa phương nhằm đạt mục tiêu 10000 ha vào năm 2010. Sản lượng ca cao trong tương lai sẽ rất lớn, nhưng hiện nay ở nước ta việc chế biến ca cao vẫn còn bằng phương pháp thủ công, hiệu quả không cao. Đưa đến tình trạng nhà nông nghiệp trồng ca cao và các nhà chế biến rất lo ngại về đầu ra của cây ca cao. Trong công nghệ chế biến ca cao, giai đoạn lên men là giai đoạn bắt buộc và quan trọng nhất. Giai đoạn này quyết định rất lớn chất lượng sau này của sản phẩm từ ca cao. Do đó, đề tài BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT CA CAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÓ BỔ SUNG VI SINH VẬT được tiến hành. Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi bước đầu quan tâm đến ảnh hưởng của việc bổ sung vi sinh vật trong quá trình lên men đến khả năng chiết chất hòa tan của bột ca cao. Mục đích của đề tài: 9 Nghiên cứu xác định những điều kiện tối ưu cho quá trình lên men hạt ca cao trong công nghệ chế biến bột ca cao 9 Nghiên cứu bổ sung vi sinh vật để tăng lượng chất hòa tan của bột ca cao 9 Xây dựng qui trình sản xuất bột ca cao ở qui mô phòng thí nghiệm Những nội dung cần nghiên cứu của đề tài: 9 Xác định thành phần của hạt ca cao 9 Tuyển trọn giống vi sinh vật thích hợp cho quá trình lên men 9 Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học cho quá trình lên men 2 9 Nghiên cứu những điều kiện tối ưu cho quá trình lên men hạt ca cao 9 So sánh lượng chiết chất hòa tan thu được giữa hai phương pháp truyền thống và phương pháp có bổ sung vi sinh vật 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CA CAO 2.1.1 Lịch sử Cây ca cao (Theobroma cacao L.) có nguồn gốc từ những khu rừng nhiệt đới Amazon, nhưng những giống hoang dại cũng được tìm thấy từ Mexico đến Peru. Người Mayas ở Yucatan và người Aztec ở Mexico đã trồng cây ca cao từ rất lâu trước khi chúng được đưa tới châu Âu. Những người Nam Mỹ cổ đại rất thích uống ca cao trộn với gia vị và bột ngô. Họ tin rằng ca cao là món ăn của thượng đế và chỉ có hoàng tộc mới được sử dụng. Từ “cacao” xuất phát từ tiếng Maya còn người Aztec gọi chúng là cacauatol nghĩa là nước ca cao. Đầu thế kỉ 16, người Tây Ban Nha xâm lược Mexico và sau đó đổi tên cacauatol thành chocolatol. Sau đó từ chocolatol được đổi thành chocolate vào khoảng cuối thế kỉ 16 và tên gọi đó được giữ đến bây giờ. Do đó từ “chocolate” có nghĩa nguyên thủy là “nước cacao” (Chiyoda, Sakado-shi, Saitama, 2003). Vào năm 1754, nhà sinh vật học người Thụy Điển Carl von Linné dùng tên “Theobroma” – món ăn của thượng đế - để chỉ loài cacao (Iwao Hachiya, 2003). Ngày nay, tất cả các cây cacao trồng đều xếp vào loài Theobroma. Do người Tây Ban Nha thích nước giải khát có vị ngọt, cho nên không bao lâu sau chocolate đã được tiêu thụ phổ biến tại Tây Ban Nha và từ đây cây cacao được mang vào trồng ở các thuộc địa của đế quốc Tây Ban Nha thời ấy. Cuối thế kỉ 16, cây cacao trồng hầu khắp ở các vùng nhiệt đới Trung và Nam Mỹ và trên nhiều hòn đảo ở vùng Caribbe như Trinidad, Grenada, St. Lucia…, mà chủ yếu là ở Trinidad. Người Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, và Hà Lan về sau cũng đưa cây cacao vào các hòn đảo West Indies (Cuba, Dominica, Jamaica), Đông Nam Á (Philippines, Indonesia) và Ceylon (Sri Lanka) (Phạm Trí Thông, 1999). Việc khuyến khích trồng cacao trong suốt thế kỉ 19 có liên quan đến sự phát triển của kĩ nghệ chocolate ở Châu Âu. Những xí nghiệp lớn thành lập trong thời kì bấy giờ như David: 1804, Hindebrand: 1987, Van Houten: 1815, Menier: 1825, Suchard: 1826, Kohler; 1830, Cadbury: 1831,…Bước đột phá mạnh mẽ nhất là sự phát minh ra máy 4 ép để ép chất bơ cacao của một người Hà Lan tên là Van Houten. Điều này cho phép người ta có thể lấy bớt dầu từ cacao, kết quả là sản phẩm bột cacao thu được có ít chất béo, dễ uống và thuận lợi cho chế biến. Sau đó không lâu, người ta lại thấy rằng đem trộn bơ cacao với bột cacao và đường thì có thể chế biến được một loại thực phẩm tuyệt ngon và có thể đóng khuôn được: chocolate. Chocolate ra đời và đưa ra bán lần đầu vào năm 1847 ở Châu Âu. Năm 1876 đánh dấu một sự phát triển mới trong kỹ nghệ chế biến chocolate sữa do một người Thụy Sỹ tên là Daniel Peter phát minh. Ông đã thêm sữa vào chocolate để tạo ra các sản phẩm giống chocolate ngày nay. Trong thế kỉ 20, sản xuất cacao phát triển với qui mô rất lớn vì có sự mở rộng cực kì nhanh chóng các diện tích cây cacao ở Châu Phi. Từ năm 1985, các nước Châu Á bắt đầu phát triển mạnh cacao, trước hết là ở các nước Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanka… (Phạm Trí Thông, 1999) Bảng 2.1: Sản lượng ca cao trên thế giới trong các năm (đơn vị ngàn tấn) 1999 2000 2001 2002 Thế giới 2737 3073 2825 2807 Brazil 164 124 163 125 Cộng hòa Dominica 49 37 45 45 Ecuador 69 95 89 80 Cameron 121 115 135 125 Bờ biển ngà 1128 1409 1175 1210 Ghana 377 437 395 355 Nigeria 174 165 180 170 Indonesia 349 410 385 420 Malaysia 80 45 35 45 (nguồn: Tổ chức lương thực thế giới, FAO) 5 2.1.2 Các đặc điểm của cây cacao 2.1.2.1 Thực vật học Cây cacao (Theobroma cacao) thuộc: ¾ Thứ (genus) Thebroma cacao L. ¾ Họ (Family) Sterculiaceae. Thứ Theobroma gồm 22 loài, trong đó chỉ có loài Theobroma cacao là có giá trị kinh tế. Theobroma cacao được chia ra làm 2 loài phụ : ¾ Criollo: có nguồn gốc từ Trung Nam Mỹ. Đặc điểm rất thơm, ít đắng nhưng năng suất thấp, khả năng kháng bệnh kém, trồng 4-5 năm mới có trái. Hiện nay giống này không được trồng phổ biến ¾ Forastero: là các giống cacao thường gặp ở Brazil và Tây Phi, Trung Nam Mỹ, Malaysia, Indonesia…Đặc điểm: năng suất cao và kháng sâu bệnh nhưng chất lượng trung bình. Hiện chiếm 80 % nguyên liệu sản xuất chính trên thế giới. Ngoài ra còn có nhóm Trinitario là nhóm lai giữa hai nhóm Criollo và Forastero. Đặc điểm: năng suất cao và kháng bệnh tốt. Chiếm 15 % sản lượng chế biến của thế giới. (Intermediate technology development group,1999). 2.1.2.2 Đặc điểm hình thái Cacao là loài cây thân gỗ nhỏ có thể cao đến 10 - 20 m nếu mọc tự nhiên trong rừng. Trong sản xuất do trồng mật độ cao và khống chế sự phát triển thông qua tỉa cành nên cây thường có chiều cao trung bình khoảng 5 - 7 m, đường kính thân từ 10 - 18 cm. Cacao sinh trưởng tốt dưới bóng che, do đó có thể trồng xen với các loại cây kinh tế khác. Thời kỳ kinh doanh hiệu quả có thể kéo dài từ 25 - 40 năm. Lá dài 25 cm, màu đậm, hình gân lông chim. Thân cây do thụ tinh, mỗi năm cho đến hàng nghìn hoa ở thân chính và cành to nhưng chỉ có 1 - 3 % thành trái. Sau khi thụ phấn trái tăng trưởng chậm trong khoảng 40 ngày đầu và đạt tốc độ tối đa sau 75 ngày. Sau khi thụ phấn 85 ngày sự tăng trưởng của trái chậm lại, trong khi hạt bên trong trái bắt đầu tăng trưởng nhanh, đây cũng là thời kỳ hạt tích luỹ chất béo. Lớp cơm nhầy hình thành khoảng 140 ngày sau khi thụ phấn. 6 Trái cacao có thể đạt chiều dài 10 - 30 cm, đường kính 7 - 9 cm, cân nặng từ 200 - 1000 g. Tuỳ theo từng loài, hình dạng của trái thay đổi từ hình cầu, hình dài và nhọn, hình trứng hoặc hình ống. Màu sắc của trái khá đa dạng, có loại trái màu xanh, màu vàng có loại màu đỏ. Khi hạt tăng trưởng tối đa, trái vào giai đoạn chín. Trái chín không nở bung ra và ít khi rụng khỏi cây. Từ khi thụ phấn đến trái chín kéo dài từ 5 - 6 tháng tuỳ theo giống. Mỗi trái chứa từ 30 - 40 hạt. Mỗi hạt có lớp cơm nhầy bao quanh có vị chua, ngọt, thơm và xếp thành 5 dãy. Thời gian thu hoạch thay đổi theo từng vùng canh tác, đối với các nước nằm ở phía Bắc xích đạo, thời gian thu hoạch vụ chính thường từ tháng 9 đến tháng 12 và vụ hai từ tháng 4 đến tháng 6. (Phạm Trí Thông, 1999) 2.1.2.3 Đặc điểm sinh thái Cây cacao thường được trồng trong khoảng từ xích đạo đến vĩ độ 20. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là từ 30 - 30 oC, nhiệt độ thấp nhất cho phép là 18oC. Lượng mưa hàng năm thích hợp nhất trong khoảng 1150 đến 3000 mm Đất trồng nên xốp và ẩm. Ẩm độ thích hợp nhất từ 70 - 80 % Cây cacao là loại cây ưa bóng mát. Cây cacao lúc đầu cần 25 - 50 % ánh sáng, nhu cầu về bóng mát giảm đi khi cây cacao đã phát triển để tự đảm bảo được tán che cho mình. Che sáng làm giảm nhu cầu phân bón đến một mức độ nhất định. Sau đó muốn tăng độ chiếu sáng để đạt năng suất cao thì phải đảm bảo đủ ẩm cho đất và tăng lượng phân bón. Cách nhân giống hiệu quả nhất là từ hạt (Intermediate technology development group, 1999). Việc tạo cây con làm giống bằng cách ghép hạt tại hố trồng không thuận lợi bằng gieo hạt tại vườn ươm, sau 4 - 6 tháng đưa cây con ra đất trồng. Ngoài ra, người ta còn nhân giống ca cao bằng phương pháp vô tính như: giâm, ghép và chiết cành. 7 2.1.2.4 Thành phần hóa học của trái ca cao Bảng 2.2: Các thành phần của hạt cacao tươi, tính theo % trọng lượng tươi Thành phần Chất nhầy (Mucilage/Sweating) Vỏ hạt (Shell/Testa) Phôi nhũ (Cotyledon/Kernel) Nước 84.5 9.4 35 Chất béo (bơ cacao) - 3.8 31.3 Carbohydrates +Cellulose +Tinh bột +Pentosans +Sucrose +Glucose + Fructose - - 2.7 0.7 10.0 13.8 46.0 - - - 3.2 4.5 4.9 - 1.1 Nitrogen +Protein +Theobromine +Enzyme Polyphenols 0.6 - - - 18.0 - - 0.8 8.4 2.4 0.8 5.2 Acid hữu cơ Citric và Acetic,Oxalic 0.7 - 0.6 Muối khoáng 0.8 8.2 2.6 Tổng số 100.0 100.0 100.0 (nguồn: F. Hardy) 2.1.3 Tình hình trồng và sản xuất ca cao tại Việt Nam Hiện nay, việc phát triển cây ca cao tại nước ta dựa theo vùng quy hoạch sản xuất. Mặc dù điều kiện của các địa phương đều thích hợp cho cây phát triển. Song hạt 8 ca cao chỉ mới là mặt hàng để xuất khẩu. Trong nước hiện chưa có cơ sở tiêu thụ sản phẩm. Một lượng nhỏ sản lượng ca cao được các cơ sở thủ công tại địa phương thu mua và sản xuất theo phương pháp thủ công. Với dự án Success Alliance được triển khai ở nước ta từ năm 2002, người nông dân trồng ca cao được hỗ trợ mọi mặt. Đây là một chương trình do Bộ Nông nghiệp Mỹ hỗ trợ và tổ chức phi Chính phủ Mỹ ACDI- VOCA triển khai để hỗ trợ đào tạo về kĩ thuật giúp nông dân trồng ca cao đạt chất lượng xuất khẩu, đồng thời liên kết các tổ chức thu mua, chế biến sản phẩm cho người nông dân. Hiện tại, Bộ nông nghiệp Mỹ (USDA) đang hỗ trợ 4 triệu USD để mở các đợt tập huấn cho nông dân trồng và nâng cao diện tích canh tác cây ca cao; Cơ quan phát triển quốc tế Mỹ (USAID) tài trợ 800000 USD để giúp Việt Nam trở thành một nước cung cấp hạt ca cao đã lên men có chất lượng cao và chương trình PSOM của Chính phủ Hà Lan giúp Việt Nam phát triển thành nhà sản xuất ca cao đạt tiêu chuẩn chất lượng với mức hỗ trợ là 650000 USD. Bên cạnh việc nhập giống từ nước ngoài vào, trong nước cũng đang tiến hành khai thác nguồn giống sẵn có ở trong nước. Thực ra, cây ca cao đã có mặt ở Việt Nam từ rất lâu nhưng do không tiêu thụ được sản phẩm nên chúng không được xem là cây trồng chính mang lại nguồn thu nhập. Nhưng cây lại có hình dáng đẹp nên vẫn được người dân giữ lại trồng làm cảnh. Nhờ đó mà ngày nay các chuyên gia nghiên cứu trong nước đã dựa trên những cây giống còn giữ lại lựa chọn và nhân rộng những giống có năng suất cao đáp ứng nhu cầu cây giống cho nông dân. Với sự giúp đỡ của các tổ chức quốc tế, diện tích trồng cây ca cao ngày càng được mở rộng. Cụ thể, sẽ nâng diện tích trồng ca cao từ 3000 ha hiện nay lên 10000 ha vào năm 2010, tập trung tại các tỉnh Bến Tre, Bình Phước và Đắk Lắk. Có nhiều mô hình trồng ca cao đang được áp dụng ở Việt Nam. Phổ biến nhất là mô hình trồng xen lẫn các loại cây khác như dừa, cà phê, tiêu, nhãn, cam , điều, chuối, sầu riêng… Ưu điểm của mô hình này là tận dụng được bóng mát của những cây có sẵn trong giai đoạn đầu phát triển của cây ca cao. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, qua 3 năm trồng thử nghiệm tại Việt Nam, cây ca cao đã phát triển tốt, hiệu quả kinh tế cao hơn các loại cây trồng khác như cà phê, điều... 9 Tuy nhiên, đầu ra của ca cao vẫn còn là nỗi băn khoăn của người nông dân. Hiện nay, đa số những trái ca cao thu hoạch được đưa vào để nhân giống. Một lượng nhỏ ca cao được các cơ sở sản xuất thủ công tại địa phương thu mua và chế biến theo phương pháp thủ công. Sản phẩm thường là bột ca cao hòa tan uống liền hay để trộn vào các sản phẩm như kẹo dừa, bánh. Một lượng rất ít còn lại được xuất khẩu. Bảng 2.3: Các tỉnh trồng ca cao ở Việt Nam STT Tỉnh Năm 2003 (ha) Năm 2004 (ha) 1 Bà Rịa - Vũng Tàu 28 100 2 Bến Tre 260 500 3 Bình Định 10 4 Bình Dương 5 5 Bình Phước 74 6 Cần Thơ 2 7 Đắc Lắc 506 990 8 Đồng Nai 25 15 9 Gia Lai 5 10 Hồ Chí Minh 3 11 Lâm Đồng 10 10 12 Long An 2 13 Phú Yên 5 14 Quảng Ngãi 50 15 Tây Ninh 5 16 Tiềng Giang 7 50 17 Đắc Nông 120 18 Vĩnh Long 5 19 Các tỉnh khác 120 Tổng Cộng 1002 1905 10 2.2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT CA CAO Hạt ca cao thô là nguyên liệu quan trọng của kỹ nghệ ca cao và chocolate. Từ hạt ca cao thô sản xuất ra: ¾ Những sản phẩm bán hoàn chỉnh cung cấp cho các kỹ nghệ khác như: o Bột chocolate nhồi để các nhà máy bánh kẹo sản xuất ra chocolate, bánh quy, bánh ngọt… o Bột ca cao dùng nhiều vào kỹ nghệ thực phẩm làm ra sản phẩm ngọt như: nước ngọt, nước ca cao o Bơ ca cao dùng vào nghề mứt chocolate, mỹ phẩm dược phẩm. ¾ Những sản phẩm hoàn chỉnh đưa thẳng vào tiêu dùng như: o Chocolate tấm (để nấu, nhai, ngậm, pha sữa…) chocolate bột (tan hoặc không tan) o Mứt kẹo chocolate ¾ Những phế liệu của kỹ nghệ này như khô dầu trong chiết ép lấy bơ ca cao, chất béo chiết từ vỏ và mầm, đều có thể thu nhặt để chăn nuôi, làm phân, làm xà phòng. 2.2.1 Công nghệ ca cao thô 2.2.1.1 Ủ hạt ca cao Ủ hạt là khâu quan trọng nhất trong ngành chế biến ca cao. Các mục đích của việc ủ là: ¾ Gây ra những thay đổi sinh hóa học trong phôi nhũ (cotyledon), để làm giảm vị đắng và chát trong hạt ca cao; đồng thời làm khơi mào cho sự phát triển các hương vị, và màu sắc trong quá trình rang hạt sau này ¾ Làm cho phôi nhũ nở rộng hơn và giòn, dẫn đến lớp vỏ hạt (testa) hở ra và diệt được rễ mầm (radicle) trong hạt ca cao. ¾ Hóa lỏng và loại bỏ cho hết lớp nhầy (pulp, sweating) bao quanh hạt ca cao tươi giúp thuận lợi cho quá trình sấy hạt tiếp theo. 11 Quá trình lên men i. Sự lên men của lớp nhầy Lớp nhầy chiếm khoảng 15-20 % trọng lượng của hạt ca cao tươi và chứa một trữ lượng đường cao, pH khoảng 3.5. Theo Roelfsen có khoảng 24 loài vi sinh vật được tìm thấy trong một khối ca cao đang lên men, nhưng chỉ có một số ít trong số đó là được biết đến vai trò của chúng. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men dưới sự tác động của các vi sinh vật có trong lớp nhầy gây chuyển hóa đường trong lớp nhầy thành cồn ethylic và khí carbonic bay ra. C6H12O6 Æ 2C2H5OH + 2 CO2 Sự chuyển hóa trên xảy ra dưới những điều kiện hơi yếm khí. Khi chất nhầy bị tan vỡ và thành dịch chảy ra làm môi trường ủ trở nên thông thoáng hơn. Độ acid cũng giảm, pH đạt khoảng 5.0. Ngay khi các tế bào chất của lớp nhầy bị hủy hoại, không khí thâm nhập vào khối ủ và có sự gia tăng về acetic do có hiện tượng oxid hóa cồn thành acid acetic. Theo Kenten và Powell (1960) các phản ứng do sự hoạt động của các vi sinh vật luôn phát nhiệt nhiều, làm tăng nhiệt độ khối ủ có thể lên đến 50 oC. Nhiệt độ tăng đều lên trong suốt 48 giờ đầu lên men, đạt 42-48 oC vào cuối giai đoạn ấy. Sau khi được đảo trộn lần đầu, nhiệt độ tăng lên đến 50 oC. Sau đó nó lại giảm chậm xuống, nhưng tăng lên lại khi đảo trộn khối hạt ủ lần nữa. Sau 6 ngày ủ nhiệt độ đạt cỡ 48 oC Ngay sau khi vỏ hạt để acid thấm qua vào tới phôi nhũ, sẽ giết chết hạt và hạ thấp độ pH của cotyledon xuống còn 4.8 gây chết hạt. Mục đích là để cho hạt chết không còn sức nảy mầm. ii. Những nội phản ứng trong các mô của cotyledon Các mô của cotyledon do hai tế bào tạo thành: tế bào có sắc tố chứa các polyphenols (tanin, catechin, anthocyanin, leucoanthocyanin); các purin (theobromine và caffeine), và các tế bào dự trữ không có màu sắc chứa những tinh thể bơ ca cao; những hạt tinh bột; những protein (hạt aleuron) và các enzyme. Khi hạt ca cao đã chết, cotyledon sẽ hút ẩm làm cho vách tế bào của nó trở nên thấm nước và nội chất của tế bào có thể khuếch tán qua các mô. Những enzyme của tế bào dự trữ nhờ thế được tiếp xúc với những polyphenols của tế bào sắc tố mà trước kia hoàn toàn bị ngăn cách. Hoạt tính enzyme về thủy phân hóa protein sẽ xảy ra. 12 Trong các polyphenols những sắc tố anthocyanin bị thủy phân hóa cho ra cyanidin và hai đường khử, là những chất không màu mà sau khi bị oxy hóa sẽ có màu nâu đặc biệt (màu nâu cacao). Những polyphenols khác sẽ tản đi một phần qua lớp vỏ của hạt hoặc chịu những biến đổi hóa học; cả hai tiến trình đều góp phần làm giảm vị đắng và chát. Các biến đổi này xảy ra cho tới cuối đợt lên men và còn tiếp tục trong quá trình phơi khô. Cần lưu ý rằng bớt chất chát là một đặc điểm của ca cao đã lên men tốt Đối với những phức chất đạm, trong quá trình lên men trữ lượng đạm tổng số giảm đều vì chất theobromine hao mất. Chừng 40% theobromine của phôi nhũ tươi khuếch tán vào các mô và di chuyển vào vỏ của hạt làm cho trữ lượng theobromine ở vỏ hạt tăng lên rất nhiều. Vì thế mà vị đắng của hạt ủ tốt càng giảm thêm đi. Còn các protein trong cotyledon bị thủy phân háo thành các amino acid và chuyển sang các dạng không hòa tan do các phản ứng với các polyphenols. Các biến đổi này sẽ phản ánh qua các vị, hương và màu sắc của các hạt Hiệu quả quan trọng nhất của quá trình ủ hạt ca cao là sự xuất hiện của những tiền chất của hương vị chocolate. Theo Rohan, 1958 những chất đường khử tìm thấy trong hạt cacao đã lên men là một thành phần của các tiền chất. Chỉ có những tiền chất này mới truyền vào cho hạt ca cao khi rang có hương vị chocolate. Cần lưu ý rằng các tiền chất ấy không hề có sẵn trong các loại tế bào của phôi nhũ khi hạt ca cao còn tươi, mà chỉ được sinh ra trong quá trình lên men mà thôi. 2.2.1.2 Các phương pháp ủ hạt ca cao i. Ủ thành đống Đây là phương pháp phổ biến nhất trong việc ủ ca cao ở Tây Phi. Hạt ca cao được đổ đống thành hình nón trên các lá chuối được xếp tròn trên mặt đất. Nhằm giúp cho sự thoát dịch nhầy, trong quá trình lên men, người ta kê dưới lớp lá chuối các cành cây hoặc các thanh tre thành hình nan hoa của bánh xe. Các lá chuối được cuộn lên nhằm giữ hơi nóng trong suốt quá trình ủ. Cứ hai ngày một lần, giở lá chuối ra để xáo trộn hạt cho đều, rồi lại đậy lá chuối vào ii. Ủ trong thúng Các thúng đan bằng tre được dùng cho phương pháp này. Chúng được đổ đầy ca cao rồi sau đó dùng lá chuối đậy lại. Dịch nhầy chảy ra qua các mặt bên và đáy thúng. 13 Việc đảo trộn được thực hiện bằng cách đổ từ thúng này sang thúng kia, cứ 2 ngày một lần. iii. Ủ trong thùng Các thùng gỗ có kích thước 1.2 x 1.2 x 0.9 hoặc 1.2 x 2 x 0.7, bằng các tấm gỗ lắp ghép có thể tháo rời được. Các thùng này có thể bố trí theo hình bậc thang. Thùng ủ có lỗ 15 mm ở dưới đáy để chất dịch nhầy có lối thoát và khối ủ dễ thông hơi. Tiến hành lót lá chuối ở đáy và quanh thùng rồi đổ hạt ca cao tươi vào, khi đổ hạt nửa thùng tiếp tục lót lá chuối phủ phần miệng thùng để để chuẩn bị đậy kín bằng lá chuối rồi dằn cây lên hoặc đậy nắp và dằn đá. Cứ 2 ngày lại một lần tiến hành đảo trộn bằng các xúc hạt từ thùng này sang thùng khác. iv. Ủ trên khay Khay ủ bằng gỗ sau 10 cm. Đáy khay là một cái vạt bằng nan tre đặt song song và cách nhau chừng 0.5 cm. Mỗi khay chia thành hai phần bằng nhau, bằng một cái ngăn di động bằng gỗ. Chỉ đổ đầy ca cao nửa khay. Chồng 12 khay lên nhau, góc đầy hạt quay về cùng một phía. Lớp hạt trên của mỗi khay tiếp giáp với vạt tre làm đáy của khay trên và những khoảng trống giữa các nan tre là những ống thông khí mà qua đó không khí có thể thấm vào khối ủ. (Phạm Trí Thông, 1999) Sau 24 giờ ủ, người ta phủ lên chồng khay một mảnh vải bao bì để vừa chống mất nhiệt cho toàn bộ vừa đảm bảo đủ thông thoáng. Sau đó không cần làm gì nữa cho đến lúc ngừng ủ. Thời gian ủ trên khay là 3-4 ngày, ngắn hơn so với các phương pháp ủ khác. 2.2.1.3 Phơi và sấy ca cao Sau khi ủ, ẩm độ của hạt ca cao khoảng 55 % và ẩm độ này cần phải giảm xuống đến giá trị 6-7 % mới bảo quản an toàn được. Nhưng nếu hạ thấp ẩm độ xuống dưới 5 % hạt ca cao sẽ rất giòn và dễ gãy. Mục đích của việc phơi sấy, ngoài việc hạ thấp ẩm độ còn để hoàn tất các biến đổi hóa học xảy ra tiếp tục bên trong hạt sau thời kì lên men để tạo hương vị đặc biệt cho ca cao. Hạt ca cao có thể được phơi nắng mặt trời hoặc sấy bằng các máy sấy. Hạt ca cao được ủ và phơi sấy tốt sẽ cho màu tím nhạt và màu nâu chocolate.Khi bóp hạt bằng tay sẽ nghe âm thanh rắc rắc và dễ nghiền thành bột. 14 2.2.2 Qui trình sản xuất bột cacao 2.2.2.1 Loại bỏ tạp chất Hạt được đi qua sàng có φ = 16 mm để tách các tạp chất lớn hay các sợi dây nhợ và sau đó đi qua sàng có lỗ φ = 8 mm để tách sạch các tạp chất nhỏ như vỏ hạt vụn, sỏi đá, mảnh kim loại. Trong quá trình lên men hay phơi sấy cacao, bụi bẩn có thể bám trên vỏ hạt có thể lẫn vào các sản phẩm sau này, làm giảm hương vị của chúng do đó cần có quá trình thổi sạch bụi khỏi hạt cacao. Hao hụt qua hệ thống làm sạch ước chừng 1 – 1,3% tính theo khối lượng. 2.2.2.2 Xử lý nhiệt Nếu hạt cacao không qua xử lý nhiệt sơ bộ mà đi thẳng vào giai đoạn rang, thì sẽ phát sinh nhược điểm sau: ¾ Hạt cacao có kích thước rất khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc loài (Forastero, Criollo hay Trinitario) do đó rất khó đảm bảo các hạt rang có độ chín đồng đều; các hạt nhỏ bị rang quá nhiệt trong khi các hạt lớn thì rang chưa tới. ¾ Hạt nguyên có kích thước khá lớn, nên bên trong và bên ngoài hạt có độ chín rất khác nhau ¾ Khi rang ở nhiệt độ cao khoảng 120 oC, dầu cacao rất linh động, dễ dàng bị vỏ hạt ca cao vốn có hàm lượng dầu thấp sẽ hấp thụ dầu cao cao mạnh, tổn thất dầu ca cao trong quá trình tách vỏ khoảng 5 – 6 %. Do đó, cần quá trình xử lý nhiệt sơ bộ để khắc phục các nhược điểm trên. Người ta cần nâng nhiệt độ trên bề mặt hạt cacao lên 90 – 100 oC để phần vỏ hạt mất nước và dễ tách rời khỏi lõi hạt ca cao. Nhờ vậy, tổn thất dầu ca cao trong quá trình thổi tách vỏ chỉ còn khoảng 1 %. 2.2.2.3 Rang Rang là một trong những công đoạn cần thiết trong kỹ nghệ chế biến ca cao và chocolate. Vai trò của quá trình rang có tác dụng nhiều mặt: ¾ Làm nảy nở chất thơm để tạo cho thành phẩm ca cao một hương và vị đặc biệt. Đây là vai trò chính yếu nhất của khâu rang ¾ Tách nhân (mảnh hạt) và vỏ, nhưng chỉ ở mức độ làm lỏng lớp vỏ hạt ¾ Loại một phần độ chua acetic của ca cao 15 ¾ Hạ thêm độ ẩm của hạt xuống đến 2.5 – 5 % để sấy khô phần nhân ca cao ¾ Phát triển màu sắc đặc thù chocolate ¾ Góp phần vô hoạt Salmonella và các vi sinh vật có hại khác. Những biến đổi trong quá trình rang i. Sự biến đổi về độ ẩm Hàm ẩm trước khi rang là 6 – 8 %. Sau khi rang còn 2 – 3 %. Độ ẩm thích hợp cho các quá trình như nghiền, ép dầu là 2 %. Nếu độ ẩm lớn hơn 3 %, độ nhớt khối chocolate tăng mạnh, việc sản xuất gặp nhiều khó khăn. Nếu độ ẩm nhỏ hơn 1 % mức độ nghiền và sản lượng ép dầu giảm; ảnh hưởng nhiều đến năng suất. ii. Sự thay đổi hàm lượng acid và các chất dễ bay hơi Trong quá trình hong khô ca cao trước đó đã tạo ra các amino acid tự do trong hạt ca cao. Các amino acid đó là một trong những tiền chất quan trọng để tao ra mùi hương chocolate, nhưng trong quá trình rang chúng sẽ bị phân huỷ một số. Có tám nhóm amino acid được phân lập ra và thấy rằng tất cả đều bị phân huỷ một phần, nhưng với các tốc độ khác nhau. Một điểm lưu ý là thành phần nitrogen tổng số trong hệ thống không hề bị mất mát, có lẽ là do sự kết hợp của các phức chất nitrogen với các đường khử. Akabori, 1932 đã cho rằng các đường khử có khả năng phân huỷ các amino acid, và sau đó hai ông Rohan và Steward tiếp tục công trình nghiên cứu trên hạt ca cao, đã chỉ ra rằng trong quá trình rang các đường khử đã bị huỷ hoại gần như toàn bộ. Qua sự biểu diễn trên đồ thị sử giảm dần của các amino acid tự do theo hàm lượng đường khử và giả thiết rằng cả hai nhóm chức này tương tác với nhau để sinh ra các sản phẩm bay hơi, có thể nói rằng nguyên nhân của sự phân huỷ một phần của các amino acids là do sự thiếu hụt các đường khử trong hạt ca cao. Các chất dễ bay hơi làm hạt ca cao có mùi khó chịu. Sau khi rang, hàm lượng của chúng giảm: hàm lượng acid dễ bay hơi từ 0.4 % (tính theo acid acetic) giảm xuống còn 0.3 %, lượng chất khô tổn thất trong quá trình rang khoảng 0.1 – 0.2 %. iii. Sự thay đổi hàm lượng chất chát Chất chát trong ca cao làm cho chocolate và bột cacao có vị chát và đắng đặc trưng. Chất chát gồm 2 loại: ¾ Chất chát thuỷ phân: là hợp chất mà các nhân phenol liên kết với nhau thông qua nguyên tử oxi. Chất chát thuỷ phân quan trọng là tanin 16 ¾ Chất chát ngưng tụ: là hợp chất mà các nhân phenol liên kết với nhau thông qua nguyên tử carbon. Chất chát ngưng tụ với nhau thì có tính chát. Trong hạt ca cao tươi chưa lên men có 0.6 –1 % catesin nhưng sau khi lên men chúng chuyển thành chất chát ngưng tụ L – epicatesin. Trong hạt ca cao khô đã lên men, lượng chất chát từ 3 – 6 %. Sau khi rang còn lại 2 – 3 % iv. Sự thay đổi chất màu Trong quá trình rang, L –epicatesin bị oxy hoá chuyển thành flobaphen có màu nâu đỏ đặc trưng của chocolate. Ngoài ra còn phải kể tới phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin, phản ứng caramel hoá. Tất cả những phản ứng này giúp tạo màu và quan trọng nhất là tạo mùi chocolate Các phương pháp rang hạt ca cao i. Rang gián đoạn Thường rang trong thùng quay: tác nhân truyền nhiệt là không khí nóng 250 – 300 oC được thổi vào thùng quay. Nhiệt độ ra của không khí 160 – 170 oC. Nhiệt độ hạt ca cao 120 – 125 oC. Thời gian rang từ 12 – 15 phút. Sau đó hạt được làm nguội nhanh xuống 30 – 40 oC nếu dùng phương pháp rang trước tách vỏ sau, nhằm ngăn chặn tinh dầu dịch chuyển từ lõi ra vỏ hạt. Tổn thất chất khô trong quá trình rang 0.2 – 0.3 %. ii. Rang liên tục Thiết bị rang liên tục nhằm kiểm soát chặt chẽ hơn các thông số trong quá trình rang, nhờ vậy mà chất lượng hạt rang tốt hơn nhiều. Thiết bị rang liên tục thường dùng là thùng quay dạng ống được cấp nhiệt trực tiếp hay gián tiếp, trao đổi nhiệt cùng chiều hay ngược chiều. Trong qui trình sản xuất của nhà máy, bột ca cao được rang trực tiếp bằng sản phẩm cháy của khí hoá lỏng propan – butan. Tuy loại nhiên liệu này đắt tiền nhưng rất sạch, caloriphe nhỏ gọn và quan trọng hơn là dễ dàng kiểm soát thông số trong quá trình rang. 2.2.2.4 Nghiền thô và phân ly Hạt nguội thì chuyển qua công đoạn nghiền thô và phân ly. Công đoạn này nhằm đề tách hoàn toàn vỏ ra khỏi mảnh nhân. Nghiền thô là tiến trình nghiền sơ bộ hạt ca cao rang nhằm làm vỡ lớp vỏ hạt. Trong khi nghiền thô cố gắng giữ sao cho các phần 17 tử vỡ ra của vỏ và mảnh nhân càng lớn càng tốt (85 – 90 % các phân tử nên có kích thước lớn hơn 3 mm) để tránh tạo ra các mảnh hạt quá vụn và bụi bặm. Nguyên lý của việc phân ly dựa trên sự khác nhau về khối lượng riêng của mảnh nhân và vỏ hạt. Máy ứng dụng các nguyên lý phân ly như phân ly cơ học dùng sàng, và phân ly động dùng quạt. Mục đích của việc phân ly là thu được hai cấu tử cơ bản: phần mảnh nhân có chứa một ít vỏ và mầm, và phần vỏ hạt chứa không đáng kể mảnh nhân. Thành phần có giá trị nhất của hạt ca cao chính là mảnh nhân, còn vỏ hạt xem như là phần bỏ đi. 2.2.2.5 Kiềm hoá Kiềm hoá nhằm làm gia tăng hương vị thơm ngon của chocolate và bột ca cao. Quá trình kiềm hoá phụ thuộc vào nồng độ và lượng chất kiềm, thời gian và nhiệt độ kiềm hoá. Trong quá trình này hàng loạt các tác động khác nhau: ¾ Sự hấp thu của nước dẫn đến sự trương nở của thành tế bào, protein, tinh bột và các chất sợi, tạo thuận lợi cho các phản ứng hoá học. ¾ Trung hoà các acid tự do như acid acetic, citric, tartric…, làm độ chua của chocolate giảm rõ rệt ¾ Hydrate hoá các ester để tạo thành các hợp chất có mùi thơm ¾ Làm giảm hàm lượng các hợp chất tanin và sản phẩm ít chát hơn ¾ Phá huỷ cấu trúc của protein, tạo thành các acid amin, hợp chất amin, amoniac tự do, các hợp chất globulin hay các protein thứ cấp khác ¾ Phản ứng Maillard giữa đường khử và acid amin tự do làm tăng cảm quan về màu sắc và mùi vị ¾ Sự phân huỷ các hợp chất glucid góp phần tạo sản phẩm một mùi vị giống như của vanille, tạo các sản phẩm đặc trưng của phản ứng caramel hoá ¾ Trung hoà các acid béo tự do, tạo thành các sản phẩm của phản ứng xà phòng hoá ¾ Phá huỷ một phần lecithin có trong ca cao, một chất bảo quản và chất nhũ tương tự nhiên của ca cao. Hai tác động cuối gây bất lợi đối với chất lượng bột ca cao. Do đó cần chú ý tác dụng tiêu cực này Việc kiềm hoá thực hiện bằng cách tẩm dung dịch kiềm 3 – 8 % (K2CO3, Na2CO- 3, KOH hay NaOH) vào bột ca cao và ủ trộn trong thùng quay ở nhiệt độ 70 – 80 oC trong 30 – 45 phút. Lượng kiềm cho vào vừa đủ để nâng pH của bột ca cao từ 4.5 – 5 18 lên 6.8 – 7. Tuỳ theo yêu cầu chất lượng của chocolate và bột ca cao mà các thông số trên có thể thay đổi rất khác nhau. 2.2.2.6 Sấy bột kiềm Mảnh nhân sau khi kiềm hoá ẩm được sấy ở 90 – 100 oC để đạt độ ẩm sau cùng là 1.5 – 2 %. Độ ẩm bột có ảnh hưởng quan trọng hiệu suất ép tách bơ cũng như độ nhớt của chocolate và bột ca cao do đó cần khống chế độ ẩm trong giới hạn nói trên 2.2.2.7 Nghiền mảnh nhân Mảnh nhân chứa cỡ 55 % bơ ca cao, có trong các tế bào ở pha rắn. Các thành tế bào bị phá huỷ trong tiến trình nghiền và nhiệt sinh ra do ma sát sẽ nâng nhiệt độ lên trên 34 oC, điểm nóng chảy của bơ ca cao, làm lỏng hoá chất béo tạo thành một chất bột nhão. Khi tiến trình tiếp tục, kích thước các phần tử nghiền giảm dần và chất bột nhão càng ngày càng có dạng lỏng, còn gọi là rượu mùi ca cao (cocoa liquor). Hỗn hợp này gồm các phần tử chất rắn lơ lửng trong thề pha chất béo liên tục Bột ca cao nhào nghiền xong có thể dùng hoặc để sản xuất bơ ca cao và bột ca cao, hoặc để làm chocolate. Người ta có thể giữ nó ở thể lỏng bằng nhiệt, hay để nó nguội và trở thành rắn thường gọi là ca cao khối. 2.2.2.8 Ép Mục đích của công đoạn ép rượu mùi ca cao (khối bột nhão) để tách bơ ca cao ra khỏi các thành phần không chứa chất béo. Bơ ca cao là một trong nhưng chất béo có giá trị rất cao. Nó không những để sản xuất ra chocolate mà còn sử dụng trong các ngành dược phẩm (chế supputoira), ngành mỹ phẩm (son đánh môi) nhờ đặc tính nhiệt độ tan chảy thấp khoảng 34 – 35 oC, và bơ ca cao kém chất lượng còn dùng được trong ngành sản xuất xà phòng. Bột ca cao đem ép có hàm lượng bơ ban đầu khoảng 55.5 %, sau đó giảm xuống còn khoảng 18 % (bột ép có hàm lượng bơ như vậy thích hợp làm thức uống). Áp lực tác động lên bột ca cao đạt tới 380 – 400 kg/cm2. Nhiệt độ bột ca cao đem ép cần đạt 65 – 70 oC để giảm độ nhớt của dầu ca cao, dầu ca cao sẽ dễ thoát ra hơn. Thời gian ép khoảng 5 – 10 phút. 2.2.2.9 Xay bánh dầu Bánh dầu ca cao sau khi ra khỏi mâm ép sẽ rơi vào thùng chứa hoặc trên một băng chuyền để tiếp tục được xay xát (nghiền tinh) để thành bột mịn hơn. Cấu trúc bánh dầu ép rất kết chặt, đặc biệt là khi bánh có hàm lượng chất béo thấp. Trước khi xay xát bánh được đập vỡ ra. Mục đích để đập vỡ bánh dầu thành từng 19 miếng có kích thước nhỏ hơn 5 mm, trước khi đưa vào xay trong các máy xay xát kiểu con lăn 2.2.2.10 Sàng Sản phẩm bột ca cao cuối cùng được sàng qua vải lọc, nylon hoặc lưới kim loại trước khi đem đi đóng gói bằng vật liệu chống hút ẩm 2.3 GIỚI THIỆU VỀ CELLULOSE, PECTIN, CELLULASE, PECTINASE 2.3.1 Giới thiệu cellulose Cellulose là một loại homocellulose gồm nhiều đơn vị β – D - glucose và được nối với nhau bởi liên kết β - D - 1,4 glucozit. Mức độ polymer hóa của phân tử cellulose thay đổi nhiều từ vài chục đến vài vạn đơn vị (15 – 15000) nhưng thường trung bình là khoảng 300 đơn vị β-glucose Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose Phân tử cellulose kéo dài thành chuỗi, nhiều chuỗi nằm song song với nhau và chúng gắn kết với nhau thông qua liên kết hydro. Như vậy cầu nối hydro có thể tạo nên giữa hai chuỗi cellulose trong cùng một lớp và giữa hai chuỗi cellulose ở hai lớp khác nhau.. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi này liên kết lại thành bó gọi là các microfibrin có cấu trúc không đồng nhất. Chúng có những phần kết tinh và những phần vô định hình nhưng phần lớn cellulose trong thiên nhiên có cấu trúc kết tinh. O O O OH OH CH2OH n O O CH2OH OH OH O CH2OH OH OH OH - D - glucopyranoseβ n 20 Những phần kết tinh không liên tục mà xen kẽ trong chuỗi cellulose. Kích thước chuỗi kết tinh này khác nhau tùy thuộc vào nguồn cung cấp cellulose nhưng thường thì đường kính dao động từ 60 – 100 Ao và dài 600 – 1500 Ao. Các sợi microfibrin có chiều rộng khoảng 100 – 300 Ao và chiều dày khoảng 40 – 100 Ao. Tính chất chung của cellulose ¾ Cellulose là một trong những chất tự nhiên khá bền, không tan trong nước nhưng có thể hút nước và trương nở lên. Tuy nhiên, chúng có thể bị phân hủy trong điều kiện nước có nhiệt độ cao và áp suất lớn, hay trong dung dịch có chứa tác nhân acid hay kiềm mạnh. ¾ Cellulose có thể bị phân hủy ở nhiệt độ 40 – 50 oC thường nhưng với điều kiện phải có mặt enzyme cellulase ¾ Cellulose có cấu tạo từ các đơn vị C6H10O5 nhưng cấu tạo phức tạp hơn rất nhiều so với tinh bột và cho màu nâu với Iod Trong tế bào thực vật cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose, pectin, lignin. Điều này ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hủy cellulose của enzyme. Trong tự nhiên không có sinh vật nào có đầy đủ các hệ enzyme vì thế để phân hủy phức cellulose thì đòi hỏi có sự kết hợp của nhiều vi sinh vật khác nhau Dạng kết tinh vô định hình dễ bị phân hủy bởi enzyme vi sinh vật, nhưng dạng kết tinh thì có cấu trúc rất chặt chẽ nên khó bị phân hủy. Ở các loại gỗ càng có nhiều vùng kết tinh thì gỗ càng chắc. Muốn phá hủy hoàn toàn cellulose thì trước tiên phải chuyển chúng sang dạng vô định hình nhờ các loại enzyme khác có ở vi sinh vật 2.3.2 Giới thiệu enzyme cellulase Enzyme cellulase có thể chia thành 3 enzyme như sau ¾ Enzyme C1 ¾ Enzyme C2 Trong loại này có thể chia làm hai loại enzyme nhỏ o Cellobiohydrolase (CBH) có tên khác là exo-β-1,4 glucanase hay exocellulase o Endoglucanase có tên khác là endo β-1,4-D-glucanase hay β-1,4 glucan-4-glucanohydrolase 21 ¾ β-glucozitase có tên khác β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có nhiều kiểu tác động khác nhau. Theo Mandels và Reese (1964) thì: Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese Trong đó C1 là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương tạo thành các chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi Cx. Các vi sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai C1 và Cx. Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C1 sinh ra từ loài nấm mốc này nhưng Cx lại sinh ra từ một loài nấm mốc khác. β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn cellobiose thành glucose. 2.3.3 Giới thiệu về pectin Khối lượng phân tử pectin trong khoảng 3.000 – 280.000, ty nguồn gốc thực vật. Dung dịch pectin có độ nhớt cao. Độ hòa tan của pectin trong nước phụ thuộc vào mức độ ester hóa nhóm cacbonyl. Mức ester hóa càng cao độ hòa tan càng cao. Dưới tác dụng của axit, protopectinase hay đun sôi protopectin chuyển thành pectin hòa tan. Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzym pectase sẽ giống nhóm metoxi tạo rượu metylic và axit pectic tự do. Pectin là dẫn xuất polysaccharide phân tử của chúng bao gồm các đơn vị mắt xích là axit -D-galacturonic. Các đơn vị này nối với nhau nhờ liên kết 1-4 glucozit. Cellulose hoạt động Cellulose Cellobiose Glucose C1 Cx -glucozitase β 22 Mỗi đơn vị mắt xích chứa một nhóm cacboxyl ở vị trí C6, các nhóm axit này tồn tại ở dạng tự do hay dưới dạng liên kết ester (như metyl ester). Trong pectin tự nhiên có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa. Các nhóm hydroxyl ở C2 và C3 của mỗi đơn vị mắc xích có thể bị ester hóa một phần bởi axit acetic hoặc axit phosphoric. Một phần nhóm axit không ester hóa tham gia tạo liên kết ngang với ion canxi và magie. O COOH OH O O COOH OH OH O O COOH OH OH O O OH Hình 2.3: Cấu trúc của axit polygalacturonic. 2.3.4 Giới thiệu enzyme pectinase i. Nhóm hydrolase Gồm có enzym pectinesterase và enzym polygalacturonase ™ Pectinesterase (PE) Theo H. lineviver, pectinesterase có ái lực với nhóm metoxy ở vị trí 5 lớn hơn với các nhóm metoxy ở vị trí 3 và 7. Hình 2.4: Sơ đồ phân cắt của enzym pectinesterase. COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3COOH 1 2 3 4 5 6 7 COOCH3 8 COOCH3 9 II I II Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxy sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm −COOH tự do. Kết quả tạo thành axit pectinic hoặc axit pectic và rượu metanol. 23 ™ Polygalacturonase (PG) PG còn có tên gọi là poly-α-1,4-galacturonit glucanohydrolase. PG là enzym xúc tác sự phân cắt các liên kết glucozit 1-4 ở trong các mạch của pectin . PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao khi tác dụng với cơ chất. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác động trên cơ chất, H.Deuel và E.Stutz (1958) đã chia ra như sau: 9 Polymetilgalacturonase (PMG):Enzym tác dụng trên axit polygalacturonic đã được metoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này thường có tên gọi hệ thống là poly-α-1-4-galacturonic metil esteglucanohydrolase và có mã số 3.2.1.11. PMG lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay ở cuối mạch của pectin là: Endoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu I (endo-PMG-I) và Exo- glucosidase-polimetilgalacturonase kiểu III (exo-PMG-III). 9 Poligalacturonase: Enzym này tác dụng trên axit pectic hoặc axit pectinic, chia thành hai nhóm nhỏ: Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II (endo-PG-II) và Exoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu IV (ex-PG- IV) ™ Nhóm Transeliminase (TE) Nhóm enzym này mới được tìm ra cách đâu không lâu. Nhóm enzym này phân cắt phi thủy phân chất pectin với sự tạo ra nối kép ở trong gốc galacturonic giữa nguyên tử carbon thứ 4 và thứ 5. Khi đứt liên kết α-1-4 bởi transeliminase thì hydro từ nguyên tử carbon thứ 5 của gốc axit galacturonic này được chuyển đến nguyên tử carbon thứ nhất của gốc axit galacturonic khác. Phản ứng xảy ra dễ dàng trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu. Hình 2.5: Sơ đồ phân cắt của enzym transeliminase. O OH OH H H H H O O COOH OH OHH H O H O H C OH OH O H H H H OH OH3C O H C OH OH H H H O OH3C O C OH3C 24 Transeliminase tác dụng được trên pectin cũng như trên axit pectic. Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng có thể phân thành những nhóm enzym sau: 9 Pectin−traseliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 galacturonit- metilesterglucano-liase và mã số là 4.2.99.8. Những enzym tác dụng trên pectin và axit pectinic. Các enzym này lại phân thành: Endo- pectintranseliminase kiểu I ( Endo-PTE-I) và Exo-pectintransemilinase kiểu III ( Exo–PTE–III). 9 Poligalacturonat–transeliminase có tên gọi hệ thống là poli α-1-4 D- galacturonit glucanoniase và mã số là 1.2.99.3. Đây là những enzym tác dụng trên axit pectinic và axit pectic. Enzym này lại chia làm 2 loại: Endo polygalacturonat-transeliminase kiểu II (Endo-PGTE-II) và Exopolygalacturonat-transeliminase kiểu IV (Exo-PGTE-IV). 25 PHẦN 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Thời gian thực hiện : từ ngày 15/3/2005 đến 15/7/2005 Địa điểm thực hiện : đề tài được nghiên cứu và thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh hoá thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 NGUYÊN LIỆU 3.2.1 Trái cacao Trái ca cao tươi được lấy từ huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Trước khi lấy hạt để lên men trái ca cao được lưu trữ ở nơi thoáng mát trong 7 - 9 ngày. Mục đích của quá trình này là giúp cho lớp cơm nhầy bao quanh hạt giảm đi giúp làm giảm độ ẩm của khối lên men sau này. Sau khi lưu trữ hạt được tách khỏi trái tươi. Sau khi tách hạt cần phải ủ ngay và không được lưu quá 20 ngày (Phạm Hồng Đức Phước, 2004). 3.2.2 Giống vi sinh vật Chủng được sử dụng là Aspergillus niger được lấy từ hai nguồn: ¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh ¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên Chủng Aspergillus niger Thuộc nhóm: Aspergillus niger Giống: Aspergillus Họ: Aspergillaceae 26 Giống đưa vào nghiên cứu được bảo quản trong môi trường PGA giữ ở nhiệt độ 4oC. 3.2.3 Nguyên liệu làm môi trường Malt: là thành phần chính của môi trường malt để nuôi cấy nấm mốc. Malt rất giàu đường và các khoáng chất cho sự phát triển của nấm mốc. Malt được sử dụng trong thí nghiệm này là loại malt đã được xay nát dùng để sản xuất bia lấy từ khoa Công nghệ thực phẩm trường Cao đẳng công nghiệp thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh Cám: trong cám gạo có chứa nhiều chất dinh dưỡng giúp cho nấm mốc phát triển tốt như: protein, lipid, tro, cellulose; các loại khoáng Na, Ca, K, Zn, Fe và các loại vitamin. Cám được sử dụng trong thí nghiệm là cám gạo được mua tại chợ Bình Tây thành phố Hồ Chí Minh. Trấu: được đưa vào môi trường với mục đích tạo độ thoáng, xốp, tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển tốt. Đồng thời theo một số nghiên cứu cho thấy trấu là nhân tố kích thích hệ enzyme cellulase rất tốt ở các loài nấm mốc. Trong thí nghiệm này trấu được mua từ chợ Kim Biên thành phố Hồ Chí Minh là loại trấu khô, không bị mục nát, không lẫn nhiều các tạp chất khác Cà rốt: là thành phần kích thích sự tổng hợp của enzyme pectinase. Cà rốt sử dụng trong thí nghiệm này được lấy từ nông trường Sông Hậu. Agar: sử dụng agar của công ty đồ hộp Hạ Long Muối sunfat amon (NH4)2SO4 là nguồn đạm bổ sung cho sự phát triển bình thường của nấm mốc. 3.3 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 3.3.1 Môi trường thạch malt Chúng tôi sử dụng môi trường malt để cấy truyền và phục hồi giống. Cách tiến hành làm môi trường Malt như sau 27 Lấy 200 g malt đã được xay nát cho vào becher 1000 ml. Thêm nước cất cho đủ 1000 ml. Đặt becher trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55 oC trong 1 giờ, sau đó tăng lên 65 oC trong 1 giờ sau. Trong quá trình thủy phân dịch malt được khuấy trộn để tăng khả năng thủy phân tinh bột. Quá trình thủy phân tinh bột tạo một lớp nước có màu nâu đục phía trên. Khi kết thúc quá trình thủy phân ta gạn thu phần dịch malt có màu nâu đục ở phía trên. Lọc qua bông gòn thấm nước để loại bỏ một số tạp chất còn sót lại. Dịch malt sau khi lọc được bổ sung agar với hàm lượng 18 ‰ thể tích dịch malt Đun sôi dịch malt và agar trên bếp ở nhiệt độ không quá cao và tiến hành khuấy liên tục tránh hiện tượng caramel hóa Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống khoảng 3 ml dịch malt Làm nút bằng bông gòn y tế không thấm nước và bao đầu ống nghiệm bằng giấy báo. Đem thanh trùng ở 121 oC, 1 atm, trong 15 phút Đặt nghiêng ống nghiệm tạo môi trường thạch nghiêng. Giữ môi trường malt ở nhiệt độ 4 oC 3.3.2 Môi trường nhân giống Chúng tôi sử dụng môi trường nhân giống có thành phần môi trường được lấy theo kết quả nghiên cứu của thạc sĩ Lê Hồng Phú trong luận văn thạc sĩ “Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ”. Môi trường này đã được xác định là thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme cellulase và pectinase của Aspergillus niger. Cụ thể nuôi cấy trên môi trường nhân giống có thành phần: cà rốt 9 %, trấu 15 %, cám 75 % và (NH4)2SO4 1 %, độ ẩm 64 %, thời gian 40 giờ. 28 Cách thực hiện môi trường nhân giống: Cấy Asp. niger trên môi trường thạch malt Thêm 10ml nước cất vào mỗi ống 48 giờ; 34,5 oC Dùng que cấy mài nhẹ trên mặt thạch tách bào tử Cân 75% cám, 9% cà rốt, 15% trấu, 1% (NH4)SO4 Thêm nước (V ml), trộn đều và cho vào erlen Thanh trùng ở 121oC, 1atm, 20 phút Lưu trữ ở nhiệt độ 34,5 oC trong 40 giờ Trộn đều Thể tích nước cất thêm vào (V ml) khi trộn các thành phần của môi trường nhân giống theo công thức: V ml = 64%.m – (w1.m1 + w2.m2 + w3.m3 + 10) Trong đó: V ml: lượng nước thêm vào để trộn các thành phần môi trường nhân giống 64%: độ ẩm của môi trường nhân giống m: khối lượng môi trường nhân giống w1, w2, w3: độ ẩm của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt m1, m2, m3: khối lượng của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt 10: thể tích nước cất thêm vào để tách bào tử Asp. niger từ môi trường thạch malt 3.3.3 Chế phẩm sinh học Mục đích của việc tạo chế phẩm là tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm mốc phát triển, dễ sử dụng, và dễ bảo quản 29 Aspergillus niger sau khi được nhân giống trên môi trường bán rắn được trộn với bột mì rang vàng. Thêm nước cất để chỉnh độ ẩm của môi trường chế phẩm về độ ẩm mong muốn. Chế phẩm sau đó được đưa vào bịch nylon có sử dụng bông gòn làm nút. Mục đích của việc sử dụng bông gòn làm nút để giúp cho môi trường chế phẩm ở trạng thái hiếu khi nhưng vẫn không làm phát tán bào tử Asp. niger ra ngoài môi trường. Chế phẩm sau đó được cất giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 34,5 oC trong 3 ngày. 3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 3.4.1 Dụng cụ và thiết bị Máy khúc xạ kế Cân phân tích Máy đo mật độ quang OD Tủ sấy Tủ ấm Tủ lạnh Bình hút ẩm Máy đo pH Bình tam giác Máy xay Bercher Erlen Pipette Bình định mức Ống đong Phễu lọc Que cấy Các loại chai lọ đựng hóa chất Đũa thủy tinh Bể điều nhiệt Máy vortex 30 Máy lắc mẫu Máy ép thủy lực Máy khuấy từ Tủ hấp Bình Kjeldahl 3.4.2 Hóa chất cho phân tích Nước cất NaOH HCl CMC (sodium carboxymethyl – cellulose) H2SO4 Cồn (C2H5OH) 96o Thuốc thử anthrone Antron Glucose C6H12O6 Saccharose Phenol Thuốc thử orcinol Dextrin Acid acetic DNS (dinitrosalicylic acid) Pectin ZnSO4 Pectinase Iod Ag(NO3) Ete ethylic H2O2 KNaC4H4O6.4H2O 31 H3BO3 HClO3 Lactose Na2HPO4 CaCl2 CuSO4 Na2CO3 3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm 3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên men Nuôi cấy hai giống Asp. niger nghiên cứu trên hai môi trường có cùng điều kiện. Giống Asp. niger được cấy truyền trên môi trường thạch malt. Sau đó hai giống Asp. niger nghiên cứu được nhân giống trên môi trường bán rắn có thành phần 75 % cám gạo, 15 % trấu, 9 % bột cà rốt và 1 % (NH4)SO4, độ ẩm 64 % trong 40 giờ. Sau khi kết thúc quá trình nhân giống chúng tôi tiến hành xác định họat tính của 2 loại enzyme: cellulase, pectinase. 3.5.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ: giống Asp. niger/bột mì rang của chế phẩm lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả tuyển chọn giống vi sinh vật ở trên được áp dụng cho thí nghiệm này. Giống Asp. niger đã tuyển chọn sau khi thu từ môi trường nhân giống được trộn với bột mì rang. Tỷ lệ giống Asp. niger so với bột mì rang sử dụng trong thí nghiệm là 1:1, 1:2, 1:3 và 1:4. Độ ẩm của chế phẩm là 55 %, giữ chế phẩm ở 34.5 oC trong 5 ngày. Độ ẩm khối lên men là 55 %. Cố định lượng chế phẩm dùng lên men là 3 % khối lượng khối hạt ca cao lên men. 3.5.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme sử dụng để lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Kết quả khảo sát thu được từ hai thí nghiệm trên tiếp tục được sử dụng trong thí nghiệm này. Cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm tối ưu, giữ độ ẩm chế phẩm ở 32 55 %. Độ ẩm khối lên men được giữ ở 55 % trong suốt quá trình lên men. Thay đổi lượng chế phẩm lên men như sau: 0.5 %, 1 %, 3 %, 5 % so với khối lượng hạt ca cao đem lên men. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm của khối lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Áp dụng những kết quả tối ưu thu được từ các thí nghiệm trước đó chúng tôi cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm, lượng chế phẩm sử dụng. Chúng tôi bố trí các mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên men là 5 ngày. 3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và cường độ màu Sử dụng các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cố định các yếu tố sau: giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm lên men, lượng chế phẩm lên men sử dụng và độ ẩm của chế phẩm. Bố trí thí nghiệm lên men các mẫu cacao kết thúc ở các thời điểm: 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, 6 ngày và 7 ngày. 3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên men có bổ sung vi sinh vật Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong việc lên men Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ hộ nông dân Nguyễn Văn Lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Tiến hành qui trình sản xuất bột ca cao trong cùng điều kiện cho cả hai mẫu hạt ca cao nói trên 3.5.2 Phương pháp vi sinh vật 3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống Môi trường PGA pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121 oC trong 15 phút, lấy ra và để nghiêng 45o cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử dụng que cấy móc đã thanh trùng cấy truyền sang môi trường PGA. Giống sau khi cấy được nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 3 ngày sau đó được bảo quản ở 4 oC. Sau 2 tháng phải cấy truyền sang môi trường giữ giống mới. 33 3.5.2.2 Phương pháp nhân giống Cho 10 ml nước cất đã thanh trùng vào ống nghiệm chứa nấm mốc đã cấy chuyền ở trên, dùng que cấy đã thanh trùng cào nhẹ trên mặt thạch để bào tử hòa vào trong nước càng nhiều càng tốt. Sau đó đổ dung dịch đó môi trường bán rắn đã chuẩn bị ở trên, trộn đều, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để sử dụng tiếp. 3.5.3 Phương pháp hóa lý 3.5.3.1 Xác định độ ẩm Sấy khô đĩa petri đến khối lượng không đổi rồi đem cân xác định trọng lượng đĩa (m1). Cân một lượng chính xác 10 g mẫu cần phân tích đựng trên đĩa petri. Đem sấy khô mẫu ở 100-105 oC đến trọng lượng không đổi (m2). Thời gian sấy khô có thể lên đến 3 - 4 giờ. Trong quá trình sấy có thể dùng đũa thủy tinh đảo trộn để nước bốc hơi hết. Sau khi sấy xong đem ra để nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút, sau đó đem cân. Trọng lượng được coi là không đổi khi chênh lệch giữa 2 lần cần kế tiếp không quá 0.03g. Độ ẩm được tính theo công thức: W(%) = (10 – (m2 – m1)) x 100/10 Trong đó: W: độ ẩm của mẫu (%) 10: khối lượng mẫu ban đầu (g) m1: khối lượng đĩa petri (g) m2: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g) m2 – m1: khối lượng mẫu sau khi sấy 3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung dịch ca cao Độ hòa tan trong luận văn này được định nghĩa là lượng chất tan (tính bằng g) có trong 10 g bột ca cao, chỉ tiêu này được xác định bằng khúc xạ kế Cân 10 g bột ca cao cho vào một becher, bổ sung 30 ml nước sôi, lọc lấy dịch giữ lại cặn, thêm 20 ml nước sôi vào cặn trên, lọc lấy dịch. Dung dịch này được đem đi xác định độ hòa tan bằng cách dùng khúc xạ kế. 34 Cũng dung dịch trên được đem đi xác định cường độ màu bằng máy đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp 3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu mạnh nhất Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành 6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp thụ ánh sáng bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng khác nhau. Bước sóng mà cho giá trị hấp thụ cao nhất được xác định là bước sóng để đo độ hấp thụ của dung dịch ca cao. 3.5.4 Phương pháp hóa sinh 3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt cacao i. Phương pháp xác định độ tro của hạt cacao Cân chính xác khoảng 2 – 5 g hạt cacao trong một chén sứ đã biết trọng lượng khô tuyệt đối, cho thêm vào chén sứ 5 giọt HNO3 đậm đặc và 1 – 2 giọt H2O2 30%, cho vào lò nung ở 500 – 550 oC cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn thuốc lá. Lấy chén sứ ra và cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác. Tổng lượng tro được tính như sau: Tổng lượng tro (%) = Trọng lượng tro x 100/ trọng lượng mẫu khô ii. Tổng hữu cơ Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân kiềm hay acid mạnh có tính oxy hoá ở nhiệt độ cao. Các chất hữu cơ bị oxy hoá hoàn toàn chuyển thành CO2 và nước bay ra khỏi chén sứ. Vì thế cách tính tổng hữu cơ như sau: iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%) N tổng số = N protein + N phi protein Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4 Vô cơ hóa Nguyên tắc 35 Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH4)SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác Thực hành : Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H2SO4 đậm đặc và khoảng 0.5 g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành 100 ml với nước cất. Chất xúc tác là hỗn hợp K2SO4 và CuSO4 tỷ lệ 9 : 1 Phương pháp Kieldahl Nguyên tắc : Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng amonium sulfate đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac (NH4)2SO4 + 2NaOH Æ 2NH4OH + Na2SO4 Sau đó lượng amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng cụ máy Parnas- Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H2SO4. Từ đây cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu. Tiến hành Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml H2SO4 N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner, thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào bình tam giác đựng H2SO4 N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu. Tính toán Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức 1 2( ).1, 42. .100( %) V V fN mg w −= 36 Trong đó V1: số ml H2SO4. 0,1N cho vào bình hứng V2: số ml NaOH dùng để chuẩn độ acid dư trong bình hứng f: hệ số điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f=1 khi nồng độ H2SO4 chính xác 0,1 N w: khối lượng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu ứng với thể tích dung dịch lấy mẫu để định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H2SO4 1,42: số mg nitơ iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan Nguyên tắc Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H2SO4. Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc: ¾ Độ sạch dụng cụ ¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H2SO4 ¾ Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun Tiến hành Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg đường Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào. Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rửa sạch 2 - 3 lần bằng rượu nóng 80o Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong nồi cách thủy Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất Thực hiện phản ứng màu Hút 1 ml dung dịch đường cho vào ống nghiệm rồi đổ thêm 1 ml dung dịch phenol 5 %. Sau đó cho chính xác vào ống nghiệm 5 ml H2SO4 đậm đặc. 37 Để 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30 oC để xuất hiện màu. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 490 nm Xây dựng đồ thị mẫu Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung dịch saccharose 0.1% mẫu trên, cho nước cất vào đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H2SO4 như đã nói ở trên. Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose. So màu rồi vẽ đồ thị mẫu. Mẫu thử không với 1ml nước cất thế dung dịch đường v. Phương pháp định lượng cellulose Nguyên tắc Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic Tiến hành Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105 oC), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội, pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml) Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml Rửa bằng ete ethylic Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105 oC đến trọng lượng không đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó cellulose xác định gọi là cellulose thô Tính kết quả Hàm lượng cellulose tính bằng công thức sau 38 .100aX w = Trong đó X: hàm lượng cellulose tính bằng % a: trọng lượng cellulose (g) w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) 100: hệ số chuyển thành % vi. Phương pháp định lượng pectin Nguyên tắc Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa Tiến hành Cân 0.15 g mẫu hạt cacao có chứa pectin vào becher 100 ml Cho thêm 100 ml NaOH 0,1 N Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành acid pectic Thêm 50 ml dung dịch CH3COOH Sau 5 phút thêm 50 ml dung dịch CH3COOH Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tro đã được sấy khô tới trọng lượng không đổi Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa (thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 % không có kết tủa trắng) Sau khi rửa xong cho giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105 oC cho đến khi trọng lượng không đổi Tính kết quả Hàm lượng của canxi pectat bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và giấy lọc không Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau: .0,92.100wP B = Trong đó w: trọng lượng kết tủa canxi pectat (g) 39 B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g) 0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm 92 % trọng lượng canxi pectat) 100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %. 3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy tinh trong môi trường lạnh 4 oC để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày. ii. Xác định hoạt tính CMCase Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose) bằng enzyme ở pH 5.0 và 40 oC. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Cách thực hiện Phản ứng enzyme Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40 oC trong 10 phút Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng enzyme. Để tránh bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AT) Phản ứng thử không Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40 oC trong 5 phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút. 40 Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều. Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều Để tránh sự bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút. Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa nước lạnh. Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (AB) Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút. Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (AG) Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng nước cất. Đo OD 540 nm (AW) Tính toán Tính hệ số glucose Hệ số glucose được tính bằng công thức ( /G G W C mg mlF A A = − ) Trong đó F: hệ số glucose CG: nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml) AG: độ hấp thụ OD của dung dịch glucose chuẩn AW: độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất Xác định hoạt tính enzyme Sử dụng công thức sau: 1000 1 1 1( / ) ( ). . . . . 180 10 1T B CMCase u g A A F phut ml C = − 41 Trong đó AT: độ hấp thu OD của dung dịch phản ứng enzyme AB: độ hấp thu OD của phản ứng thử không F: hệ số glucose (mg/ml) 1000: chuyển từ mg sang μg 180: trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ μg sang μmol 10 phút: thời gian phản ứng C: nồng độ dung dịch mẫu (g/ml) iii. Xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp so màu Nguyên tắc Xác định lượng galacturonic acid là sản phẩm của quá trình thủy phân pectin dưới tác dụng của pectinase không kết tủa bằng ZnSO4 Cách tiến hành Cho 20 ml dung dịch pectin 1 % vào ống nghiệm rồi tiếp theo cho 10 ml dung dịch enzyme 1 %, lắc đều và cho vào tủ ấm ở 30 oC (dung dịch pectin có pH = 3,9 – 4,1). Sau 60 phút lấy ra thêm vào 2 ml ZnSO4 15 %, đem lọc qua giấy lọc, dung dịch lọc được đem pha loãng gấp 5 lần dùng cho phản ứng với Antron Lấy 5 ml Antron cho vào ống nghiệm, rồi cho 2.5 ml dung dịch lọc đã pha loãng, lắc mạnh trong thời gian 10 phút. Sau đó đặt trong nồi cách thủy ở 70 oC trong thời gian 12 phút. Sau đó lấy ra làm nguội đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo giá trị OD ở bước sóng 584 nm. Tính kết quả Hoạt tính pectinase được tính bằng công thức 0,340. 0,0104ODDVHT m −= Trong đó OD: mật độ quang của dung dịch sau khi phản ứng với antron m: lượng enzyme lấy tiến hành phản ứng (g hoặc ml) 42 3.5.5 Qui trình sản xuất bột ca cao trong phòng thí nghiệm Rửa sạch Sấy khô Làm nguội Hạt ca cao tươi Ủ Chế phẩm sinh học Sấy khô Loại hạt lép, sâu Rang, 20’, t = 140oC Tách vỏ Đập nhỏ hạt nhân Kiềm hóa bằng dd Na2CO3 3%, 80oC, 45’ Xay nhuyễn Ép bơ bằng máy ép thủy lực Xay nhuyễn ở nhiệt độ lạnh Bột ca cao 43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 XÁC ĐỊNH CÁC THÀNH PHẦN CHỦ YẾU CỦA HẠT CA CAO Bảng 4.1: Các thành phần chủ yếu có trong hạt ca cao tươi STT Thành phần Phần trăm so với khối lượng Chất nhầy Hạt nhân 1 Độ pH 3.5 4.5 2 Đường tổng số hòa tan (%) 14 1.6 3 Hàm lượng đường khử (%) 9 4 Hàm lượng pectin (%) 9.568 11 5 Hàm lượng tro (%) 2.2 3 6 Tổng lượng hữu cơ (%) 97.78 97 7 Nitơ tổng % 2.26 8 Hàm lượng cellulose (%) 1.89 16 (nguồn từ kết quả thực nghiệm) Nhận xét Từ các số liệu thu thập được, chúng tôi nhận thấy rằng chất hữu cơ là một thành phần chiếm chủ yếu trong hạt ca cao. Trong đó, ở cả lớp nhầy và hạt nhân chúng tôi đều nhận thấy thành phần pectin và cellulose chiếm một tỷ lệ khá lớn. Ở lớp nhầy hàm lượng pectin và cellulose tương ứng là 9.568 % và 1.89 %. Còn trong phần hạt nhân tỷ lệ là 11 % pectin và 16 % cellulose. Cellulose và pectin là những thành phần rất bền và khó phân giải nếu chỉ sử dụng các tác nhân hóa học, nhiệt độ hay cơ học… Trong tế bào thực vật, cellulose và pectin phân bố chủ yếu ở lớp vỏ tế bào. Do khả năng khó bị phá vỡ nên chúng cản trở những thành phần hòa tan có trong tế bào chiết ra môi trường bên ngoài. Chính những thành phần hòa tan này mới dễ được cơ thể hấp thụ và sử dụng. Vì vậy để tăng khả năng hòa tan của bột ca cao cần phải phá vỡ những cấu 44 trúc pectin và cellulose bền vững bằng phương pháp sinh học. Chúng tôi chọn nấm mốc Aspergillus niger là loại vi sinh vật có khả năng tạo enzyme cellulase, pectinase cao và đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm để bổ sung vào quá trình lên men. 4.2 TUYỀN CHỌN GIỐNG VI SINH VẬT THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN HẠT CA CAO Chúng tôi tiến hành so sánh dựa trên hai giống nấm mốc được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên và tại phòng thí nghiệm công nghê sinh học trường Đại học Bách khoa. Nuôi hai giống Asp. niger trong cùng một điều kiện môi trường có 9 % cà rốt, trấu 15 %, cám 75 %, và 1% (NH4)SO4, độ ẩm 64 %, thời gian 48 giờ. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Bảng 4.2:So sánh hoạt tính enzyme cellulase và pectinase do hai giống Asp. niger lấy từ trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên và Đại Học Bách Khoa tạo ra Giống Asp. niger Bách Khoa Asp. niger Tự Nhiên Hoạt tính cellulase 2.3 UI/g MT 1.9 UI/g MT Hoạt tính pectinase 650 đvht/g MT 600 đvht/g MT (nguồn từ thực nghiệm) Nhận xét Mục đích của việc tuyển chọn là chọn ra giống Asp. niger có khả năng tạo enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao nhất. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy rằng giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa cho enzyme cellulase và pectinase có hoạt tính cao hơn hẳn so với giống Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đai học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh. Được biết giống Asp. niger của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp.HCM là giống nấm mốc đã được tuyển chọn không sinh độc tố thích hợp cho việc sử dụng trong công nghệ thực phẩm. Chúng tôi quyết 45 định chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa để lên men trong các thí nghiệm tiếp theo. 4.3 ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ GIỮA GIỐNG VI SINH VẬT VỚI BỘT MÌ RANG ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Chúng tôi sử dụng giống Asp. niger được lấy từ Bộ môn Công nghệ sinh học Đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh trong thí nghiệm này. Tiến hành cùng lúc 4 thí nghiệm như đã nêu ở phần 3.5.1.2. 4.3.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến độ hòa tan Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Độ hòa tan 2.4 2.5 2.8 2.5 2.4 2.5 2.8 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 1\1 1\2 1\3 1\4 Tỷ lệ giống/bột mì rang Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến độ hòa tan 46 Nhận xét Trong quá trình phát triển nấm Aspergillus niger tiết ra các enzyme như cellulase, pectinase phá vỡ cấu trúc cellulose và pectin trong hạt cacao nên những chất tan có trong hạt cacao có khả năng tan vào dung dịch dễ dàng hơn. Do đó độ hòa tan tỷ lệ thuận với khả năng phân giải của enzyme cellulase và pectinase. Một trong các yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự tiết enzyme là thành phần môi trường dinh dưỡng. Bột mì rang được trộn chung với Asp. niger có tác dụng như là một nguồn dinh dưỡng giúp cho sự phát triển của nấm mốc. Trong bột mì có nhiều thành phần thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm mốc. Áp lực về nồng độ cơ chất lên nấm mốc sẽ điều chỉnh lượng enzyme tiết ra nhiều hay ít. Tuy nhiên, không phải cứ tăng hàm lượng cơ chất thì sự sinh tổng hợp enzyme cũng tăng theo, mà khi đến một ngưỡng nhất định thì sự tổng hợp enzyme không thể tăng nữa. Sự tổng hợp enzyme tùy thuộc vào năng lực tiết đối đa của từng loại vi sinh vật, mỗi loài có một ngưỡng nhất định. Ngoài ra nếu tăng hàm lượng cơ chất vượt quá một giới hạn nhất định thì hoạt tính enzyme sẽ giảm do hai lý do, thứ nhất cơ chất tạo áp lực làm giảm quá trình sinh tổng hợp; thứ hai cơ chất tăng trong khi năng lực tiết tối đa không đổi làm hoạt tính enzyme giảm. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang tối ưu nhất để tăng độ hòa tan của cacao là 1:3. 4.3.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.4: Ảnh hưởng của tỷ lệ giữa giống vi sinh vật với bột mì rang đến cường độ màu Tỷ lệ giống : bột mì rang 1:1 1:2 1:3 1:4 Cường độ màu 1.98 2.134 2.229 2.028 47 1.98 2.056 2.229 2.028 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 1/2 1/3 1/4 Tỷ lệ giống/bột mì rang C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống/bột mì rang đến cường độ màu Nhận xét Từ những khảo sát thực tế (như đã nêu ở mục 3.5.3.3) chúng tôi đã xác định được dung dịch ca cao hấp thụ bước sóng 390 nm cao nhất. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng bước sóng 390 nm để xác định cường độ màu của dung dịch ca cao. Màu của dung dịch lọc từ bột ca cao là do các chất hòa tan tạo thành. Do đó cường độ màu của dung dịch ca cao càng cao thì độ hòa tan càng nhiều và ngược lại. Trong thí nghiệm này chúng tôi xác định được cường độ màu của dung dịch ca cao cao nhất ở tỷ lệ 3 bột mì rang : 1 giống Asp. niger 4.4 ẢNH HƯỞNG CỦA LƯỢNG CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG ĐỂ LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Dựa vào kết quả thu được từ thí nghiệm trên chúng tôi chọn tỷ lệ 3 bột mì rang / 1 giống Asp. niger để tạo chế phẩm enzyme. Thí nghiệm được thiết kế như đã nêu ở phần 3.5.1.3. 48 4.4.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.5: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Lượng chế phẩm sinh học (%) 0.5 1 3 5 Độ hòa tan 3.0 3.4 3.1 2.8 3 3.4 3.1 2.8 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học Đ ộ hò a ta n Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến độ hòa tan Nhận xét Độ hòa tan của dung dịch là lượng chất hòa tan có trong dung dịch đó. Tỷ lệ chế phẩm cho vào càng nhiều thì khả năng phân giải các chất phức tạp càng cao. Khi đó các chất hòa tan càng dễ chiết ra khỏi ca cao để hòa tan vào dung dịch. Tuy nhiên không phải càng nhiều chế phẩm thì lượng chất hòa tan càng tạo ra nhiều. Vi sinh vật cần có đủ lượng cơ chất cần thiết để phát triển. Vì vậy nếu bổ sung lượng chế phẩm sinh học quá lớn thì nhu cầu về cơ chất của nấm mốc càng cao. Khi đó nấm mốc sẽ sử dụng những chất hòa tan để tiếp tục phát triển, làm cho độ hòa tan giảm đi. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận thấy ở tỷ lệ 0.5% chế phẩm lượng chế phẩm còn ít nên khả năng phân giải không cao dẫn đến tỷ lệ hòa tan thấp. Ở tỷ lệ 1% chế phẩm trên tổng lượng ca cao lên men cho kết quả độ hòa tan cao nhất. Những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3%, và 5% đều cho kết quả là độ hòa tan giảm mạnh. 49 4.4.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.6: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm sinh học đến cường độ màu Lượng chế phẩm sinh học 0.5 % 1 % 3 % 5 % Cường độ màu 2.163 2.178 2.148 2.174 2.163 2.306 2.248 2.204 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0.5% 1% 3% 5% Lượng chế phẩm sinh học C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của lượng chế phẩm đến cường độ màu Nhận xét Những chất chiết hòa tan tạo ra màu sắc của dịch ca cao. Lượng chất hòa tan trong dung dịch càng cao thì cường độ màu khi đo càng lớn. Trong thí nghiệm này chúng tôi nhận ra rằng khi lượng chế phẩm sử dụng ở mức 0,5 %, khả năng phân giải của nấm mốc không cao nên lượng chất tan sinh ra không nhiều, cường độ màu cũng ở mức thấp. Lượng chất tan thu được ở tỷ lệ chế phẩm 1% là cao nhất 2,178 kéo theo cường độ màu đạt được ở mức cao nhất. Ở những tỷ lệ chế phẩm cao hơn 3% và 5% khi nhu cầu cơ chất của nấm mốc tăng cao, nấm mốc phải sử dụng những chiết chất hòa tan do đó lượng chiết chất hòa tan trong dung dịch giảm xuống rõ rệt do đó cường độ màu cũng giảm theo tỷ lệ thuận. 50 4.5 ẢNH HƯỞNG CỦA ĐỘ ẨM KHỐI LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Từ kết quả đạt được ở những thí nghiệm trước chúng tôi chọn giống Asp. niger của trường Đại học Bách Khoa, tỷ lệ giống vi sinh vật / bột mì rang là 1:3 để tạo chế phẩm sinh học, lượng chế phẩm sử dụng để lên men là 1 % khối lên men để áp dụng cho thí nghiệm này. Thí nghiệm được thiết kế như đã đề cập ở mục 3.5.1.4 4.5.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.7: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Độ ẩm khối lên men 50% 55% 60% 65% Độ hòa tan 2.8 3.3 3.8 3.5 2.8 3.3 3.8 3.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50% 55% 60% 65% Độ ẩm khối lên men Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.5: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến độ hòa tan Nhận xét Hầu như các quá trình sống của nấm đều có liên quan đến nước do đó độ ẩm là một yếu tố quan trọng của môi trường. Nếu độ ẩm quá thấp tức lượng nước trong môi trường thấp thì xảy ra hiện tượng loại nước ra khỏi tế bào nấm mốc làm tế bào bị chết. Nhưng nếu độ ẩm quá cao thì cũng không tốt cho sự sinh trưởng và phát triển. Chỉ ở 51 một độ ẩm nhất định, khi đó hoạt động trao đổi chất diễn ra tốt nhất thì sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc mới diễn ra tốt nhất. Sự sinh trưởng và phát triển mạnh thể hiện qua việc tiết ra một lượng lớn enzyme ngoại bào để phân giải cơ chất. Chúng tôi đã xác định độ ẩm của khối lên men 60% thì độ hòa tan của bột ca cao là cao nhất. 4.5.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu. Bảng 4.8: Ảnh hưởng của khối lên men đến cường độ màu Độ ẩm khối lên men 50% 55% 60% 65% Cường độ màu 2.232 2.286 2.349 2.304 2.23 2.264 2.349 2.289 0 0.5 1 1.5 2 2.5 50% 55% 60% 65% Độ ẩm khối lên men C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.6: Ảnh hưởng của độ ẩm khối lên men đến cường độ màu Nhận xét Cũng như các trường hợp trên, chúng tôi nhận thấy rằng cường độ màu của dung dịch ca cao tỷ lệ với độ hòa tan. Lượng chất hòa tan càng cao thì cường độ màu của dung dịch càng cao và ngược lại. Trong thí nghiệm này chúng tôi ghi nhận ở độ ẩm 50% cường độ màu là 2.232, ở độ ẩm 55% cường độ màu là 2.286, ở độ ẩm 60% cường độ màu là 2.349 đây là giá trị cao nhất đạt được, còn ở độ ẩm 65% cường độ màu giảm xuống còn 2.304. 52 4.6 ẢNH HƯỞNG CỦA THỜI GIAN LÊN MEN ĐẾN ĐỘ HÒA TAN, CƯỜNG ĐỘ MÀU CỦA BỘT CA CAO Sau khi đã xác định được một số điều kiện tối ưu cho quá trình lên men như giống Asp. niger Bách Khoa, tỷ lệ giống / bột mì rang là 1:3, độ ẩm chế phẩm 60%, lượng chế phẩm sử dụng là 1 % lượng hạt lên men. Chúng tôi sử dụng các kết quả trên cho thí nghiệm này. Thí nghiệm được bố trí như đã nêu ở mục 3.5.1.6 4.6.1 Ảnh hưởng đến độ hòa tan Bảng 4.9: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan Thời gian lên men 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ 168 giờ Độ hòa tan 3.8 4.2 3.9 3.6 3.3 3.8 4.2 3.9 3.6 3.3 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 72 96 120 144 168 Thời gian lên men (giờ) Đ ộ h òa ta n Đồ thị 4.7: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan Nhận xét Nấm mốc khi được cấy vào môi trường không có nghĩa chúng tiết ngay ra enzyme. Trong giai đoạn đầu, nấm mốc từ môi trường chế phẩm chuyển sang môi trường sản xuất chưa kịp thích ứng với môi trường mới, nấm mốc phát triển chưa nhiều nên chưa sử dụng hết những chất đơn giản trong ca cao để sinh trưởng, hơn nữa 53 lượng enzyme ngoại bào trong chế phẩm ít nên sử dụng chưa nhiều những chất phức tạp như pectin, cellulose trong hạt ca cao. Thêm vào đó thời gian đầu lớp chất nhầy bao quanh hạt ca cao còn dầy nên những enzyme chưa thể xâm nhập để phá vỡ những cấu trúc cellulose, pectin bên trong hạt ca cao được. Theo quan sát của chúng tôi trong hai ngày đầu lớp chất nhầy còn bám nhiều, đến ngày thứ 3 lớp chất nhầy hầu như bị loại bỏ và nấm mốc bắt đầu phát triển. Sau khi lớp nhầy bị loại bỏ, nấm mốc phát triển mạnh nhu cầu về nguồn cơ chất tăng cao nấm mốc phải tiết enzyme để phân hủy các chất phức tạp. Khi những cấu trúc phức tạp cellulose và pectin bị phá hủy, những chất hòa tan có thể dễ dàng hòa tan vào môi trường. Tuy nhiên không phải thời gian càng dài thì độ hòa tan càng cao. Khi nấm mốc phát triển mạnh, áp lực về cơ chất càng cao do đó nấm mốc phải sử dụng ngược lại những chất hòa tan làm độ tan giảm đi. Độ hòa tan đo được khi lấy mẫu ở 72 giờ là 3.8. Đến 96 giờ độ hòa tan đạt được giá trị cao nhất 4.2 sau đó ở các thời điểm 120, 144, 168 giờ độ hòa tan giảm dần. 4.6.2 Ảnh hưởng đến cường độ màu Bảng 4.10: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu Thời gian lên men 72 giờ 96 giờ 120 giờ 144 giờ 168 giờ Cường độ màu 2.356 2.401 2.372 2.298 2.277 2.356 2.401 2.372 2.298 2.277 0 0.5 1 1.5 2 2.5 72 96 120 144 168 Thời gian lên men (giờ) C ư ờ ng đ ộ m àu Đồ thị 4.8: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến cường độ màu 54 Nhận xét Cũng như các thí nghiệm trước, độ hòa tan của dung dịch ca cao vẫn tỷ lệ với độ hòa tan. Trong 72 giờ đầu khi lớp nhầy bao quanh hạt còn nhiều lượng chất tan ít cường độ màu đo được chỉ 2,356. Nhưng sau 96 giờ, độ hòa tan cao nhất thì cường độ màu đạt được cũng ở giá trị cao nhất 2,401. Ở những thời điểm 120,144, 168 giờ lượng chất hòa tan giảm dần do sự tái sử dụng những chất hòa tan, lượng chất chất giảm dần do đó cường độ màu mà chúng tôi xác định được tương ứng 2,372; 2,298; 2,277. 4.7 SO SÁNH ĐỘ HÒA TAN VÀ CƯỜNG ĐỘ MÀU GIỮA BỘT CA CAO ĐƯỢC LÊN MEN CÓ VÀ KHÔNG BỔ SUNG VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN Ứng dụng những điều kiện tối ưu đã xác định trong quá trình lên men hạt ca cao. Hai mẫu ca cao lên men có và không bổ sung vi sinh vật được sản xuất tạo ra bột ca cao trong cùng điều kiện như nhau Bảng 4.11: So sánh độ hòa tan và cường độ màu của hai mẫu ca cao có và không bổ sung vi sinh vật trong quá trình lên men Mẫu ca cao Có bổ sung vi sinh vật Không bổ sung vi sinh vật Độ hòa tan 4.3 2.1 Cường độ màu 2.409 1.568 Nhận xét Như chúng tôi đã kết luận trong thí nghiệm đầu tiên, hàm lượng cellulose và pectin trong hạt ca cao tươi rất cao. Hai thành phần này lại rất bền vững và khó phân giải bằng các tác nhân nhiệt độ, cơ, hóa học…Các thành phần này sẽ cản trở những chất hòa tan trong tế bào chiết ra ngoài môi trường. Do đó, ở mẫu lên men không bổ sung vi sinh vật chúng tôi nhận thấy độ hòa tan và cường độ màu không cao chỉ ở mức 2.1 và 1.568. Ở mẫu lên men có bổ sung Asp. niger trong quá trình lên men đã tối ưu 55 chúng tôi thu được kết quả rất khả quan ở cả hai chỉ tiêu độ hòa tan và cường độ màu. Giá trị độ hòa tan và cường độ màu lần lượt đạt 4.3 và 2.409. Điều này cũng dễ hiểu do Asp. niger là loại nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase và pectinase cao. Do đó cấu trúc pectin và cellulose dễ dàng bị phân hủy bằng phương pháp sinh học. 56 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1. Hàm lượng cellulose và pectin chiếm tỷ lệ lớn trong thành phần của hạt ca cao tươi. Hai thành phần bền, khó phân giải này sẽ cản trở những chất hòa tan trong bột ca cao chiết ra môi trường bên ngoài. Chúng tôi sử dụng nấm Asp. niger là loại nấm mốc có khả năng sinh cellulase và pectinase cao bổ sung vào quá trình lên men để tăng khả năng phân giải cellulose và pectin. 2. Từ kết quả thực nghiệm chúng tôi xác định rằng giống nấm mốc Asp. niger được lấy từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh là thích hợp nhất cho mục đích phân giải cellulose và pectin để gia tăng lượng chiết chất hòa tan 3. Chúng tôi đã hoàn thành mục tiêu đề ra là xác định điều kiện tối ưu nhất cho quá trình lên men có bổ sung vi sinh vật. Cụ thể chế phẩm sinh học có tỷ lệ giống Asp. niger : bột mì rang là 1 :3; độ ẩm tối ưu khối lên men là 60 %; lượng chế phẩm sử dụng lên men chiếm 1 % khối lượng hạt lên men; thời gian lên men kéo dài 96 giờ. 4. Kết quả khi đem so sánh hai chỉ tiêu độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao lên men có sử dụng vi sinh vật và bột ca cao lên men không sửng dụng vi sinh vật chúng tôi nhận thấy việc bổ sung vi sinh vật cho kết quả cao hơn hẳn. 5.2 KIẾN NGHỊ Đề tài mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá độ hòa tan của bột ca cao khi lên men bổ sung nấm mốc Asp. niger Thử nghiệm một số loại vi sinh vật khác để tăng hiệu quả của việc lên men. Tiến hành cảm quan chất lượng ca cao theo nhiều chỉ tiêu để có đánh giá chung nhất chất lượng sản phẩm cuối cùng của ca cao lên men. 57 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Trần Lam Điền, 2002. Bước đầu nghiên cứu công nghệ chế biến cacao bằng phương pháp ủ đống. Khoá luận tốt nghiệp Kỹ Sư Nông Học, Đại Học Nông Lâm TP.HCM. 51 trang 2. Vương Thị Việt Hoa, 2002 - 2003. Thực tập vi sinh vật đại cương. Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 3. Nguyễn Đức Lượng và Cao Cường, 2003. Thí nghiệm công nghệ sinh học: Thí nghiệm hóa sinh. Tập 1. NXB Đại học quốc gia Tp HCM, Tp HCM. 183 trang. 4. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh học, tập 1, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 5. Nguyễn Đức Lượng, 2002. Công nghệ vi sinh học, tập 2, Vi sinh vật học công nghiệp. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 6. Lê Hồng Phú, 2003. Nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme pectinase và cellulase từ Aspergillus niger và ứng dụng để xử lý vỏ cà phê trong sản xuất phân hữu cơ. Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Bách Khoa, Tp HCM. Việt Nam. 7. Phạm Hồng Đức Phước, 2004. Kỹ thuật trồng ca cao ở Việt Nam.