Khóa luận Bước đầu hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền cây mắm trắng (avicenni alba) tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******************* BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH Niên khóa: 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8 / 2007 iii LỜI CẢM TẠ  Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ. Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay. Em xin gởi lòng biết ơn đến:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.  Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.  Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng kỹ thuật. đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này. Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới. Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này. Xin chân thành cảm ơn ! NGUYỄN PHƢỚC DOANH iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD” đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt động khai thác của con ngƣời, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến lƣợc tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái. Những kết quả đạt đƣợc:  Thu đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.  Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.  Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng, trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thƣớc 450 bp, 390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thƣớc 200bp.  Kết quả thực hiện phản ứng RAPD đƣợc xử lý trên mần mềm NTSYS thu đƣợc cây phân loài của những cây đem phân tích. Cây phân loài cho thấy chỉ số đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng trong thời gian tới. v SUMMARY NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA USING RAPD”. This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment Center, Nong Lam university from April to August 2007. Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However, over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic information for establishing the strategies for conserving and recovering biodeversity of the ecosystem. The obtained results were:  Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.  The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.  The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps, 300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).  A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in 14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed. vi MỤC LỤC ĐỀ MỤC TRANG LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii TÓM TẮT KHÓA LUẬN ......................................................................................... iv SUMMARY ................................................................................................................ v MỤC LỤC .................................................................................................................. vi DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... ix DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... xi Phần 1. GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2 1.4. Giới hạn của đề tài ............................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3 2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ...................................................... 3 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên ............................................................................................ 3 2.1.2. Cấu trúc ............................................................................................................ 6 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................... 7 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển .................................................................... 9 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................... 9 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) ................................................. 10 2.2.1. Vùng phân bố ................................................................................................. 10 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng ......................................................................... 11 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng .................................................................. 13 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ ....................... 13 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng .............................................. 14 vii 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền ......................................................................... 14 2.3.1. Đa dạng sinh học ............................................................................................ 14 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học .......................................... 14 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................ 15 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái ..................................................................................... 15 2.3.3.2. Đa dạng loài ................................................................................................. 15 2.3.3.3. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 16 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam ........................................................ 17 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật ............................................................. 18 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 19 2.5.1 Khái niệm ........................................................................................................ 19 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR .............................. 19 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 20 2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR .......................................................................... 21 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................. 21 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền .................... 22 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .............................................. 22 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR ........................................................................................ 23 2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ............................... 23 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) .......................................... 24 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 25 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................................ 30 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................................... 33 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................... 33 3.1.1. Thời gian tiến hành ......................................................................................... 33 3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33 3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 33 3.2.1. Mẫu thực vật.................................................................................................... 33 viii 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 34 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA ............................................................... 34 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA ............................................................. 35 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD .............................................. 36 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 36 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 37 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 37 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích ........................................................................ 39 3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel ...................... 39 3.3.2.2. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế ............................................ 39 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD ............................................................................... 40 3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 ..................................... 42 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 43 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ............... 43 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu ........................................................................ 44 4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số ............................................................. 44 4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD .................................................... 47 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 ....................................................................................... 47 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................................... 50 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ .......................................................................................................... 50 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 54 5.1. Kết luận .............................................................................................................. 54 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56 PHỤ LỤC ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ................... 40 Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 40 Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ................ 41 Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 41 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 ............................................................ 47 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 5 Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. ................................. 11 Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. ......................................................................... 12 Hình 2.4. Trái mắm trắng. ......................................................................................... 12 Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. ..................................................... 20 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI .................................................... 26 Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. ...................................... 26 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. .......................... 27 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. ................................. 28 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP ................................................... 29 Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR ........................ 30 Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ ......................... 43 Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 ........................................ 45 Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. .............................................................. 45 Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu ....................................................... 46 Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 ............................................................... 46 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 48 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 48 Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) .............................................................................................. 49 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng ............................... 50 Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng ....................................... 51 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích ......................... 52 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT  µl: microlite  µM: micromol/lite  bp: base pair  cm: centimét  CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide  DNA: Deoxyribonucleic acid  dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate  Kb: kilobases  mM: milimol/lite  m: mét  nm: nanomét  OD: Optical density.  PCR: Polymerase chain reaction  pmol: picomol  RNA: Ribonucleic acid  Rnase: Ribonuclease  SSR: Single sequence repeat  Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)  TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid  TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)  Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)  U: Đơn vị hoạt tính của enzyme 1 Phần 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển trên Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lƣu quốc tế. Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ. Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ. Quần thể mắm trắng tại đây chủ yếu là phát triển tự nhiên. Tuy nhiên, qua thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu hẹp trƣớc sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng. Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng. Đáp ứng yêu cầu đó, đƣợc sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, và dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: 2 “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”. 1.2. Mục đích  Tối ƣu hóa quy trình ly trích DNA và bƣớc đầu hoàn thiện quy trình thực hiện phản ứng RAPD thích hợp cho cây mắm trắng.  Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ. 1.3. Yêu cầu  Thu thập đƣợc nhiều mẫu đặc trƣng, mang tính đại diện cao cho quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, chú ý đến những mẫu đặc biệt, cá biệt trong quần thể, ghi nhận tọa độ chính xác của mỗi cá thể.  Ly trích thành công DNA từ các mẫu đã thu đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch và số lƣợng cho các phân tích tiếp theo.  Thiết lập quy trình RAPD - PCR trên cây mắm trắng cho độ tin cậy cao. 1.4. Giới hạn của đề tài  Số lƣợng các primer đƣợc sử dụng còn bị hạn chế.  Chƣa có điều kiện khảo sát quần thể mắm trắng với số lƣợng mẫu lớn.  Việc tìm kiếm những cá thể đặc biệt bị giới hạn do điều kiện đi lại trong rừng gặp nhiều khó khăn.  Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian ngắn, từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007, do đó chƣa phản ánh đúng đắn và chính xác với tất cả các giống hiện có. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ 2.1.1. Đặc điểm tự nhiên Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm trên địa bàn huyện Cần Giờ, một huyện ngoại thành của TP Hồ Chí Minh, nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông Đồng Nai, là cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km. Đây là khu dự trữ sinh quyển mang đặc điểm của hệ sinh thái cửa sông ven biển, hệ động thực vật đặc trƣng cho hệ sinh thái rừng ngập mặn. Vùng rừng ngập mặn bị chia cắt bởi hệ thống sông rạch dày đặc gồm sông lớn nhƣ Lòng Tàu nằm giữa khu rừng (đƣờng thủy ra vào cảng Sài Gòn), sông Đồng Tranh, sông Nhà Bè, sông Thị Vải, sông Gò Gia, và nhiều rạch khác [19]. Trƣớc năm 1960, rừng ngập mặn Cần Giờ (có tên gọi thông thƣờng là Rừng Sác) có tới hơn 40.000 ha cây rừng, đƣợc xếp hạng rừng giàu. Rừng có cấu trúc dày đặc với tán rừng dày, cao trên 25 m, đƣờng kính 25 – 40 cm, là sinh cảnh của nhiều động vật hoang dã. Trong rừng, đƣớc (Rhizophora apiculata) là loài chiếm ƣu thế, bên cạnh các quần thể khác nhƣ bần đắng (Sonneratia alba), mắm trắng (Avicennia alba), đƣng (R. mucronata), vẹt (Bruguiera spp.), xu (Xylocarpus spp), cóc (Lumnitzera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria agallocha) [5], [19]. Trong suốt thời gian chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ là đối tƣợng tàn phá của nhiều phƣơng tiện chiến tranh, đặc biệt bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do chất độc hóa học, liên tục từ năm 1961 đến năm 1971, hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ biến mất. Một số ít cây dà (Ceriops spp), giá (Excoecaria agallocha) ven bờ kênh rạch tái sinh theo từng cụm nhỏ, nơi đất ngập triều có mắm, trên đất cao có chà là nƣớc (Phoenix paludosa) và các loài ráng đại (Acrostichum aureum), dây mủ (Gymnanthera mitida), cóc kèn 4 (Derris trifoliata), chùm lé (Azima sarmentosa), lức (Pluchea indica), chùm gọng (Clerodendrum inerme) [5]. Sau giải phóng, một chƣơng trình lớn đƣợc thực hiện: khôi phục rừng ngập mặn Cần Giờ vì yêu cầu cấp bách khắc phục hậu quả nghiêm trọng đối với môi trƣờng TP Hồ Chí Minh do chiến tranh hóa học gây ra. Từ năm 1967 đến nay, công việc tái tạo rừng đƣợc thực hiện mạnh mẽ. Đến nay diện tích rừng ngập mặn Cần Giờ vào khoảng 38.000 ha. Sau hơn 30 năm bảo tồn và phát triển, rừng ngập mặn Cần Giờ vinh hạnh đƣợc UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển với tên chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh và tên ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ [19], [21]. Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có tọa độ địa lý và các đặc điểm nhƣ sau:  Vĩ độ Bắc: 10o22’14” – 10o37’39”  Kinh độ Đông: 106o46’12” – 107o00’59”  Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000.  Tổng diện tích: 71.370 ha, chiếm tới 1/3 diện tích đất đai toàn TP Hồ Chí Minh. Trong đó diện tích rừng và đất liền là 38.664 ha (chiếm khoảng 54,2%).  Dân số: 57.650 ngƣời (nguồn thống kê tháng 7/1999 của huyện Cần Giờ), với 40% số hộ thuộc diện xóa đói giảm nghèo, sống chủ yếu dựa vào khai thác tài nguyên rừng [5], [8], [19]. 5 Hình 2.1. Bản đồ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Ghi chú: Vùng lõi Vùng đệm Vùng chuyển tiếp 6 2.1.2. Cấu trúc Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp [5]. Vùng lõi (4.721 ha): đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn, gồm các tiểu khu rừng số 4b, 6, 11, 12 và 13. Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động của con ngƣời và có các chức năng chính nhƣ sau:  Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.  Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.  Bảo tồn hệ thống thuỷ vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.  Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn [5]. Vùng đệm (37.339 ha): tiếp giáp với vùng lõi, là nơi có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn trong vùng lõi, bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 3, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng trong bảo tồn vùng lõi. Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng Sác, thăm vƣờn chim, vƣờn cò, vƣờn dơi sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ngƣời dân, nâng cao ý thức và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển. Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã nhƣ khỉ, rái cá, kỳ đà kiếm ăn. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung 7 vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm [5]. Vùng chuyển tiếp (29.310 ha): gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp, thuỷ sản của dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ. Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng, tạo điều kiện thuận lợi và đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng [5]. 2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu dự trữ sinh quyển thế giới đầu tiện tại Việt Nam, và là thành viên thứ 368 của mạng dự trữ sinh quyển quốc tế thuộc 97 quốc gia. Đến tháng 7/2002, Rừng ngập mặn Cần Giờ tiếp tục đƣợc Tổ chức Du lịch thế giới (World Tourism Organization) công nhận là Khu du lịch Sinh thái bền vững nhất (là 1 trong 65 khu đƣợc thế giới công nhận). Theo Ủy ban Quốc gia Con ngƣời và Sinh quyển Việt Nam (MAB), rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là khu rừng phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á, đặc biệt là còn rất ít trên thế giới [5], [19]. Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều loài hải sản, chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ, trên cạn [19]. Rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về số loài thực vật di cƣ. Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35 loài thực vật, phổ biến là đƣớc đôi (Rhizophora apiculata), đƣng (Rhizophora mucronata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans) [19]. 8 Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại nhanh chóng ở nơi đây nhƣ khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá, trong đó có nhiều loài đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam nhƣ Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa. Đặc biệt, nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các sân chim tự nhiên đã và đang hình thành trở lại với số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nƣớc ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài quí hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới. Động vật không xƣơng sống thủy sinh ở rừng ngập mặn Cần Giờ có hơn 700 loài, đặc biệt những loài giáp xác, nhuyễn thể có giá trị kinh tế cao. Trong rừng Cần Giờ có 137 loài cá, 40 loài lƣỡng thể và bò sát, 130 loài chim, 19 loài thú. Rừng ngập mặn thực sự là cầu nối giữa hệ sinh thái thủy vực và hệ sinh thái trên cạn, giữa hệ sinh thái ngập triều và hệ sinh thái ngập nƣớc lợ và lũ sông nƣớc ngọt [19]. Bên cạnh những giá trị về đa dạng sinh học, Cần Giờ còn là nơi lần đầu tiên ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á phát hiện khu mộ cổ chum (trên 300 ngôi), di chỉ có giá trị về nền văn hoá Óc Eo [19]. Ngoài ra, lịch sử phát triển Cần Giờ còn gắn liền với tên tuổi Nguyễn Huệ (chiến thắng trên sông Soài Rạp), Nguyễn Lữ, Trƣơng Định và những chiến công của quân dân trong thời kỳ kháng chiến chống ngoại xâm trong chiến khu Rừng Sác [19]. Những giá trị văn hoá bản địa của cộng đồng ngƣời dân nơi đây cũng rất phong phú và mang đậm bản sắc, gắn liền với các lễ hội theo ngành nghề cổ truyền: làng chài thờ Thần Nam Hải (Cá voi); làng rừng, làng nông thờ Hà Bá, Thủy Quan sông rạch [ 19]. Rừng ngập mặn ở đây có những tổ hợp gien đặc biệt có thể sống và phát triển tốt trong điều kiện nƣớc mặn, ngập nƣớc triều mà các loại cây khác không thể sống đƣợc. Tuy là rừng trồng nhƣng rừng ngập mặn Cần Giờ đạt đƣợc hệ sinh thái giống nhƣ rừng tự nhiên. Một ƣu thế nữa là rừng ngập mặn Cần Giờ nằm trong một thành phố công nghiệp đông dân cƣ, rất thuận lợi để phát triển du lịch, giáo dục, hợp tác quốc tế vô cùng thuận lợi [5]. 9 2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển Các khu dự trữ sinh quyển là đại diện mẫu của các hệ sinh thái trên Trái đất, là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái, đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng và Quốc tế [5]. Hiện nay trên thế giới có 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 nƣớc [5]. Khu dự trữ sinh quyển có các chức năng sau:  Bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn địa dạng cảnh quan, hệ sinh thái loài và vốn gien di truyền.  Phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế dựa trên cơ sở bền vững môi trƣờng và văn hóa.  Trợ giúp: nghiên cứu, giám sát, đào tạo và giáo dục về bảo tồn và phát triển bền vững địa phƣơng, Quốc gia, khu vực và Quốc tế. 2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ Trong chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do chất độc hóa học của Mỹ. Hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây chính của rừng nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ bị biến mất [19]. Sau chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc tái sinh theo kế hoạch trồng và phát triển rừng của thành phố Hồ Chí Minh, nhanh chóng trở thành Khu rừng phòng hộ (1991) và Khu dự trữ sinh quyển thế giới (2000). Tuy nhiên hiện nay rừng ngập mặn Cần Giờ đang đứng trƣớc những nguy cơ đe dọa đáng báo động [21]. Việc nghiêm cấm tỉa thƣa rừng của Ủy ban Nhân dân thành phố Hồ Chí Minh ban hành (6/1999) làm chất lƣợng rừng có xu hƣớng xấu đi, do cạnh tranh không gian, dinh dƣỡng và tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển. Chiều cao của cây quá cao (với tuổi đời 19 – 27 chiếm đa số), cộng với thiếu ánh sáng nên đƣờng kính thân không cân đối, làm thiệt hại đáng kể đến thu nhập từ nguồn gỗ. Mặc khác, việc lƣu thông tàu bè đã làm xói lở ven bờ, khói thải, dầu làm ảnh hƣởng đến môi sinh. Nhiều hộ dân cƣ vẫn còn sinh sống và sản xuất trong rừng làm ảnh hƣởng đến dòng chảy, nguồn nƣớc, tạo các dịch bệnh cho cây rừng. Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu 10 bệnh hại cây rừng, nhƣ sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng của cây rừng. Thêm vào đó, việc mở con đƣờng Rừng Sác băng qua rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay càng làm tăng thêm mối đe dọa đến môi sinh và sinh thái rừng nghiêm trọng [21]. Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài cây rừng có giá trị để làm tiền đề cho công tác chọn giống, khôi phục rừng đang trở thành một vấn đề cấp bách hiện nay. 2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba)  Tên Việt Nam: mắm trắng  Tên Latinh: Avicennia alba  Vị trí phân loại cây mắm trắng [17]: 2.2.1. Vùng phân bố Mắm trắng là một nhóm các loài cây rừng ngập mặn phân bổ rộng khắp trên thế giới, trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa lúc triều lên và triều xuống, về phía nam của Bắc chí tuyến, phổ biến ở Rừng Sác Việt Nam (Cà Mau, Cần Giờ) Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin, Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee, Saloman, Caroline [15]. (Superrgnum): Eukarya Giới (regnum): Plantae Ngành (divisio): Magnoliophyta Lớp (class): Magnoliopsida Bộ (ordo): Lamiales Họ (familia): Acanthaceae hay Avicenniaceae Chi (genus): Avicennia Loài (species): Avicennia alba 11 2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng Hình dạng: Thân gỗ, có thể cao đến 20 m, đƣờng kính 0,5 m, thân ít khi thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với rừng đƣớc (Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần [17]. Hình 2.2. Cây mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ 2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dƣới phủ lông màu trắng bạc, gân bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thƣa ở cả mặt dƣới và mặt trên, lá khô có màu đen ở mặt trên [17]. 12 Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài bằng nhau, vành đứng hình ống thẳng có 4 thùy bằng nhau, 4 tiểu nhị (2 dài, 2 ngắn), tua nhị ngắn và trơn, bao phấn có buồng song song, hình bầu dục, bầu nhụy hình bầu dục, hơi mịn ở đầu, có nhựa thơm, 4 tiểu noãn tròn dài gắn ở đầu 1 trục, vòi nhụy rất ngắn 1 mm, trơn đầu chẻ đôi [17]. Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. Trái: Trái là manh nang hình tim, phồng lên ở một bên làm mũi trái cong qua 1 bên, dài 2 cm, vỏ dày lông mịn, xanh lục, 1 hột, không phôi nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trƣớc khi trái rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có nhiều lông trắng [17]. Hình 2.4. Trái mắm trắng. 13 Nơi sống: Mắm trắng là loại cây ƣa sáng, sinh trƣởng nhanh, thích nghi với nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt). Mắm trắng là loài cây cho chồi gốc, thƣờng trổ hoa vào đầu mùa mƣa (tháng 4 – 6 dƣơng lịch), cho trái vào cuối mùa mƣa (tháng 9 – 11 dƣơng lịch). Chỉ vài giờ sau khi trái rụng, cây mầm bên trong hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành cây mới. Mắm trắng thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, nơi có mực thủy triều lên xuống hàng ngày. Nói chung "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng ngày" là đất sinh trƣởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15]. 2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc" của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15]. Gỗ cây mắm trắng trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc tố cho công nghiệp thuộc da. Vì thiếu nguồn cây giống để trồng bảo vệ ven biển và đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm, đƣớc và vẹt [17]. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm ở lợi ích trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ (riêng Cà Mau vài km²/năm) [15]. 2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ Trong tƣơng lai gần quần thể mắm trắng tại Cần Giờ sẽ lâm vào tình trạng nguy cấp do khai thác bừa bãi quá mức, không có kế hoạch, chặt cây phá rừng lấy đất làm đầm nuôi tôm và sản xuất nông nghiệp khác [16]. 14 Bên cạnh đó việc phá rừng, phóng đƣờng đã và đang gây nhiều ảnh hƣởng đến diện tích và môi sinh của cây mắm trắng. Do đó mặc dù diện tích rừng và trữ lƣợng cây rất lớn nhƣng lại bị giảm sút nhanh chóng và ngày càng nghiêm trọng, mức độ đe dọa: bậc V [16]. Do đó các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên các cây rừng ngập mặn nói chung và cây mắm trắng nói riêng rất đƣợc chú trọng đầu tƣ và khuyến khích thực hiện. 2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng Những nghiên cứu trên cây mắm trắng chủ yếu đƣợc thực hiện ở trong nƣớc ta, nguyên nhân có thể là do mắm trắng không phải là quần thể thực vật tiên phong chính tại các rừng ngập mặn khác trên thế giới (mà thay vào đó là quần thể mắm biển). Tuy vậy những nghiên cứu đã thực hiện chủ yếu là điều tra, khảo sát các đặc điểm sinh lý, tình hình sâu bệnh, ít có những nghiên cứu thực sự ở mức độ phân tử. Một số đề tài nghiên cứu đã thực hiện: Phân bố rễ Mắm trắng trên các vùng có mức độ ngập triều khác nhau ở Cần Giờ TP Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam, 2006) 2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền 2.3.1. Đa dạng sinh học Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002). Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng” [8]. 2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta [9]. 15 Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế đƣợc, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và bền vững của loài ngƣời [22]. 2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học 2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học. Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều kiện nhất định và có mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi trƣờng. Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Các nhân tố hữu sinh gồm có nhóm sinh vật tự dƣỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp trở lại cho thực vật. Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình). Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao. Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9]. 2.3.3.2. Đa dạng loài Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất. Sự đa dạng này đƣợc thể hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc xác định bởi một trong hai cách:  Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm khác. Cách phân loại này thƣờng đƣợc các nhà phân loại học, sinh học vận dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.  Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách 16 này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan hệ về gien [8]. Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế thƣờng phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992). Một loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Ngƣợc lại, các phân loài đôi khi giống nhau đến mức tƣởng nhƣ chúng là các thành viên của cùng một loài. Trong thiên nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu tạo hình thái hay sinh lý nhƣng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối đƣợc với nhau [8], [22]. Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết. 2.3.3.3. Đa dạng di truyền Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài. Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ. Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều quần thể. Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau. Sự đa dạng về bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gien là đơn vị di truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trƣng cho những protein riêng biệt. Những hình thái khác nhau của gien đƣợc thể hiện bằng những alen và những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau. Những sự khác biệt về gien trong di truyền học đƣợc tăng dần khi con cái nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các 17 gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống nhất mới cho con cái. Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện đặc trƣng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trƣờng nhất định. Số lƣợng khác biệt nhau về gien trong một quần thể đƣợc xác định bởi số gien trong vốn gien đó, thƣờng mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình) và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng [9], [22]. 2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế giới. Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới. Song sự đa dạng này đang bị đe dọa vì môi trƣờng sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây dựng đập nƣớc và đƣờng xá cũng nhƣ việc mở rộng các hoạt động công nghiệp. Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi trƣờng. Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự là vấn đề chất lƣợng. Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất. Hiện có 700 loài sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mức độ ô nhiễm thƣờng xuyên vƣợt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa. Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hƣởng xấu đến đa dạng sinh học [8]. 18 2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng sinh học [6]. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết thích hợp. Mục đích cuối cùng là để thu đƣợc DNA tinh khiết cho những phân tích tiếp theo [2], [12], [14]. Quy trình chiết tách gồm 3 bƣớc cơ bản sau:  Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Mô đƣợc nghiền trong một hỗn hợp chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này có tác dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.  Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc). Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid. Protein sau khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.  Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại trong dung dịch theo nồng độ mong muốn. 19 2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.5.1. Khái niệm Kỹ thuật PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm 1985. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu [8]. 2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR DNA mẫu: Đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau. DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô. Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao. Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết. Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần khiết [1]. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang) ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo công thức : DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Primer (mồi): Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác [2]. 20 Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F – primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngƣợc). dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP): Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau. Dung dịch buffer: Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động. Taq DNA polymerase: Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại. Ion kim loại Mg++: Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động. 2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 40 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 21 Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các bƣớc: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7]. Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép đƣợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94 - 96 0 C). Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhƣng thƣờng là 50 - 560 C). Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dƣới sự thực hiện của Taq DNA polymerase (72 0 C). Sau 30 - 40 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 4oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản phẩm PCR. 2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử, với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp và trong nhiều lĩnh vực khác. Trong nghiên cứu genomic: multiplex PCR. Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán đƣợc nhiều loại bệnh do virus, vi khuẩn, ký sinh trùng gây ra. Trong nông nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ chỉ thị DNA (MAS), kiểm tra kết quả chuyển gien [8]. 2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR Ưu điểm của kỹ thuật PCR  Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện.  Độ nhạy rất cao.  Thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh.  Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.  Lƣợng mẫu cần ít. 22 Nhược điểm của kỹ thuật PCR [1], [7]  Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.  Kích thƣớc của đoạn khuếch đại bị giới hạn. Phản ứng PCR chỉ cho kết quả tốt khi thực hiện với những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 1,5 kb. Với những đoạn có kích thƣớc trên 3kb, phản ứng PCR tỏ ra vô hiệu.  Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (đến 10-4, nghĩa là cứ khoảng 10000 nucleotid thì enzyme có thể gắn sai một nucleotid) 2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của chúng. Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự các bộ ba trên DNA trong bộ gien giống hệt nhau. Việc xác định tính đa dạng sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để lai tạo thƣờng đƣợc đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt [8]. Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản ngƣời ta thƣờng dựa trên các chỉ thị DNA. Chỉ thị DNA có thể đƣợc chia làm hai nhóm:  Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP  Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP Các phƣơng pháp này đều sử dụng sản phẩm DNA đã đƣợc chiết tách, tinh sạch từ khâu ly trích. 2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Là phƣơng pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy 23 các băng DNA hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại nếu có sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA. Phƣơng pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết đƣợc phân cắt bằng một enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau tùy theo kích thƣớc của nó chạy trên gel agarose. Những đoạn DNA này đƣợc chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon), nơi nó bị cố định. Sau giai đoạn trƣớc khi lai DNA, ngƣời ta cố định các vị trí trên màng, nơi quá trình lai DNA sẽ xảy ra. Các DNA (gien liên kết với marker) sẽ gắn với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) đƣợc đánh dấu bằng phóng xạ. Quá trình lai giữa DNA và probe nhƣ vậy đƣợc gọi là lai DNA. Sau khi lai, tấm lọc hay màng lọc đƣợc rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA đang nghiên cứu. Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau khi điện di, gel đƣợc chụp dƣới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm liên tục. DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X – quang. Các sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể đƣợc quan sát để đánh giá [10]. RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase [3], [4], [11]. 2.6.2. Nhóm dựa trên PCR 2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Ngƣời ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn, trong điều kiện chƣa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn . Ngƣời ta giả định rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn (single – strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel, tạo ra thể đa hình [1], [4]. 24 Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nƣớc đá. Khi đó hiện tƣợng snap – back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tƣợng đứt gãy cấu trúc thứ cấp, các mẫu phải đƣợc xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P32 đƣợc dùng trong PCR, thì phim chụp X – quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel. Nếu không, ngƣời ta sẽ dùng bạc để nhuộm gel. DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần nhuộm Ethidium bromide [11]. SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhƣng nó chỉ áp dụng cho việc tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tƣơng đối ngắn. SSCP có thể xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lƣợng phân tử), và nó có thể phân biệt đƣợc sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó. Ngƣời ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở ngƣời. Trong thực vật, SSCP chƣa đƣợc phát triển nhiều. Ngƣời ta hi vọng, SSCP marker sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó [11]. 2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide ((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại. Do vậy nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite. Sản phẩm PCR là các đoạn DNA có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài đƣợc tách ra trên gel polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. Do số lần lặp lại cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trƣờng hợp khác nhƣ RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau. Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thƣờng có kích thƣớc 100 – 200 bp. Tuy nhiên, SSR thƣờng đƣợc phân tích trên DNA hệ gien nhỏ mang trình tự lặp lại và kích thƣớc của chúng đƣợc nhận biết sau khi điện di trên gel [4], [11]. SSR đƣợc thực hiện theo bốn bƣớc:  Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu. 25  Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trƣng cho các đoạn lặp đơn giản.  Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.  Xử lý số liệu bằng các phần mềm nhƣ Map Marker Program, SYSTAT, NTSYSpc lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại. 2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA đƣợc khuếch đại chọn lọc, do Vos và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật đƣợc áp dụng để phân tích tính đa dạng của sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã đƣợc khuếch đại đồng thời nhờ phản ứng PCR [13], [18], [20]. Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:  Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các primer đã chọn trƣớc. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, đƣợc tổng hợp nhân tạo và có trình tự tƣơng ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA đƣợc phân cắt bởi một loại enzyme nhất định.  Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại primer khác nhau.  Các thành phần tham gia trong phản ứng AFLP: Các enzyme: Để cắt DNA của bộ gien, 2 enzyme cắt hạn chế đƣợc sử dụng:  MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base  EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận đƣợc: một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13]. 26 Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI. Adapter: Adapters là trình tự sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã đƣợc cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết [13]. Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. Các primer: Có hai loại primer đƣợc sử dụng: Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc:  EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’  MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’ Primer này đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’. Kết quả chủ yếu của việc chọn trƣớc PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bƣớc khuếch đại tiền chọn lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA [13]. 27 Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc: Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc đƣợc thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’. Kết quả là so với primer đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter thì primer khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA trên gel. Sau khi đƣợc khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu đƣợc phân tích trên máy giải trình tự DNA. Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ yếu các đoạn DNA đƣợc gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI không đƣợc khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không đƣợc nhận biết trong quá trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa EcoRI đƣợc nhận biết [1], [13].  EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’  MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’ 28 Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bƣớc cơ bản:  Tách chiết và tinh sạch DNA.  Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc có bổ sung adapter tƣơng ứng.  Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 + 1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide.  Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các mẫu nghiên cứu. Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP nhƣ sau: 29 Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP.  Kỹ thuật AFLP có các ƣu điểm:  Lƣợng DNA cần cho phản ứng rất ít.  Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.  Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tƣợng sinh vật khác nhau.  Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gien.  Tạo nhiều băng khuếch đại – khả năng tạo đa hình cao, chỉ thị phân tử cho lƣợng thông tin cao.  AFLP đƣợc ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gien thực vật bao gồm:  Thiết lặp nhóm gien liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá trình cho tạp giao.  Làm bão hòa các vùng có gien lạ đƣa vào.  Ƣớc lƣợng mức độ có quan hệ giữa các giống. 30 2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể đa hình mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp, mạch đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR [4]. Sau khi bắt cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di [11]. Một primer có thể tạo nên sự đa hình DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa hình DNA nhanh và hữu hiệu [7]. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hình cao. Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau: 3’ 1 2 3 5’ DNA mẫu 5’ 4 5 6 3’ Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR.  Chú giải: Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣợng trƣng cho các vị trí trên DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA mẫu 5’ - 3’. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành: Sản phẩm B Sản phẩm A 31  Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 2 và 5.  Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai vị trí 3 và 6.  Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4 do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại.  Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và 5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau.  Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản:  Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR  Điện di trên gel Agarose hoặc gel Polyacrylamid  Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu. Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một số vấn đề sau:  Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.  PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq DNA polymerase và có thể có hoặc không có Mg2+. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+, nếu nồng độ Mg2+ khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau.  Taq DNA polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq DNA polymerase và nồng độ của Taq đòi hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.  Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf [1], [8].  Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD [11]:  Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít. 32  Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản.  Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.  Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.  Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD [11]:  Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao.  Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao. 33 Phần 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành 3.1.1. Thời gian tiến hành Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007. 3.1.2. Địa điểm Các mẫu lá cây mắm trắng (Avicennia alba) đƣợc thu thập tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh. Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phân tích RAPD tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 3.2. Vật liệu nghiên cứu 3.2.1. Mẫu thực vật Địa điểm lấy: Mẫu đƣợc lấy tại một số tiểu khu của Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ. Cách lấy mẫu: Lấy mẫu theo hai đƣờng chéo của rừng, một theo đƣờng bộ và một theo đƣờng sông. Lấy theo khoảng cách, khoảng 1 km lấy một mẫu, ghi nhận các đặc tính hình thái (thân cây to, mọc khỏe hoặc yếu ớt, các cây có khối u, hình dáng dị thƣờng) và tọa độ vị trí nơi lấy mẫu bằng máy định vị GPS. Chọn những lá tƣơi tốt, còn non, thƣờng là phần ngọn của các cành. Lấy 8 – 10 lá trên mỗi cây. Kí hiệu cho mẫu theo kiểu AAxx Trong đó: AA: tên loài (Avicennia alba) và xx: số thứ tự. Bảo quản và vận chuyển mẫu: Lá đƣợc cho vào bịch nylon, buộc kín miệng, bảo quản tạm thời trong thùng xốp lạnh, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản. 34 3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA CTAB (C19H42NBr, M=364,5 g/mol) Phá vỡ màng tế bào, màng nhân Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở 65 o C Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ muối Sodium acetate cao và nhiệt độ thấp Dung dịch gốc Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol 100% và 3 thể tích nƣớc cất 2 lần đã hấp tiệt trùng Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ thấp, không cần muối Sodium Acetate Dung dịch gốc Chloroform Biến tính protein và các sắc tố có trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm Dung dịch gốc Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong quá trình vortex hay ly tâm tốc độ cao Dung dịch gốc Hỗn hợp Chloroform:Isoamyl Alcohol (24:1) Biến tính protein và các sắc tố trong mẫu. Tách lớp sau khi ly tâm, DNA đƣợc phóng thích sẽ nằm trong pha nƣớc ở lớp trên Pha với tỷ lệ 24 thể tích Chloroform và 1 thể tích Isoamyl Alcohol EDTA 0,5M (C10H14N2Na2O3, M=372,54 g/mol) Gắn nối các ion hóa trị II (Mg ++ , Ca ++…) có trong dịch ly trích, ngăn chặn sự hoạt động của các enzyme phân hủy DNA. Các enzyme này hoạt động rất mạnh nếu có sự có mặt của các ion hóa trị II nhất là ion Mg++ Pha 100ml: - 18,622 g bột EDTA + 80ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc cất 2 lần cho đủ 100ml. - Hấp 121oC/20phút trƣớc khi dùng. NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận lợi cho việc kết tủa DNA Pha 100ml: - 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. 35 TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml: - 10ml Tris-HCl 1M + 2ml EDTA 0,5M + 88ml nƣớc cất 2 lần. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng. TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X + 90ml nƣớc cất 2 lần EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml: - 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ 65 oC cho tan, hạn chế tạo bọt). - Thêm vào 28ml NaCl 5M + 10ml Tris-HCl 1M + 4ml EDTA 0,5M + 1ml Mercaptro Ethanol. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Sodium Acetate 3M (CH3COONa, M=82 g/mol) Dung dịch đệm, làm tăng lực ion trong dịch trích, tạo điều kiện thuận lợi cho DNA kết tủa với ethanol 100% trong điều kiện -20oC Pha 100ml: - 24,6g bột Sodium Acetate + 100ml nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan. - Hấp 121oC/20 phút trƣớc khi dùng RNase (Ribonuclease) (10%, w/v) Enzyme thủy phân RNA có trong dịch trích Pha 1ml: - 10mg bột RNase + 1ml nƣớc cất 2 lần. - Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC, tránh ánh sáng trực tiếp. Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc PVP (polyvinylpyrrolydol) Biến tính các hợp chất phenol Dạng bột, sử dụng 2g PVP, thêm vào thành phần của dịch trích EB 3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA Nƣớc cất 2 lần khử ion TE 1X TAE 0,5 X Loading dye 6X Ethidium bromide 36 3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD  Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV  dNTP 25mM (Promega)  Buffer free Mg2+ 10X (Promega)  MgCl2 25mM (Promega)  Taq DNA Polymerase 5U (Promega)  Primer: Sử dụng 7 primer có trình tự và Tm nhƣ sau: Primer OPAC10 _ 5’AGC AGC GAG G3’, Tm = 34 Primer 1 (OPA02) _ 5’TGC CGA GCT G3’, Tm = 40,7 Primer 2 (OPA03) _ 5’AGC CAG CCA C3’, Tm = 34,3 Primer 9 (OPN03) _ 5’GGT ACT CCC C, Tm = 33,9 Primer OPA05 _ 5’AGG GGT CTT G3’, Tm = 34,2 Primer OPA10 _ 5’GTG ATC GCA G3’, Tm=30,7 Primer RAH8 _ 5’GAG AGC CAA C 3’, Tm = 31,9 3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm Chén sứ và chày giã (Đức) Máy Vortex (IKA - Đức) Cân điện tử (Ohaus - Mỹ) Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh) Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh) Tủ sấy (Jencons-Anh) Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức) Bồn điện di (Biorad) Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản) Lò Viba (Electrolux) Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển) Đầu típ các loại (Đức) 37 Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ) Máy PCR (PTC 100 - MJ) Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản) Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp) Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản) 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA Chúng tôi đã tiến hành thực hiện ly trích DNA theo các quy trình sau:  Quy trình 1: Theo quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng không sử dụng Rnase. Gồm 11 bƣớc: Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào cối, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650C trong 45 phút. Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), vortex 10 phút, ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C. Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Bƣớc 4: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C. Bƣớc 6: Thêm vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và để – 200C trong 60 phút. Bƣớc 8: Li tâm 14.000 vòng/10 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 14.000 vòng/2 phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C. 38  Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm, thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu. Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá đã rửa sạch, lau khô. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ ở tốc độ thấp (800 vòng/phút). Ủ ở 650C trong 60 phút. Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), đảo nhẹ vài lần, li tâm 10.000 vòng/20 phút ở 100C. Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Thu đƣợc V l dịch nổi. Bƣớc 4: Thêm V l dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm. Bƣớc 5: Li tâm 8.000 vòng/20 phút ở 100C. Đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút. Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3M, và 640 l Ethanol 100%, trộn đều và ủ – 200C trong 60 phút. Bƣớc 8: Li tâm 8.000 vòng/15 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 6.000 vòng/5 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút. Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.  Quy trình 3: Cải tiến quy trình 2, bổ sung PVP 2% vào dịch trích EB.  Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu trong dích trích EB, tăng số vòng vortex. Bƣớc 1: Cân 0,4 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong N2 lỏng, cho vào eppendorf. Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đều cho đến khi hỗn hợp có màu đồng nhất ở 14.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút. Ủ ở 650C trong 1 giờ. Bƣớc 3: Ly tâm 10.000 vòng/20 phút. Thu đƣợc V µl dịch nổi. 39 Bƣớc 4: Thêm V Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm 10.000 vòng trong 20 phút ở 40C. Thu dịch nổi. Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4. Bƣớc 6: Thêm 300 µl Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ - 200C qua đêm. Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa. Bƣớc 8: Thêm 300 l TE 1X, đem ủ ở 370C trong 30 phút. Thêm 20 l Sodium acetate 3M và 64 l Ethanol 100%, trộn đều, đem ủ - 200C trong 1 giờ. Bƣớc 9: Li tâm 15 phút, 8.000 vòng ở 40C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 6.000 vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong. Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở 37 0C trong 30 phút, bảo quản mẫu ở - 200C. 3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích 3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 20 phút. Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide 0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA. Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và tạo thành các băng trên gel [6], [7]. 3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế Hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức sau: DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n Trong đó:  OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm  OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm 40  n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100) Cách tiến hành:  Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.  Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette, hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD [7]. 3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:  Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau: Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM dNTP 10 mM 0,25 l 100 M Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng H2O 12,05 l Tổng thể tích phản ứng 25 l 41 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) 1 94 3 40 94 1 Ta 1 72 2 1 72 15 Hold 4 0 C Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38 Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau : Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối PCR buffer 10X 2,5 l 1X MgCl2 25 mM 3 l 3 mM dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM Primer 100 M 0,3 l 1,2 M Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng H2O 17,8 l Tổng thể tích phản ứng 25 l Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 5 phút 42 40 94 30 s Ta 30 s 72 1 phút 1 72 5 Hold 4 0 C Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38  Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer. Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2 Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1. Trong đó : Ta (OPA05) = 36 Ta (OPA10) = 34 Ta (primer2) = 36 Ta (primer9) = 36 Ta (primerRAH8) = 34 2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số 0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu. 43 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này. Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông. Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng. 44 4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40C. Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn đến sự hóa nâu của lá. Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5 phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn. 4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo. Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn, lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2 không thể loại hết những hợp chất này. Có thể sự tồn tại các hợp chất này ở hàm lƣợng cao nhƣ vậy trong lá sẽ làm ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của các hóa chất 45 dùng trong ly trích, làm DNA dễ bị tổn hại trong các thao tác vortex hay ly tâm, từ đó dẫn đến việc DNA bị gãy nhiều. Vì các lí do này, chúng tôi đã quyết định sử dụng quy trình 3, bổ sung PVP2% vào thành phần của dịch ly trích EB, với mục đích loại bỏ các hợp chất phenol có trong lá tốt hơn. Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2. Kết quả điện di trên gel agarase 1% cho thấy việc sử dụng quy trình 3 làm giảm đáng kể sản phẩm không mong muốn. Chỉ số đo OD của những mẫu này từ 1,6 – 2, có thể sử dụng để thực hiện phản ứng RAPD. Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy quá trình nghiền mẫu trong dịch trích EB có một số hạn chế là tốn nhiều thời gian, công sức và cho kết quả không ổn định, còn phụ thuộc nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Ngoài ra thao tác nghiền phải đƣợc tiến hành trong các tủ hút để tránh sự khuếch tán của Mercaptro ethanol vào không khí sẽ gây ra mùi khó chịu và gây nhều tác dụng xấu nếu nhƣ hít phải. Đồng thời, nhằm thu đƣợc những mẫu DNA tinh sạch hơn với độ tin cậy cao hơn, chúng tôi quyết Nhiều vết smear trên 46 định tiếp tục thử nghiệm quy trình 4, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền trong EB và sử dụng các bƣớc tiếp theo giống nhƣ quy trình 3. Hình 4.4. Kết quả ly trích theo quy trình 4 Kết quả đạt đƣợc tốt hơn hẳn. Kết quả điện di ở hình 3.5 cho thấy việc gãy DNA đã giảm xuống, các băng DNA dày và sáng. Chỉ số đo OD từ 1,75 – 2,2. Những mẫu này đáp ứng đựoc các yêu cầu về độ tinh sạch, và có thế đƣợc dùng cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền. Nhƣ vậy việc nghiền mẫu trong N2 tỏ ra hiệu quả hơn nhiều so với nghiền trong dịch trích EB là không cần phải nghiền trong tủ hút, lá dễ nghiền hơn do đã khô cứng và giòn trong N2 lỏng. Ngoài ra mẫu có thể nghiền mạnh tay mà không sợ làm gãy DNA, kết quả thu đƣợc tốt hơn, tốn ít thời gian và công sức hơn. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định tiến hành ly trích DNA theo quy trình cải tiến (đƣợc chỉ rõ ở sơ đồ 3.1) để lấy nguyên liệu cho phân tích RAPD. Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19 47 Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 Đây là một quy trình ổn định và có độ tin cậy, vấn đề còn lại chỉ là thao tác hút dịch trong sau mỗi lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách giữa 2 pha. Chúng tôi tiến hành ly trích 48 mẫu lá mắm trắng, kết quả thu đƣợc 40 mẫu cho băng DNA rõ nét, 6 mẫu cho băng DNA mờ (mẫu ở vị trí 1,2,3,4,19,33) và 2 mẫu cho băng DNA rất mờ ( mẫu số 31 và 50), đạt tỉ lệ 83%. Với kết quả này, các mẫu thu đƣợc hoàn toàn có thể thực hiện phản ứng RAPD. 4.4. Kết thực hiện phản ứng RAPD 4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 Nghiệm thức 1: Nghiền 0,4 g lá trong N2 lỏng thành bột mịn Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex kĩ, ủ 65 0C/1 giờ Thêm 1V hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu V’ dịch trong Thêm V’ hỗn hợp CIA, đảo đều. Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/40C, thu dịch trong. Thêm Isopropanol theo tỉ lệ 1:1, ủ ở - 20 0C qua đêm Ly tâm 9.000 vòng/20 phút/40C, đổ bỏ dịch trong, thu tủa Ly tâm 11.000 vòng/15 phút/ 40C, thu V dịch nổi. Thêm 300µl TE1X, ủ 370C/30 phút. Thêm 20 µl Sodium acetate và 640 µl Ethanol 100%, đem ủ -200C/1 giờ Ly tâm 8.000/20 phút/40C. Đổ bỏ dịch trong, thu tủa. Rửa cặn với 300 µl Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút/6.000 vòng Lặp lại bƣớc 10, làm khô tủa DNA trong không khí. Hòa tan tủa trong 100 µl TE1X, ủ ở 37 0C/30 phút. Bảo quản ở -20 0 C 48 Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với thành phần các chất và chu kì nhiệt đã nêu ở bảng 2.1 và 2.2 để thực hiện phản ứng RAPD, chúng tôi thu đƣợc kết quả là không có băng nào trên gel điện di, nhƣ thể hiện ở hình 3.6 Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 Trong nghiệm thức này, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích RAPD của Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho cây đƣớc. Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên đã thu đƣợc kết quả rất tốt. Theo chúng tôi, điều này có thể là do một số lý do sau:  Thao tác của chúng tôi còn chƣa chính xác.  Đây chƣa phải là quy trình phù hợp cho cây mắm trắng. Nghiệm thức 2: Khi sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với chu kì nhiệt và thành phần hóa chất nhƣ đã đƣa ra trong bảng 2.3 và 2.4, chúng tôi thu đƣợc 4 băng khi chạy với primer OPAC10, và chỉ 1 băng khi chạy với primer 1 nhƣ ở hình 3.7 Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 Không có sản phẩm tạo thành Avicennia officinalis Avicennia alba Avicennia marina OPAC10 Primer 1 49 Từ kết quả này, chúng tôi kết luận rằng thực hiện phản ứng RAPD theo điều kiện ở nghiệm thức 2 này là phù hợp cho cây mắm trắng. Với OPAC10, chúng tôi thu đƣợc 4 băng cho mỗi mẫu DNA đem phân tích. Các băng tách rõ và có thể quan sát bằng mắt thƣờng. Với primer 1, tuy kết quả PCR tốt nhƣng chúng tôi chỉ thu đƣợc chỉ 1 băng đồng hình duy nhất. Do chỉ có 1 băng nên kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm này không có ý nghĩa trong việc so sánh sự đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. Tuy nhiên khi so sánh kết quả này với kết quả chạy primer 1 trên 2 loài mắm đen (Avicennia officinalis) và mắm biển (Avicennia marina), chúng tôi kết luận có thể đây là băng đặc trƣng không những chỉ cho cây mắm trắng mà còn cho cả chi Avicennia và có thể là một vùng bảo tồn của chi Avicennia, là chỉ thị phân tử để phân biệt chi mắm với các chi khác trong họ Avicenniacea. Kết quả điện di với ladder cho thấy băng này có kích thƣớc khoảng 400 bp. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định khảo sát thêm một số primer khác với mong muốn tìm đƣợc primer cho sản phẩm khuếch đại trên gel cao hơn nhƣ trong thí nghiệm 2. Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen (Avicennia officinalis) Băng đặc trưng 400 bp Ladder 1kb 50 4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 3 trên cây mắm trắng. Với các primer đã sử dụng, chỉ có primer OPA05 và OPA10 không cho băng nào, primer 9 và primer 2 đều cho 3 băng, primer RAH8 chỉ cho 2 băng. Theo chúng tôi, lý do không có băng ở mẫu thực hiện với primer OPA05 và OPA10 là do các primer này đã đƣợc bảo quản trong thời gian dài (từ năm 2004), hoạt tính có thể đã giảm đi, vì vậy không xảy ra phản ứng khuếc đại. Ở các primer khác, mặc dù có cho băng, nhƣng số băng còn ít (chỉ từ 2 – 3 băng), do đó chúng tôi không chọn để phân tích đa dạng di truyền. Với kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 để thực hiện phản ứng RAPD, phân tích đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. 4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ Chúng tôi đã tiến hành phản ứng RAPD với primer OPAC10 sử dụng thành phần hóa chất và chu kì nhiệt ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1 trên 16 mẫu DNA đã ly trích có kết quả đo OD đạt từ 1,8 -2,2. Kết quả có 2 mẫu không cho sản phẩm khuếch đại. Đối chiếu với thao tác thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy đây là mẫu cuối cùng khi chúng tôi tiến hành chia từ ống trộn chính sang các eppendorf khác, sự hao Primer 2 Primer 9 RAH8 OPA05 OPA10 51 hụt không thể tránh khỏi khi tiến hành với những thể tích nhỏ nhƣ vậy, do đó nồng độ thành phần các chất ở mẫu này có thể đã bị thay đổi, do đó phản ứng khuếch đại đã không xảy ra. Với 16 mẫu thực hiện phản ứng RAPD – PCR, chúng tôi thực hiện thành công 14 mẫu (chiếm tỉ lệ 87%), thu đƣợc tổng cộng là 49 băng, với 7 băng có kích thƣớc khác nhau, trung bình 3,5 băng/mẫu. Số băng tối đa chúng tôi thu đƣợc là 5 băng (ở 2 mẫu 11.AA07 và 5A.AA19), số băng ít nhất là 2 băng (thu đƣợc đƣợc ở 2mẫu 11.AA09 và 11.AA11). Măc dù số băng còn thấp nhƣng cũng thấy xuất hiện những băng đa hình ở những mẫu này. Kết quả thu đƣợc 6 băng đa hình (chiếm tỉ lệ 85%) và 1 băng đồng hình (chiếm tỉ lệ 15%) có kích thƣớc khoảng 200 bp. Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng. Trong các mẫu phân tích, băng đồng hình 200 bp luôn xuất hiện, vì vậy chúng tôi nghĩ rằng có thể đây là băng đặc trƣng để phân biệt giữa cây mắm trắng với các cây khác trong chi mắm. Từ kết quả điện di thu đƣợc trên gel điện di, chúng tôi mã hóa số liệu thành dạng nhị phân 1 và 0 (1 là có băng, 0 là không có băng), và đem kết quả này phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích sự đa dạng di truyền. Kết quả chúng tôi thu đƣợc cây phân nhóm của các mẫu đã phân tích. AA01 AA03 ladder AA06 AA07 AA08 AA09 AA11 AA12 AA13 AA19 AA25 ladder AA32 AA45 AA47 AA48 AA49 52 Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích Với 14 mẫu đem phân tích chia thành 2 nhánh chính có khoảng cách phân nhóm là 0,55. Nhóm I gồm 5 mẫu 10A.AA12, 2B.AA48, 6B.AA32, 10A.AA13 và 1.AA49. Nhánh này lại chia thành 2 nhánh phụ có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,81 – 1, điều này cho thấy có sự tƣơng đồng cao giữa 5 mẫu này. Đặc biệt giữa 2 cặp mẫu 10A.AA13 và 1.AA49; 10A.AA12 và 2B.AA48, có hệ số đồng dạng lên đến 1, chứng tỏ những cặp mẫu này có bộ gien hoàn toàn giống nhau. Mặc dù các mẫu này đƣợc lấy ở các tiểu khu khác nhau và khoảng cách cũng khá xa nhau. Điều này có thể là do chúng là những cây đƣợc tái sinh cùng thời điểm từ một nguồn cây mẹ giống nhau do đó mang bộ gien giống nhau. Bên cạnh đó, khi so sánh tọa độ lấy mẫu của những mẫu này, chúng tôi nhận thấy chúng đƣợc lấy tại những tiểu khu liền kề nhau dọc theo đƣờng thủy, nhƣ vậy theo chúng tôi nhận định, có thể đây là một dạng phát tán tự nhiên của cây mắm trắng. Trong nhánh II gồm 5 mẫu còn lại đƣợc chia làm nhiều nhánh nhỏ, phức tạp, có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,63 – 1. Đáng chú ý là 2 mẫu 17A.AA01 và 17A.AA03 có hệ số đồng dạng di truyền là 1. Hai mẫu này đều đƣợc lấy từ tiểu khu 17, mẫu 17A.AA01 là cây con, trong khi mẫu 17A.AA03 là cây đã trƣởng thành. Coefficient 0.55 0.66 0.78 0.89 1.00 10A.AA12 17.AA01 17.AA03 21.AA06 11.AA09 11.AA11 5A.AA19 10B.AA25 7.AA45 11.AA07 10A.AA12 2B.AA48 6B.AA32 10A.AA13 1.AA49 53 Điều này cho thấy có thể đây là những cây đƣợc phát tán tự nhiên hoặc đƣợc trồng từ một nguồn gốc chung. Tƣơng tự, hai mẫu 11.AA09 và 11.AA11 đƣợc lấy tại tiểu khu 11 cũng có hệ số đồng dạng di truyền là 1, và đều là cây con. Nhƣ vậy, có thể chúng cũng đƣợc phát tán tự nhiên cùng một nguồn gốc chung, hoặc có thể là cây đƣợc tái sinh theo các chƣơng trình phục hồi rừng với cùng một nguồn cây giống. Nhƣ vậy một cách tổng quát, kết quả phân tích trên phần mềm NTSYSpc2.1 cho thấy quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có hệ số đồng dạng di truyền tƣơng đối cao, từ 0,55 – 1, và có đến 3 cặp mẫu có hệ số này là 1. Điều này có thể nhận định rằng sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng nơi đây ở mức thấp. Ở những mẫu đƣợc lấy theo đƣờng bộ và lấy theo đƣờng sông đều cho thấy có vài trƣờng hợp hệ số đồng dạng di truyền là 1. Với kết quả nhƣ vậy, chúng tôi nhận định rằng, mắm trắng tuy là cây tiên phong của rừng ngập mặn nhƣng nó không phải là cây chủ lực của rừng Cần Giờ, chủ yếu là mọc tự nhiên. Công tác tái tạo, trồng mới quần thể mắm trắng cũng ít đƣợc tiến hành do đó sự phân bố rộng của mắm trắng có thể chủ yếu là do tính thích nghi, sinh trƣởng mạnh của cây mắm trắng trên những rừng ngập mặn, hình thức sinh sản chủ yếu là của mắm trắng là tự thụ phấn và phát tán, lan rộng nhờ vào hạt và cây con mọc lên từ rễ chính, trong đó hình thức phán tán của hạt chiếm ƣu thế hơn ở cây mắm trắng. Ở những cây mọc theo sông, nhờ dòng nƣớc mà hạt mắm trắng đƣợc mang khắp nơi. Có thể vì lý do này mà tính đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại nơi đây ở mức thấp. Bên cạnh đó cũng nguồn giống cây mắm trắng đƣợc tái sinh lúc ban đầu chủ yếu lấy từ nguồn giống tại chỗ do đó mức độ đa dạng về di truyền thấp là điều hoàn toàn có thể xảy ra. Nhƣ vậy càng về sau, hệ số đồng dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại nơi đây sẽ càng tăng cao hơn nữa do sự tự thụ phấn và lại giống. Điều này có thể dẫn đến sự hủy diệt quần thể mắm trắng nơi đây khi có dịch bệnh, sâu hại tấn công trên diện rộng. Vì vậy các công tác tái tạo, phục hồi tính đa dạng di truyền của cây mắm trắng cần đặc biệt đƣợc chú trọng để nâng cao tính đa dạng của quần thể mắm, giữ gìn tính đa dạng sinh học rừng và giữ gìn một hệ sinh thái rừng bền vững. 54 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận  Mẫu lá mắm trắng không giữ đƣợc lâu trong điều kiện bảo quản 40C và chỉ giữ đƣợc khoảng 1 tháng ở điều kiện -200C.  Quy trình ly trích 4, sử dụng N2 lỏng khá ổn định (đạt tỉ lệ 83%), cho DNA đạt tiêu chuẩn trong phân tích sinh học phân tử.  Quy trình RAPD theo nghiệm thức 2, sử dụng primer OPAC10 cho kết quả khá ổn định, vấn đề còn lại chỉ là do thao tác, nên trộn thật kĩ để đảm bảo nồng độ các chất đƣợc chính xác.  Primer 1 cho 1 băng có kích thƣớc 400 bp đặc trƣng cho cả 3 loài mắm đƣợc khảo sát.  Phân tích kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ cho hệ số đồng dạng di truyền trong cây nhân nhóm di truyền dao động từ 0,55 – 1.  Sự đa dạng di truyền quần thể mắm trắng tại đây ở mức thấp. 55 5.2. Đề nghị  Khảo sát thêm các primer khác trên cây mắm trắng cho số sản phẩm khuếch đại nhiều hơn, có ý nghĩa hơn trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền.  Phân tích trên số lƣợng mẫu lớn hơn để cho kết quả chính xác hơn.  Tách riêng băng 400 bp khi chạy RAPD với primer 1 và băng 200 bp khi chạy với primer OPAC10 đem giải trình tự phục vụ cho công tác phân loại giống giữa cây mắm trắng với các cây khác trong họ Avicenniacea.  Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nói chung và của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) nói riêng. Trong công tác tái tạo quần thể mắm trắng, nên thu thập thêm nhiều nguồn giống từ các địa phƣơng khác, và nên trồng xen kẽ những cây thuộc những tiểu khu khác nhau và xen kẽ những cây trên đƣờng thủy, đƣờng bộ, để nâng cao tính đa dạng vốn có của quần thể mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ. 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC 1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP. Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. 2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. 3. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh 4. Phạm Thành Hổ, 2006. Bài giảng Một số chỉ thị phân tử và ứng dụng trong công tác giống cây trồng. 5.Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuân, 2006. Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000). Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh học. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 8. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi (Rhizophora apiculata BLUME) ở khu Dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD. Đại học Nông Lâm. 9. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà Nội. 10. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang. 11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện khoa học và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ sinh học Hà Nội. 57 12. Bùi Trang Việt, 2002. Bài giảng Sinh học phân tử. Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh. TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 13. Ambike Baldev Gaikwad. Amplified Fragment Length polymorphism (AFLP) technique. 14. Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants. Japan international cooperation agency. TRANG WEB 15. 16. 17. 18. Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc 19. 20. 21. 22. PHỤ LỤC Phụ lục 1. Bảng thống kê các mẫu mắm trắng được thu thập tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ STT Tên mẫu Tên tiểu khu lấy Tọa độ GPS Đặc điểm hình thái 48P UTM 1 AA01 17 0707699 1153876 Cây non, nhiều hoa, chƣa trái 2 AA02 17 0706956 1153990 Cây cao, lá xanh tƣơi, nhiều trái 3 AA03 17 0706752 1154072 Cây già, sâu bệnh nhiều 4 AA04 21 0706678 1154972 Thân nhỏ, lùn, nhiều cành ngang 5 AA05 21 0706898 1156443 Cây to cao nhung chƣa thấy hoa trái. 6 AA06 21 0706380 1157741 Cây trẻ, có hoa, chƣa trái, lá bị sâu 7 AA07 11 0705765 1158774 Cây trẻ, tƣơi tốt, cành lá xum xuê, hoa trái rất nhiều. 8 AA08 11 0705441 1159250 Cây trƣởng thành, cao, lá xanh tốt 9 AA09 11 0705161 1159715 Cây non, chƣa có hoa, trái, sâu nhiều. 10 AA10 11 0704781 1160407 Lá có nhiều vết sâu bệnh, già cỗi 11 AA11 11 0704086 1161940 Cây già cỗi, sâu nhiều, lá bạc xám. 12 AA12 10A 0703881 1162362 Cây non, sâu nhiều. 13 AA13 10A 0703258 1163077 Cây cao, to , lá tƣơi tốt, không bị sâu so với những cây xung quanh. 14 AA14 10A 0702913 1163559 Thân nhỏ, cành gầy guộc, bị sâu 15 AA15 5 0702489 1164263 Cây cao, ốm, nhiều cành, lá già cỗi 16 AA16 5 0701380 1165102 Cây mọc trong gò mối, già cỗi 17 AA17 5 0700452 1165786 Không bị sâu bệnh mặc dù những cây gần kề có rất nhiều bệnh tích 18 AA18 5 0700650 1166971 Thân rất gầy, ít sâu bệnh, có trái 19 AA19 5 0700167 1167848 Cây non, tuoi tốt 20 AA20 5 0699834 1168876 Cây đã già, cao, nhiều sâu 21 AA21 5 0699673 1169617 Cây to, cao, tƣơi tốt 22 AA22 5 0699710 1169929 Cây cao, nhiều sâu 23 AA23 10B 0704861 1161423 Thân to, cành nhiều, lá bị sâu nhẹ 24 AA24 10B 0704929 1161680 Rất ít cành, không bị sâu, chƣa có hoa 25 AA25 10B 0704353 1167004 Ít bị sâu bệnh so với cây xung quanh 26 AA26 10A 0704815 1162305 Cây cao, là cằn cỗi, sâu nhiều 27 AA27 10A 0704402 1162602 Thân cong queo, nhiều cành 28 AA28 10A 0704558 1162782 Cây cao, to , tƣơi tốt 29 AA29 10A 0704676 1163013 Nhiều trái, tƣơi tốt 30 AA30 1